DE69703047T2

DE69703047T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur detoxifizierung von moniliformin

Info

Publication number: DE69703047T2
Application number: DE69703047T
Authority: DE
Inventors: Jon Duvick; A Rood
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1996-11-22
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 2001-01-11
Anticipated expiration: 2017-11-13
Also published as: EP0932663A1; NZ335211A; CA2272554A1; EP0932663B1; HUP9904074A3; AU728202B2; ATE196161T1; CA2272554C; DE69703047D1; JP2001504347A; US6083736A; WO1998022572A1; AU5355998A; HUP9904074A2; TR199901118T2; US6001638A; ES2151748T3; PT932663E; RO118757B1; BR9713389A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen den Nachweis und die Isolierung von Moniliformin-abbauenden Bakterien und Zusammensetzungen und Verfahren zur Entgiftung oder zum Abbau von Moniliformin in Getreide. Dieses Verfahren besitzt ein weites Anwendungsgebiet in der Getreidewirtschaft und bei der Verbesserung der Qualität von Getreide für Nahrungsmittel und der Futtermittelsicherheit.

Hintergrund der Erfindung

Pilzerkrankungen sind weitverbreitete Probleme im Getreidelandbau. Es wurden viele Schritte gegen Pflanzenerkrankungen unternommen, wie beispielsweise die Verwendung von Hybridpflanzen, Pestiziden und unbewiesenen landwirtschaftlichen Praktiken. Wie jedoch jeder Züchter oder Heimgärtner bestätigen kann, verursachen die Probleme der pilzlichen Pflanzenerkrankung weiterhin Schwierigkeiten bei der Kultivierung von Pflanzen. Es besteht daher weiterhin ein Bedarf für neue Verfahren und Materialien zur Lösung der durch die Pilzerkrankungen der Pflanzen verursachten Probleme. Diesen Problemen kann durch eine Reihe von Ansätzen begegnet werden. Beispielsweise kann der infektiöse Organismus durch Verwendung von Mitteln, die selektiv biozid für die Pathogene sind, kontrolliert werden. Ein anderes Verfahren ist die Störung des Mechanismus, durch den das Pathogen die Wirtsgetreidepflanze befällt. Noch eine weitere Methode im Falle der Pathogene, die Ernteverluste verursachen, ist die Störung des Mechanismusses durch den das Pathogen die Wirtsgetreidepflanze schädigt. Eine noch weitere Methode im Falle von Pathogenen, die Toxine produzieren, die für Säugetiere oder andere Tiere, die mit diesen Getreidepflanzen gefüttert werden, ungünstig sind, ist die Störung der Toxinproduktion, -speicherung oder -aktivität.
Innerhalb der Fusarium sp. gibt es einige wichtige Pathogene von Mais und anderen Cerealien in verschiedenen Ländern. Es ist bekannt, dass das Fusarium bei Mais Wurzel-, Stengel- und Ährenfäulnis verursacht, welche zu einem ernsthaften Ernteverlust führt. Die Ethiologie von Fusarium-Ährenschimmel ist noch wenig verstanden, obwohl eine physische Schädigung der Ähre und bestimmte Umweltbedingungen zu dessen Auftreten beitragen können (Nelson, P. E., 1992, "Taxonomy und Biology of Fusarium moniliforme", Mycopathologia 117: 29-36). Fusarium kann aus den meisten auf dem Feld gezüchteten Maispflanzen, bei denen kein sichtbarer Schimmel vorhanden ist, isoliert werden. Die Beziehung zwischen Sämlinginfektion und den von Fusarium verursachten Stengel- und Ährenerkrankungen ist nicht klär. Eine genetische Widerstandsfähigkeit gegen sichtbaren Schimmel der Körner wurde nachgewiesen (Gendloff E., Rossman E., Casale W., Isleib T., Hart P., 1986, "Components of resistance to Fusarium ear rot in field corn", Phytopathology 76 : 684-688; Holley RN, Hamilton PB, Good man mm, 1989 "Evaluation of tropical maize germplasm for resistance to kernel colonization by Fusarium moniliforme", Plant Dis 73 : 578-580). Die von den die Pflanzen infizierenden Fusarium-Spezies produzierten Mykotoxine können sich in infizierten Pflanzen oder in gelagerten Getreiden anhäufen, was ernsthafte gesundheitliche Konsequenzen für Vieh, Menschen und andere Verbraucher von Fleisch oder anderen Nahrungsmittelprodukten, die mit Hilfe eines solchen Viehbestandes hergestellt wurden, darstellen. Die Infektion mit Fusarium wurde mit chronischen oder akuten Mykotoxikosen, sowohl bei landwirtschaftlichen Tieren als auch bei Menschen, in Verbindung gebracht (Botallico, et al.). Ein wichtiges Mykotoxin, von dem man herausgefunden hat, dass es von einer bestimmten Fusarium sp. produziert wird, und in Fusarium-infizierten Feldfrüchten identifiziert worden ist, ist Moniliformin.
Moniliformin ist ein wasserlösliches Toxin, das von Fusarium-Arten, wie Fusarium moniliforme und F. moniliforme var. subglutinans und auch von anderen Arten produziert wird. Diese Fusarium-Arten werden in praktisch allen Nahrungsmittel-Maissorten weltweit gefunden; von Moniliformin-produzierenden Isolaten wurde in Europa, Südafrika, den Vereinigten Staaten, Neuseeland, Taiwan und Südamerika berichtet. Es ist wahrscheinlich, dass je mehr Untersuchungen abgeschlossen werden, desto mehr Moniliformin in hohen Spiegeln in bestimmten Getreideproben auf einer Vielzahl von Gebieten gefunden werden wird. Von Moniliformin wurde gezeigt, dass es ausgeprägte toxische Wirkungen auf Tiere und Pflanzen hat. Es inhibiert selektiv die mitochondriale Pyruvat- und alpha-Ketoglutarat-Oxidationen. Getreide mit hohen Spiegeln an Moniliformin kann in seiner Verwendung beschränkt sein oder wichtigen Import/Exportverordnungen unterliegen.
Die Entdeckung von Bakterien, die fähig sind, Moniliformin zu metabolisieren, erlaubt die Detoxifikation von kontaminiertem Getreide. Diese Erfindung stellt Bakterien einer Ochrobactrum-Art bereit, die auf Moniliformin als einziger Kohlenstoffquelle wachsen können. Der Abbau von Moniliformin im Medium kann durch einen Dünnschichtchromatographie(TLC)-Test überprüft werden. In einem Ausführungsbeispiel stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, die Menge von Mykotoxin in Mais durch Inkubation von infiziertem Mais mit erfindungsgemäßen Bakterien zu reduzieren.
Es besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf nach neuen Verfahren, mit denen Moniliformin aus einer Pflanze oder geerntetem Getreide entfernt werden kann. Es wird von den Fachleuten als wichtig angesehen, die Entwicklung von Erfindungen zum Schutz des Endverbrauchers von Pflanzen oder geerntetem Getreide fortzusetzen. Die vorliegende Erfindung stellt Mittel und Verfahren bereit, die notwendig sind, Pflanzen und geerntetes Getreide bezüglich einer Kontamination durch Moniliformin zu verbessern.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Ausführungsbeispiel stellt die vorliegende Erfindung ein Wildtyp-Bakterium aus der Ochrobactrum-Art bereit, welches die Fähigkeit besitzt, Moniliformin abzubauen oder zu entgiften. Die vorliegende Erfindung kann weiterhin eine Mutante des Wildtypbakteriums umfassen, der die Fähigkeit besitzt, Moniliformin abzubauen oder zu entgiften. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Entgiftung von infizierten Getreide vor oder nach der Ernte unter Verwendung solcher erfindungsgemäßer Mikroorganismen bereit.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von Bakterien, die die Fähigkeit besitzen, das Mykotoxin Moniliformin abzubauen. Die vorliegende Erfindung resultiert aus einer Suche nach biologischen Mitteln, Moniliformin zu entgiften, und umfasst eine bakterielle Art, die von den auf dem Feld gezüchteten Maiskörnern isoliert wurde und fähig ist, auf Moniliformin als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, wobei dieses im Verlauf teilweise oder vollständig abgebaut wird.
In der Durchführung wird die vorliegende Erfindung, wenn nichts anderes angezeigt, konventionelle Techniken der Botanik, der Mikrobiologie, der Gewebekultur, der Molekularbiologie, der Chemie, der Biochemie und der rekombinanten DNA-Technologie verwenden, welche auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z. B. J. H: Langenheim und K. V. Thimann, Botany: Plant Biology and Its Relation to Human Affairs (1982), John Wiley; Cell Cultures and Somatic Cell Genetics of Plants, Bd. 1 (I. K. Vasil, Hrs. (1984); R. V. Stanier, J. L. Ingraham, M. L. Wheelis und P. R. Painter, The Microbial World, (1986), 5. Aufl., Prentice-Hall; O. D. Dhringa und J. B. Sinclair, Basic Plant Pathology Methods, (1985), CRC Press; Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Bd. I und II (D. N. Glover Hrs. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Hrs. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrs. 1984); The Series in Methods in Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan, Hrs., Academic Press, Inc.), und Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc. 1996).
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet werden und sollen wie unten angezeigt verstanden werden.
Eine Mikrobe wird als irgendein Mikroorganismus definiert (einschließlich eukaryotischer und prokaryotischer Organismen), wie Pilzen, Hefen, Bakterien, Actinomyzeten, Algen und Protozoen, wie auch andere einzellige Strukturen, die fähig sind, in Kultur zu wachsen.
Eine Moniliformin produzierende Mikrobe ist irgendeine Mikrobe, die fähig ist, das Mykotoxin Moniliformin oder Analoga hiervon zu produzieren. Solche Mikroben sind im allgemeinen Mitglieder der Pilzgattung Fusarium und auch rekombinant erhaltene Organismen, die genetisch verändert wurden, um sie zu befähigen, Moniliformin oder Analoga hiervon zu produzieren.
Mit Abbauen von Moniliformin oder mit dem Aufweisen der Fähigkeit, Moniliformin abzubauen, ist jede Modifikation oder Fähigkeit, irgendeine Modifikation am Moniliforminmolekül auszuführen, gemeint, die eine Abnahme oder den Verlust seiner toxischen Aktivität bewirkt. Eine solche Veränderung kann die Spaltung irgendeiner der verschiedenen Bindungen, eine Oxidation, eine Reduktion, die Addition oder Deletion eines chemischen Restes oder ir gendeine andere Veränderung, die die Aktivität des Moleküls beeinflusst, umfassen. Weiterhin kann chemisch verändertes Moniliformin aus Kulturen von Mikroben, die ein erfindungsgemäßes Enzym produzieren, isoliert werden, beispielsweise durch Züchten der Organismen auf Medium, das radioaktiv markiertes Moniliformin enthält, Aufspüren der Markierung und Isolieren des abgebauten Enzymes zur weiteren Untersuchung. Das abgebaute Moniliformin kann mit der aktiven Verbindung hinsichtlich seiner Toxizität bei bekannten empfindlichen Arten, wie beispielsweise dem salinen Krebs (Artenia salina L.) (Logrieco, 1993) verglichen werden.
Geerntetes Getreide wird definiert als jede Form von Getreide, das irgendwie aus der Umgebung, aus der es gezüchtet wurde, entfernt worden ist. Beispielsweise kann geerntetes Getreide Maiskolben oder Maiskörner umfassen. Geerntetes Getreide kann weiterhin solches in Lagerung oder solches, das verarbeitet wird, umfassen. Verarbeitetes Getreide ist Getreide, das in irgendeiner Art und Weise der Verarbeitung unterliegt und für die Herstellung von Nahrungsmitteln für den menschlichen Verbrauch verwendet werden wird oder als tierisches Futtermittel ("Futtermittelgetreide") verwendet werden wird.
Innerhalb dieser Anmeldung bezieht sich der Ausdruck Pflanze auf einen photosynthetischen Organismus einschließlich aber nicht begrenzt auf Algen, Moos, Fam, Gymnospermen oder Angiospermen. Vorzugsweise ist eine solche Pflanze eine, von der Futtermittelgetreide (und vorzugsweise für den Verbrauch durch Mensch oder Tier) geerntet werden kann ("geerntetes Getreide"). Besonders bevorzugt umfassen solche Pflanzen alle Kornarten (Mais), Weizen, Sorghum, Reis und Gerste.
Eine reife Pflanze wird als Pflanze definiert, bei der eine normale Entwicklung aller vegetativer und reproduktiver Organe abgelaufen ist.
Eine Pflanzenzelle umfasst jede Zelle, die von einer Pflanze abstammt, einschließlich Callus und Protoplasten und embryonische und Gameten-Zellen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolation eines Bakteriums, das die Fähigkeit besitzt, Moniliformin abzubauen, und ein Verfahren zum Abbau von Moniliformin auf einer Pflanze auf dem Feld wie auch auf geerntetem Getreide. Um das Bakterium mit der Fähigkeit, Moniliformin abzubauen, zu isolieren, wurde ein Test entwickelt, bei dem die Bakterien zunächst von einem Quellenmaterial isoliert werden. Dieses Quellenmaterial kann jedes Pflanzen- oder pflanzenassoziierte Material beinhalten, einschließlich aber nicht begrenzt auf jedes grüne Gewebe, wie den Stengel, das Blatt, die Ähre oder Körner. Pflanzenassoziiertes Material kann Erde in nahem Abstand zu der Pflanze beinhalten, ist aber hierauf nicht begrenzt. Das Bakterium wird dann in einem Medium, das Moniliformin als einzige Kohlenstoffquelle besitzt, kultiviert. Das Medium wird dann hinsichtlich des Abbaus von Moniliformin durch Dünnschichtchromatographie (TLC) überwacht.
Um die Fähigkeit von Bakterien, die mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens isoliert wurden, Moniliformin auf Pflanzen abzubauen oder zu entgiften, zu untersuchen, werden reife Pflanzen mit einem Moniliformin-produzierenden Organismus inokuliert und dann mit dem Bakterium behandelt. Die Behandlung kann eine Anwendung einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge des Organismus mit der Fähigkeit, Moniliformin abzubauen, umfasst, auf die Pflanze umfassen, wobei das Moniliformin abgebaut wird. Vorzugsweise besteht die Anwendung aus dem topischen Auftragen der Zusammensetzung auf die Gewebe der Pflanze, so dass das Moniliformin auf diesen Geweben abgebaut wird. Alternativ kann die Pflanze oder das geerntete Getreide mit dem Organimus nach Ernte behandelt werden. Reife Pflanzen können mit einem Moniliformin-produzierenden Organismus inokuliert und zu einem geeigneten Zeitpunkt geerntet werden.
Nach der Ernte können die Pflanze oder das geerntete Getreide mit einer wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Bakteriums behandelt werden. Besonders nützlich an der vorliegenden Erfindung ist die Entgiftung von auf geerntetem Getreide vorhandenem Moniliformin. Ein geeignetes Futtermittelmaterial oder "Probe" wird mit einer bekannten Menge an Mykotoxin, das in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Ethanol, bereitgestellt wird, in einer geeigneten Dosis, vorzugsweise ein ml Lösungsmittel pro Gramm, beimpft und dann ausreichend gemischt, um das Mykotoxin über das ganze Material zu verteilen. Eine Kontrollprobe erhält nur Lösungsmittel. Die Endkonzentration des Mykotoxins liegt vorzugsweise zwischen 0,1 und 1,0 mg pro Gramm Futtermittelmaterial. Die Probe kann dann an der Luft getrocknet werden, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen. Dann wird die Probe mit 105 bis 107 kolonienbildenden Einheiten (cfu)/g von 10 g-Phasen-Zellen eines Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, das Mykotoxin abzubauen, in einer ausreichenden Dosis, vorzugsweise 1 ml Zellen pro Gramm, inokuliert und dann ausreichend gemischt, um die Zellen über die Probe zu verteilen. Eine Kontrollprobe kann Zellen umfassen, die durch Erhitzen abgetötet worden sind, vorzugsweise bei etwa 80ºC. Eine Kontrollprobe kann weiterhin Zellen eines Mikroorganismus umfassen, der nicht fähig ist, das Mykotoxin abzubauen. Die Probe wird dann in einen Behälter überführt, der Behälter wird verschlossen und für eine ausreichende Zeitdauer bei einer geeigneten Temperatur inkubiert. Die entsprechende Zeitperiode liegt vorzugsweise im Bereich von einem Tag bis zwei Wochen und die Temperatur ist vorzugsweise Raumtemperatur oder etwa 28ºC. Nach Inkubation werden die Inhalte des Behälters in einem geeigneten organischen Lösungsmittel (oder organisch wässriger Mischung) extrahiert, um das Mykotoxin zurückzugewinnen. Der resultierende Extrakt wird konzentriert und einer qualitativen und quantitativen Analyse hinsichtlich der Anwesenheit des Mykotoxins unterzogen. Die Menge des in dem Extrakt nachgewiesenen Mykotoxins wird dann mit der Menge des in der Kontrollprobe nachgewiesenen Mykotoxins verglichen, und die Effizienz der Entfernung des Mykotoxins als prozentuale Reduktion des Levels dieses Mykotoxins in dem experimentellen Extrakt, verglichen mit dem Level des Mykotoxins in der Kontrollprobe ausgedrückt. In der vorliegenden Erfindung ist dieses Mykotoxin vorzugsweise Moniliformin. Dieses Verfahren erlaubt den Abbau von Moniliformin auf oder in den Pflanzen oder dem geernteten Getreide, wodurch eine verbesserte Qualität von Getreide als Nahrungsmittel und Futtermittelsicherheit bereitgestellt wird.

BEISPIEL 1. ISOLIERUNG VON BAKTERIEN, DIE MONILIFORMIN ABBAUEN

Verschiedene Pflanzenmaterialquellen, bei denen es wahrscheinlich war, dass sie natürlicherweise Moniliformin enthalten, wurden als Quellenmaterial zum Durchmustern gesammelt. Fusarium graminearum-befallene Maiskörper (92 unabhängige Proben) wurden von einer Pioneer-Hi-Bred Gibberella zeae(Fusarium graminearum)-Krankheitspflanzenschule erhalten.
Der Moniliformin-Metabolismus wurde mit Dünnschichtchromatographie gemessen. Die Mikroben wurden von dem Quellenmaterial abgewaschen, indem eine kleine Menge in eine 7 ml Falcon-Röhre gegeben wurde und wobei 1 bis 2 ml destilliertes Wasser hinzugefügt wurde (Produzieren der "Waschflüssigkeit"). Maiskörner wurden mit einer Rasierklinge gesplittet, und ein oder zwei Körner wurden verwendet. Die Röhren wurden verschlossen und 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Moniliformin (Sigma Cat. No. M5269) wurde als Lösung in Mineralsalzmedium hergestellt und als einzige Kohlenstoffquelle verwendet. Die verwendete Moniliforminkonzentration umfasst, ist aber nicht begrenzt auf, 0,75 bis 1,0 mg/ml in Mineralsalzmedium. Das Mineralsalzmedium wurde durch Kombination von Reagentien, umfassend, aber nicht begrenzt auf, 1,0 g/l Ammoniumsulfat, 1,0 g/l Natriumchlorid, 1,0 g/l dibasisches Kaliumphosphat, 0,2 g/l Magnesiumsulfat, hergestellt. Die Lösung wurde durch Filtration durch ein 0,2 Mikron-Filter sterilisiert, obwohl den Fachleuten verschiedene Verfahren zur Sterilisierung zur Verfügung stehen. 100 ul des Moniliformin/Mineralsalz-Suspensionsmediums wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte (Platte mit 96 Vertiefungen) gegeben. 1 ul frische Waschflüssigkeit wurde in jede Vertiefung gegeben. Kontrollvertiefungen erhielten 1 ul Wasser. Nach 2 Wochen wurde 1 ul aus jeder Vertiefung in eine neue Mikrotiterplatte, die 100 ul des Moniliformin/Mineralsalzmediums enthielt, überführt. Der Abbau des Moniliformins wurde mit Dünnschichtchromatographie (TLC) überprüft. Auf Silicagelplatten, die einen Fluoreszensindikator enthielten (Whatman 4410 222) wurde typischerweise 1 ug Moniliformin (typischerweise 1 ul aus den Testplatten oder 1 ul aus einer 1 mg/ml Standardlösung) aufgetropft. Der Plattenlauf wurde unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform- Ethylalkohol 3 : 2 durchgeführt. Moniliformin konnte als hellblauer Fleck unter kurzwelligem UV gesehen werden. Mikrobieller Metabolismus des Moniliformins bewirkte ein stufenweises Verschwinden des Flecks; Flecken mit veränderter Mobilität in dem TLC-System wurden unter Verwendung dieser Methode nicht nachgewiesen.
Eine Reinkultur von Bakterien, die verantwortlich für den Moniliforminabbau waren, wurde isoliert. 1 ul wurde aus positiven Vertiefungen entnommen und zu 1 ml sterilem Wasser hinzugefügt. Einige Zehnfachverdünnungen wurden in sterilem Wasser durchgeführt und 100 ul aus jeder Verdünnung wurden auf YDP-Agarplatten ausplattiert und verteilt. YDP- Agarplatten wurden durch Kombination von 10 Gramm Hefeextrakt (Difco); 20 g/l Bacto- Pepton, 0,5 g/l Dextrose, 15 g/l Bacto-Agar in Wasser, gefolgt von Sterilisierung durch Autoklavieren, hergestellt. Aus dieser Mischkultur von diesen verteilten Mischkulturplatten wurden individuelle Kolonien zur Isolation auf neuen YDP-Platten als Strichkultur angelegt. Es wurde Mühe darauf verwendet, mindestens eine von jedem Bakterientyp, der auf den ausgestrichenen Platten vorhanden war, zu wählen. Jedes Bakterium wurde verwendet, um eine Verdünnungssuspension in sterilem Wasser herzustellen, und 1 ul dieser Suspension wurde verwendet, um Mikrotitervertiefungen, die Moniliformin in Mineralsalzen, wie oben beschrieben, enthielten, zu inokulieren.
Eine erste Charakterisierung der Bakterien wurde mit Gram-Färbungsproben durchgeführt. Eine endgültigere Identifikation wurde unter Verwendung einer Reihe von Techniken ausgeführt. Strichkulturen von individuellen bakteriellen Kolonien wurden an die Microbe Inotech Laboratories, Inc. (St. Louis, MO) zur versuchsweisen Identifizierung übersandt. Die Analyse umfasste den Vergleich von bakteriellen Fettsäuremethylestern mit Aerobe und Clinical Aerobe-Datenbanken und bei BiologTM-Substratverwertungsvergleich mit einer gramnegativen Datenbank. Die Resultate dieser Untersuchungen weisen darauf hin, dass das bakterielle Isolat ein gramnegatives Ochrobactrum anthropi ist, und diese Resultate sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Kulturen wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC; 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA) am 15. Oktober 1996 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. TABELLE 1. Mikrobielle Isolate mit der Fähigkeit, Moniliformin abzubauen

BEISPIEL II: BEHANDLUNG VON MONILIFORMIN-KONTAMINIERTEM MAIS

A. Behandlung von kontaminiertem Mais auf dem Feld

Um die Fähigkeit der mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens isolierten Bakterien, Moniliformin oder dessen Derivate oder Analoga auf Mais abzubauen oder zu entgiften, zu überprüfen, werden reife Pflanzen mit einem Moniliformin-produzierenden Fusariurn sp. inokuliert und dann mit einer geeigneten Menge erfindungsgemäßer Bakterien behandelt. Die Behandlung besteht aus dem topischen Anwenden einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge Bakterien umfasst, auf die Gewebe der Maispflanze, so dass Moniliformin, umfassend jedwedes Derivat oder Analogon von Moniliformin, partiell oder vollständig abgebaut oder entgiftet wird.

B. Behandlung von kontaminiertem Mais nach Ernte

Eine 1- bis 10-Gramm Probe gespaltener Mais wird mit einer bekannten Menge von Moniliformin in Ethanol bei einer Konzentration von 1 g Moniliformin pro ml Ethanol zusammengebracht oder "beimpft", gefolgt von Mischen, um das Moniliformin über die Mischung zu verteilen. Eine Kontrollprobe oder -proben werden mit dem Lösungsmittel alleine gemischt. Die Proben werden luftgetrocknet, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen. Die Proben werden dann mit 10&sup6; cfu/g 10 g-Phase-Zellen erfindungsgemäßer Bakterien, wie die, die als MON2906.G1 bezeichnet werden (hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC 55846) bei einer Dosis von 1 ml Zellen pro Gramm inokuliert und gut gemischt, um die Zellen über die Probe zu verteilen. Kontrollen werden entweder mit Zellen dieses Mikroorganismus [bezeichnet MON2906.G1], hinterlegt bei der ATCC unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 55846), die auf 80ºC erhitzt worden waren, so dass diese Zellen nicht lebend sind oder mit Zellen eines Mikroorganismus, der nicht die Fähigkeit besitzt, Moniliformin abzubauen, vermischt. Die Mischung wird in einen Behälter gegeben, der dann verschlossen wird und zwei Wochen bei Raumtemperatur inkubiert wird. Am Ende der Inkubationsperiode werden die Container geöffnet und der vollständige Inhalt in einem geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert, um Moniliformin wiederzugewinnen. Der Extrakt wird dann konzentriert und einer qualitativen und quantitativen Analyse zum Nachweis von Moniliformin unterzogen. Die Menge an Moniliformin wird bestimmt und mit Kontrollen verglichen. Die Effizienz der Entfernung von Moniliformin wird durch Vergleich der prozentualen Reduktion der Menge an Moniliformin in der Probe, umfassend die Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Moniliformin abzubauen, mit der Reduktion der Menge an Moniliformin, die in der Kontrollprobe vorhanden ist, bestimmt. Die Bakterien mit der Bezeichnung MON2906.B2 (ATCC Hinterlegungsnummer 55854) sind auch fähig, Moniliformin abzubauen und können für den oben beschriebenen Zweck verwendet werden.

Claims

1. Bakterium einer Ochrobactrum-Art mit der Fähigkeit, Moniliformin abzubauen.

2. Bakterium nach Anspruch 1, welches Ochrobactrum anthropi ist.

3. Bakterium nach Anspruch 1, welches unter der ATCC- Hinterlegungsnummer 55846 oder ATCC-Hinterlegungsnummer 55854 hinterlegt ist.

4. Verfahren zum Abbau von Moniliformin auf einer Pflanze, umfassend das topische Anwenden einer Zusammensetzung, welche ein Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt, auf diese Pflanze.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei diese Pflanze Mais ist.

6. Verfahren zum Abbau von Moniliformin auf geerntetem Getreide, umfassend das Anwenden eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 3 auf dieses geerntete Getreide.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei dieses geerntete Getreide Mais ist.