DE69633742T2

DE69633742T2 - Wasserlöslicher komplex aus membranproteinamphiphile acrylpolymer und verwendung zur diagnose

Info

Publication number: DE69633742T2
Application number: DE69633742T
Authority: DE
Inventors: Jean-Luc Popot; Christophe Tribet; Roland Audebert
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2016-12-17
Also published as: DE69633742D1; EP0946875A1; WO1998027434A1; EP0946875B1; JP2001519836A; US6492501B1

Description

Die Erfindung betrifft neue wasserlösliche Komplexe aus Membranproteinen-Vinylpolymeren mit amphiphilem Charakter, ein Verfahren zur Herstellung dieser Komplexe und die Anwendung dieser Komplexe in Diagnose- oder Analyseverfahren.
Die vollständigen Membranproteine, eine spezielle Klasse von Proteinen, sind in vivo in die biologischen Membranen eingefügt, deren Lipid-Doppelschicht sie durchqueren. Die Oberfläche dieser Proteine, die natürlich in Kontakt mit den Membranen kommt (transmembrane Zone), ist besonders hydrophob.
Die Membranproteine stellen wesentliche biologische Funktionen sicher, insbesondere, was den Austausch von Information oder Molekülen zwischen verschiedenen Zellkompartimenten und zwischen der Zellen und ihrer Umgebung betrifft. Als solche weisen sie eine Hauptbedeutung auf dem medizinischen Gebiet auf. Sie stellen beispielsweise vorrangige Ziele für medikamentöse Moleküle dar. Sie sind auch an zahlreichen menschlichen Krankheiten beteiligt, von denen gewisse (zum Beispiel die Plaque-Sklerose oder die Myasthenia gravis pseudoparalytica) eine Autoimmun-Komponente aufweisen, die sich in der Anwesenheit von Antikörpern, die gegen Membranproteine gerichtet sind, im Serum manifestiert. Die Handhabung von Membranproteinen in wässriger Lösung ist sehr häufig eine Vorbedingung, die für ihre Reinigung und ihre strukturelle und funktionelle Untersuchung unabdingbar ist. Sie erfordert es, eine spontane Aggregation der hydrophoben Domänen zu vermeiden und um die transmembranen Zonen herum eine wenig polare Umgebung aufrechtzuerhalten.
Die klassischen Präparate dieser Proteine im wasserlöslichen Zustand enthalten Mizellen-Konzentrationen von Tensiden. Der Erfolg des Verfahrens beruht auf der enthalten, mit einer Konzentration oberhalb ihrer kritischen Mizellen-Konzentration (kMK) zugesetzt werden. Abgesehen von eventuellen Problemen mit den Kosten, die durch den Verbrauch von Tensiden entstehen, werden die Experimente häufig aufgrund der Tatsache schwierig gemacht, dass die Membranproteine sehr häufig zerbrechlich und empfindlich für ihre Umgebung sind. Beispielsweise können sie in Anwesenheit eines Überschusses von Mizellen denaturiert werden, während ein Mangel an Tensid im Allgemeinen zu ihrer Fällung führt.
Mehrere Patente, unter denen man die WO-A-9400557; WO-A-9115505; EP-A-363 106; DE-A-35 27 139; JP-A-61076500; US 5 223 411 ; JP-A-02270856 und JP-A-01168653 zitieren kann, beschreiben die Extraktion, Reinigung und Handhabung von Membranproteinen in wässrigem Medium. Diese Proteine sind entweder in Mizellen-Systemen dispergiert oder in Lipid-Doppelschichten eingefügt.
Schafmeister et al., Science, 262, S. 734–738, 1993, haben ebenfalls die Bildung von Komplexen zwischen Membranproteinen und amphiphilen Peptid-Polymeren beschrieben. Die betreffenden amphiphilen Polymere sind kleine Polypeptide, die als Peptitergentien bezeichnet werden, starre Strukturen (α-Helices), deren eine Seite hydrophob und deren andere Seite hydrophil ist. Die Peptitergentien halten die Löslichkeit von Bakteriorhodopsin aufrecht. Sie scheitern jedoch im Fall eines Porins, ohne Zweifel, weil ihre Starrheit ihre Möglichkeit der Anpassung an verschiedene hydrophobe Oberflächen beschränkt. Die Autoren ziehen die Verwendung der Peptitergentien für die Erleichterung der Kristallisation von Membranproteinen in Betracht.
Man kann auch das Gebiet der Assoziationen von synthetischen amphiphilen Polymeren und globulären (wasserlöslichen) Proteinen, die Arbeiten von F. Petit et al., Sci., 273, S. 777–781, 1995, über modifizierte amphiphile Polyacrylate mit einem Molekulargewicht zwischen 150 000 und 200 000 anführen. Der Gegenstand dieser Arbeiten richtet sich auf die Untersuchung von Assoziationen von Proteinen/Polymeren (Bildung von Gelen, insbesondere Kinetik und Energetik der Komplexbildung) und nicht auf die Aufrechterhaltung von Membranproteinen in dispersen Lösungen.
Es besteht dem gemäß ein zu lösendes Problem, was die Handhabung von Membranproteinen in wässrigen Lösungen, die frei von Detergentien sind, in Form von löslich gemachten Membranproteinen betrifft.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, dieses Problem allgemein zu lösen und insbesondere neue Komplexe aus Membranproteinen-Vinylpolymeren mit amphiphilem Charakter vorzuschlagen, welche die folgenden Vorteile aufweisen:

– Herstellung von konzentrierten Lösungen von Membranproteinen in nativer Form,
– Herstellung von lyophilisierten Präparaten von Membranproteinen in nativer Form,
– geringe Herstellungskosten.

Die Komplexe werden in Abwesenheit von amphiphilen Zusätzen in dem Medium gehandhabt, daher eine Verringerung der Reinigungskosten (große Volumina von Lösungen für die Chromatographie, die Dialysen ...)
Der Ausdruck „Vinyl" umfasst in seiner allgemeinen Bedeutung die Acryl-Polymere.
Die Erfindung betrifft demgemäß einen wasserlöslichen Komplex aus Membranprotein-Vinyl-Polymer mit amphiphilem Charakter, der dadurch gekennzeichnet ist, dass das Vinyl-Polymer der Formel
entspricht, in der
R₁ eine der folgenden Gruppen ist:

– COO^– M⁺; wobei M⁺ ein Alkalikation ist,
– COOR₇, wobei R₇ ein Zuckerrest, Polyoxyalkylen, insbesondere Polyoxyethylen, mit 4 bis 10 Alkylenoxid-Einheiten, ein Rest (CH₂)_t-NR₁₀R₁₁ ist, wobei t eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, R₁₀, R₁₁, identisch oder verschieden, ein Wasserstoffatom, ein (C₁-C₄)-Alkylrest sind,
– N-Pyrrolidonyl,
– Phenylsulfonat
– CONR₈R₉, wobei R₈ und R₉, identisch oder verschieden, ein Wasserstoffatom, ein Zuckerrest, Polyoxyalkylen, insbesondere Polyoxyethylen, mit 4 bis 10 Alkylenoxid-Einheiten, ein zwitterionischer Rest sind,

₄

₅

₆

₂

₁₂

₁₃

₁₄

– wobei R₁₂ ein linearer oder verzweigter Alkyl- oder Alkenylrest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen ist,
– R₁₃, R₁₄, identisch oder verschieden, eine der Bedeutungen von R₁₂ aufweisen und darüber hinaus eines der beiden einem Wasserstoffatom entsprechen kann,

₃

₁₅

₁₆

₁₇

– wobei R₁₅ ein (C₁-C₅)-Alkylrest ist,
– R₁₆, R₁₇ die Bedeutungen von R₁₅ aufweisen und darüber hinaus eines der beiden einem Wasserstoffatom entsprechen kann,

– wobei x 20 bis 90% beträgt,
– wobei y 10 bis 80% beträgt,
– wobei z 0 bis 60% beträgt,

Die mittlere Molmasse ist als Gewicht angegeben.
Die Polymere, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind demgemäß amphiphile Polymere, die mindestens eine Fettkette, das heißt einen hydrophoben Teil, und hydrophile Einheiten, das heißt einen hydrophilen Teil, umfassen.
Nachstehend wird hinweisend und nicht beschränkend die Bedeutung der verschiedenen Substituenten, die in der Formel I angezeigt sind, im Detail erläutert:

– M⁺ ist ein Lithium-, Natrium- oder Kalium-Alkalikation,
– R₇ ist insbesondere ausgewählt aus:

₂

_4,8

₂

₃

₂

– R₈, R₉ sind insbesondere aus dem Glucosamin-, Fructosamin-, Maltosamin, Saccharosamin-Rest und allgemein den Aminomono- oder Disaccharid-Resten;
ausgewählt.

Unter den Alkylresten R₁₂ bis R₁₄ werden insbesondere der n-Hexyl-, n-Heptyl-, n-Octyl-, n-Nonyl, n-Decyl-, n-Undecyl-, n-Dodecyl-Rest, die (C₆-C₁₂)-Reste aufgeführt, die einen sekundären Kohlenstoff oder einen tertiären Kohlenstoff besitzen.
Unter den Alkenylresten R₁₂ bis R₁₄ werden insbesondere die linearen (C₆-C₁₂)-Reste, die oben erwähnt sind und eine oder zwei Doppelbindungen besitzen, oder die gleichen Reste aufgeführt, die einen sekundären Kohlenstoff oder einen tertiären Kohlenstoff besitzen.
Unter den Alkylresten R₁₅ bis R₁₇ werden insbesondere Ethyl, Isopropyl, n-Propyl, n-Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl, sek-Pentyl, t-Pentyl, Isopentyl angeführt.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung wasserlösliche Komplexe aus Membranproteinen-Acryl-Polymeren mit amphiphilem Charakter, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Acryl-Polymere der Formel:
entsprechen, wobei M⁺, R₄, R₅, R₆, R₁₃, R₁₄, R₁₆, R₁₇, x, y, z die gleiche Bedeutung wie in der Formel I aufweisen.
Die Acryl- oder Vinyl-Polymere mit amphiphilem Charakter der Formel I oder II werden auf bekannte Weise ausgehend von Acryl- oder Vinyl-Polymer-Vorstufen erhalten, die unter Umständen im Handel erhältlich sind oder durch Polymerisation von vinylischen, acrylischen oder methacrylischen Monomeren oder einer Mischung dieser Monomere synthetisierbar sind. In diesem letztgenannten Fall erhält man Copolymere, die durch Ausdehnung in dem Gattungsausdruck „Polymer" eingeschlossen sind. Die Acryl-Polymere mit amphiphilem Charakter der Formel II sind das Ergebnis einer Reaktion von Verbindungen R₁₃R₁₄NH und gegebenenfalls R₁₆R₁₇NH mit einem Acryl-Polymer, was zu einer zufälligen Verteilung der Amide entlang der ganzen Kette führt. Das Polymer wird zuvor oder in einem späteren Schritt in Salzform gebracht. Ein solches Syntheseverfahren ist beispielsweise in March, J. (1985) Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, S. 372–374 (Wiley, New York); Wang, T. K., Illiopoulos, I. und Audebert, R. (1988) Polym. Bull. 20, 577–582, beschrieben.
Nachstehend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, in Kombination untereinander oder mit gewissen unter ihnen oder auch nicht, angegeben.

– Gemäß einer ersten Ausführungsform entsprechen R₁₃, R₁₄ einem Wasserstoffatom oder einem linearen Alkylrest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, wobei R₁₃, R₁₄ nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom sein können, vorzugsweise R₁₃ oder R₁₄ ein n-Octylrest ist, wobei der andere Rest R₁₄ oder R₁₃ ein Wasserstoffatom ist.
– Gemäß einer zweiten Ausführungsform entsprechen R₁₆, R₁₇ einem Alkylrest, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Isopropyl-, Isobutylrest besteht, oder einem Wasserstoffatom, wobei R₁₆, R₁₇ nicht gleichzeitig einem Wasserstoffatom entsprechen können.
– Gemäß einer dritten Ausführungsform liegt:
– x zwischen 30 und 80% einschließlich,
– y zwischen 20 und 70% einschließlich,
– z zwischen 0 und 50% einschließlich.
– Gemäß einer vierten Ausführungsform ist das Acryl-Polymer mit amphiphilem Charakter aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem Polymer besteht, in dem:

⁺

₁₃

₁₄

Die mittlere Molmasse liegt zwischen 2000 und 50 000.
M⁺ für Na⁺ oder K⁺ steht,
R₁₃ n-Octyl ist, R₁₄ für H steht,
R₁₆ Isopropyl ist, R₁₇ für H steht,
x 30 bis 40% beträgt,
y 20 bis 30% beträgt,
z 30 bis 50% beträgt.
Die mittlere Molmasse liegt zwischen 2000 und 50 000.
Der Komplex umfasst darüber hinaus Lipide, wie diejenigen, die aus der Migration des Membranproteins während seiner Abtrennung von Detergens-Molekülen abstammen.
Der Komplex kann alle interessierenden Membranproteine umfassen, wie diejenigen, die in der Einleitung der Beschreibung definiert worden sind.
Die Erfindung ist deshalb nicht auf eine spezielle Kategorie von Membranproteinen beschränkt. Es werden jedoch insbesondere die immunogenen Membranproteine, die Membranproteine von Zellen, die das Ziel von Medikamenten sind, angeführt.
Unter den Membranproteinen werden insbesondere die Proteine, die in der Tabelle 4 von Popot und Vitry (Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1990, 19: 369–403) Seiten 375–378, erwähnt sind, und ihre eukaryotischen und prokaryotischen Homologe angeführt.
Die Allgemeinheit des Mechanismus der Aufrechterhaltung in wässriger Lösung durch die Polymere wird durch die große Mannigfaltigkeit der Zusammensetzung und der Struktur der bis heute am häufigsten untersuchten Proteine veranschaulicht: Bakteriorhodopsin ist ein einzigartiges Polypeptid mit einem MG von etwa 27 000, das mit einem Retinal-Molekül assoziiert ist. Das photosynthetische Reaktionszentrum (MG etwa 100 000) und das Cytochrom b₆f (MG etwa 110 000) stammen von der nicht-kovalenten Assoziation mehrerer Polypeptide und anderer Moleküle, wie Häme, Chlorophylle, Karotinoide ... ab. Darüber hinaus ist b₆f in nativer Form ein Dimer (MG etwa 220 000). Die transmembranen Zonen dieser drei Proteine sind aus Bündeln von α-Helices aufgebaut, während das Porin OmpF (ein Trimer mit einem MG von etwa 110 000) eine Struktur mit einem β-Fass ist. Was die Bildung von Komplexen mit den Polymeren betrifft, hat man keinerlei qualitativen Unterschied zwischen diesen Proteinen entdeckt. Eine mäßige Anpassung der Konzentrationen der Partner hat sich natürlich als notwendig erwiesen, um die nützliche Polymermenge zur Aufrechterhaltung jedes Proteins in Lösung zu optimieren.
Die Zugabe eines amphiphilen Polymers mit mäßiger Molmasse (MG < 50 000 g/mol) selbst mit geringen Konzentrationen zu einer Dispersion von Membranproteinen in Mizellen-Medium führt zur Bildung eines Komplexes. Ein Reinigungsschritt ermöglicht es, diesen Komplex zu isolieren, der das Protein in nativer Form, dessen eventuelle gebundene Cofaktoren oder Lipide und mehrere amphiphile Makromoleküle umfasst. Das Verhalten der Makromoleküle, die mit den hydrophoben Oberflächen der Proteine assoziiert sind, weist die allgemeinen Merkmale der Adsorption von Polymer auf Kolloiden auf. Insbesondere dissoziieren die gebundenen Polymere nicht aus dem Komplex, solange die Lösung nicht konkurrierende Moleküle, wie Tenside, enthält. Das Protein ist dann in Abwesenheit von freien Tensiden in dem Medium wie ein wasserlösliches Protein handhabbar.
Die Menge an Acryl-Polymer mit amphiphilem Charakter pro Membranprotein hängt natürlich von der Größe der Polymere und der Proteine ab. Gewisse Proteine sind Dimere, Trimere oder Tetramere und können deshalb mehr oder weniger große Mengen an Polymer aufnehmen.
Unter Berücksichtigung dieser Einzelheiten umfassen die Komplexe gemäß der Erfindung im Allgemeinen 1 bis 100 Moleküle Polymer/Protein, vorteilhaft weniger als 10, wobei es sich versteht, dass die Zahl der Moleküle eine Funktion der Polymermasse und der Größe des Proteins ist.
Die Erfindung betrifft auch den Komplex aus Acryl-Polymer mit amphiphilem Charakter/Membranprotein in lyophilisierter Form.
Sie betrifft auch eine hoch konzentrierte wässrige Lösung des Komplexes gemäß der Erfindung, vorteilhaft mehr als 5 g/l, vorzugsweise zwischen 10 und 500 g/l. Die Membranproteine in ihren lyophilisierten oder hoch konzentrierten Formen sind im nativen Zustand und können demgemäß leicht gehandhabt und in verschiedenen Anwendungen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Komplexe gemäß der Erfindung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Lösung von Membranproteinen in Detergens-Medium in Mizellen-Form mit einem oder mehreren Vinyl-Polymeren mit amphiphilem Charakter, wie vorstehend beschrieben, in Kontakt bringt und die Konzentration des Detergens auf eine Konzentration unterhalb der kritischen Mizellenkonzentration erniedrigt und den Komplex isoliert.
Die Erniedrigung der Konzentration des Detergens kann auf bekannte Weise durchgeführt werden: zum Beispiel Verdünnung, Adsorption der Detergentien, Dialyse, Abtrennung auf Molekularsieb oder auf einem Gradienten.
Die Bildung von Mizellen aus Detergenzien/Membranproteinen wird auf bekannte Weise bewerkstelligt.
Die Komplexe aus Proteinen und Polymeren können von den Tensiden, die in den Mutterlaugen der Proteine und des im Überschuss zugeführten Polymers anwesend sind, durch verschiedene Verfahren abgetrennt werden. Die Adsorption von amphiphilen Molekülen beispielsweise auf Biobeads SM-2-Kugeln ermöglicht es, den größten Teil der Tenside ohne Folge auf die Konzentration des Polymers zu extrahieren. Durch Dialyse gegen eine pH-Pufferlösung können die Tenside und die nicht an die Proteine gebundenen Polymere in einigen Tagen aus dem Medium extrahiert werden, das die Komplexe enthält. Schließlich kann man insbesondere die Sedimentation auf einem Saccharose-Gradienten verwenden. Die Analyse der Sedimentationsprofile zeigt die Abwesenheit von Aggregaten bei den Komplexen der Proteine an.
Die wenigen rückständigen Tensid-Moleküle pro Protein sind mit den Hunderten von Tensid-Molekülen zu vergleichen, die im Mizellen-Medium pro Protein gebunden sind. Lipide, die manchmal eine funktionelle Rolle spielen, können mit den Komplexen assoziiert verbleiben. In den erhaltenen löslichen Komplexen scheinen die Polymere mit den Proteinen in Verhältnissen gebunden zu sein, die unabhängig von der anfänglichen Zusammensetzung der Mischung aus Protein, Tensid, Polymer sind. Jedoch hängt die Polymermasse, die pro Protein gebunden ist, von der Art des Proteins, dem pH und der Ionenstärke ab.
Im Allgemeinen verwendet man, um eine wirksame Bildung der Komplexe sicherzustellen, eine Lösung, die 0,1 bis 10 μM Membranproteine und 0,005% bis 1% Polymer in Gramm pro Gramm Lösung umfasst, das heißt 0,005 g bis 1 g Polymer pro 100 g Lösung.
Die Zugabe der Polymere muss vor der Verdünnung der Lösung bewirkt werden, welche sich über oder bei der kritischen Mizellen-Konzentration befindet.
Dieser Komplex bewirkt insbesondere die Aufrechterhaltung der Proteine nach der Verdünnung in löslicher Form.
Die Beibehaltung des nativen Zustands ist sehr häufig für Anwendungen in der Biochemie oder auf dem medizinischen Gebiet unerlässlich. Man weist die Anwesenheit der Gesamtheit der Untereinheiten, welche die komplexierten Membranproteine aufbauen, wie Cytochrom b₆f oder das Reaktionszentrum, in den durch Sedimentation gereinigten Komplexen nach. Die Absorptionsspektren im Sichtbaren von b₆f oder dem Reaktionszentrum gehen keine Veränderung ein. Das Spektrum von Bakteriorhodopsin, das für die Umgebung des Proteins sehr empfindlich ist, weist in Anwesenheit des Polymers eine Verschiebung von einigen Nanometern gegen kleinere Wellenlängen auf, ähnlich derjenigen, die in Mizellen-Medium beobachtet wird. Man hat die enzymatische Aktivität von gereinigten Komplexen aus b₆f und Polymeren gemessen. Wenn sie in Lösung gehalten werden, bleiben die Komplexe während mehrerer Wochen aktiv. Die Geschwindigkeit des Abbaus ist mit derjenigen von Proteinen in klassischem Mizellen-Medium vergleichbar.
Die Komplexe aus Membranproteinen-Acryl-Polymeren mit amphiphilem Charakter gemäß der Erfindung können in verschiedenen Anwendungen verwendet werden:

a – Vereinfachung der Handhabung von Lösungen dieser Proteine, da die strenge Steuerung der Konzentration an Tensid nicht mehr erforderlich ist.
b – Zugang zu Techniken der Untersuchung von Proteinen, die in Anwesenheit von Tensiden oder Lipidmembranen unmöglich oder schwierig durchzuführen sind (zum Beispiel NMR in flüssigem Medium, Kristallisation, gewisse Formen der Elektronenmikroskopie ...).
c – Erhalt von konzentrierten (> 10 g/l) und dünnflüssigen Proteinlösungen.
d – Möglichkeit, die Präparate zu lyophilisieren, um sie zu konservieren, dann die Proteine durch einfache Zugabe von Wasser oder Puffer wieder zu suspendieren. Dies eröffnet einen Weg für die Kommerzialisierung von Membranproteinen.
e – Neue Diagnosesysteme, welche die Membranproteine als Rezeptoren oder als Antigene verwenden, können angestrebt werden, beispielsweise für die Untersuchung von zirkulierenden, löslichen oder durch Lymphozyten getragenen Antikörpern; im ersten Fall erleichtert die Löslichkeit des Membranproteins in Abwesenheit von Detergens die Durchführung von Immunpräzipitations-Protokollen; im zweiten Fall ist es möglich, den Zellen Antigen in löslicher Form zu präsentieren, ohne die zelluläre Lyse zu riskieren, die durch die klassischen Tenside hervorgerufen wird.
f – Die Komplexe aus Membranproteinen-amphiphilen Polymeren weisen potentiell eine große Bedeutung in der Immunologie für die Präsentation von Membranproteinen oder anderen hydrophoben Molekülen als Immunogene für die Zwecke der Impfung oder Antikörper-Produktion auf; speziell modifizierte Polymere zur Verstärkung der Immunreaktion sind vorstellbar.
g – Zahlreiche Membranproteine sind Enzyme, deren Komplexierung durch amphiphile Polymere entweder die industrielle Verwendung oder die Verwendung in Reagenzienkits erleichtern kann.
h – In der Pharmakologie kann die Bereitstellung von Präparaten von löslichen Membranproteinen in Abwesenheit von Tensiden auch die Vereinfachung von zahlreichen Tests beispielsweise zur Messung der Affinität von Zellrezeptoren zu interessierenden pharmazeutischen Molekülen ermöglichen.

Die Erfindung betrifft deshalb Reagenzienkits, die als Merkmal mindestens einen Komplex gemäß der Erfindung, insbesondere in Form einer konzentrierten Lösung oder eines lyophilisierten Präparats, umfassen.
Die Erfindung betrifft auch diagnostische Kits, die als Merkmal mindestens einen Komplex gemäß der Erfindung, insbesondere in Form einer konzentrierten Lösung oder eines lyophilisierten Präparats, umfassen.
Die Erfindung betrifft schließlich neue Acryl-Polymere mit amphiphilem Charakter der oben beschriebenen Formel II, die insbesondere für die Herstellung von Komplexen aus Membranproteinen-Acryl-Polymeren mit amphiphilem Charakter nützlich sind.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung, jedoch ohne sie zu beschränken:
I. – Herstellung von Acryl-Polymeren mit amphiphilem Charakter
Die Polymere werden durch die Bildung von Amid-Bindungen zwischen n-Octylamin, gegebenenfalls Isopropylamin und den Carboxylgruppen von Polyacrylsäuren mit niedrigem Molekulargewicht: (Molmasse etwa 1000 bis 20 000) gemäß March, J. et al., oder Wang, T. K. et al. (oben) hergestellt.
Die erhaltenen Acryl-Polymere mit amphiphilem Charakter sind Co- oder Terpolymere, die auf statistische Weise entlang der Kette gepfropft sind. Die erhaltenen Polymere besitzen einen amphiphilen Charakter und sind in Wasser nicht unlöslich.
Die Merkmale einiger der erhaltenen Polymere sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.
Das Molekulargewicht wird ausgehend von Polyacrylat-Vorstufen durch Gelpermeationschromatographie gemessen, indem man Kalibrierungsstandards aus Polyoxyethylen mit einer MM mit enger Verteilung verwendet. MM ist die scheinbare Molmasse in kDa. x, y, z sind die Molprozentsätze jeder Art der Einheiten, die auf statistische Weise entlang der Kette verteilt sind, nicht gepfropft, Octylamid bzw. Isopropylamid.
Die Werte sind unter dem Vorbehalt von den Messungen inhärenten Fehlern angegeben.
II. – Herstellung von Membranproteinen
– Bakteriorhodopsin (BR)
Die Membran von Halobacterium salinarium wird in 100 mM Octylthioglucosid (OTG) in 100 mM Ammoniumphosphat (AP) bei pH 8,0 gelöst, dann wird BR durch Zentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten (5–20 Gew.-%) in dem gleichen Puffer, der 10 mM OTG enthält, gereinigt (10 h bei 54 000 U/min: 250 000 × g). Die Endkonzentration betrug 0,1 g/Liter in 100 mM AP (pH 8,0), etwa 10% Saccharose, 10 mM OTG.
– Cytochrom b₆f von Chlamydomonas reinhardtii
Der Cytochrom b₆f-Komplex von Chlamydomonas reinhardtii wird in Anwesenheit von Hecameg^® und von Ei-Phosphatidylcholin (PC) gereinigt. Die endgültige Lösung enthält etwa 5 μM b₆f-Komplex in 20 mM Hecameg^®, 0,1 g/l PCE und 400 mM eines NaOH/AP-Puffers und verschiedene Inhibitoren von Proteasen.
– Photosynthetisches Reaktionszentrum von Rhodobacter sphaeroides (RC)
Das photosynthetische Reaktionszentrum von Rhodobacter sphaeroides liegt zu etwa 3 g/l 20 mM in Hecameg^®/20 mM NaON-Tricin-Puffer, pH 8,0, in Lösung vor.
– Porin OmpF von Escherichia coli
Das Porin OmpF von Escherichia coli liegt zu 4 g/l in 0,2 Gew.-% Octylpolyoxyethylen in dem gleichen Puffer wie oben in Lösung vor.
III – Herstellung von Komplexen
In eine Mizellen-Lösung von Membranproteinen zu 0,1 bis 5 μM gibt man entweder 0,05 Gew.-% oder 0,005 Gew.-% Polymere, dann verdünnt man zehnfach mit Puffer.
Nach 15-minütiger Inkubation bei 4°C werden die Lösungen über 30 min bei 4°C bei 210 000 × g zentrifugiert.
Die Konzentrationen der Proteine im Überstand werden ausgehend von der Extinktion bei 564 nm (Redox-Differenzspektrum des Cytochrom b₆f); 546 nm (BR); 278 nm (OmpF); 802 nm (RC) bestimmt.
Die beigefügte 1 zeigt die Gewichtsprozentsätze der Membranproteine in dem Überstand im Vergleich mit:
C1 einer Verdünnung in Mizellen-Medium,
C2 einer Verdünnung durch Puffer ohne Zusatz von Polymer,
C3 einer Verdünnung durch Puffer nach Zugabe von nicht-gepfropftem Polyacrylat.
Das verwendete Membranprotein ist das Cytochrom b₆f

– in schwarz 0,005% Polymer
– in weiß 0,05% Polymer.

Die beigefügte 2 zeigt den Gewichtsprozentsatz von Membranproteinen im Überstand (BR, OmpF, RC) im Vergleich mit einem Puffer-Medium ohne Polymer (C4).
Die durchgeführten Tests zeigen, dass diese vier so stabilisierten Proteine alle Merkmale der nativen Proteine aufweisen.
Nach Verdünnung in 0,25 mM LM-Lösung katalysierten die Komplexe Polymere-Cytochrom b₆f die Elektronenübertragungen von Decylplastochinol auf Plastocyanin.

Claims

Wasserlöslicher Komplex aus Membranprotein-Vinylpolymer mit amphiphilem Charakter, dadurch gekennzeichnet, dass das Vinylpolymer die Formel:
aufweist, in der: R₁ eine Gruppe: – COO^–M⁺, wobei M⁺ ein Alkalikation ist, – COOR₇, wobei R₇ ein Zuckerrest; Polyoxyalkylen, insbesondere Polyoxyethylen, mit 4 bis 10 Alkylenoxid-Einheiten; ein Rest (CH₂)_t-NR₁₀R₁₁ ist, wobei t eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, R₁₀, R₁₁, identisch oder verschieden, ein Wasserstoffatom, ein (C₁-C₄)-Alkylrest sind, – N-Pyrrolidonyl, – Phenylsulfonat, – CONR₈R₉, wobei R₈ und R₉, identisch oder verschieden, ein Wasserstoffatom, ein Zuckerrest, Polyoxyalkylen, insbesondere Polyoxyethylen, mit 4 bis 10 Alkylenoxid-Einheiten, ein zwitterionischer Rest sind, darstellt, R₄, R₅, R₆, identisch oder verschieden, ein Wasserstoffatom oder ein Methylrest sind, R₂ ein Rest COOR₁₂ oder CONR₁₃R₁₄ ist, wobei – R₁₂ ein linearer oder verzweigter Alkyl- oder Alkenylrest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen ist, – R₁₃, R₁₄, identisch oder verschieden, eine der Bedeutungen von R₁₂ aufweisen und darüber hinaus eines der beiden ein Wasserstoffatom darstellen kann, R₃ ein Rest COOR₁₅ oder CONR₁₆R₁₇ ist, wobei – R₁₅ ein (C₁-C₅)-Alkylrest ist, – R₁₆, R₁₇ eine der Bedeutungen von R₁₅ aufweisen und darüber hinaus eines der beiden ein Wasserstoffatom darstellen kann, x, y, z den jeweiligen Prozentsätzen der Einheiten entsprechen, wobei – x 20 bis 90% beträgt, – y 10 bis 80% beträgt, – z 0 bis 60% beträgt, wobei das mittlere Molekulargewicht 500 bis 100000, vorteilhaft weniger als oder gleich 50000 beträgt.
Wasserlöslicher Komplex aus Membranprotein-Acrylpolymer mit amphiphilem Charakter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Acrylpolymer der Formel:
entspricht, wobei M⁺, R₄, R₅, R₆, R₁₃, R₁₄, R₁₆, R₁₇, x, y, z die gleichen Bedeutungen wie in der Formel 1 von Anspruch 1 aufweisen.
Komplex nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R₁₃, R₁₄ ein Wasserstoffatom oder einen linearen Alkylrest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen darstellen, wobei R₁₃, R₁₄ nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom sein können.
Komplex nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass R₁₃ oder R₁₄ ein n-Octylrest ist, wobei der andere Rest R₁₄ oder R₁₃ ein Wasserstoffatom ist.
Komplex nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R₁₆, R₁₇ einen Alkylrest, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Isopropyl-, Isobutylrest besteht, oder ein Wasserstoffatom darstellen, wobei R₁₆, R₁₇ nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom darstellen können.
Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass: x 30 bis 80% beträgt, y 20 bis 70% beträgt, z 0 bis 50% beträgt.
Komplex nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Acryl-Polymer mit amphiphilem Charakter aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Polymer besteht, in welchem: M⁺ für Na⁺ oder K⁺ steht, R₁₃ für n-Octyl steht, R₁₄ für H steht, x 70 bis 80% beträgt, y 20 bis 30% beträgt, z 0% beträgt, wobei das mittlere Molekulargewicht 2000 bis 50000 beträgt, oder M⁺ für Na⁺ oder K⁺ steht, R₁₃ für n-Octyl steht, R₁₄ für H steht, R₁₆ für Isopropyl steht, R₁₇ für H steht, x 30 bis 40% beträgt, y 20 bis 30% beträgt, z 30 bis 50% beträgt, wobei das mittlere Molekulargewicht 2000 bis 50000 beträgt.
Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er darüber hinaus lipidische Verbindungen enthält.
Komplex nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er in lyophilisierter Form vorliegt.
Hochkonzentrierte wässrige Lösung mit einer Konzentration über 5 g/l, vorteilhaft zwischen 10 und 500 g/l, eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranproteine aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Proteinen von Eukaryoten und Prokaryoten, insbesondere Proteinen mit enzymatischer Aktivität, besteht.
Verfahren zur Herstellung der Komplexe nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung von Membranproteinen in Detergens-Medium in Mizellenform mit einem oder mehreren Vinylpolymeren mit amphiphilem Charakter gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in Kontakt bringt und dass man die Konzentration des Detergens auf eine Konzentration unterhalb der kritischen Mizellenkonzentration absenkt und den Komplex isoliert.
Reagenzkit, umfassend mindestens einen Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als Reagenz.
Diagnostisches Kit, umfassend mindestens einen Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als immunologisches Reagenz.