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TECHNISCHES
GEBIET
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Diese
Erfindung betrifft eine neue alkalische Protease. Insbesondere betrifft
sie eine alkalische Protease, die in oberflächenaktiven Mitteln stabil
und hitzeresistent ist, deren Herstellungsverfahren, deren Verwendung
in Detergenzien und Mikroorganismen, die die alkalische Protease
herstellen.
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STAND DER TECHNIK
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In
den letzten Jahren ist die Umweltverschmutzung ein gesellschaftliches
Problem geworden. Mit der Beschränkung
der Verwendung von Phosphat als Bestandteil in Detergenzien wurde
ein Enzym mit einem Detergenz gemischt, um die Reinigungskraft zu
verbessern. Detergenz mit einem Enzym, wie z. B. einer Protease,
Amylase, Cellulase und Lipase, werden derzeit vermarktet. Vor allem
Protease kann organische Kleiderflecke abbauen, von denen 10 bis
40% durch Proteine verursacht werden und welche mit herkömmlichen
Detergenzien nicht gereinigt werden können. Protease ist ein bedeutender
Bestandteil geworden, der die Reinigungskraft verbessert.
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Als
Protease für
Detergenz gibt es viele, von Mikroorganismen stammende Enzyme, die
im alkalischen pH-Bereich aktiv sind, und Proteasen, wie z. B. Kazusase
(Showa Denko K. K.), Savinase (Novo), Maxacal (Gist), Alcalase (Novo)
und Biosam (Showa Denko, K. K.), wurden verwendet. Mit der Verbreitung
automatischer Geschirrspüler
wird ein Enzym erforderlich, das für automatische Geschirrspüler verwendbar
ist. Protease ist gegen Proteinflecke von Eigelb, Milchprodukten,
usw. auf Geschirr wirksam. Jedoch ist im Allgemeinen die Inaktivierung
von Enzymen in einer wässrigen
Lösung
bei hoher Temperatur beschleunigt. Daher ist ein Enzym erforderlich,
das einen Vorteil im Hinblick auf die Stabilität aufweist.
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Obwohl
Esperase (Novo) usw. derzeit für
diesen Zweck verwendet wurden, weisen diese Enzyme nicht gänzlich zufrieden
stellende Aktivität
und Stabilität
auf. Die Protease, die derzeit als die stabilste in oberflächenaktiven
Mitteln bekannt ist, ist eine Protease, die von dem Bacillus-Stamm
SD 521 (Patentanmeldungsnummer 191781 von 1991) hergestellt wird.
Jedoch ist eine noch stabilere Protease erwünscht.
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Deshalb
ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine alkalische Protease,
die in Gegenwart eines oberflächenaktiven
Mittels stabiler ist, ein Herstellungsverfahren der alkalischen
Protease, die Verwendung der Protease für die Zusammensetzung eines
Detergenz usw. und einen die Protease herstellenden Mikroorganismus
bereit zu stellen.
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BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Als
Ergebnis unserer diesbezüglichen
Untersuchung haben wir herausgefunden, dass die von Bacillus sp.
SD 114 – ein
Bacillus-Stamm – hergestellte
Protease API-26 hervorragende Stabilität aufweist und als Detergenz
geeignet ist, und wir stellten die vorliegende Erfindung fertig.
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Folglich
stellt die vorliegende Erfindung eine neue alkalische Protease deren
Herstellungsverfahren, deren Verwendung und einen die Protease herstellenden
Mikroorganismus bereit.
- 1) Alkalische Protease,
die mindestens einer der Bedingungen genügt, die im folgenden (a) bis
(c) spezifiziert sind:
- (a) Restaktivität
von mehr als 60% nach 30 Minuten bei 40°C in einer Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels (50 mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer,
pH 10, 0,1 mM EDTA und 500 ppm LAS)
- (b) Restaktivität
von mehr als 40% nach 15 Minuten bei 55°C in einer Pufferlösung (50
mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer, pH 10, und 0,1 mM EDTA)
- (c) Restaktivität
von mehr als 20% nach 15 Minuten bei 55°C in einer Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels (50 mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer,
pH 10, 0,1 mM EDTA und 500 ppm LAS)
- 2) Alkalische Protease, die im vorstehenden Punkt 1) spezifiziert
ist, mit den folgenden Eigenschaften:
- (1) Aktivität
Die
Protease hydrolysiert Proteine und Peptide.
- (2) Optimaler pH-Wert
Der optimale pH-Wert beträgt etwa
12, wenn die Protease 10 Minuten lang bei 30°C mit Casein als Substrat umgesetzt
wird.
- (3) Stabiler pH-Bereich
Die Protease ist in dem pH-Bereich
von 5 bis 11 stabil, wenn sie 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert
wird.
- (4) Optimale Temperatur
Die optimale Temperatur ist ungefähr 60°C, wenn die
Protease 10 Minuten lang bei pH 10 mit Casein als Substrat umgesetzt
wird.
- (5) Molekulargewicht
Das Molekulargewicht beträgt gemäß SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
29.000 ± 2.000.
- (6) Isoelektrischer Punkt
Der isoelektrische Punkt beträgt gemäß isoelektrisch
fokussierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese 10,1 ± 0,5.
- 3) Alkalische Protease, die in dem vorstehenden Punkt 1) oder
2) spezifiziert ist und die durch zu Bacillus gehörende Mikroorganismen
hergestellt wird
- 4) Alkalische Protease, die in dem vorstehenden Punkt 3) spezifiziert
ist und die durch einen zu Bacillus gehörenden Mikroorganismus, der
Bacillus sp. SD 114 (FERM BP-5736) ist, hergestellt wird
- 5) Alkalische Protease, die immunologische Kreuzreaktivität mit einer
Protease aufweist, die in dem vorstehenden Punkt 4) spezifiziert
ist und mindestens einer der Bedingungen genügt, die im folgenden (a) bis
(c) spezifiziert sind:
- (a) Restaktivität
von mehr als 60% nach 30 Minuten bei 40°C in einer Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels (50 mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer,
pH 10, 0,1 mM EDTA und 500 ppm LAS)
- (b) Restaktivität
von mehr als 40% nach 15 Minuten bei 55°C in einer Pufferlösung (50
mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer, pH 10, und 0,1 mM EDTA)
- (c) Restaktivität
von mehr als 20% nach 15 Minuten bei 55°C in einer Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels (50 mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer,
pH 10, 0,1 mM EDTA und 500 ppm LAS)
- 6) Herstellungsverfahren der alkalischen Protease, das durch
Gewinnung der Protease von einer Kultur gekennzeichnet ist, in der
ein zu Bacillus gehörender
Mikroorganismus oder dessen Variante eine Protease herstellt, die
in den vorstehenden Punkten 1) bis 5) spezifiziert ist
- 7) Herstellungsverfahren der alkalischen Protease, die in dem
vorstehenden Punkt 6) spezifiziert ist und durch einen zu Bacillus
gehörenden
Mikroorganismus, der Bacillus sp. SD 114 (FERM BP-5736) ist, hergestellt
wird
- 8) Bacillus sp. SD 114 (FERM BP-5736) und dessen Mutanten
- 9) Inhaltsstoffe des Detergenz, in dem die Protease enthalten
ist, die in den vorstehenden Punkten 1) bis 5) spezifiziert ist
- 10) Detergenzien, in denen die Protease enthalten ist, die in
den vorstehenden Punkten 1) bis 5) spezifiziert ist
- 11) Detergenzien für
automatische Geschirrspüler,
in denen die Protease enthalten ist, die in den vorstehenden Punkten
1) bis 5) spezifiziert ist
- 12) Herstellungsverfahren von Peptiden oder Aminosäuren, das
durch die Umsetzung einer Protease, die in jedem der vorstehenden
Punkten 1) bis 5) spezifiziert ist, mit Protein oder Peptiden gekennzeichnet
ist
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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[1]
Diagramm, das den optimalen pH-Bereich für das erfindungsgemäße Enzym
darstellt.
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[2]
Diagramm, das den stabilen pH-Bereich für das erfindungsgemäße Enzym
darstellt.
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[3]
Diagramm, das den optimalen Temperaturbereich für das erfindungsgemäße Enzym
darstellt.
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[4]
Diagramm, das die Stabilität
des erfindungsgemäßen Enzyms
und bekannter Enzyme bei 55°C
darstellt.
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[5]
Diagramm, das die Stabilität
des erfindungsgemäßen Enzyms
und bekannter Enzyme in einem Detergenz auf dem Markt, Ultra Ariel,
bei 55°C
darstellt.
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[6]
Diagramm, das die Stabilität
des erfindungsgemäßen Enzyms
und bekannter Enzyme in einem Detergenz auf dem Markt, Super Cheer,
bei 55°C
darstellt.
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[7]
Diagramm, das die Stabilität
des erfindungsgemäßen Enzyms
und bekannter Enzyme in einem Detergenz auf dem Markt, Tide Grease
Releasing, bei 40°C
darstellt.
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DETAILLIERTE
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Enzym-herstellender
Mikroorganismus
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Der
Stamm SD 114 von Bacillus sp., der einer der Mikroorganismen ist,
der das erfindungsgemäße Enzym
herstellt, ist ein Stamm, der mit Bacillus firmus bakteriologisch
eng verwandt ist. Da er jedoch in einigen Eigenschaften offensichtlich
von anderen bekannten Stämmen
verschieden ist, wurde er als ein neuer Stamm anerkannt.
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Bakteriologische Eigenschaften
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Der
Stamm SD 114 von Bacillus sp. weist in Bezug auf diese Erfindung
folgende bakteriologische Eigenschaften auf:
- (a)
Form: Bacilli
- (b) Gram-Färbung:
positiv
- (c) Sporogenese: positiv
- (d) Form der Sporen: Ellipse
- (e) Beweglichkeit: positiv
- (f) Verhalten gegen Sauerstoff: aerob
- (g) Katalase-Herstellung: positiv
- (h) Wachstum unter anaeroben Bedingungen: negativ
- (i) Voges-Proskauer (VP)-Reaktion: negativ
- (j) pH-Wert der VP-Kulturbrühe:
6,2
- (k) Säureherstellung:
Glucose: negativ
Arabinose: negativ
Xylose: negativ
Mannit:
negativ
- (l) Aerogenese (Gasbildung) aus Glucose: negativ
- (m) Gelatine-Verflüssigung:
positiv
- (n) Stärkeabbau:
positiv
- (o) Citrat-Verwertung: negativ
- (p) Propionat-Verwertung: negativ
- (q) Phenylalanin-Desaminierung: negativ
- (r) Eigelb-Reaktion: negativ
- (s) Nitrat-Reduktion: negativ
- (t) Wachstum bei pH 6,8: positiv
- (u) Wachstum bei pH 5,7: positiv
- (v) Wachstum in 5% Natriumchlorid: positiv
- (w) Wachstum in 7% Natriumchlorid: positiv
- (x) Wachstum bei 10°C:
positiv
- (y) Wachstum bei 30°C:
positiv
- (z) Wachstum bei 55°C:
positiv
- (aa) GC-Gehalt der mikrobiellen DNA (mol-%): 45%
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In
Bezug auf Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 2, William & Wilkins, 1986,
waren die systematischen Eigenschaften dieses Bakteriums, das bakteriologische
Eigenschaften aufweist, die im Vorstehenden spezifiziert sind verglichen
mit anderen Stämmen,
folgendermaßen:
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Der
Stamm SD 114 von Bacillus sp. zeigte in Bezug auf diese Erindung
nicht dieselben spezifischen Eigenschaften wie diejenigen von Bacillus
firmus bezüglich
Säureherstellung
aus Zucker und Wachstum bei 50°C.
Der bekannte Stamm SD 521 stellt jedoch Säure aus Glucose her, desoxidiert
Nitrate, wächst
nicht bei pH 6,8 und wächst
nicht bei 50°C.
NCIB 10309 stellt Säure
aus Glucose, Arabinose und Mannit her. PB 92 stellt Säure aus
Glucose und Xylose her und kann Propionate verwerten. Es ist aus
den vorstehenden bakteriologischen Eigenschaften offensichtlich,
dass der Stamm SD 114 ein mesophiles Bakterium und Bacillus sp. eng
verwandt zu Bacillus firmus ist, aber er ist von anderen bekannten
Stäm men
verschieden. Somit wurde dieser Stamm als ein neuer Stamm anerkannt.
Er wurde am 2. Okt. 1995 als FERM P-15214 am National Institute
of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science
and Technology (Sitz: 1–3,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt und
zur internationalen Hinterlegung gemäß dem Budapest-Vertrag am 30.
Okt. 1996 als Stamm SD 114 (FERM BP-5736) übergeben.
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Zusätzlich können in
der Protease-Produktivität
verbesserte, durch den Stamm zu bekommende Mutanten, die durch spontane
oder induzierte Mutation des Stammes SD 114 erhalten werden, als
ein die erfindungsgemäße Protease
herstellendes Bakterium verwendet werden. Um diese Mutanten herzustellen,
können herkömmliche
Verfahren verwendet werden; zum Beispiel nach Induzieren einer künstlichen
Mutation des ursprünglichen
Stammes durch Ultraviolett-Bestrahlung oder Mutagene, wie z. B.
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(NTG), wird die Kultur in ein Agarmedium übergeimpft, das Magermilch,
usw. enthält.
Eine Mutante mit hervorragender Produktivität wird aus den Kolonien mit
einer größeren klaren,
um die Kolonien herum gebildeten Zone ausgewählt. Darüber hinaus kann die Produktivität durch
Verwenden eines Gen-Amplifikations-Phänomens in den geeigneten Wirtszellen
verbessert werden, die mit einem Gen der erfindungsgemäßen Protease
transformiert wurden, welches mit einer geeigneten selbstreplizierbaren
DNA gekoppelt ist.
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Herstellungsverfahren
der Protease
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Jedes
Medium, in dem Mikroorganismen heranwachsen, die die erfindungsgemäße Protease
herstellen, und die Protease hergestellt wird, kann verwendet werden,
um die erfindungsgemäße Protease
herzustellen.
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Zum
Beispiel sind Glucose, Maltose, Saccharose, lösliche Stärke, usw. als Kohlenstoffquelle
verwendbar, und organische Stickstoffverbindungen, wie z. B. Sojabohnenkuchen,
Kleiekuchen und Mais-Laugenwasser, sind als Stickstoffquelle verwendbar.
Außerdem
werden Mineralien, wie z. B. Phosphat, Kaliumsalz und Magnesiumsalz
zugesetzt. In dieser Erfindung wird die Kultur unter aeroben Bedingungen
inkubiert, zum Beispiel kann eine Belüftungskultur oder Schüttelkultur
verwendet werden. Als Inkubationstemperatur ist 30 bis 37°C wünschenswert,
obwohl eine Temperatur zwischen 20 bis 40°C stabil ist. Es ist wünschenswert,
dass der anfängliche
pH-Wert 9 bis 10 und der pH-Wert während der Inkubation 8,5 bis
10 beträgt.
Die Inkubationsdauer beträgt
16 bis 60 Stunden, und es ist wünschenswert,
die Inkubation zu beenden, wenn das Maximum an Proteaseaktivität erreicht
ist. Die Reinigung der durch das Vorstehende erhaltenen Kultur kann
nach herkömmlichen
Verfahren zur Isolierung und Reinigung durchgeführt werden. Die erfindungsgemäße Protease
wird durch Aussalen zur Ausfällung
des Proteins, Lösungsmittelfraktionierungsverfahren,
Sprühtrocknungsverfahren,
Lyophilisierung, usw. erhalten, indem lösliche Salze oder hydrophile
organische Lösungsmittel
zum Überstand
oder Filtrat zugesetzt werden, der/das durch Zentrifugieren oder
Filtration zur Entfernung von Körperzellen
und festen Rückständen des
Mediums erhalten wurde. Darüber
hinaus kann die Protease durch Kombination anderer Reinigungsverfahren,
wie z. B. Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationschromatographie
weiter gereinigt werden. Wir bezeichneten die erfindungsgemäße Protease,
die auf der vorstehenden Weise erhalten wurde, als API-26. Die Aktivität von API-26
wird nach dem folgenden Verfahren getestet.
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Test der Enzymaktivität
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50 μl der angemessen
verdünnten
Enzymlösung
werden zu 500 μl
50 mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer, pH
10, gegeben, und es wird für
eine Dauer von 3 bis 5 Minuten bei 30°C vorinkubiert. Dieser Lösung werden 500 μl 2% Hammarsten*s
Casein-Lösung,
pH 10, zugesetzt, und die Reaktion wird nach 10 Minuten durch Zugabe
von 2 ml Trichloressigsäure
(TCA)-Lösung
(0,032 M TCA-Lösung,
mit Acetat-Puffer auf pH 4 eingestellt) gestoppt. Dies wird bei
30°C für eine Dauer
von mehr als 10 Minuten stehen gelassen und mit Papierfilter Nr. 2
(Toyo Roshi) filtriert. Zu 1 ml des Filtrats werden 5 ml 0,4 M Natriumcarbonat
und 1 ml 6fach mit Wasser verdünntes
Phenol-Reagenz gegeben. Dies wird zur Färbung für eine Dauer von 20 Minuten
bei 30°C
stehen gelassen, wonach die Absorption bei 660 nm gemessen wird.
Die Einheit der Proteaseaktivität
wird durch das Katal beschrieben. Ein Katal ist definiert als die
Aktivität,
mit welcher die Protease, die mit Casein als Substrat bei pH 10
und bei 30°C
reagiert, ein Abbauprodukt mit der Absorption bei 660 nm herstellt,
das zu einem mol Tyrosin äquivalent
ist.
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Eigenschaften
der Protease
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Die
physikalischen und chemischen Eigenschaften der durch die Erfindung
erhaltenen Protease sind folgendermaßen:
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(1) Wirkung und Substratspezifität
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Die
Protease baut Proteine oder Peptide, wie z. B. Casein, Hämoglobin,
Albumin, Fleischprotein, Fischprotein und Sojabohnenprotein ab.
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(2) Optimaler pH-Wert
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Bestimmung des optimalen
pH-Wertes
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Der
Britton-Robinson-Breitbandpuffer wurde als Pufferlösung verwendet.
Um den optimalen pH-Wert zu bestimmen, wurden etwa 20 nKatal des
Enzyms/ml zu jedem, 1% Casein enthaltenden pH-Puffer gegeben. Nach
Inkubieren bei 30°C
für eine
Dauer von 10 Minuten wurde die Enzymaktivität bestimmt. Wie in Tabelle
1 und 1 gezeigt, stellen diese die Enzymaktivität dar, wobei
die Aktivität
bei pH 11,7 als 100 betrachtet wird. Aufgrund dieser Ergebnisse
beträgt
der optimale pH-Wert für
dieses Enzym etwa 12.
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(3) Stabiler pH-Bereich
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Bestimmung des stabilen
pH-Bereiches
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Das
Enzym wurde zu etwa 20 nKatal/ml zu einzelnen pH-Pufferlösungen gegeben,
und nach Inkubieren bei 30°C über 24 Stunden
wurde die Aktivität
bestimmt. Tabelle 2 und 2 stellen die Restaktivität dar, wobei
die Aktivität
vor der Inkubation als 100 betrachtet wird. Aufgrund dieser Ergebnisse
liegt der stabile pH-Bereich des Enzyms bei etwa 5 bis 11 bei 30°C.
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(4) Optimale Temperatur
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Bestimmung der optimalen
Temperatur
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Nachdem
25 mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer, pH 10, der 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielt,
bei jeder Temperatur vorinkubiert wurde, wurde das Enzym zugesetzt
und für
eine Dauer von 10 Minuten bei jeder Temperatur umgesetzt. Nachdem
die Lösung
24 Stunden bei 30°C
inkubiert wurde, wurde die Enzymaktivität bestimmt. Tabelle 2 und 2 stellen
die relative Aktivität
dar, wobei die Aktivität
bei 60°C
als 100 betrachtet wird. Aufgrund dieser Ergebnisse liegt die optimale
Temperatur für
dieses Enzym bei etwa 60°C.
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(5) Wirkung von Inhibitoren
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Die
Wirkungen verschiedener Inhibitoren auf das Enzym wurden gemäß der folgenden
Bedingungen und Methode untersucht:
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Es
wurde eine Lösung
hergestellt, die dieses Enzym zu etwa 20 nKatal/ml in 50 mM Borat-Puffer,
pH 10, enthielt. Zu dieser Lösung
wurde EDTA, p-Mercuribenzoesäure
(PCMV) oder Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) in einer Konzentration
zugesetzt, die in Tabelle 4 gezeigt ist. Nach Inkubieren bei 30°C über 30 Minuten
wurde die Enzymaktivität
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt, wobei die relative
Aktivität des
Enzyms ohne Inhibitor als 100% betrachtet wird. Wie in Tabelle 4
gezeigt wird dieses Enzym am intensivsten durch PMSF inhibiert,
und folglich ist dieses Enzym eine Serin-Protease.
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(6) Molekulargewicht
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Das
Molekulargewicht dieses Enzyms wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
auf 29.000 ± 2.000
bestimmt.
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(7) Isoelektrischer Punkt
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Der
isoelektrische Punkt beträgt
nach isoelektrisch fokussierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese 10,1 ± 0,5.
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(8) Stabilität
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Dieses
Enzym genügt
mindestens einer der folgenden Bedingungen:
- (a)
Restaktivität
von mehr als 60% nach 30 Minuten bei 40°C in einer Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels (50 mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer,
pH 10, 0,1 mM EDTA und 500 ppm lineares Alkylbenzol-Natriumsulfonat
(LAS))
- (b) Restaktivität
von mehr als 40% nach 15 Minuten bei 55°C in einer Pufferlösung (50
mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer, pH 10, und 0,1 mM EDTA)
- (c) Restaktivität
von mehr als 20% nach 15 Minuten bei 55°C in einer Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels (50 mM Atkins-Pantin-Borat-Puffer,
pH 10, 0,1 mM EDTA und 500 ppm LAS)
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Kreuzreaktivität mit API-26-Antikörper
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Die
erfindungsgemäße Protease
zeigt vorzugsweise Kreuzreaktion mit dem API-26-Antikörper unter den folgenden Bedingungen
für die
Bestimmung.
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Bedingung für die Bestimmung
der Kreuzreaktion
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Das
Antigen API-26 wird mit 2 mg/ml angesetzt, und es wird mit der äquivalenten
Menge Freund'schem
komplettem Adjuvans gemischt, um eine vollständige Wasser-in-Öl-Emulsion
herzustellen. 1 ml dieser Emulsion wird zwei weiblichen Kaninchen
am Tag 0, Tag 21, Tag 42 und Tag 63 verabreicht. Ausblutung mit
Sammlung des ganzen Blutes wird am Tag 70 durchgeführt, und
eine den Antikörper
enthaltende Serumprobe wird hergestellt.
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Die
Kreuzreaktion wird mit der Ouchterlony-Methode (Acta. Med. Scan.
133: 76–79,
1950) festgestellt, d. h.: die zentrale Vertiefung wird mit 10 μl API-26
oder anderen Proteasen in einer Konzentration von 1 mg/ml befüllt, und
die umliegenden Vertiefungen werden mit 10 μl Antiserum befüllt, das
im Verhältnis
zur n-ten Potenz von 2 (n = 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7) verdünnt wurde.
Die Platte wird in eine feuchte Kammer gestellt und über Nacht
bei 37°C
inkubiert bis Präzipitin-Linien
sichtbar sind. Wenn eine Präzipitin-Linie
bei einer 4fachen oder höheren
Konzen tration der minimalen Konzentration gebildet wird, bei der
die Präzipitin-Linie
für API-26
gebildet wird, wird gefolgert, dass das Enzym eine Kreuzreaktivität mit API-26-Antikörper aufweist.
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Anwendung
der Protease
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Peptide
oder Aminosäuren
können
durch Behandeln von Proteinen oder Peptiden mit der erfindungsgemäßen Protease
hergestellt werden. Die Protease kann zum Verarbeiten von Zielsubstanzen
verwendet werden, indem Proteine oder Peptide enthaltende Zielsubstanzen
mit der Protease behandelt werden. In den herkömmlich verwendeten Verfahren
kann die erfindungsgemäße Protease
mit herkömmlichen
Proteasen platziert werden. Selbst unter einer harten Bedingung,
bei der herkömmliche
Enzyme inaktiviert werden, kann die erfindungsgemäße Protease
verwendet werden, bis diese Protease inaktiviert wird. Zum Beispiel
ist diese Protease in Gegenwart von LAS nicht nur im Bereich von
50 ppm bis 500 ppm, sondern auch bei mehr als 500 ppm verwendbar.
Jedoch ist es bevorzugt, diese Protease bei nicht mehr als 3.000
ppm zu verwenden und stärker
bevorzugt, sie bei nicht mehr als 300 ppm zu verwenden. Diese Protease
ist bei einer hohen Temperatur von mehr als 48°C verwendbar. Jedoch ist es
bevorzugt, diese Protease bei weniger als 75°C zu verwenden und stärker bevorzugt,
sie bei weniger als 70°C
zu verwenden.
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Anwendung
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Die
erfindungsgemäße alkalische
Protease ist hochstabiler in verschiedenen Detergenzlösungen oder oberflächenaktiven
Mitteln auf dem Markt als herkömmliche
alkalische Proteasen. Da diese Protease auch gegen Hitze stabil
ist und sie tatsächlich
Proteinflecken in warmem Wasser abbaut, das für das Waschen von Wäsche oder
Geschirr verwendet wird, ist es möglich, die Reinigungskraft
durch Mischen dieser Protease in Detergenzien zu erhöhen.
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Außerdem kann
diese Protease zur Futterverarbeitung, Nahrungsmittelverarbeitung
(Fischölverarbeitung,
Fleischverarbeitung, usw.), Faserverarbeitung, Wollverarbeitung,
Lederverarbeitung, Waschen von Kontaktlinsen, Waschen von Rohrleitungen
verwendet werden. Zusätzlich
kann die Protease mit Bademitteln und Enthaarungsmitteln gemischt
werden.
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Detergenz-Zusammensetzungen
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Diese
Erfindung stellt Detergenz-Zusammensetzungen, die mit einer alkalischen
Protease mit den vorstehend spezifizierten Eigenschaften gemischt
sind, bereit. Obwohl die Menge der alkalischen Protease, die mit
den erfindungsgemäßen Detergenz-Zusammensetzungen
gemischt ist, nicht begrenzt ist, ist es angemessen, eine Menge
zu mischen, die 10 bis 1000 nKatal pro Liter der Detergenzlösung äquivalent
ist. Wenn die Beladungsmenge zu klein ist, wird die Reinigungskraft
nicht zufrieden stellend verbessert. Im Gegenteil, wenn die Beladungsmenge
zu groß ist,
wird die Reinigungskraft nicht wie durch die Beladungsmenge erwartet
verbessert, und es ist vom wirtschaftlichen Standpunkt aus nicht
wünschenswert.
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Die
alkalische Protease der vorliegenden Erfindung kann mit bekannten
Detergenz-Zusammensetzungen ohne jegliche Änderung der Zusammensetzung
gemischt werden. Spezielle Inhaltsstoffe sind für die erfindungsgemäße Detergenz-Zusammensetzung nicht
erforderlich. Ein typisches Beispiel solcher Detergenz-Zusammensetzungen
ist: Detergenz-Zusammensetzungen mit einer oder mehr Arten der Zusammensetzung
bestehen zu 10 bis 50 Gewichtsprozent aus einem oberflächenaktiven
Mittel, zu 0 bis 50 Gewichtsprozent aus einem Gerüststoff,
zu 1 bis 50 Gewichtsprozent aus einem alkalischen Mittel oder Mineralien)
und zu 0,1 bis 5 Gewichtsprozent aus einem Mittel gegen Wiederablagerung,
dem Enzym, einem Bleichmittel, einem fluoreszierenden Farbstoff,
einem Mittel gegen Anbacken und einem Antioxidationsmittel, basierend
auf dem Gewicht der Detergenz-Zusammensetzung.
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Die
folgenden oberflächenaktiven
Mittel, die üblicherweise
in Detergenz-Zusammensetzungen
enthalten sind, können
verwendet werden: Seifen, lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenylsulfate,
Amidosulfate, aliphatische sulfatierte Verbindungen, wie z. B. Alkyl-
oder Alkenylethersulfate mit einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe
oder Alkenylgruppe, wobei eine oder mehrere aus Ethylenoxid, Propylenoxid
und Butylenoxid hinzugefügt
ist/sind, Alkylsulfonate, Amidosulfonate, Dialkylsulfosuccinat,
aliphatische Sulfonate, wie z. B. Sulfonate von α-Olefin, Vinylidenolefin und
internes Olefin, aromatische Sulfonate, wie z. B. lineare oder verzweigte
Alkylbenzolsulfonate, Alkyl- oder Alkenylethercarboxylate oder Carbonsäureamide
mit einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe oder Alkenylgruppe,
wobei einer oder mehrere aus Ethylenoxid, Propylenoxid und Butylenoxid
hinzugefügt
ist/sind, α-Sulfono-Fettsäuren oder
Ester, oberflächenaktive
Mittel vom Aminosäure-Typ,
Alkyl- oder Alkenylphosphatester, oberflächenaktive Phosphatester, wie
z. B. Alkyl- oder Alkenylsäure-Phosphate,
ampholytische oberflächenaktive
Mittel vom Sulfonsäure-Typ,
ampholytische oberflächenaktive
Mittel vom Betain-Typ, Alkyl- oder Alkenylether oder Alkohole mit
einer linearen oder verzweigten Alkylgruppe, wobei einer oder mehrere
aus Ethylenoxid, Propylenoxid und Butylenoxid hinzugefügt ist/sind,
Polyoxyethylenalkylphenylether mit einer linearen oder verzweigten
Alkylgruppe, wobei einer oder mehrere aus Ethylenoxid, Propylenoxid
und Butylenoxid hinzugefügt
ist/sind, höhere
Fettsäure-Alkanolamide
und ihre Alkylenoxid-Additionsverbindungen,
Saccharose-Fettsäureester,
Fettsäure-Monoester
von Glyerin, Alkyl- oder Alkenylaminoxide, kationische oberflächenaktive
Mittel vom Tetraalkylammoniumsalz-Typ, usw. Ein Gegenion von anionischen
oberflächenaktiven
Mitteln ist vorzugsweise ein Natrium-Ion oder Kalium-Ion. Ein Gemisch von
ein oder mehreren dieser oberflächenaktiven
Mittel ist in Detergenzien enthalten.
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Die
folgenden anorganischen Verbindungen können als Gerüststoffe
und alkalisierende Substanzen oder anorganische Elektrolyte verwendet
werden. Als alkalische Metallsalze: Phosphate, wie z. B. Orthophosphat,
Pyrophosphat, Tripoly phosphat, Metaphosphat, Hexametaphosphat, Phytate,
usw.; Phosphonsäuresalze,
wie z. B. Ethan-1,1-diphosphonsäure,
Ethan-1,1,2-triphosphonsäure,
Ethan-1-hydroxy-1,1-diphosphonsäure und
ihre Derivate, Ethanhydroxy-1,1,2,-triphosphonsäure, Ethan-1,2-dicarboxy-1,2-diphosphonsäure, Methanhydroxyphosphonsäure, usw.,
Phosphoncarboxylate, wie z. B. 2-Phosphonbutan-1,2-dicarbonsäure, 1-Phosphonbutan-2,3,4-tridicarbonsäure, α-Methylphosphonbernsteinsäure, usw.,
Aminosäuresalze,
wie z. B. Asparaginsäure,
Glutaminsäure,
usw., Aminopolyacetate, wie z. B. Nitrilotriessigsäure, Ethylendiamintetraacetat,
Diethylentriaminpentaacetat, usw., hochmolekulare Elektrolyte, wie
z. B. Polyacrylsäure,
Polyitaconsäure, Polymaleinsäure, wasserfreies
Maleinsäure-Copolymer,
Carboxymethyl-Zellulosesalz, usw., nicht dissoziierte Polymere,
wie z. B. Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, usw., Carboxymethyl-Verbindungen, wie
z. B. Diglykolsäure,
Oxydiglykolsäure,
Carboxymethyloxybernsteinsäure,
Zitronensäure,
Milchsäure,
Weinsäure,
Saccharose, Lactose, usw., Salze organischer Säuren, wie z. B. Carboxymethyl-Verbindungen
von Pentaerythritol, Carboxymethyl-Verbindungen von Gluconsäure, Benzolpolycarbonsäure, Oxalsäure, Äpfelsäure, Oxydibernsteinsäure, Gluconsäure, usw.,
Aluminiumsilikate, wie z. B. Zeolith, usw., anorganische Salze,
wie z. B. Carbonat, Sesquicarbonat, Sulfat, Bisilikat, usw., wie
alkalische Metallsalze, Stärke,
Harnstoff, usw., wie organische Verbindungen; Natriumchlorid, Bentonit,
usw., wie anorganische Verbindungen; und Triethanolamin, Diethanolamin,
Monoethanolamin, Triisopropanolamin, usw. wie organische alkalisierende
Substanzen.
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Wie
vorstehend beschrieben enthalten erfindungsgemäße Detergenz-Zusammensetzungen
(ein) oberflächenaktives)
Mittel, die erfindungsgemäße alkalische
Protease und alkalisierende Substanzen oder anorganische Elektrolyte
als wesentliche Inhaltsstoffe. Außerdem können nach Bedarf ampholytische
oberflächenaktive
Mittel, Bleichmittel, wie z. B. Natriumpercarbonat, Natriumperborat,
usw., Bleichaktivatoren, Farbstoffe, Gerüststoffe, Mittel gegen Wiederablagerungen,
wie z. B. Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon,
Carboxymethyl-Zellulose, usw., Mittel gegen Anbacken, Antioxidationsmittel,
Kor rosionsschutzmittel, fluoreszierende Aufheller, Schaumverstärker, andere
Enzyme, wie z. B. Lipase, usw. einbezogen werden.
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Jedes
Verfahren kann verwendet werden, um das Enzym mit der erfindungsgemäßen Detergenz-Zusammensetzung
zu mischen. Jedoch ist es nicht bevorzugt, feines Pulver des Enzyms
wegen Sicherheits- und Gesundheitsrisiken des Detergenzanwenders
oder der Arbeiter in der Detergenzindustrie aufgrund des Staubes,
der während
des Hantierens mit dem Detergenz aufsteigt, zu mischen. Deshalb
wird das Enzym vorzugsweise in einer flüssigen oder staubfreien Form
formuliert. Die Form des Enzyms kann durch beliebige herkömmliche
Verfahren, wie z. B. Trommelgranulierung, Extrudergranulierung,
Wirbelschichtgranulierung und Zentrifugal-Wirbelschicht-Granulierung
hergestellt werden. Die Formen des Enzyms, das mit der erfindungsgemäßen Detergenz-Zusammensetzung
gemischt ist, sind nicht auf diejenigen, die nach diesen Verfahren
hergestellt sind, beschränkt.
Da die erfindungsgemäße alkalische
Protease hochstabil ist, kann das Formulieren dieses Enzyms bei
höherer
Temperatur als der bei üblichen
Verfahren zur Herstellung durchgeführt werden, zum Beispiel bei
mehr als 50°C.
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Erläuterungen
der erfindungsgemäßen Detergenz-Zusammensetzungen
schließen
Detergenzien, die die erfindungsgemäße alkalische Protease enthalten,
und Detergenzien für
automatische Geschirrspüler,
usw. ein.
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BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE
DER ERFINDUNG
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Folgendes
sind Beispiele, um die Erfindung zu veranschaulichen, jedoch ist
die Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
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Es
wurden die in den Beispielen spezifizierten Detergenzien auf dem
Markt verwendet. Bevor sie verwendet wurden, wurden enzymfreie Detergenz
durch Entzug von Enzymkörnchen,
die in den Detergenzien enthalten sind, durch Sortieren, usw. hergestellt.
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Beispiel 1: Züchten des
Stamms SD 114 von Bacillus sp.
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Der
Stamm SD 114 wurde unter Schütteln
bei 35°C
für eine
Dauer von 66 Stunden in 300 ml, enthaltend 1% Casein, 1% Bouillon
und 1% Polypepton und mit Natriumcarbonat auf pH 7,5 eingestellt – inkubiert, und
dann wurde das Enzym hergestellt und in die Kultur sekretiert. Diese
Kultur wurde bei 1000 g und 4°C zentrifugiert,
um den Überstand
zu erhalten. Die Aktivität
des Enzyms im Überstand
betrug etwa 50 nKatal/ml.
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Beispiel 2: Reinigung
des Enzyms API-26
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Der Überstand
der Kultur, der in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde mit einer Bakterienausschlussmembran
filtriert und dann mit einer Ultrafiltermembran konzentriert. Diese
konzentrierte Lösung
wurde mit 30 bis 60% gesättigtem
Ammoniumsulfat ausgesalzt. Der erhaltene Niederschlag wurde in 25
mM Tris-Salzsäure-Puffer, pH 7,5, der
1 mM CaCl2 enthielt, aufgelöst und mit
dem Puffer dialysiert. Dann wurde diese Lösung in einer Säule des
Typs CM-Cellulofine C-500-Säule
(Seikagaku Corp.) bei pH 7,5 absorbiert, und das Enzym wurde mit
der Konzentrationsgradientenmethode mit 0 bis 1 M KCl, das 1 mM
CaCl2 enthielt, eluiert. Eine Fraktion des
Enzyms, in der die spezifische Aktivität eine etwa 8fache Zunahme,
verglichen mit der vor der Ionenaustausch-Chromatographie zeigte.
Das Enzym wurde als eine einzelne Bande durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
dieser Fraktion nachgewiesen.
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Beispiel 3: Temperaturstabilität
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Das
erfindungsgemäße Enzym
API-26, Subtilisin 10309 (ein Enzym, das durch den Stamm NCIP 10309
hergestellt wird), PB 92 (ein Enzym, das durch den Bacillus-Stamm
PB 92 hergestellt wird) und SD 521 (ein Enzym, das durch den Bacillus-Stamm
SD 521 hergestellt wird) wurden zu 50 mM Atkin-Pantin-Borat- Puffer, pH 10, der
0,1 mM EDTA enthielt, zugesetzt, um Lösungen mit der Aktivität von etwa
20 nKatal/ml herzustellen. Während
des Inkubierens der Lösungen
bei 55°C
wurden periodisch Proben gesammelt, und die Restaktivität wurde
bei 30°C
bestimmt. Tabelle 5 stellt die Restaktivität zu jedem Zeitpunkt dar, wobei
die Aktivität bei
einer Bedingung ohne Hitzebehandlung 100 ist. Subtilisin 10309,
PB 92 und SD 521 wurden gemäß der Verfahren
hergestellt, die in der Offenlegungsschrift Nr. 8401 von 1976, in
der provisorischen Anwendung Offenlegungsnr. 125407 von 1976 bzw.
in der provisorischen Anwendung Offenlegungsnr. 191781 von 1991
spezifiziert sind. Wie in Tabelle 5 und 4 gezeigt,
weist API-26 hervorragende Temperaturstabilität auf.
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Tabelle
5. Temperaturstabilität
(55°C)
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Beispiel 4: Stabilität gegen
oberflächenaktive
Mittel
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Wir
untersuchten die Stabilität
dieses Enzyms gegen oberflächenaktive
Mittel.
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Methode zur Bestimmung
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LAS
wurde in 50 mM Atkin-Pantin-Borat-Puffer, pH 10, der 0,1 mM EDTA
enthielt, aufgelöst,
um eine 500 ppm LAS-Lösung
herzustellen. Zu dieser Lösung
wurden Enzyme (API-26, Subtitlisin 10309, PB 92 und SD 521) gegeben,
um Lösungen
mit einer Aktivität
von etwa 20 nKatal/ml herzustellen, und die Lösungen wurden bei 40°C und 55°C inkubiert.
Die Restaktivität
wurde periodisch bei 30°C
bestimmt. Tabelle 6 (40°C)
und Tabelle 7 (55°C)
stellen die Restaktivität
zu jedem Zeitpunkt dar, wobei die Aktivität zum Zeitpunkt 0 100 beträgt. Wie
in diesen Tabellen gezeigt weist API-26 hervorragende Stabilität in oberflächenaktiven
Mitteln verglichen mit herkömmlichen
Enzymen auf.
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Tabelle
6. Stabilität
in Gegenwart eines oberflächenaktiven
Mittels (40°C)
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Tabelle
7. Stabilität
in Gegenwart eines oberflächenaktiven
Mittels (55°C)
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Beispiel 5: Stabilität des Enzyms
API-26 in Detergenzlösungen
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Wir
untersuchten die erfindungsgemäße Stabilität in Lösungen von
Ultra Ariel (P&G),
Super Cheer (P&G)
und Tide Grease Releasing (P&G),
welche Detergenzien auf dem Markt in Übereinstimmung mit den folgenden
Bedingungen und Methoden sind. Zu 50 mM Atkin-Pantin-Borat-Puffer,
pH 10, der 1000 ppm Ca2+ und 1000 ppm der
Detergenzlösungen
enthielt, wurden das Enzym API-26 und andere Enzyme, Subtilisin 10309,
PB 92 und SD 521 zugesetzt, um Lösungen
mit der Aktivität
von etwa 20 nKatal/ml herzustellen, und die Lösungen wurden bei 55°C oder 40°C inkubiert.
Die Restaktivität
wurde periodisch bei 30°C
bestimmt. Tabellen 8 bis 10 und 5 bis 7 legen
die Restaktivität
zu jedem Zeitpunkt dar, wobei die Aktivität zum Zeitpunkt 0 100 beträgt. Wie
in diesen Tabellen und Fi guren gezeigt weist API-26 verglichen mit
anderen Enzymen eine bemerkenswert hohe Stabilität in Detergenzien auf.
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Tabelle
8. Ultra Ariel (55°C)
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Tabelle
9. Super Cheer (55°C)
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Tabelle
10. Tide Grease Releasing (40°C)
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Beispiel 6: Test der Reinigungskraft
von Enzym API-26 enthaltenden Detergenzien
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Der Überstand
der Kultur, der in derselben Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurde,
wurde mit einer Bakterienausschlussmembran behandelt. Nachdem der Überstand
mit einer Ultrafiltermembran konzentriert wurde, wurde durch Sprüh trocknung
ein Rohenzym hergestellt. Das Rohenzym wurde zu Tide (P&G) – ein flüssiges Detergenz
auf dem Markt – zugesetzt,
und die Reinigungskraft wurde bestimmt. Das Rohenzym wurde zu Tide
in einer Konzentration von 100 nKatal/ml zugesetzt. Das Detergenz,
das das hergestellte Enzym enthielt, wurde für eine Dauer von 4 Wochen bei
40°C inkubiert.
Zwei Gramm des für
eine Dauer von 4 Wochen inkubierten Detergenz wurden zu 1 Liter
Wasser gegeben, das 40 ppm Calcium-Ion (Ca2+)
enthielt, um verschmutzte Wäsche
zu waschen, und die Helligkeit wurde gemessen, um die durch die
folgende Gleichung definierte Reinigungskraft zu bestimmen. Zehn
Stücke,
jedes von EMPA-116 in der Größe von 5
cm × 5
cm wurde als beschmutzte Wäsche
verwendet. Reinigungskraft (%) = (Helligkeit
der Wäsche
nach dem Waschen – Helligkeit
der verschmutzen Wäsche)/(Helligkeit
der unverschmutzen Wäsche – Helligkeit
der verschmutzten Wäsche) × 100
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Die
Reinigungskraft wurde auch mit SD 521 als Kontrolle getestet. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Aufgrund der Ergebnisse erhöht die Zugabe
von API-26 die Wirksamkeit
von Flüssigdetergenzien.
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Beispiel 7: Test der Reinigungskraft
von Detergenzien für
automatische Geschirrspüler
mit dem Enzym API-26
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Wir überprüften die
Reinigungskraft in einem automatischen Geschirrspüler, indem
das in Beispiel 6 spezifizierte Rohenzym verwendet wurde.
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Ein
das Enzym enthaltende Detergenz für automatische Geschirrspüler wurde
mit einem Detergenz auf dem Markt – Hi-wash S (NCC) – das Polyethylenalkylenether,
Natriumpercarbonat, Carbonat, Sulfat und Salz einer organischen
Säure enthielt,
hergestellt und mit dem API-26-Rohenzym im Gewichtsverhältnis von 20
: 1 gemischt. Dieses Detergenz wurde in einer Konzentration von
0,21% beim Waschen verwendet, und die Reinigungskraft wurde bestimmt.
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Waschbedingung
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Maschine:
Ein automatischer Geschirrspüler
NP-600, der durch Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. zusammengebaut
wurde, bei der eine Detergenzlösung
von einer rotierenden Düse
eingespritzt wird, und Geschirr gewaschen wurde, das in der Umlaufbahn
der eingespritzten Detergenzlösung
platziert war.
Waschtemperatur: stufenweise von 5°C bis 55°C erhöht
Wasser:
Härte 3,5°DH
Enzymkonzentration:
0,01%
Menge des zirkulierenden Wassers beim Waschen: 2,5 Liter
Verschmutztes
Geschirr: Zwei Porzellan-Geschirre mit einem Durchmesser von 25
cm wurden mit 1 g Eigelb beschmutzt und über Nacht luftgetrocknet.
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Bewertung
der Reinigungskraft
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Nach
dem Waschen wurde der Bereich (P1) einer
Purpurfarbe, die auf dem Geschirr durch Reaktion mit der Amid-Schnitz-Lösung hergestellt
wurde, mit Lichtbildern gemessen. Die Reinigungsrate wurde aus dem
gemessenen verschmutzten Bereich gemäß der folgenden Gleichung berechnet.
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Reinigungsrate
(%) = {(P0 – P1) × P0} × 100,
wobei P0 der Bereich des Geschirrs ist.
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Tabelle
12 zeigt die berechnete Reinigungsrate. Dieser Test wurde auch mit
SD 521 als Kontrolle durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass das Enzym API-26 enthaltende Detergenz eine starke
Reinigungswirkung aufweist, da die Reinigungsrate selbst für einen
hartnäckigen
Fleck, wie z. B. das in diesem Test verwendete Eigelb, 100% betrug.
Es wird erwogen, dass das Enzym stark dazu beiträgt, die Reinigungskraft in automatischen
Geschirrspülern
zu verbessern.
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MÖGLICHKEITEN DER INDUSTRIELLEN
VERWENDUNG
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Die
erfindungsgemäße alkalische
Protease ist in verschiedenen Detergenzien auf dem Markt oder oberflächenaktiven
Mitteln hochstabil und auch gegen Hitze stabil verglichen mit bestehenden
alkalischen Proteasen. Da dieses Enzym Proteinflecke auf Wäsche und
Geschirr wirksam abbaut, kann die Reinigungskraft durch Mischen
mit diesem Enzym erhöht
werden.
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Durch
Behandeln von Proteinen und Peptiden mit diesem Enzym ist ein wirtschaftliches
Verfahren zur Herstellung von anderen Peptiden und Aminosäuren möglich, weil
das Enzym stabil ist.
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Der
erfindungsgemäße Stamm
SD 114 von Bacillus sp. und seine Mutanten sind einfach zu handhabende
Mesophile, die für
die Herstellung einer erfindungsgemäßen alkalischen Protease brauchbar
sind.
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Eine
erfindungsgemäße alkalische
Protease kann wirksam durch das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren für Proteasen
hergestellt werden, wobei Mikroorganismen gezüchtet werden, die zu Bacillus oder
zu seinen Mutanten gehören.
