DE69635414T2

DE69635414T2 - Nicht antigenische und durch peressigsäure vernetzte transplantate mit innerer kollagenschicht

Info

Publication number: DE69635414T2
Application number: DE69635414T
Authority: DE
Inventors: M. Robert CARR; L. Paul TERMIN; D. Kimberlie CONDON; Hardin Janet YOUNG
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2016-03-13
Also published as: JPH11503051A; EP0828453B1; EP0828453A1; ES2252753T3; CA2217581C; CA2217581A1; EP0828453A4; MX9707655A; WO1996031157A1; DE69635414D1; EP1623681A1; ES2426668T3; EP1623681B1; JP2004267791A; AU5308396A; AU711900B2; JP3756187B2; JP2012101100A; ATE308926T1; US5733337A

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
1. Gebiet der Erfindung:
Diese Erfindung bewegt sich auf dem Gebiet implantierbarer biologischer Transplantate. Die vorliegende Erfindung ist ein nicht artigenes, elastisches, biokompatibles Gewebetransplantat, das in einer Vielzahl von Formen angefertigt werden und zum Reparieren, Verstärken oder Ersetzen von Geweben und Organen in Säugetieren verwendet werden kann. Das Transplantat wird schrittweise von den Zellen des Empfängers, die das eingesetzte Transplantat ersetzen, ab- und umgebaut, um die Struktur und die Funktion wiederherzustellen, und ist nützlich für die Reparatur und die Rekonstruktion von Organen.
2. Kurzbeschreibung des allgemeinen Standes der Technik:
Trotz des wachsenden Entwicklungsstandes der medizinischen Technologie bleibt das Reparieren und Ersetzen geschädigter Gewebe ein häufiges, kostenaufwendiges und ernstes Problem im Gesundheitswesen. Gegenwärtig werden implantierbare Transplantate aus einer Reihe synthetischer und behandelter natürlicher Materialien angefertigt. Das ideale Transplantatmaterial sollte chemisch inert, nicht-karzinogen, gegenüber mechanische Beanspruchung widerstandsfähig, in der benötigten Form herstellbar und sterilisierbar sein, außerdem durch Gewebeflüssigkeiten physikalisch nicht verändert werden, keine entzündlichen oder Fremdkörperreaktion hervorrufen, keinen Allergie- oder Hypersensivitätszustand verursachen oder, in einigen Fällen, keine viszerale Adhäsionen fördern. (Jenkins S.D., et al. Surgery 94(2):392–398, 1983).
Zum Beispiel erfordern Körperwandschäden, die aufgrund von Trauma, Nekrose oder anderen Ursachen nicht mit autogenem Gewebe geschlossen werden können, das Reparieren, Verstärken oder Ersetzen durch ein synthetisches Netz. Für das Stärken oder Reparieren von Schäden der Bauchdecke sind verschiedene Transplantatmaterialien verwendet worden, einschließlich Tantalgaze, rostfreies Stahlnetz, DACRON^®, ORLON^®, FORTISAN^®, Nylon, gestricktes Polypropylen (MARLEX^®), mikroporöses geschäumtes Polytetraflourethylen (GORE-TEX^®), Dacron-verstärkter Silikongummi (SILASTIC^®), Polyglactin 910 (VICRYL^®), Polyester (MERSILENE^®), Polyglykolsäure (DEXON^®), bearbeitetes Hautkollagen vom Schaf (PSDC^®), vernetztes bovines Pericardium (PERI-GUARD^®) und konservierte menschliche Dura (LYODURA^®). Kein einziges Transplantatmaterial hat umfassende Anerkennung erworben.
Die Hauptvorteile von metallischen Netzen sind, dass sie inaktiv, infektionsresistent sind und Bindegewebswachstum anregen können. Ihr Hauptnachteil ist die Fragmentierung, die nach dem ersten Jahr der Transplantation auftritt, sowie die fehlende Biegsamkeit. Synthetische Netze haben den Vorteil, dass sie leicht geformt werden können und, außer Nylon, ihre Zugfestigkeit im Körper behalten. Ihr Hauptnachteil ist ihre fehlende Inaktivität, die Infektionsanfälligkeit und ihre Interferenz mit der Wundheilung.
Absorbierbare synthetische Netze haben den Vorteil der Unbeständigkeit an der Implantations-Stelle, aber oft den Nachteil, dass sie ihre mechanische Festigkeit aufgrund der Auflösung durch die Empfängerzelle vor einem ausreichenden Zell- und Gewebeeinwuchs verlieren.
Das am weitesten verbreitete Material zum Ersetzen von Bauchdecken und zum Stärken bei Bruchreparaturen ist MARLEX^®; jedoch berichteten verschiedene Untersuchende, dass bei Narbenkontraktion Polypropylen-Netztransplantate verformt und von dem umgebenden Gewebe in eine Windung fasrigen Gewebes abgeschieden wurden. Andere haben von einer gemäßigten bis starken Adhäsion bei Verwendung von MARLEX^® berichtet.
GORE-TEX^® wird gegenwärtig als das chemisch inerste Polymer angesehen und es wurde erkannt, dass es minimale Fremdkörperreaktionen beim Implantieren hervorruft. Ein wesentliches Problem besteht beim Verwenden von Polytetraflourethylen in einer kontaminierten Wunde, da es keine makromolekulare Ableitung ermöglicht, was die Behandlung von Infektionen einschränkt.
Kollagen hat vorerst Verwendung als medizinisches Material erfahren, weil es ein natürlicher, biologischer Transpantatersatz ist, der reichlich aus verschiedenen tierischen Quellen verfügbar ist. Die Gestaltungsaufgaben für die ursprünglichen Kollagentransplantate sind die gleichen wie für die synthetischen. Polymertransplantate; das Transplantat soll widerstandsfähig sein und im Wesentlichen als inertes Material agieren. Mit diesen Zielen im Hinterkopf wurden Verfahren zum Reinigen und Vernetzen entwickelt, um die mechanische Festigkeit zu verstärken und die Abbaurate des Kollagen zu verringern (Chvapil, M., et al (1977) j. Biomed. Mater. Res. 11: 297–314; Kligman, A.M., et al (1986) J. Dermatol. Surg. Oncol. 12 (4): 351–357; Roe, S.C., et al (1990). Artif. Organs 14: 443–448. Woodroff, E.A. (1978). J. Bioeng. 2: 1–10). Vernetzungsmittel, die ursprünglich verwendet wurden, beinhalteten Glutaraldehyd, Formaldehyd, Polyepoxide, Diisocyanate (Borick P.M., et al. (1964) J. Pharm. Sci. 52: 1273–1275) und Acylazide. Bearbeitetes Hautkollagen vom Schaf wurde als Implantat für eine Vielzahl von Anwendungen untersucht. Vor dem Implantieren wird das Hautkollagen von Schafen typischerweise mit Hexamethylendiisocyanat (van Wachem, P.B., et al., Biomaterials 12(March):215–223, 1991) oder Glutaraldehyd (Rudolphy, V.J., et al. Ann Thorac Surg 52:821–825, 1991) gegerbt. Glutaraldehyd, wahrscheinlich das am meisten verwendete und untersuchte Vernetzungsmittel, wurde auch als Sterilisationswirkstoff verwendet. Im allgemeinen erzeugten diese Vernetzungsmittel kollagenes Material, das einem synthetischem Material sowohl mechanisch als auch biologisch mehr ähnelte als einem natürlichen biologischen Gewebe.
Das Vernetzen von natürlichen Kollagen verringert die Antigenität des Materials (Chvapil, M. (1980) Reconstitued collagen. pp. 313–324. In: Viidik, A., Vuust J. (Hrsg.) Biology of Collagen. Academic Press, London; Harjula, A., et al. (1980) Ann. Chir. Gynaecol. 69: 256–262.) durch Verbinden der antigenen Epitope, entweder indem sie für Phagozytose unzugänglich oder durch das Immunsystem nicht erkennbar gemacht werden. Daten aus Untersuchungen, die Glutaraldehyd als das Vernetzungsmittel verwendeten, sind jedoch schwer zu interpretieren, da Glutaraldehydbehandlung auch dafür bekannt ist, zytotoxische Rückstände zu hinterlassen (Chvapil, M. (1980), supra; Cooke, A., et al. (1983) Br. Exp. Path. 64: 172–176; Speer D.P., et al. (1980) J. Biomed. Mater. Res. 14: 753–764); Wiebe, D., et al. (1988) Surgery 104: 26–33). Daher ist es möglich, dass die verringerte Antigenität, die mit einer Glutaraldehydvernetzung assoziiert ist, eher einer nicht-spezifischen Zytotxität als einer spezifischen Wirkung auf antigene Determinanten zuzuschreiben ist. Glutaradlehybehandlung eine akzeptable Weise, um die Beständigkeit zu erhöhen und die Antigenität von Kollagenmaterialien zu verringen, im Vergleich zu denen, die nichtvernetzt sind. Jedoch schränkt Glutaraldehyd, das Kollagenmaterialien vernetzt, die Fähigkeit des Körpers, das Transplantat umzuformen, ein (Roe, S.C., et al. (1990), supra).
Alle der obengenannten Probleme im Zusammenhang mit traditionellen Materialien entstammen der Unfähigkeit des Körpers, ein Implantat als „inert" zu erkennen. Obwohl biologischer Herkunft, führt umfassende chemische Veränderung von Kollagen dazu, es „fremd" werden zu lassen. Um die Langzeitleistung implantierter kollagener Vorrichtungen zu verbessern, ist es wichtig, viele der Eigenschaften des natürlichen Kollagengewebes zu erhalten. Bei dieser Methode der „Gewebezüchtung" wird das Transplantat nicht als dauerhaftes Implantat gestaltet, sondern als ein Gerüst oder Schablone für die Regeneration oder das Umformen. Gewebezüchtungsprinzipien beinhalten eine Notwendigkeit für isomorphes Ersetzen von Gewebe, wobei der biologische Abbau der Implantatmatrix mit etwa der gleichen funktionellen Rate des Ersetzens von Gewebe auftritt (Yannas, I.V. (1995) Regeneration Templates. pp. 1619– 1635. In: Bronzino, J.D., (Hrsg.), The Biomedical Engineering Handbook, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida.)
Wenn ein solches Transplantat eingepflanzt wird, soll es sofort seine erforderliche mechanische bzw. biologische Funktion als ein Körperbestandteil ausüben. Das Transplantat soll auch geeignete Zellbildung des Empfängers durch einwachsen von mesenchymalen Zellen fördern und rechtzeitig durch isomorphes Ersetzen von Gewebe durch Empfängergewebe ersetzt werden, wobei das Empfängergewebe ein funktionelles Analogon des Originalgewebes ist. Um dieses zu tun, darf das Implantat keine signifikante humorale Immunreaktion hervorrufen oder weder zytotoxisch noch pyrogen sein, um die Heilung und Entwicklung von Neugewebe zu fördern.
Transplantate oder Transplantatmaterial, die von entnommenen Säugetiergewebe gewonnen werden, wurden umfassen auf chirurgische Reparatur oder das Ersetzen von Gewebe und Organen untersucht. Das Gewebe wird typischerweise bearbeitet, um Zellbestandteile zu entfernen, wobei eine natürliche Gewebematrix zurückgelassen wird. Weiteres Bearbeiten, wie z.B. Vernetzen, Desinfizieren oder das Bilden von Formen, wurden auch untersucht. Die US-Patentschrift Nr. 3,562,820 an Braun offenbart röhrenförmige, flache und streifenförmige Formen von Transplantaten, die aus der submucosa gebildet und durch das Verwenden einer Bindemasse, wie einer Kollagenfasermasse, oder das Verwenden einer Säure oder eines alkalischen Mediums zusammengeklebt werden. Die US-Patentschrift Nr. 4,502,159 an Woodroof stellt ein röhrenförmiges Transplantat bereit, das aus perikardialem Gewebe gebildet wird, in dem das Gewebe von Fett, Fasern und Fremdstoffe gereinigt und dann in eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung gegeben wird. Das perikardiale Gewebe wird dann auf einen Dorn gegeben und der Saum durch Zunähen geschlossen, und das Gewebe wird dann vernetzt. Die US-Patentschrift Nr. 4,703,108 an Silver liefert eine biologisch abbaubare Matrix aus löslichen Kollagenlösungen oder unlöslichen Kollagendispersionen, die gefriergetrocknet und dann vernetzt werden, um eine poröse Kollagenmatrix zu bilden. Die US-Patentschrift Nr. 4,776,853 an Klement liefert ein Verfahren zum Herstellen biologischen Implantatmaterials, das die Extraktion von Zellen unter Verwenden einer hypertonischen Lösung bei einem alkalischen pH-Wert beinhaltet, gefolgt von einer hochsalzigen Lösung, die Detergens enthält, wobei das Gewebe proteasefreier Enzymlösung und dann einer anionischen Detergenslösung ausgesetzt wird. Die US-Patentschrift Nr. 4,801,299 an Brendel offenbart ein Verfahren zum Bearbeiten ganzer Strukturen die aus dem Körper gewonnen werden, zur Implantation, durch das Behandeln des aus dem Körper gewonnenen Gewebes mit Detergenzien, um Zellstrukturen, Nukleinsäuren und Lipide zu entfernen, um eine extrazelluläre Matrix zu erhalten, die dann vor der Implantation sterilisiert wird. Die US-Patentschrift Nr. 4,902,508 an Badylak offenbart eine dreischichtige Gewebetransplantatzusammensetzung, die aus dem Dünndarm gewonnen wird, welche die Tunica submucosa, die Muscularis mucosa und das Stratum compactum der Tunica submucosa aufweist. Das Verfahren zum Erhalten einer Gewebetransplantatzusammensetzung weist das Abschaben des Darmgewebes gefolgt von einer Behandlung mit einer antibiotischen Lösung auf. Die US-Patentschrift Nr. 5,336,616 an Livesey offenbart ein Verfahren zum Bearbeiten biologischer Gewebe durch Behandlung von Gewebe, um Zellen zu entfernen, Behandelung mit einer Kälteschutzlösung, Einfrieren, Rehydration und schließlich Inokulation mit Zellen für die Repopulation des Gewebes.
WO-A-93/10722 offenbart Eihautschicht, die aus der Plazenta gewonnen und durch Spülen der Eihaut in physiolischer Kochsalzlösung oder Wasser und dann in Trypsin gereinigt werden, und dann werden die Schichten Gammastrahlung ausgesetzt, um die Schichten zu vernetzen und zu sterilisieren. Die Eihautschichten können dann verwendet werden, um Kanäle durch das Wickeln der Eihaut um Stente, um Röhren zu formen, Trocknen der Röhren, gegebenenfalls unter Verwendung eines Leims oder Klebers, um eine Schichtentrennung zu verhindern, zu bilden, und dann werden sie Gammastrahlung ausgesetzt, um die Kanäle weiters zu sterilisieren und zu vernetzen.
Es ist ein kontinuierliches Ziel von Forschern, inplantierbare Transplantate zu entwickeln, die erfolgreich zum Ersetzen oder Reparieren von Säugetiergewebe verwendet werden können, wie bei Bauchdeckenschäden und Gefäßversorgung.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung überwindet die Schwierigkeiten der gegenwärtig verfügbaren Materialien und liefert ein Transplantationskörper zur Verwendung bei der Reparatur, Stärkung oder als Ersatz von beschädigten Gewebe und Organen.
Nach einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein steriles, nicht pyrogenes und nicht antigenes Transplantat bereitgestellt, das aus kollagenem Gewebe von der Tunica submucosa des Dünndarms von Säugetieren gebildet wird zum Implantieren in einen Empfänger, wobei das Transplantat zwei oder mehr übereinanderliegende, miteinander verbundene Schichten von Tunica submucosa des Dünndarms aufweist, welche von den anderen Schichten des Dünndarms getrennt sind, wobei das vorerwähnte eingepflanzte Transplantat keine humorale Immunreaktion gegenüber Komponenten in dem vorerwähnten Kollagengewebe hervorruft und wobei das vorerwähnte Transplantat gleichzeitig einen biologischen Umbau erfährt, der mit einem geeigneten Ersatz durch lebende Zellen auftritt, so dass das ursprünglich eingesetzte Transplantat durch die lebenden Zellen des Patienten umgebaut wird.
Die Tunica submucosa des Dünndarms kann vom Schwein, Rind oder Schaf sein, wobei die Tunica submucosa des Dünndarms vorzugsweise vom Schwein ist. Die Tunica submucosa des Dünndarms kann chemisch gereinigt werden. Das Transplantat kann vernetzt sein. Bei einigen Ausführungsformen kann das Transplantat flach sein, während das Transplantat bei anderen röhrenförmig sein kann, und außerdem kann das Transplantat Poren enthalten. Ein Transplantat der vorliegenden Erfindung kann außerdem Heparin enthalten, oder es kann weiters einen Wachstumsfaktor enthalten.
Das Transplantat kann ein vaskulärer Lappen, ein intrakardialer Lappen, eine Blasenstützschlinge oder eine Uterusstützschlinge, oder ein Herzklappenersatz sein. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Transplantat ein Bauchdeckenlappen aus vernetzter Tunica submucosa des Dünndarms vom Schwein, ein perikardialer Reparaturlappen aus vernetzter Tunica submucosa des Dünndarms vom Schwein, ein Hernien-Reparaturlappen aus vernetzter Tunica submucosa des Dünndarms, ein Bandscheibenersatz aus vernetzter Tunica submucosa des Dünndarms oder ein Gefäßtransplantatkonstrukt aus vernetzter Tunica submucosa des Dünndarms vom Schwein sein.
Diese Erfindung liefert wie oben beschrieben ein Transplantatmaterial, das, wenn es in einen Säugetierempfänger implantiert wird, einen kontrollierten biologischen Abbau erfährt, begleitet von einem adäquaten lebenden Zellersatz oder einer Neubildung von Gewebe, so dass das ursprünglich implantierte Transplantat endgültig durch vom Empfänger entnommene(s) Gewebe und Zellen umgebaut und ersetzt wird. Das Transplantat dieser Erfindung weist wie oben beschrieben ein nicht antigenes kollagenes Material, das von Säugertiergewebe der Tunica submucosa des Dünndarms entnommen wird auf. Das kollagene Material kann in Schichten angeordnet und miteinander verbunden werden, um mehrschichtige Platten, Röhren oder komplex geformte Transplantate zu bilden. Die verbundenen Kollagenschichten der Erfindung sind strukturell stabil, biegsam, semipermeabel und nähbar.
Es ist daher ein Ziel dieser Erfindung, einen Gewebereparaturstoff bereitzustellen, der keinen der vielen Nachteile aufweist, die mit vielen der Transplantate, die gegenwärtig klinisch verwendet werden verbunden sind.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines Transplantatmaterials, das ein Einwachsen von Gewebe bzw. eine Organregeneration an der Stelle der Implantation ermöglicht und erleichtert, das ein steriles nicht pyrogenes und nicht antigenes aus kollagenem Säugetiergewebe abgeleitetes Material ist. Aus diesem Material hergestellte Transplantate rufen keine signifikante humorale Immunantwort hervor, wenn sie in einen Empfänger oder Patienten eingepflanzt werden. Aus diesem Material gebildete Transplantate erfahren gleichzeitig kontrollierten biologischen Umbau, der mit einem adäquaten Ersatz durch lebende Zellen auftritt, so dass das ursprüngliche implantierte Transplantat durch die lebenden Zellen des Patienten umgebaut wird, um ein regeneriertes Organ oder Gewebe zu bilden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches, wiederholbares Verfahren für das Herstellen eines Gewebereparaturstoffs bereitzustellen.
Noch ein anderes Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren für das Verwenden eines neuartigen Mehrzweckgewebereparaturstoffs bei Autotansplantations-, Allotransplantations- und Heterotransplantations-Indikationen bereitzustellen.
Noch ein weiteres Ziel ist es, einen neuartigen Gewebereparaturstoff bereitzustellen, der unter Verwendung konventioneller chirurgischer Techniken implantiert werden kann.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist wie oben definiert auf aus Gewebe gezüchtete Transplantate gerichtet, die, wenn sie in einen Säugetierempfänger eingesetzt werden, als funktionstüchtige Körperteile oder Gewebestrukturen zur Reparatur, Verstärkung oder als Ersatz dienen können, und einen kontrollierten biologischen Abbau erfahren, der gleichzeitig mit Umbau durch die Zellen des Empfängers auftritt. Das Transplantat dieser Erfindung hat in seinen vielfältigen Ausführungsformen somit Doppeleigenschaften: Erstens funktioniert es als ein Ersatzkörperteil und zweitens funktioniert es, während es noch als Ersatzkörperteil funktioniert, als eine Umbaumatrize für das Einwachsen von Empfängerzellen. Um dies zu tun, wurde das Transplantatmaterial dieser Erfindung, ein Gewebereparaturstoff, entwickelt, der von Säugetieren abgeleitetes kollagenes Gewebe der Tunica submucosa des Dünndarms aufweist, das nicht antigen gemacht wird und in der Lage ist, zu sich selbst und zu anderen verbunden zu werden. Obwohl die Transplantate durch den Aufbau verschiedener Anordnungen und Konstrukte veranschaulicht werden, wird die Erfindung nicht auf die Art eingeschränkt. Es wird erkannt, dass die Gestaltung der Anordnungen in ihrer Gestalt und Dicke in Abhängigkeit von der endgültigen Indikation für das Konstrukt ausgewählt werden soll.
Das kollagene Material, aus dem die Transplantate, oder das Transplantat selbst, gebildet werden sollen, wird steril, nicht pyrogen und nicht antigen gemacht. Die Transplantate rufen, wenn sie in einen Empfänger oder Patienten implantiert werden, keine signifikante humorale Immunantwort hervor. Ein akzeptables Antwortniveau ist eines, das keine wesentliche Zunahme des Antikörpertiters gegen kollagene Gewebeproteine vom Grundlinientiterniveau aufweist, wenn Blutserum, das von einem Empfänger eines Transplantats erhalten wird, auf Antikörper gegen Proteine in Extrakten des kollagenen Gewebes getestet wird.
Das Transplantat selbst wird nicht-antigen gemacht, während die Fähigkeit für das Transplantat aufrecht erhalten wird, einen biologischen Umbau, der begleitend mit einem adäquaten Ersatz durch lebender Zellen auftritt, zu erfahren. Das Verfahren zum Herstellen eines nicht antigenen kollagenen Transplantatmaterials weist geeigneterweise eine Desinfektion des Materials durch ein Verfahren, das einen mikrobiologischen Abbau des Materials verhindern soll, auf, vorzugsweise durch Verwendung einer Lösung, die Peressigsäure beinhaltet, und Vernetzen des desinfizierten kollagenen Materials mit einem Vernetzungsmittel, vorzugsweise 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC).
Kollagene Gewebe der Tunica submucosa des Dünndarms, die aus dem Säugetierkörper entnommen werden, werden zum Herstellen dieses kollagenen Materials verwendet. Die Tunica submucosa wird von den anderen Schichten des Dünndarms abgetrennt oder abgespalten. Diese Schicht wird nachfolgend als die Darmkollagenschicht (Intestinal Collagen Layer „ICL") bezeichnet. Weiters können die Kollagenschichten der Transplantatanordnung aus dem gleichen Kollagenmaterial, wie z.B. zwei oder mehr Schichten ICL, oder aus verschiedenem Kollagenmaterialien, wie z.B. einer oder mehr Schichten ICL und einer oder mehr Schichten Fascia lata sein.
Die Submucosa, oder die Darmkollagenschicht (ICL), von einer Säugetierquelle, typischerweise vom Schwein, Rind oder Schaf, wird mechanisch gereinigt durch Zusammenpressen des Rohmaterials zwischen entgegengesetzt liegenden Walzen, um die Muskelschichten (Tunica muscularis) und die Mucosa (Tunica mucosa) zu entfernen. Die Tunica submucosa des Dünndarms ist härter und steifer als das umgebende Gewebe, und die Walzen pressen die weicheren Bestandteile aus der Submucosa heraus. Im nachfolgenden Beispiel wurde die ICL mechanisch aus Schweinedünndarm unter Verwendung einer Bitterling-Darmreinigungsmaschine gewonnen.
Da die mechanisch gereinigte Submucosa etwas verstecktes, optisch nicht wahrnehmbare Zellbruchstücke, das die Konsistenz der mechanischen Eigenschaften beeinflusst, aufweisen kann, kann die Submucosa chemisch gereinigt werden, um Zellbruchstücke und andere Substanzen, andere als Kollagen zu entfernen, zum Beispiel durch Einweichen in Pufferlösungen bei 4 °C oder durch Einweichen mit NaOH oder Trypsin oder andere bekannte Reinigungstechniken. Alternative Mittel, die Detergenzien, wie TRITON X-100^TM (Rohm und Haas) oder Natrium-Dodecylsulfat (SDS); Enzyme, wie Dispase, Trypsin oder Thermolysin; und/oder Chelatbildner, wie Ethylendiamin-/tetraessigsäure (EDTA) oder Ethylen- bis(Oxyethylnitril)-tetraessigsäure (EGTA) anwenden, können ebenfalls in das chemische Reinigungsverfahren einbezogen werden.
Nach dem Reinigen soll die (ICL) dekontaminiert und desinfiziert werden, vorzugsweise durch die Verwendung von verdünnten Peressigsäurelösungen, wie in US-Patentschrift Nr. 5,460,962 beschrieben ist.
Dekontamination oder Desinfektion des Materials wird durchgeführt, um einen Abbau der Kollagenmatrix durch Bakterien oder proteolytische Enzyme zu verhindern. Andere desinfizierende Lösungen und Systeme für die Verwendung mit Kollagen sind auf dem Fachgebiet bekannt und können verwendet werden, solange nach der Desinfektionsbehandlung keine Beeinträchtigung der Fähigkeit des Materials umgebaut zu werden, auftritt.
Die Transplantatanordnugnen der Erfindung weisen zwei oder mehr übereinanderliegende Schichten auf, die miteinander verbunden sind. Wie hierin verwendet bedeutet „verbundene Kollagenschichten", die aus zwei oder mehr Schichten des gleichen oder von unterschiedlichem Kollagenmaterial zusammengesetzt sind, das in einer Weise behandelt ist, so dass die Schichten übereinandergelegt und ausreichend miteinander durch Eigenschichtbildung verbunden sind. Das Verbinden der Kollagenschichten kann durch eine Vielzahl von Weisen ausgeführt werden: durch Schweißen oder Verbinden durch Hitze, Klebstoffe, chemisches Verbinden oder Nähte.
Bei dem bevorzugten Verfahren und dem nachfolgenden Beispiel wird die ICL mit einer Peressigsäurelösung bei einer Konzentration zwischen etwa 0,01 und 0,3 % v/v in Wasser, vorzugsweise etwa 0,1 %, bei einem neutralisierten pH-Wert zwischen etwa pH 6 und pH 8 desinfiziert und bei etwa 4 °C in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gelagert. Die ICL wird längs aufgeschnitten und auf eine feste, flache Platte geflächt. Eine oder mehr aufeinanderfolgende Schichten werden dann übereinandergelegt. Eine zweite feste, flache Platte wird oben auf die Schichten gelegt und die zwei Schichten werden eng zusammen geklemmt. Das komplette System, Klemm-Platten und Kollagenschichten, wird dann für eine gewisse Zeit und unter Bedingungen erhitzt, die ausreichen um ein Verbinden der Kollagenschicht aneinander zu bewirten sind. Der Betrag der angewendeten Hitze sollte ausreichend sein, um dem Kollagen zu ermöglichen, sich zu verbinden, aber nicht so hoch, dass das Kollagen irreversible denaturiert wird. Die Zeit des Erhitzens und Verbindens hängt von der Art der verwendeten Kollagenmaterialschicht, dem Feuchtigkeitsgehalt und der Dicke des Materials und der angewandten Hitze ab. Ein typischer Hitzebereich ist von etwa 50 °C bis etwa 75 °C, typischer 60 °C und 65 °C und am typischsten 62 °C. Eine typische Zeitspanne bewegt sich von etwa 7 Minuten bis etwa 24 Stunden, typischerweise etwa eine Stunde. Der Hitzegrad und der Zeitumfang, in dem die Wärme zugeführt wird, können leicht durch Routineuntersuchungen durch das Variieren der Hitze- und Zeitparameter ermittelt werden. Der Verbindungsschritt des Verbindens kann in einem konventionellen Ofen ausgeführt werden, obwohl andere Systeme oder Hitzeanwendungen verwendet werden können, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, einem Wasserbad, Laserenergie oder elektrische Wärmeleitung. Unmittelbar nach dem Erwärmen und Verbinden wird das System an der Luft oder in einem Wasserbad auf einen Bereich zwischen Zimmertemperatur bei 20 °C und 1 °C gekühlt. Schnelles Kühlen, Abschrecken genannt, wird sofort, oder fast sofort die Erhitzungsaktion anhalten. Um diesen Schritt auszuführen, kann das System gekühlt werden, typischerweise in einem Wasserbad bei einer Temperatur, die vorzugsweise zwischen etwa 1 °C bis etwa 10 °C, am bevorzugtesten bei etwa 4 °C, liegt. Obwohl Kühltemperaturen von unter 1 °C verwendet werden können, muss Sorge dafür getragen werden, dass die Kollagenschichten nicht gefrieren, was strukturelle Beschädigung verursachen kann. Zusätzlich können beim Abschrecken Temperaturen von über 10 °C verwendet werden, aber wenn die Abschrecktemperatur zu hoch ist, dann kann die Erhitzung nicht rechtzeitig angehalten werden, um die Kollagenschichten ausreichend in ihrer gegenwärtigen Konfiguration zu fixieren.
Das Transplantatmaterial oder mehrschichtige Konstrukt wird dann vorzugsweise vernetzt. Das Vernetzen der verbundenen Transplantatanordnung stellt der Anordnung Festigkeit und eine gewisse Beständigkeit bereit, um die Handhabungseigenschaften zu verbessern. Vernetzungsmittel sollten danach ausgewählt werden, so dass sie ein biologisch kompatibles Material, das durch die Empfängerzellen umgebaut werden kann, erzeugen. Verschiedene Arten von Vernetzungsmittel sind auf dem Fachgebiet bekannt und können verwendet werden, wie z.B. Ribose und andere Zucker, Oxidativusmittel und dehydrothermale (DHT) Verfahren. Ein bevorzugtes Vernetzungsmittel ist 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC). Die Vernetzungslösung, die EDC und Wasser enthält, kann auch Aceton enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Sulfo-N-Hydroxysuccinimid dem Vernetzungsmittel hinzugegeben (Staros, J.V., Biochem. 21, 3950–3955, 1982).
Desinfektion kann mit Peressigsäure und nachfolgendem Vernetzen des ICL-Materials mit EDC durchgeführt werden, um die Antigenität des Materials zu verringern. Die immunoreaktiven Proteine, die in nicht sterilisierter, nicht vernetzter ICL vorhanden sind, werden entweder verringert oder entfernt oder ihre Epitope wurden so verändert, dass sie nicht mehr eine signifikante humorale Immunantwort hervorrufen. Transplantatimplantate dieses Materials zeigen jedoch eine anfängliche, vorübergehende Entzündungsreaktion als Ergebnis der Wundheilungsreaktion. Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „nicht antigen", dass bei dem Empfänger oder Patienten, dem ein Transplantat implantiert wird, keine signifikante humorale Immunantwort hervorgerufen wird. Ein akzeptables Antwortniveau ist eines, das keine wesentliche Zunahme des Antikörpertiters gegen kollagene Gewebeproteine vom Grundlinientiterniveau aufweist, wenn Blutserum, das von einem Empfänger eines Transplantats erhalten wird, auf Antikörper gegen Proteine in Extrakten des kollagenen Gewebes getestet wird. Für einen Patienten oder Empfänger, der vorher nicht gegen kollagenes Gewebe sensibilisiert wurde, beträgt der bevorzugte Serumantikörpertiter 1:40 oder weniger.
Transplantate der Erfindung sind auch nicht pyrogen. Ein Transplantat, das pyrogen ist, ruft, wenn es einem Empfänger oder Patienten implantiert wird, eine fiebrige Reaktion beim Patienten hervor, die damit die Fähigkeit des Transplantats, umgebaut zu werden, beeinträchtigt. Pyrogene werden durch intravenöse Injektion einer Lösung die eine Probe des Materials enthalten in drei Kaninchen getestet. Eine die Temperatur messende Sonde wird in das Rektum der Kaninchen eingeführt, um Temperaturveränderungen zu überwachen. Wenn bei einem der Kaninchen ein Temperaturanstieg über 0,5 °C auftritt, dann wird der Test bei fünf weiteren Kaninchen fortgesetzt. Wenn nicht mehr als drei der acht Kaninchen einen individuellen Temperaturanstieg von 0,5 °C oder mehr aufweisen und die Summe der acht individuellen Maximaltemperaturanstiege 3,3 °C nicht überschreitet, erfüllt das untersuchte Material die Anforderung für das Nichtvorhandensein von Pyrogenen. (Pyrogen Test (151), pp. 1718–1719. In: The United States Pharmacopeia (USP) 23 The United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD.)
Der Gewebereparaturstoff dieser Erfindung, der als Ersatzkörperteil fungiert, kann flach, röhrenförmig oder von komplexer Geometrie sein. Die Form des Gewebereparaturstoffs wird von dem beabsichtigten Verwendungszweck bestimmt. Somit kann der Formkörper oder die Platte, so gestaltet werden, um die gewünschte Form, wenn die verbundenen Schichten des Transplantates dieser Erfindung gebildet werden, aufzunehmen. Der Gewebereparaturstoff kann implantiert werden, um erkrankte oder beschädigte Organe zu reparieren, zu stärken oder zu ersetzen, wie Bauchdeckenschäden, Perikard (=Pericardium), Hernien und verschiedene andere Organe und Strukturen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Knochen, Knochenhaut, Knorpelhaut, Bandscheibe, Gelenkknorpel, Dermis, Epidermis, Darm, Bänder und Sehnen. Zusätzlich kann der Gewebereparaturstoff als vaskulärer oder intrakardialer Lappen oder als Herzklappenersatz verwendet werden. Flache Platten können zum Beispiel verwendet werden, um prolabierende oder hypermobile Organe, unter Verwendung der Platten als Schlinge für die Organe, zu stützen. Die Schlinge kann Organe wie Blase oder Uterus stützen.
Röhrenförmige Transplantate können zum Beispiel verwendet werden, um Querschnitte röhrenförmiger Organe wie Vaskulaturen, Speiseröhre, Luftröhre, Darm und Eilleiter zu ersetzen. Diese Organe verfügen über eine grundsätzliche Röhrenform mit einer äußeren Oberfläche und einer luminolen Oberfläche.
Zusätzlich können flache Platten und röhrenförmige Strukturen zusammen gebildet werden, um eine komplexe Struktur zu bilden, um Herz- oder Venenklappen zu ersetzen oder zu stärken.
Zusätzlich zur Funktion als Ersatzkörperteil oder Stütze ist die zweite Funktion eines Transplantats die einer Matrize oder eines Gerüsts für einen biologischen Umbau. „Biologischer Umbau" wird hierin mit der Bedeutung des Erzeugens von strukturellen Kollagen, Vaskularisierung und Epithelialisierung durch das Einwachsen der Empfängerzellen mit einer funktionellen Rate, die ungefähr gleich der Rate des biologischen Abbaus des implantierten Transplantats durch Empfängerzellen und Enzyme ist, verwendet. Der Gewebereparaturstoff behält die Merkmale des ursprünglich implantierten Transplantats bei, während es durch den Empfänger komplett, oder im wesentlichen komplett, in Empfängergewebe umgebaut wird, und als solches als Analogon des Gewebes, das es repariert oder ersetzt, fungiert.
Die mechanischen Eigenschaften beinhalten mechanisch Integrität, so dass der Gewebereparaturstoff einem Kriechen während des biologischen Umbaus widersteht und zusätzlich biegsam und nähbar ist. Der Begriff „biegsam" bedeutet gute Handhabungseigenschaften. Der Begriff „nähbar" bedeutet, dass die mechanischen Eigenschaften der Schicht ein Nähbeständigkeit beinhalten, das Nadeln und Nähmaterialen ermöglicht, durch das Transplantatmaterial zum Zeitpunkt des Annähens des Transplantats an Abschnitte von natürlichem Gewebe zu durchdringen, ein Vorgang, der als Anastomose bekannt ist. Während des Annähens dürfen Transplantate weder aufgrund der Zugkräfte, die auf sie beim Annähen wirken, reißen, noch sollen sie reißen, wenn die Naht verknüpft wird. Die Nähbarkeit von Gewebereparaturstoff, d.h. die Fähigkeit von Transplantaten, einem Zerreißen während des Annähens zu widerstehen, ist verbunden mit der inneren mechanischen Festigkeit des Transplantatmaterials, der Dicke des Transplantats, der Spannung, die auf die Naht angewendet wird und der Rate, mit der der Knoten festgezogen wird.
Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „nicht kriechend" die biomechanischen Eigenschaften der integralen Festigkeit des Transplantats, so dass das Transplantat nicht gestreckt, überdehnt oder über die normalen Grenzen nach der Implantation ausgedehnt wird. Wie unten beschrieben ist, bewegt sich eine Gesamtstreckung des implantierten Transplantats dieser Erfindung in akzeptablen Grenzen. Das Transplantat dieser Erfindung erwirbt eine Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Ausdehnung als eine Funktion des zellularen biologischen Zellumbaus nach der Implantation durch Ersetzen von strukturellen Kollagen durch Empfängerzellen mit einer schnelleren Rate als dem Verlust an mechanischer Festigkeit des implantierten Materials aufgrund von biologischem Abbau und Umbau. Der Gewebereparaturstoff der vorliegenden Erfindung ist „semipermeabel", obwohl er vernetzt worden ist. Semipermeabilität erlaubt das Einwachsen von Empfängerzellen zum Umbau oder zum Ablagern der kollagenen Schicht. Die „nicht poröse" Eigenschaft des Transplantats verhindert den Durchlass von Flüssigkeiten, die vorgesehen sind, durch die Implantation des Transplantats zurückgehalten zu werden. Im umgekehrten Fall können Poren im Transplantat gebildet werden, wenn die Eigenschaft für die Anwendung des Transplantats erforderlich ist.
Die mechanische Integrität des Transplantats dieser Erfindung liegt auch in seiner Fähigkeit, gefaltet oder gefalzt zu werden, ebenso wie in der Fähigkeit, das Transplantat zu schneiden oder zu stutzen, wodurch ein sauberer Rand (Kante) entsteht, ohne die Ränder des Konstrukts aufzuspalten oder auszufransen.
Zusätzlich können in einer anderen Ausführungsform der Erfindung mechanisch abgeschnittene und abgehackte Kollagenfasern zwischen die Kollagenschichten eingesetzt werden, um dem Konstrukt Masse hinzuzufügen und Bereitstellen eines Mechanismusses für eine unterschiedliche Rate des Umbaus durch Empfängerzellen. Die Eigenschaften der Konstrukte, die die Fasern enthalten können durch Variieren der Länge und des Durchmessers der Fasern; Variieren der Proportionen der verwendeten Fasern und völliger oder teilweises Vernetzen der Fasern verändert werden. Die Länge der Fasern kann von 0,1 cm bis 5,0 cm reichen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können Kollagenfäden, wie jene in die in US-Patentschrift Nr. 5,378,469 beschrieben sind, in den mehrschichtigen Gewebereparaturstoff zum Verstärken oder für unterschiedliche funktionelle Raten des Umbaus eingebracht werden. Eine Helix oder „Verdrallung" einer Borte von 20 bis 200 Denier Kollagenfaden können zum Beispiel auf der Oberfläche des Gewebereparaturstoffs angebracht werden. Der Durchmesser der Helix oder Borte von Kollagenfaden kann von 50 bis 500 Mikron, vorzugsweise 100 bis 200 Mikron, reichen. Die Eigenschaften der Gewebereparaturstoffschicht können so durch die Geometrie des zur Verstärkung verwendeten Fadens variiert werden. Die Funktionalität des Designs hängt von der Geometrie der Borte oder der Verdrallung ab. Zusätzlich können Kollagenfadenkonstrukte, wie Filz, ein flacher gewirkter oder gewebter Stoff, ein dreidimensionaler gewirkter, gewebter oder geflochtener Stoff, zwischen den Schichten oder auf der Oberfläche des Konstrukts angebracht werden. Einige Ausführungsformen können auch ein Kollagengel zwischen den Schichten beinhalten, allein oder mit einem Arzneimittel, Wachstumsfaktor oder Antibiotikum, um als Abgabesystem zu fungieren. Zusätzlich könnte ein Kollagengel mit einem Faden oder einem Fadenkonstrukt zwischen den Schichten einbezogen werden. Wie von den Fachleuten eingeschätzt wird, beeinflussen viele der Ausführungsformen, die Kollagengel, -faden oder ein Fadenkonstrukt einbeziehen, auch die physischen Eigenschaften, wie Kompleanz, Radialfestigkeit, Knickfestigkeit, Nahtbeständigkeit und Biegsamkeit.
Bei einigen Ausführungsformen können zusätzliche kollagene Schichten den äußeren oder inneren Oberflächen der verbundenen Kollagenschichten hinzugefügt werden, um eine glatte Fließoberfläche für ihre endgültige Anwendung, wie in der PCT Internationalen Publikation Nr. WO 95/22301 beschrieben ist, zu schaffen.
Die glatte kollagene Schicht fördert auch das Anheften von Empfängerzellen, was ein Einwachsen und einen biologischen Umbau erleichtert. Wie in der PCT Internationalen Publikation Nr. WO 95/22301 beschrieben ist, kann diese glatte kollagene Schicht aus durch Säure extrahiertem, fasrigem oder nicht fasrigem Kollagen erzeugt werden, das vorwiegend Typ-I-Kollagen ist, aber auch andere Kollagentypen beinhalten kann. Das verwendete Kollagen kann einer Reihe von Säugetierquellen, typischerweise Rinder-, Schweine- oder Schafhaut oder -sehnen entnommen werden. Das Kollagen wurde vorzugsweise durch Säureextraktion bearbeitet, um eine Fibrilldispersion oder -gel von hoher Reinheit zu erhalten. Kollagen kann durch Säure von der Kollagenquelle durch Verwendung einer schwachen Säure, wie Essig-, Zitronen- oder Ameisensäure, extrahiert werden. Wenn es einmal in die Lösung extrahiert ist, kann das Kollagen unter Verwendung von NaCl als Salz ausgefällt und unter Verwendung von Standardtechniken, wie Zentrifugation oder Filtration, zurück gewonnen werden. Einzelheiten von durch Säure extrahiertem Kollegen aus Rindersehne werden zum Beispiel in der US-Patentschrift 5,106,949 beschrieben.
Kollagendispersionen oder -gels für Verwendung in der vorliegenden Erfindung liegen im allgemeinen bei einer Konzentration von etwa 1 bis 10 mg/ml, vorzugsweise von etwa 2 bis 6 mg/ml und am bevorzugtesten von etwa 3 bis 5 mg/ml und bei einem pH-Wert von etwa 2 bis 4. Ein bevorzugtes Lösungsmittel für das Kollagen ist verdünnte Essigsäure, z.B. ungefähr 0,05 bis 0,1 %. Andere konventionelle Lösungsmittel für Kollagen können verwendet werden, sofern diese Lösungsmittel kompatibel sind.
Wenn die Transplantatanordnung einmal hergestellt wurde, kann es luftgetrocknet, verpackt und durch Gammabestrahlung, typischerweise 2,5 Mrad, sterilisiert und gelagert werden. Eine abschließende Sterilisation, wobei chemische Lösungen, wie Peressigsäurelösungen, wie in US-Patenschrift Nr. 5,460,962 beschrieben ist, kann auch angewendet werden.
Bei dem nachfolgenden Beispiel wird die ICL längs aufgeschnitten und auf einer Glasplatte planiert, obwohl jeder inerte, nicht-isolierte, beständige Formkörper verwendet werden kann. Zusätzlich kann der Formkörper jede Form haben: flach, gerundet oder komplex. Bei einem runden oder komplexen Formkörper werden der Boden und die oberen Formkörperteile passend gestaltet, so dass das fertig gestellte Transplantat in die gewünschte Form gebracht wird. Wenn es einmal so gestaltet ist, behält das Transplantat seine Form bei. So zum Beispiel, wenn das Transplantat in eine gerundete Form geformt wird, kann es als ein Herzklappensegelersatz verwendet werden.
Der mehrschichtige Gewebereparaturstoff kann durch verschiedene alternative Mittel oder Kombinationen davon in Röhrenform gebracht werden. Der mehrschichtige Gewebereparaturstoff kann entweder in der normalen oder der umgestülpten Position in eine Röhre geformt werden. Die Röhre kann mechanisch durch Nähen angefertigt werden, wobei unterbrochene Nähte mit geeignetem Nähmaterial verwendet werden, und ist vorteilhaft, da sie ermöglicht, dass die Röhre vom Chirurgen zum Zeitpunkt der Implantation ohne sich aufzulösen zugeschnitten und geformt werden kann. Andere Verfahren zur Nahtbildung an der Submucosa können Klebeverbindungen beinhalten, wie die Verwendung von Klebstoffen auf Fibrinbasis oder von industriellen Klebstoffen, wie Polyurethan, Vinylacetat oder Polyepoxidharz. Vorzugsweise können Hitzeverbindungsverfahren einschließlich Laserschweißen oder Hitzeschweißen der Naht verwendet werden, gefolgt von Abschrecken, um die Seiten der so geformten Röhre zu versiegeln. Andere mechanische Mittel sind möglich, wie die Verwendung von Blindnieten und Krampen. Bei diesen Röhrenformungstechniken können die Enden der Seiten entweder auf Stoß endend oder überlappend sein. Wenn die Seiten überlappend sind, kann die Naht zugeschnitten werden, wenn die Röhre schon geformt ist. Zusätzlich werden diese Röhrenformungstechniken typischerweise auf einem Dorn durchgeführt, um den gewünschten Durchmesser festzulegen.
Die so geformte Strukturröhre kann zur weiteren Bearbeitung auf einem Dorn oder einer anderen geeigneten Spindel gelassen werden. Um die funktionellen Raten des biologischen Abbaus und damit die Rate der Abnahme der Transplantatfestigkeit während des biologische Umbaus zu steuern, wird das Transplantat vorzugsweise unter Verwendung eines geeigneten Vernetzungsmittels, wie 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC), vernetzt. Ein Vernetzen des Transplantats hilft auch beim Verhindern von luminalem Kriechen, in dem der Röhrendurchmesser einheitlich gehalten und die Bruchfestigkeit erhöht wird. Die Verbindungsfestigkeit einer Naht oder eines mehrschichtigen Transplantats wird erhöht, wenn Verbindungsverfahren durch Hitze oder Dehydration verwendet werden. Es wird angenommen, dass ein Vernetzen der Darmkollagenschicht auch die Festigkeit der Nahtbeständigkeit durch Verbessern der Widerstandsfähigkeit gegen Rissausbreitung verbessert.
Kollagen kann auf die innere oder die äußere Oberfläche der ICL, wie in Beispiel 5 der US-Patenschrift Nr. 5,256,418 beschrieben wird, gelegt werden. Kurz gesagt, wenn der Gewebereparaturstoff in Röhrenform gebracht werden soll, wird der mehrschichtige Stoff an einem Ende mit Luer-Lock-Konnektoren befestigt und die Kollagendispersion füllt die Röhre. Dieser Schritt kann auch, wie in der oben angeführten Patenanmeldung beschrieben ist, unter Verwendung einer hydrostatischen Druckspitze ausgeführt werden. Die innere Schicht von Kollagen kann auch durch Einfließen von Kollagen in beide Enden der Röhre gleichzeitig gelagert werden. Die Röhre wird dann in ein Bad von 20 % Polyethylenglykol (PEG) in isotonischer phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) mit neutralem pH-Wert gegeben. Das osmotische Gefälle zwischen der internen Kollagenlösung und der äußeren PEG-Lösung in Kombination verursacht eine gleichzeitige Konzentration und Ablagerung des Kollagens entlang des Lumens der inneren strukturellen Schichtwand. Die Röhre wird dann aus dem PEG-Bad herausgenommen, und ein Glasstab mit einem gewünschten Durchmesser des Transplantatlumens wird in die Kollagenlösung eingeführt, oder, alternativ dazu, wird ein Ende des Transplantats verschlossen und Luftdruck wird innen angewendet, um das Röhrenlumen offen zu halten. Das Transplantat wird dann trocknen gelassen und anschließend in PBS rehydriert. Die so gebildete Kollagenbeschichtung, in der Form eines dichten fibrillären Kollagens, füllt leichte Unregelmäßigkeiten in der strukturellen Darmschicht aus, wobei sie so zu einem Transplantat mit sowohl einer glatten Fließoberfläche als auch einer gleichmäßigen Dicke führt. Das Verfahren fordert auch das Verbinden von Kollagengel mit der Darmkollagenschicht. Eine kollagene Schicht mit variierender Dicke und Dichte kann durch Verändern der Ablagerungsbedingungen, die durch routinemäßige Parameteränderungen festgelegt werden, erzeugt werden. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um das Kollagen auf der äußeren Oberfläche der ICL anzuwenden, um ein dreischichtiges Transplantat zu schaffen. Das Transplantatkonstrukt ist thrombogen in Blutgefäßersetzungen mit geringem Durchmesser. Es kann nur bei vaskulären Anwendungen in Gefäßen mit hoher Durchflussrate (großer Durchmesser) verwendet werden. Daher muss das Transplantat nicht thrombogen gemacht werden, wenn es zum Reparieren oder Ersetzen von Blutgefäßen mit geringem Durchmesser nützlich sein soll.
Heparin kann durch eine Vielzahl gut bekannter Techniken bei dem Transplantat angewendet werden. Zur Veranschaulichung, Heparin kann bei dem Transplantat in den folgenden drei Arten angewendet. Erstens, Benzalkonium-Heparin-(BA-Hep)-Lösung kann bei dem Transplantat angewendet werden, in dem das Transplantat in die Lösung getaucht und danach luftgetrocknet wird. Dieses Verfahren behandelt das Kollagen mit einem ionisch gebundenen BA-Hep-Komplex. Zweitens, EDC kann verwendet werden, um das Heparin zu aktivieren, um dann kovalent das Heparin mit der Kollagenfaser zu verbinden. Drittens, EDC kann verwendet werden, um das Kollagen zu aktivieren, um dann kovalent Protamin mit dem Kollagen zu verbinden und dann Heparin mit dem Protamin zu verbinden. Viele andere Beschichtungs-, Verbindungs- und Anheftungsverfahren, die auch verwendet werden können, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Eine Behandlung des Gewebereparaturstoffs mit Arzneimitteln zusätzlich zu oder als Ersatz für Heparin kann ausgeführt werden. Die Arzneimittel können zum Beispiel Wachstumsfaktoren zum Fördern der Vaskularisierung und Epithelialisierung, wie von Makrophagen abgeleiteter Wachstumsfaktor (MDGF), von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), von Endothelzellen abgeleiteter Wachstumsfaktor (ECDGF); Antibiotika zum Bekämpfen jeder potentiellen Infektion durch das chirurgische Transplantat; oder Nervenwachstumsfaktoren, die in die innere kollagene Schicht eingesetzt werden, wenn das Transplantat als Rohr für Nervenregeneration genutzt wird, einschließen. Zusätzlich zu oder als Ersatz für Arzneimittel können Matrixkomponenten wie Proteoglykane oder Glykoproteine oder Glykosaminoglykane in das Konstrukt eingeschlossen werden.
Der Gewebereparaturstoff kann mit Laser gebohrt werden, um Poren von Mikronengröße durch das vollständige Transplantat zu schaffen, um das Einwachsen der Zellen zu unterstützen, unter Verwendung eines Excimer-Lasers (z.B. bei KrF- oder ArF-Wellenlängen). Die Porengröße kann von 50 bis 100 Mikron variieren, ist aber vorzugsweise von rund 15 bis 50 Mikron, und die Zwischenräume können variieren, aber 500 Mikron vom Mittelpunkt wird bevorzugt. Der Gewebereparaturstoff kann zu jedem Zeitpunkt während des Herstellungsverfahrens des Transplantats mit Laser gebohrt werden, wird aber vorzugsweise vor der Dekontamination oder Sterilisation durchgeführt.
Hohlräume oder Zwischenräume können auch durch das Verfahren der Phaseninversion gebildet. Zum Zeitpunkt des Schichtens der ICL werden zwischen Schichten kristalline Partikel verteilt, die unlöslich in der flüssigen Wärmequelle zum Verbinden sind, aber sollten in dem Abschreckbad oder der Vernetzungslösung löslich sein. Wenn Laser oder trockene Hitze verwendet wird, um die Schichten zu verbinden, dann kann jeder lösliche kristalline Feststoff verwendet werden, solange er in dem Abschreckbad oder der Vernetzungslösung löslich ist. Wenn der kristalline Feststoff aufgelöst wurde und ausdiffundierte, verbleibt ein Zwischenraum, den der Feststoff eingenommen hat. Die Größe der Partikel kann von 10 bis 100 Mikron variieren, ist aber vorzugsweise von etwa 15 bis 50 Mikron, und die Zwischenräume zwischen den Partikeln, wenn sie zwischen den Schichten verteilt werden, können variieren. Die Anzahl und Größe der gebildeten Hohlräume beeinflusst auch die physischen Eigenschaften (Kompleanz, Knickfestigkeit, Nahtbeständigkeit und Biegsamkeit).
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Praxis der vorliegenden Erfindung besser zu erklären und sollten nicht in einer Weise ausgelegt werden, die den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Entnahme und Bearbeitung der Darmkollagenschicht aus Schweinedarm
Der Dünndarm eines Schweins wurde entnommen und mechanisch abgezogen unter Verwendung einer Bitterling-Darmreinigungsmaschine (Nottingham, GB), die gewaltsam die Fett-, Muskel- und Mucosaschichten von der Tunica submucosa entfernt wobei eine Kombination von mechanischer Tätigkeit und Waschen mit heißem Wasser verwendet wird. Die mechanische Tätigkeit kann beschrieben werden als eine Serie von Walzen, die die aufeinanderfolgenden Schichten der Tunica submucosa zusammenpressen und abziehen, wenn der intakte Darm zwischen ihnen hindurchgezogen wird. Die Tunica submucosa des Dünndarms ist härter und steifer als das umgebende Gewebe, und die Walzen quetschen das weichere Gewebe aus der Submucosa heraus. Das Ergebnis der maschinellen Reinigung war so, dass die Submucosaschicht des Darms allein übrig bleibt. Zuletzt wurde die Submucosa mit 0,3 % Peressigsäure über 18 Stunden bei 4 °C dekontaminiert und dann in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Das verbleibende Produkt war eine Darmkollagenschicht (ICL).
Beispiel 2: Verschiedene Schweißtemperaturen und EDC-Konzentrationen von ICL
Die Auswirkungen von Schweißtemperaturen (auf das Abschrecken folgend), Schweißzeit, 1-Ethyl-3-(3-(Dimethylamino)propyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid-(EDC)-Konzentration, Acetonkonzentration und Vernetzungszeit wurden nach dem Schweißen auf Schweißfestigkeit für die ICL-zweischichtige Röhrenanwendung untersucht. ICL stammte vom Schwein, wie im Beispiel 1 beschrieben ist. Festigkeitseigenschaften wurden unter Verwendung eines Nahtbeständigkeitstests und eines Endzugfestigkeits-(UTS)-Tests gemessen.
ICL wurde umgestülpt und über ein Paar Dorne gestreckt, die in einen ICL-Befestigungsrahmen eingefügt wurden. Die Dorne bestanden aus rostfreien Stahlrohren mit einem Außendurchmesser von 4,75 mm. Die ICL und die Dorne wurden dann für etwa 60 Minuten in eine Dehydrierkammer bei 20 % relativer Feuchtigkeit bei 4 °C gegeben. Nach der Dehydrierung wurde die ICL aus den Kammern und von den Dornen entfernt. Die lymphatischen Anhangsbereiche wurden entfernt und die ICL wurde manuell zweimal um den Dorn gewickelt, um ein ,ungeschweißtes' zweischichtiges Konstrukt zu bilden. Die gewickelte ICL wurde wieder in die Dehydrierkammer gegeben und für weitere 90 Minuten nach wie vor bei 20 % relative Feuchtigkeit bis ungefähr 50 % Feuchtigkeit +/– 10 % getrocknet. Um die in einem Probenkonstrukt vorhandene Feuchtigkeitsmenge zu bestimmen, wurde ein CEM^TM-Ofen verwendet.
Ein THERMOCENTER^TM-Ofen wurde für die vorgesehene
Temperaturbehandlung für die zu schweißenden Konstrukten eingestellt. Temperaturen zum Schweißen getestet wurden, reichten von 55 °C bis 70 °C. Wenn die Konstrukte einmal in den Ofen gegeben wurden, konnte der Ofen ins Gleichgewicht kommen, bevor die Zeitnahme begann. Die Konstrukte konnten für die Zeit, die für diese Bedingung notwendig war, in der Kammer verbleiben. Schweißzeiten reichten von 7 bis 30 Minuten. Sobald die Zeit abgelaufen war, wurden die Konstrukte aus der Kammer entnommen und für etwa 2 bis 5 Minuten in ein Wasserbad bei 4 °C gegeben. Die geschweißten Konstrukte wurden für etwa 30 Minuten wieder in die Dehydrierkammer gegeben, bis sie auf etwa 20 % +/– 10 % dehydriert waren.
Nach dem Dehydrieren wurden die Konstrukte in ein Gefäß, das EDC entweder in deionisiertem Wasser oder in deionisiertem Wasser und Aceton mit Konzentrationen, die für gestesteten Bedingungen geeignet waren, enthielt, hineingegeben. Getestete EDC-Konzentrationen waren 50, 100 und 200 mM. Acetonkonzentrationen, die getestet wurden, waren 0, 50 und 90 % in Wasser. Die Zeitdauer für das Vernetzen wurde durch die getesteten Bedingungen bestimmt. Vernetzungszeiten waren 6, 12 und 24 Stunden. Nach dem Vernetzen wurde das Konstrukt aus der Lösung herausgenommen und dreimal bei Zimmertemperatur mit pH-phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gespült. Das geschweißte und vernetzte Konstrukt wurde dann von dem Dorn entfernt und bis zum Test in PBS gelagert. Zusätzlich zu den dreißig Konstrukten, die hergestellt wurden, wurden zwei weitere zweischichtige Konstrukte durch Schweißen bei 62 °C für 15 Minuten hergestellt und in 100 mM-EDC in 100 % H₂O über 18 Stunden vernetzt.
Der Nahtbeständigkeitstest wurde verwendet, um die Fähigkeit eines Konstrukts, eine Naht zu halten, zu bestimmen. Ein Konstruktstück wurde in einem CHATTILION^TM- Kraftmessgerät gesichert und ein 1–2 mm Stückchen wurde mit einer SURGILENE^TM-6-0-Naht genommen, durch eine Wand des Konstrukts gezogen und gesichert. Das Gerät zieht dann an der Naht, um die Kraft zu bestimmen, die benötigt wird, um das Konstruktmaterial zu zerreißen. Die Durchschnittsnaht reißt zwischen 400–500 g Zugkraft; der Zug des Chirurgen liegt bei 150 g Zugkraft.
Der Schweiß-/Materialfestigkeitstest wurde durchgeführt, um die UTS eines Konstrukts zu bestimmen. Probenringe von 5 mm Länge wurden von jeder Röhre herausgeschnitten und alle wurden auf ihre Endzugfestigkeit (UTS) unter Verwendung eines mechanischen Testsystems MTS^TM getestet. Drei Probenringe wurden aus jeder Röhre für drei Zugversuche, die bei jedem Konstrukt durchgeführt wurden herausgeschnitten, für insgesamt 90 Zugversuche. Ein Ring wurde in den Probenhalter des MTS^TM gegeben und wurde mit einer Rate von 0,02 kg_Kaft/s gezogen bis die Schweißnaht verrutscht oder bricht, oder bis das Material (eher als die Schweißnaht) bricht.
Beispiel 3: Verschiedene Schweißtemperaturen von ICL
Die Auswirkung der Schweißtemperatur und des Abschreckens nach dem Schweißen auf die Schweißfestigkeit wurde bei der ICL-zweischichtigen Röhrenanwendung untersucht.
Eine ICL-Probe von 10 Fuß Länge wurde längs aufgeschnitten und wurde nach dem in Beispiel 2 dargestellten Verfahren hergestellt. Sechs Röhren mit 6 mm Durchmesser, wobei die Länge zwischen 15–20 cm lag, wurden für jede Temperaturbedingung hergestellt.
Röhren wurden, während sie feucht waren, 3,5 Stunden einer Temperaturbedingung ausgesetzt. Die Temperaturbedingungen waren: Raumtemperatur (20 °C), 55 °C, 62 °C und 62 °C, dann wurden sie sofort in einem 4 °C Bad für eine Minute abgeschreckt. Alle Röhren wurden dann in EDC vernetzt. Sechs Röhren wurden zusammen in 300 ml 100 mM EDC über Nacht bei Zimmertemperatur belassen. Die Röhren wurden nach dem Vernetzen mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung gespült.
Probenringe von 5 mm Länge wurden aus jeder Röhre herausgeschnitten und alle wurden unter Verwendung eines MTS^TM auf Endzugfestigkeit (UTS) getestet. Fünf Probenringe wurden jeder Röhre für 5 Zugversuche bei jeder von 6 Röhren pro Bedingung für insgesamt 30 Zugversuche entnommen.
Die Schweißfestigkeit war weniger konsistent bei Röhren, die durch Dehydrierung bei Zimmertemperatur verbunden wurden, im Vergleich zu anderen Temperaturbedingungen, wenn sie unter Verwendung des UTS-Tests getestet wurden. Eine der sechs bei Raumtemperatur geschweißten Röhren wies UTS-Messwerte auf, die mit denen der anderen Behandlungen vergleichbar war. Bei den Röhren, die entweder mit oder ohne Abschrecken bei anderen Temperaturen geschweißt wurden, gab es keine Unterschiede in der Schweißfestigkeit. Nach dem UTS-Test wurde bestimmt, dass das Brechen des Materials keine Auftrennung der Schweißnaht sondern in allen Fällen ein Materialversagen war.
Beispiel 4: Die Antigenität vernetzter Darmkollagenschichten
Frische Proben von der Submucosadarmschicht vom Schwein wurden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Reinigungsschritt erhalten. Die Proben wurden dann unbehandelt belassen und in Wasser gelagert, in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung eingeweicht, mit 0,1 % Peressigsäure behandelt oder wurden mit 0,1 % Peressigsäure behandelt und mit 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) vernetzt. Die Proben wurden dann mit einer 0,5 m NaCl/0,1 M Weinsäure-Lösung für etwa 18 Stunden extrahiert.
Zwei 12 %-Tris-Glycin-Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gels (Novex Precast Gels Kat.Nr. EC6009) wurden laufen gelassen und nach etwa 18 Stunden auf 0,45 μ Nitrozellulosepapier übertragen. Weinsäureextrakte von entweder behandelter oder unbehandelter ICL wurden gegen eine Kontroll-Standard-Bahn laufen gelassen, enthaltend: 10 μl Kaleidoscope Prestained Standards (Bio-Rad Kat.Nr. 161-0324): 2 μl biotinylierte SDS-PAGE Niedrigbereichmolekulargewichtsstandards (Bio-Rad Kat.Nr. 161-0306): 6 μl Ladungspuffer; 10 μl Kontroll-Standard wurden auf jede Bahn geladen. Das Gel wurde etwa 2 Stunden mit 1 % Magermilchpulver (Carnation) in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung geblottet. Das Gel wurde dann dreimal in boratgepufferter physiologischer Kochsalzlösung/Tween mit 200 μl Waschflüssigkeit pro Bahn gewaschen. Primärantikörper in 200 μl Rb-Serum und boratgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (100 mM Borsäure : 25 mM Natriumborat 150 mM NaCl)/Tween wurde jeder Bahn in verschiedenen Titerverhältnissen (1:40, 1:160, 1:640 und 1:2560) hinzugegeben. Das Gel wurde dann eine Stunde auf einer Kippplattform (Bellco Biotechnology) bei Raumtemperatur mit einer auf 10 eingestellten Geschwindigkeit inkubiert. Dann wurde das Gel wieder dreimal mit boratgepufferter Kochsalzlösung/Tween gewaschen. Sekundärantikörper, Goat Anti-Rabbit Ig-AP (Southern Biotechnology Associates Inc. Kat.Nr. 4010-04) in einer 1:1000 Verdünnung wurde den Bahnen mit 200 μl pro Bahn hinzugegeben, und das Gel wurde eine Stunde bei Raumtemperatur auf einer Kippplattform inkubiert. Die Nitrozellulosemembran wurde dann in AP-Farbentwicklungslösung eingetaucht, während sie bei Raumtemperatur auf einer Kippplattform inkubiert wurde, bis die Farbentwicklung abgeschlossen war. Die Entwicklung wurde durch Waschen der Membran in deionisiertem Wasser für 10 Minuten auf einer Kippplattform gestoppt, während das Wasser einmal in den zehn Minuten gewechselt wurde. Die Membran wurde dann luftgetrocknet.
Die durch die Analyse des Gels erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Antigenität der vom Schwein stammenden ICL, die mit Peressigsäure und EDC behandelt wurde, eine stark verringerte Antigenität im Vergleich zu den anderen Behandlungen aufwies.
Beispiel 5: Sechsschichtiger Gewebereparaturstoff als ein Bauchdeckenlappen
Sechs Schichten von Schweinedarmkollagen wurden auf einer Glasplatte übereinandergelegt. Eine zweite Glasplatte wurde oben auf die Darmkollagenschichten gelegt und fest an die erste Platte geklammert. Das System wurde eine Stunde bei 62 °C in einen konventionellen Ofen gegeben. Unmittelbar nach der Erwärmung wurde das System 10 Minuten in ein 4 °C Wasserbad gegeben. Das System wurde auseinander genommen, die Darmkollagenschichten entfernt und für vier Stunden bei 25 °C mit 100 mM 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) in 50 % Aceton behandelt. Das Material wurde abgefüllt und durch Gammabestrahlung (2,5 Mrad) sterilisiert.
Der Gewebereparaturstoff wurde auf eine 3 cm × 5 cm große Schadstelle in Midline weiße-neuseeländische weiße Kaninchen (4 kg) unter Verwendung einer durchgängigen 2-0 Prolennaht aufgenäht. Die Tiere wurden nach vier Wochen, zehn Wochen und 16 Wochen getötet und grob, mechanisch und histologisch untersucht. Die Grobuntersuchung zeigte eine geringe Entzündung und Schwellung. Das Implantat war mit einer glänzenden Gewebeschicht bedeckt, die mit dem parietalen Bauchfell durchgängig zu sein schien. Es konnten kleine Blutgefäße erkannt werden, die sich kreisförmig vom Außenrand zur Mitte des Lappens fortsetzten. Mechanisch war das Transplantat stabil, wobei keine Reherniation beobachtet wurde. Die histologische Untersuchung offenbarte relativ wenige inflammatorische Zellen und die, die beobachtet wurden, waren vorrangig in der Nähe des Randes des Transplantats (aufgrund des Vorhandenseins von Prolennähmaterial). Die Bauchfelloberfläche war glatt und vollkommen von Mesothelium bedeckt.
Beispiel 6: Zweischichtiger Gewebereparaturstoff als ein perikardialer Reparaturlappen
Zwei Schichten von Schweinedarmkollagen wurden auf einer Glasplatte übereinandergelegt. Eine zweite Glasplatte wurde oben auf die Darmkollagenschichten gelegt und fest an die erste Platte geklammert. Das System wurde eine Stunde bei 62 °C in einen konventionellen Ofen gegeben. Unmittelbar nach der Erwärmung wurde das System für 10 Minuten in ein 4 °C Wasserbad gegeben. Das System wurde auseinandergenommen, die Darmkollagenschichten entfernt und vier Stunden bei 25 °C mit 10 mM 1-Ethyl-3-(3- Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) in 50 % Aceton behandelt. Das Material wurde abgefüllt und durch Gammabestrahlung (2,5 Mrad) sterilisiert.
Ein 3 × 3 cm Stück vom Perikardium vom neuseeländischen weißen Kaninchen wurde herausgeschnitten und durch ein gleichgroßes Stück Gewebereparaturstoff (mit unterbrochener Naht von 7-0 Prolen miteinander verbunden) ersetzt. Die Tiere wurden nach 4 Wochen und nach 180 Tagen getötet und grob, mechanisch und histologisch untersucht. Die Grobuntersuchung zeigte minimale Entzündung und Schwellung. Es konnten kleine Blutgefäße erkannt werden, die sich kreisförmig vom Außenrand zur Mitte des Lappens fortsetzten. Mechanisch war das Implantat stabil ohne Adhäsion weder zum Brustbein noch zum perikardialen Gewebe. Die histologische Untersuchung offenbarte relativ wenige inflammatorische Zellen und die, die beobachtet wurden, waren vorrangig in der Nähe des Randes des Transplantats (aufgrund des Vorhandenseins von Prolennähmaterial).
Beispiel 7: Hernienreparaturmittel
Eine Prototyp-Anordnung für die Hernienreparatur wurde unter Verwendung von ICL entwickelt, um einen inneren hohlen Bereich zu erhalten. Die Anordnung hatte, als es fertiggestellt wurde, eine runde Gestalt, die an der Peripherie verbunden war und einem geschwollenen inneren Bereich, der durch die Zufuhr einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung zum Anschwellen gebracht wurde. Der innere Bereich kann wahlweise eine Drahtspule für zusätzliche Festigkeit oder eine andere Substanz zum strukturellen Halt oder zur Abgabe von Substanz enthalten.
Um mehrschichtige ICL-Platten zusammenzusetzen, wurde 15 cm lange ICL aus lymphatischen Anhängen herausgeschnitten und die Seiten mit den Anhänge abgeschnitten, um eine Platte zu bilden. Die Platten wurden mit Texwipes trocken geklopft. Auf einer sauberen Glasplatte (6'' × 8'') wurden die Platten mit der Mucosaseite nach unten aufgeschichtet. In diesem Fall wurden die zweischichtigen und die vierschichtigen Lappen durch Aufschichten von entweder zwei oder vier Schichten ICL auf die Glasplatte konstruiert. Eine zweite Glasplatte (6'' × 8'') wurde oben auf die letzte ICL-Schicht gelegt, und die Platten wurden zusammengeklammert und dann eine Stunde bei 62 °C in einen hydratisierten Ofen gegeben. Die Konstrukte wurden dann für etwa zehn Minuten in deionisiertem Wasser bei 4 °C abgeschreckt. Die Glasplatten wurden dann aus dem Bad genommen und eine Platte von jedem Lappen entnommen. Die jetzt verbundenen ICL-Schichten wurden dann geglättet, um alle Falten und Blasen zu entfernen. Die Glassplatte wurde wieder auf die ICL-Schichten gelegt und das Ganze wieder für 30–60 Minuten in den hydratisierten Ofen gegeben, bis es trocken war. Die Lappen wurden aus dem Ofen genommen und durch Besprühen mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung teilweise rehydriert.
Für die Konstruktion eines zweischichtigen Konstrukts wurde ein zweischichtiger Lappen von der Glasplatte entfernt und auf den anderen zweischichtigen Lappen, der sich noch auf der anderen Glasplatte befand, gelegt. Eine ringförmige Platte (d_außen = 8,75 cm; d_innen = 6 cm) wurde auf den zweiten Lappen gelegt. Ungefähr 10 cm³ phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung wurden durch eine Nadel (Gauge 25) zwischen die beiden zweischichtigen Lappen injiziert. Eine zweite Glasplatte wurde dann oben auf die ringförmige Platte gelegt, und beide wurden dann zusammengeklammert. Für die Konstruktion eines vierschichtigen Konstrukts wurden die gleichen Schritte getätigt, außer dass zwei vierschichtige Lappen anstelle von zweischichtigen Lappen verwendet wurden. Die Konstrukte wurden für eine Stunde bei 62 °C in einen hydratisierten Ofen gegeben. Dann wurden die Konstrukte für fünfzehn Minuten in deionisiertem Wasser bei 4 °C abgeschreckt. Dann wurden die Konstrukte 18 Stunden in 200 ml 100 mM EDC in 50 % Aceton vernetzt und dann mit deionisiertem Wasser gespült. Die Konstrukte wurden dann mit einer Rasierklinge zum Formen auf die Größe des Außenrandes der ringförmigen Platte zugeschnitten.
Beispiel 8: Bandscheibenersatz
ICL, dichtes fibrilläres Kollagen und Hyaluronsäure wurden konfiguiert, um an die anatomische Struktur und Zusammensetzung einer Bandscheibe nah heranzukommen.
Dichte fibrillare Kollagendisketten, die Hyaluronsäure enthielten, wurden erzeugt. 9 mg Hyaluronsäure-Natriumsalz, das von der Luftröhre vom Rind (Sigma) stammt, wurde in 3 ml 0,5 N Essigsäure aufgelöst. 15 ml von 5 mg/ml Kollagen (Antek) wurde hinzugegeben und gemischt. Die Mischung wurde zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen. Zu drei Transwells (Costar) in einer Sechs-Kammern-Platte (Costar) wurde 5 ml der Lösung hinzugegeben. Zu dem Bereich außerhalb der Transwell wurde N600 PEG hinzugegeben, um den Boden der Membranen zu bedecken. Die Platte wurde 22 Stunden bei 4 °C auf einem Orbitalschütteln bei niedriger Geschwindigkeit mit einem Austausch der PEG-Lösung nach 5,5 Stunden aufbewahrt. Die PEG-Lösung wurde entfernt und die Transwells bei 4 °C/20 % relativer Feuchte über Nacht dehydriert.
Um vielschichtige ICL-Platten zusammenzusetzen, wurde 15 cm lange ICL aus lymphatischen Anhängen herausgeschnitten und die Seiten mit den Anhänge abgeschnitten, um eine Platte zu bilden. Die Platten wurden mit Texwipes trocken geklopft. Auf einer sauberen Glasplatte wurden die Platten mit der Mucosaseite nach unten auf fünf Lagen geschichtet und eine zweite Glasplatte wurde auf die fünfte Lage gelegt. Fünf fünfschichtige Lappen wurden gebildet. Die Platten mit der ICL dazwischen wurden zusammengeklammert und für eine Stunde bei 62 °C in einen hydratisierten Ofen gegeben. Die Konstrukte wurden dann für 10 Minuten in RODI-Wasser bei 4 °C abgeschreckt, dann aus dem Abschreckbad genommen und bei 4 °C bis zum Zusammensetzen der Scheibe gelagert.
Ein großer Lappen wurde auf eine andere Glasplatte gelegt. Ein etwas kleinerer Lappen wurde auf den ersten Lappen gelegt, der nach einer Kante des größeren Lappens ausgerichtet wurde. Ein Lappen wurde in zwei Hälften geschnitten und ein Loch, das annähernd die Größe einer DFC-Diskette hatte, wurde in die Mitte einer jeden geschnitten. Mit den Zentrumslöchern ausgerichtet, wurden die zwei Hälften auf den zweiten Lappen, gelegt, wobei sie nach der gleichen Kante ausgerichtet wurden. Drei rehydrierte DFC/HA-Disketten wurden in das mittige Loch gelegt. Ein anderer etwas kleinerer Lappen wurde auf die zwei Hälften, die die DFC-Disketten enthielten, gelegt, und ein größerer Lappen wurde auf den kleineren Lappen gelegt, beide sind nach der gleichen Kante ausgerichtet. Eine zweite Glasplatte wurde oben auf das Konstrukt gelegt. Die sich daraus ergebende Form war die eines Keils, wobei das dickere Teil jenes ist, das nach den Kanten, ausgerichtet wurde und sich zur entgegengesetzten Seite hin verjüngt. Die so geformte Anordnung wird eine Stunde bei 62 °C in einen hydratitisierten Ofen gegeben und dann für zehn Minuten in RODI-Wasser bei 4 °C abgeschreckt. Die Anordnung wurde ungefähr fünf Stunden in 100 mM EDC (Sigma) in 90 % Aceton (Baxter) vernetzt und dann mit drei Austauschvorgängen von phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gespült. Die Ränder der Anordnung wurden dann mit einer Rasierklinge zugeschnitten.
Beispiel 9: Die Bildung eines vaskulären Transplantatkonstrukts
Ein proximales Jejunum eines Schweins wurde mit einer Darmreinigungsmaschine (Bitterling, Nottingham, GB) gewonnen und bearbeitet und dann mit Peressigsäurelösung wie in Bespiel 1 beschrieben dekontaminiert. Die mit Peressigsäure behandelte ICL (PA-ICL) wurde längs aufgeschnitten und die lymphatischen Anhangsbereiche wurden entfernt, um eine ICL Platte zu formen. Die ICL-Platten wurden um rostfreie Stahldorne mit einem Durchmesser von 6,0 mm gewickelt, um zweischichtige Konstrukte zu bilden. Die Konstrukte (auf Dornen) wurden dann für 1 Stunde in eine ins Gleichgewicht gebrachte THERMOCENTER^TM-Ofenkammer, die auf 62 °C eingestellt wurde, gegeben. Die Konstrukte wurden aus der Kammer genommen und ungefähr 2 bis 5 Minuten in ein 4 °C Wasserbad gelegt. Die Konstrukte wurden 18 Stunden chemisch in 50 ml einer 100 mM 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) in 50/50 Wasser-/Acetonlösung vernetzt, um mit Peressigsäure behandelte, EDC-vernetzte (PA/EDC-ICL) vaskuläre Transplantatkonstrukte zu bilden. Die Konstrukte wurden von den Dornen entfernt und mit Wasser gespült, um die restliche EDC-Lösung zu entfernen. Nach dem Entfernen der Dornen wurde eine Schicht (ungefähr 200 μm dick) von Typ-I-Kollagen, das aus einer Rindersehne extrahiert wurde auf der Lumenoberfläche des Konstrukts entsprechend dem Verfahren, das in US-Patentschrift Nr. 5,256,418 beschrieben ist, abgelagert.
Polycarbonatspitzen (Luer-Lock-Halterungen, die an einem Ende konisch geformt sind) werden versiegelbar an einem der Enden der Konstrukte angebracht und die Konstrukte wurden horizontal in eine Ablagerungseinrichtung gegeben. Ein 50 ml Speicher von 2,5 mg/ml Säure-extrahiertem Kollagen, das nach dem Verfahren, das in der hierin einbezogenen US-Patenschrift Nr. 5,106,949 beschrieben ist, erzeugt wurde, wurde mittels der Spitzen befestigt. Das Kollagen konnte dann das Lumen der ICL-Röhre füllen und wurde dann für 16 Stunden bei 4 °C in ein Rührbad von 20 % MW 8000 Polyethylenglykol (Sigma Chemicals Co.) gegeben. Die Vorrichtung wurde dann zerlegt und ein Glasstab mit 4 mm Durchmesser wurde in die mit Kollagen gefüllte Röhre gegeben, um den Lumendurchmesser festzulegen. Das Transplantat konnte dann trocknen.
Die DFC-Lumenschicht wurde mit Benzalkonium-Chlorid-Heparin (HBAC) beschichtet, in dem die Transplantate dreimal in eine 800 U/ml HBAC-Lösung getaucht wurden und dann trocknen gelassen. Schließlich bekam das Transplantat eine abschließende chemische Sterilisationsbehandlung in 0,1 % v/v Peressigsäure. Das Transplantat wurde dann bis zur Implantation in trockenem Zustand gelagert.
Beispiel 10: Implantationsstudien bei Tiermodellen
Fünfundzwanzig Mischungshunde mit einem Gewicht von 15–25 kg wurden über Nacht ohne Nahrung gelassen und dann mit intravenösem Thiopental (30 mg/kg) narkotisiert, intubiert und mit Halothan und Lachgas (Distickstoffoxid) unter Narkose gehalten. Cefazolin (1000 mg) wurde intravenös sowohl vor als auch nach der Operation verabreicht. Jeder Hund erhielt entweder ein Aortabypasstransplantat oder ein Oberschenkelknocheninterpositionstransplantat. Für die Aortabypasstransplantate wurde ein medianer Bauchschnitt vorgenommen und die Aorta von den Nierenarterien bis zur Gabelung freigelegt, gefolgt von der Verabreichung von intravenösem Heparin (100U/kg). Die Transplantate (6 mm × 8 cm) wurden zwischen der distalen infrarenalen Aorta (End-zu-Seit-Anastomose) und der Aorta annäherungsweise zu der Gabelung (End-zu-Seit-Anastomose) angebracht. Die Aorta wurde distal zu der proximalen Anastomose abgebunden. Die Einschnitte wurden geschlossen und die Hunde für 30 Tage nach dem Eingriff mit Aspirin behandelt. Für die Oberschenkelknocheninterpositionstransplantate wurden die Tiere bilateral geöffnet, die Oberschenkelarterien freigelegt und ein 5 cm langes Stück herausgeschnitten. Die Transplantate (4 mm × 5 cm) wurden in End-zu-End-Form mit der Oberschenkelarterie verbunden. Auf der Gegenseite wurde das Kontrolltransplantat angebracht. Die Schnitte wurden geschlossen und die Tiere für 30 Tage nach dem Eingriff mit Aspirin behandelt. Das weitere Beobachten nach der Operation reichte von 30 Tagen bis zu 360 Tagen. Blutproben wurden vor der Implantation und vier und acht Wochen nach der Implantation entnommen. Die Tiere wurden zu verschiednen Zeitpunkten getötet (30 Tage, 60 Tage, 90 Tage, 180 Tage und 360 Tage).
Neuseeländische weiße Kaninchen mit einem Gewicht von 3,5–4,5 kg wurden über Nacht ohne Nahrung gelassen und dann mit Acepromazin (20 mg) und Ketamin (40 mg) narkotisiert, intubiert und mit Ketamin (50 mg/ml), das wie benötigt injiziert wurde, unter Narkose gehalten. Penicillin (60.000 U) wurde vor der Operation intramuskulär verabreicht. Ein medianer Bauchschnitt wurde vorgenommen, und die Aorta von den Nierenarterien bis zur Aufzweigung freigelegt, gefolgt von der Verabreichung von intravenösem Heparin (100 U/kg). Ein 3 cm langes Stück Aorta wurde herausgeschnitten, und die Transplantate in End-zu-End-Form mit der Aorta verbunden. Die Schnitte wurden verschlossen, und die Tiere wurden mit keiner Antigerinnungstherapie nach dem Eingriff behandelt. Die Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten getötet (30 Tage, 60 Tage, 90 Tage, 180 Tage und 360 Tage).
Die Implantate zusammen mit den angrenzenden vaskulären Geweben, welche von den getöteten Tieren erhalten wurden, zur Transmissionselektronenmikroskopieanalyse (TEM) 4 h in eine Lösung von 2 % Paraformaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat mit pH-Wert 7,4 fixiert. Die Proben wurden in 1,0 % OsO₄ (in 0,1 M Natriumcacodylat) nachfixiert und en bloc mit 2,0 % Uranylacetat (wässrig) eingefärbt. Nach einer zweiten Fixierung wurden alle Proben in einer gradierten Ethanolreihe und Propylenoxid dehydriert und in Epox 812 (Ernest F. Fullam, Rochester, NY, USA) eingelagert. Ultradünne (–700 nm) Abschnitte wurden mit Uranylacetat und Bleizitrat eingefärbt. Abschnitte wurden auf einem JOEL Instruments JEM100S bei 80 kV untersucht. Für die Scanning-Elektronenmikroskopie (SEM) wurden die Proben für 18 Stunden in einer halbstarken Karnovsky-Lösung fixiert und fünfmal in Sorensen-Phosphatpuffer vor einer einstündigen Nachfixierung in 1,0 % OsO₄ gespült. Die Proben wurden dann zweimal in Sorensen-Phosphatpuffer und dreimal in doppelt destilliertem Wasser gespült. Dehydrierung wurde durch eine Ethanolreihe (50 %, 70 %, 90 % und 100 %) durchgeführt gefolgt von einer Kritischen-Punkt-Trocknung. Die Proben wurden präpariert und mit 60/40 Gold/Palladium beschichtet.
ICL-Implantatsentnahmen von Hunden und Kaninchen wurden histologisch untersucht, um das Einwachsen von Empfängerzellen zu evaluieren. Masson's Trichrom-Färbung einer 60-Tage-Entnahme wies merkliches Empfängerinfiltrat auf. Die dunkelblauere Färbung zeigte Kollagen der ICL, während eine die Myofibroblasten umgebende Matrix, die heller blau gefärbt war, eine große Menge von Empfängerkollagen aufwies. Eine hohe Kraftverstärkung des Bereichs wies zahlreiche innerhalb der ICL vermischte Zellen auf. Die bei 30 Tagen entdeckte Entzündungsreaktion wurde aufgelöst, und die zellulare Reaktion war vorherrschend myofibroblastisch. Die Oberfläche des umgebauten Transplantats wurde von endothelialen Zellen, wie durch SEM und Factor VIII-Färbung verdeutlicht, gesäumt. Am Tag 360 hatte sich eine reife neue Arterie ausgebildet. Die junge Adventitia wurde aus Empfängerkollagenbündeln, die von fibroblastähnlichen Zellen besiedelt wurde, zusammengesetzt. Die Zellen und Matrizen des umgebauten Konstrukts erschienen ziemlich reif und gewebeähnlich.
Beispiel 11: Erzeugung von Anti-ICL-Antikörpern
Frische Proben von submucosaler Darmschicht vom Schwein wurden nach dem Reinigungsschritt, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, gewonnen jedoch nicht mit Peressigsäure behandelt. Die Proben wurden dann unbehandelt belassen (NC-ICL), mit 0,1 % Peressigsäure (PA-ICL) behandelt oder mit 0,1 % Peressigsäure behandelt und dann mit 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (PA/EDC-ICL) vernetzt.
Neuseeländische weiße Kaninchen wurden mit 0,5 mg von einer der drei ICL-Proben-Arten (NC-ICL, PA-ICL oder PA/EDC-ICL) immunisiert, um Antiserum zu erzeugen. Ursprünglich wurden die Kaninchen subkutan mit 0,5 ml homogenisierter unbehandelter ICL in Freund's komplettem Adjuvans (1:1, 1 mg/ml) injiziert. „Scheinkaninchen" erhielten 0,5 ml phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung in Freund's komplettem Adjuvans. Die Kaninchen wurden aller 3 bis 4 Monate mit der geeigneten Form von ICL in Freund's unvollständigem Adjuvans (0,25 mg/ml) aufgefrischt. Die Seren wurden 10–14 Tage nach jeder Auffrischung eingesammelt.
Beispiel 12: Erzeugung von ICL-Extrakten und Charakterisierung potentieller antigener Proteine die mit natürlichem Kollagen assoziiert sind.
Proteine wurden von NC-ICL, PA-ICL oder PA/EDC-ICL unter Verwendung von Weinsäure (Bellon, G. et al (1988) Aal. Biochem. 175:263–273) oder TRITON X-100 (Rohm und Hass) extrahiert. Pulverisierte NC-ICL, PA-ICL oder PA/EDC-ICL (10 % w/v) wurde entweder mit Weinsäure (0,1 M Weinsäure, 0,5 M NaCl) oder TRITON X-100-(Rohm und Haas)-Extraktionspuffer (TEB; 1 % TRITON X-100 in 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,2), 2mM EGTA, 2 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonyl-Flouride und je 25 mg/ml Aprotinin, Leupetin und Pepstatin (Sigma, St. Louis, MO)) vermischt. Die Mischungen wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Extrakte wurden durch Gaze gefiltert, um Zellbruchstücke zu entfernen, gegenüber PBS dialysiert und unter Verwendung von Centripep-30 (Amicon, Danvers, MA) konzentriert. Die Extrakte wurden bis zum Verwenden bei –80 °C gelagert.
Weinsäure- und TEB-Extrakte wurden auf einen 10 % Polyacrylamid-Gels durch SDS-PAGE nach Laemmli (Laemmli, GB (1970) Nature 227: 680–685) getrennt. Die Gele wurden entweder silbergefärbt (Bio-Rad, Hercules, CA) oder auf Nitrozellulosemembranen (Amersham, Arlington Heights, IL) übertragen. Multiple Proteinbanden wurden durch Silberfärbung in den NC-ICL-Extrakten sichtbar gemacht. Im Gegensatz dazu wurden nur zwei Banden in den PA-ICL-Extrakten sichtbar, und es wurden keine Proteinbanden in den Bahnen, die PA/EDC-ICL enthielten sichtbar. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Behandlung mit Peressigsäure und EDC, in Kombination, zu einer Verringerung der extrahierbaren nicht kollagenen Proteine in ICL fuhrt.
Immunblot-Übertragung wurde über Nacht unter Verwendung einer Trans-Blot Zelle (Bio-Rad) in Tris-Glyzin 20 % Methanoltransferpuffer durchgeführt. Nitrozellulosemembranen, die ICL-übertragene Proteine enthielten, wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit Blotto-Puffer (1 % Magermilchpulver in boratgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (BBS/Tween)) geblockt. Die Nitrozellulosemembranen wurden auf ein Multiscreen-System, das 12 einzelne Bahnen enthielt, übertragen. Die Membranen wurden dreimal mit BBS/Tween gewaschen. Positive Kontroll- oder Testseren (100 μl/Bahn) wurden der Membran hinzugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Jede Bahn wurde dreimal mit BBS/Tween gewaschen. Sekundärantikörper: ALPH-markierter Goat-anti-rabbit Ig oder ALPH-markierter Goat-anti-dog Ig (Southern Biotechnology) wurden den entsprechenden Bahnen (100 μl/Bahn) hinzugegeben, und Streptavidin-AP (100 μl) wurde einer der Bahnen, die Kaleidoscope Molecular Weight Standards (Bio-Rad) enthielten, hinzugegeben. Ein Alkaline Phosphatase Conjugate Substrate Satz (Bio-Rad) wurde verwendet, um die Immunblots sichtbar zu machen.
Anti-NC-ICL-Serum von Kaninchen, das durch wiederholtes Immunisieren mit NC-ICL erzeugt wurde, wurde verwendet, um potentiell immunreaktive Proteine nachzuweisen. Seren von immunisierten Kaninchen erkannten Antigene mit Molekulargewichten im Bereich von < 30, 40–70 und > 100 kDa in dem Weinsäureextrakt. Die gleichen Seren wurden auf Immunblots von TEB-Extrakten von NC-ICL getestet. Immunreaktive Proteine mit Molekulargewichten, die denen in dem Weinsäureextrakt festgestellten ähnlich waren, wurden nachgewiesen, wobei eine zusätzliche Reaktivität im 70–100 kDa-Bereich festgestellt wurde. Die Ergebnisse zeigten an, dass NC-ICL mehrere Proteine, die immunreaktiv sind, enthält, und diese Proteine durch Weinsäure oder TEB extrahiert werden können. Die größere Anzahl in immunreaktiver Proteine, die dem TEB-Extrakt vorhanden sind korreliert mit der Zunahme an Proteinen, die unter Verwendung von TEB im Vergleich zu Weinsäure extrahiert wurden.
Beispiel 13: Auswirkung von PA- oder EDC-Behandlung von ICL auf die Antigenität von Typ-I-Kollagen in ICL
Seren von Kaninchen, die mit NC-ICL, PA-ICL oder PA/EDC-ICL (Seren werden wie in Beispiel 11 beschrieben ist erzeugt) oder mit Säure-extrahiertem Typ-I-Kollagen (Organogenesis, Canton, MA) immunisiert wurden, wurden auf Typ-I-Kollagen-spezifische Antikörper mittels ELISA getestet. ELISA-Platten (Immolun II, NUNC, Bridgeport, NJ) wurden mit 200 ml/Well von 1 mg/ml Säure-extrahiertem Typ-I-Kollagen über Nacht bei 4 °C in 0,05 M Karbonatpuffer (pH-Wert 9,6) beschichtet. Die Platten wurden zweimal mit PBS/Tween-20 (0,1 %) gewaschen. Serumproben von Tieren oder Rabbit-Anti-Kollagen-Typ-I-Antikörper (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) Kaninchen wurden den Kammern (100 ml/Kammer) hinzugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS/Tween gewaschen. Sekundärantikörper: ALPH-markierter Goat-anti-rabbit Ig oder ALPH-markierter Goat-anti-dog Ig (Souterhn Biotechnology) wurden den entsprechenden Kammern hinzugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS/Tween gewaschen. P-Nitrophenylphosphat-(PNPP)-Substrat (1 mg/ml) wurde jede Kammer (100 ml/Kammer) hinzugegeben. Die Absorption wurde bei 405 nm auf einem SpectraMax-Mikroplattenlesegerät (Microplate Reader)(Molecular Devices, Sunnydale, CA) abgelesen.
Anti-Kollagen-Typ-I-Antikörper konnten in den Seren von Kaninchen, die mit irgendeiner Form von ICL immunisiert wurden, selbst bei einer Serumverdünnung von 1:40 nicht festgestellt werden. Im Gegensatz dazu wiesen Kaninchen, die mit gereinigten Typ-I-Kollagen immunisiert wurden, einen Antikörpertiter von 1:2560 auf. Diese Daten deuten darauf hin, dass Vernetzen nicht notwendig ist, um die Antigenität gegenüber Kollagen Typ I zu verringern, da Kaninchen, die mit NC-ICL immunisiert wurden, keine Anti-Kollagen-Typ-I-Antikörper erzeugen. Diese Daten deuten darauf hin, dass die immundominanten Proteine in NC-ICL nicht-kollagene Proteine sind. Ebenso ist die Auswirkung von PA und EDC auf die Verringerung der Antigenität von ICL auf nicht kollagene Proteine gerichtet.
Beispiel 14: Auswirkungen von Desinfektion und Vernetzung auf die Antigenität von ICL
Die Auswirkung von PA- und EDC-Behandlung auf die Antigenität von ICL wurde durch Verwendung von Anti-NC-ICL-Antiserum bestimmt, um auf immunreaktive Proteine, die in Weinsäure- oder TEB-Extrakten von PA- oder PA/EDC-behandelter ICL vorhanden sind, zu suchen.
Weinsäureextrakte von PA-ICL- und TEB-Extrakten von PA/EDC-ICL wurden auf 10 % SDS-PAGE-Gelen getrennt und auf Nitrozellulosemembranen zur Immunblot-Analyse übertragen, wie in Beispiel 12 beschrieben ist. NC-ICL-spezifische Antiseren wurden verwendet, um auf immunreaktive Proteine in jedem Extrakt zu suchen. Selbst wenn Immunblots von PA/ICL und PA/EDC-ICL überschichtet wurden, konnte keine Reaktivität in den Bahnen, die Anti-NC-ICL-Antikörper enthielten, festgestellt werden, was somit darauf hindeutete, dass die in der NC-ICL festgestellten immunreaktiven Proteine entweder fehlten oder ihre Epitope so modifiziert wurden, dass sie von Anti-NC-ICL-Antiserum nicht länger erkannt wurden. Um die letztere Frage zu addressieren, wurde Serum von Kaninchen, die entweder mit PA-ICL oder PA/EDC-ICL immunisiert wurden, ebenfalls getestet. Es wurde keine Antikörperbindung in einer der Bahnen über dem Hintergrund festgestellt. Diese Daten weisen darauf hin, dass, selbst wenn Kaninchen mit modifizierter ICL immunisiert wurden, sie keine Antikörper erzeugten, die aus modifizierter ICL extrahierte Proteine erkennen konnten. Diese Ergebnisse deuten an, dass die Proteine, die während des Verfahrens der Desinfektion und des Vernetzens entfernt oder modifiziert wurden, die gleichen Proteine, die für die Antigenität von NC-ICL verantwortlich sind, waren. Eine Antikörperreaktion von PA-ICL- oder PA/EDC-ICL-immunisierten Kaninchen wurde durch Immunblotting, wie in Beispiel 12 beschrieben ist, analysiert. Dieser Versuch wurde unternommen, um sicherzustellen, dass das Fehlen von Reaktivität von Anti-NC-ICL-Seren mit PA/EDC-ICL auf der Abwesenheit von Proteinen in ICL beruhte und nicht auf der Unfähigkeit, Proteine zu extrahieren, die dem Immunsystem in vivo zugänglich sein könnten, da das Vernetzen von kollagenen Materialien mit EDC die Menge und die Qualität von aus ICL extrahiertem Protein verringern könnte. Anti-ICL-Seren wurden unter Verwendung von PA-ICL oder PA/EDC-ICL erzeugt, um Kaninchen zu immunisieren. Seren von diesen Kaninchen wurden auf Antikörper, die für Proteine entweder in Weinsäure- oder TEB-Extrakten von NC-ICL spezifisch sind, getestet. Anti-PA-ICL erkannte von Anti-NC-ICL erkannte Proteine mit 207, 170 und 38–24 kDa, verlor jedoch die Reaktivität gegenüber Proteinen mit niedrigerem Molekulargewicht. Es wurden keine Banden durch das Anti-PA/EDC-ICL-Serum von 1 Kaninchen festgestellt. Diese Daten deuteten an, dass sowohl PA-ICL als auch PA/EDC-ICL weniger antigen als NC-ICL sind. Entweder wurden die antigenen Epitope von ICL während des Desinfektions- und Vernetzungsverfahrens entfernt, oder sie wurden modifiziert, um ihre Antigenität zu verringern. In jedem Fall ergaben Desinfektion und Vernetzen ein Material, dessen Antigenität beträchtlich reduziert war.
Beispiel 15: Bestimmung der humoralen Immunantwort in den Transplantatempfängern
Hunde wurden auf eine humorale Immunantwort gegenüber ICL-Transplantatbestandteile getestet, um festzustellen, ob ICL ihre Antigenität aufrechterhalten muss, um das Einwachsen von Zellen in dem Transplantat zu stimulieren. Blutproben wurden vor der Implantation und vier und acht Wochen nach der Implantation von fünfzehn Hunden entnommen, die vaskuläre PA/EDC-ICL-Transplantate erhalten hatten. Serum von jeder Blutprobe wurde auf Antikörper gegen Proteine sowohl in Weinsäure- als auch TEB-Extrakten von NC-ICL getestet. Selbst bei einer 1:40 Verdünnung des Serums wies keiner der getesteten Hunde Antikörper auf, die mit ICL-Proteinen reagierten. Die gleichen Serenproben wurden auf das Vorhandensein von Anti-Kollagen-Typ-I-Antikörpern mittels ELISA getestet. Alle Serenproben waren negativ für Antikörper gegen Typ-I-Kollagen bei einer Serum-Verdünnung von 1:40. Masson's Trichrom-Färbung von entnommenen Paraffinabschnitten dieser Hunde wiesen tatsächlich eine Infiltration von Empfängerzellen auf. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass PA/EDC-ICL keine Antikörperreaktion hervorruft, wenn der Empfänger das Material aktiv umbaut.
Obwohl die vorangehende Erfindung in einigen Einzelheiten durch Erklärungen und Beispiele zum Verdeutlichen und zum Verständnis beschrieben wurde, wird es jedem Fachmann verständlich sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen im Rahmen der beigefügten Patentansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Sterile, nicht pyrogene und nicht antigene Transplantate, die aus Kollagengewebe der Tunica submucosa des Dünndarms von Säugetieren gebildet sind zum Einpflanzen in einen Empfänger wobei die Transplantate zwei oder mehr übereinanderliegende, miteinander verbundene Schichten von Tunica submucosa des Dünndarms aufweisen, welche von den anderen Schichten des Dünndarms getrennt sind; wobei das vorerwähnte eingepflanzte Transplantat keine humorale Immunreaktion gegen Komponenten in dem vorerwähnten Kollagengewebe hervorruft und wobei das vorerwähnte Transplantat gleichzeitig einen biologischen Umbau erfährt, der mit einem geeigneten Ersatz durch lebende Zellen auftritt, so dass das ursprüngliche eingesetzte Tranplantat durch die lebenden Zellen des Patienten umgebaut wird.
Transplantat nach Anspruch 1, bei welchem die Tunica submucosa des Dünndarms jene von Schweinen, Rindern oder Schafen ist.
Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die Tunica submucosa des Dünndarms vom Schwein ist.
Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die Tunica submucosa des Dünndarms chemisch gereinigt ist.
Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transplantat vernetzt ist.
Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transplantat flach ist.
Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche wobei das Transplantat röhrenförmig ist.
Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transplantat Poren enthält.
Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transplantat weiters Heparin enthält.
Transplantat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transplantat weiters einen Wachstumsfaktor enthält, der die Vaskularisierung und Epithelialisierung fördern soll.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat ein vaskulärer Lappen ist.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat ein intracardialer Lappen ist.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat eine Blasenstützschlinge oder eine Uterusstützschlinge ist.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat ein Herzklappenersatz ist.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat ein Bauchwandlappen ist, der vernetzte Tunica submucosa des Dünndarms vom Schwein aufweist.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat ein pericardialer Reparaturlappen ist, der vernetzte Tunica submucosa des Dünndarms vom Schwein aufweist.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat ein Hernien-Reparaturlappen ist, der vernetzte Tunica submucosa des Dünndarms aufweist.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat ein Bandscheibenersatz ist, der vernetzte Tunica submucosa des Dünndarms aufweist.
Transplantat nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Transplantat ein Gefäßtransplantatkonstrukt ist, das vernetzte Tunica submucosa des Dünndarms vom Schwein aufweist.