DE69634633T2 - Thrombopoietinzusammensetzungen - Google Patents
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Description
- Hintergrund der Erfindung
- Die Hämatopoese ist der Vorgang, durch den sich Blutzellen entwickeln und aus den pluripotenten Stammzellen in dem Knochenmark differenzieren. Dieser Vorgang beteiligt ein komplexes Zusammenspiel von Polypeptid-Wachstumsfaktoren (Cytokinen), die über membran-gebundene Rezeptoren auf die Zielzellen wirken. Die Cytokin-Wirkung führt zu zellulärer Proliferation und Differenzierung, wobei eine Antwort auf ein bestimmtes Cytokin häufig abstammungsspezifisch und/oder stadienspezifisch ist. Die Entwicklung eines einzelnen Zelltyps, wie eines Thrombozyten, aus der Stammzelle kann die koordinierte Wirkung von einer Vielzahl von Cytokinen, die in der richtigen Reihenfolge wirken, erforderlich machen.
- Es wurden verschiedene Cytokine als therapeutische Wirkstoffe entwickelt. Zum Beispiel wird Erythropoetin, das die Entwicklung von Erythrozyten stimuliert, bei der Behandlung der Anämie, die aus renalem Versagen entsteht, verwendet. Mehrere der koloniestimulierenden Faktoren wurden in Verbindung mit Krebs-Chemotherapie verwendet, um die Erholung des Immunsystems des Patienten zu beschleunigen. Interleukin-2, α-Interferon und γ-Interferon werden bei der Behandlung bestimmter Krebsarten verwendet.
- Es wurde eine Aktivität, die die Megakaryozytopoese und Thrombozytopoese stimuliert, in den Körperflüssigkeiten thrombozytopenischer Tiere identifiziert und sie wird in der Literatur als „Thrombopoetin" bezeichnet (kürzlich von McDonald, Exp. Hematol. 16 : 201–205, 1988 und McDonald, Am. J. Ped. Hematol. Oncol. 14 : 8–21, 1992 geprüft). Dieses Protein wird jetzt unter Verwendung von gentechnisch kultivierten Zellen hergestellt. Siehe de Sauvage et al., Nature 369 : 533–538, 1994; Lok et al., Nature 369 565–568, 1994; Kaushansky et al., Nature 369 : 568–571, 1994 und Bartley et al., Cell 77 : 1117–1124, 1994.
- Menschliches Thrombopoetin (TPO) ist ein 70 kD Glykoprotein aus 332 Aminosäureresten. Es enthält eine aminoterminale Wachstumsfaktor-Domäne aus ungefähr 152 Resten und eine carboxylterminale Domäne, die reich an Kohlenhydraten ist. Gekürzte Formen von TPO, die die aminoterminale Domäne umfassen, zeigen biologische Aktivität in vitro und in vivo. Es wurden auch nichtmenschliche TPOs in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben (zum Beispiel Lok et al., ebenda; Bartley et al., ebenda; Shimada et al., Blood 84 (10 Suppl. 1) : 326a, 1994).
- Die Europäische Patentanmeldung Nr. EP-A-858-809 offenbart in Beispiel 4 eine Zusammensetzung, die 2500 μg TPO, 10 mg Polyoxyethylen-hydrogeniertes Rizinusöl 60 und 81,82 mg Natriumchlorid in 10 ml 10mM Tris-Puffer (pH 6,5) enthält. Dieses Dokument kann jedoch nur gemäß Artikel 54 (3) EPÜ berücksichtigt werden.
- Thrombopoetin scheint Proteolyse unterworfen zu sein und wurde in heterogener oder zersetzter Form isoliert (Bartley et al., ebenda; de Sauvage et al., ebenda). Thrombopoetinpräparate, über die in der wissenschaftlichen Literatur berichtet wird, sind daher nicht gut hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und den relativen Aktivitäten der verschiedenen molekularen Arten charakterisiert, obwohl zumindest einige der proteolytischen Produkte biologisch aktiv sind. Es wurde jedoch bis zum heutigen Zeitpunkt nur über wenig Arbeiten zu der Produktion von Erythropoetin in großem Umfang berichtet und es besteht Bedarf auf dem Fachgebiet nach Zusammensetzungen von TPO, die für die pharmazeutische Verwendung geeignet sind. Solche Formulierungen sollten bei der Lagerung stabil und einfach zu verwenden sein.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen von TPO, einschließlich wässerigen Zusammensetzungen, bereitzustellen, die bei der Lagerung stabil sind.
- Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren für die Reduktion der Adsorption von TPO an Oberflächen, einschließlich den Oberflächen von Aufbewahrungsampullen und Filtern, die bei der Zubereitung und Verpackung von pharmazeutischen Zusammensetzungen von TPO verwendet werden, bereitzustellen.
- Es ist eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung, Verfahren für die Stabilisierung pharmazeutischer Zusammensetzungen von TPO, einschließlich wässeriger Lösungen und lyophilisierter Pulver, bereitzustellen.
- Bei einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die TPO, einen physiologisch akzeptablen Puffer, einen Oberflächenadsorptions-Inhibitor, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus nicht-ionischen Tensiden und Polyolen besteht, eine isotonische Menge eines physiologisch akzeptablen Salzes und Histidin in einer Menge, die ausreicht, um die Aggregation von Thrombopoetin zu reduzieren, enthält, bereit. Das TPO kann menschliches TPO oder nicht-menschliches (zum Beispiel Ratten-, Maus-, Hunde- oder nicht-menschliches Primaten-) TPO sein. In bestimmten Ausführungsarten der Erfindung ist die Zusammensetzung eine wässerige Lösung mit einem pH von 5,0 bis 7,0, vorzugsweise 5,5 bis 6,5. In einer alternativen Ausführungsart ist die Zusammensetzung ein lyophilisiertes Pulver. In einer anderen Ausführungsart ist die Zusammensetzung eine wässerige pharmazeutische Zusammensetzung, die Thrombopoetin, 10–100 mM Phosphat-Puffer, 0,01–1,0% Polysorbat 20 oder Polysorbat 80 und eine isotonische Menge Natriumchlorid umfasst, wobei die Zusammensetzung einen pH von ungefähr 6,0 aufweist, und die weiter 10–100mM Histidin umfasst.
- Die Reduktion der Adsorption von Thrombopoetin an eine Oberfläche kann erreicht werden, indem man zu einer wässerigen Lösung von Thrombopoetin eine wirksame Menge eines Oberflächenadsorptions-Inhibitors, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus nicht-ionischen Tensiden und Polyolen besteht, hinzufügt, bevor man die Lösung mit der Oberfläche in Kontakt bringt. In ausgewählten Ausführungsarten der Erfindung ist der Oberflächenadsorptions-Inhibitor ein Polyoxyethylen-sorbitan-Fettsäureester, wie Polysorbat 20 oder Polysorbat 80.
- In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Stabilisierung einer Zusammensetzung von Thrombopoetin bereit, die die Zugabe einer wirksamen Menge von Histidin, vorzugsweise 10–100 mM, zu der Zusammensetzung umfasst, wobei die Zusammensetzung optional als ein lyophilisiertes Pulver vorliegt.
- Diese und andere Aspekte der Erfindung werden bei der Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und die angefügten Zeichnungen offensichtlich werden.
- Kurze Beschreibung der Abbildungen
-
1 veranschaulicht die Wirkungen von Albumin und Serumproteinen auf die Rückgewinnung von rekombinantem Maus-TPO nach Filtration. -
2 veranschaulicht die Wirkungen von nicht-ionischen Tensiden, Polyolen und Zucker auf die Rückgewinnung von rekombinantem menschlichem TPO nach Filtration. -
3 veranschaulicht die Reduktion der Oberflächenadsorption von TPO durch NaCl. -
4 veranschaulicht die Wirkungen verschiedener Formulierungen auf die Adsorption von TPO an Glasperlen. -
5 ist ein Diagramm von Abbauprofilen für chromatographisch gereinigtes rekombinantes menschliches TPO bei 37°C in 20mM Phosphat- oder Histidin-Puffer bei pH 6,0. - Ausführliche Beschreibung der Erfindung
- Der Begriff „isotonisch" wird hier in seiner konventionellen Bedeutung verwendet, dass heißt als eine Tonizität gleich der von Blut, äquivalent zu einer 0,9% Lösung von NaCl. „Eine isotonische Menge" eines Salzes ist diejenige Menge, die erforderlich ist, um eine Lösung isoton zu machen oder bei der Rekonstitution eines lyophilisierten Präparates eine isotone Lösung herzustellen.
- Die Konzentrationen werden hier in Einheiten der Molarität oder % Gew/V von flüssigen Zusammensetzungen spezifiziert. Wenn die Zusammensetzung in der Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt, werden die Konzentrationen der jeweiligen Bestandteile so sein, dass sie die spezifizierte Konzentration bei der Rekonstitution des Pulvers bereitstellen.
- Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind formuliert, um den Verlust an TPO-Aktivität aufgrund von Oberflächenadsorption, Aggregation, anderem physikalischem oder chemischem Abbau oder Kombinationen dieser Vorgänge zu reduzieren. Es wurde durch die Erfinder herausgefunden, dass nicht-ionische Tenside und Polyole die Adsorption von TPO an Oberflächen, wie Filter oder Ampullen, reduzieren kann.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird TPO mit einem Puffer, einem Oberflächenadsorptions-Inhibitor, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus nichtionischen Tensiden und Polyolen besteht, einer isotonische Menge eines physiologisch akzeptablen Salzes und Histidin in einer Menge, die ausreicht, um die Aggregation von Thrombopoetin zu reduzieren, verbunden. Die Zusammensetzung kann als eine wässerige Lösung oder ein lyophilisiertes Pulver formuliert sein. Das Letztere wird vor der Verwendung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, wie sterilem Wasser für Injektionszwecke, wieder hergestellt.
- Puffer für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung beinhalten physiologisch akzeptable Puffer geringer ionischer Stärke, die innerhalb des pH-Bereiches von 5,0–7,0 wirksam sind. Solche Puffer beinhalten Phosphat, Acetat, Citrat, Succinat und Histidin-Puffer. Mit „geringer ionischer Stärke" sind 5–500 mM, vorzugsweise 10–100 mM, am besten ca. 20 mM, gemeint. Natrium- und Kaliumphosphat-Puffer und Histidin-Puffer werden bevorzugt. Es wird bevorzugt, dass der pH der Zusammensetzung bei 5,5–6,5, am besten bei ungefähr 6,0 liegt. Ein besonders bevorzugter Puffer ist 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0 (16 mM monobasisches Natriumphosphat + 4 mM dibasisches Natriumphosphat).
- Oberflächenadsorptions-Inhibitoren, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beeinhalten nicht-ionische Tenside und Polyole. Nicht-ionische Tenside beeinhalten Polyoxyethylen-sorbitan-Fettsäureester, wie Polysorbat 20 (Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat), Polysorbat 80 (Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat) und dergleichen. Andere in dieser Hinsicht nützliche nicht-ionische Tenside beeinhalten Polyethylenoxide; Sorbitanester; Polyoxyethylenalkylether und Glyceride von Fettsäuren, einschließlich Glycerylmonooleat und Glycerylmonostearat. Polyole für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung beinhalten Polyethylenglykol (zum Beispiel PEG 3350), Mannitol, Xylitol, Sorbitol, Inositol und Glycerol. Im Allgemeinen wird der Oberflächenadsorptions-Inhibitor in einer Konzentration von 0,001 % bis 5%, vorzugsweise 0,01 % bis 1,0%, mehr vorzuziehen ungefähr 0,05% eingeschlossen. Ein besonders bevorzugter Oberflächenadsorptions-Inhibitor ist Polysorbat 80 in einer Konzentration von ungefähr 0,05%. Es können auch Kombinationen von Oberflächenadsorptions-Inhibitoren (zum Beispiel Polysorbat 80 + PEG 3350) verwendet werden.
- Es wurde herausgefunden, dass eine isotonische Menge eines physiologisch akzeptablen Salzes die Oberflächenadsorption von TPO weiter reduziert, wenn es in wässerige Lösungen, die ein nicht-ionisches Tensid enthalten, eingeschlossen wird. Bevorzugte Salze in dieser Hinsicht beinhalten Chloridsalze wie NaCl, KCl, CaCl2 und MgCl2. NaCl wird besonders bevorzugt. Wie es den Fachleuten klar sein wird, werden die tatsächlich benötigten Mengen eines Salzes, um Isotonizität zu erreichen, von solchen Faktoren wie dem besonderen ausgewähltem Salz und den anderen Bestandteilen der Zusammensetzung abhängen.
- Es können Vorteile erzielt werden, indem man in die Zusammensetzung Kombinationen bestimmter oben offenbarter Bestandteile einschließt. Zum Beispiel kann die Zugabe von Histidin zu einer nicht-Histidin-gepufferten Zusammensetzung TPO in der Zusammensetzung weiter stabilisieren. Experimentelle Anzeichen weisen darauf hin, dass Histidin die Aggregation von TPO reduziert und auch den nicht-proteolytischen Abbau (zum Beispiel Desamidierung oder Oxidation) bei pH > 5,5 reduzieren könnte. So wird Histidin zum Beispiel in einer Phosphat-gepufferten TPO-Zusammensetzung in einer Konzentration von 5–500 mM, vorzugsweise 10–100mM, mehr vorzuziehen ungefähr 20 mM eingeschlossen. Polyethylenglykol oder ein anderes Polyol kann zu einer Zusammensetzung, die ein nicht-ionisches Tensid enthält, zugegeben werden, um die Oberflächenadsorption weiter zu reduzieren. Polyole können vorteilhaft in lyophilisierte Zusammensetzungen eingeschlossen werden, um Aggregation zu reduzieren.
- Albumin kann auch in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindungen eingeschlossen werden. Menschliches Serum-Albumin wird für den Einschluss in pharmazeutische Zusammensetzungen, die für den Einsatz beim Menschen gedacht sind, vorgezogen, obwohl nicht-menschliche Albumine in analysenreinen Zusammensetzungen oder solchen, die für tiermedizinische Verwendung gedacht sind (einschließlich experimentelle Verwendung bei Tieren), verwendet werden können. Albumin ist als ein Bindemittel in lyophilisierten Zusammensetzungen nützlich und wirkt als ein Stabilisator, wenn es in einer Konzentration von 0,01–1,0%, vorzugsweise ungefähr 0,25% eingeschlossen wird.
- Es können auch ein oder mehrere Konservierungsstoffe in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden, insbesondere in diejenigen Zusammensetzungen, die für mehrfache Verwendung abgepackt werden. Konservierungsmittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten solche, die allgemein in pharmazeutischen Präparaten verwendet werden, wie Methylparaben, Propylparaben, Benzylalkohol, m-Kresol, Ethylmercurithiosalicylat, Phenol, Thiomersal und dergleichen.
- Zucker können in die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Füllstoffe, Stabilisatoren oder Tonizitätseinsteller eingeschlossen werden. Zucker sind als Füllstoffe und Stabilisatoren für lyophilisierte Zusammensetzungen von besonderem Interesse. Geeignete Zucker schließen Dextrose, Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose und dergleichen mit ein.
- Pharmazeutische Zusammensetzungen von TPO werden für die parenterale, insbesondere intravenöse oder subkutane Abgabe gemäß konventioneller Methoden formuliert. Verfahren der Formulierung sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, offenbart. In pharmazeutischen Zusammensetzungen wird die Konzentration von TPO typischerweise innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 10 mg/ml liegen, obwohl höher konzentrierte Lösungen bereitgestellt und vor der Verwendung verdünnt werden können. Es können auch Zusammensetzungen mit TPO-Konzentrationen außerhalb dieses bevorzugten Bereiches bereitgestellt werden, wie für die Verwendung als Forschungsreagenzien. Es können auch Bestandteile zusätzlich zu den oben offenbarten für auf dem Fachgebiet bekannte Zwecke eingeschlossen werden, zum Beispiel Füllstoffe, die vor der Lyophilisierung zugegeben werden. Diese Zusammensetzungen können weiter auch andere Cytokine, insbesondere früh wirkende Cytokine wie Stammzellenfaktor, II-3, II-6, II-11 oder GM-CSF enthalten.
- TPO-Zusammensetzungen, die für die pharmazeutische Verwendung gedacht sind, werden steril und pyrogenfrei sein und sie werden nach akzeptierten pharmazeutischen Vorgehensweisen hergestellt und abgepackt werden. Diese Zusammensetzungen können als Einheitsdosierung oder in Mengen zur Mehrfachdosierung abgepackt werden. Die Zusammensetzungen werden typischerweise in versiegelten Glasampullen mit Polytetrafluoretylen-ausgekleideten Stöpseln und mit passender Etikettierung abgepackt werden. Lyophilisierte Zusammensetzungen können als ein Kit, das eine passende Menge eines geeigneten Verdünnungsmittel, wie Wasser für Injektionszwecke (WFI) oder 5% Dextrose in WFI, beinhaltet, abgepackt werden.
- Thrombopoetin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können therapeutisch verwendet werden, wo immer es erwünscht ist, die Proliferation von Zellen, die aus dem Knochenmark stammen, zu erhöhen, wie bei der Behandlung von Zytopenie, wie z. B. die, die durch Aplastische Anämie, Myelodysplastisches Syndrome, Chemotherapie oder kongenitale Zytopenien induziert wird. TPO ist besonders für die Steigerung der Thrombozyten-Produktion, wie zum Beispiel bei der Behandlung von Thrombozytopenie, nützlich. Thrombozytopenie ist mit einer vielfältigen Gruppe von Erkrankungen und klinischen Situationen vergesellschaftet, die alleine oder zusammen wirken können, um den Zustand hervorzurufen. Erniedrigte Thrombozytenwerte können zum Beispiel aus Defekten bei der Thrombozyten-Produktion, anormaler Thrombozytenverteilung, Verdünnungsverlusten aufgrund massiver Transfusionen oder anormaler Zerstörung von Thrombozyten resultieren. Zum Beispiel können chemotherapeutische Medikamente, die bei der Krebstherapie verwendet werden, die Entwicklung von Thrombozyten-Vorläuferzellen in dem Knochenmark unterdrücken und die resultierende Thrombozytopenie begrenzt die Chemotherapie und kann Transfusionen notwendig machen. Zusätzlich können bestimmte Tumoren die Thrombozyten-Produktion und Thrombozyten-Verteilung behindern. Bestrahlungstherapie, die verwendet wird, um bösartige Zellen zu töten, tötet auch Thrombozyten-Vorläuferzellen. Thrombozytopenie kann auch aus verschiedenen autoimmunen Thrombozytenstörungen, die durch Medikamente, neonatale Alloimmunität oder Thrombozyten-Transfusions-Alloimmunität induziert werden, entstehen. TPO kann die Notwendigkeit für Transfusionen reduzieren oder verhindern, wodurch die Inzidenz von Thrombozyten-Alloimmunität verringert wird. Anormale Zerstörung von Thrombozyten kann resultieren aus: (1) erhöhtem Thrombozytenverbrauch in Gefäßtransplantaten oder traumatisiertem Gewebe oder (2) Immunmechanismen, die zum Beispiel mit medikamenten-induzierter Thrombozytopenie, Idiopathischer thrombozytopenischer Purpura (ITP), Autoimmun-Erkrankungen, hämatologischen Störungen wie Leukämie und Lymphom oder metastatischen Tumoren, die das Knochenmark mit einbeziehen, vergesellschaftet sind. Andere Indikationen für TPO schließen Aplastische Anämie und Medikamenten-induzierte Knochenmarkssuppression, die zum Beispiel aus Chemotherapie oder Behandlung einer HIV-Infektion mit AZT resultiert, mit ein.
- Thrombozytopenie manifestiert sich als verstärkte Blutung, wie Schleimhautblutungen aus dem Nasen-Rachen-Raum oder dem Gastrointestinal-Trakt, wie auch als Sickerblutungen aus Wunden, Ulcera oder Injektionsorten.
- Therapeutische Dosierungen werden im Allgemeinen in dem Bereich von 0,1 bis 100 μg/kg Patientengewicht pro Tag, vorzugsweise bei 0,5–50 μg/kg pro Tag, mehr vorzuziehen bei 1–25 μg/kg/Tag liegen, wobei die genaue Dosis durch den Kliniker, der die Art und Schwere des Zustandes, der behandelt werden soll, die Patienteneigenschaften etc. berücksichtigt, gemäß akzeptierten Standards festgelegt wird. Die Festlegung der Dosis liegt innerhalb der normalen Level der Befähigung auf dem Fachgebiet. TPO wird gewöhnlich über einen Zeitraum von bis zu 28 Tagen in Folge einer Chemotherapie oder Knochenmarkstransplantation oder bis eine Thrombozytenzahl von > 20.000/mm3, vorzugsweise > 50.000/mm3, erreicht ist, verabreicht. Häufiger wird TPO über eine Woche oder weniger, oft über einen Zeitraum von 1 bis 3 Tagen verabreicht werden. Im Allgemeinen ist eine therapeutisch wirksame Menge von TPO eine Menge, die ausreicht, um eine klinisch signifikante Steigerung in der Proliferation und/oder Differenzierung von Lymph- oder Knochenmarks-Vorläuferzellen hervorzurufen, was sich als eine Steigerung in den zirkulierenden Spiegeln reifer Zellen (z.B. Thrombozyten, Erythrozyten oder Neutrophilen) manifestieren wird. Die Behandlung von Thrombozytenstörungen wird so fortgesetzt bis eine Thrombozytenzahl von mindestens 20.000/mm3, vorzugsweise 50.000/mm3, erreicht ist. TPO kann auch in Kombination mit anderen Cytokinen wie IL-3, -6 und -11; Stammzellenfaktor; Erythropoetin (EPO); G-CSF und GM-CSF verabreicht werden. Innerhalb von Regimen für Kombinationstherapie, werden die täglichen Dosierungen für andere Cytokine in Allgemeinen sein: EPO, < 150 U/kg; GM-CSF, 5–15 μg/kg; IL-3, 1–5 μg/kg und G-CSF, 1–25 μg/kg. Eine Kombinationstherapie mit EPO ist zum Beispiel bei anämischen Patienten mit niedrigen EPO-Spiegeln indiziert.
- TPO kann auch ex vivo verwendet werden, wie in einer autologen Knochenmarks-Kultur. Kurz gesagt wird Knochenmark von einem Patienten vor Chemotherapie entnommen und mit TPO, optional in Kombination mit einem oder mehr anderen Cytokin(en), behandelt. Das behandelte Knochenmark wird dann nach der Chemotherapie an den Patienten zurückgegeben, um die Erholung des Knochenmarks zu beschleunigen. Zusätzlich kann TPO für die ex vivo Expansion von Knochenmark oder peripheren Blut-Vorläuferzellen (PBCP) verwendet werden. Vor einer Chemotherapie-Behandlung kann Knochenmark mit Stammzellenfaktor (SCF) oder G-CSF stimuliert werden, um frühe Vorläuferzellen an die periphere Zirkulation freizusetzen. Diese Vorläufer können aus dem peripheren Blut gesammelt und konzentriert werden und dann in Kultur mit TPO, optional in Kombination mit einem oder mehreren anderen Cytokin(en), einschließlich, aber nicht beschränkt auf, SCF, G-CSF, II-3, GM-CSF, II-6 oder II-11, behandelt werden, um sich in Megakaryozyten-Kulturen hoher Dichte zu differenzieren und proliferieren, die dann dem Patienten nach der Hochdosis-Chemotherapie wieder zugeführt werden können.
- TPO ist auch als ein Laborreagens bei dem Studium hämatopoetischer Vorgänge nützlich. Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen lagerungsstabile Präparate für solche Verwendungen bereit.
- Die Erfindung wird weiter durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht.
- Beispiele
- Rekombinantes menschliches und Maus-TPO wurden unter Verwendung transfizierter Babyhamster-Nierenzellen (BHK 570 Zellen; ATCC CRL 10314) hergestellt. TPO wurde aus zellkonditionierten Kulturmedien durch Affinitätschromatographie auf immobilisiertem MPL-Rezeptor oder chromatographisch unter Verwendung einer Kombination aus Farbstoff-Ligand-Affinitätschromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und Adsorption auf Protein-Kontaminanten auf Hydroxyapatit gereinigt. Die biologische Aktivität von TPO wurde in einem Mitogenese-Assay unter Verwendung von BaF3-Zellen, die mit einem Expressionsvektor, der den menschlichen MPL-Rezeptor kodiert (Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 5640–5644, 1992), transfiziert wurden, als Zielzellen bestimmt. BaF3 ist eine Interleukin-3-abhängige Prä-Lymphzell-Linie, die aus Maus-Knochenmark stammt (Palacios und Steinmetz, Cell 41 : 727–734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6 : 4133–4135, 1986). Die Zellen wurden Testproben in der Gegenwart von 3H-Thymidin ausgesetzt. Die Menge von 3H-Thymidin, das in die zelluläre DNA eingeschlossen war, wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve von menschlichem TPO quantifiziert. 10 U/ml wurden als die Menge, die halbmaximale Stimulation in dem Mitogenese-Assay ergab, definiert.
- Polysorbat 80 (Tween 80), Reinheitsgrad NF, wurde von Spectrum Chemical Mfg.. Corp., New Brunswick, NJ, erhalten. Natriumchlorid (AR, USP), Natriumphosphat, dibasisch, Heptahydrat (USP, TAC) und Natriumphosphat, monobasisch, Monohydrat (USP), wurden von Mallinkrodt Chemical Corp., Chesterfield, MO erhalten.
- Beispiel 1
-
- * chrom. = chromatographisch gereinigt; affin. = affinitätsgereinigt.
- ** Mito Verdünner = RPMI 1640 ergänzt mit 10% FBS, 1% L-Glutamin, 1% PSN antibiotische Mischung (Penecillin, Streptomycin, Neomycin), 0,001 M Natriumpyruvat, 0,025 M Hepes, 0,00033% Gew./V. Mercaptoethanol.
- Die Filteradsorption wurde unter Verwendung von 0,2 μm Polyvinylidenfluorid-Membranfiltern (DuraporeTM Filter; Millipore, Bedford, MA) oder AcrodiscTM Membranfiltern (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI), befestigt an Spritzen, gemessen. Die Lösungen von TPO wurden durch die Filter per Hand gedrückt. Es wurden Proben vor der Zugabe der Lösung an die Spritze und nach dem Durchtritt durch den Filter genommen. Es wurde gefunden, dass die Rückgewinnung von rekombinantem Maus-TPO in Formulierungen, die 0,25% menschliches Serumalbumin enthielten, höher war als in denjenigen ohne Albumin (
1 ). Ähnliche Ergebnisse wurden mit rekombinantem menschlichen TPO erhalten. Es wurden keine großen Unterschiede in der Filterrückgewinnung als eine Funktion des pH über den getesteten Bereich (pH 4–8) beobachtet, aber die Rückgewinnung war bei pH 6,0 am größten. Die Oberflächenadsorption von menschlichem rekombinanten TPO wurde ebenfalls reduziert, wenn 0,01 % Polysorbat 80 in die Formulierung eingeschlossen wurde (2 ). Man fand heraus, dass isotonisches Natriumchlorid die Adsorption in Gegenwart von Polysorbat 80 weiter reduziert (3 ). - Die Oberflächenadsorption wurde weiter unter übertriebenen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnissen unter Verwendung von Glasperlen untersucht. Es wurden 0,5 ml Proben von verdünnten TPO-Lösungen (≈ 10 μg/ml) gegenüber 1,0 g Glasperlen (425–600 μm) bei 5°C auf einem Röhrchen-Schüttler ausgesetzt. Die mitogene Aktivität wurde nach 1,5, 5 und 24 Stunden bestimmt, um die Adsorption als eine Funktion der Zeit auszuwerten. Wie in
4 gezeigt wird, nahm die Adsorption über den 24 Stunden Testzeitraum mit der Zeit zu. Die Adsorption wurde in einem größeren Ausmaß durch Polysorbat 80 als durch Polysorbat 20 reduziert. Die Rückgewinnung nahm zu, als die Polysorbat 80 Konzentration von 0,001 % auf 0,05% erhöht wurde. Die Kombination von Polysorbat 80 und isotonischem Natriumchlorid war bei der Reduktion der Oberflächenadsorption wirksamer als Polysorbat 80 allein. - Beispiel 2
- Der Effekt des pH auf die Stabilität von TPO in Lösung wurde in Phosphat- und Histidin-Puffern getestet. Proben von affinitäts- und chromatographisch gereinigtem Maus- und Mensch-TPO wurden in geeigneten Puffern verdünnt oder mit NaOH oder HCl bis zu dem gewünschten pH titriert (siehe Tabelle). Die Proben wurden dann bei verschiedenen Temperaturen gelagert und intermittierend durch Mitogenese-Assay, wie oben beschrieben, und SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS PAGE), gefolgt von Western Blotting untersucht. Pseudo-Abbaugeschwindigkeitskonstanten 1. Ordnung (Kobs) wurden aus den Abfällen der log-linearen Einstellungen (fits) der verbleibenden mitogenen Aktivität gegen die Zeit geschätzt, wenn geeignet.
- SDS PAGE/Western Blot Analyse zeigte, dass affinitätsgereinigtes rekombinantes menschliches TPO Proteolyse zu Varianten geringeren Molekulargewichtes auf eine pH- und zeitabhängige Weise unterworfen ist. In dem pH-Bereich von 6–8, resultierte die Proteolyse in der Spaltung in zwei Varianten geringeren Molekulargewichtes (35 und 18 kD durch Gelelektrophorese), wobei die Proteolyse mit zunehmendem pH als eine Funktion der Temperatur zunahm. Bei pH ≤ 5, trat ein Abbauprodukt mit einem offensichtlich gering niedrigerem Molekulargewicht als das des Elternproteins (≈ 60 kD durch Gelelektrophorese) auf und nahm mit abnehmendem pH als eine Funktion der Temperatur zu.
- Chromatographisch gereinigtes rekombinantes menschliches TPO zeigte ein unterschiedliches Abbauprofil. SDS PAGE/Western Blot Analyse wies auf eine temperaturabhängige Spaltung in zwei Arten niedrigeren Molekulargewichtes (30 und 20 kD durch Gelelektrophorese) bei pH ≤ 5 auf, wobei die Proteolyse mit abnehmenden pH zunahm. Es wurde keine signifikante Proteolyse bei pH > 6 beobachtet, es bildeten sich jedoch Aggregate höheren Molekulargewichtes bei Zunahme von pH und Temperatur. Alle Abbauprodukte wiesen geringere biologische Aktivität als ihr Elternprotein auf. Die pH-Geschwindigkeitsprofile (in Kobs gegen pH), die die Pseudo-Abbaugeschwindigkeiten 1. Ordnung (Kobs) des Proteins darstellen, legten Unterschiede in den relativen Abbaugeschwindigkeiten der verschiedenen Stoffwechselwege als eine Funktion der Temperatur nahe. Die Profile bei 30°C und 37°C waren ähnlich und zeigten einen pH maximaler Stabilität ≈ 6. Obwohl ein schneller Verlust an Bioaktivität bei pH > 6 auftrat, wurden grobe Änderungen durch SDS PAGE und Western Blotting nicht offensichtlich. Diese Ergebnisse legten nahe, dass bei pH > 6 der Abbau vorrangig über Desamidierung, Oxidation oder irgendeinen anderen Mechanismus, der durch Elektrophorese nicht nachweisbar ist, auftritt. Die Abbaugeschwindigkeit bei 5°C war bei pH ≤ 6 relativ konstant, was nahe legt, das der/die Abbau-Stoffwechselweg(e) in diesem pH-Bereich eine große Aktivierungsenergie (steile Temperaturabhängigkeit) besitzen und nicht wesentlich zu dem gesamten Verlust von TPO bei dieser Temperatur beitragen.
- Äquivalente Abbaugeschwindigkeiten wurden als eine Funktion des pH gefunden, wenn die Ergebnisse mit Natrium- und Kalium-Phosphat-Puffern verglichen wurden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, wenn verschiedene Konzentrationen von Kaliumphosphat-Puffern verwendet wurden (20 mM–100mM, pH 6,0). Es wurden jedoch Unterschiede bemerkt, wenn Histidin als ein Puffer (20 mM) in dem pH-Bereich von 5 bis 6 verwendet wurde. Die Abbaugeschwindigkeit war bei einem pH von 5,0 bei Histidin-Puffer größer als bei Phosphat-Puffer bei 37°C, aber bei pH 5,5 oder 6,0 waren die Abbaugeschwindigkeiten äquivalent oder niedriger bei Histidin-Puffer (
5 ). Ähnliche Ergebnisse wurden bei 30°C gesehen, obwohl die Unterschiede weniger stark waren. Bei 5°C waren die Abbaugeschwindigkeiten bei Histidin- und Phosphat-Puffern bei pH 5–6 äquivalent. Diese Ergebnisse stimmen mit gesteigertem Abbau über Niedrig-pH-Abbaustoffwechselwege in der Gegenwart von Histidin überein, während Histidin den Abbau über Hoch-pH-Stoffwechselwege reduziert. Da die Niedrig-pH-Stoffwechselwege inhibiert werden, wenn die Temperatur gesenkt wird, ist der verstärkte Abbau in der Gegenwart von Histidin bei 5°C nicht feststellbar.
Claims (8)
- Zusammensetzung, optional für eine parenterale Verwendung geeignet, umfassend: Thrombopoietin, z.B. menschliches Thrombopoietin; einen physiologisch akzeptablen Puffer; einen Oberflächen-Adsorptions-Inhibitor, gewählt aus nicht-ionischen Tensiden und Polyolen; eine isotonische Menge eines physiologisch akzeptablen Salzes und Histidin in einer ausreichenden Menge um die Aggregation des Thrombopoietins zu reduzieren.
- Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich um eine wässrige Lösung mit einem pH von 5,0 bis 7,0, vorzugsweise 5,5 bis 6,5 oder ein lyophilisiertes Pulver handelt.
- Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Puffer aus Phosphat-, Acetat-, Citrat- und Histidin-Puffern gewählt ist.
- Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Oberflächen-Adsorptions-Inhibitor ein Polyoxyethylen-Sorbitan-Fettsäureester ist, z.B. Polysorbat 20 oder Polysorbat 80, der optional in einer Konzentration von 0,01 % bis 1 % (G/V) vorliegt.
- Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Salz NaCl, KCl, CaCl2 oder MgCl2 ist.
- Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin umfassend Albumin oder ein Konservierungsmittel.
- Verfahren zum Stabilisieren einer Zusammensetzung von Thrombopoietin, umfassend die Zugabe einer effektiven Menge Histidin, vorzugsweise 10–100 mM zu der Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung optional in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt.
- Wässrige pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: Thrombopoietin; 10–100 mM Phosphat-Puffer; 01–1,0% Polysorbat 20 oder Polysorbat 80 und eine isotonische Menge Natriumchlorid, wobei die Zusammensetzung einen pH von ungefähr 6,0 aufweist und weiterhin umfassend 10–100 mM Histidin.
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