DE69632176T2

DE69632176T2 - Anti-inflammatorische Verbindungen

Info

Publication number: DE69632176T2
Application number: DE69632176T
Authority: DE
Inventors: Kazuko Handa; Mary Ellen K. Salyan; Mark R. Stroud; Sen-Itiroh Hakomori
Original assignee: Seikagaku Corp; Biomembrane Institute
Current assignee: Seikagaku Corp; Biomembrane Institute
Priority date: 1995-08-17
Filing date: 1996-08-14
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2016-08-15
Also published as: JP3795588B2; JPH09216902A; EP0765884A1; EP0765884B1; DE69632176D1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Verbindungen, welche Saccharidsequenzen besitzen, welche unter dynamischen Strömungsbedingungen die Replikation und die Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen bewirken. Die vorliegende Erfindung betrifft spezieller die Anwesenheit einer Gruppe von Monosialofucogangliosiden, welche die Replikation und die Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen bewirken. Die Erfindung basiert auf der Feststellung, daß neue Kohlehydratliganden (bezeichnet "Myelorollin"), exprimiert auf Leukocyten und leukämischen Zellen das E-Selectin-abhängige Replizieren und die Haftung an aktivierte Endothelzellen an Plätzen der Entzündung unter dynamischen Strömungsbedingungen vermitteln. Myelorollin ist eine Gruppe von unverzweigten Polyactosaminverbindungen, welche einen α2→3 Sialosylrest am Ende und α1→3 Fucosylreste an dem inneren GlcNAc jedoch nicht an dem vorletzten GlcNAc haben. Die Erfindung basiert ebenfalls auf der Feststellung, daß Mischungen von unterschiedlichen Myelorollinen einen Synergismus bei der Replikation und der Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen unter dynamischen Strömungsbedingungen zeigen. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck "Replikation", falls nichts anderes angegeben ist, das glatte Abrollen, das Abrollen gefolgt von Haftung und Haftung gefolgt von Abrollen und der Ausdruck "Haftung" bedeutet glatte Haftung ohne irgendeine begleitende Replikation.
2. Hintergrund der Erfindung
Seit 1989 führte das Klonen von vaskulären oder plättchenförmigen Haftproteinen, jetzt bezeichnet "Selectine", zu ausgeprägten Versuchen zur Identifizierung von Kohlehydratepitopen, welche auf Leukocyten exprimiert werden (Varki, A., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7390–7397; Lasky, L. A., 1995, Ann. Rev. Biochem. 64: 113–139) und daß sie als Ziele von Selectin abhängiger "Replikation" und Haftung von Leukocyten auf aktivierten Endothelzellen, gefolgt von transendotheler Migration, funktionieren. Dieser Mechanismus spiele eine zentrale Rolle beim Ansprechen auf Entzündungen (Lasky, L. A., 1995, Ann. Rev. Biochem. 64: 113–139). Solche Epitope spielen bei der Auswahl der Zellen zu Entzündungsplätzen im Anschluß an Infektion oder Verwundung eine Rolle. Derzeit wird allgemein angenommen, daß Sialosyl-Le^x (Sle^x) das Ziel-Epitop für die Bindung von E-Selectin ist, basierend auf den folgenden Begründungen: (i) menschliche Leukocyten, leukämische Leukocyten und leukämische Zelllinien (z. B. HL60- und U937-Zellen) exprimieren SL^x, jedoch nicht nicht-menschliche Leukocyten. Diese Behauptung basierte auf starken Reaktivitäten dieser Typen von Zellen mit mAbs, angenommen als gerichtet auf Sle^x (Ito et al., 1994, Glycoconj. J. 11: 232–237). Diese Sle^x exprimierenden Zellen haften an aktivierten Endothelzellen oder Plättchen, welche E- oder P-Selectin exprimieren (Phillips et al., 1990, Science 250: 1130–1132; Polley et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6224–6228). (ii) Ovary-Zellen vom chinesischen Hamster (CHO), welche die Sialosyl-Typ-2-kette exprimieren, haften nicht an E-Selectin, während Transfekte dieser Zellen mit Fucosyltransferase-III-cDNA an E-Selectin haften (Lowe et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 17467–17477). (iii) E-Selectin-abhängige Haftung von Sle^x-exprimierenden Zellen an aktiviertem Ecs wird durch Liposome, die SLe^xGSLs enthalten, oder durch Oligosaccharide mit terminaler Sle^x-Struktur gehemmt (Phillips et al., 1990, Science 250: 1130–1132; Polley et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6224–6228; Handa et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 181: 1223–1230).
Diese Beobachtungen haben die Akzeptanz der Annahme gefördert, daß SLe^x das Epitop ist, an welchem E-Selectin bindet. E- und P-Selectin binden ebenfalls an Sle^a, dem Stellungsisomeren von SLe^x (Handa et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 181: 1223–1230; Berg et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 14869–14872; Takada et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 713–719); jedoch fehlt Sle^a bei Leukocyten und wird nicht als ein physiologisches Epitop von Selectinen für hämatopoetische Zellen angesehen. Es gab keine systematische Charakterisierung von SLe^x enthaltenden Gangliosiden, die in Neutrophilen und HL60-Zellen vorliegen, noch irgendeine unzweideutige Demonstration, daß SLe^x das Hauptepitop ist, das in N-gebundenen oder O-gebundenen Glycoproteinnebenketten in normalen oder leukämischen Leukocyten oder in hiervon abstammenden Zelllinien vorliegt.
Es wird angegeben, daß ein IgG-Immunkomplexmodell der Ratte mit neutrophil-verbundenem und E-Selectin-abhängigen Lungenschaden SLe^x Schutzeffekte gegen vaskuläre Entzündungsschäden liefert (Mulligan et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 623–631).
Jedoch wird ebenfalls angegeben, daß aus den Ergebnissen von Immunofärbung durch Antikörper und von indirekten Bindungsversuchen an E- oder P-Selectin gebunden an Platte, von menschlichen Meutrophilen (polymorphonuklearen Leukocyten; PMN) nur menschliches PMN und promyelogene Leukämie-HL60-Zellen SLe^x und andere Epitope von Lactoserien, wie Le^x oder Le^y exprimierten, jedoch keine andere Säugetier PMN, wie PMN von Pavian, Makakken, Schwein, Kaninchen, Ratte, Meerschweinchen und Hamster (Ito et al., 1994, Glycoconj. J. 11: 232–237). Und daß die E-Selectinligandensaccharidsequenzen, erhalten aus Mäusenieren und Mäuseleukocyten, identifiziert sind als
(Osanai et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 218: 610–615).
Diese Veröffentlichungen zeigten, daß Liganden für Selectin von Säugetieren, die vom Menschen verschieden sind, nicht SLe^x sind. Und bislang bestätigte Ergebnisse von antiinterflammatorischen Effekten, erhalten durch Verwendung von tierischen Modellen, sind fraglich geworden.
Weiterhin wird angegeben, daß, falls Liposome, welche das Glycolipid enthalten
in vitro zu aktivierten Endothelzellen zugesetzt werden und hierzu HL60-Zellen zugegeben werden, Bindung von HL60-Zellen an aktivierte Endothelzellen selektiv blockiert ist (WO 91/19501 und WO 91/19502).
Weiterhin wird angegeben, daß aus Leukocyten von Patienten mit chronischer myelogener Leukämie extrahierte Glycolipide entweder an Polyvinylchlorid-Mikrotiterlochplatten oder aufgelöst auf TLC-Platten sich durch Binden an COS-Zellen aussonderten, exprimierend endotheles Leukocyten-Haftungsmolekül-1 (ELAM-1) und sie wurden strukturmäßig analysiert, so daß das unten angegebene Glycolipid aufgefunden wurde:
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 138–1142 [1991]).
Weiterhin wurde von Stroud et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 209: 777–787 [1995]) angegeben, daß die folgenden Glycolipide
welche üblicherweise in festen Tumorzellen und Geweben gefunden werden, nicht in menschlichen Neutrophilen und HL60-Zellen existieren, und daß die folgenden Glycolipide
aus menschlichen Neutrophilen und HL60-Zellen, entwickelt auf TLC und in Kontakt gebracht mit E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen zum Nachweis der Haftung extrahiert wurden, was beweist, daß diese Zellen an das Glycolipid #4 einschließlich sehr geringer Menge von #5 hafteten.
Andererseits, da Haftung vom Abrolltyp (Replikation) zwischen den Selectinen auf vaskulären Endothel und die Oligosaccharidliganden von Leukocyten bei der Initiierung des Entzündungsansprechens partizipieren, wird angenommen, daß vor Einfließen von Leukocyten in die Gewebeplätze der Entzündung und lokalisierte Schädigung des Endothels durch aktivierte Neutrophile über eine Inhibierung von Leukocytenreplikation längs Endothelium geschützt wird (Lasky, 1995, Ann. Rev. Biochem. 64: 113–139).
Die derzeit bekannten E-Selectinligandenverbindungen wurden ausgewählt und es wurde bewiesen, daß sie unter Bedingungen ohne irgendeine Scherspannung effektiv sind, wobei nicht das oben genannte Abrollphänomen, welches tatsächlich im menschlichen Körper auftritt, in Betracht gezogen wurde. Daher sollten diese Verbindungen kein reales E-Selectinligandenmaterial sein. Sie könnten weder das E-Selectinabhängige Replizieren und die Haftung von Leukocyten längs E-Selectin exprimierenden Zellen, wie Endothel, das im lebenden Körper aktiviert wird, noch Entzündung beim Menschen spezifisch steuern.
Es wird angegeben, daß E-Selectin exprimierende CHO-Zellen sich unter einer Scherspannung von 0,73 dyn/cm² längs der festen Phase anbanden, die mit SLe^x über Eilecithinphosphatidylcholin (abgekürzt als PC) gebunden war. Die für diesen Versuch verwendete feste Phase wurde durch Zugabe von 3 μl von SLe^x (aufgelöst bei 1 μg/ml in 20 : 1 Methanol : Butanollösung, enthaltend 4 μg/ml PC) zu der Fläche, die einen Durchmesser von 4 mm hatte, und Trocknen hergestellt, wobei, basierend auf die zu dieser festen Phase zugegebenen Menge, 15% des SLe^x über PC an der festen Phase gebunden war (J. Immunol. 154: 5356–5366 (1995)). Jedoch, wie zuvor erwähnt, konnte SLe^x, das im menschlichen Neutrophil nicht vorlag, menschliche Entzündung nicht sicher und spezifisch kontrollieren.
Das Dokument EP 0 344 955 (The Biomembrane Institute) beschreibt zwei Tumorantigene, welche Lactosylceramide sind. Jedoch beide der angegebenen Lactosylceramide haben vier N-Acetyllactosaminwiederholungen und eine Fucose auf dem zweiten N-Acetylglucosamin von dem nicht-reduzierenden Ende. Die Verwendung von Antikörpern, welche spezifisch diese zwei Lactosylceramide binden, zur Behandlung von Patienten mit Tumoren wird ebenfalls beschrieben.
Ein neuerer Bericht charakterisiert Monosialoganglioside von HL60-Zellen und menschliche Neutrophile, welche binden (oder nicht binden) an E-Selectin unter statischen Bedingungen (Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 777–787; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35: 758–769). Es gab keine SLe^x-Struktur mit oder ohne interne Fucosylierung mit < 10-Zuckermonosaccharideinheiten als Poly-LacNac-Kernstruktur (Stroud et al., 1996, Biochemistry 35: 758–769). Alle die E-Selectin bindenden Fraktionen hatten eine α2→3-Sialosylierung an dem endständigen Gal und zwei oder mehr α1←3-Fucosylierungen an dem inneren GlcNAc, verschieden von dem vorletzten (Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 777–787; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35: 770–778). Diese bindenden Fraktionen wurden kollektiv als "Myeloglycan" bezeichnet. Es gab eine extrem geringfügige Komponente von Poly-LacNAc mit SLe^x-Terminus mit α1→3-Fucosylierung bei interner GlcNAc. Es wurde geschlossen, daß der überwiegende Bindeplatz für E-Selectin in menschlichen Neutrophilen und HL60-Zellen vom Myeloglycantyp ist statt SLe^xenthaltendes Glycan. Keine der untersuchten Myeloglycan- oder Poly-LacNAc-SLe^x-Strukturen zeigte Bindung von P- Selectin (Stroud et al., 1996, Biochemistry 35: 758–769; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35: 770–778).
3. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf im wesentlichen reine Verbindungen, welche Saccharidsequenzen besitzen, die das Replizieren und die Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen auf Oberflächen, die mit diesen Saccharidsequenzen beschichtet sind, unter dynamischen Strömungsbedingungen ermöglichen. Die dynamischen Strömungsbedingungen sind solche Bedingungen, welche den physiologischen Scherspannungen vergleichbar sind, welche im menschlichen Körper vorkommen, wie die durch die Blutströmung bewirkten Scherspannungen. Die Verbindungen der Erfindung haben bevorzugt Saccharidsequenzen, welche in menschlichen Neutrophilen oder anderen hiermit vergleichbaren Zellen vorliegen.
Die Erfindung bezieht sich besonders auf im wesentlichen reine Myelorolline, Myelorollinmimetica wie auch auf Zusammensetzungen, welche solche Verbindungen enthalten. Myelorollin wird durch die folgende Gruppe von nicht-SLe^x-enthaltenden Strukturen A, B, C, D und X, Y verkörpert, welche nicht-verzweigte Polylactosamine mit endständiger α2→3-Sialyierung und interner Fucosylierung an verschiedenen GlcNAc-Resten mit Ausnahme des vorletzten GlcNAc sind:

worin → kovalente Bindung anzeigt, R und R' jeweils ein H-Atom, ein Komplexlipid, ein einfaches Lipid, ein Oligosaccharid (R' ein Oligosaccharid, welches überhaupt keinen Lactosaminrest enthält), ein Ceramidrest, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe, eine Alkyl-, Alkenyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, ein pharmazeutisch aktiver Inhaltsstoff, ein fester Träger oder eine kovalente Verbindung hiervon.
Myelorollin enthaltende Strukturen, insbesondere die im menschlichen Körper als Gangliosid vorliegenden, sind nützliche Reagenzien für hemmendes Entzündungsansprechen, insbesondere chronische Zustände wie rheumatoide Arthritis, Nierenversagen und Hepatitis.
Eine Mischung von Myelorollin statt einer einzigen molekularen Spezies bewirkt eine stärkere Replikation und Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen. Daher sind Mischungen von Myelorollin besonders brauchbare Reagenzien zum Hemmen von Entzündungsansprechen.
Die Erfindung basiert auf der überraschenden Feststellung, daß E-Selectin exprimierende Zellen, welche an Oberflächen, die mit Myelorollin enthaltenden Gangliosiden beschichtet sind, haften und replizieren.
Die Erfindung ist spezifisch auf ein Polylactosamin mit der folgenden Formel gerichtet:
und auf eine Zusammensetzung, welche wenigstens umfaßt:

(a) ein Polylactosamin mit der Struktur:
und
(b) ein Polylactosamin mit der Struktur:
worin R und R' jedes sind: ein H-Atom, eine unsubstituierte Arylgruppe oder eine Arylgruppe, substituiert mit einem beliebigen der folgenden: (i) einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, wobei diese Gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome besitzt, (ii) Halogenatome, (iii) Hydroxylgruppe, (iv) Nitrogruppe und (v) Carboxylgruppe; eine Alkyl-, Alkenyl- oder Hydroxyalkylgruppe, wobei diese Gruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome hat; ein Ceramidrest; ein Oligosaccharid (R' ist ein Oligosaccharid, das überhaupt keinen Lactosaminrest enthält); ein fester Träger; oder ein nicht-steroider Antientzündungswirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Salicylsäurederivaten, Arylessigsäurederivaten, Propionsäurederivaten, Pyrazolonderivaten, Oxicamderivaten und Epirizol besteht.

3.1. Abkürzungen und Definitionen
Die folgenden Abkürzungen werden in dieser Beschreibung immer verwendet: BSA, Rinderserumalbumin; CID, kollisionsinduzierte Dissoziierung; CHO-Zellen, Eistockzellen vom chinesischen Hamster; EC, Endothelzelle; EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure; ES-MS, Elekronenstrahlmassenspektrometrie, FABMS, Massenspektrometrie mit Bombardierung mit schnellen Atomen; Fr., Fraktion/en; GSL, Glycosphingolipid; Ig, Immunoglobulin; IHW, Isopropanol/Hexan/Wasser; mAb, monoklonaler Antikörper; MFI, mittlere Fluoreszenzintensität; NMR, kernmagnetische Resonanz; PLA, Polylactosamin; PBS, phosphat-gepuf ferte Salzlösung; Sdiy² oder SLe^x-Le^x, Sialosyl-Le^x-Le^x; SLe^x, Sialosyl-Le^x; Sle^a, Sialosyl-Le^a, Str., Struktur/en; TLC, Dünnschichtchromatographie.
Glycolipide werden entsprechend den Empfehlungen der Kommission für biochemische Nomenklatur IUPAC-IUB (Lipids 12: 455–463, 1977) abgekürzt, jedoch wird der Suffix -OseCer abgekürzt auf -Cer. Insbesondere haben Sialosyl-Le^x und Sialosyl-Le^x-Le^x die folgenden Strukturen:
Wie in den obigen Formeln angegeben, sind die Zahl "1" zur Anzeige der Stellung von Glycosid-OH im Saccharid und der Pfeil zur Anzeige der Bindung benachbart zum Saccharid, falls nichts anderes angegeben ist, aus Abkürzungszwecken in dieser Beschreibung weggelassen.
4. Kurze Beschreibung der Zeichnung
1A. Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen an Löcher von Platten mit 96 Löchern, beschichtet mit verschiedenen Mengen von Poly-LacNAc-gangliosiden unter statischen Bedingungen. Jeder Punkt stellt mittleren experimentellen Wert minus Kontrollwert von Dreifachversuchen dar. Das Symbol "•" stellt SLe^x-Le^x dar. Die anderen Symbole stellen Fr. 9, 10-1, 10-2, 12-2 dar.
1B. Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen an Polystyrolperlen (1 μm Durchmesser), beschichtet mit verschiedenen Poly-LacNAc-gangliosiden unter statischen Bedingungen. Jeder Punkt stellt das Ergebnis von einem Versuch dar. Horizontale Linien zeigen arithmetische Mittelwerte an.
2A–2E. Replikation und Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen an Polystyrolperlen, beschichtet mit verschiedenen Gangliosiden (GSL) unter dynamischen Strömungsbedingungen. Ganglioside wurden quantitativ an Perlen adsorbiert, die an Mikroskopobjektträger aus Glas befestigt waren, wie in dem Abschnitt Materialien & Methoden angegeben. Die an Glasplatten befestigten Polystyrolperlen sind gegenüber dynamischer Strömung resistent. Die Objektträger wurden durch Inkubieren in PBS mit 2% BSA bei Zimmertemperatur für 1 h (hr) inkubiert und in einer Laminarströmungskammer mit parallelen Platten angeordnet. E-Selectin exprimierende CHO-Zellen waren frisch geerntet und in RPMI-Medium (1 × 10⁵ Zellen/ml) suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in einer Infusionspumpe, die an eine Strömungskammer angeschlossen war, angeordnet, und in die Anordnung mit verschiedenen Laminarströmungsraten infusiert. Zellbewegungen wurden im Phasenkontrastmikroskop beobachtet und mittels Videokassettenrecorder aufgezeichnet. Die Anzahl von replizierenden Zellen (O) und Anzahl von gesamt replizierenden und haftenden Zellen (•), gefunden in wenigstens 10 Mikroskopfeldern, bei vier oder fünf unterschiedlichen Scherspannungen (dyn/cm²; siehe Abszisse) wurden aufgezeichnet. Die Anzahl von Kreisen größer als 4 sind der Einfachheit halber als 4 in diesen Figuren wiedergegeben.
2A. Replizieren/Haftung von Zellen auf 4 μm Perlen, beschichtet mit SLe^x-Le^x.
2B. Replizieren/Haftung von Zellen auf 4 μm Perlen, beschichtet mit Fr. 12-2.
2C. Replizieren/Haftung von Zellen auf 4 μm Perlen, beschichtet mit Fr. 13-1.
2D. Replizieren/Haftung von Zellen auf 1 μm Perlen, beschichtet mit Fr. 13-1.
2E. Replizieren/Haftung von Zellen auf 1 μm Perlen, beschichtet mit Fr. 14.
3A. Haftung von mit E-Selectin beschichteten Perlen an Perlen, die mit verschiedenen Gangliosiden beschichtet sind, unter statischen Bedingungen. Offene Balken, mit E-Selectin beschichtete Perlen; schwächer schraffierte Balken, mit E-Selectin beschichtete Perlen bei Anwesenheit von 5 mM EDTA; dunkler schraffierte Balken, mit P-Selectin beschichtete Perlen; und schwarze Balken, mit menschlichem IgG beschichtete Perlen.
3B. Hemmeffekt von Anti-E-Selectinantikörper auf mit E-Selectin beschichtete Perlen, bindend an Perlen, die mit verschiedenen Myelorollinfraktionen beschichtet sind. Offene Balken, mit E-Selectin beschichtete Perlen, vorinkubiert mit IgG von Kontrollmäusen; und schwarze Balken, mit E-Selectin beschichtete Perlen, vorinkubiert mit mAb E1C.
4A–4C. Replizieren und Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen auf Perlen, beschichtet mit sehr geringen Mengen von SLe^x-Le^x oder Fraktion 10-1 plus Fraktion 10-2 unter dynamischen Strömungsbedingungen. 4A. Plot 1. Gesamtreplizieren und Haftung (•) und Replizieren (O) von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen auf Perlen, beschichtet mit 0,05 ng von SLe^x-Le^x bei Scherspannungen von 7,7, 3,1 und 1,5 dyn/cm². Plot 2. Wiederholungsexperiment, gleiche Bedingungen wie Plot 1. 4B. Plot 1. Gesamtreplizieren und -haftung (•) und Replizieren (O) von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen auf Perlen, beschichtet mit einer Mischung von jeweils 0,05 ng von Fr. 10-1 und 10-2 (Anmerkung: dies ergibt die gleiche Molarität wie 0,05 ng von SLe^x-Le^x, da das Molekulargewicht von SLe^x-Le^x das Doppelte von Fr. 10-1 oder 10-2 ist). Gleiche Scherspannungen wie in 4A. Plot 2. Wiederholungsexperiment, gleiche Bedingungen wie Plot 1. 4C. Replizieren von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen unter dynamischen Strömungsbedingungen. Mittelwert von replizierender Zellanzahl auf Perlen (Durchmesser 4 μm), beschichtet mit verschiedenen Gangliosiden (jeweils 100 ng) bei unterschiedlichen Scherspannungen im dynamischen Strömungssystem. Ordinate: Anzahl von replizierenden Zellen (Anmerkung: schließt haftende Zellen ein). Abszisse: Wandscherspannung (dyn/cm²). Bei jeder Scherspannungsgruppe sind die Balken von links nach rechts, bezogen auf das zum Beschichten der Perlen verwendete Material: SLe^x-Le^x; Fr. 10 (Mischung von Fr. 10-1 und 10-2); Fr. 13-1 und Fr. 14.
5A und 5B. Replizieren und Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen auf Perlen, beschichtet mit Fr. 10-1, Fr. 10-2 oder einer Mischung von 10-1 und 10-2 unter dynamischen Strömungsbedingungen. 5A. Gesamtreplizieren und -haftung (•) und Replizieren (O) von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen auf Perlen, beschichtet mit: 100 ng von Fr. 10-1 (Plot 1); 100 ng von Fr. 10-2 (Plot 2) und einer Mischung von jeweils 50 ng Fr. 10-1 und 10-2 (Plot 3). Ganglioside waren auf 1 μm Perlen adsorbiert. Werte für Scherspannungen von 2,4 und 4,8 dyn/cm² sind gezeigt. Statistische Signifikanz von Unterschieden zwischen verschiedenen Unterergebnissen von Werten wurden mittels des nicht-gepaarten t-Test von Student ausgewertet, und P-Werte sind in der eingefügten Tabelle zusammengefaßt. 5B. Gesamtreplizieren und -haftung (•) und Replizieren (O) von E-Selectin exprimie renden CHO-Zellen auf Perlen, beschichtet mit: 0,1 ng von Fr. 10-1 (Plot 1); 0,1 ng von Fr. 10-2 (Plot 2) und einer Mischung von jeweils 0,05 ng Fr. 10-1 und 10-2 (Plot 3).
Ganglioside wurden an 1 μm Perlen adsorbiert. Drei unterschiedliche Scherspannungswerte sind gezeigt. Replizieren/Haftung erfolgte selbst bei dieser niedrigen Gangliosidkonzentration. Die Anzahl von replizierenden und haftenden Zellen war am größten für die Mischung von Gangliosiden (Plot 3). P-Werte sind in der eingefügten Tabelle, wie in 5A zusammengefaßt.
6A und 6B. Haftung und Replizieren, gefolgt von Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen an Perlen, beschichtet mit verschiedenen Gangliosiden, unter dynamischen Strömungsbedingungen.
7. Mögliche Raumanordnungen von Sialosylresten (SA) und Fucosylresten an der inneren GlcNAc von unterschiedlichen Stellungen (Fuc 1 und Fuc 2) längs der Polylactosaminkette. Panel A: Mögliche Konfiguration der Doppelhelixstruktur von Monofucosylgangliosiden mit Fuc 1 oder Fuc 2 in unterschiedliche Stellungen (z. B. Str. 4 und 5 oder Str. 9 und 10). Wenn diese Struktur vom terminalen Ende, wo SA vorhanden sind, betrachtet wird, kann die Raumanordnung von SA und Fuc 1, Fuc 2 wie in I von Panel D gezeigt, gesehen werden. Panel B: Mögliche Konfiguration von Doppelhelixstruktur von Difucosylgangliosiden mit Fuc 1 und Fuc 2 in unterschiedlichen Stellungen jedoch auf derselben Polylactosaminkette (z. B. Str. 7, Str. 11). Wenn die Struktur von dem terminalen Ende, wo SA vorhanden sind, betrachtet wird, kann die Raumanordnung von SA und Fuc 1 und 2, wie in II von Panel D gezeigt, gesehen werden. Panel C: SLe^x-Struktur, wenn Fuc an dem vorletzten GlcNAc vorhanden ist (Fuc x); die Stellungsbeziehung zwischen SA und Fuc x ist ersichtlich, wie in III von Panel D gezeigt.
Panel D: Endansichten von in den Panelen A-C gezeigten Gangliosiden.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert im wesentlichen reine Myelorolline, Mimetica und Zusammensetzungen hiervon. Die Erfindung liefert ebenfalls Verfahren zur Verwendung von Myelorollinen, Mimetica und Zusammensetzungen hiervon zur Hemmung von Zellwechselwirkungen, welche verschiedenen Krankheiten zugrunde liegen. Myelorolline können aus tierischen Zellen isoliert werden. Myelorolline und Mimetica können künstlich synthetisiert werden. Ein Myelorollin hat die Fähigkeit, wenn auf Oberflächen aufgeschichtet, die Replikation, die Haftung und das Strömen von E-Selectin exprimierenden Zellen auf solchen Oberflächen unter dynamischen Strömungsbedingungen herbeizuführen.
Die Myelorolline und Mimetica der Erfindung sollten durch eine geeignete Arbeitsweise ausgewählt werden. Sie schließt die V-Arbeitsweise ein, umfassend das Binden von Sondenmaterial, wie von menschlichen Neutrophilen oder hierzu ähnlichen Zellen exprimierten Gangliosiden, an eine feste Phase, die Zugabe hierzu unter einer im menschlichen Körper erreichbaren Scherspannung von E-Selectin exprimierenden Zellen, wie E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen, die Beobachtung für jede Zeiteinheit, das Replizieren, die Haftung und das Strömen dieser Zellen auf dieser festen Phase und anschließend die Auswahl von das Replizieren herbeiführenden Materialien. Eine Scherspannung, die im menschlichen Körper erreichbar ist, bedeutet bevorzugt eine Scherspannung, welche durch menschliche Blutströmung herbeigeführt wird, in dem bevorzugten Bereich von 0,8 bis 12 dyn/cm².
Das Myelorollin oder Mimetica kann an Polystyrolperlen, die auf einem Objektträger befestigt sind, angeheftet werden, wobei diese dann in einer Kammeranordnung mit paralleler la minarer Strömung angeordnet werden, wobei die Bestimmung des Replizierens und der Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen unter dynamischen Strömungsbedingungen mit definierter Scherspannung ermöglicht wird. Die verwendete Apparatur kann zu derjenigen vergleichbar sein, die von Lawrence et al., 1990, Blood 75: 227, beschrieben ist.
Gemäß der Erfindung kann ein Myelorollin die folgende Struktur besitzen, welche eine Gruppe von nicht-verzweigten Polylactosaminen umfaßt, bestehend aus wenigstens 6 Monosacchariden (drei sich wiederholende Lactosamineinheiten sind gezeigt), und das eine terminale α2→3-Sialylierung und interne α1→3-Fucosylierung an verschiedenen N-Acetylglucosaminresten aufweist, ausgenommen lediglich an dem vorletzten N-Acetylglucosaminrest:
worin jedes R₁ unabhängig ausgewählt ist unter -OH und α1→3-Fucose (C₆H₁₂O₅), vorausgesetzt, daß wenigstens ein, R₁ α1→3-Fucose ist.
Ausführungsformen von Myelorollin schließen Verbindungen mit den folgenden Strukturen ein:

worin → kovalente Bindung anzeigt; R und R' jeweils ist ein H-Atom, ein komplexes Lipid, ein einfaches Lipid, ein Oligosaccharid (ausgenommen R', welches überhaupt keinen Lactosaminrest enthält), ein Ceramidrest, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe, eine Alkyl-, Alkenyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, ein pharmazeutisch aktiver Inhaltsstoff, ein fester Träger oder eine kovalente Verbindung hiervon.
Die Gruppen R und R' können kovalent an GlcNAc an dem reduzierenden Terminus der Formeln über geeignete Abstandshalter, wie ein Diamin, Aminoalkohol, eine Aminosäure, ein Peptid, gebunden sein. Als Substituenten für die Arylgruppe werden beispielhaft genannt Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogenatome, Hydroxylgruppe, Nitrogruppe und Carboxylgruppe. Unter komplexen Lipiden und einfachen Lipiden ist Ceramid am meisten bevorzugt, und natürlich vorkommender Lipidträger von Myelorollinen. Glycerolipide einschließlich Diacylglycerin und ähnliche neutrale Lipide. Kettenlänge und Unsättigungsgrad der Acylgruppe in solchen Lipiden sind nicht besonders eingeschränkt.
Die pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoffe, welche R und R' bilden, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf nicht-steroide Antientzündungswirkstoffe: Salicylsäurederivate wie Aspirin, Arylessigsäurederivate wie Indomethacin, Propionsäurederivate wie Ibuprofen; Pyrazolonderivate wie Phenylbutazon; Oxicamderivate wie Piroxicam und Epirizol und dergleichen.
Die Erfindung liefert ebenfalls Myelorollinmimetica, welche die folgende Struktur haben, wobei diese eine Gruppe von nicht-verzweigten Polylactosaminen einschließt, die aus wenigstens 6 Monosacchariden besteht und terminale α2→3-Sialylierung und interne α1→3-Fucosylierung an verschiedenen N-Acetylglucosaminresten haben, ausgenommen lediglich an dem vorletzten N-Acetylglucosaminrest:
worin R₁ eine α1→3-Fucose ist, R₂ entweder -OH oder Fucose ist, a eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, b eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist.
Ausführungsformen von Myelorollinmimetica schließen solche ein, welche die folgenden Strukturen besitzen:

worin → kovalente Bindung anzeigt, R gleich wie dasjenige für die zuvor beschriebenen Myelorolline ist.
Die Strukturen von Myelorollinmimetica unterscheiden sich von denjenigen von Myelorollinen (z. B. A, B, C, D und X, Y), und sie können weiter in Werten von möglichen räumlichen Anordnungen von Sialosylresten (SA) und Fucosylresten an der inneren GlcNAc von unterschiedlichen Stellungen (Fuc 1 und Fuc 2) längs der Polylactosaminkette definiert werden. Poly-N-acetyllactosaminkette ([3Galβ1→4GlcNAcβ1→]_n), hat bekannterweise eine Helixstruktur (Niemann et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 81: 1286–1293; Rees, D. A., 1975, MTP International Review of Science 5: 1–42, Herausgeber Whelan, W., Butterworths (London) University Park Press (Baltimore); Atkins et al., 1974, Polymer 15: 263–271). Mimetica von Myelorollin A, B, C, D und X, Y können basierend auf räumlicher Konfiguration konstruiert werden, d. h. Anordnung von Sialinsäure und unterschiedliche Plätze von Focusylrest. Die Orientierung von Fucosylrest und seine Beziehung zu der Sialinsäurestellung ist von primärer Wichtigkeit (siehe 7).
Myelorolline können aus einer Kultur im großen Maßstab von HL60-Zellen oder U937-Zellen, wie im folgenden beschrieben, hergestellt werden. Myelorolline und Mimetica können in großen Mengen durch Polymerisation von N-Acetyllactosamin, gefolgt von α2→3-Sialylierung und α1→3-Fucosylierung durch Sialosyltransferase bzw. Fucosyltransferase synthetisiert werden.
Spezifisch kann ein Myelorollinderivat erhalten werden durch Umsetzung (a) nicht-verzweigtes Polylactosamin, das einen α2→3-Sialosylrest an dem nicht-reduzierenden Terminus und α1→3-Fucosylreste an dem internen GlcNAc jedoch nicht lediglich an dem vorletzten GlcNAc direkt oder über einen Abstandshalter besitzt, mit (b) einem substituierten oder unsubstituierten Arylhalogenid, einem Alkyl-, Alkenyl- oder Hydroxyalkylhalogenid mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, einem komplexen Lipid, einem einfachen Lipid, einem Oligosaccharid, einem Ceramid, einem pharmazeutisch aktiven Inhaltsstoff, einem festen Träger oder einer kovalenten Verbindung hiervon unter Anwendung bekannter Methoden, wie Glycosylierung des Saccharidrestes an dem reduzierenden Terminal.
Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls ein Verfahren zur Hemmung von Zellwechselwirkungen, umfassend das Exponieren einer ersten Zelle, wie menschlichen Neutrophilen oder Leukocyten, welche einen Liganden exprimiert, der Replizieren und Haftung abhängig von E-Selectin, das auf einer zweiten Zelle, wie Endothelzellen oder anderen E-Selectin exprimierenden Zellen exprimiert wird, an eine E-Selectin abhängige Replizieren und Haftung inhibierende Menge von wenigstens einem nicht-verzweigten Polylactosamin bewirkt, wobei dieses wenigstens 6 Monosaccharide umfaßt und terminale α2→3-Sialylierung und interne α1→3-Fucosylierung an verschiedenen N-Acetylglucosaminresten mit Ausnahme lediglich an dem vorletzten N-Acetylglucosaminrest, hat.
Weiterhin liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Hemmen von Zellwechselwirkungen, umfassend das Exponieren einer ersten Zelle, wie menschlichen Neutrophilen oder Leukocyten, die einen Liganden exprimiert, der das Replizieren und die Haftung abhängig von E-Selectin, das auf einer zweiten Zelle exprimiert wird, wie Endothelzellen und anderen E-Selectin exprimierenden Zellen, an eine E-Selectin abhängige Replizieren und Haftung inhibierende Menge von einem Antikörper, der an unverzweigtes Polylactosamin bindet, bewirkt, wobei dieses wenigstens 6 Monosaccharide umfaßt und eine terminale α2→3-Sialylierung und interne α1→3-Fucosylierung an verschiedenen N-Acetylglucosaminresten mit Ausnahme für lediglich an dem vorletzten N-Acetylglucosaminrest besitzt, wobei dieser Antikörper weiterhin durch eine inhibierende Haftung von diesen ersten und zweiten Zellen unter dynamischen Strömungsbedingungen in vitro gekennzeichnet ist.
Myelorollinherstellung aus HL60-Zellen
HL60-Zellen. HL60-Zellen wurden ursprünglich von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten und in RPMI, ergänzt mit 10% FCS, wachsen gelassen. Die Zellen wurden in 5% CO₂ bei 37°C gehalten, für zwei Zyklen in Rollflaschen zum Sammeln von großen Zellmengen wachsen gelassen und durch Zentrifugieren geerntet. Auf diese Weise kultivierte HL60-Zellen zeigten einen Wert der Bindeaktivität für E-Selectin vergleichbar zu denjenigen der Zellen, die kontinuierlich in einem CO₂-Inkubator kultiviert worden waren, d. h. Kultur im großen Maßstab in Rollflaschen in dieser Weise bewirkte keinen signifikanten Verlust der Bindungsaktivität für E-Selectin. Insgesamt wurden 1200 ml von gepackten HL60-Zellen in Teilmengen von etwa 400 ml abgepackt, jede hiervon wurde wie in dem folgenden Abschnitt beschrieben, extrahiert.
Glycolipidextraktion. Annähernd 100 ml von gepackten menschlichen Neutrophilen oder 400 ml von gepackten HL60-Zellen wurden durch Homogenisieren in einem Waringmischer mit 10 Volumina der unteren Phase von IHW (55 : 25 : 20) extrahiert. Der Extrakt wurde durch ein Filter Whatman #1 filtriert, und der Rückstand wurde wie oben erneut extrahiert. Die Arbeitsweise Extraktion/Filtration wurde einmal mehr wiederholt, die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck bei 40°C unter Verwendung eines Rotationsverdampfers Brinkmann konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wurde der Partitionierung nach Folch durch Auflösen des Rückstandes in 3 l Chloroform/Methanol (C/M; 2 : 1), die 500 ml Wasser enthielten, unterworfen. Nach kräftigem Schütteln wurde sich der Extrakt auftren nen gelassen, bis zwei durchscheinende Phasen erschienen (etwa 8 h (hr)). Die obere Phase wurde entfernt, und die untere Phase wurde durch Zugabe von C/M/1% KCl (1 : 10 : 10) zu dem ursprünglichen Volumen erneut extrahiert. Die Arbeitsweise Flüssigkeit-Extraktion wurde zweimal wiederholt, und die kombinierten oberen Phasen wurden durch Rotationsverdampfen konzentriert, in Wasser rekonstituiert und gründlich gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Dialyserohres Spectropor 3 (MG-Schnitt = 3500) dialysiert.
Anionen-Austauschchromatographie. Nach Dialyse wurde der Extrakt der oberen Phase zur Trockne wie oben eingedampft und in 50 ml C/M/Wasser (30 : 60 : 8) durch eine Kombination von Erwärmen (37°C) und Ultraschallbehandlung aufgelöst. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren bei 1000 × g für 10 min entfernt und durch Ultraschallbehandlung in zusätzlich 50 ml desselben Lösungsmittels extrahiert. Im Anschluß an das Zentrifugieren wie oben wurden die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten auf eine Säule DEAE-Sephadex (300 ml Bettvolumen; Acetatform) aufgegeben und mit 2 l C/M/Wasser (30 : 60 : 8) zur Entfernung aller neutralen Lipide gewaschen. Sephadex ist eine eingetragene Marke. Die Kolonne wurde mit 500 ml Methanol ins Gleichgewicht gesetzt, und die Monosialogangliosidfraktion wurde mit 2 l 0,05 M NH₄OAc in Methanol eluiert. Anschließende Entfernung von Di-, Tri- und Polysialosylgangliosiden wurde durch Eluieren ansatzweise mit 0,15 M, 0,45 M bzw. 1,0 M NH₄OAc erreicht. Die eluierten Gangliosidfraktionen wurden durch Rotationsverdampfung getrocknet, gegen Wasser dialysiert und getrocknet, wie oben angegeben.
Reinigung von Monosialogangliosiden aus HL60-Zellen
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Die Monosialogangliosidfraktion wurde in 10 ml IHW solubilisiert und aus dem Eindampfkolben in ein 15 ml Rohr überführt. Die Probe wurde vollständig unter N₂ unter Verwendung eines N-EVAP (Organomation Inc.) getrocknet und in 2 ml IHW durch Ultra schallbehandlung rekonstituiert. Die Probe wurde in eine präparative Kolonne Iatrobead (6RS-8010; 0,8 × 60 cm; Iatron Laboratories Inc., Kanda/Tokyo, Japan), welche mit IHW (55 : 40 : 5) vorher ins Gleichgewicht gesetzt worden war, injiziert und einem linearen Gradienten von IHW 55 : 40 : 5 bis 55 : 25 : 20 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min unterzogen. Fraktionen von 4 ml wurden während 400 min gesammelt. Jede Fraktion wurde auf eine HPTLC-Platte aufgebracht, in einem geeigneten Lösungsmittelsystem entwickelt (im folgenden beschrieben), durch Besprühen mit 0,5% Orcinol in 2 N Schwefelsäure sichtbar gemacht und je nach Wanderung zusammengefaßt. Die zusammengefaßten Fraktionen, welche mehr als 1 Band durch TLC enthielten, wurden unter N₂ getrocknet, in 1 ml IHW erneut solubilisiert und in eine halbpräparative Kolonne Iatrobead (0,4 × 60 cm) injiziert. Ein linearer Gradient von IHW 55 : 40 : 5 bis 55 : 25 : 20 während 200 min mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min wurde angewandt. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt und entsprechend der HPTLC-Wanderung zusammengefaßt. Fraktionen, welche ein einzelnes Band bei HPTLC enthielten, wurden entsprechend der Reihenfolge der Wanderung in C/M/0,5% CaCl₂ (50 : 55 : 19) markiert; d. h. das am schnellsten wandernde Band wurde mit #1 markiert, und die langsame mit #20. Mehrfachbanden enthaltende Fraktionen wurden weiter durch präparative HPTLC gereinigt.
Hochleistungsdünnschichtchromatographie. Monosialogangliosidfraktionen, welche nicht in einzelne Banden durch HPTLC aufgelöst worden waren, wurden durch präparative HPTLC getrennt. Fraktionen innerhalb der Banden 1 bis 7 wurden in einem Lösungsmittelsystem von C/M/0,5% CaCl₂ (50 : 40 : 10) erneut aufgelöst. Fraktionen mit Banden 8–14 wurden in C/M/0,5% CaCl₂ (50 : 55 : 19) aufgelöst. Fr. 12 und 13 wurden weiter gespalten (in Fr. 12-1 bis 12-5 bzw. 13-1 bis 13-3) unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Isopropanol/Wasser/NH₄OH (6 : 3, 2 : 1). Präparative TLC wurde durch Aufstreichen von 50 μl der Probe quer über eine 10 × 20 cm HPTLC-Kieselgelplatte (Kieselgel 60; EM Science, Gibbstown, NJ) aufgestrichen, getrocknet und in dem geeigneten Lösungsmittelsystem entwikkelt. Die Platten wurden getrocknet, und die Banden wurden durch Besprühen mit 0,03% Primulin in 80% Aceton sichtbar gemacht. Die Banden wurden mit einem Stift unter UV-Licht markiert. Die markierten Banden wurden von der Platte unter Verwendung einer Rasierklinge abgekratzt, und die Ganglioside wurden aus dem Kieselgel durch Ultraschallbehandlung für 20 min in IHW (55 : 25 : 20; 2 ml pro Bande) extrahiert. Das Kieselgel wurde durch Zentrifugieren mit 100 × g für 10 min zentrifugiert, wie oben angegeben erneut extrahiert, und die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten wurden unter N₂ getrocknet. Die Proben wurden unter Verwendung von 1 cc tC-18 Sep-Pak-Patronen (Waters, Milford, MA) gereinigt, zuerst durch Auflösen der Proben in 1 ml PBS und dann Aufbringen hiervon auf eine Kolonne, die mit PBS nach aufeinanderfolgendem Waschen mit 5 ml Methanol und 5 ml Wasser ins Gleichgewicht vorher gebracht worden war. Sobald die Probe zurückgehalten wurde, wurde die Kolonne mit 10 ml Wasser gefolgt von 10 ml 50% Methanol gewaschen und in 10 ml 100 Methanol eluiert. Die Probe wurde unter N₂ getrocknet, in 1 ml IHW (55 : 25 : 20) aufgelöst und in eine Kolonne Iatrobead (0,4 × 60 cm) wie oben unter Anwendung eines linearen Gradienten von IHW 55 : 40 : 5 bis 55 : 25 : 20 für 100 min bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Minute injiziert. Es wurden Fraktionen von 1 ml aufgefangen und mittels HPTLC unter Anwendung der Orcinol-Schwefelsäurereaktion sichtbar gemacht. Orcinolpositive Fraktionen wurden zusammengefaßt und unter N₂ vor der Strukturanalyse getrocknet.
Therapeutische Applikation
Zwei anti-inflammatorische Myelorollinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wurden einem in Not befindlichen Probanden für prophylaktische Verhinderung der Entzündung oder zur Beseitigung hiervon, nachdem sie begonnen hatte, appliziert. Die Myelorollinzusammensetzungen für den Probanden wurden bevorzugt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger gegeben, beispielsweise eingeschlossen in Liposome oder gebunden an spezifische Trägermoleküle mit dem geeigneten Design, wobei die Natur hiervon mit dem Applikationsweg sich unterscheidet. Beispielsweise erfordert orale Applikation üblicherweise einen festen Träger, obwohl "Mimetica" von Myelorollin aufgebaut werden, falls oral appliziert, während intravenöse Applikation üblicherweise einen flüssigen Salzlösungsträger oder Liposomsuspension erfordert. Typischerweise werden injizierbare Zusammensetzungen als flüssige Lösungen oder Suspensionen präpariert, feste Formen geeigneterweise zum Auflösen in oder zur Suspension in flüssigen Trägern vor der Injektion können ebenfalls hergestellt werden. Die Verbindungen können ebenfalls emulgiert werden, oder der aktive Inhaltsstoff kann in Liposomträger eingekapselt werden, wobei dies für die Abgabe von höherer Aktivität stärker erwünscht ist.
Geeignete Träger sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen sowie Kombinationen hiervon. Zusätzlich kann, falls gewünscht, der Träger kleinere Mengen von Hilfssubstanzen enthalten, wie Netz- oder Emulgiermittel oder pH-Puffermittel. Tatsächliche Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 17. Aufl., 1985.
Pharmazeutisch annehmbare Formulierungen können eine Vielzahl von Verdünnungsmitteln verwenden, einschließlich beispielsweise pharmazeutischen Qualitäten von Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharincellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Orale Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freigabe oder Pulver genommen werden. Pharmazeutisch brauchbar ist die Applikation der betreffenden Myelorollinmoleküle direkt in transdermalen Formulierungen mit Permeationsförderern wie DMSO. Andere topische Formulierungen können zur Behandlung von Hautentzündungen appliziert werden. Zusätzlich kann Applikation durch die Schleimhaut unter Verwendung von Durchdringungsmitteln wie Gallensalzen oder Fusidinsäurederivaten, wahlweise in Kombination mit zusätzlichen Tensidmolekülen, herbeigeführt werden. Diese Formulierungen sind bei der Herstellung von beispielsweise Suppositorien oder für Nasensprays nützlich. Für Suppositorien schließt die Trägerzusammensetzung traditionelle Bindemittel und Träger wie Polyalkylenglycole oder Triglyceride ein. Solche Suppositorien können aus Mischungen gebildet werden, welche den aktiven Inhaltsstoff im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 10% (Gew./Gew.), bevorzugt etwa 1% bis etwa 2% enthalten.
Intranasale Formulierungen schließen üblicherweise Träger ein, welche weder Reizung der Nasenschleimhaut noch signifikantes Stören der Wimperfunktion bewirken. Verdünnungsmittel wie Wasser, wässrige Salzlösung oder andere bekannte Substanzen können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Nasenformulierungen können ebenfalls Konservierungsstoffe enthalten, wie, jedoch nicht beschränkt auf Chlorbutanol und Benzalkoniumchlorid. Ein Tensid kann vorliegen, um die Absorption der betreffenden Liganden durch die Nasenschleimhaut zu fördern.
Typischerweise enthalten die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung von weniger als 1% bis etwa 95% des aktiven Inhaltsstoffes, bevorzugt etwa 10% bis etwa 50%. Bevorzugt werden zwischen etwa 10 mg und 50 mg einem Kind und zwischen etwa 50 mg und 1000 mg einem Erwachsenen appliziert. Die Häufigkeit der Applikation wird von der Sorge bestimmt, welche auf Basis des Ansprechens des Patienten gegeben ist. Andere effektive Dosierungen können in einfacher Weise von dem Fachmann auf dem Gebiet durch routinemäßige Versuche unter Aufstellung von Dosisansprechkurven festgelegt werden.
Bei der Bestimmung der zu applizierenden Dosis ist darauf hinzuweisen, daß es nicht erwünscht sein kann, sämtliche Selectinmoleküle vollständig zu blockieren. Damit ein normaler Entzündungsprozeß fortschreitet, müssen wenigstens einige der weißen Blutzellen oder Neutrophile in dem Gewebe in die Bereiche gebracht werden, wo irgendeine Wunde, Infektion oder ein Krankheitszustand gegeben ist. Die Menge von als Blokkiermittel applizierten Selectinliganden muß sorgfältig eingestellt werden, basierend auf den besonderen Notwendigkeiten des Patienten, wobei eine Vielzahl von Faktoren wie der Typ der Krankheit, welche behandelt werden soll, in Betracht gezogen wird.
Wenn die anti-inflammatorische Zusammensetzung der beanspruchten Erfindung ein Antikörper, gerichtet gegen ein Myelorollin ist, kann ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel verwendet werden, und der Antikörper sollte "humanisiert" und Fab-fragmentiert sein. Das verwendete, besonders pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel ist hierfür nicht kritisch. Beispiele solcher Verdünnungsmittel schließen physiologische Salzlösung, Ringer-Lösung, einen Vitamincocktail und Aminosäure-Vitamincocktail ein.
Die pharmazeutisch effektive Menge der Antikörper der vorliegenden Erfindung, welche appliziert werden soll, variiert in Abhängigkeit vom Alter, Gewicht und Geschlecht der zu behandelnden Person. Im allgemeinen beträgt die pharmazeutisch effektive Menge etwa 1,0 bis 5,0 μg/100 g Körpergewicht pro eine Injektion. Im allgemeinen werden 5 bis 10 Injektionen der Antikörper angewandt, jedoch ist die vorliegende Erfindung hierauf nicht beschränkt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich zur Behandlung einer breiten Vielzahl von Krankheiten, beispielsweise Autoimmunkrankheiten wie rheumatoider Arthritis und Multiple Sclerose. Die Zusammensetzungen der Erfin dung sind zur Behandlung eines beliebigen Krankheitszustandes anwendbar, bei welchem das Immunsystem sich gegen den Körper richtet, wobei die Ansammlung von weißen Zellen in den Geweben bis zu einem Ausmaß hervorgerufen wird, daß sie Gewebeschädigung, Anschwellen, Entzündung und/oder Schmerzen bewirken, insbesondere chronische Entzündungszustände, welche durch E-Selectin vermittelt werden.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zur Verhinderung der unerwünschten Nacheffekte von Gewebeschädigungen appliziert werden, welche aus akuten Entzündungszuständen, die Herzangriffe induzieren, herrühren. Dies ist besonders in Kombination mit P-Selectininhibitoren oder P-Selectinliganden erwünscht, da P-Selectin, jedoch nicht E-Selectin, eine Hauptrolle bei akutem Entzündungsansprechen wie Herzattacken oder Schlaganfällen spielt. Wenn eine Herzattacke auftritt und der Patient wiederbelebt worden ist, beispielsweise durch Anwendung von Antikoagulantien oder thrombolytisch (z. B. tPA), hat die Endothelauskleidung, wo ein Pfropf gebildet wurde, oftmals Schaden erlitten. Wenn das antithrombotische Mittel den Pfropf entfernt hat, wird das beschädigte Gewebe neben dem Pfropf und anderes beschädigtes Gewebe in der Endothelauskleidung, welche an Sauerstoff verarmt ist, aktiviert. Die aktivierten Endothelzellen synthetisieren die ELAM-1-Rezeptoren, ein Typ von Selectin, innerhalb von Stunden der beschädigten Zellen. Die Rezeptoren werden in die Blutgefäße abgegeben, wo sie an Glycolipidligandmoleküle auf der Oberfläche der weißen Blutzellen anhaften. Große Zahlen von weißen Blutzellen werden rasch eingefangen und in das Gewebe, welches den Bereich der aktivierten Endothelzellen umgibt, gebracht, was eine Entzündung, ein Quellen und Nekrose ergibt, wodurch die Wahrscheinlichkeit des Überlebens des Patienten abnimmt.
Zusätzlich zur Behandlung von Patienten, die am Trauma, das sich aus Herzangriff ergibt, leiden, können Patienten, welche ein akutes physikalisches Trauma haben, mit Formulie rungen der Erfindung behandelt werden, um das Ausmaß der Entzündung und des Anschwellens, welche normalerweise sich ergeben, nachdem ein Bereich des Körpers einem harten Trauma ausgesetzt wurde, aufzuheben. Andere Zustände, welche unter Verwendung der Formulierungen der Erfindung behandelbar sind, schließen verschiedene Typen von Arthritis und rwachsenen Respirationsdistresssyndrom ein. Nach dem Durchlesen der vorliegenden Angaben erkennt der Fachmann auf dem Gebiet andere Krankheitszustände und/oder Symptome, welche durch Applikation von Formulierungen der vorliegenden Erfindung behandelt und/oder gelindert werden können.
Verschiedene Zusammensetzungen, bestehend aus: (1) einem Myelorollin: (A) Fr. 10-2, (B) einer Mischung von Fr. 10-1 und Fr. 10-2 oder (C) Fr. 14 und (2) ein pharmazeutisch annehmbarer Träger wie, jedoch nicht beschränkt auf: (D) Polyalkylenglycol, (E) Triglycerid, (F) Fettöl, (G) synthetischer Fettsäureester, (H) Liposom, (I) Carboxymethylcellulose, (J) Sorbit oder (K) Dextran werden in einer therapeutisch wirksamen Dosierungsform hiervon bei Patienten appliziert, welche an einer Entzündungskrankheit leiden, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf: Arthritis, rheumatoider Arthritis, Multiple Sclerose. Diese Applikationen sind bei der Behandlung zur Verbesserung solcher Krankheitszustände nützlich.
6. BEISPIEL
Es wurde in Neutrophilen und menschlichen promyelogenen Leukämie-HL60-Zellen die Anwesenheit von Polylactosamingangliosiden mit terminaler α2→3-Sialylierung und α1→3-Fucosylierung bei verschiedenen internen (jedoch nicht dem vorletzten) GlcNAc-Resten festgestellt. Diese Verbindungen mit der Saccharidsequenz solcher Ganglioside werden kollektiv als "Myelorollin" bezeichnet. Im Gegensatz dazu waren SLe^x-Le^x, Determinanten ohne interner α1→3-Fucosylierung der Po lylactosaminkette, in diesen Zellen nicht vorhanden. Bei dieser Untersuchung wurden die Aktivitäten einer Reihe von Myelorollin (A, B, C, D, X, Y, siehe oben) untersucht, um anzubinden, damit Haftung und Replizieren von E-Selectin exprimierenden Zellen herbeigeführt wird. Die Haftungsuntersuchungen wurden unter sowohl statischen Bedingungen als auch dynamischen Strömungsbedingungen durchgeführt. Dagegen wurde das Replizieren von E-Selectin exprimierenden Zellen auf mit Gangliosid beschichteten Oberflächen unter dynamischen Strömungsbedingungen durchgeführt.
Aus dieser Untersuchung kann folgendes geschlossen werden. SLe^x enthaltende Strukturen bewirken keine Replikation, sie fehlen praktisch in Neutrophilen und HL60-Zellen, und sie spielen keine physiologische Rolle beim Replizieren, der Haftung und der Extravasation von Neutrophilen. Es ist nicht die SLe^x enthaltende Struktur, sondern eine Gruppe von Nicht-SLe^x-enthaltenden Strukturen, kollektiv genannt "Myelorollin" (d. h. nicht-verzweigtes Polylactosamin mit terminaler α2→3-Sialylierung und interner Focusylierung [an verschiedenen GlcNAc-Resten mit Ausnahme des vorletzten GlcNAc alleine]), welche zum Herbeiführen des Replizierens, der Haftung und der Extravasation von Neutrophilen verantwortlich sind. Verschiedene Typen von Myelorollin in einem Gemisch bewirken synergistisch von E-Selectin abhängiges Replizieren und Haftung im Vergleich zu einem einzelnen Molekül von Myelorollin. Myelorollin ist das Hauptglycan und Gangliosid von HL60-Zellen und menschlichen Leukocyten. Das Blockieren der Myelorollinfunktion kann durch minimale essentielle Struktur erreicht werden, welche in Myelorollin auftritt, was Replizieren und Haftung abhängig von E-Selectin bewirkt. Hochspezifische Antikörper gegen Saccharidfrequenz von Myelorollin kann in einfacher Weise hergestellt, ausgewählt und für Herstellung von Antientzündungsarzneimitteln verwendet werden.
6.1 Materialien und Methoden
GSLs und Monosialoganglioside
Tabelle 1 zeigt die Strukturen von Gangliosiden (identifiziert als Fr. oder Str.), wie hier angegeben. Strukturen von Gangliosiden wurden verifiziert durch ¹H-NMR, ⁺Ionen-FAMCS und ES-MS mit CID von permethylisierten Verbindungen, wie zuvor beschrieben (Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 777-787; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35: 758–769; Stroud et al., 1996, Biochemistry 35: 770–778). Strukturen von Fr. 9-1, 9-2, 10-1 und 10-2 wurden weiter durch endo-β-Galactosidaseverdauung (Fukuda et al., 1979, J. Biol. Chem. 254: 5458–5465), Methylierungsanalyse und ⁺Ionen-FAMS bestätigt.
Zellen und Bindungsversuch
CHO-Zellen, transfektiert mit E-Selectin-cDNA wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Handa, et al., 1995, Int. J. Oncol. 6: 773–781). E-Selectin exprimierende Transfektanten wurden durch Cytofluorometrie unter Verwendung von Anti-E-Selectin-mAb E1A isoliert. Inhibierung von E-Selectin abhängiger Zellhaftung wurden unter Verwendung von Anti-E-Selectin-mAb E1C bei 10 μg/ml Konzentration durchgeführt. Diese mAbs wurden durch Immunisierung von Mäusen BALB/c mit NS1-Zellen, welche E- oder P-Selectin exprimierten, hergestellt.
E-Selectin abhängige Zellhaftung von verschiedenen GSLs unter statischen Bedingungen auf Kunststoffplatte
Statische Haftungsversuche unter Verwendung von Platten mit 96 Löchern: Poly-LacNAc Gangliosiden (z. B. SLe^x-Le^x und Fr. 9, 10-1, 10-2 und 12-2), aufgelöst in 50% Ethanol, wurden aufeinanderfolgend in Platten von 96 Löchern (das erste Loch enthielt 200 ng) verdünnt, und die Platten wurden bei 37°C für 5 h (hr) getrocknet. Platten mit vergleichbaren Serienverdünnungen von Poly-LacNAc-gangliosiden wurden für Kontrollzellhaftung in Anwesenheit von mAb E1C hergestellt. E-Selectin exprimierende CHO-Zellen (Handa et al., 1995, Int. J. Oncol. 6: 773–781) wurden metabolisch markiert mit [³H]Thymidin und für 2 Tage inkubiert. Zellsuspension (2 × 10⁶ pro ml) wurden durch Behandlung mit 2 mM EDTA von kultivierten Zellen hergestellt. Eine Teilmenge von 50 μl dieser Zellsuspension (enthaltend 1 × 10⁵ Zellen; annähernd 5000 cpm [Ipm] wurden zu jedem Loch zugegeben und für 1 h (hr) inkubiert. Zur Kontrolle wurden EDTA-geerntete Zellen mit DMEM gewaschen und mit mAb E1C auf Eis für 30 min inkubiert, gefolgt von Herstellung einer Zellsuspension wie zuvor, welche jedoch 10 μg mAb E1C pro ml enthielt. Teilmengen wurden zu jedem Loch zugegeben und wie oben angegeben inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS durch Umdrehen der Platte auf Fließpapier gewaschen. Das Auszählen von anhaftenden Zellen, gemessen durch die Aktivität von ³H, wurde bestimmt.
E-Selectin abhängige Zellhaftung an Ganglioside. befestigt auf Polystyrolperlen unter statischen Bedingungen
Zur Beobachtung der statischen Haftung mit derselben Matrix, welche für den Versuch bei dynamischer Haftung verwendet wurde, wurde die folgende Arbeitsweise angewandt. Polystyrollatexperlen von 1 μm oder 4 μm Durchmesser (IDC Spheres^TM; IDC, Portland, OR), haftend an Mikroskopobjektträgern, wurden als Trägere für Poly-LacNAc-GSLs verwendet. 30 μl dieser Suspension von Perlen mit 4 μm Durchmesser (enthaltend 2 × 10⁹ Perlen/ml) oder 60 μl von Suspension von Perlen von 1 μm (enthaltend 1 × 10¹¹ Perlen/ml) wurden in Eppendorfröhrchen angeordnet und dreimal mit absolutem Ethanol gewaschen. Sedimentierte Perlen von 4 μm wurden in 500 ml Ethanol suspendiert, und sedimentierte Perlen von 1 μm wurden in 2 ml Ethanol suspendiert. 1 μl Teilmengen dieser Suspensionen wurden auf frisch geöffneten Mikroskopobjektträgern (Labcraft Superfrost^® Plus, Curtin Matheson Scientific, Houston, TX) angeordnet. Die Perlen wurden homogen auf der Glasoberfläche innerhalb eines kreisförmigen Flecks mit einem Durchmesser von annähernd 1 cm verteilt. Die Objektträger wurden auf 150°C für 50 sec erhitzt, dies bewirkte die feste Haftung der Perlen an der Oberfläche, so daß sie nicht durch Wasserströmung bei verschiedenen Geschwindigkeiten weggewaschen werden konnten. Ganglioside, aufgelöst in Isopropanol-Hexan-Wasser bei derselben molaren Konzentration wurden auf die Perlen, die auf den Objektträgern befestigt waren, aufgebracht; nämlich 1 μl Teilmengen, enthaltend 50–100 ng Gangliosid wurden im Zen trum des kreisförmigen Flecks angeordnet. Das Gangliosid wurde auf diese Weise auf der Oberfläche der Perlen befestigt. Objektträger wurden in 3% BSA in PBS für 1 h (hr) bei Zimmertemperatur eingetaucht, und dreimal mit PBS, das Ca²⁺/Mg²⁺ enthielt, gewaschen.
Über die Objektträger wurden 5 × 10⁵ CHO-Zellen, welche frisch geerntet worden waren und in RPMI-Kulturmedium suspendiert waren, für 15 min ohne Bewegung überschichtet. Das dreimalige Waschen mit RPMI war üblicherweise ausreichend, um nicht-haftende Zellen an den Perlen zu entfernen. Jedoch mußte sorgfältige mikroskopische Prüfung wiederholt werden, bis die auf Kontrollperlen angeordneten Zellen weggewaschen waren. Die Objektträger wurden dann mit 1% Glutaraldehyd in PBS fixiert und die Anzahl der Zellen wurde ausgezählt, welche an der Schicht der mit Poly-LacNAc-gangliosid beschichteten Perlen hafteten.
E-Selectin abhängige Zellreplikation und -haftung durch verschiedene GSLs unter dynamischen Strömungsbedingungen
Polystyrolperlen (4,2 ± 3,7% μm oder 1 μm) wurden hergestellt und an Mikroskopobjektträger unter Anwendung der oben beschriebenen Arbeitsweisen gebunden. In IHW aufgelöste Ganglioside bei derselben molaren Konzentration wurden auf die auf den Objektträgern befestigten Perlen aufgebracht; nämlich Teilmengen von 1 μl enthaltend 50–100 oder 0,05–0,1 ng Gangliosid wurde im Zentrum eines kreisförmigen Flecks angeordnet.
Die Objektträger wurden in PBS mit 3% BSA für 1 h (hr) bei Zimmertemperatur eingetaucht und dreimal mit Ca²⁺/Mg²⁺ enthaltendes PBS gewaschen. Die Objektträger wurden in einer Laminarströmungskammer mit parallelen Platten, verbunden mit einer Infusionspumpe (Modell 935, Harvard Apparatus, Cambridge, MA) angeordnet. Die Anordnung, wie von Lawrence et al., 1990, Blood 75: 227–237; Lawrence and Springer, 1991, Cell 65: 859–873, beschrieben, simuliert die Strömungsscherspannung, die bei physiologisch mikrovaskulären Umgebungen vorliegt. Eine laminare Strömung mit definierter Geschwindigkeit und Wandscherspannung wird durch Veränderungen der Infusionspumpe, welche mit dem Einlaß der Strömungskammer verbunden ist, erreicht. Eine Suspension von E- oder P-Selectin exprimierenden CHO-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/ml in 2A–2E, 2 × 10⁵ Zellen/ml in 5A, 5 × 10⁵ Zellen/ml in 5B, 4A und 4B) frisch geerntet aus Kultur mit EDTA, gewaschen und resuspendiert in RPMI Medium, das 1% FCS enthält, wurden in die Anordnung bei verschiedenen Laminarströmungsraten infusiert. Zellbewegungen wurden bei Umkehrphasenkontrastmikroskop (Diaphot-TMD, Nikon) beobachtet und in einem zeitversetzten Videokassettenrecorder aufgezeichnet. Die Zellreplikation und -haftung wurde beobachtet, und die Anzahl von replizierenden und haftenden Zellen während einer Periode von 2 min bei Scherspannungen von 0,6 bis 12,0 dyn/cm² wurden für wenigstens 10 Felder auf dem Videoband ausgezählt. Die Wandscherspannung (T) wurde mittels der Gleichung berechnet, die von Lawrence et al., 1990, Blood 75: 227–237 und Lawrence et al., 1987, Blood 70: 1284–1290: T = 3μQ/2ba², worin μ = Viskositätskoeffizient (1,0 cP), Q volumetrische Strömungsgeschwindigkeit (cm³/sec), a = Halbkanalhöhe (in diesem Fall 5,7 × 10^–3 cm) und b = Kanalbreite (1,3 cm) beschrieben ist.
Demonstration der direkten Bindung von E- oder P-Selectin an Myelorollinganglioside durch fluorometrische Analyse
5 × 10⁶ Polystyrolperlen (Durchmesser 4,2 ± 3,7% μm) (IDC Spheres^TM; IDC, Portland, OR) wurden mit Ethanol durch Zentrifugieren gewaschen. 1 μg von GSL in 50 μl Ethanol wurde zu den gewaschenen Perlen zugesetzt, und das Gemisch wurde unter Stickstoffströmung eingedampft. Die Perlen wurden in PBS(+) mit 1% BSA resuspendiert und zweimal durch Zentrifugieren ge waschen. Gewaschene Perlen wurden mit PBS(+) mit 3% BSA bei Zimmertemperatur für 2 h (hr) blockiert. Nach dem Zentrifugieren wurden die Perlen in PBS(+) mit 1% BSA und 0,1% Azid resuspendiert und bei 4°C gelagert. Gelbgrün fluoreszierende sulfatierte Latexperlen (Durchmesser 1 μm) (Molecular Probes, Inc., Portland, OR) wurden mit Ziegen-Antihuman-IgG (Fc-Fragment spezifisch) Antikörper (Jackson Immunoresearch Lab, West Grove, PA) entsprechend den Angaben des Herstellers beschichtet. Nach dem dreimaligen Waschen mit PBS wurden die Perlen mit PBS mit 3% BSA bei 4°C für 2 h (hr) blockiert. Blockierte Perlen (etwa 5 × 10⁸) wurden mit 1,5 ml von E- oder P-Selectin-Ig-fusionsprotein enthaltender überstehender Kulturflüssigkeit (etwa 1 μg/ml Fusionsprotein) aus CHO-Transfektanten (Handa et al., 1995, Int. J. Oncol. 6: 773–781) in einem Blutmischgerät bei 4°C für 6–18 h (hr) gemischt. Diese Mischarbeitsweise wurde drei weitere Male unter Verwendung von neuer überstehender Kulturflüssigkeit, welche das Fusionsprotein enthielt, wiederholt. Nach Waschen mit PBS wurden die Perlen in 1 ml PBS, das 50 μg Human-IgG (Jackson Immunoresearch) enthielt, inkubiert. Für die Herstellung von Kontrollperlen wurde Human-IgG mit 1 μg/ml anstelle von Fusionsprotein verwendet. Die mit Gangliosid beschichteten Perlen wurden mit den fluoreszierenden Perlen bei Zimmertemperatur für verschiedene Zeiten gemischt. Die resultierende Suspension wurde strömungscytometrischer Analyse unterworfen. Die Bedingungen eines jeden Versuchs sind unten im einzelnen aufgeführt.
6.2. Ergebnisse
E-Selectin abhängige Haftung unter statischen Bedingungen
Die Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen an Myelorollingangliosiden und SLe^x enthaltenden Gangliosiden unter statischen Bedingungen wurden nach zwei unterschiedlichen Methoden untersucht, wie in Materialien & Methoden beschrie ben, untersucht. Bei einer Methode wurden Ganglioside direkt an Löcher mit Platten mit 96 Löchern gefolgt von Blockieren durch BSA aufgeschichtet, und mit [³H]Thymidin markierte E-Selectin exprimierende Zellen wurden zugesetzt und bei Anwesenheit und Abwesenheit von Anti-E-selectinantikörpern inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, daß E-Selectin exprimierende Zellen an Oberflächen binden, welche mit SLe^x-Le^x beschichtet sind, jedoch nicht an die mit Myelorollin beschichteten (Fr. 10-1, 10-2, 9 und 12-2) unter statischen Bedingungen (1A). Die Anwesenheit von mAb E1C in der Bindungsreaktion hob die Bindung von E-Selectin exprimierenden Zellen an mit SLe^x-Le^x beschichteten Oberflächen auf.
Zusätzliche Einzelheiten des Experimentes, dessen Werte in 1A gezeigt sind, waren wie folgt: SLe^x-Le^x und Poly-LacNAc-ganglioside (Fr. 9, 10-1, 10-2 und 12-2), aufgelöst in 50% Ethanol, wurden geeignet verdünnt und auf Löcher von 96er-Lochplatten (Mengen von 25 bis 200 ng, wie auf der Abszisse gezeigt) aufgeschichtet. Die Löcher wurden bei 37°C für 5 h (hr) getrocknet. Zwei identische Platten (1 und 2) wurden wie folgt hergestellt. Bei Platte 1 wurden Teilmengen von 50 μl von RPMI, enthaltend 1 × 10⁵ E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen, metabolisch markiert mit [³H]Thymidin, zu den Löchern zugegeben. In Platte 2 wurden Teilmengen von 50 μl von RPMI, enthaltend 1 × 10⁵ E-Selectin exprimierende CHO-Zellen und mAb E1C-Zellen, vorinkubiert mit Anti-E-selectin-mAb-E1C (10 μg Ig pro ml), zu den Löchern zugegeben.
Die Platten 1 und 2 wurden für 25 min inkubiert und mit PBS wie folgt gewaschen. Jedes Loch wurde mit 200 μl PBS gefüllt, sorgfältig geschüttelt, und die Platten wurden auf Fließpapier für 10 min umgedreht. Alle nicht-haftenden Zellen wurden sedimentiert und absorbierten auf dem Fließpapier. Haftende Zellen, zurückgeblieben auf den Löchern, wurden ausgezählt. Die Zellzahlen wurden berechnet, basierend auf der gemessenen Radioaktivität.
Die andere Methode verwendete Polystyrolperlen (1 μm Durchmesser), befestigt auf Glasmikroskopobjektträgern). Ganglioside wurden quantitativ auf den Perlen adsorbiert. Zu dieser Matrix wurden nicht-radioaktiv markierte E-Selectin exprimierende CHO-Zellen zugesetzt, inkubiert, gewaschen, und die Anzahl der anhaftenden Zellen wurden ausgezählt, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Die Ergebnisse waren wie folgt. SLe^x-Le^x (VI³NeuAcV³FucIII³FucnLc₆Cer) zeigten schwach stärkere Haftung von Zellen als Fr. 13-1 (X³NeuAcVII³FucV³FucnLc₁₀Cer; Str. 7). Fr. 14 (eine Mischung von Str. 9, 10, 11 und 12) zeigte mäßige Haftung (schwach geringer als SLe^x-Le^x). Unter denselben Bedingungen zeigten Fr. 10-1 (VIII³NeuAcV³FucnLc₈Cer; Str. 4), Fr. 10-2 (VIII³NeuAcIII³FucnLc₈Cer; Str. 5) und Fr. 12-2 (X³NeuAcVII³FucnLc₁₀Cer) sehr viel schwächere Haftung von Zellen als Fr. 13-1 oder Fr. 14 (1B). Sialosyl-poly-LacNAc-produkte ohne interne Fucosylierung (z. B. VI³NeuAcnLc₆Cer; Fr. 7) zeigten keine Haftung von Zellen.
Wichtige Feststellungen, gezeigt in den 1A und 1B sind, daß unter statischen Bedingungen: 1) SLe^x-Le^x sehr viel stärkere Haftungsaktivität als Myelorollin (Fr. 13-1 und 14) zeigt; 2) Sialosyl-poly-LacNAc mit einzelner interner α1→3-Fucosylierung (Fr. 9, 10-1, 10-2 und 12-2) und Sialosyl-poly-LacNAc ohne Fucosylierung (Fr. 7) zeigen geringe oder keine Haftungsaktivität, und 3) mAb E1C blockiert die Haftung von E-Selectin exprimierende Zellen an Oberflächen, die mit SLe^x-Le^x beschichtet sind.
E-Selectin abhängige Zellbindung an Ganglioside, gebunden an Polystyrolperlen unter dynamischen Strömungsbedingungen
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Ergebnissen erfolgte Replizieren und Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen auf Perlen, die mit Fr. 10, 13-1 und 14 (enthaltend Str. 4–5, Str. 7–8 bzw. Str. 9–12) beschichtet waren, unter dynamischen Strömungsbedingungen. Polystyrolperlen wurden an Glasmikroskopobjektträger gebunden. Verschiedene Ganglioside wurden aufgeschichtet, wie in Materialien & Methoden beschrieben. Objektträger wurden durch Anordnen in 1% oder 2% Rinderserumalbumin in PBS für 1 h (hr) blockiert, und dann in einer Kammer mit paralleler Laminarströmung, wie in Materialien & Methoden angegeben, angeordnet. E-Selectin exprimierende CHO-Zellen wurden frisch geerntet und in RPMI-Medium (1 × 10⁵ Zellen) suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in einer Infusionspumpe angeordnet, die mit der Strömungskammer verbunden war, und in die Anordnung bei verschiedenen Laminarströmungsraten infusiert. Zellbewegungen wurden unter Phasenkontrastmikroskop beobachtet und mittels Videokassettenrecorder aufgezeichnet. Anzahl von replizierenden Zellen in wenigstens 10 Mikroskopfeldern wurden ausgezählt, und Durchschnittszahlen wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in 4C gezeigt.
Die Zellreplikation war am stärksten auf Perlen, die mit Fr. 10 oder 14 beschichtet waren, wobei diese Myelorollinstruktur haben und ihnen SLe^x-Epitop fehlt (4C). Das Replizieren war besonders evident bei 2,4 und 4,8 dyn/cm² Scherspannungen. Kein Replizieren wurde auf mit SLe^x-Le^x beschichteten Perlen beobachtet, unabhängig von der Scherspannung. Dies ist in starkem Gegensatz zu signifikantem Replizieren, gefolgt von Haftung, die bei Perlen beobachtet wurde, welche mit Myelorollin Fr. 13-1 oder Fr. 14 beschichtet sind. Unter dynamischen Strömungsbedingungen haben Perlen, beschichtet mit SLe^x-Le^x Zellen gebunden, jedoch in einem geringeren Ausmaß als Perlen, welche mit den Myelorollinfraktionen beschichtet sind. Es gab überhaupt keine Zellhaftung an Perlen, die mit Str. 1 oder 2 beschichtet waren.
E-Selectin abhängiges bloßes Replizieren, Replizieren gefolgt von Haftung und Haftung in einem dynamischen Strömungssystem unter verschiedenen Scherspannungen sind in den 6A und 6B miteinander verglichen. Geringes oder kein Replizieren wurde auf mit SLe^x-Le^x beschichteten Perlen beobachtet, unabhängig von Scherspannung (12 bis 1,2 dyn/cm²). Eine kleine Anzahl von Zellen (weniger als 5/Feld) hafteten, zeigten jedoch keine Replikation. Im Gegensatz dazu traten signifikante Zahlen von nur replizierenden Zellen auf den mit Myelorollin beschichteten Perlen unter Scherspannungsbedingungen (4,8 und 12 dyn/cm²) auf. Die Anzahl von Zellen, welche nur Replikation und Replikation gefolgt von Haftung zeigten, war am höchsten bei 2,4 dyn/cm² für sämtliche getestete Myelorolline (Fr. 13-1, Fr. 14 und Fr. 10). Bei Scherspannungsbedingungen (0,6 und 1,2 dyn/cm²) nahm die Anzahl von replizierenden Zellen gefolgt von Haftung stark zu.
Unter Bezugnahme auf die 6A und 6B ist mehr im einzelnen die Anzahl von nur replizierenden Zellen und replizierenden Zellen gefolgt von Haftung unter definierten Wandscherspannungsbedingungen (12, 4,8, 2,4, 1,2 und 0,6 dyn/cm²) in dem Block mit dem spiralförmigen Pfeilsymbol angezeigt. 6A: Panel I, Zellhaftung an Sle^x-Le^x (Sdiy²). Es gab keine Replikation unter irgendeiner der untersuchten Scherspannungsbedingungen. Niedriger Wert von Haftung ohne Replizieren wurde bei 4,8 bis 1,2 dyn/cm² unter Scherspannung beobachtet. Keine Variation in der Zahl von haftenden Zellen bei unterschiedlichen Wandscherspannungen. a, Anzahl von replizierenden Zellen; b nicht-replizierende haftende Zelle. Panel II, nur replizierende Zelle und replizierende Zelle gefolgt von Haftung an Perlen, beschichtet mit Gangliosid Fr. 13-1 (Str. 7). Die Replikation war maximal bei 2,4 dyn/cm², und sie nahm bei niedrigerer Scherspannung ab. a, Anzahl von replizierenden Zellen; b, Anzahl von replizierenden Zellen gefolgt von Haftung. 6B: Panel III, nur replizierende Zelle und replizierende Zelle gefolgt von Haftung an Perlen, beschichtet mit Fr. 14, wobei dies eine Mischung von Strukturen 9, 10, 11 und 12 ist. Hohe Replikation gefolgt von Haftung wurde bei 2,4 bis 1,2 dyn/cm² beobachtet. a, Anzahl von replizierenden Zellen; b, Anzahl von replizierenden Zellen gefolgt von Haftung. Panel IV, nur replizierende Zelle und replizierende Zelle gefolgt von Haftung an Perlen, beschichtet mit einer Mischung von Fr. 10-1 und 10-2, wobei dies eine Mischung von Strukturen 4 und 5 ist. Maximale Replikation gefolgt von Haftung wurde bei 2,4 dyn/cm² beobachtet. a, Anzahl von replizierenden Zellen; b, Anzahl von replizierenden Zellen gefolgt von Haftung.
Replikation und Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen unter dynamischen Strömungsbedingungen
2A und 2E zeigen die Ergebnisse des Replizierens und der Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen unter Scherspannungsbedingungen vergleichbar zu denjenigen, die im oben beschriebenen Experiment erhalten wurden. 2A zeigt, daß haftende, jedoch nicht replizierende Zellen auf mit SLe^x-Le^x beschichteten Perlen bei allen Scherspannungen vorhanden waren.
2B zeigt die Ergebnisse des Replizierens und der Haftung von Zellen auf mit Fr. 12-2 beschichteten Perlen. Die Replikation war am höchsten bei 4,8 dyn/cm². Sowohl Replikation als auch Haftung waren niedriger als diejenigen auf Perlen, die mit Fr. 13-1 oder 14 (2C bzw. 2E) aufgeschichtet waren, jedoch vergleichbar zu denjenigen auf Perlen, die mit SLe^x-Le^x beschichtet waren.
2C zeigt die Ergebnisse der Replikation und der Haftung von Zellen auf mit Fr. 13-1 (Str. 7) beschichteten Perlen. Die Anzahl von replizierenden Zellen war größer bei 4,8 und 2,4 als bei 1,2 dyn/cm².
2D zeigt die Ergebnisse der Replikation und der Haftung von Zellen auf mit Fr. 13-1 beschichteten Perlen. Die Anzahl von replizierenden Zellen war am höchsten bei 4,8 dyn/cm². Haftung war höher und Replikation war niedriger bei 1,2 dyn/cm².
2E zeigt die Ergebnisse der Replikation und der Haftung von Zellen auf mit Fr. 14 beschichteten Perlen. Die Replikation und die Haftung waren am höchsten bei 2,4 und 4,8 dyn/cm². Die Replikation war niedriger bei 1,2.
Myelorollinanaloge zeigten höhere E-Selectin-abhängige Replikation und Haftung als SLe^x-Le^x unter dynamischen Strömungsbedingungen bei physiologischer Scherspannung
100 ng von Poly-LacNAc-gangliosid (Fr. 13-1, Fr. 14 oder SLe^x-Le^x) wurden an Perlen angebunden, die auf Mikroskopobjektträgern befestigt waren, diese wurden dann in dem dynamischen Strömungssystem, wie in Materialien & Methoden beschrieben, angeordnet. Das Replizieren und die Haftung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen wurde in diesem System unter verschiedenen Scherspannungen beobachtet. Die Neigung zur Zellhaftung an mit Poly-LacNAc-gangliosiden beschichtete Perlen war im wesentlichen vergleichbar für die Perlen mit 4 μm und 1 μm (2C bzw. 2D). Fr. 13-1 oder Fr. 14 erzeugten starke Replikation und Haftung bei 4,8 oder 2,4 dyn/cm². Die Anzahl von replizierenden Zellen war niedriger bei 1,2 dyn/cm² (2C, 2D und 2E). Die Anzahl von haftenden Zellen auf mit SLe^x-Le^x beschichteten Perlen war signifikant niedriger als diejenige, die mit Fr. 13-1 oder 14 beschichtet waren. Keine replizierenden Zellen wurden mit Perlen beobachtet, die mit SLe^x-Le^x beschichtet waren (2A).
Eine Reihe von Experimenten über Replizieren/Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen an verschiedene Ganglioside unter dynamischen Strömungsbedingungen zeigen, daß SLe^x enthaltende Strukturen kein Replizieren hervorrufen. Sialosylpoly-LacNAc mit nur einem α1→3-gebundenen Fuc an unterschiedlichen GlcNAc, wie in Fr. 10 und 14 gefunden, ergab starkes Replizieren. Fr. 13-1, wobei dies in wesentlich reine Komponente mit zwei α1→3-Fuc-resten ist, bewirkte ebenfalls starke Replikation. Replizierende Zellen wurden ausgezählt, ausgeschlossen anhaftende Zellen, und die Ergebnisse sind in 4C angegeben.
MISCHUNGEN VON Myelorollin bewirkte bessere Replikation und Haftung als gereinigtes Myelorollin
Die in den 3A, 4B, 4C, 5A, 5B, 6A und 6B gezeigten Werte der Zellreplikation und -haftung unter dynamischen Bedingungen beziehen sich auf Mischungen von Myelorollinen (ausgenommen die sich auf SLe^x-Le^x beziehenden Werte). Weitere Untersuchungen zeigen, daß "Myelorollinmischungen" eine sehr viel höhere Fähigkeit zeigen, E-Selectin abhängiges Replizieren gefolgt von Haftung herbeizuführen, als gereinigtes Myelorollin (siehe Tabelle 2).
Myelorollinmischungen haben ebenfalls stärkere Haftungsaktivität als gereinigtes Myelorollin unter statischen Bedingungen. Beispielsweise zeigt Fr. 11, eine reine Verbindung von Str. 6, schwache Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen, während Fr. 10, eine Mischung von Str. 4 und 5, eine bemerkenswert stärkere Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen zeigt (3A).
Direkte Bindung von Myelorollin an E- und P-Selectin, bestimmt durch Strömungscytometrie
In den vorangegangenen Untersuchungen waren Poly-LacNAc-ganglioside, welche zwei α1→3-Fuc-reste haben (z. B. Fr. 12-3, 13-1 und 14), nur in der Lage, E-Selectin exprimierende Zellen unter statischen Bedingungen zu binden. Es wurde keine Zellhaftung an Poly-LacNAc-ganglioside beobachtet, welche einen einzelnen α1→3-Fuc-rest an interner GlcNAc (Fr. 9, 10 und 12-1) hatten, unter statischen Bedingungen (Stroud et al., 1995, Biochem Biophys Res. Commun 209: 777–778; Stroud et al., Biochemistry 35: 758–769 und Stroud et al., 1996, Biochemistry 35: 770–778). Diese Ergebnisse wurden durch die Werte von nachfolgenden Experimenten bestätigt, welche in 1A und 1B gezeigt sind.
Im Gegensatz dazu banden unter dynamischen Strömungsbedingungen Poly-LacNAc-ganglioside, welche einen einzelnen α1→3-Fuc-rest an interner GlcNAc hatten (Fr. 9, 10 und 12-1), an E-Selectin exprimierenden Zellen und bewirkten starke Replikation. Da diese Myelorollinfraktionen größere Zelloberflächenkomponenten von Neutrophilen und HL60-Zellen sind, ist es wichtig, ihre E-Selectin-Bindungsfähigkeit nach anderen Methoden zu bestätigen.
Haftung von E- oder P-Selectinbindung an verschiedene Ganglioside wurde durch eine neue empfindliche Methode unter Verwendung von mit E- oder P-Selectin beschichteten fluoreszierenden Perlen bestätigt. Haftung wurde durch Aggregation von Polystyrolperlen, beschichtet mit Myelorollin und mit Selectin beschichteten fluoreszierten Perlen bestimmt. Ganglioside wurden auf nicht-fluoreszierende Polystyrolperlen aufgeschichtet und mit fluoreszierenden Perlen, die mit E- oder P-Selectin in Anwesenheit oder Abwesenheit von EDTA beschichtet waren, gemischt. Da Aggregation unter kurzem starkem Inbewegunghalten auftritt, ist das Verfahren weder "statische" noch "dynamische" Haftung, bei welchem Myelorollin als unbewegliche feste Phase vorhanden ist. Die Bindung wurde durch Cytofluorometrie bestimmt. Der Bindungsindex wurde als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Gangliosidfraktion, dividiert durch MFI von Sialylparaglobosid (IV³NeuAcnLc₅Cer), bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 3A gezeigt. Die Bindung von mit Myelorollin beschichteten Perlen an mit E-Selectin beschichtete Perlen wurde vollständig bei Anwesenheit von EDTA aufgehoben; Myelorollin beschichtete Perlen waren nicht in der Lage, mit P-Selectin beschichtete Perlen zu binden. Mit einer Mischung von Str. 4 und 5 beschichtete Perlen, welche keinen SLe^x-Terminus haben, sondern intern α1→3-fucosyliert bei GlcNAc-III und GlcNAc-V sind, binden stark an mit E-Selectin beschichtete Perlen. Perlen, beschichtet mit Fr. 13-1 (enthaltend Str. 7 und 8 in einem Verhältnis von 10 : 1) und mit Fr. 14, enthaltend Myelorollin Str. 9–12, zeigten ebenfalls klare Bindung an mit E-Selectin beschichtete Perlen. Im Gegensatz dazu zeigten Perlen, beschichtet mit Fr. 7 (enthaltend Str. 1) oder mit Fr. 8 (enthaltend Str. 2), welche keine interne Fucosylierung haben, keine Bindung an mit E-Selectin beschichtete Perlen. Mit Str. 3 beschichtete Perlen, welche SLe^x-Terminus mit interner α1→3-Fucosylierung hatten, zeigten keine Bindung an mit E-Selectin beschichtete Perlen, wie erwartet.
3B zeigt den Inhibitoreffekt von einem Anti-E-selectinantikörper auf das Binden von mit E-Selectin beschichteten Perlen an Perlen, beschichtet mit verschiedenen Myelorollinfraktionen. E1C war eine der Anti-E-selectin-mAbs, ausgewählt basierend auf dem Inhibitoreffekt auf E-Selectin-Bindung an HL60-Zellen. Der Einschluß von mAB E1C bei der Bindungsreaktion vereitelte im wesentlichen das Binden von mit E-Selectin beschichteten Perlen an Perlen, welche mit irgendeinem der untersuchten Ganglioside beschichtet waren (3B).
Verbesserte Haftung und Replikation von Zellen auf zwei Poly-LacNAc-ganglioside mit Fucosyl α1→3-gebunden an unterschiedlichen GlcNAc-resten
Die 5A und 5B zeigten die synergistischen Effekte der Kombination von Myelorollinen auf die Haftung und die Replikation von E-Selectin exprimierenden Zellen. Fr. 10-1 und 10-2 sind Poly-LacNAc-ganglioside, welche α1→3-Fucosylierung an GlcNAc-V bzw. GlcNAc-III haben. Mit 100 ng von jeder Fraktion beschichteten Perlen bewirkten vergleichbare Zellreplikation und -haftung bei 4,8 und 2,4 dyn/cm² (5A, Plot 1 und 2). Mit Mischungen von 50 ng von jedem von Fr. 10-1 und 10-2 beschichtete Perlen bewirkten höhere Zellreplikation und -haftung bei denselben Scherspannungen (Plot 3). Statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen drei Plots (P-Werte von ungepaartem t-Test nach Student) sind in der eingesetzten Tabelle in 5A gezeigt.
Der synergistische Effekt einer Mischung von Fr. 10-1 und Fr. 10-2, verglichen mit jeder Fraktion alleine, auf die Zellreplikation und -haftung war evidenter, wenn Fr. 10-1 und Fr. 10-2 bei 1000-fach niedrigeren Konzentrationen verwendet wurden. (5B). Fr. 10-2 erzeugte bei diesem niedrigen Wert (0,1 ng pro Spot) immer noch eine geringe Zellreplikation und -haftung (5B, Plot 2), jedoch taten dies Fr. 10-1 nicht (Plot 1). Im Gegensatz dazu bewirkte eine Mischung von 0,05 ng von jedem von Fr. 10-1 und 10-2 signifikante Zellreplikation und -haftung bei physiologischer Scherspannung (2,4 – 4,8 dyn/cm²) (Plot 3). Statistische Signifikanz zwischen Plots (P-Werte von ungepaartem t-Test nach Student) sind in der eingesetzten Tabelle von 5B gezeigt.
Vergleich der Zellreplikation und -haftung bei niedrigen Konzentrationen von SLe^x-Le^x und einer Mischung von Fr. 10-1 und Fr. 10-2
4A zeigt, daß 0,05 ng von SLe^x-Le^x (der Verbindung, welche die stärkste Haftung unter statischen Bedingungen erzeugte) keine Replikation oder Haftung unter dynamischen Bedingungen bei zwei Wiederholungsexperimenten (Plot 1 und 2) bewirkte. Im Gegensatz, 4B zeigt, daß 0,05 ng von jedem von Fr. 10-1 und Fr. 10-2 hohe Zellreplikation und -haftung bei denselben Scherspannungen (Plot 1 und 2) ergab. Weitere Experimente zeigten, daß 0,1 ng von SLe^x-Le^x keine Zellreplikation oder -haftung bewirkte.
6.3 Diskussion
Expression von E- und P-Selectin auf Ecs im Ansprechen auf Entzündungstimuli bewirkt Wechselwirkung von Ecs mit Neu trophilen oder anderen Leukocyten, was eine Replikation gefolgt von Haftung und transendotheler Migration von Leukocyten ergibt. Es wurde angenommen, daß E-Selectin-abhängige Replikation gefolgt von Haftung und E-Selectin-abhängige Haftung durch Erkennen des SLe^x-Epitops, exprimiert auf Leukocyten durch E-Selectin gemildert werden könnten. Dieses Konzept basierte auf verschiedenen Beobachtungen, welche jedoch nicht unzweideutige chemische Identifizierung des realen Kohlehydratepitops, das auf Neutrophilen vorliegt, einschließt. Human-Neutrophile, andere Leukocyten und leukämische Leukocytenzelllinien (HL60 und U937) zeigen starke Reaktivität mit verschiedenen mAbs, zuvor beansprucht als auf SLe^x gerichtet. Jedoch sind die Mengen von chemisch nachweisbarem SLe^x in diesen Zellen extrem klein. ⁺Ionen-FABMS von permethylierten Nebenketten von N-gebundenen Strukturen in leukämischen Leukocyten ergaben ein kaum nachweisbares m/z 999 Signal, was SLe^x-Struktur darstellt (Fukuda et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 10925–10935). Die Anwesenheit von SLe^x in Nebenketten von N- oder O-gebundenen Strukturen in Neutrophilen oder myelogenen Leukämiezellen wurde angenommen (Asada et al., 1991, Biochemistry 30: 1561–1571; Patel et al., 1994, Biochemistry 33: 14815–14824), dies wurde jedoch nicht durch unzweideutige chemische Analyse gestützt.
Unsere neueren systematischen Untersuchungen an Gangliosiden von normalen Humanleukocyten und promyelogenen Leukämie-HL60-Zellen haben angezeigt, daß nur unverzweigte Monosialoganglioside, welche Kerne mit > 10 Zucker haben, für die Bindung von E-Selectin verantwortlich sind (Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209: 777–787). Ganglioside mit SLe^x-Struktur (z. B. IV³NeuAcIII³FucnLc₄Cer, VI³NeuAcV³FuncnLc₆Cer, VI³NeuAcV³FucIII³FucnLc₆Cer), welche übermäßig in verschiedenen Typen von festem menschlichem Krebs vorhanden sind (Yang und Hakomori, 1971, J. Biol. Chem. 246: 1192–1200; Fukushi et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 10511–10517), fehlten vollständig bei Leukocyten und HL60-Zellen. Unter langkettigen PLA-Lipiden mit 8-, 10- oder 12-Zuckerkernen fehlten Strukturen, welche SLe^x-Epitop ohne interne Fucosylierung hatten (z. B. VIII³NeuAcVII³FucnLc₈Cer, X³NeuAcIX³FucnLc₁₀Cer, XII³NeuAcXI³FucnLc₁₂Cer), vollständig. Stattdessen gab es Spurenkomponenten mit SLe^x mit interner Fucosylierung (z. B. X³NeuAcIX³FucVII³FucnLc₁₀Cer) (Stroud et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209: 777–787). Die in Leukocyten und HL60-Zellen vorhandenen Hauptstrukturen waren eine Reihe von nicht-verzweigten langkettigen PLAs, welche terminale α2→3-Sialylierung und interne α1→3-Fucosylierung hatten mit den repräsentativen Strukturen A, B, C, D, X und Y, welche unten gezeigt sind.
worin → kovalente Bindung anzeigt; R ein Ceramidrest ist.
Struktur A ist gemeinsam mit Str. 4 und 6. Struktur B ist gemeinsam mit Str. 5 und 10. Struktur C ist gemeinsam mit Str. 7 und 11. Struktur D findet sich in str. 12. Keine dieser vier Strukturen enthält SLe^x-Epitop.
Struktur A war zuvor in Gangliosiden gefunden worden, welche aus chronischen myelogenen Leukämiezellen (Fukuda et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 10925–10935) und aus menschlichem Dickdarmkrebs isoliert worden waren, und sie wurde als ACFH-18-Antigen identifiziert (Nudelman et al. 1988. J. Biol. Chem. 263: 13942–13951). Struktur A wurde ebenfalls identifiziert, als definiert durch mAb "VIM-2" (Macher et al., 1988. J. Biol. Chem. 263: 10186–10191) und sie wurde einmal beansprucht, das E-Selectin bindende Epitop zu sein (Tiemeyer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1138–1142). Weil jedoch VIM-2-positive, SLe^x-negative CHO-Zellen keine E-Selectin-abhängige Haftung zeigten (Lowe et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 17467–17477; Walz et al., 1990, Science 250: 1132–1135), ist VIM-2-Epitop wahrscheinlich nicht bei einer solchen Haftung beteiligt. Eine Möglichkeit für das VIM-2-Antigen als ein potentieller E-Selectinligand wurde durch die Tatsache geleugnet, daß VIM-2-Antikörper nicht in der Lage waren, Haftung zu blockieren, und Zellen, welche das VIM-2-Antigen jedoch nicht die SLe^x-Strukturen enthielten, waren nicht in der Lage, an rekombinantes E-Selectin und an aktivierte Endothelzellen zu binden (Lowe et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 17467–1744; Walz et al., 1990, Science 250: 1132–1135). Tatsächlich zeigen Gangliosid Str. 4 und 6, welche VIM-2-Epitope haben, keine nennenswerte Haftung unter statischen Bedingungen.
Wir führten jetzt einen neuen Versuch ein, basierend auf der Wechselwirkung zwischen Latexperlen, beschichtet mit Gangliosiden, und fluoreszenten Perlen, beschichtet mit E- oder P-Selectin-Ig-fusionsprotein. Die Wechselwirkung kann leicht durch Strömungscytometrie mit geeignetem Ausfiltern überwacht werden. Unter Anwendung dieses Versuches wurde ge funden, daß Mischungen von Fr. 10-1 und 10-2 (enthaltend Str. 4 und 5), Fr. 13-1 (enthaltend hauptsächlich Str. 7) und Fr. 14 (enthaltend Str. 9 und 11 als Hauptkomponenten) stark an E-Selectin binden. Von besonderer Wichtigkeit ist die Beobachtung, daß eine Mischung von unterschiedlichen Typen von Myelorollin die Replikation gefolgt von Haftung stark förderten. Dies wird klar gezeigt, nicht nur durch die strömungscytometrische Methode, sondern auch durch Zellhaftung in einer dynamischen Strömungskammer (siehe Tabelle 2).
Tabelle 2. Anzahl von E-Selectin exprimierenden Zellen, haftend an Myelorollin unter dynamischer Strömung (0,6 bis 1,2 dyn/cm²)
Zusammenfassend, Str. 1 und 2 (welche keine interne Fucosylierung haben) zeigten überhaupt keine Bindung an mit E-Selectin beschichteten Oberflächen. Unter diesen Fraktionen enthielt nur Fr. 13-1 eine Spurenmenge von Str. 8 (welches SLe^x-Determinante an dem Terminus hat, jedoch ebenfalls interne Fucosylierung). Keine der anderen E-Selectin bindenden Fraktionen enthielt SLe^x-Epitop. Str. 3 (übermäßig vorhanden in menschlichem festem Krebs wie Dickdarm-, Magen- und Langkarzinomen), welche SLe^x und interne Fucosylierung besitzen, binden an mit E-Selectin beschichtete Oberflächen.
Monosialoganglioside mit terminalen α2→3-sialylierten und internen α1→3-fucosylierten PLAs sind die Hauptkomponenten von Neutrophilen und myelogenen Leukämiezellen, und sie werden kollektiv als "Myelorollin" bezeichnet. MAbs FH6 (Fukushi et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 10511–10517), CSLEX (Fukushima et al., 1984, Cancer Res. 44: 5279–5285) und SNH3 und SNH4 (Muroi et al., 1992, Blood 79: 713–719), zuvor identifiziert als auf SLe^x-Determinante gerichtet, wurden als reagierend mit allen Myelorollinen gefunden. Es gibt kein mAb spezifisch für SLe^x, d. h. nicht kreuz-reagierend mit irgendeinem Myelorollin. Die Spezifität dieser mAbs wird untersucht.
Wir verglichen die Replikation und die Haftung von E- und P-Selectin exprimierenden CHO-Zellen bei mit Gangliosid beschichteten Latexperlen, gebunden an mikroskopische Objektträger unter dynamischen Strömungsbedingungen und statischen Bedingungen. Nur Myelorollin (in der Mischung von Fr. 10-1 und Fr. 10-2, Fr. 13-1 oder Fr. 14) erzeugten Replikation von Zellen gefolgt von Haftung unter dynamischen Strömungsbedingungen. Fr. 10 und 14, welche nur aus Myelorollin ohne Spuren von SLe^x bestehen, zeigten die stärksten Replikations- und Haftungseffekte, insbesondere bei 0,6 bis 2,4 dyn/cm² Scherspannung. Str. 3, welches SLe^x-Epitop mit interner Fucosylierung besitzt, erzeugte einen niedrigeren Wert von Haftung und keine Zellreplikation. Unter statischen Bedingungen bewirkte im Gegensatz dazu Str. 3 sehr viel höhere Haftung als Myelorollin.
Da Zellhaftung im Anschluß an Replikation (Replikation gefolgt von Haftung) als ein charakteristisches Merkmal für von Selectin abhängiges Replizieren und Haftung ist, nehmen wir an, daß Myelorollin, wie durch Str. 4, 5, 7 10, 11, etc. beispielhaft gezeigt, eine Hauptrolle bei der Haftung von Leukocyten, gemildert durch Selectinexpression auf ECs spielt. Diese Schlußfolgerung basiert auf den Tatsachen, daß (i) Myelorollin die Hauptstruktur ist, welche in Leukocyten und HL60-Zellen vorliegt. (ii) Nur Myelorollin (nicht SLe^x mit oder ohne interne Fucosylierung) Zellreplikation gefolgt von Haftung erzeugt; (iii) SLe^x ohne interne Fucosylierung vollständig bei Neutrophilen und HL60-Zellen fehlt.
In unserer Untersuchung zeigten nur Fraktionen mit terminaler α2→3-Sialylierung und mehrfacher interner α1→3- Polyfucosylierung (z. B. die Strukturen C und D oben, oder eine Mischung dieser Strukturen) klare E-Selectinbindung bei Anwendung von TLC-Überlagerungstechnik mit ³²P-markierten CHO-Zellen, permanent exprimierend E- oder P-Selectin. Poly-LacNAc mit Terminierung α2→3-Sialylierung und interner α1→3-Monofucosylierung (z. B. Strukturen A und B) zeigten keine E-Selectinbindung unter diesen Bedingungen. Diese Bindungseigenschaften wurden in einem statischen System zur Haftungsuntersuchung unter Verwendung von E-Selectin exprimierenden CHO-Zellen bestätigt, welche auf Glycolipiden überlagert waren, beschichtet auf Polystyrolperlen, befestigt an Glasplatten. Glycolipid mit typischer Sle^x-Struktur (SLe^x-Le^x; VI³NeuAcV³FucIII³FucnLc₆Cer) zeigten die höchste Haftung in dem statischen System. Im Gegensatz dazu zeigte bei einem dynamischen Strömungssystem unter Verwendung der gleichen mit Glycolipid beschichteten Perlen, gebunden an Glasplatten, SLe^x-Le^x keine Replikation und nur schwache Haftung verglichen mit Fr. 10-1, 10-2, 13-1 und 14. Starke Replikation und Haftung von Zellen wurde beobachtet, wenn die Strukturen X und Y verwendet wurden. Typische Beispiele sind Fr. 10-1, 10-2, Fr. 13-1 und Fr. 14 (Mischungen von Strukturen A, B, C und D) erzeugten ebenfalls starke Replikation und Haftung unter physiologischen Scherspannungsbedingungen.
Aufgrund des Auffindens, daß eine Mischung von Myelorollinstrukturen (z. B. Fr. 14) die stärkste Replikation und Haftung unter physiologischen Scherspannungsbedingungen erzeugt, untersuchten wir intensiv Fr. 10-1, Fr. 10-2 und eine Mischung von gleichen Mengen von Fr. 10-1 und 10-2. Replikation und Haftung, hervorgerufen durch 100 ng von reinem Fr. 10-1 und Fr. 10-2 unter physiologischer Scherspannung waren miteinander vergleichbar. Interessanterweise erzeugte eine Mischung von jeweils 50 ng dieser zwei Komponenten sehr viel höhere Replikation und Haftung, insbesondere unter physiologischer Scherspannung. Dieser Trend war auffälliger, wenn sehr viel kleinere Mengen von Glycolipiden verwendet wurden. Die dramatischste Steigerung wurde gefunden, wenn 0,05 ng von jedem Fr. 10-1 und 10-2 verwendet wurden, verglichen mit 0,1 ng von jeder der Komponenten alleine. Diese Feststellungen legen es nahe, daß extrem geringe Mengen von Fr. 10-1 und 10-2 miteinander unter Bildung einer geeigneten Struktur für E-Selectin bewirkende Replikation und Haftung unter dynamischen Strömungsbedingungen in Wechselwirkung treten können. Der Mechanismus für diesen synergistischen Effekt bleibt unbekannt.
SLe^x-Le^x-Struktur, welche die stärkste E-Selectin-abhängige Haftung unter statischen Bedingungen erzeugte, war schwächer als Myelorollinstrukturen unter dynamischen Strömungsbedingungen (vgl. 2A gegen 2C, 2D und 2E). Der Unterschied war bei sehr niedriger Konzentration noch ausgeprägter. SLe^x-Le^x bei einer Konzentration von 0,05 ng bewirkte im wesentlichen keine Zellreplikation und -haftung (4A), während eine Mischung von Fr. 10-1 und 10-2 (jeweils 0,05 ng, was dieselbe Molarität wie 0,05 ng SLe^x-Le^x ergibt) starke Replikation und Haftung bewirkten (4B). Die Steigerung durch eine Mischung von Fr. 10-1 und 10-2 im Vergleich zu jeder Fraktion alleine war stärker ausgeprägt, wenn niedrige (d. h. 0,05–0,1 ng) als hohe Konzentration (50–100 ng) verwendet wurde. Im Gegensatz zu den Effekten von Fr. 10-1 und 10-2 bewirkte SLe^x-Le^x bei niedriger Konzentration (d. h. 0,05–0,1 ng) überhaupt keine Replikation oder Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß Myelorollin, statt SLe^x-Le^x, der Hauptligand für die E-Selectin-abhängige Replikation und Haftung von Myeloidzellen auf vaskulären Endothelzellen unter physiologischen dynamischen Strömungsbedingungen ist.
Unsere Ergebnisse legen ebenfalls eine Erklärung nahe, warum eine Reihe von Poly-LacNAc-strukturen mit unterschiedlicher Anordnung von α1→3-Fucosylierung und terminaler Sialylierung vorhanden sind und Ordnungen auf der Neutrophiloberfläche bilden. Kombinationen von spezifischen Strukturen können Bindungsplätze mit hoher, mittlerer oder niedriger Affinität bilden, um optimal E-Selectin unter dynamischen Strömungsbedingungen mit hoher, mittlerer oder niedriger Scherspannung zu binden. Poly-LacNAc bildet bekannterweise Helixstrukturen. Myelorollin und Myeloglycan können Helixrückgratstrukturen haben, auf denen mehrfache oder einzelne Fucosylreste gebunden und in unterschiedlichen Richtungen orientiert sind. Solche Helixstrukturen, basierend auf der Positionierung der Fucosylreste, könnten miteinander in Wechselwirkung treten.
Bei dieser gesamten Untersuchung wurde P-Selectin-abhängige Bindung mit irgendeinem der untersuchten Ganglioside nicht beobachtet, sowohl bei strömungscytometrischen Methoden, wie oben beschrieben, oder durch Haftung von P-Selectin exprimierenden CHO-Zellen an mit Gangliosid beschichtete Platten, sowohl unter statischen als auch unter dynamischen Strömungsbedingungen. P-Selectin-abhängige Haftung erfordert deutlich ein "PSGL-1-ähnliches" Assemblermolekül zusätzlich zur spezifischen Kohlehydratstruktur (Handa et al., 1995, Int. J. Oncol. 6: 773–781; Sako et al., 1993, Cell 75: 1179–1186). Weitere Untersuchungen hinsichtlich des Kohlehydratepitops, das für die P-Selectinbindung erforderlich ist, sind im Fortschreiten.
Drei mögliche Schemata für die Anordnung von Sialinsäure (SA) und Fucosylrest (Fuc) auf Polylactosaminkette von Myelorollin sind in 7 gezeigt. Wiederholende Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Gal bildet eine Helixstruktur (Atkins et al., Polymer 15: 263–271, 1974; Rees DA, MTP Intl Review of Science 5: 1–42, 1975; Niemann et al., Biochem Biophys Res Commun 81: 1286–1293, 1978). Es gibt eine hohe Möglichkeit, daß Doppel- oder Dreifachhelixstruktur durch Wasserstoffbindung gebildet wird (Rees DA, MTP Intl Review of Science 5: 1–42, 1975; Frey-Wyssling A., Submicroscopic morphology of protoplasm, Elsevier Publ. Co., Amsterdam, 1953). Schema A ist eine mögliche Doppelhelixanordnung von zwei Mye lorollinmolekülen, welche ein einzelnes Fuc an unterschiedlichen internen GlcNAc-Resten haben (Lokalisierungen bezeichnet als 1 und 2; Fuc-Reste bezeichnet bei "Fuc 1" und "Fuc 2") (7, Panel A). Schema B: mögliche Doppelhelixassoziierung von zwei identischen Myelorollinmolekülen, wovon jedes zwei Fuc-Reste hat; einer jeweils bei Lokalisierungen 1 und 2; Reste bezeichnet als "Fuc 1" und "Fuc 2" wie oben (7, Panel B). Schema C ist die Konfiguration von SLe^x, das Fuc "x" an dem vorletzten GlcNAc hat (7, Panel C).
Die Replikation/Haftung von E-Selectin exprimierenden Zellen unter dynamischen Bedingungen wird wahrscheinlich durch räumliche Konfiguration und Untereinanderbeziehung von SA und Fuc gesteuert: ihren Winkelabstand und die Orientierung längs des helixförmigen Polylactosaminrückgrates.
Eine mögliche Konfiguration und Beziehung zwischen SA und Fuc, betrachtet längs der Achse des Helixrückgrates, ist in Panel D von 7 gezeigt (I entspricht Schema A; II Schema B; III Schema C). Konfiguration I, gebildet zwischen zwei Myelorollinmolekülen, welche unterschiedliche Fuc-Lokalisierungen besitzen (Fuc 1 [schwarz] und Fuc 2 [weiß]) können in starkem Maße die Replikations- und Haftungsmöglichkeiten fördern, wie durch die Mischung von Fr. 10-1 und 10-2 beispielhaft gezeigt wird. Möglicherweise sind Fuc 1 und Fuc 2 an symmetrischen Positionen längs des helixförmigen Polylactosaminrückgrates angeordnet, wie gezeigt.
Die Fähigkeit zur Replikation/Haftung zwischen Myelorollinmolekülen, assoziiert wie in Schema B und betrachtet längs der Achse wie in II ist nahezu dieselbe wie für zwei Moleküle, assoziiert wie in Schema A. Möglicherweise sind Fuc 1 und Fuc 2 auf den zwei Molekülen bei symmetrischen Positionen angeordnet, wie in II gezeigt.
SLe^x kann eine sehr verschiedene Konfiguration besitzen (Schema C; Ansicht III), und versagt bei dem Bewirken von Replikation.
Während die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung erläutert und beschrieben wurden, wird betont, daß verschiedene Änderungen hierbei ohne Abweichen von dem Umfang der Ansprüche gemacht werden können.

Claims

Polylactosamin mit der Formel:
Zusammensetzung, umfassend wenigstens (a) ein Polylactosamin mit der Struktur:
und (b) ein Polylactosamin mit der Struktur:
worin R und R' jeweils sind: ein H-Atom; eine unsubstituierte Arylgruppe oder eine Arylgruppe, substituiert mit irgendeinem der folgenden: (i) einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, wobei diese Gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, (ii) Halogenatomen, (iii) Hydroxylgruppe, (iv) Nitrogruppe und (v) Carboxylgruppe; eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, wobei diese Gruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome hat; ein Ceramidrest; ein Oligosaccharid (R' ist ein Disaccharid, das nicht irgendeinen Lactosaminrest enthält); ein fester Träger; oder ein nicht-steroiden antiinflammatorischen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Salicylsäurederivaten, Arylessigsäurederivaten, Propiansäurederivaten, Pyrazolonderivaten, Oxicamderivaten und Epirizol.
Zusammensetzung von Anspruch 2, welche Polylactosamine mit den Formeln umfaßt:
Zusammensetzung von Anspruch 2, welche Polylactosamine mit den Formeln umfaßt (a) ein Polylactosamin mit der Struktur:
(b) ein Polylactosamin mit der Struktur:
(c) ein Polylactosamin mit der Struktur:
und (d) ein Polylactosamin mit der Struktur:
worin R ist: ein H-Atom; eine unsubstituierte Arylgruppe oder eine Arylgruppe, substituiert mit irgendeinem der folgenden: (i) einer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, wobei diese Gruppe 1 bis 6 Koh- lenstoffatome hat, (ii) Halogenatomen, (iii) Hydroxylgruppe, (iv) Nitrogruppe und (v) Carboxylgruppe; eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, wobei diese Gruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome hat; ein Ceramidrest; ein Oligosaccharid (R' ist ein Disaccharid, das nicht irgendeinen Lactosaminrest enthält); ein fester Träger; oder ein nicht-steroiden antiinflammatorischen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Salicylsäurederivaten, Arylessigsäurederivaten, Propionsäurederivaten, Pyrazolonderivaten, Oxicamderivaten und Epirizol.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, welche Polylactosamine mit den Formeln umfaßt:
Zusammensetzung, umfassend wenigstens ein Polylactosamin mit den Formeln:
Verwendung des Polylactosamins von Anspruch 1 oder der Zusammensetzung von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung des E-Selectin-abhängigen Rollens einer ersten Zelle auf eine zweite Zelle, wobei die erste Zelle einen Liganden exprimiert, der E-Selectin-abhängiges Zell-Rollen bewirkt, und die zweite Zelle E-Selectin exprimiert.
Verwendung des Polylactosamins von Anspruch 1 oder der Zusammensetzung von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhütung von Inflammation bei einem Patienten.
Polylactosamin von Anspruch 1 oder Zusammensetzung von irgendeinem der Ansprüche 2 bis 6 zur Verwendung bei der Behandlung oder Verhütung von Inflammation bei einem Patienten.