DE69703298T2 - Propargylethoxyamino nucleotide - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Nucleotidverbindungen, die als Substrate für Polymeraseenzyme geeignet sind und davon abgeleitete Polynucleotide. Insbesondere betrifft, diese Erfindung Propargylethoxyaminonucleotide und ihre Verwendung zur Herstellung fluoreszierend markierter Nucleotide, die als Substrate für thermostabile Polymerasen geeignet sind, insbesondere ihre Verwendung zur Herstellung fluoreszierend markierter Nucleotide als kettenabbrechende Substrate in DNA-Sequenzierverfahren auf Fluoreszenzbasis.
- [F]dNTP Reagents Protocol, PE Applied Biosystems, Revision A, p/n 402774 (März 1996)
- ABI PRISMTM 373 DNA Sequencing System User's Manual, p/n 903204 (Juni 1994)
- ABI PRISMTM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kit with AmpliTaq® DNA Polymerase, FS, Protocol, Revision C, p/n 402114 (1996)
- ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit Protocol, PE Applied Biosystems, Revision A, p/n 402116 (August 1995)
- Benson et al., US-Patentanmeldung Seriennummer 08/626,085, angemeldet am 1. April 1996
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- Die DNA-Sequenzierung hat sich in der modernen Biologie und Biotechnologie zu einer Technik größter Bedeutung enwickelt, die Informationen liefert, welche auf den Gebieten der biologischen Grundlagenforschung über die Arzneistoffentwicklung bis hin zur klinischen Medizin Bedeutung haben. Aufgrund der großen Menge an zu sammelnden DNA- Sequenzierdaten wurden automatisierte Techniken entwickelt, um den Durchsatz zu steigern und die Kosten der DNA-Sequenzierverfahren zu senken (Smith; Connell; Trainor).
- Ein bevorzugtes DNA-Sequenzierverfahren beruht auf der von Sanger entwickelten enzymatischen Replikationstechnik (Sanger). Im Verfahren gemäß Sanger wird die DNA- Sequenz einer einzelsträngigen Templat-DNA unter Verwendung einer DNA-Polymerase bestimmt, um einen Satz von Polynucleotid-Fragmenten zu synthetisieren, wobei die Fragmente (i) eine Sequenz aufweisen, die zur Templatsequenz komplementär ist, (ii) sich in ihrer Länge in einem einzigen Nucleotid unterscheiden und (iii) ein 5'-Ende aufweisen, das mit einem bekannten Nucleotid, z. B. A, C, G oder T endet. Bei diesem Verfahren wird ein Oligonucleotidprimer an ein 3'-Ende einer zu sequenzierenden Templat-DNA gebunden, wobei das 3'-Ende des Primers als Initiationsstelle für die Polymerase-vermittelte Polymerisation eines komplementären Polynucleotid-Fragments dient. Der enzymatische Polymerisationsschritt wird durch Kombinieren des Templat-Primer-Hybrids mit den vier natürlichen Desoxynucleotiden ("dNTP's"), einem DNA-Polymeraseenzym und einem 2',3'- Didesoxynucleotidtriphosphat-("ddNTP")-"Terminator" durchgeführt. Das Einbringen des Teminators führt zu einem Fragment, bei dem am 3'-Terminus eine Hydroxygruppe fehlt und das daher nicht erweitert werden kann, d. h. das Fragment ist "terminiert". Die Konkurrenz zwischen dem ddNTP und dem entsprechenden dNTP um das Einbringen führt zu einer Verteilung von Fragmenten verschiedener Größe, wobei jedes Fragment mit dem bei der Reaktion verwendeten jeweiligen Terminator endet. Um die vollständige DNA-Sequenz des Templats zu bestimmen, werden vier Parallelreaktionen durchgeführt, wobei in jeder ein anderer ddNTP-Terminator eingesetzt wird. Um die Größenverteilung der Fragmente zu bestimmen, werden diese mittels Elektrophorese getrennt, so dass Fragmente aufgelöst werden, die sich in ihrer Größe durch ein einziges Nucleotid unterscheiden.
- Bei einer modernen Variante der klassischen Sanger-Technik werden die Nucleotid- Terminatoren mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert (Prober; Hobbs) und es wird ein thermostabiles DNA-Polymeraseenzym verwendet (Murray). Durch die Verwendung farbstoffmarkierter Terminatoren ergeben sich verschiedene Vorteile: (i) Probleme, die mit der Lagerung, dem Gebrauch und der Entsorgung radioaktiver Isotope verbunden sind, entfallen; (ii) das Erfordernis, farbstoffmarkierte Primer zu synthetisieren entfällt und (iii) bei Verwendung unterschiedlicher Farbstoffmarker für jedes der Nucleotide A, G, C oder T können alle vier Reaktionen gleichzeitig in einem Röhrchen durchgeführt werden. Die Verwendung eines thermostabilen Polymeraseenzyms gestattet es, (i) dass die Polymerisationsreaktion bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt wird, wobei jegliche Sekundärstruktur des Templats unterbrochen wird, was zu weniger sequenzabhängigen Artefakten führt und (ii) dass die Sequenzierreaktion Thermocyclen unterworfen werden kann, was dazu dient, die Menge des erzeugten Extensionsprodukts linear zu amplifizieren und folglich die zum Erhalt einer Sequenz erforderliche Menge an DNA-Templat zu verringern.
- Während sich diese modernen Varianten des Sanger-Sequenzierverfahrens als effektiv erwiesen haben, bestehen nach wie vor Probleme bezüglich der Optimierung ihrer Leistungsfähigkeit und Kosten. Ein Problem, das bei der Verwendung von farbstoffmarkierten Terminatoren in Kombination mit thermostabilen Polymeraseenzymen, insbesondere bei Fluorescein-Farbstoffmarkern, auftritt, ist der erforderliche große Überschuss von farbstoffmarkiertem Terminator gegenüber den unmarkierten dNTP's, und zwar bis zu einem Verhältnis von 50 : 1. Der große Überschuss von farbstoffmarkiertem Terminator macht es erforderlich, dass die Produkte der Sequenzierreaktion vor der Durchführung des elektrophoretischen Trennschritts gereinigt werden. Diese Aufreinigungsstufe ist nötig, um eine durch die Ko-Migration von nicht einverleibten markierten Terminatoren und echten Sequenzierfragmenten verursachte Störung zu vermeiden. Ein typisches Aufreinigungsverfahren umfasst eine Ethanolpräzipitation oder eine chromatographische Trennung (ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit Protocol). Ein solcher Aufreinigungsschritt kompliziert das Ziel der Entwicklung vollautomatischer Sequenziersysteme, bei denen die Produkte der Sequenzierreaktion direkt einem elektrophoretischen Trennverfahren zugeführt werden. Ein zweites Problem, das bei der Verwendung gegenwärtig erhältlicher farbstoffmarkierter Terminatoren in Kombination mit thermostabiler Polymerase auftritt, ist eine ungleichmäßige Verteilung der Peakhöhen, die beim DNA-Sequenzieren nach Sanger auftritt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft unsere Entwicklung einer neuen Klasse von Propargylethoxyaminonucleotiden, die als kettenabbrechende Didesoxynucleotide und als kettenverlängernde Desoxynucleotide in einer Primerextensionsreaktion, z. B. beim DNA- Sequenzieren nach Sanger oder in einer PCR geeignet sind.
- Die EP-A-251786 beschreibt Alkynylaminonucleotide, insbesondere Propargylaminonucleotide, die als kettenabbrechende Substanzen geeignet sind.
- Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Nucleotid bereitzustellen, das zur Bildung eines markierten kettenabbrechenden Nucleotids verwendet werden kann.
- Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein kettenabbrechendes Nucleotid bereitzustellen, das einen Marker umfasst.
- Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein kettenabbrechendes Nucleotid bereitzustellen, das einen Fluoreszenzmarker umfasst, wobei eine verringerte Überschusskonzentration eines solchen markierten kettenabbrechenden Nucleotids gegenüber einem unmarkierten kettenabbrechenden Nucleotid in einem DNA- Sequenzierverfahren nach Sanger erforderlich ist.
- Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung ein markiertes kettenabbrechendes Nucleotid bereitzustellen, das zu einer gleichmäßigeren Verteilung der Peakhöhen in einem DNA- Sequenzierverfahren nach Sanger führt.
- Es ist eine Aufgabe der Erfindung ein Nucleotid bereitzustellen, das zur Bildung eines markierten kettenverlängernden Desoxynucleotids verwendet werden kann.
- Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung ein kettenverlängemdes Desoxynucleotid bereitzustellen, das einen Marker umfasst.
- Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung Verfahren einschließlich einer Primerextensionsreaktion unter Verwendung der erfindungsgemäßen Propargylethoxyaminonucleotide bereitzustellen.
- In einem ersten Aspekt werden die vorstehend genannten und andere Aufgaben der Erfindung durch eine Nucleosidverbindung der allgemeinen Formel
- gelöst, wobei die variablen Substituenten R&sub1;, R&sub2; und W&sub1;-W&sub3; wie folgt definiert sind. R&sub1; und R&sub2; sind getrennt voneinander Wasserstoffatome, Niederalkylgruppen, Schutzgruppen oder ein Marker. In einer bevorzugten Ausführungsform ist einer der Reste R&sub1; und R&sub2; ein Marker, wobei der Marker vorzugsweise ein Fluoresceinfarbstoff oder ein Rhodaminfarbstoff ist. 8 ist eine 7-Desazapurin-, Purin- oder Pyrimidin-Nucleosidbase, vorzugsweise Uracil, Cytosin, 7- Desazaadenin oder 7-Desazaguanosin. Wenn B Purin oder 7-Desazapurin ist, dann ist der Zuckerrest an der N&sup9;-Position des Purins oder Desazapurins gebunden, und wenn B Pyrimidin ist, dann ist der Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden. Wenn B ein Purin ist, dann ist das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 8- Position des Purins gebunden, wenn B 7-Desazapurin ist, dann ist das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 7-Position des 7-Desazapurins gebunden und wenn B Pyrimidin ist, dann ist das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 5-Position des Pyrimidins gebunden. W&sub1; ist ein Wasserstoffatom oder -OH. W&sub2; ist -OH oder ein Rest, der verhindert, dass an der 3'-Position des Nucleosids eine Phosphodiesterbindung gebildet wird. W&sub3; ist -PO&sub4;, -P&sub2;O&sub7;, -P&sub3;O&sub1;&sub0;, ein Phosphatanalogon oder -OH.
- In einem zweiten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Ausführung einer Primerextensionsreaktion, umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellen einer Templat- Nucleinsäure; Binden eines Oligonucleotid-Primers an einen Abschnitt der Templat- Nucleinsäure und Zugeben von Primer-Extensionsreagenzien zum Primer-Tempiat-Hybrid zur Extension des Primers. In einem wichtigen Aspekt der Erfindung umfassen die Primerextensionsreagenzien eine Propargylethoxyamino-Nucleosidverbindung der vorstehend gezeigten allgemeinen Formel.
- Die Fig. 1A-1C zeigen Ergebnisse eines Terminator-Titrationsassays unter Verwendung verschiedener Konzentrationen des farbstoffmarkierten Terminators.
- Fig. 2 zeigt einen Vergleich von Sequenziermustern, die unter Verwendung herkömmlicher farbstoffmarkierter Terminatoren und erfindungsgemäßer farbstoffmarkierter Terminatoren erhalten worden sind.
- Fig. 3 zeigt ein Diagramm des Einzelnucleotid-Einbauassays, der verwendet wurde, um die erfindungsgemäßen farbstoffmarkierten Terminatoren zu charakterisieren.
- Fig. 4 zeigt Ergebnisse des Einzelnucleotid-Einbauassays, wobei die Raten der Inkorporierung unmarkierter und farbstoffmarkierter Terminatoren verglichen werden.
- Fig. 5 zeigt die Synthese von 2-Phthalimidoethanol (3) und 3-(2-Phthalimidoethoxy)propin (5).
- Fig. 6 zeigt die Synthese von 5-{3-(2-Phthalimidoethoxy)-propin-1-yl}-2',3'-didesoxycytidin (7) und von 5-{3-(2-Trifluoracetamidoethoxy)-propin-1-yl}-2',3'-didesoxycytidin (8).
- Fig. 7 zeigt die Synthese von 5-{3-(2'-Trifluoracetamidoethoxy)-propin-1-yl}-2',3'- didesoxycytidin-monophosphat (10).
- Fig. 8 zeigt die Synthese von 5-{3-(2-Trifluoracetamidoethoxy)-propin-1-yl}-2',3'- didesoxycytidin-triphosphat (12) und von 5-{3-(2-Aminoethoxy)-propin-1-yl}-2',3'- didesoxycytidin-triphosphat (13).
- Fig. 9 zeigt die Synthese von 2-(2-Phthalimidoethoxy)ethanol (15) und 3-[2-(2- Phthalimidoethoxy)ethoxy]propin (16).
- Fig. 10 zeigt die Synthese von 5-[3-{2-(2-Phthalamidoethoxy)ethoxy}-propin-1-yl]-2',3,- didesoxycytidin (17) und von 5-[3-{2-(2-Trifluoracetamidoethoxy)ethoxy}-propin-1-yl]-2',3'- didesoxycytidin (18).
- Fig. 11 zeigt die Synthese von 5-[3-{2-(2-Trifluoracetamidoethoxy)ethoxy}-propin-1-yl]-2',3'- didesoxycytidin-monophosphat (20).
- Fig. 12 zeigt die Synthese von 5-[3-{2-(2-Trifluoracetamidoethoxy)ethoxy}-propin-1-yl]-2',3'- didesoxycytidin-triphosphat (22) und von 5-[3-{2-(2-Aminoethoxy)ethoxy}-propin-1-yl]-2',3'- didesoxycytidin-triphosphat (23).
- Fig. 13 zeigt die Ergebnisse einer Einzelfarben-Sequenzierreaktion unter Verwendung eines DTAMRA-1-markierten Terminators, der einen Propargylamido-Linker (oben) umfasst, und eines DTAMRA-2-markierten Terminators, der einen Propargyl-1-ethoxyamido-Linker (unten) umfasst.
- Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei Beispiele davon in den beigefügten Zeichnungen erläutert werden. Während die Erfindung im Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, soll die Erfindung nicht als auf diese Ausführungsformen beschränkt angesehen werden. Vielmehr soll die Erfindung Alternativen, Modifikationen und Äquivalente umfassen, die gemäß den nachstehenden Patentansprüchen von der Erfindung umfasst sein können.
- Im Allgemeinen umfasst die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von Propargylethoxyamino-Nucleosidverbindungen, die als Substrate für Polymeraseenzyme geeignet sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können insbesondere als markierte Didesoxynucleotid-kettenabbrechende Mittel in DNA-Sequenzierverfahren gemäß Sanger und als markierte Desoxynucleotid-kettenverlängernde Mittel in Verfahren einschließlich Primerextensionsreaktionen, z. B. PCR, verwendet werden.
- Die Erfindung beruht zum Teil auf der Erkenntnis, dass die betreffenden farbstoffmarkierten Nucleotide besonders gute Substrate für thermostabile DNA-Polymeraseenzyme sind. So ist z. B. ein signifikant geringerer molarer Überschuss bei einer DNA-Sequenzierreaktion gemäß Sanger erforderlich, und zwar bezüglich gegenwärtig erhältlicher farbstoffmarkierter Terminatoren.
- Falls nichts anderes angegeben ist, sollen die hier verwendeten Begriffe und Formulierungen folgendes bedeuten:
- Der Begriff "Niederalkyl" bezeichnet geradkettige und verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, d. h. Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, tert-Butyl-, Isobutyl-, sec- Butyl-, Neopentyl-, tert-Pentylreste und dergleichen.
- Der Begriff "Marker" bezieht sich auf einen Rest, der, wenn er an die erfindungsgemäßen Nucleoside gebunden ist, solche Nucleoside und Polynucleotide, die solche Nucleotide enthalten, mittels bekannter Nachweiseinrichtungen nachweisbar macht. Beispiele für Marker umfassen Fluorophore, Chromophore, Radioisotope, Spinmarker, Enzymmarker, chemilumineszierende Marker und dergleichen, die den direkten Nachweis einer markierten Verbindung mit einem geeigneten Detektor erlauben, oder einen Liganden, wie ein Antigen oder Biotin, der spezifisch mit hoher Affinität an einen nachweisbaren Anti-Liganden binden kann, wie einen markierten Antikörper oder Avidin. Die Marker sind vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluorescein- oder Rhodaminfarbstoffe (Lee; Menchen).
- Der Begriff "Nucleosid" bezieht sich auf Verbindungen, die aus einer Purin-, Desazapurin- oder Pyrimidinnucleosidbase bestehen, z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin, Desazaadenin, Desazaguanosin und dergleichen, die an der 1'-Position mit einer Pentose verbunden sind, einschließlich 2'-Desoxy- und 2'-Hydroxyl-Formen (Stryer). Der hier verwendete Begriff "Nucleotid" bezieht sich auf Nucleosid-Phosphatester, z. B. Triphosphatester, wobei die gebräuchlichste Veresterungsstelle die C-5-Hydroxylgruppe der Pentose ist. In der vorliegenden Beschreibung umfasst der Begriff Nucleosid häufig sowohl Nucleoside als auch Nucleotide. "Analoga" in Bezug auf Nucleoside umfassen synthetische Analoga mit modifizierten Basenresten, modifizierten Zuckerresten und/oder modifizierten Phosphatesterresten, wie es z. B. an anderer Stelle (Scheit; Eckstein 1991) beschrieben ist.
- Die hier verwendeten Begriffe "Polynucleotid" oder "Oligonucleotid" beziehen sich auf lineare Polymere von natürlichen Nucleotidmonomeren oder Analoga davon, einschließlich doppel- und einzelsträngige Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide, α-anomere Formen davon und dergleichen. Gewöhnlich sind die Nucleosidmonomere mittels Phosphodiesterbindungen verbunden, wobei sich der hier verwendete Begriff "Phosphodiesterbindung" auf Phosphodiesterbindungen oder Bindungen bezieht, die Phosphatanaloga davon umfassen, einschließlich zugehöriger Gegenionen, wie z. B. H&spplus;, NH&sub4;&spplus;, Na&spplus; und dergleichen, falls solche Gegenionen vorliegen. Polynucleotide haben typischerweise eine Größe von wenigen Monomereinheiten, z. B. 8-40, bis mehrere Tausend Monomereinheiten. Immer dann, wenn ein Polynucleotid als Buchstabensequenz dargestellt wird, wie "ATGCCTG", soll dies so verstanden werden, dass die Nucleotide in 5'→3'- Richtung von links nach rechts angeordnet sind und dass "A" Desoxyadenosin, "C" Desoxycytidin, "G" Desoxyguanosin und "T" Thymidin bezeichnet, falls nichts anderes angegeben ist.
- Der Begriff "Phosphatanalogon" bezieht sich auf Analoga von Phosphat, wobei sich das Phosphoratom in der Oxidationsstufe +5 befindet und ein oder mehrere Sauerstoffatome durch einen nicht-Sauerstoffrest ersetzt ist. Beispiele für Analoga umfassen Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Phosphoroselenoat, Phosphorodiselenoat, Phosphoroanilothioat, Phosphoroanilidat, Phosphoramidat, Boronphosphate und dergleichen, einschließlich zugehöriger Gegenionen, z. B. H&spplus;, NH&sub4;&spplus;, Na&spplus; und dergleichen, falls solche Gegenionen vorliegen.
- Der hier verwendete Begriff "Propargylamido-Linker" soll sich auf Linker mit der Struktur
- =C C-CH&sub2;-NH-,
- der Begriff "Propargyl-1-ethoxyamido-Linker" soll sich auf Linker mit der Struktur
- -C C-CH&sub2;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-,
- und der Begriff "Propargyl-2-ethoxyamido-Linker" soll sich auf Linker mit der Struktur
- -C C-CH&sub2;-(O-CH&sub2;-CH&sub2;)&sub2;-NH-
- beziehen, wobei bei jeder der vorstehenden Strukturen das terminale Ende des Acetylenrests an eine Nucleotidbase und der Amidstickstoff mit einer herkömmlichen Bindung an einen Marker gebunden ist.
- Der Begriff "Fluorescein-Farbstoff" bezieht sich auf eine Klasse von Xanthen- Farbstoffmolekülen, die das nachstehende anellierte dreigliedrige Ringsystem umfasst
- wobei an jeder Desoxy-Ringposition eine Vielzahl von Substitutionen möglich ist. Eine besonders bevorzugte Untergruppe von Fluorescein-Farbstoffen umfasst die 4,7- Dichlortluoresceine (Menchen). Beispiele für Fluorescein-Farbstoffe, die als Fluoreszenzmarker in DNA-Sequenzierverfahren verwendet werden, umfassen 6- Carboxyfluorescein (6-FAM), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM), 6-Carboxy-4,7,2',7'- tetrachlorfluorescein (TET), 6-Carboxy-4,7,2',4',5',7'-hexachlorfluorescein (HEX), 5- (und 6- ) -Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein (JOE) und 5-Carboxy-2',4',5',7'- tetrachlorfluorescein (ZOE). Häufig wird die Bezeichnung -1 oder -2 der Abkürzung eines bestimmten Farbstoffs nachgestellt, z. B. HEX-1. Die Bezeichnungen "-1" und "-2" geben an, dass ein bestimmtes Farbstoffisomer verwendet wurde. Die 1- und 2-Isomere werden durch die Elutionsreihenfolge (das 1-Isomer eluiert zuerst) des freien Farbstoffs in einem chromatographischen Umkehrphasen-Trennsystem unter Verwendung einer C-8-Säule und einem Elutionsgradienten von 15% Acetonitril/85% 0,1 M Triethylammoniumacetat bis 35% Acetonitril/65% 0,1 M Triethylammoniumacetat definiert.
- Der Begriff "Rhodamin-Farbstoff" bezieht sich auf eine Klasse von Xanthen- Farbstoffmolekülen, die das nachstehende anellierte dreigliedrige Ringsystem umfassen
- wobei vorzugsweise Y&sub1;-Y&sub4; unabhängig Wasserstoffatome oder Niederalkylreste sind, oder, zusammengenommen, Y&sub1; und R&sub2; ein Propano-Rest und Y&sub2; und R&sub1; ein Propano-Rest sind, oder, zusammengenommen, Y&sub3; und R&sub3; ein Propano-Rest und Y&sub4; und R&sub4; ein Propano-Rest sind. An jeder der Desoxy-Ringpositionen einschließlich der Positionen R&sub1;-R&sub4; ist eine Vielzahl von Substitutionen möglich. Beispiele für Rhodamin-Farbstoffe, die als Nucleosid- Marker geeignet sind, umfassen Tetramethylrhodamin (TAMRA), 4,7- Dichlortetramethyirhodamin (DTAMRA), Rhodamin X (ROX), Rhodamin 6G (R6G), Rhodamin 110 (R110) und dergleichen (Bergot; Lee).
- Der hier verwendete Begriff "FLAN-Farbstoffe" bezieht sich auf asymmetrische Benzoxanthen-Farbstoffverbindungen der allgemeinen Formel
- wobei Y&sub1; und Y&sub2; unabhängig Hydroxyl-, Sauerstoff-, Iminium- oder Aminogruppen sind. R&sub1;- R&sub8; sind unabhängig Wasserstoff-, Fluor-, Chloratome, Niederalkyl-, Niederalkenyl-, Niederalkinyl-, Sulfonat-, Amino-, Ammonium-, Amido-, Nitril-, Alkoxyreste, verbrückende Reste oder Kombinationen davon. R&sub9; ist ein Acetylenyl-, Alkyl-, Alkenyl-, Cyanorest, ein substituierter Phenylrest oder Kombinationen davon, wobei der substituierte Phenylrest die allgemeine Formel
- hat, worin X&sub1; ein Carbon- oder Sulfonsäurerest ist, X&sub2; und X&sub5; unabhängig Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratome oder Niederalkylreste sind und X&sub3; und X&sub4; unabhängig Wasserstoff-, Chlor-, Fluoratome oder Niederalkylreste, Carbon- oder Sulfonsäurereste oder verbrückende Reste sind (Benson).
- Der hier verwendete Begriff "Primer-Extensionsreagenz" bezieht sich auf ein Reagenz, dass Komponenten umfasst, die zur enzymatischen Templat-vermittelten Extension eines Oligonucleotid-Primers notwendig sind. Primer-Extensionsreagenzien umfassen: (i) ein Polymeraseenzym, z. B. ein thermostabiles Polymeraseenzym wie Taq-Polymerase; (ii) einen Puffer; (iii) Desoxynucleotidtriphosphate, z. B. Desoxyguanosin-5'-triphosphat, 7- Desazadesoxyguanosin-5'-triphosphat, Desoxyadenosin-5'-triphosphat, Desoxythymidin-5 triphosphat, Desoxycytidin-5t-triphosphat, und gegebenfalls im Fall von DNA- Sequenzierreaktionen, (iv) Didesoxynucleotidtriphosphate, z. B. Didesoxyguanosin-5' - triphosphat, 7-Desazadidesoxyguanosin-5'-triphosphat, Didesoxyadenosin-5'-triphosphat, Didesoxythymidin-5'-triphosphat und Didesoxycytidin-5'-triphosphat.
- "Templat-Nucleinsäure" bezieht sich auf eine beliebige Nucleinsäure, die in einer einzelsträngigen Form vorliegen und sich mit einem Primer-Oligonucleotid verbinden kann. Beispiele für Templat-Nucleinsäuren umfassen DNA und RNA, wobei die DNA oder RNA einzel- oder doppelsträngig sein kann. Insbesondere kann die Templat-Nucleinsäure genomische DNA, Messenger-RNA, cDNA, von einer PCR stammende DNA- Amplifikationsprodukte und dergleichen sein. Verfahren zur Herstellung von Templat-DNA sind an anderer Stelle beschrieben (ABI PRISMTM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kit).
- In einem ersten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung eine neue Klasse von Propargylethoxyamino-Nucleosidverbindungen der unmittelbar nachstehend gezeigten allgemeinen Formel I. (Es ist zu beachten, dass alle in dieser Beschreibung angegebenen Molekülstrukturen nicht nur die genaue dargestellte Elektronenstruktur umfassen sollen, sondern auch alle Resonanzstrukturen und protonierten Formen.) FORMEL I
- In der allgemeinen Formel I sind R&sub1; und R&sub2; ausgewählt aus Wasserstoffatomen, Niederalkylgruppen, Schutzgruppen oder Markern. Der Marker ist vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff. Mehr bevorzugt ist der Marker ein Fluorescein-Fluoreszenzfarbstoff oder ein Rhodamin-Fluoreszenzfarbstoff. Wenn einer der Reste R&sub1; und R&sub2; ein Marker ist, ist der andere der Reste R&sub1; und R&sub2; entweder ein Wasserstoffatom oder ein Niederalkylrest. Bevorzugte Schutzgruppen umfassen Acyl-, Alkoxycarbonyl- oder Sulfonylgruppen. Mehr bevorzugt ist die Schutzgruppe ein Trifluoracetylrest.
- Der Marker ist mittels einer "Bindung" mit dem Nucleosid verbunden, die typischerweise durch Reaktion der primären oder sekundären Aminogruppe des Propargylethoxyamino- Nucleosids mit einer "komplementären Funktionalität" am Marker gebildet wird. Die komplementäre Funktionalität ist vorzugsweise Isothiocyanat, Isocyanat, Acylacid, N- Hydroxysuccinimid-(NHS)-ester, Sulfonylchlorid, Aldehyd oder Glyoxal, Epoxid, Carbonat, Arylhalogenid, Imidoester, Carbodiimid, Anhydrid, 4,6-Dichlortriazinylamin oder ein anderes aktives Carboxylat (Hermanson). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die komplementäre Funktionalität ein aktivierter NHS-Ester, der mit der Aminogruppe des erfindungsgemäßen Propargylethoxyaminonucleosids reagiert, wobei zur Bildung des aktivierten NHS-Esters ein Marker, der eine zu Carboxylat komplementäre Funktion umfasst, mit Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid umgesetzt wird (Khanna; Kasai). Die nachstehende Tabelle 1 zeigt eine Auswahl repräsentativer komplementärer Funktionalitäten und daraus resultierender Bindungen, die durch Reaktion der komplementären Funktionalität mit der Aminogruppe des Propargylethoxyamino-Nucleosids gebildet wurde. TABELLE 1
- In der allgemeinen Formel 1 ist B eine 7-Desazapurin-, Purin- oder Pyrimidinnucleotidbase, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform B aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Cytosin, 7-Desazaadenin und 7-Desazaguanosin ausgewählt ist. Wenn B Purin oder 7- Desazapurin ist, ist der Zuckerrest des Nucleosids an der N&sup9;-Position des Purins oder Desazapurins gebunden, und wenn B Pyrimidin ist, ist der Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden. Wenn B ein Purin ist, ist das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 8-Position des Purins gebunden, wenn B 7-Desazapurin ist, ist das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 7-Position des 7-Desazapurins gebunden, und wenn B Pyrimidin ist, ist das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 5-Position des Pyrimidins gebunden.
- W&sub1; ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom und -OH ausgewählt. Wenn W&sub1; die Gruppe -OH ist, dann ist das Nucleosid ein Ribonucleotid und wenn W&sub1; ein Wasserstoffatom ist, dann ist das Nucleosid ein Desoxyribonucleotid.
- W&sub2; ist die Gruppe -OH oder ein Rest, der verhindert, dass an der 3'-Position des Nucleosids eine Phosphodiesterbindung gebildet wird. Bevorzugte, für diese Funktion geeignete Reste umfassen Wasserstoffatome, Azid-, Amino-, Fluor-, Methoxygruppen und dergleichen.
- W&sub3; ist aus der Gruppe bestehend aus -PO&sub4;, -P&sub2;O&sub7;, -P&sub3;O&sub1;&sub0;, einem Phosphatanalogon und der Gruppe -OH ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform, die für die enzymatische Synthese von Polynucleotiden geeignet ist, ist W&sub3; die Gruppe -P&sub3;O&sub1;&sub0;.
- Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Propargylethoxyamino-Nucleoside wie nachstehend beschrieben hergestellt. Bromethanol wird mit Kaliumphthalimid unter Bildung eines Phthalimidoderivats umgesetzt. Das Phthalimidoderivat wird dann mit Propargylbromid in Gegenwart von NaH O-alkyliert, was zu einem geschützten 3-(2- Phthalimidoethoxy)propin-Bindungsarm führt. Ein Iod-Nucleosid wird dann mit dem geschützten Bindungsarm in Gegenwart von Kupfer(I)-iodid, Tetrakis(triphenylphosphin)palladium und Triethylamin in Dimethylformamid etwa 12 h bei Raumtemperatur oder solange umgesetzt, bis die Umsetzung vollständig ist (Prüfung mit DC). Die Lösung wird dann unter vermindertem Druck konzentriert. Das Produkt wird mittels Silicagel-Flashchromatographie gereinigt und mittels Protonen-NMR und analytischer Umkehrphasen-HPLC (C-18-Säule) auf Identität und Reinheit untersucht. Die Behandlung mit Ethylendiamin und anschließender Acetylierung mit Ethyltrifluoracetat führt zu einer Verbindung mit einem Nucleosid-Bindungsarm. Der Verbindung mit einem Nucleosid- Bindungsarm wird frisch destilliertes Phosphoroxychlorid in Trimethylphosphat bei -30ºC zugesetzt, wobei das entsprechende Dichlormonophosphat gebildet wird. Das Reaktionsgemisch wird mit 2 M Tetraethylammoniumbicarbonat (TEAB) bei einem pH-Wert von 8,0 gequencht, wobei das Monophosphat erhalten wird, das dann mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC (C-18-Säule) gereinigt wird. Das Monophosphat wird mit Carbonyldiimidazol (CDI) aktiviert und überschüssiges CDI mit MeOH gequencht. Das aktivierte Monophosphat wird bei Raumtemperatur mit Tributylammoniumpyrophosphat umgesetzt. Wenn die Umsetzung abgeschlossen ist, wird sie mit 0,2 M TEAB gequencht und mittels Umkehrphasen-HPLC (C-18-Säule) gereinigt. Das gereinigte geschützte Triphosphat wird bis zur Trockne von flüchtigen Bestandteilen befreit und in konzentriertem wäßrigen NH&sub4;OH zur Entfernung der TFA-Gruppe resuspendiert. Die Lösung des entschützten Triphosphats wird zur Trockne eingedampft und mit 0,1 M TEAB mit einem pH- Wert von 7,0 bis zu einer gewünschten Konzentration formuliert. Die Konzentration und Reinheit der formulierten Lösung wird mittels UV/Vis-Spektroskopie bzw. Ionenpaarungs- HPLC bestimmt.
- Im Allgemeinen werden in einem bevorzugten Verfahren erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Propargylethoxyamino-Nucleoside wie folgt hergestellt. Ein Propargylethoxyamino-Nucleosid wird in 100 mM TEAB (pH 7,0) gelöst, die Lösung wird zu Trockne eingedampft und das Nucleosid wird in 250 mM Natriumhydrogencarbonat-Puffer (pH 9,0) resuspendiert. Farbstoff-NHS (in DMSO) wird zugesetzt und man lässt das erhaltene Gemisch über Nacht unter Rühren reagieren. Wenn die Umsetzung abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch durch einen Ionenaustausch und Umkehrphasen-HPLC (C-18-Säule) gereinigt. Die Lösung mit dem farbstoffmarkierten Triphosphat-Nucleotid wird zur Trockne eingedampft und mit 50 mM 3-[Cyclohexylamino]-2- hydroxy-1-propan-sulfonsäure (CAPSO) mit einem pH-Wert von 9,6 bis zu einer gewünschten Konzentration formuliert. Die Konzentration und Reinheit der formulierten Lösung wird mittels UV/Vis-Spektroskopie bzw. Ionenpaarungs-HPLC bestimmt.
- Die erfindungsgemäßen Propargylethoxyaminoverbindungen sind besonders gut zur Verwendung in Verfahren geeignet, die eine Templat-vermittelte Primer-Extensionsreaktion mit den folgenden Stufen umfassen: (i) Bereitstellen einer Templat-Nucleinsäure; (ii) Binden eines Oligonucleotid-Primers an einen Abschnitt der Templat-Nucleinsäure, wobei ein Primer-Templat-Hybrid gebildet wird und (iii) Zugeben von Primer-Extensionsreagenzien zum Primer-Templat-Hybrid zur Extension des Primers. Insbesondere stellen die erfindungsgemäßen Verbindungen ein Mittel bereit, mit dem ein Marker direkt in ein Primer- Extensionsprodukt eingeführt werden kann.
- In einer ersten bevorzugten Klasse von Verfahren, bei denen eine Primer- Extensionsreaktion eingesetzt wird, werden die Extensionsprodukte durch Einbringen von erfindungsgemäßen markierten Desoxynucleotidtriphosphaten oder Desoxyribonucleosidtriphosphaten in die Primer-Extensionsreaktion markiert, wodurch Marker statistisch in das Extensionsprodukt eingebracht werden ([F]dNTP Reagents Protocol). Ein derartiges Verfahren kann sowohl zur Markierung von PCR-Amplifikaten als auch zur Markierung von Extensionsprodukten, die von einem Einzelprimer abgeleitet sind, verwendet werden. Um ein Extensionsprodukt auf diese Weise zu markieren, wird die Primer-Extensionsreaktion unter Verwendung bekannter Protokolle durchgeführt, jedoch wird der Reaktion ein markiertes Desoxynucleotidtriphosphat zugesetzt. Im Allgemeinen wird zur Durchführung einer Primer- Extensionsreaktion im Zusammenhang mit einer PCR eine Templat-Nucleinsäure mit jeweils 20 umol von jedem Primer und jedem Primer-Extensionsreagenz, das 20 mM Puffer bei einem pH-Wert von 8 umfasst, 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM von jedem Desoxynucleotidtriphosphat (dNTP) und 2 Einheiten Taq-Polymerase oder einer anderen geeigneten thermostabilen Polymerase versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann einem Thermocyclus unterworfen, wobei ein typisches Thermocyclus-Profil einen Denaturierungsschritt (z. B. 96ºC, 15 s), einen Primer-Bindungsschritt (z. B. 55ºC, 30 s) und einen Primer-Extensionsschritt (z. B. 72ºC, 90 s) umfasst. Typischerweise wird der Thermocyclus für etwa 10 bis 40 Cyclen wiederholt. Für PCR-Amplifikationen liegt das Verhältnis von markiertem Desoxynucleotidtriphosphat zu unmarkiertem Desoxynucleotidtriphosphat typischerweise zwischen 100 : 1 und 1000 : 1, abhängig von der gewünschten Signalstärke. Das maximale Verhältnis von markiertem Desoxynucleotidtriphosphat zu unmarkiertem Desoxynucleotidtriphosphat, das bei einem PCR-Reaktionsgemisch eingesetzt werden kann, ohne die Wirksamkeit der Amplifikation nachteilig zu beeinflussen, liegt bei etwa 1 : 4.
- In einer zweiten bevorzugten Klasse von Verfahren, bei denen eine Primer- Extensionsreaktion eingesetzt wird, werden die Extensionsprodukte durch Einbringen von erfindungsgemäßen markierten Didesoxynucleotidtriphosphaten oder Didesoxyribonucleosidtriphosphaten in die Primer-Extensionsreaktion markiert, wodurch nachweisbare Marker statistisch am 3'-terminalen Nucleotid eingebracht werden, z. B. beim DNA-Sequenzieren gemäß Sanger. Im Allgemeinen werden zur Durchführung einer Primer-Extensionsreaktion im Zusammenhang mit dem DNA-Sequenzieren gemäß Sanger unter Verwendung der erfindungsgemäßen markierten Didesoxynucleotidtriphosphate 1 ul Templatlösung (1 ml PCR-Lösung verdünnt mit 5 ml Wasser) und 2 ul Primer (0,4 umol/ul) mit Primer- Extensionsreagenzien gemischt, die 2 uf Puffer (400 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, pH 9,0), 2 ul eines Gemisches aus Desoxynucleotid und markiertem Desoxynucleotid (T-Terminationsreaktion, 1250 uM ddTTP, 250 uM dATP, 250 uM dCTP, 180 uM 7-Desaza-dGTP und 250 uM dTTP) und 2 ul Polymeraseenzym (5 Einheiten/ul, wobei eine Einheit gemäß Lawyer definiert ist) umfassen. Das Reaktionsgemisch wird dann unter Verwendung des nachstehenden beispielhaften Programms einem Thermocyclus unterworfen: Denaturierung bei 98ºC für 5 s, gefolgt von wiederholten Cyclen von 96ºC für 5 s, 55ºC für 40 s, 68ºC für 1 min. wobei der Cyclus etwa 15 Mal wiederholt wird.
- Die erfindungsgemäßen Propargylethoxyaminoverbindungen können auch im Zusammenhang mit Varianten des Sequenzierverfahrens gemäß Sanger verwendet werden, die auf der basenspezifischen Spaltung der Primer-Extensionsprodukte beruhen, z. B. Verfahren, bei denen labile Nucleotide verwendet werden (Eckstein 1988; Shaw).
- Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele, die nicht beschränkend aufzufassen sind, weiter erläutert.
- Der Terminator-Titrationsassay wurde verwendet, um die minimale Menge an Farbstoffterminator zu bestimmen, die notwendig ist, um eine volle Sequenzierleiter zu erzeugen, d. h. eine Sequenzierleiter, die alle Fragmente einschließt, die mit einer bestimmten Base enden und eine Länge zwischen etwa 20 bis etwa 600 Nucleotide aufweisen. Die Schlüsselkomponenten des Assays waren (i) ein mit einem ersten Farbstoff markierter Primer und (ii) ein mit einem zweiten, spektral vom ersten Farbstoff unterscheidbaren Farbstoff markierter Terminator. Wenn der Sequenzierreaktion im Assay eine ungenügende Konzentration an Farbstoffterminator zugesetzt wurde, bildeten sich keine Didesoxy-terminierten Fragmente und auf dem Sequenziergel waren lediglich Produkte sichtbar, die durch "falsche Stops", die lediglich mit dem ersten Farbstoff markiert waren, gebildet wurden. Der hier verwendete Begriff "falsche Stops" bezieht sich auf Primer- Extensionsprodukte, die nicht mit einem Didesoxyterminator enden, wobei solche Produkte möglicherweise dann gebildet werden, wenn sich das Polymeraseenzym spontan vom Templatstrang ablöst. Wenn zuviel Terminator verwendet wurde, bildeten sich nur kurze Terminationsprodukte, d. h. mit einer Länge von weniger als etwa 50 Nucleotiden, wobei solche Produkte sowohl den ersten als auch den zweiten Farbstoff enthielten. Wenn die richtige Menge an Terminator verwendet wurde, bildete sich eine vollständige Sequenzierleiter, wobei jedes Fragment der Leiter mit sowohl dem ersten als auch dem zweiten Farbstoff markiert war.
- Die Farbstoff-Terminatorreaktionen wurden unter Verwendung von AmpliTaq DNA- Polymerase FS durchgeführt, wobei nach Protokollen gemäß ABI PRISMIM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit Manual (PE Applied Biosystems p/n 402116) vorgegangen wurde. (Das FS-Enzym ist eine rekombinante Thermus aquaticus DNA-Polymerase mit zwei Punktmutationen - G46D und F667Y). Alle Reagenzien mit Ausnahme des dNTP- Gemisches, der farbstoffmarkierten Primer und der farbstoffmarkierten Terminatoren stammten von einem ABI PRISMTM Dye Terminator Core Kit (PE Applied Biosystems p/n 402117). Das dNTP-Gemisch bestand aus jeweils 2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Ein Vorgemisch der Reaktionskomponenten wurde gemäß der nachstehenden Tabelle hergestellt, wobei sich alle Mengenangaben auf eine Umsetzung beziehen:
- 4,0 ul 5X-Puffer
- 1,0 ul dNTP-Gemisch.
- Templat: 0,2 ug/ul, 5,0 ul pGEM®-3Zf(+)
- Primer: 0,8 pmol/ul, 4,0 ul -21 M13 (vorwärts)
- 0,5 ul AmpliTaq DNA-Polymerase FS
- 0,5 ul H&sub2;O
- Die Umsetzungen wurden in 0,5 ml Röhrchen durchgeführt, die an den 480 DNA Thermal Cycler von Perkin-Elmer (PE Applied Biosystems p/n N801-100) angepasst waren. Die Reaktionsvolumina betrugen 20 ul, einschließlich 15 ul des vorstehend genannten Reaktionsvorgemisches, einer variablen Menge des farbstoffmarkierten Terminators und einem ausreichenden Volumen Wasser, um das Gesamt-Reaktionsvolumen auf 20 ul zu bringen. Jedem Reaktionsgemisch wurden 1 bis 1000 umol des Farbstoffterminators zugesetzt. Um eine Verdampfung zu verhindern, wurde jedes Reaktionsgemisch mit 30 ul Mineralöl überschichtet. Die Reaktionsgemische wurden wie folgt einem Thermocyclus unterworfen: 30 s bei 96ºC, 15 s bei 50ºC und 4 min bei 60ºC, wobei 25 Cyclen durchgeführt wurden, gefolgt von einem Haltecyclus bei 4ºC.
- Alle Reaktionsgemische wurden mittels Spinsäulen-Reinigung auf Centri-Sep Spinsäulen gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt (Princeton Separations p/n CS-901). Das Gelmaterial in der Säule wurde mit 0,8 ml entionisiertem Wasser mindestens 30 min bei Raumtemperatur hydratisiert. Nach der Hydratisierung der Säule wurde sichergestellt, dass sich keine Blasen im Gelmaterial befanden. Danach wurden die obere und untere Endkappe der Säule entfernt und die Säule ablaufen gelassen. Die Säule wurde dann in die im Kit enthaltenen Waschröhren eingesetzt und in einer Mikrozentrifuge mit variabler Geschwindigkeit 2 min bei 1300 · g zentrifugiert, von der Waschröhre entfernt und in ein Probensammelröhrchen eingesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde vorsichtig von unterhalb der Ölschicht entnommen und auf das Gelmaterial aufgebracht. Die Säulen wurden in einer Mikrozentrifuge mit variabler Geschwindigkeit 2 min bei 1300 · g zentrifugiert. Eluierte Proben wurden dann in einer Vakuumzentrifuge getrocknet.
- Vor dem Aufbringen auf ein Sequenziergel wurden die getrockneten Proben in 25 ul Templat-Unterdrückungsreagenz (PE Applied Biosystems p/n 401674) resuspendiert, gevortext, 2 min auf 95ºC erhitzt, auf Eis gekühlt, erneut gevortext und zentrifugiert (13000 · g). 10 ul der resuspendierten Probe wurden zu gleichen Teilen in Probengefäße (PE Applied Biosystems p/n 401957) aufgeteilt, die an den PE ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems p/n 310-00-100/120) angepasst waren. Die Elektrophorese auf dem 310 Genetic Analyzer wurde mit Siebpolymeren und -kapillaren durchgeführt, die speziell an die DNA-Sequenzieranalyse angepasst waren (PE Applied Biosystems p/n 402837 (Polymer) und p/n 402840 (Kapillare) oder p/n 402091 (Polymer) und p/n 401821 (Kapillare)). In jedem Fall umfassten die Siebpolymere Nucleinsäure-Denaturierungsmittel. Die Proben wurden 30 s bei 2,5 kV elektrokinetisch auf die Kapillare injiziert und 2 Stunden bei 10 bis 12,2 kV laufengelassen, wobei die Außenwand der Kapillare bei 42ºC gehalten wurde.
- Die Fig. 1A-C zeigen typische Ergebnisse eines Terminator-Titrationsassays, die mit einem 310 Analysegerät erhalten worden sind. In jedem Fall enthielt der farbstoffmarkierte Terminator den herkömmlichen Propargylamido-Linker. Die Spuren zeigen Fluoreszenzintensität bei einer gegebenen Wellenlänge als Funktion der Zeit während eines Elektrophoreselaufs für die Nucleotide 71-175. Die Menge des der Primer-Extensionsreaktion zugesetzten Farbstoffterminators variierte, wobei in Fig. 1A 1 pmol, in Fig. 1B 4 pmol und in Fig. 10 150 umol Terminator verwendet wurden. Die obere Spur in jeder Darstellung ist die Fluoreszenz, die vom farbstoffmarkierten Terminator emittiert worden ist und bei 535-545 nm aufgenommen wurde. Die untere Spur in jeder Darstellung ist die Fluoreszenz, die vom farbstoffmarkierten Primer emittiert worden ist und bei 575- 585 nm aufgenommen wurde. Die Farbstoffprimer-Spur (unten) zeigt falsche Stops, d. h. Fragmente, die nicht mit einem farbstoffmarkierten Terminator enden, sowie richtig terminierte Fragmente. Falsche Stops treten auf, wenn nicht genügend Terminator vorliegt oder wenn ein Terminator ein schlechtes Polymerasesubstrat ist. Die Farbstoffterminator- Spur (oben) zeigt den spezifischen Einbau des farbstoffmarkierten Terminators. Die experimentellen Bedingungen waren wie folgt:
- Terminator: ddATP markiert mit 6-FAM bei verschiedenen Konzentrationen
- Primer: TAMRA-markierter-21M13 (vorwärts)
- Templat: pGEM-3Zf(+)
- DNA-Polymerase: AmpliTaq®-Polymerase FS
- Fig. 1A zeigt Daten für eine Reaktion, bei der 1 umol 6-FAM-ddATP verwendet wurden. Ein sehr geringer spezifischer Einbau wurde mittels kleiner Peaks in der Farbstoffterminator- Spur nachgewiesen. Die in der unteren Farbstoffprimer-Spur sichtbaren falschen Stops waren im wesentlichen so groß wie beliebige spezifisch terminierte Peaks. Dieses Muster zeigt, dass die Farbstoffterminatorkonzentration zu niedrig war. Fig. 1B zeigt Daten für eine Reaktion, bei der 4 umol 6-FAM-ddATP verwendet wurden. Es wurde ein guter spezifischer Terminatoreinbau mit relativ gleichmäßigen Peakhöhen über die gesamte Sequenzierleiter beobachtet. In der Farbstoffprimer-Spur lagen leicht unterscheidbare Peaks über dem Grundrauschen der falschen Stops vor, wobei die Peaks mit den Peaks in der Farbstoffterminator-Spur mitwanderten. Dieses Muster zeigt, dass sich die Farbstoffterminatorkonzentration innerhalb eines brauchbaren Bereichs befand. Fig. 1C zeigt Daten für eine Reaktion, bei der 150 umol 6-FAM-ddATP verwendet wurden. Es wurde ein "top heavy"-Muster beobachtet, wobei die frühen Peaks sehr hohe Anteile an Farbstoffterminator-Einbau und die späteren Peaks einen sehr viel geringeren Einbau zeigten. Dieses Muster zeigt, dass die Farbstoffterminatorkonzentration zu hoch war.
- Fig. 2 zeigt einen Vergleich der für 6-FAM-ddCTP-Terminatoren erhaltenen Sequenziermuster unter Verwendung des Propargylamido-Linkers bei einer Konzentration von 250 umol (obere Spur) und der für 6-FAM-ddCTP-Terminatoren erhaltenen Sequenziermuster unter Verwendung des erfindungsgemäßen Propargyl-1-ethoxyamido- Linkers bei einer Konzentration von 50 umol (untere Spur). Diese Konzentrationen wurden als die optimalen Konzentrationen für jeden Terminatortyp bestimmt. Für den 6-FAM-ddCTP- Terminator, bei dem der Propargylamido-Linker verwendet wurde, betrug die mittlere Peakhöhe 1800 und die Standardabweichung 959, was einen relativen Fehler von 0,533 ergibt. Für den 6-FAM-ddCTP-Terminator, bei dem der erfindungsgemäße Propargyl-1- ethoxyamido-Linker verwendet wurde, betrug die mittlere Peakhöhe 504 und die Standardabweichung 220, was einen relativen Fehler von 0,436 ergibt. Der bei Verwendung des Propargyl-1-ethoxyamido-Linkers erhaltene niedrigere relative Fehler zeigt eine gleichmäßigere Peakhöhenverteilung, die die Basenerkennung in einem automatischen DNA-Sequenziersystem erleichtert.
- Die nachstehende Tabelle zeigt den zur Bildung einer vollständigen Sequenzierleiter gemäß dem vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen Terminator-Titrationsassay erforderlichen relativen molaren Überschuss an farbstoffmarkiertem C-Terminator. Der relative molare Überschuss ist so definiert, dass die Menge an unmarkiertem Didesoxy-Terminator, die erforderlich ist, um eine vollständige Sequenzierleiter zu bilden, zu einem Wert von 1 führt. In jedem Fall wurde ein C-Terminator mit einem 6-FAM-Farbstoff verbunden. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, erfordert der C-Terminator, bei dem der Propargyl-1-ethoxyamido- Linker verwendet wird, einen 6-fach geringeren molaren Überschuss verglichen mit Terminatoren, bei denen der herkömmliche Propargylamido-Linker verwendet wird (9 gegenüber 55) und einen 5-fach geringeren molaren Überschuss verglichen mit Terminatoren, bei denen ein Propargyl-2-ethoxyamido-Linker verwendet wird (9 gegenüber 45).
- unmarkierter Terminator 1
- Propargylamido 55
- Propargyl-1-ethoxyamido 9
- Propargyl-2-ethoxyamido 45
- aDer relative molare Überschuss ist so definiert, dass die Menge an unmarkiertem Didesoxy- Terminator, die zur Bildung einer vollständigen Sequenzierleiter erforderlich ist, zu einem Wert von 1 führt.
- Die nachstehende Tabelle vergleicht den zur Bildung einer vollständigen Sequenzierleiter gemäß dem vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen Terminator-Titrationsassay erforderlichen relativen molaren Überschuss an farbstoffmarkiertem C-Terminator für verschiedene Kombinationen von Farbstoffen und Linkem. Der relative molare Überschuss ist wie vorstehend definiert. Wie aus der Tabelle ersichtlich, erfordert der C-Terminator, bei dem der Propargyl-1-ethoxyamido-Linker verwendet wird, einen 6- bis 2-fach geringeren molaren Überschuss verglichen mit Terminatoren, bei denen herkömmliche Propargylamido- Linker verwendet werden, in Abhängigkeit von den verwendeten Farbstoffen.
- Der in diesem Beispiel beschriebene Assay bestimmt die Präferenz, die eine DNA- Polymerase für einen nicht-farbstoffmarkierten Terminator gegenüber einem farbstoffmarkierten Terminator zeigt, um die Wirkung verschiedener Terminator- Farbstofflinkerarm-Strukturen auf den Einbau des Terminators zu quantifizieren. Bei diesem Assay liegen ein unmarkierter Terminator und der entsprechende farbstoffmarkierte Terminator in gleichen Konzentrationen vor und man lässt sie um die gleiche Polymerase- Substratbindungsstelle unter Enzym-begrenzenden (steady state) Bedingungen konkurrieren.
- Unter Bezugnahme auf Fig. 3 umfassen die Komponenten des Assays ein 36-Nucleotid- Templat (5), einen 25-Nucleotid-Primer (10) mit einer Sequenz, die komplementär zu der des Templats ist und mit einem ersten Fluoreszenzmarker am 5'-Ende (15), einen unmarkierten Terminator (20), einen farbstoffmarkierten Terminator (25) mit einem damit verbundenen zweiten Fluoreszenzmarker (30), der spektral vom ersten Fluoreszenzmarker unterscheidbar ist und ein Polymeraseenzym. Im vorliegenden Beispiel war der unmarkierte Terminator 2',3'-ddCTP und der farbstoffmarkierte Terminator 6-(FAM)-ddCTP, wobei zur Bindung des Farbstoffs an das Nucleotid verschiedene Linkerarme verwendet wurden. Die Templat-DNA enthielt ein einzelnes G (35) an der Templatposition nach dem Ende des Primers. Der Einbau des unmarkierten Terminators (20) führte zur Bildung eines 26 Basen langen Primerprodukts, das mit ddC (40) endete, während der Einbau des farbstoffmarkierten Terminators zur Bildung eines 26 Basen langen Primerprodukts führte, das mit (FAM)-ddC (45) endete.
- Die Produkte (40) und (45) wurden durch elektrophoretische Trennung und Nachweis der erhaltenen Banden unter Verwendung einer ABI PRISMTM 373 DNA-Sequenziermaschine (PE Applied Biosystems) nachgewiesen. Ein typisches Bandenmuster bestand aus einer 25- mer Bande, die dem markierten Primer (10) entsprach, einer 26-mer Bande, die dem Produkt (40) entsprach und einem "scheinbaren 27-mer", das dem Produkt (45) entsprach. Die in Produkt (45) beobachtete scheinbare zusätzliche Base ist das Resultat der Wirkung des farbstoffmarkierten Terminators auf die elektrophoretische Mobilität des Fragments. Durch Entnahme von Proben aus einem Reaktionsgemisch und Bestimmung der relativen DNA-Mengen in den 25-, 26- und scheinbaren 27-mer-Banden als Funktion der Zeit war es möglich, die relativen Einbauraten der unmarkierten und farbstoffmarkierten Terminatoren bei der Reaktion zu bestimmen. Nach der Korrektur des Farbstoff-Energietransfers (vgl. nachstehende Ausführungen) zeigte sich, dass das Verhältnis der Einbauraten ein direktes Maß der Präferenz des Enzyms für einen unmarkierten Terminator gegenüber einem farbstoffmarkierten Terminator war. Auf diese Weise war es möglich, die Wirkung der Linkerstruktur auf den Einbau des Farbstoffterminators zu bestimmen.
- Im Fall des Produkts (45) ist es notwendig, das Fluoreszenzsignal bezüglich Fluoreszenzenergietransfer zu korrigieren, der zwischen dem ersten Fluoreszenzmarker (15), der am 5'-Ende des Produkts (45) angeordnet ist, TAMRA in diesem Beispiel, und dem zweiten Fluoreszenzmarker (30), der sich auf dem am 3'-Ende des Produkts (45) angeordneten Terminator befindet, FAM in diesem Beispiel, stattfindet. Unter den Nachweisbedingungen verstärkt die Gegenwart des 3-FAM-Markers das vom TAMRA- Marker stammende Signal. Die Korrektur des Energietransfers wird durch Synthese eines zweifach markierten internen Standardmoleküls mit der gleichen Struktur wie Produkt (45), Herstellen einer Kontrollprobe, die gleiche molare Anteile des 5'-TAMRAmarkierten Primers (10) und des zweifach markierten internen Standardmoleküls enthält, und Laufenlassen der Kontrollprobe in einer Kontrollspur auf dem gleichen Gel wie die Assayprodukte (40) und (45) durchgeführt. Jeglicher Unterschied der TAMRA-Fluoreszenz zwischen dem Primer (10) und dem zweifach markierten internen Standardmolekül ist ein quantitatives Maß für das Ausmaß des Energietransfers zwischen den Farbstoffeinheiten im Assayprodukt (45). Z. B. ist für den gleichen molaren Anteil an Primer (10) und an zweifach markiertem internen Standard die TAMRA-Fluoreszenz des internen Standards typischerweise 1,6 bis 1,7 mal höher als die TAMRA-Fluoreszenz des Primers (10), was vermuten lässt, dass die FAM- Einheit Energie auf den TAMRA-Farbstoff im internen Standard überträgt, was zu einer künstlich hohen TAMRA-Fluoreszenz führt. Diese Bestimmung wurde durchgeführt, um die TAMRA-Fluoreszenz des Produkts (45) in jeder der Testprobenspuren zu korrigieren.
- Die Reaktionsbedingungen, die zur Bestimmung der Präferenz einer mutanten Form von Taq-DNA-Polymerase ("AmpliTaq FS") für ddCTP gegenüber FAM-ddCTP verwendet werden, sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt. (Die Zahl in Klammern bei bestimmten Komponenten bezieht sich auf Elemente in Fig. 3.)
- TRIS-Cl, pH 9,0 bei 20ºC 80 mM
- 5'-TAMRA-markierter Primer (10) 1000 nM
- Templat (5) 1000 nM
- MgCl&sub2; 2,4 mM
- ddCTP (20) 200 uM
- FAM-ddCTP (25) 200 uM
- AmpliTaq FS Polymerase 8 nM
- Reaktionstemperatur 60ºC
- Die Assay-Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt. Zwei 2x-konzentrierte "Halbreaktionsgemische" wurden hergestellt und auf Eis gelagert. Eine erste Lösung, das "2 Enz DNA" -Gemisch, umfasste 2000 nM Templat/Primer-DNA und 16 nM AmpliTaq FS in 80 mM TRIS-Puffer. Eine zweite Lösung, das "2· Mg Nuc" -Gemisch, umfasste 80 mM TRIS-Puffer plus 4,8 mM MgCl&sub2; und jedes der Nucleotide in einer Konzentration von 400 uM. Eine "Zeitpunkt Null-Kontroll"-Probe wurde durch Zugeben von 1 ul des 2· Enz DNA - Gemisches zu 25 ul der "STOP-Lösung" (0,5 M EDTA, ºC) und nach dem Mischen hergestellt, und zwar durch Zugeben von 1 ul des 2· Mg Nuc -Gemisches. Die Zeitpunkt Null-Kontrollprobe wurde solange auf Eis gelagert, bis der Rest der zeitlich abgestimmten Proben auch für die Weiterbearbeitung gesammelt wurden.
- Der Rest eines jeden Halbreaktionsgemisches wurde 5 min bei 60ºC vorinkubiert und die Assay-Reaktion durch Zugeben eines gleichen Volumens des 2· Mg Nuc -Gemisches zum 2· Enz DNA -Gemisch gestartet. Zu geeigneten Zeitpunkten (in diesem Beispiel bei 20- Sekunden-Intervallen) wurden Proben entnommen (jeweils 2 ul) und schnell in 25 ul der eiskalten STOP-Lösung gequencht. Insgesamt wurden während eines Zeitraums von etwa 200 s 10 Proben gesammelt.
- Um eine Überlastung des Detektors im 373 DNA-Sequenziergerät zu verhindern, wurden die Proben weiterverarbeitet, um überschüssiges nicht-eingebautes FAM-ddCTP zu entfernen. Dies wurde durch eine Lithiumchlorid-Ethanol-Präzipitation unter Verwendung von tRNA als Träger erreicht. 5 ul einer gequenchten Probe wurden 250 ul einer "PPT-Lösung" (bestehend aus 0,8 M LiCl plus 0,2 ug/ml E. coli tRNA) zugesetzt. Nach dem Mischen wurden 750 ul 95% Ethanol zugesetzt. Jede Probe wurde gemischt und 30 bis 60 min auf Eis aufbewahrt, um die Primer/Templat-DNA auszufällen.
- Um Proben zum Einbringen in die 373 herzustellen, wurde das LiCl/Ethanol-Präzipitat in einer Mikrozentrifuge 5 min bei 10000 · g pelletiert und die überstehende Flüssigkeit abgesaugt. Nach 5 min Lufttrocknen wurden 50 ul "Gel-Probenlösung" (50% Formamid plus 3% Dextranblau) zugesetzt. Pellets wurden durch heftiges Mischen und 3 min Erhitzen bei 95ºC gelöst, worauf 3 ul jeder Probe auf getrennte Spuren eines 16%igen denaturierenden Polyacrylamid-Sequenziergels (ABI PRISMTM 373 DNA Sequencing System User's Manual) aufgebracht wurden. Die Elektorphorese-Laufbedingungen waren 2600 V, 50 mA, 100 mW. Der Nachweis des Fluoreszenzsignals in jeder der Banden wurde unter Verwendung der GeneScanTM-Software (PE Applied Biosystems, p/n 672-30) durchgeführt.
- Eine "Kontrollspur" wurde mit 3 ul der Gel-Probenlösung enthaltend 10 fmol TAMRAmarkierten Primer und 10 fmol des zweifach farbstoffmarkierte internen Standards beladen. Das Ausmaß der TAMRA-Fluoreszenz wurde für die 25-mer Bande bestimmt und mit dem TAMRA-Signal in der Bande des internen Standards verglichen. In diesem Fall, wie vorstehend erwähnt, war das TAMRA-Signal des internen Standards 1,6 mal höher als das TAMRA-Signal der Primerbande. Daher wurde das TAMRA-Signal in jeder der Assay- Produkt (45)-Banden mit einem Korrekturfaktor von 1/1,6 multipliziert.
- Die relativen DNA-Mengen in jeder der Banden einer gegebenen Spur wurden durch Dividieren der Fluoreszenzeinheiten in jeder der Banden durch die Gesamtzahl der Einheiten für diese Bande und Multiplizieren dieser Zahl durch die Konzentration des DNA- Primers/Templats in der Reaktion berechnet. Dies normalisierte das Signal in jeder der Spuren auf die DNA-Gesamtkonzentration in der Reaktion und korrigierte die Unterschiede von Spur zu Spur aufgrund von Gel-Beladungsartefakten.
- Um die Einbaurate jedes der Nucleotide zu bestimmen, wurden die DNA-Mengen in jeder der Banden gegen die Zeit aufgetragen und die linearen Abschnitte einer jeden Kurve wurden unter Verwendung eines Fit-Programms nach dem Verfahren der kleinsten Fehlerquadrate gefitted. Die Einbaurate wurde für das unmarkierte ddC als die Rate des Auftretens des 26-mer Assay-Produkts (40) berechnet, während die Einbaurate für FAM- ddC als die Rate des Auftretens des scheinbaren 27-mer Assay-Produkts (45) berechnet wurde. Das Verhältnis dieser Raten zeigte die Präferenz, die die DNA-Polymerase für ddCTP gegenüber FAM-ddCTP aufwies.
- Fig. 4 zeigt repräsentative Daten, die die Einbauraten von unmarkierten und farbstoffmarkierten Terminatoren vergleichen. Die in der Figur gezeigten Daten wurden bezüglich Energietransfereffekten, wie vorstehend diskutiert, korrigiert. Als Linker wurde der Propargylamido-Linker verwendet.
- Die Daten in der nachstehenden Tabelle zeigen, dass es eine Präferenz für unmarkiertes ddCTP gegenüber einem beliebigen der geprüften farbstoffmarkierten Derivate gibt, ungeachtet des im Einzelnen verwendeten Farbstoffs oder Linkers. Das Ausmaß dieser Präferenz hängt jedoch stark vom Typ des zur Bindung des Farbstoffs an die Base verwendeten Linkerarms ab. Im Fall des herkömmlichen Propargylamido-Linkers ist ddCTP 65· mehr bevorzugt als FAM-ddCTP und mehr als 800· mehr bevorzugt als HEX-ddCTP. Wenn der Linkerarm durch lediglich 3 Atome (ein Ethersauerstoffatom und zwei Methylen- Kohlenstoffatome, d. h. den Propargyl-1-ethoxyamido-Linker) verlängert wird, wird die Präferenz gegenüber FAM-ddCTP von 65· auf 19· und für HEX-ddCTP von über 800· auf nur etwa 4· verringert, ein Rückgang um einen Faktor von über 200. Der Einschub von zwei Ethereinheiten (d. h. im Propargyl-2-ethoxyamido-Linker) zwischen dem Propargyl-Linker und dem Farbstoff hat jedoch einen schädlichen Effekt, wobei die Präferenz gegenüber FAM- ddCTP etwa 2-fach erhöht wird (von 65· auf 110·).
- (6-FAM)-Propargylamido-C 65·
- (6-FAM)-Propargyl-1-ethoxyamido-C 19·
- (6-FAM)-Propargyl-2-ethoxyamido-C 110·
- (HEX)-Propargylamido-C > 800·
- (HEX)-Propargyl-1-ethoxyamido-C 4·
- Dünnschichtchromatographie (DC) wurde auf Glasplatten durchgeführt, die mit 250 um- Schichten von Silicagel 60-F&sub2;&sub5;&sub4; beschichtet waren. Die Verbindungen wurden auf der DC- Platte nach dem Entwickeln durch Quenchen der Fluoreszenz und/oder durch Verkohlen mit 5% Schwefelsäure lokalisiert. Für die Flash-Säulenchromatographie wurde SIP Silicagel 60 Å, 230-400 Mesh ASTM (Baxter Scientific p/n C4582-87) verwendet. NMR-Spektren wurden wie folgt erhalten: ¹H-NMR-Spektren wurden bei 300 MHz in CDCl&sub3; (Me&sub4;Si als interner Standard, δ 0) oder D&sub2;O (Me&sub4;Si als externer Standard, δ 0) bei Umgebungstemperatur, ¹³C- NMR-Spektren bei 75,5 MHz in CDCl&sub3; (Me&sub4;Si als interner Standard, δ 0), ¹&sup9;F-NMR-Spektren bei 282,23 MHz in CDCl&sub3; oder D&sub2;O (CFCl&sub3; als externer Standard, δ 0) und ³¹P-NMR- Spektren bei 121,44 MHz in D&sub2;O aufgenommen. In allen Fällen stimmten die NMR-Daten mit den vorgeschlagenen Strukturen überein. Falls nichts anderes angegeben ist, wurden alle Umsetzungen bei Raumtemperatur durchgeführt und bei der Aufarbeitung wurden Lösungen in organischen Lösungsmitteln mit gleichen Volumina wäßriger Lösungen gewaschen.
- Organische Lösungen wurden im Allgemeinen über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, bevor sie in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 40-50ºC konzentriert wurden. Für analytische und präparative Zwecke wurde das nachstehende HPLC-System verwendet:
- Analytische Umkehrphasen-HPLC: Säule: Spheri-5 RP-C18, 5 um Teilchengröße, 220 · 4,6 mm (PE Applied Biosystems p/n 0711-0017); Gradient: 0 bis 50% Acetonitril bei 1,5 ml/min während 20 min. gefolgt von 50% Acetonitril bis 100% Acetonitril bei 1,5 ml/min während 10 min.
- Analytische Ionenpaarungs-HPLC: Säule: AquaporeTM OD-300, 7 um Teilchengröße, 220 · 4,6 mm (PE Applied Biosystems p/n 0711-0331); Gradient: 0 bis 40% Acetonitril bei 1,5 ml/min während 30 min. gefolgt von 40% Acetonitril bis 60% Acetonitril bei 1,5 ml/min während 5 min.
- Präparative Anionenaustausch-HPLC: Säule: AquaporeTM Anion, 20 um Teilchengröße, 250 · 10 mm (PE Applied Biosystems p/n 0711-0172); Gradient: 40% Acetonitril: 60% 100 mM TEAB, pH 7,0 bis 40% Acetonitril: 60% 1,5 mM TEAB, pH 8 bei 4,5 ml/min während 20 min. gefolgt von isokratischer Elution.
- Präparative Umkehrphasen-HPLC: Säule: Prep Nova Pak HR-C18, 6 um Teilchengröße, 60 A Porengröße, 300 · 40 mm (Waters Division of the Millipore Corporation pin WAT037704); Gradient (für Mono- und Triphosphate): 100% 100 mM TEAB pH 7 bis 20% Acetonitril: 80% 100 mM TEAB pH 7 bei 50 ml/min während 30 min gefolgt von 20% Acetonitril: 80% 100 mM TEAB pH 7 bis 50% Acetonitril: 50% 100 mM TEAB, pH 7 während 10 min; Gradient (für farbstoffmarkierte Triphosphate): 100% 100 mM TEAB pH 7 bis 10% 100 mM TEAB pH 7 : 90% Acetonitril.
- Kaliumphthalimid 2 (2,7 g, 14,6 mmol) wurde einer Lösung von Bromethanol 1 in N,N- Dimethylformamid (12 ml, 14,1 mmol) zugesetzt. Nach 12 h Rühren bei 70ºC wurde das Gemisch konzentriert und dann mit Dichlormethan verdünnt (100 ml). Nach dem Abfiltrieren von Feststoffen wurde die organische Schicht mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert. Das Konzentrat wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Hexan- Ethylacetat 3 : 2 bis 2 : 3) gereinigt, wobei Verbindung 3 als weißer Feststoff (1,19 g, 44,12%) mit einem Rf-Wert von 0,22 (Hexan-Ethylacetat 3 : 2) erhalten wurde, vgl. Fig. 5.
- Einer gerührten Lösung von Verbindung 3 (1,14 g, 5,96 mmol) in N,N-Dimethylformamid (20 ml) wurde NaH (0,36 g, 80%) tropfenweise zugesetzt. Nach vollständiger Zugabe des NaH wurde das Rühren 0,5 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 0ºC abgekühlt. Propargylbromid 4 (1,5 ml, 13,47 mmol) wurde zugesetzt und das Rühren weitere 0,5 h bei 0ºC und dann 2 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach vorsichtiger Zugabe von Methanol, um überschüssiges NaH zu zersetzen, wurde das Lösungsmittel verdampft und das Rohprodukt mittels Flash- Säulenchromatographie (Hexan-Ethylacetat 3 : 2 bis 1 : 1 bis 2 : 3) gereinigt, wobei Verbindung 5 als Feststoff (495 mg, 36,2%) mit einem Rt-Wert von 0,22 (Hexan-Ethylacetat 3 : 2) erhalten wurde, vgl. Fig. 5.
- 5-Iod-2',3'-didesoxycytidin 6 (100 mg, 0,3 mmol) wurde mit Verbindung 5 (158 mg, 0,69 mmol) in Gegenwart von Kupfer(I)-iodid (11,4 mg, 0,06 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)- palladium (69 mg, 0,06 mmol) und Triethylamin (84 ul, 0,6 mmol) in N,N-Dimethylformamid (1 ml) 12 h bei Raumtemperatur unter Argon umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 2 g Dowex-1 Anionenaustauscherharz, Hydrogencarbonatform, in Methanol verdünnt. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Dichlormethan-Methanol 13 : 1) gereinigt, wobei Verbindung 7 (75 mg, 57,66%) mit einem Rt-Wert von 0,23 (Dichlormethan- Methanol 9 : 1) erhalten wurde, vgl. Fig. 6.
- Ein Gemisch von Verbindung 7 (73 mg, 0,17 mmol) und Ethylendiamin (400 ul) wurde 1 h bei 80ºC in Ethanol (4 ml) erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne eingedampft, der Rückstand in N,N-Dimethylformamid (2 ml) gelöst und der Lösung Methyltrifluoracetat (6,5 ml) zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei 80ºC wurde das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand mittels Flash-Säulenchromatographie (Dichlormethan- Methanol 9 : 1) gereinigt, wobei Verbindung 8 (36 mg, 50,7%) mit einem Rt-Wert von 0,24 (Dichlormethan-Methanol 9 : 1) erhalten wurde, vgl. Fig. 6.
- Frisch destilliertes Phosphoroxychlorid (16,2 ul, 0,17 mmol) wurde Nucleosid 8 (18,8 mg, 0,046 mmol) in Trimethylphosphat (150 ul) bei -30ºC zugesetzt, wobei das entsprechende Dichlormonophosphat 9 gebildet wurde. Man ließ das Reaktionsgemisch während 80 min auf -5ºC erwärmen und das Rühren wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Umsetzung wurde mit 2 M TEAB-Puffer pH 8,0 gequencht und wie vorstehend beschrieben durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Produkthaltige Fraktionen wurden konzentriert, wobei das Monophosphat 10 (12,3 mg, 54,56%) erhalten wurde, vgl. Fig. 7.
- Das in N,N-Dimethylformamid (200 ul) gelöste Monophosphat 10 (7,4 mg, 15,3 mmol) wurde mit Carbonyldiimidazol (CDI) (4,2 mg, 25,9 mmol) 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges CDI wurde durch Zugabe von trockenem Methanol (40 ul) gequencht. Das aktivierte Monophosphat 11 wurde mit einer Lösung von Tributylammoniumpyrophosphat in N,N-Dimethylformamid (160 ul), das n-Tributylamin (16 ul) enthielt, 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde mit 2 M TEAB pH 8,0 gequencht und wie vorstehend beschrieben durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Produkthaltige Fraktionen wurden konzentriert, wobei das Triphosphat 12 erhalten wurde, vgl. Fig. 8.
- Das gereinigte und geschützte Triphosphat 12 wurde in konzentrierter wäßriger NH&sub4;OH (4 ml) aufgenommen und 2,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wobei Verbindung 13 erhalten wurde. Verbindung 13 wurde mit 0,1 M TEAB pH 7,0 zu einer Konzentration von 2,6 mM formuliert. Die Konzentration und Reinheit der erhaltenen Lösung wurde wie vorstehend beschrieben mittels UV/Vis-Spektroskopie bzw. analytischer Ionenpaarungs-HPLC bestätigt, vgl. Fig. 8.
- Materialien und Verfahren entsprachen im Wesentlichen den vorstehend in Beispiel 5 beschriebenen.
- Einer Lösung von 2-(2-Chlorethoxy)ethanol 14 (5 ml, 47,4 mmol) in N,N-Dimethylformamid (35 ml) wurde Kaliumphthalimid 2 (8,8 g, 47,51 mmol) zugesetzt. Nach 20 h Rühren bei 70ºC wurde das Gemisch konzentriert und dann mit Dichlormethan verdünnt (300 ml). Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (Hexan-Ethylacetat 3 : 2 bis 2 : 3) gereinigt, wobei Verbindung 15 als weißer Feststoff (7,15 g, 64,17%) mit einem Rf-Wert von 0,12 (Hexan-Ethylacetat 3 : 2) erhalten wurde, vgl. Fig. 9.
- Einer gerührten Lösung von Verbindung 15 (1,39 g, 5,91 mmol) in N,N-Dimethylformamid (25 ml) wurde tropfenweise NaH (0,33 g, 80%) zugesetzt. Nach vollständiger Zugabe des NaH wurde das Rühren 0,5 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf 0ºC abgekühlt. Propargylbromid 4 (1,24 ml, 11,13 mmol) wurde zugesetzt und das Rühren für weitere 0,5 h bei 0ºC und dann 2 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach vorsichtiger Zugabe von Methanol, um überschüssiges NaH zu zersetzen, wurde das Lösungsmittel verdampft und das Rohprodukt mittels Flash- Säulenchromatographie (Hexan-Ethylacetat 3 : 2 bis 1 : 1 bis 2 : 3) gereinigt, wobei Verbindung 16 als Feststoff (591 mg, 36,6%) mit einem Rf-Wert von 0,41 (Hexan-Ethylacetat 3 : 2) erhalten wurde, vgl. Fig. 9.
- 5-Iod-2',3'-didesoxycytidin 6 (240 mg, 0,71 mmol) wurde mit Verbindung 16 (810 mg, 2,69 mmol) in Gegenwart von Kupfer(I)-iodid (33 mg, 0,173 mmol), Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (164 mg, 0,142 mmol) und Triethylamin (198 ul, 1,42 mmol) in N,N- Dimethylformamid (4 ml) 12 h bei Raumtemperatur unter Argon umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 4 g Dowex-1 Anionenaustauscherharz, Hydrogencarbonatform, in Methanol verdünnt. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde mittels Flash- Säulenchromatographie (Dichlormethan-Methanol 13 : 1) gereinigt, wobei Verbindung 17 (245 mg, 71,3%) mit einem Rf-Wert von 0,35 (Dichlormethan-Methanol 9 : 1) erhalten wurde, vgl. Fig. 10.
- Ein Gemisch von Verbindung 17 (230 mg, 0,48 mmol) und Ethylendiamin (1 ml) wurde 1 h bei 80ºC in Ethanol (10 ml) erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne eingedampft, der Rückstand in N,N-Dimethylformamid (5 ml) gelöst und der Lösung Methyltrifluoracetat (15 ml) zugesetzt. Nach 1 h Rühren bei 80ºC wurde das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand mittels Flash-Säulenchromatographie (Dichlormethan- Methanol 13 : 1) gereinigt, wobei Verbindung 18 (72 mg, 33,7%) mit einem Rf-Wert von 0,37 (Dichlormethan-Methanol 9 : 1) erhalten wurde, vgl. Fig. 10.
- Frisch destilliertes Phosphoroxychlorid (34,8 ul, 369 umol) wurde Nucleosid 18 (41,1 mg, 92 umol) in Trimethylphosphat (350 ul) bei -30ºC zugesetzt, wobei das entsprechende Dichlormonophosphat 19 gebildet wurde. Man ließ das Reaktionsgemisch während 80 min auf -5ºC erwärmen und das Rühren wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Umsetzung wurde mit 2 M TEAB-Puffer pH 8,0 gequencht und wie vorstehend beschrieben durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Produkthaltige Fraktionen wurden konzentriert, wobei das Monophosphat 20 (14,8 mg, 27,6%) erhalten wurde, vgl. Fig. 11.
- Das in N,N-Dimethylformamid (300 ul) gelöste Monophosphat 20 (14,8 mg, 28 umol) wurde mit Carbonyldiimidazol (CDI) (13,5 mg, 83,26 umol) 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges CDI wurde durch Zugabe von trockenem Methanol (80 ul) gequencht. Das aktivierte Monophosphat 21 wurde mit einer Lösung von Tributylammoniumpyrophosphat (160 mg) in N,N-Dimethylformamid (300 ul), das n-Tributylamin (32 ul) enthielt, 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde mit 2 M TEAB pH 8,0 gequencht und wie vorstehend beschrieben durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Produkthaltige Fraktionen wurden konzentriert, wobei das Triphosphat 22 (0,9 mg, 4,7%) erhalten wurde, vgl. Fig. 12.
- Das gereinigte und geschützte Triphosphat 22 wurde in konzentrierter wäßriger NH&sub4;OH (2 ml) aufgenommen und 3 h bei etwa 48ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wobei Verbindung 23 erhalten wurde. Verbindung 23 wurde mit 0,1 M TEAB pH 7,0 zu einer Konzentration von 3,5 mM formuliert. Die Konzentration und Reinheit der erhaltenen Lösung wurde wie vorstehend beschrieben mittels UV/Vis-Spektroskopie bzw. analytischer Ionenpaarungs-HPLC bestätigt, vgl. Fig. 12.
- Das Nucleosid-Aminotriphosphat in 100 mM TEA-Hydrogencarbonat (pH 7,0) wurde zur Trockne eingedampft. Anschließend wurde es in 250 mM Hydrogencarbonat-Puffer (pH 9,0) resuspendiert. Eine Lösung von Farbstoff-NHS (in DMSO) wurde zugesetzt und bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde wie vorstehend beschrieben mittels präparativer Ionenaustausch-HPLC gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden konzentriert und wie vorstehend beschrieben mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC erneut gereinigt. Das Endprodukt wurde unter vermindertem Druck getrocknet und mit 50 mM CAPSO, pH 9,6 auf eine Konzentration von 1 mM verdünnt. Die Konzentration und Reinheit der erhaltenen Lösung wurde wie vorstehend beschrieben mittels UV/Vis-Spektroskopie bzw. analytischer Ionenpaarungs- HPLC bestätigt.
- Fig. 13 zeigt Einzelfarben-Sequenzierreaktionen, bei denen farbstoffmarkierte ddCTP als Terminator verwendet wurden. Die obere Abbildung zeigt Ergebnisse, die unter Verwendung eines DTAMRA-1-markierten Terminators, der einen Propargylamido-Linker enthielt, erzielt wurden, während die untere Abbildung Ergebnisse zeigt, die unter Verwendung eines DTAMRA-2-markierten Terminators, der einen erfindungsgemäßen Propargyl-1- ethoxyamido-Linker enthielt, erzielt wurden. Für optimale Ergebnisse wurden verschiedene Farbstoffisomere eingesetzt, und zwar das 1-Isomer als bevorzugte Verbindung zur Verwendung mit dem Propargylamido-Linker und das 2-Isomer als bevorzugte Verbindung zur Verwendung mit dem Propargyl-1-ethoxyamido-Linker. Der Abschnitt der in Fig. 13 gezeigten Sequenzierleiter beginnt mit einem Paar von C's an den Basen 495 und 496 und endet mit einzelnen C's an den Basen 553, 557 und 560 in der Sequenz von pGEM-3Zf(+) unter Verwendung des -21 M13-Primers (vorwärts). In der oberen Abbildung, in der Gruppe von 6 C's, ist das erste C lediglich als Schulter vorhanden und nicht als getrennter Peak, während in der unteren Abbildung alle 6 C's klar aufgelöst sind. Die Auflösung der 6 C's in der unteren Abbildung wird durch die gleichmäßigeren Peakhöhen ermöglicht, die bei Verwendung des erfindungsgemäßen Propargyl-1-ethoxyamido-Linkers in Kombination mit Rhodamin-Farbstoffen erhalten werden. Diese verbesserte Auflösung benachbarter Peaks erleichtert automatische Basenerkennungs-Routinen, wie sie in automatischen Sequenziersystemen eingesetzt werden.
- Obwohl vorstehend nur wenige Ausführungsformen detailliert beschrieben wurden, ist es für den Fachmann klar, dass die bevorzugte Ausführungsform vielfältig modifiziert werden kann, ohne von der erfindungsgemäßen Lehre abzuweichen. Alle derartigen Modifikationen sind von den nachstehenden Patentansprüchen umfasst.
Claims (10)
1. Eine Nucleosidverbindung der allgemeinen Formel
worin:
R&sub1; und R&sub2; getrennt voneinander aus der Gruppe bestehend aus -H, Niederalkyl, einer
Schutzgruppe und einem Marker ausgewählt sind;
B eine 7-Desazapurin-, Purin- oder Pyrimidin-Nucleosidbase ist;
wobei dann, wenn B Purin oder 7-Desazapurin ist, der Zuckerrest an der N&sup9;-Position des
Purins oder Desazapurins gebunden ist, und dann, wenn B Pyrimidin ist, der Zuckerrest an
der N¹-Position des Pyrimidins gebunden ist; und
wobei dann, wenn B ein Purin ist, das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an
der 8-Position des Purins gebunden ist, wenn B 7-Desazapurin ist, das benachbarte
dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 7-Position des 7-Desazapurins gebunden ist,
und wenn B Pyrimidin ist, das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 5-
Position des Pyrimidins gebunden ist;
W&sub1; aus der Gruppe bestehend aus -H und -OH ausgewählt ist;
W&sub2; die Gruppe -OH oder ein Rest ist, der verhindert, dass an der 3'-Position des Nucleosids
eine Phosphodiesterbindung gebildet wird; und
W&sub3; aus der Gruppe bestehend aus -PO&sub4;, -P&sub2;O&sub7;, -P&sub3;O&sub1;&sub0;, einem Phosphatanalogon und -OH
ausgewählt ist.
2. Nucleosidverbindung nach Anspruch 1, wobei einer der Reste R&sub1; und R&sub2; ein Marker
ist.
3. Nucleosidverbindung nach Anspruch 2, wobei der Mater ein Farbstoff des
Fluorescein-Typs ist.
4. Nucleosidverbindung nach Anspruch 2, wobei der Marker ein Farbstoff des Rhodamin-
Typs ist.
5. Nucleosidverbindung nach Anspruch 1, wobei W&sub1; -H und W&sub2; -OH oder ein Rest, und
W&sub3; -P&sub3;O&sub1;&sub0; ist.
6. Nucleosidverbindung nach Anspruch 1, wobei W&sub1; -H und W&sub2; -OH oder ein Rest ist, der
verhindert, dass an der 3'-Position des Nucleosids eine Phosphodiesterbindung gebildet
wird, und W&sub3; -P&sub3;O&sub1;&sub0; ist.
7. Nucleosidverbindung nach Anspruch 1, wobei W&sub2; -OH oder ein Rest ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus -H, Azid, Amino, Fluor und Methoxy ist.
8. Nucleosid nach Anspruch 1, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Uracil, Cytosin, 7-
Desazaadenin und 7-Desazaguanosin ausgewählt ist.
9. Verfahren zum Ausführen einer Primer-Extensionsreaktion, umfassend die Schritte:
Bereitstellen einer Templat-Nucleinsäure;
Binden eines Oligonucleotid-Primers an einen Abschnitt der Templat-Nucleinsäure;
und
Zugeben von Primer-Extensionsreagenzien zum Primer-Templat-Hybrid zur Extension
des Primers, wobei die Primer-Extensionsreagenzien eine Nucleosidverbindung der
allgemeinen Formel
einschließen, worin
R&sub1; und R&sub2; getrennt voneinander aus der Gruppe bestehend aus -H, Niederalkyl, einer
Schutzgruppe und einem Marker ausgewählt sind;
B eine 7-Desazapurin-, Purin- oder Pyrimidin-Nucleosidbase ist;
wobei dann, wenn B Purin oder 7-Desazapurin ist, der Zuckerrest an der N&sup9;-Position
des Purins oder Desazapurins gebunden ist, und dann, wenn B Pyrimidin ist, der
Zuckerrest an der N¹-Position des Pyrimidins gebunden ist; und
wobei dann, wenn B ein Purin ist, das benachbarte dreifach-gebundene
Kohlenstoffatom an der 8-Position des Purins gebunden ist, wenn B 7-Desazapurin ist,
das benachbarte dreifach-gebundene Kohlenstoffatom an der 7-Position des 7-
Desazapurins gebunden ist, und wenn B Pyrimidin ist, das benachbarte
dreifachgebundene Kohlenstoffatom an der 5-Position des Pyrimidins gebunden ist;
W&sub1; aus der Gruppe bestehend aus -H und -OH ausgewählt ist;
W&sub2; die Gruppe -OH oder ein Rest ist, der verhindert, dass an der 3'-Position des
Nucleosids eine Phosphodiesterbindung gebildet wird; und
W&sub3; aus der Gruppe bestehend aus -PO&sub4;, -P&sub2;O&sub7;, -P&sub3;O&sub1;&sub0;, einem Phosphatanalogon und
-OH ausgewählt ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei einer der Reste R&sub1; und R&sub2; ein Marker und der
andere -H ist.
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