DE69718680T2

DE69718680T2 - Beta-Hydroxyasparaginsäurederivate

Info

Publication number: DE69718680T2
Application number: DE69718680T
Authority: DE
Inventors: Bruno Lebrun; Masahiro Sakaitani; Keiko Shimamoto; Yoshimi Yasuda
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2017-10-25
Also published as: DE69710847D1; DE69718680D1; US6147113A; JPH10130215A; EP0990640B1; EP0844234B1; EP0990640A3; EP0948962A3; EP0948962A2; EP0844234A3; EP0844234A2; JP3936418B2; DE69710847T2; EP0990640A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hemmer der L-Glutamataufnahme und insbesondere β-Hydroxyasparaginsäurederivate, die eine hemmende Wirkung die Glutamataufnahme-Aktivität von L-Glutamat-Transportern zeigen.
Die vorliegenden Verbindungen stellen Stützpunkte für die Entwicklung von Hemmern von L-Glutamat-Transportern bereit, um Glutamat aufzunehmen und für die Behandlung von Neuropathien oder neurodegenerativen Erkrankungen, wie Epilepsie, Huntington-Erkrankung, amyotropher lateraler Sklerose (ALS) und Alzheimer-Erkrankung.
L-Glutamat ist als exzitatorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem bei Säugetieren bekannt, dieser induziert nicht nur eine schnelle Neurotransmission zwischen Synapsen sondern nimmt auch an physiologischen Prozessen höherer Ordnung und Komplexität sowie dem Gedächtnis und Lernen teil. Die exzitatorische Neurotransmission zwischen Synapsen beginnt mit der Freisetzung von Glutamat aus Präsynapsen und endet mit der schnellen Aufnahme von Glutamat durch hochaffine Glutamat-Transporter, die in den Präsynapsen sowie in den Glialzellen vorliegen aus dem synaptischen Spalt (Attwaell, D. und Nicholls, D., TIPS 68-74, 1991).
Bei bestimmten genetischen neurodegenerativen Erkrankungen wurde über eine Abnahme der natriumabhängigen Glutamataufnahme-Aktivität im Gehirn einiger Patienten berichtet (Rothstein, J. D. et al., N. Eng. J. Med. 326, 1464-1468, 1992). Dies zog die Aufmerksamkeit von Forschern auf die Funktion von Glutamat-Transportern in Verbindung mit diesen Krankheiten auf sich, insbesondere auf die Expression der Funktion und Hemmung davon.
Vorherige Studien über Glutamat-Transporter haben sich auf die Synaptosomen konzentriert, die aus dem Gehirn oder Membranproben, hergestellt aus Niere oder Dünndarm, hergestellt wurden. Molekularbiologische Ansätze wurden ebenfalls seit 1992 unternommen, als cDNAs von natriumabhängigen hochaffinen Glutamat-Transportern kloniert wurden (Pines, G. et al., Nature 360, 464-467, 1992; Storck, T. et a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10955-10959, 1992; Kanai, , Y. et al., Nature 360, 467-471, 1992). Kürzlich wurden Glutamat-Transportergene menschlichen Ursprungs kloniert und die Subtypen EAAT1 bis 5 gruppiert (Arriza, J. L. et al., J. Neurosci. 14, 5559-5569, 1994; Arriza, J. L. et. al., Nature, 375, 599-603, 1995; Arriza, J. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 4155, 1997).
Bis jetzt wurden Glutamataufnahme-Hemmer, wie Threo-β- hydroxyaspartat und CCG-III [(2S,1'S,2'R)-2-(2- Carboxycyclopropyl)glycin] als Ergebnis eines Screenens auf Glutamataufnahme-Hemmer über den Weg der Synaptosomen entdeckt. Diese Verbindungen sind Antagonisten, die selbst als Substrate durch die Transport aufgenommen werden, und daher die Glutamataufnahme kompetitiv hemmen.
Andererseits haben elektrophysiologische Studien gezeigt, daß Glutamataufnahme-Hemmer, wie Kainsäure und Dihydrokainsäüre, als Blockiermittel anstatt als kompetitive Substrate wirken, da sie die Glutamataufnahme hemmen ohne durch die Transporter aufgenommen zu werden. Für diese Verbindungen wurden gezeigt, daß sie selektiv auf EAAT2 (GLT-1 Typ) der fünf EAAT Subtypen wirken (Arriza, J. L. et al., J. Neurosci. 14, 5559-5569, 1994). Diese Verbindungen wirken jedoch auch auf die Glutamat-Rezeptoren vom Ionenkanaltyp, um eine starke Neuroexzitation zu induzieren.
Unter diesen Umständen besteht ein Bedarf an der Entwicklung verschiedener Hemmer für Glutamat-Transporter, insbesondere diejenigen, die als Blocker wirken, um die Beziehung zwischen Glutamat-Transportern und Neuropathien oder neurodegenerativen Erkrankungen, wie Epilepsie, Huntington- Erkrankung, amyotropher lateraler Sklerose (ALS) und Alzheimer-Erkrankung aufzuklären.
Die Erfinder haben bereits ein System zur Evaluierung der Hemmung der Glutamataufnahme durch Rinder- oder humane Glutamat-Transporter, exprimiert auf Xenopus Oozyten von Rinder- oder humanem Glutamat-Transportergenen, die darin injiziert wurden, entwickelt. Ausgedehnte Studien bei der Suche nach Glutamataufnahme-Hemmern unter Verwendung dieses Systems bewiesen, daß neue β-Hydroxyasparaginsäurederivate der folgenden chemischen Formel (1) die Glutamataufnahme durch diese Transporter hemmen und daß sie weiterhin nicht einen Strom erzeugen, sondern statt dessen den nach Innen gerichteten Strom, der durch die Aufnahme von Glutamat in die Transporter-exprimierenden Oozyten induziert wurde, vermindern. Die vorliegende Erfindung wurde aufgrund der obigen Befunde erreicht.
wobei R eine aromatische Acylgruppe darstellt, die am Ring substituiert sein kann, eine geradkettige oder verzweigte niederaliphatische Acylgruppe, eine Arylgruppe, die am Ring substituiert sein kann, eine Aralkylgruppe, die am Ring durch substituiert sein kann, oder eine geradkettige oder verzweigte Niederalkylgruppe. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung β-Hydroxyasparaginsäurederivate der chemischen Formel (1) und deren Salze als Blocker der Glutamataufnahme bereit.
In der Formel (1) beinhaltet die durch R dargestellte aromatische Acylgruppe zum Beispiel Benzoyl, Naphthoyl oder eine Gruppe, worin ein oder mehrere Wasserstoffatome am Ring durch ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Methoxygruppe substituiert sein können. Die geradkettige oder verzweigte niederaliphatische Acylgruppe, dargestellt durch R, beinhaltet Acetyl, Propanoyl, n-Butanoyl, sec-Butanoyl, n-Pentanoyl, sec-Pentanoyl.
In der Formel (1) beinhaltet die durch R dargestellte Arylgruppe Phenyl, Naphthyl, wobei ein oder mehrere Wasserstoffatome am Ring durch ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Methoxygruppe substituiert sein können. Die durch R dargestellte Aralkylgruppe beinhaltet Benzyl, Phenethyl, worin ein oder mehrere Wasserstoffatome am Ring durch ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Methoxygruppe substituiert sein können. Die geradkettige oder verzweigte Niederalkylgruppe, dargestellt durch R, beinhaltet Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch herkömmliche Verfahren in ihre Salze ungewandelt werden. Diese Salze beinhalten Alkalimetallsalze, wie Natriumsalz und Kaliumsalz; Erdalkalimetallsalze, wie Calciumsalz; Ammoniumsalz; wobei all diese in der vorliegenden Erfindung beinhaltet sind. Alle vier Isomere jeder erfindungsgemäßen Verbindung, d. h. (2S, 3S), (2R, 3R), (2S, 3R) und (2R, 3S) Isomere, die sich aus der Gegenwart von asymmetrischen Kohlenstoffatomen an den 2- und 3-Positionen ergeben, sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In der Beziehung zwischen der Struktur und der Aktivität der Verbindungen erwies es sich als wichtig für die erfindungsgemäßen Verbindungen, daß sie eine große Gruppe als Substituent R aufweisen und eine relative Konfiguration von "Threo" zwischen den 2- und 3-Positionen, um eine starke Aktivität zu zeigen. Jede dieser großen Gruppe als gewünschter Substituent R kann durch ein herkömmliches Verfahren gemäß unten dargestelltem Syntheseschema eingeführt werden. Jedes der vier Isomere kann aus β-Hydroxyasparaginsäure mit der entsprechenden Konfiguration synthetisiert werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können wie folgt synthetisiert werden. Zum Beispiel können die Verbindungen, in denen R eine Acylgruppe ist, durch Schutz der Aminogruppe und der Carboxylgruppe durch ein herkömmliches Verfahren synthetisiert werden, dann Umwandeln der Hydroxylgruppe in die gewünschte Acyloxygruppe, gefolgt vom Entfernen der Schutzgruppen gemäß dem folgenden Schema:
(4) R=COCH&sub3;
(5) R=COCH&sub2;CH&sub3;
(6) R=COC&sub6;H&sub5;
(7) R=CO-1-C&sub1;&sub0;H&sub7;
(8) R=CO-2-C&sub1;&sub0;H&sub7;
(9) R=COCH&sub3;
(10) R=COCH&sub2;CH&sub3;
(11) R=COC&sub6;H&sub5;
(12) R=CO-1-C&sub1;&sub0;H&sub7;
(13) R=CO-2-C&sub1;&sub0;H&sub7;
worin Boc eine t-Butoxycarbonylgruppe bedeutet, t-Bu bedeutet eine tert-Butylgruppe und R bedeutet eine gewünschte Acylgruppe. Gemäß dem obigen Schema können die eine gewünschte Acylgruppe als R tragenden Verbindungen durch Umsetzung der Verbindung (3) mit Essigsäureanhydrid (worin R Acetyl ist) oder mit Acylchlorid, entsprechend dem gewünschten R, erhalten werden. Zum Beispiel wird (2S*, 3S*)-3-Acetoxyasparaginsäure (9), worin R Acetyl ist, durch Umsetzung der Verbindung (3) mit Essigsäureanhydrid erhalten, (2S*, 3S*)-3-Propanoyloxyasparaginsäure (10), worin R Propanoyl ist, wird durch Reagieren der Verbindung (3) mit Propionylchlorid erhalten, und (2S*, 3S*)-3- Benzoyloxyasparaginsäure (11), worin R Benzoyl ist, wird durch Reagieren der Verbindung (3) mit Benzoylchlorid erhalten. Hier bedeutet (2S*, 3S*) eine Mischung von Threoisomeren mit den Konfigurationen (2S, 3S) und (2R, 3R).
Die gebildeten Etherverbindungen, worin R eine Aryl-, Aralkyl- oder Alkylgruppe ist, können durch Schutz der Aminogruppe und der Carboxylgruppe durch ein herkömmliches Verfahren, dann Einführen eines gewünschten Substituenten anstelle der Hydroxylgruppe, gefolgt vom Entfernen der Schutzgruppen, synthetisiert werden. Zum Beispiel kann (2S*, 3S*)-3-Benzoyloxyasparaginsäure (15), worin R Benzyl ist, ausgehend von dem vorherigen Synthesezwischenprodukt (3) gemäß dem folgenden Schema synthetisiert werden:
worin Bzl Benzyl darstellt, Boc bedeutet eine t-Butoxycarbonylgruppe und t-Bu bedeutet tert-Butyl. Wenn das Benzylbromid durch ein gewünschtes Aryl-, Aralkyl- oder Alkylbromid in diesem Schema ersetzt wird, kann eine Verbindung mit dem entsprechenden Substituenten R erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen die Glutamataufnahme in Oozyten in einem System von Xenopus Oozyten, die Rinder BGLAST und humanes EAAT1 oder EAAT2 aus darin eingeführten cRNAs exprimieren. In denselben Oozyten vermindern die erfindungsgemäßen Verbindungen den durch die Glutamataufnahme induzierten Strom, anstatt selbst einen Strom zu erzeugen. Diese Tatsache zeigt, daß die Verbindungen als Blockierer wirken. Es wird daher angenommen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen für das Verständnis der Rolle vom Glutamat-Transportern bei neurodegenerativen Erkrankungen nützlich sind und daß für die Behandlung dieser Neuropathien durch Untersuchung der Beziehung zwischen Struktur und Aktivität der Arzneimittel usw. vielversprechend sind.
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch darauf zu begrenzen.

Beispiele

Beispiel 1. Synthese von (2S*, 3S*)-3-Acetoxyasparaginsäure (9)

Schritt 1. Synthese von di-t-Butyl (2S*, 3S*)-N-t- Butoxycarbonyl-3-hydroxyaspartat (3)

Zu 1,37 g (5,5 mmol) einer bekannten Verbindung (2S*, 3S*)-N- t-Butoxycarbonyl-3-hydroxyasparaginsäure (2) wurden 10,5 ml (44 mmol) N,N-Dimethylformamid-di-t-butylacetal bei Raumtemperatur unter Stickstoffstrom zugegeben. Dann wurde die Mischung unter Rühren für 2 Stunden auf 60ºC erwärmt. Die Mischung mit Ether extrahiert und die organische Schicht wurde mit Wasser, mit gesättigter Salzlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rest wurde durch Silicagel- Säulenchromatographie gereinigt (Ethylacetat/Hexan = 1/9).
Das erhaltene ölige Produkt wurde aus Hexan auskristallisiert, um 1,68 g der obigen Verbindung (3) zu ergeben (Ausbeute 85%).
Eigenschaften: farblose Prismen
Schmelzpunkt: 106-107ºC
¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, δppm): 1,40 (s, 9H), 1,50 (s, 18H), 3,12 (d, 1H, J = 5,0 Hz), 4,53 (dd, 1H, J = 5,0, 2,0 Hz), 4,68 (d, 1H, J = 10 Hz), 5,14 (d, 1H, J = 10 Hz).

Schritt 2. Synthese von di-t-Butyl (2S*, 3S*)-3-Acetoxy-N- t-butoxycarbonylaspartat (4)

Zu einer Lösung von 500 mg (1,38 mmol) der in Schritt 1 erhaltenen Verbindung (3) in Pyridin (3 ml) wurden 1 ml Essigsäureanhydrid hinzugefügt und die Mischung wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde mit Ether extrahiert und die organische Schicht wurde mit Wasser und mit gesättigter Salzlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Fest wurde durch Silicagel- Säulenchromatographie gereinigt (Ethylacetat/Hexan = 1/9), um 550 mg der obigen Verbindung (4) zu ergeben (Ausbeute 99%).
¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, δppm): 1,40 (s, 9H), 1,43 (s, 9H), 1,50 (s, 9H), 2,13 (s, 3H), 4,90 (brd, 1H, J = 10 Hz), 5,18 (brd, 1H, J = 10 Hz), 5,50 (brs, 1H).

Schritt 3. Synthese von (2S*, 3S*)-3-Acetoxyasparaginsäure (9)

Zu einer Lösung von 202 mg (0,50 mmol) der in Schritt 2 erhaltenen Verbindung (4) in Chloroform (2 ml) wurden 2 ml Trifluoressigsäure hinzugefügt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rest wurde durch C18 Silicagel- Säulenchromatographie gereinigt (RP-C18, destilliertes Wasser), um 43 mg der obigen Verbindung (9) zu ergeben (Ausbeute 45%).
¹H NMR (400 MHz, D&sub2;O, δppm): 2,05 (s, 3H), 4,19 (d, 1H, J = 2 Hz), 5,38 (d, 1H, J = 2 Hz).

Beispiel 2. Synthese von (2S*, 3S* )-3-Propanoyloxyasparaginsäure (10)

Schritt 1. Synthese von di-t-Butyl (2S*, 3S*)-N-t- Butoxycarbonyl-3-propanoyloxyaspartat (5)

Zu einer Lösung von 300 mg (0,83 mmol) der Verbindung (3) in CH&sub2;Cl&sub2; (6 ml) wurden 0,5 ml Triethylamin und 0,3 ml Propionylchlorid hinzugefügt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Die Mischung wurde mit Ether extrahiert und die organische Schicht mit Wasser und dann mit gesättigter Salzlösung gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rest wurde durch Silicagel- Säulenchromatographie gereinigt (Ethylacetat/Hexan = 1/9), um 303 mg der obigen Verbindung (5) zu ergeben (Ausbeute 87%).
¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, δppm): 1,12 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,40 (s, 9H), 1,42 (s, 9H), 1,50 (s, 9H), 2,40 (m, 2H), 4,88 (brd, 1H, J = 11Hz), 5,15 (brd, 1H, J = 11 Hz), 5,48 (brs, 1H).

Schritt 2. Synthese von (2S*, 3S* )-3-Propanoyloxyasparaginsäure (10)

Das Verfahren von Schritt 3 aus Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgehend von 195 mg (0,47 mmol) der Verbindung (5), um 92,5 mg der obigen Verbindung (10) zu ergeben (Ausbeute 96%).
¹H NMR (400 MHz, CD&sub3;OD, δppm) 1,12 (t, 3H, J = 7 Hz), 2,45 (q, 2H, J = 7 Hz), 4,53 (d, 1H, J = 2 Hz), 5,72 (d, 1H, J = 2 Hz).

Beispiel 3. Synthese von (2S*, 3S* )-3-Benzoyloxyasparaginsäure (11)

Schritt 1. Synthese von di-t-Butyl (2S*, 3S*)-3-Benzoyloxy- N-t-butoxycarbonylaspartat (6)

Das Verfahren von Schritt 1 aus Beispiel 2 wurde wiederholt, ausgehend von 300 mg (0,83 mmol) der Verbindung (3) und Ersatz von Propionylchlorid durch Benzoylchlorid, um 291 mg des Propionylchlorids (6) zu ergeben (Ausbeute 75%).
¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, δppm): 1,30 (s, 9H), 1,40 (s, 9H), 1,43 (s, 9H), 4,95 (brd, 1H, J = 10 Hz), 5,23 (brd, 1H, J = 10 Hz), 5,60 (d, 1H, J = 4 Hz), 7,35 (t, 2H, J = 6 Hz), 7,50 (t, 1H, J = 8 Hz), 7,92 (d, 2H, J = 8 Hz).

Schritt 2. Synthese von (2S*, 3S* )-3-Benzoyloxyasparaginsäure (11)

Das Verfahren von Schritt 3 aus Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgehend von 152 mg (0,33 mmol) der Verbindung (6), um 66 mg der obigen Verbindung (11) zu ergeben (Ausbeute 80%).
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;, δppm): 4,20 (d, 1H, J = 10 Hz), 5,36 (d, 1H, J = 10 Hz), 7,50 (t, 2H, J = 8 Hz), 7,68 (t, 1H, J = 8 Hz), 8,15 (d, 2H, J = 8 Hz).
(DMSO-d&sub6; bedeutet Dimethylsulfoxid, worin alle Wasserstoffe deuteriert sind.)

Beispiel 4. Synthese von (2S*, 3S*)-3-(1-Naphthoyl)oxy- asparaginsäure (12)

Das Verfahren von Schritt 1 aus Beispiel 2 wurde wiederholt, ausgehend von 100 mg (0,27 mmol) der Verbindung (3) und Ersatz von Propionylchlorid durch 1-Naphthoylchlorid, um di-t-Butyl (Propinylchlorid)-N-t-butoxycarbonyloxy-3-(1- naphthoyl)aspartat (7) zu ergeben, das in derselben Weise wie im Schritt 3 aus Beispiel 1 ohne Aufreinigung behandelt wurde, um 82,5 mg der obigen Verbindung (12) zu ergeben (Ausbeute in zwei Schritten 70%).
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;, bppm): 4,23 (d, 1H, J = 12 Hz), 5,50 (d, 1H, J = 12 Hz), 7,63 (m, 3H), 8,03 (d, 1H, J = 9 Hz), 8,20 (d, 1H, J = 9 Hz), 8,40 (d, 1H, J = 9 Hz), 8,80 (d, 1H, J = 9 Hz).

Beispiel 5. Synthese von (2S*, 3S*)-3-(2-Naphthoyl)oxy- asparaginsäure (13)

Schritt 1. Synthese von di-t-Butyl (2S*, 3S*)-N-t- Butoxycarbonyl-3-(2-naphthoyl)oxyaspartat (8)

Das Verfahren von Schritt 1 aus Beispiel 2 wurde wiederholt, ausgehend von 300 mg (0,83 mmol) der Verbindung (3) und Ersatz von Propionylchlorid durch 2-Naphthoylchlorid, um 95,5 mg der obigen Verbindung (8) zu ergeben (Ausbeute 22%).
¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, δppm): 1,35 (s, 9H), 1,42 (s, 9H), 1,48 (s, 9H), 5,05 (brd, 1H, J = 10 Hz), 5,37 (brd, 1H, J = 10 Hz), 5,72 (s, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,83 (s, 2H, J = 10 Hz), 7,95 (d, 1H, J = 10 Hz), 8,00 (d, 1H, J = 10 Hz), 8,60 (s, 1H).

Schritt 2. Synthese von (2S*, 3S*)-3-(2-Naphthoyl)oxy- asparginsäure (13)

Das Verfahren von Schritt aus Beispiel 1 wurde wiederholt, ausgehend von 82 mg (0,16 mmol) der Verbindung (8), um 46 mg der obigen Verbindung (13) zu ergeben (Ausbeute 95%).
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;, δppm): 4,25 (d, 1H, J = 10 Hz), 5,43 (d, 1H, J = 10 Hz), 7,63 (m, 2H), 8,05 (m, 4H), 8,83 (s, 1H).

Beispiel 6. Synthese von (2S*, 3S* )-3-Benzyloxyasparaginsäure (15)

Schritt 1. Synthese von di-t-Butyl (2S*, 3S*)-3-Benzyloxy- N-t-butoxycarbonylaspartat (14)

Zu einer Lösung von 78 mg (0,22 mmol) der Verbindung (3) in DMF (3 ml) wurden 13 mg (0,32 mmol) Natriumhydrid zugefügt sowie 16 mg (0,04 mmol) tetra-n-Butylammoniumiodid bei -20ºC und die Mischung wurde für 10 Minuten gerührt, dann wurden 38 ul (0,32 mmol) Benzylbromid zugefügt und die Mischung wurde bei 0ºC für 1 Stunde gerührt. Die Mischung wurde mit Ether extrahiert und die organische Schicht wurde mit Wasser und dann mit gesättigter Salzlösung gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel würde abdestilliert und der Rest wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt (Ether/Hexan = 1/9), um 65 mg der obigen Verbindung (14) zu ergeben (Ausbeute 65%).
¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, δppm): 1,40 (s, 18H), 1,50 (s, 9H), 4,40 (d, 1H, J = 11 Hz), 4,42 (d, 1H, J = 3 Hz), 4,73 (dd, 1H, J = 3, 10,5 Hz), 4,80 (d, 1H, J = 11 Hz), 5,26 (d, 1H, J = 10,5 Hz), 7,32 (m, 5H).

Schritt 2. Synthese von (2S*, 3S* )-3-Benzyloxyasparaginsäure (15)

Zu einer Lösung von 65 mg (0,14 mmol) der Verbindung (14) in Chloroform (2 ml) wurden 2 ml Trifluoressigsäure zugegeben und dann wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert und der Rest wurde einer Säulenchromatographie auf einem Ionenaustauschharz (Dowex 50Wx4) unterzogen und mit Wasser gewaschen, dann mit 1 N wäßrigem Ammoniak eluiert, um 23 mg der obigen Verbindung (15) zu ergeben (Ausbeute 65%).
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;, δppm): 4,01 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 4,34 (d, 1H, J = 2,5 Hz), 4,44 (d, 1H, J = 11,5 Hz), 4,73 (d, 1H, J = 11,5 Hz), 7,42 (m, 5H).

Evaluierungsbeispiel 1.

Bestimmung der Glutamataufnahme-Hemmung in Xenopus Oozyten injiziert mit Rinder-Glutamat-Transportergen (BGLAST)

Gemäß dem Protokoll unserer vorherigen Patentanmeldung (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 126250/95) wurden Xenopus Oozyten erhalten, die das Rinder-Glutamat- Transportergen BGLAST exprimierten. Die Glutamataufnahme- Aktivität wurde durch Flüssigszintillation gemessen, wobei die Radioaktivität bei komplett lysierten Oozyten gezählt wurde, die sie nach Inkubation mit 1 ptM L-[¹&sup4;C] Glutamat (11 GBq/mmol) haben und jede Probe bei 100 uM für 20 Minuten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, z. B. (2S*, 3S*)-3- Benzoyloxyasparaginsäure (11), (2S*, 3S*)-3-(1- Naphthoyl)oxyasparaginsäure (12) und (2S*, 3S*)-3-(2- Naphthoyl)oxyasparaginsäure (13) zeigten eine Glutamat aufnahmehemmende Aktivität von 79%, 63% bzw. 63%.

Evaluierungsbeispiel 2.

Bestimmung der Glutamataufnahme-Hemmung in Xenopus Oozyten injiziert mit humanem Glutamat-Transportergen (EAAT1 oder 2)

Die Glutamataufnahme-Aktivität von (2S*, 3S*)-3- Benzyloxyasparaginsäure (15) wurde in derselben Weise wie im Evaluierungsbeispiel 1 unter Verwendung von Oozyten, die cRNA von humanem EAAT1 oder EAAT2 exprimierten, gemessen, hergestellt dem vorherigen Protokoll. Die Verbindung (15) zeigte eine Hemmung von 74% für EAAT1 und 99% für EAAT2 bei einer Konzentration von 100 uM.

Evaluierungsbeispiel 3.

Elektrophysiologische Evaluierung in Xenopus Oozyten injiziert mit Rinder-Glutamat-Transportergen (BGLAST)

In Oozyten, die cRNA von Rinder BGLAST, hergestellt gemäß dem vorherigen Protokoll, exprimierten, induzierten 100 um Glutamat einen nach innen gerichteten Strom von ungefähr 125 nA. Die erfindungsgemäßen Verbindungen (2S*, 3S*)-3- Benzoyloxyasparaginsäure (11), (2S*, 3S*)-3-(1- Naphthoyl)oxyasparaginsäure (12) und (2S*, 3S*)-3-(2- Naphthoyl)oxyasparaginsäure (13) injizierten jedoch keinen nach innen gerichteten Strom bei einer Konzentration von 100 uM. Wenn 10 uM Glutamat und jede dieser Verbindungen mit 100 uM gleichzeitig zugefügt wurden, war der nach innen gerichtete Strom, der durch die Glutamataufnahme induziert wurde, deutlich reduziert. Die Hemmungsrate durch die Verbindungen (11), (12) bzw. (13) betrug 50%, 40% bzw. 20%.
Diese Ergebnisse belegen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen als Hemmer von Glutamat-Transportern geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung stellt β-Hydroxyasparaginsäurederivate und Salze bereit, die Hemmer von Glutamat-Transportern sind. Die neuen Verbindungen hemmen die Glutamataufnahme-Aktivität und sind daher nicht nur geeignete biochemische Reagenzien für das Verständnis der Funktion von Glutamat-Transportern sondern auch vielversprechende Werkzeuge für die Entwicklung von Behandlungsverfahren für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen durch solche. Studien.

Claims

1. Zusammensetzung zur Hemmung der Aufnahme von Glutamat in Zellen, die L-Glutamat-Transporter exprimieren, umfassend β-Hydroxyasparaginsäurederivat der folgenden chemischen Formel (1):

wobei R eine aromatische Acylgruppe darstellt, die am Ring durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein kann, ausgewählt aus einem Halogenatom, einer Hydroxylgruppe und einer Methoxygruppe; eine geradkettige oder verzweigte niederaliphatische Acylgruppe, ausgewählt aus Acetyl, Propanoyl, n-Butanoyl, sec-Butanoyl, n-Pentanoyl und sec-Pentanoyl; eine Arylgruppe, die am Ring durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein kann, ausgewählt aus einem Halogenatom, einer Hydroxylgruppe und einer Methoxygruppe; eine Aralkylgruppe, die am Ring durch ein oder mehrere Substituenten substituiert sein kann, ausgewählt aus einem Halogenatom, einer Hydroxylgruppe und einer Methoxygruppe; oder eine geradkettige oder verzweigte Niederalkylgruppe, ausgewählt aus Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl und tert- Butyl; und ein Salz davon.

2. Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, wobei das β-Hydroxyasparaginsäurederivat ein Threoisomer ist, wobei die relative Konfiguration der 2- und 3-Positionen Threo ist.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff ein β-Hydroxyasparaginsäurederivat gemäss Anspruch 1, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 3, wobei das β-Hydroxyasparaginsäurederivat das Threoisomer ist, bei dem die relative Konfiguration der 2- und 3-Positionen Threo ist.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 3 oder 4 zur Behandlung von Neuropathie oder einer neurodegenerativen Erkrankung, wobei L-Glutamat- Transporter am Fortgang oder der Entwicklung der Erkrankung beteiligt sind.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 5, wobei die Neuropathie oder neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Epilepsie, Huntington-Erkrankung, amyotropher lateraler Sklerose (ALS) und Alzheimer-Erkrankung.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei 0,1 bis 100 mg des Wirkstoffs in einer Dosiseinheit enthalten sind.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 3 bis 7, die eine orale Zusammensetzung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Sirup, Körnchen oder Pulver, oder eine injizierbare Flüssigkeit oder eine lyophilisierte Zusammensetzung ist.

9. Verwendung eines β-Hydroxyasparaginsäurederivats gemäss Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Neuropathie oder einer neurodegenerativen Erkrankung, wobei L-Glutamat-Transporter am Fortgang oder der Entwicklung der Erkrankung beteiligt sind.

10. Verwendung gemäss Anspruch 9, wobei das β-Hydroxyasparaginsäurederivat ein Threoisomer ist, bei dem die relative Konfiguration der 2- und 3-Positionen Threo ist.

11. Verwendung gemäss Anspruch 9 oder 10, wobei die Neuropathie oder neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Epilepsie, Huntington- Erkrankung, amyotropher lateraler Sklerose (ALS) und Alzheimer-Erkrankung.

12. Verwendung eines β-Hydroxyasparaginsäurederivats gemäss Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Aufnahme von Glutamat durch Zellen, die L-Glutamat- Transporter exprimieren.

13. Verwendung gemäss Anspruch 12, wobei das β-Hydroxyasparaginsäurederivat ein Threoisomer ist, bei dem die relativen Konfigurationen der 2- und 3-Positionen Threo ist.