-
Die vorliegende Erfindung betrifft
bioresorbierbare Alginatderivate und Verfahren zur Herstellung von
bioresorbierbaren Alginatderivaten. Die vorliegende Erfindung betrifft
auch die Verwendung von solchen bioresorbierbaren Alginatderivaten
in pharmazeutischen Zusammensetzungen.
-
Alginate sind lineare binäre Copolymere
von D-Mannuronsäure
(MA) und L-Guluronsäure
(GA), die die in 1 gezeigten Strukturen
aufweisen. Die Polymere sind durch Etherbrükken aufgebaut, die 1- und
4-Positionen der MA- und GA-Saccharidreste verbinden. Alginate werden
aus marinen Braunalgen isoliert, und solche natürlich vorkommenden Alginate umfassen
im allgemeinen Blocks von MA-reichen Einheiten, GA-reichen Einheiten
und gemischte Sequenzen von MA- und GA-Einheiten. Käuflich erhältliche
Alginate dieses Typs enthalten typischerweise ungefähr 45% an
MA.
-
Alginate sind in der Form von Algininsäure, verschiedenen
Salzen und verschiedenen Esterderivaten, wie zum Beispiel Propylenglycolalginaten
erhältlich.
Alginatsalze mit monovalenten Kationen, wie zum Beispiel Natrium,
sind im allgemeinen in Wasser löslich.
Alginatsalze, gebildet mit bivalenten oder trivalenten Kationen,
wie zum Beispiel Calcium oder Zink sind im allgemeinen in Wasser
unlöslich.
Die Löslichkeit
von Alginatzusammensetzungen kann daher über einen breiten Bereich durch
variieren des Natrium/Calciumverhältnisses eines gemischten Natrium/Calciumalginatsalzes
kontrolliert werden. Kommerziell erhältliche Alginatprodukte sind
im allgemeinen aus solchen gemischten Salzen gebildet.
-
Alginatprodukte wurden im Bereich
der Wundheilung lang verwendet, insbesondere als ein Wickelmaterial
für Wundhöhlen und
zur Behandlung von Verbrennungen. Alginatmaterialien werden unter den
eingetragenen Markennamen KALTOSTAT (Britcaire Limited), SORBSAN
(Pharma-Plast Limited) und ALGOSTERIL (Johnson & Johnson) verkauft. Diese Produkte
sind in einer Zahl von Formen, einschließlich Seilen und Kissen erhältlich.
Diese Materialien sind hoch absorbierend, biokompatibel und billig.
-
Obwohl Alginate gute Eigenschaften
zur Behandlung von Lochwunden und Verbrennungen aufweisen, muß acht gegeben
werden, wenn die Verbände
gewechselt werden, um sicherzustellen, daß nichts in der Wunde zurückbleibt.
Alginat ist nicht bioresorbierbar, neigt jedoch dazu, zu fragmentieren. Falls
in der Wunde zurückgelassen,
werden Fragmente zu Alginaten in der Bildung von Granuloma führen. Es
ist daher erforderlich, die Wunde gründlich mit Kochsalzlösung zu
spülen,
um sicherzustellen, daß kein
restliches Alginat zurückbleibt.
-
Von Alginaten wurde auch gezeigt,
daß sie ausgezeichnete
hämostatische
Eigenschaften aufweisen, weil sie jedoch nicht resorbierbar sind,
müssen
sie vor dem Schließen
einer Wunde entfernt werden, was unvermeidbar ihre Brauchbarkeit
in dieser Anwendung begrenzt.
-
Demzufolge besteht ein Bedarf für verbesserte
Materialien, insbesondere für
Wundverbände und
hämostatische
Anwendungen, die die Vorteile von Alginaten zeigen und auch bioresorbierbar
sind.
-
Es ist lang bekannt, daß Cellulose
durch Aussetzen gegenüber
einem oxidierenden Mittel, wie zum Beispiel Distickstofftetroxid,
bioresorbierbar gemacht werden kann, wie in US-A-3122479 beschrieben. Die sich ergebende
oxidierte regenerierte Cellulose (ORC) ist in der Form eines gestrickten
Gewebes unter dem eingetragenen Markennamen SURGICEL zur Verwendung
als ein absorbierbares Hämostatikum
erhältlich.
ORC ist auch unter dem eingetragenen Markenname INTERCEED zur Verwendung als
eine Adhäsionsbarriere
erhältlich.
Der bioresorbierbare Charakter von ORC wird als aufgrund der Oxidation
der primären
Hydroxylgruppen auf den Celluloseresten zu Carboxylatgruppen basierend vermutet.
-
US-A-4543410 beschreibt absorbierende, kohärente, flexible
Strukturen in der Form von fibrösen
Netzen und porösen
Schwämmen,
umfassend Wasser-unlösliche
Ring-oxidierte cellulosische Basen. Es wird angegeben, daß die Ringoxidation
der cellulosischen Basen die Hydroxylgruppen an den 2-, 3- und 6-Positionen
der Anhydroglucose-Einheiten von Cellulose selektiv in Carboxylgruppen überführen kann,
in Abhängigkeit
von dem spezifischen Oxidans, das verwendet wird. Es wird angegeben,
daß Distickstofftetroxid
die Hydroxylgruppe an der 6-Position in eine Carboxylgruppe überführt, um
eine mono-Carboxylform der Base (wie bei der Bildung von ORC) zu
ergeben. Perjodsäure
wird den Ring zwischen der 2- und 3-Position öffnen und Hydroxylgruppen an
der 2- und 3-Position in Aldehydgruppen überführen. Das erhaltene Dioxid
kann weiter mit Chlor oder Distickstofftetroxid oxidiert werden,
um eine Dicarboxyl- oder Tricarboxylform der Base herzustellen.
Es wird angegeben, daß Ringoxidierte
cellulosische Basenschwämme,
die aufgrund der Ringoxidation einen Carboxylgehalt von mehr als
15% aufweisen, hämostatisch
und bioresorbierbar sind. Die Ringoxidation von Stärke wird
ebenfalls beschrieben.
-
EP-A-0 693 291 beschreibt eine Zusammensetzung
umfassend eine hydrolysierbare Wundbehandlung, die ein oxidiertes
Polysaccharid einschließt,
das Kreuz-vernetzt ist und eine chemisch induzierte Ladung aufweist
und ein Zuführvehikel,
wobei das modifizierte Polysaccharid und das Zuführvehikel in einem Zustand
sind, in dem das oxidierte Polysaccharid vor der Auftragung auf
eine Wundstelle nicht wesentlich hydrolysieren wird.
-
Es wurde nun gefunden, daß die Ringoxidation
von Alginaten mit Distickstofftetroxid zu bioresorbierbaren oxidierten
Alginatderivaten führt.
Dieses Ergebnis ist überraschend,
weil die Saccharidreste, die die Alginatmoleküle ausmachen, bereits an der 6-Position
vollständig
zu Carboxylat oxidiert sind, vor einer Behandlung mit dem Distickstofftetroxid.
-
Demzufolge stellt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines oxidierten Alginats
zur Verfügung,
umfassend die Schritte von: in Kontakt bringen eines Alginats mit
einem Oxidationsmittel, umfassend N2O4 in einem inerten Lösungsmittel, um die oxidierten
Alginate herzustellen; gefolgt von Isolierung und Waschen des oxidierten
Alginats.
-
Bevorzugterweise wurde mindestens
ein Teil der MA- und/oder GA-Saccharidreste des Alginats an der
2- oder 3-Position oxidiert. Solche Oxidation sollte ohne Ringöffnung stattfinden,
durch Oxidation der sekundären
Alkoholgruppen zu Ketogruppen oder sie kann mit Ringöffnung zu
Dialdehyden oder Dicarboxylatderivaten stattfinden. Weiter bevorzugt
wurden mindestens 0,2% der Saccharidreste des Alginats an der 2-
oder 3-Position oxidiert und noch weiter bevorzugt wurden mindestens
1,0% der Saccharidreste so oxidiert.
-
Bevorzugterweise fand die Ringoxidation
der Alginatreste mit einer Ringöffnung
zu Dicarboxylsäurederivaten
statt. Als ein Ergebnis weist das oxidierte Alginat gemäß der vorliegenden
Erfindung bevorzugterweise einen Carboxylatgehalt auf, der größer ist als
der der Ausgangsalgininsäure.
Bevorzugterweise wird der Carboxylatgehalt um mindestens 1% erhöht und weiter
bevorzugt gibt es eine mindestens 2%-ige Erhöhung in der Zahl von Carboxylat gruppen,
relativ zu dem entsprechenden unoxidierten Material. Der Carboxylatgehalt
wird wie folgt bestimmt.
-
Eine Probe von oxidiertem Alginat
(ungefähr 0,2
g) wird 0,5 M Natriumhydroxid (5 ml) gelöst und ein paar Tropfen von
0,1 % Phenolphtalein-Indikatorlösung
werden hinzugefügt.
Das überschüssige Natriumhydroxid
wird mit 0,1 M HCl auf den Phenolphtalein-Endpunkt (rot zu klar)
zurück-titriert.
Ein Nullwert wird durch Titrieren von 5 ml 0,1 M Natriumhydroxid
mit 0,1 M HCl bestimmt. Der Wert für den Carboxylgehalt (Gewichtsprozent)
wird unter der Verwendung der Formel:
berechnet,
worin:
C = Prozent Carboxylgehalt
B = Volumen von Standard-HCl,
um Nullprobe zu titrieren (ml)
S = Volumen von Standard-HCl,
um Probe zu titrieren (ml)
M = Molalität von Standard-HCl
W =
Trockengewicht von Probe (g)
(4,5 = Milliäquivalentgewicht von Carboxyl × 100)
-
Das oxidierte Alginat ist im Körper des
Säugers
bioabsorbierbarer und bioverstoffwechselbar. Bevorzugterweise ist
das oxidierte Alginat voll absorbierbar, wenn in den Säugerkörper implantiert.
-
Die oxidierten Alginatderivate weisen
ein im wesentlichen ähnliches
Löslichkeitsverhalten
wie natürlich
auftretende Alginate auf. Insbesondere kann die Löslichkeit
von oxidierten Alginatsalzen durch variieren des Verhältnisses
von Natrium- und Calciumkationen variiert werden. Bevorzugterweise
sind die oxidierten Alginate im wesentlichen in Wasser unlöslich. Dies
impliziert, daß die
oxidierten Alginate bevorzugterweise ein Salz des oxidierten Alginats
und divalenter oder trivalenter Kationen, wie zum Beispiel Calcium-
oder Zinkionen, sind.
-
Bevorzugterweise weisen die oxidierten
Alginate ein Gewicht eines durchschnittlichen Molekulargewichts
im Bereich von 10.000 bis 1.000.000 auf, weiter bevorzugt 50.000
bis 400.000.
-
Die vorliegende Erfindung stellt
auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein oxidiertes
Alginat zur Verfügung,
erhältlich
durch ein Verfahren gemäß der Erfindung.
Das oxidierte Alginat kann zur Herstellung eines Wundverbands, chirurgischen
Implantats oder einer Prothese verwendet werden.
-
Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren zur Herstellung eines oxidierten Alginats zur Verfügung, umfassend
die Schritte von: in Kontakt bringen eines Alginats mit einem Oxidationsmittel
umfassend Distickstofftetroxid in einem inerten Lösungsmittel,
um das Alginat zu oxidieren, gefolgt von Isolieren und Waschen des
oxidierten Alginats. Bevorzugterweise ist das Alginat vor, während und
nach dem Kontaktschritt fest. Zum Beispiel kann das Ausgangsalginat
ein Calciumalginatschaum, -netz oder -Vlies sein.
-
Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung werden nun, unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen weiter beispielhaft
beschrieben, in denen:
-
1 die
Strukturen der Mannuronsäure- und
Guluronsäure-Bausteine
von Alginat vor der Oxidation zeigt;
-
2 ein
Ionenaustauschchromatogramm von Abbauprodukten von oxidierter Algininsäure, die in
Serum für
48 Stunden inkubiert wurde, zeigt; und
-
3 ein
Vergleichsionen-Austauschchromatogramm von nicht-oxidierter Algininsäure zeigt,
in Serum inkubiert für
48 Stunden.
-
Beispiel 1
-
Ein oxidiertes Algininsäurederivat
wurde wie folgt hergestellt.
-
20 g von Algininsäure (Sigma Chemical Company)
wurden in 150 g Fluorkohlenwasserstoff-Lösungsmittel
(Lösungsmittel
FC77, geliefert von 3M Corporation) suspendiert. 20 g von flüssigem Distickstofftetroxid
wurden sorgfältig
in 50 g des selben fluorierten Lösungsmittel
gelöst
und langsam zu der Alginatsuspension über 2 Stunden bei Raumtemperatur
hinzugefügt.
Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für weitere 4 Stunden reagieren
gelassen. Die erhaltene Schlämme
wurde in einem Buchner-Trichter mit einer eingebauten porösen Glasfrite abgegossen
und das oxidierte Alginat wurde gesammelt. Die oxidierte Algininsäure wurde
durch Aufschlämmen
in Fluorkohlenwasserstoff-Lösungsmittel für 10 Minuten
gewaschen und durch Buchner-Filtration gesammelt. Die oxidierte
Algininsäure
wurde dann viermal in 90% Isopropanol und zweimal in 100% Isopropanol
gewaschen, bevor es ihm erlaubt wurde, an der Luft zu trocknen.
-
Die oxidierte Algininsäure wurde
zu ihrem Natriumsalz durch Reagieren mit 12 g von Natriumacetat,
gelöst
in 200 ml destilliertem Wasserüberführt. Das
Natriumsalz der oxidierten Algininsäure wurde durch Hinzufügen eines Überschusses
von Calciumchlorid zu der oxidierten Natriumalginatlösung re-präzipitiert.
Das Calciumalginat wurde durch Zentrifugation gesammelt, ausgiebig
in destilliertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.
-
Das erhaltene Material ist ein cremefarbenes Pulver,
das in 0,5 molarer Natriumhydroxidlösung löslich ist.
-
Beispiel 2
-
Der Abbau der oxidierten Algininsäure, hergestellt
in Beispiel 1, bei Inkubation in Serum wird wie folgt studiert.
-
Eine Probe von oxidierter Algininsäure, hergestellt
und beschrieben in Beispiel 1, wurde zu Serum bei einer Konzentration
von 10 mg/ml hinzugefügt
und der pH wurde auf 7,4 unter der Verwendung von 0,5 M NaOH wieder
eingestellt. Die Dispersion wurde dann bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. Im
Anschluß an
die Inkubation wurde die Probe durch einen 0,2 μm Filter passiert. Eine 10 ml
Probe der Filtratlösung
wurde dann in ein Dionex (eingetragene Marke) 500 Ionen-Austauschchromatographiesystem
injiziert, das mit einer Carbopac VA 1 Anionenaustauschsäule (25
cm × 4
mm) mit Carbopac PA 1 Guard-Säule
(5 cm × 4
mm) ausgestattet war. Die mobile Phase war wie folgt: Eluent A – ultrareines Wasser;
Eluent B – 200
mN Natriumhydroxid; und Eluent C – 2 M Natriumacetat.
-
Das Lösungsgradientenprogramm war
wie folgt:
Anfänglich-100%
B; 0–20
Minuten – 86%
A, 10% B, 4% C; 20–70
Minuten – von
86% A, 10% B, 4% C zu 40% A, 10% B, 50% C; 70–80 Minuten – 100% B.
-
Die Probe wurde für 15 Minuten in den Lauf hinein
injiziert und die Daten wurden von dem Moment an dem die Probe injiziert
wurde, bis zum Ende des Laufs gesammelt.
-
Das in 2 gezeigte
Chromatogramm zeigt eine Zahl von Elutionspeaks zwischen 10 Minuten und
50 Minuten, die verschiedenen Fragmenten der oxidierten Algininsäure entsprechen,
die Abbau im Serum erfahren hat. Der Peak, der Mannuronsäure entspricht
(in einem vergleichbaren Lauf mit hinzugefügter reiner Mannuronsäure identifiziert),
ist markiert.
-
Dieses Beispiel zeigt, daß oxidierte
Algininsäure
in Serum bei 37°C
einen Abbau in eine Zahl von löslichen
Komponenten erfährt.
-
Beispiel 3 (Vergleichsbeispiel)
-
Das experimentelle Verfahren von
Beispiel 2 wurde exakt mit nicht oxidierter Algininsäure anstelle der
oxidierten Algininsäure
wiederholt. Das erhaltene Chromatogramm ist in 3 gezeigt.
Es kann gesehen werden, daß das
Chromatogramm für
Algininsäure
im wesentlichen frei von den Elutionspeaks für Abbauprodukte ist, die für die oxidierte
Algininsäure gesehen
werden. Dieses steht im Einklang mit klinischen Beobachtungen, daß unoxidierte
Alginate in vivo keinen Abbau in löslichen Komponenten erfahren.
-
Beispiel 4
-
Proben von oxidierter Algininsäure wurden wie
in Beispiel 1 beschrieben präpariert,
jedoch mit verschiedenen Oxidationszeiten in der Distickstofftetroxidlösung. Der
Carboxylatgehalt der oxidierten Algininsäuren wurde dann durch Titration
wie oben beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse waren wie folgt:
| Oxidationszeit
(Std.) | Carboxylatgehalt (Gew.%) |
| 0 (Vergleichsbeispiel) | 23,12 |
| 2 | 23,15 |
| 4 | 23,51 |
| 20 | 24,90 |
| 72 | 27,25 |
-
Es kann daher gesehen werden, daß das Ausmaß von Oxidation,
um so neue Carboxylatgruppen zu bilden, mit der Zeit ansteigt. Es
kann auch gesehen werden, daß relativ
wenig zusätzliche
Carboxylatgruppen, z. B. ungefähr
1,5% basierend auf den anfänglichen
Carboxylatgruppen gebraucht werden, um das bioabsorbierbare Alginat
nach 4 Stunden herzustellen.
-
Beispiel 5
-
Die Eigenschaften von oxidierter
Algininsäure,
hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden durch Thermogravimetrie
und differentielles Scanning-Calorimetrie (DSC) in Luft von 30°C bis 200°C bei 10°C pro Minute
untersucht. Die TGA-Ergebnisse waren wie folgt:
| Oxidationszeit
(Std.) | Gewichtsverlust
(%) |
| 0 (Vergleichsbeispiel) | 16,98% |
| 20 | 25,09% |
| 72 | 38,31 |
-
Zusätzlich zeigten die oxidierten
Proben ein deutliches Endotherm oberhalb 100°C und veränderten ihre Farbe zu Schwarz.
-
Die oben angegebenen Ausführungsformen wurden
lediglich als Beispiel beschrieben. Viele andere Ausführungsformen,
die innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche fallen, werden dem fachkundigem
Leser ersichtlich sein.
-
Beispiel 6
-
Die Eigenschaften von oxidiertem
Alginat in vivo wurden wie folgt untersucht:
-
(1) Herstellung von Vergleichsalginatkissen
-
Calciumalginat (0,5 g) und Natriumalginat
(1 g) wurden in 100 ml destilliertem Wasser homogenisiert und in
eine 10 cm × 10
cm Petrischale gegossen. Die Lösung
wurde gefroren, gefriertrocknet und das so erhaltene Kissen in 1 × 0,5 cm
Blocks geschnitten. Diese wurden γ-Bestrahlung-sterilisiert.
-
(2) Herstellung von oxidierten
Alginatkissen
-
Oxidiertes Calciumalginat (0,5 g)
und oxidiertes Natriumalginat (1 g), hergestellt wie in Beispiel
1 beschrieben, wurden in 100 ml destilliertem Wasser homogenisiert
und in eine 10 cm × 10
cm Petrischale gegossen. Die Lösung
wurde gefroren, gefriergetrocknet und das erhaltene Kissen in 1 × 0,5 cm
Blocks geschnitten. Diese wurden γ-Bestrahlung-sterilisiert.
-
(3) In vivo-Untersuchung
-
Zwölf Sprague Dawley-Ratten wurden
in der Studie verwendet. Unter Standardoperationsbedingungen wurden
zwei Kissen von jedem Material auf der ventralen Oberfläche jeder
Ratte subkutan implantiert. Vier Ratten wurden an 3, 7 und 14 Tagen nach
Implantation getötet.
Die Alginatkissen wurden zu der Zeit vollständig mit der darüberliegenden
Dermis und der darunterliegenden Muskulatur entfernt. Die Proben
wurden in Formaldehyd fixiert und für Routinehistologie verarbeitet.
Schnitte der Alginatkissen wurden von so dicht wie möglich von
der Mitte der Kissen hergestellt. Diese wurden mit entweder H & E oder Masson's-Trichrom gefärbt und
unter einem Lichtmikroskop untersucht. Die Zahl von Neutrophilen,
die in jedem Schnitt vorhanden waren, wurde als ein Indikator der
Intensität
der entzündlichen
Reaktion verwendet.
-
Die oxidierten Alginatkissen wurden
als bei einer schnelleren Rate resorbierend gefunden, als diejenigen,
die aus normalen Alginat hergestellt wurden. Die oxidierten Alginatpads
wurden auch als eine verringerte entzündliche Antwort hervorrufend
gefunden, wenn mit dem normalen Material verglichen.
