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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher
Partikel (VLP), welche sich zur Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion
eignen, und Assays, welche die synthetischen virusähnlichen
Partikel einsetzen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Papillomavirus-Infektionen
treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von
Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und
Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie
im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore
an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind speziesspezifische
infektiöse
Agenzien; ein Human-Papillomavirus kann kein nicht-menschliches
Lebewesen infizieren.
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Papillomaviren
können
auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen
eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf
der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 60 Typen eingeteilt
(hinsichtlich eines Überblicks
siehe Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (Hrsg.), CRC
Press, Inc., 1990). Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische
Immunogene darzustellen, als eine neutralisierende Immunität gegen
Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen
einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.
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Beim
Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen.
Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen
bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen
5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25,
36 und 46–50
verursachen flache Läsionen
bei immungeschwächten
Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome
der Schleimhäute
der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16 und 18 verursachen
eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit
von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina,
Vulva und des Analkanals assoziiert. HPV6 und HPV11 sind die Ursachen
für mehr
als 90% aller Condylome (Genitalwarzen) und laryngealer Papillome.
Der häufigste
Subtyp von HPV Typ 6 ist HPV6a.
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Immunologische
Studien bei Tieren haben gezeigt, daß die Produktion neutralisierender
Antikörper gegen
Papillomavirus-Antigene eine Infektion mit dem homologen Virus verhindert.
Die Entwicklung wirksamer Papillomavirus-Vakzine wurde durch Schwierigkeiten,
die mit der Kultivierung von Papillomaviren in vitro verbunden sind,
verlangsamt. Die Entwicklung eines effektiven HPV-Vakzins wurde
insbesondere durch das Fehlen eines geeigneten Tiermodells verlangsamt.
Die Neutralisation von Papillomavirus durch Antikörper scheint typspezifisch
zu sein und abhängig
von Konformationsepitopen auf der Oberfläche des Virus.
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Papillomaviren
sind kleine (50–60
nm), nicht von einer Hülle
umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche
für bis
zu acht frühe
und zwei späte
Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden
als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet
und "L" spät bedeutet.
L1 und L2 kodieren für
Virus-Kapsidproteine. Die frühen
(E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und zellulärer Transformation
assoziiert.
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Das
L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht
von 55–60
kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches
ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares
Molekulargewicht von 75–100
kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist.
Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil
des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins befindet. Die L2-Proteine
sind bei verschiedenen Papillomaviren hoch konserviert, insbesondere die
10 basischen Aminosäuren
am C-Terminus. Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hoch
konserviert.
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Die
L1- und L2-Gene wurden zur Herstellung von Vakzinen für die Prophylaxe
und Behandlung von Papillomavirus-Infektionen bei Lebewesen eingesetzt.
Zhou et al. (1991; 1992) klonierten HPV-Typ 16-L1- und -L2-Gene
in einen Vacciniavirus-Vektor und infizierten CV-1-Säugerzellen mit dem rekombinanten
Vektor, um virusähnliche
Partikel (VLP) zu produzieren.
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Es
wurden aus Bakterien stammende rekombinante Rinder-Papillomavirus-L1
und -L2 erzeugt. Neutralisierende Seren gegen die rekombinanten
bakteriellen Proteine reagierten in einer Kreuzreaktion mit nativem
Virus auf niedrigen Niveaus, mutmaßlich aufgrund von Unterschieden
in den Konformationen der nativen und von Bakterien stammenden Proteine.
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Rekombinante
Baculoviren, die HPV6-L1-, HPV11-L1-, HPV16-L1-, HPV18-L1-, HPV31-L1- oder HPV16-L2-ORFs
exprimieren, wurden zur Infektion von Sf9-Insektenzellen und zur Produktion
von L1- und L2-Proteinen eingesetzt. Westernblot-Analysen zeigten,
daß die
von Baculovirus erhaltenen L1- und L2-Proteine mit Antikörper gegen
HPV16 reagierten. Das von Baculovirus erhaltene L1 bildet VLPs.
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Carter
et al. (1991) demonstrierten die Produktion von HPV16-L1- und HPV16-L2-Proteinen
durch rekombinante Stämme
von Saccharomyces cerevisiae. Carter et al. demonstrierten auch
die Produktion von HPV6b-L1- und -L2-Proteinen. Das HPV6b-L1-Protein
war kein Vollängen-L1-Protein.
Die rekombinanten Proteine wurden als intrazelluläre und als
sekretierte Produkte produziert. Die rekombinanten L1- und L2-Proteine hatten ähnliche
Molekulargewichte wie die nativen Proteine. Wurden die Proteine
intrazellulär
exprimiert, wurde die Hauptmenge des Proteins als unlöslich befunden,
wenn die Zellen in Abwesenheit denaturierender Reagenzien lysiert
wurden. Obwohl diese Unlöslichkeit
die Reinigung des Proteins erleichtern kann, kann sie eine Analyse
der nativen Epitope des Proteins behindern.
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Von
rekombinanten Proteinen, die von Hefe sekretiert wurden, wurde gezeigt,
daß sie
von Hefe stammende Kohlenhydrate enthalten. Die Anwesenheit dieser
N-verknüpften
Oligosaccharide kann native Epitope maskieren. Darüber hinaus
können
die sekretierten rekombinanten Proteine andere Modifizierungen enthalten,
wie z. B. die Retention der sekretorischen Leadersequenz.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung rekombinanter Papillomavirus-Proteine
mit den immunitätsverleihenden
Eigenschaften der nativen Papillomavirus-Proteine sowie Verfahren
zu deren Herstellung und Verwendung. Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Reihe synthetischer virusähnlicher
Partikel, die für
die Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion geeignet sind,
und Assays, welche die synthetischen virusähnlichen Partikel einsetzen.
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Die
Erfindung beeinhaltet die Ableitung von HPV11-L1-spezifischen Resten,
welche für
die Bindung neutralisierender Antikörper erforderlich sind. Die
Erfindung beinhaltet ferner die Ableitung von zwei HPV11-L1-spezifischen
Resten, welche zusammen zur Bindung neutralisierender Antikörper erforderlich
und ausreichend sind.
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HPV11-L1
enthält
nur 38 Aminosäureabweichungen
von HPV6-L1 plus einen inserierten Rest. Trotz der starken Identität zwischen
diesen beiden Proteinen wurde eine Gruppe von neutralisierenden
monoklonalen Antikörpern
erzeugt, welche spezifisch für
HPV11-VLPs sind. Wir stellten fest, welche dieser Aminosäurepositionen
für die
Bindung der neutrali sierenden monoklonalen Antikörper von Bedeutung sind. Dies
erfolgte durch Beurteilung der Bindung der monoklonalen Antikörper an
eine Familie von HPV11-Klonen, welche Substitutionen von HPV11-Aminosäureresten
gegen HPV6b-Aminosäurereste
an diesen Positionen enthielten, und anschließende Mutation von HPV6b, um
der HPV11-Sequenz an diesen kritischen Positionen zu entsprechen.
Wir demonstrierten, daß die
neutralisierenden Antikörper
HPV6b-VLPs mit so wenig wie nur zwei dieser Substitutionen binden
werden und daß beide
Substitutionen für
die Bindung essentiell sind. Diese Arbeit definiert die minimale
Einheit für
die Bindung neutralisierender Antikörper.
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Die
Gruppe von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern für HPV11 wurde von Neil Christiansen (Pennsylvania
State University, Hershey, PA) erhalten. Die monoklonalen Antikörper in
der Gruppe sind HPV11-spezifisch und VLP-abhängig. Die Antikörper können voneinander
dadurch unterschieden werden, welche Aminosäurereste die Bindung der individuellen
Antikörper
beeinflussen, obwohl es überlappende
Positionen für
alle der monoklonalen Antikörper
gibt.
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Diese
Reste definieren zusammen das Epitop für Antikörper, von denen bekannt ist,
daß sie
HPV11 neutralisieren. Im Prinzip führt die Mutation von HPV6-L1
an nur diesen ausgewählten
Positionen zur Bindung dieser HPV11-spezifischen neutralisierenden
monoklonalen Antikörper.
Die derivatisierten HPV6-VLPs können
eingesetzt werden, um monoklonale Antikörper gegen das HPV11-neutralisierende
Epitop zu erzeugen. Dies ist die Grundlage eines Freisetzungsassays
zur Bestätigung,
daß hergestellte
HPV11-VLPs das neutralisierende Epitop enthalten.
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Dieses
Problem wurde in der Vergangenheit nicht gelöst und unseres Wissens ist
dies die erste Demonstration der Übertragung eines konformationsabhängigen Epitops.
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Es
gab zwei Probleme zu bewältigen.
Erstens ist das Epitop ein Konformationsepitop und herkömmliche
Mittel der Epitopkartierung, die Bindung an Peptidfragmente, konnten
nicht eingesetzt werden. Es war nötig, irgendein Test-L1-Protein
in einer Weise zu exprimieren, welche die Bildung virusähnlicher
Partikel, welche die Virusstruktur nachahmen, erleichterte. Zweitens
machte die große
Anzahl von L1-Klonen, welche für
die Kartierung erforderlich war, die Schaffung eines leichten Mittels
zur Expression der viralen Test-Hüllproteine erforderlich.
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Ohne
Kenntnis des neutralisierenden Epitops wäre es schwierig, die Herstellung
von VLPs für
den kommerziellen Einsatz zu validieren.
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Eine
Verwendung des derivatisierten VLP ist diejenige als Reagens in
einem Freisetzungsassay für HPV11.
HPV6-L1 ist mutiert, um HPV11 in den durch diese Studien bestimmten
Positionen zu entsprechen. Die Bindung der HPV11-neutralisierenden
monoklonalen Antikörper
an diese derivatisierten HPV6-VLPs wird demonstriert werden.
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Diese
derivatisierten HPV6-VLPs können
in einem Konkurrenzbindungsassay mit hergestellten HPV11-VLPs zur
Bindung an die HPV11-neutralisierenden monoklonalen Antikörper eingesetzt
werden. Nur diejenigen HPV6-Derivate, von denen demonstriert wurde,
daß sie
die monoklonalen Antikörper
binden, werden mit authentischem Material konkurrieren.
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Alternativ
können
monoklonale Antikörper
gegen das neutralisierende Epitop auf derivatisierten HPV6 erzeugt
werden; dann wird gezeigt werden, daß hergestelltes HPV11-Vakzin
diese Antikörper
bindet.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher
Partikel, die sich für
die Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion eignen,
und Assays, welche die synthetischen Partikel verwenden. Die synthetischen
virusähnlichen
Partikel werden von Konstrukten mit der Bezeichnung HPV6:2, HPV6:4Δ132 und HPV6:4,S131G
hergestellt.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt, daß VLPs mit
typspezifischen Eigenschaften bei einer transienten Transfektion
gebildet werden. Sf9-Zellen wurden mit BaculogoIdTM-DNA
und entweder pVL1393:CRPV oder pVL1393:HPV11 kotransfiziert. Zellen
wurden nach 6 Tagen geerntet, Extrakte präpariert und ELISAs wie im Text
beschrieben durchgeführt.
Spalte 1, CRPV-VLPs; Spalte 2, HPV11-VLPs; Spalte 3, Sf9-Extrakt,
Spalte 4, Baculovirus-DNA; Spalte 5, pVL1393:CRPV; Spalte 6, pVL1393:HPV11.
- A. Primärer
Antikörper
ist eine 10–5-Verdünnung von
CRPV.5A-Ascitesflüssigkeit.
- B. Primärer
Antikörper
ist eine 10–5-Verdünnung von
H11.F1-Ascitesflüssigkeit.
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2 zeigt, daß das durch
die transiente Transfektion produzierte immunogene Material gegenüber einer
Denaturierung sensitiv ist. Sf9-Zellen wurden mit pVL1393:HPV11
und BaculoGoldTM-DNA kotransfiziert, Zellen
wurden nach sechs Tagen geerntet und Extrakte wie im Text beschrieben
präpariert.
Ein Teil der Extrakte wurde durch Verdünnung in 0,1 M Natriumcarbonat,
pH 10,5, denaturiert und bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert.
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Mit
diesen Extrakten wurde dann eine Mikrotiterplatte beschichtet und
trocknen gelassen. Mikrotiterplatten wurden mit unbehandelten Extrakten
beschichtet und über
Nacht bei 4°C
inkubiert. ELISAs wurden wie im Methodenteil beschrieben durchgeführt unter
Verwendung einer 10–5-Verdünnung von
entweder H11.F1- oder H6.C6-Ascites. Spalte 1, Sf9-Extrakt; Spalte
2, pVL1393-Extrakt; A, Extrakt ist nicht denaturiert; B, Extrakt war
mit Carbonatpuffer behandelt.
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3 zeigt die Aminosäuresequenzen
des HPV11- und HPV6-L1-Proteins. Diese Sequenzen sind auch in der
EMBL GeneBank verfügbar.
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4 zeigt, daß VLPs,
die von dem Klon HPV6:2 (mit einer Substitution an Position 131,
gefolgt von der Tyrosin-Insertion, um die Position 132 zu schaffen)
gebildet wurden, die Antikörper
H11.B2, H11.F1 und H11.G5 binden. Im Gegensatz dazu binden VLPs,
die von HPV6:4 gebildet wurden, das entweder an der Position 131
(HPV6:4, S131G) oder 132 (HPV6:4Δ132)
rückmutiert
war, diese Antikörper
trotz der Anwesenheit der anderen drei kritischen Restsubstitutionen
nicht. Die Antikörper
H11.B2, H11.F1 und H11.G5 sind neutralisierende MAbs in dem Xenograft-System.
H6.C6 mißt
das Gesamtniveau der L1-Produktion
wie in Beispiel 4 beschrieben. Der ELISA wurde wie in Beispiel 3
beschrieben durchgeführt.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe synthetischer virusähnlicher
Partikel (VLP), welche sich zur Charakterisierung einer Human-Papillomavirus-Infektion
eignen, und Assays unter Verwendung der synthetischen virusähnlichen
Partikel, welche zur Überwachung
und Validierung von VLPs, die mittels rekombinanter DNA-Technologien
hergestellt wurden, eingesetzt werden können. Die synthetischen virusähnlichen Partikel
werden von Konstrukten mit der Bezeichnung HPV6:2, HPV6:4Δ132 und HPV6:4,S131G
gebildet. Andere Konstrukte sind für Referenzzwecke eingeschlossen.
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Papillomavirus-Infektionen
treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von
Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und
Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie
im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore
an der Infektionsstelle induzieren.
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Papillomaviren
können
auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen
eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf
der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 60 Typen eingeteilt
(hinsichtlich eines Überblicks
siehe Papillomaviruses and Human Cancer, H. Pfister (Hrsg.), CRC
Press, Inc., 1990). Papillomavirus-Typen scheinen insofern typspezifische
Immunogene darzustellen, als eine neutralisierende Immunität gegen
Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen
einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.
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Beim
Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen.
Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen
bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen
5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25,
36 und 46–50
verursachen flache Läsionen
bei immungeschwächten
Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome
der Schleimhäute
der Genitalien und Atemwege. Die HPV-Typen 16 und 18 verursachen
eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit
von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina,
Vulva und des Analkanals assoziiert. HPV6 und HPV11 verursachen
die Mehrheit von Genitalwarzen und laryngealen Papillomen.
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Immunologische
Studien bei Tieren haben gezeigt, daß die Produktion neutralisierender
Antikörper gegen
Papillomavirus-Kapsidproteine eine Infektion mit dem homologen Virus
verhindert. Die Entwicklung wirksamer Papillomavirus-Vakzine wurde
durch Schwierigkeiten, die mit der Kultivierung von Papillomaviren
in vitro verbunden sind, verlangsamt. Die Entwicklung eines effektiven
HPV-Vakzins wurde insbesondere durch das Fehlen eines geeigneten
Tiermodells verlangsamt. Die Neutralisation von Papillomavirus durch
Antikörper scheint
typspezifisch zu sein und abhängig
von Konformationsepitopen auf der Oberfläche des Virus.
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Papillomaviren
sind kleine (50–60
nm), nicht von einer Hülle
umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche
für bis
zu acht frühe
und zwei späte
Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden
als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet
und "L" spät bedeutet.
L1 und L2 kodieren für
Virus-Kapsidproteine. Die frühen
(E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und Transformation
assoziiert.
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Das
L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht
von 55–60
kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches
ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares
Molekulargewicht von 75–100
kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist.
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Über die
Herstellung von HPV16-L1-, HPV16-L2- und HPV Typ 6-L1-Proteinen
durch rekombinante Stämme
von Saccharomyces cerevisiae wurde berichtet. Es wäre von Nutzen,
Verfahren zur Herstellung großer
Mengen von Papillomavirus-Proteinen beliebiger Spezies und beliebigen
Typs durch Kultivierung rekombinanter Hefen zu entwickeln. Es wäre auch
von Nutzen, große
Mengen von Papillomavirus-Proteinen mit den immunitätsverleihenden
Eigenschaften der nativen Proteine, wie z. B. der Konformation des
nativen Proteins, herzustellen. Zur Erreichung dieses letzteren
Ziels wäre
es erforderlich, die Wirkung zahlreicher Mutationen in dem L1-Gen
auf die Bindung von Antikörpern
bekannter Eigenschaften (VLP-abhängig, kreuzreaktiv,
etc.) zu analysieren.
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Das
empirische Scanning natürlicher
oder konstruierter Peptidsequenzen hinsichtlich funktioneller Reste
ist inhärent
abhängig
von der Expression einer großen
Zahl von Sequenzvarianten, um deren relative funktionelle Wirksamkeit
zu untersuchen. Das Niveau der erhaltenen Proteinexpression kann
insbesondere im Falle von selbstassemblierenden viralen Strukturproteinen
kritisch sein, da die Effizienz der Selbstassemblierung häufig konzentrationsabhängig ist.
Das Baculovirus-Insektenexpressionsvektorsystem wurde in großem Umfang
eingesetzt, um virale Selbstassemblierung zu untersuchen, es erfordert
jedoch im allgemeinen eine vorherige Isolierung und Expansion einer
plaquegereinigten rekombinanten Virenstammkultur, um brauchbare Mengen
selbstassemblierter Partikel herzustellen. Bei der Prüfung einer
Reihe von Möglichkeiten
zur Expression analytischer Niveaus des L1-Hüll-proteins von Baumwollschwanzkaninchen-
und Human-Typ 11-Papillomaviren fanden wir, daß selbst eine kurze transiente
Cotransfektion von Insektenzellen mit Baculovirus-Transfervektoren
und viraler DNA assemblierte Partikel ergab, welche immunologisch
von Partikeln, die zuvor aus plaquegereinigten Stammkulturen erhalten
worden waren, nicht unterscheidbar waren. Binnen sechs Tagen von
Plasmid/Virus-DNA-Cotransfektion von Sf9-Zellen konnten mindestens
1–2 μg assemblierter
L1-Partikel/100-mm-Platte demonstriert werden. Dieses Expressionsniveau
ist mehr als ausreichend, um die Funktionalität zu untersuchen, und bietet
mehrere Vorteile gegenüber
vergleichbaren transienten Expressionssystemen in Säugerzellen.
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Zur
Bestimmung neutralisierender Epitope bei HPV-Infektionen mußten wir
die Aminosäurereste
identifizieren, welche Human-Papillomavirus-Subtypen eine antigene
Typspezifität
verleihen (Christensen, N. D., et al., 1990, Monoclonal antibody-mediated
neutralizafion of infectious human papillomavirus type 11, J. Virol. 64,
1936–1944).
Viele der typspezifischen Epitope sind konformationsabhängig und
nur nach VLP-Assemblierung nachweisbar. Das L1-Strukturhüllprotein
mehrerer Tier- und Human-Papillomaviren wurde befunden, bei Expression
in Insektenzellen mittels rekombinanter Baculovirus-Stämme effizient
selbst zu assemblieren (Christensen, N. D., et al., 1994, Assembled
baculovirus-expressed human papillomavirus type 11 L1 capsid protein
virus-like particles are recognized by neutralizing monoclonal antibodies
and induce high titres of neutralizing antibodies, J. Gen. Virol.
75, 2271–2276).
Die Zeit und Mühe,
die mit der Herstellung rekombinanter Phagen verbunden ist, schließt die Anwendung
dieses Verfahrens zum Screenen einer großen Anzahl von VLP-Varianten, welche
mittels stellengerichteter Mutagenese hergestellt wurden, aus. Jedoch
beobachteten wir früher,
daß ein
rekombinantes Protein bei Expression in dem Baculovirus-System als sekretiertes
Produkt in Mengen von μg/ml
innerhalb von 5–7
Tagen der ursprünglichen
Transfektion von Insektenzellen mit Plasmid- und Virus-DNAs nachweisbar
ist. Auf Grundlage dieser Beobachtung überprüften wir, ob sich ausreichende Mengen
an Papillomavirus-L1-Protein anhäufen
würden,
um eine Selbstassemblierung in VLPs nach transienter Expression
zu erlauben, insbesondere wenn ein effizienteres Baculovirus-Transfektionssystem
wie das BaculogoIdTM-System (Pharmingen,
San Diego, CA) eingesetzt würde.
Unter Anwendung eines schnellen sechstägigen transienten Transfektionsprotokolls
wurde das L1-Hüllprotein
zahlreicher Papillomaviren, korrekt zu VLPs assembliert, gebildet.
Extrakte, die aus transient transfizierten Zellen mit CRPV- oder
HPV11-L1-Genkonstrukten präpariert
worden waren, enthielten immunogenes Material, das von typspezifischen
und VLP-abhängigen
monoklonalen Antikörpern,
gebildet gegen entweder CRPV- oder HPV11-VLPs, erkannt wurde. Das transient exprimierte
Material war nicht kreuzreaktiv mit anderen typspezifischen Antikörpern und
die Erkennung war für
eine alkalische Denaturierung sensitiv, was ferner die Naturgetreuheit
der VLP-Bildung demonstrierte.
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Zur
Kartierung des HPV11-neutralisierenden Epitops mutierten wir HPV11
individuell an den Resten, an denen die Sequenz von der HPV6b-Sequenz
abweicht. Die Positionen wurden mutiert, um der HPV6b-Sequenz zu
entsprechen (das Tyrosin an Position 132 wurde deletiert, um die
Wirkung dieser Insertion zu analysieren). Unter Einsatz des oben
beschriebenen transienten Sf9-Expressionssystems wurden diese Mutanten-HPV11-L1-Gene
exprimiert und hinsichtlich Bindung von HPV11-spezifischen monoklonalen
Antikörpern analysiert.
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Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung näher zu erläutern, ohne
die Erfindung jedoch auf die speziellen Details dieser Beispiele
zu beschränken.
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BEISPIEL 1
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Erzeugung von Test-Expressionskonstrukten
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Das
HPV11-L1-Strukturgen wurde aus klinischen Isolaten unter Anwendung
von PCR mit Primern, die anhand der veröffentlichten L1-Sequenz konstruiert
worden waren, kloniert. Das L1-Gen wurde anschließend sowohl
in BlueScript (Pharmacia) für
die Mutagenese als auch in pVL1393 (Stratagene) für die Expression
in Sf9-Zellen subkloniert.
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Mutationen
wurden in das L1-Gen unter Einsatz des Amersham-Sculptor-in vitro-Mutagenesekits
eingeführt.
Das Auftreten der gewünschten
Mutation wurde durch Sequenzierung bestätigt und das mutierte Gen in
pVL1393 für
die Expression in Sf9-Zellen subkloniert.
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Das
HPV6-L1-Strukturgen wurde sowohl in pAlt-1 (Promega) für die Mutagenese
als auch in pVL1393 (Stratagene) für die Expression in Sf9-Zellen
subkloniert. Mutationen wurden unter Einsatz des Altered Sites II-in
vitro-Mutagenesesystems (Promega) erzeugt, durch Sequenzierung verifiziert
und in pVL1393 für
die Expression in Sf9-Zellen subkloniert.
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Sequenzen
der L1-Gene von HPV6 und HPV11 wurden mit den veröffentlichten
Sequenzen verifiziert [(Dartmann, K., et al., 1993, EMBO J. 2: 2341;
EMBL GeneBank-Zugangsnummer M14119 (HPV11-L1) und-Zugangsnummer
X00203 (HPV6B-L1)].
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BEISPIEL 2
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Transiente Expression
von L1-VLPs in Sf9-Zellen
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Sf9-Zellen
wurden mit Hilfe des BaculoGold-Transfektionskits (Pharmingen) transfiziert.
Die Transfektionen erfolgten im wesentlichen nach den Anweisungen
des Herstellers mit den folgenden Modifizierungen. 8 × 108 Sf9-Zellen wurden in einer 100-mm-Schale
mit 4 μg
BaculoGold-DNA und 6 μg
Test-DNA transfiziert. Zellen wurden nach 6 Tagen geerntet und hinsichtlich
VLP-Produktion einem Assay unterworfen.
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BEISPIEL 3
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Herstellung von Sf9-Extrakten
und ELISA-Assays
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Zellen
wurden 6 Tage nach der Transfektion durch Abkratzen, gefolgt von
einer Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, geerntet. Die
Zellen wurden in 300 μl
Aufbruchpuffer (1 M NaCl, 0,2 M Tris, pH 7,6) resuspendiert und
30 Sekunden lang auf Eis mit Hilfe eines Polytron PT 1200 B mit
einer PT-DA 1205/2-A-Sonde (Brinkman) in einem Falcon-1259-Röhrchen homogenisiert. Die Proben
wurden drei Minuten lang bei 2500 UpM zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu
pelletieren. Die Röhrchen
wurden mit zusätzlichen
150 μl Aufbruchpuffer
gewaschen, die Überstände in einem
1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
gesammelt und erneut fünf
Minuten lang in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge (Brinkman) zentrifugiert.
Die Überstände wurden
gesammelt und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. ELISA-Assays wurden
typischerweise am selben Tag durchgeführt.
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5 μl Extrakt
wurden in 50 μl
1%igem BSA in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung; 20 mM NaPO4,
pH 7,0, 150 mM NaCl) verdünnt
und auf eine Polystyrolplatte ausplattiert. Die Platte wurde über Nacht
bei 4°C inkubiert.
Die Extrakte wurden entnommen und die Platte mit 5% Milchpulver
in PBS blockiert. Alle anschließenden
Waschschritte wurden mit 1%igem BSA in PBS durchgeführt. Die
Platte wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit primärem Antikörper inkubiert.
Primäre
Antikörper,
monoklonale Antikörper,
die gegen HPV11-VLPs gebildet worden waren, wurden als Ascites-Stammlösung von
Dr. Neil Christensen (Pennsylvania State University) erhalten. Sie
wurden vor der Verwendung 105 in 1%igem
BSA-PBS verdünnt. Nach
dem Waschen wurden die Platten eine Stunde lang mit sekundärem Antikörper inkubiert.
Der sekundäre
Antikörper, mit
Peroxidase markiertes Anti-Maus-Ziegen-IgG(γ)
wurde von Kirkegaard&Perry
Laboratories, Inc., bezogen und in einer 103-Verdünnung in
1%igem BSA in PBS eingesetzt. Nach einem letzten Waschschritt wurde
ein Meerrettichperoxidase-Assay durchgeführt und die Extinktion bei
405 nm abgelesen.
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BEISPIEL 4
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HPV11-Scan
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Zur
Kartierung der kritischen Reste für ein HPV11-spezifisches neutralisierendes
Epitop nutzten wir zwei Bedingungen. Zuallererst verwendeten wir
eine Gruppe monoklonaler Antikörper,
welche spezifisch für HPV11-L1
sind und L1 nur erkennen, wenn es in einem VLP vorliegt. Die in
Beispiel 3 beschriebenen Assaybedingungen sind derart, daß diese
Antikörper
nicht mit dem engverwandten HPV6b-L1-VLP kreuzreagieren können. Von
diesen fünf
Antikörpern
ist von vier gezeigt worden, daß sie
HPV11 in dem Kreider-Xenograft-System
neutralisieren (Kreider et al., 1987, J. Virol. 61: 590–593).
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HPV6-
und HPV11-L1s sind die am engsten verwandten L1-Proteine innerhalb
der Papillomavirus-Familie. HPV6-L1 hat eine Länge von 500 Aminosäureresten.
HPV11-L1 hat 501 Reste. Sie können
so zugeordnet werden, daß die
zusätzliche
Aminosäure
in HPV11 an Position 132 vorliegt. Mit dieser Zuordnung sind sie in
der Aminosäuresequenz
in allen Positionen außer
39 Positionen (92,4%), einschließlich der Insertion, identisch.
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Wir
folgerten, daß die
Typ 11-Spezifität
der monoklonalen Antikörper
innerhalb dieser Unterschiede von 39 Resten liegen muß. Durch
systematischen Austausch eines Typ 11-Restes gegen einen Typ 6-Rest würden diejenigen
Reste, welche kritisch für
die Typ 11-Reaktion sind, durch einen Verlust der Bindungsaffinität von den
Typ 11-spezifischen monoklonalen Antikörpern offenbart werden. Nachdem
die Reste zu Resten mutiert würden,
welche natürlicherweise
in Typ 6 vorliegen, würde
die Wahrscheinlichkeit, daß solche
Substitutionen die VLP-Bildung beeinflußten, gering sein.
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Zur
Feststellung der Wirkung irgendeines speziellen Rests auf die Bindung
wurden sowohl HPV11 als auch das korrespondierende HPV11-Derivat
in dem transienten Expressionssystem exprimiert. Ein ELISA wurde
unter Verwendung der Gruppe von HPV11-spezifischen monoklonalen
Antikörpern
vorgenommen und die Ergebnisse der beiden verglichen. Die L1-Produktion wurde
mit dem monoklonalen Antikörper
H6.C6 normalisiert. H6.C6-Antikörper
ist kreuzreaktiv mit HPV11, das Epitop ist linear und unabhängig von
der VLP-Bildung. Somit mißt
es die L1-Produktion.
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Die
Ergebnisse werden einer doppelten Normalisierung unterworfen. Zuerst
wird das Verhältnis
der Extinktion des Testantikörpers
zu H6.C6 für
die Testposition berechnet. Das gleiche Verhältnis wird für HPV11 bestimmt
und durch das Verhältnis
für die
Testposition geteilt. Somit bedeutet ein doppeltes Verhältnis in
der Nähe
von 1, daß es
keinen nachweisbaren Unterschied in der Antikörperbindung des Testklons im
Verhältnis zu
HPV11 gibt. Ein doppeltes Verhältnis
von weniger als 1 bedeutet, daß der
Testantikörper
schlechter an den Testklon bindet als an Wildtyp. In der Theorie
bedeutet ein Verhältnis
von größer als
1, daß der
Antikörper
besser an den Testklon bindet als an HPV11. In der Praxis wurde
dies nicht beobachtet. Ein Verhältnis
im Bereich von 0,1 bis 0,2 ist im wesentlichen Hintergrund, was
bedeutet, daß wir
keine Bindung des Antikörpers
an das Mutanten-VLP nachweisen können.
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Die
Positionen in HPV11-L1, welche sich von HPV6 unterscheiden, wurden
individuell mutiert, um dem entsprechenden Rest in HPV6 zu entsprechen.
Die Klone wurden in Sf9-Zellen
durch eine baculovirus-exprimierende Rekombinante exprimiert und
die Wirkung der Bindung durch die Gruppe von HPV11-spezifischen monoklonalen
Antikörpern
bestimmt (Tabelle 1). Reste, welche in Spalte 2 erscheinen, gekennzeichnet
als "weniger Bindung", sind Positionen,
welche für
die Bindung eines oder mehrerer der monoklonalen Antikörper kritisch
gehalten werden. Reste, die in Spalte 1 aufgeführt sind, gekennzeichnet als "behält Bindung", werden als nicht
kritisch für
die Bindung irgendwelcher der monoklonalen Antikörper beurteilt. Tabelle
1
behält Bindung | verliert
Bindung |
HPV11:K28T | HPV11:G131S |
HPV11:Y49F | HPV11:Y132Δ |
HPV11:K53R | HPV11:Y246F |
HPV11:V54A | HPV11:N278G |
HPV11:L119F | HPV11:S346T |
HPV11:T170K | |
HPV11:S173T | |
HPV11:S166P | |
HPV11:N179A | |
HPV11:L2191 | |
HPV11:V225T | |
HPV11:T263E | |
HPV11:D271T | |
HPV11:L2731 | |
HPV11:V2741 | |
HPV11:G277S | |
HPV11:S281T | |
HPV11:A294G | |
HPV11:H300N | |
HPV11:H325Q | |
HPV11:K347T | |
HPV11:A349S | |
HPV11:F366V | |
HPV11:Q434P | |
HPV11:D439N | |
HPV11:M440L | |
HPV11:F458Y | |
HPV11:T474S | |
HPV
11:A467I | |
HPV11:P488A | |
HPV11:T497A | |
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Die
Klone, die für
die in Tabelle 1 unter der Spalte "verliert Bindung" beschriebenen L1-Mutanten kodieren,
werden als HPV11:G131S, HPV11:Y132Δ, HPV11:Y246F, HPV11:N278G und
HPV11:S346T bezeichnet. Alternativ kann die Vorsilbe "HPV" weggelassen werden.
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Die
vier Reste, welche die Bindung beeinflussen, sind in beträchtlichen
Abständen
von einander angeordnet, wobei die gesamte Spannweite mehr als 200
Reste entlang der linearen Sequenz umfaßt.
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Die
Positionen beeinflussen die Bindung der Antikörper unterschiedlich. Nicht
mehr als drei Positionen beeinflussen die Bindung irgendeines einzelnen
Antikörpers.
Nur Position 246 beeinflusst die Bindung aller fünf Antikörper. In allen Fällen wird
ein gewisses Maß nachweisbarer
Bindung beobachtet. Dies zeigt an, daß die VLP-Bildung nicht beeinflußt ist.
Die Wirkung auf die Bindung durch den Austausch an Position 278
erscheint marginal und ist fraglich, ist jedoch derzeit eingeschlossen,
da die leichte Verringerung reproduzierbar ist. Die Wirkung auf
die Bindung, wie durch das VLP-normalisierte Affinitätsverhältnis gemessen,
ist in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 3 gibt die Bindungskonfigurationen
für die
monoklonalen HPV11-Antikörper
an, wie aus diesen Studien abgeleitet.
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Tabelle
3: Antikörperbindungskonfigurationen
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BEISPIEL 5
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Klärungs ("Strippinq")-Assay
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Zur Überwachung
der Produktion von HPV11-VLPs, um sicherzustellen, daß sie das
relevante neutralisierende Epitop enthalten, wird der folgende Konkurrenz-ELISA
eingesetzt. HPV6-Derivat-VLPs, nicht jedoch HPV6-VLPs, konkurrieren
um die Bindung an HPV11-VLPs
mit den monoklonalen Antikörpern
H11.B2, H11.F1 und H11.G5. Dies zeigt die Anwesenheit des neutralisierenden
Epitops auf den VLPs durch die Demonstration einer spezifischen
konkurrierbaren Bindung an das neutralisierende Epitop. Der Assay
wird auf folgende Weise durchgeführt.
- 1. Ausplattieren von 10–100 ng Testansatz-HPV11-VLPs
pro Mulde einer 96-Mulden-ELISA-Platte.
Verdünnen
der Probe in 1,0%igem BSA in PBS (ELISA-Puffer). Ausplattieren einer
50-μl-Probe.
Inkubieren über Nacht
bei 4°C.
- 2. Entfernen von Überständen aus
den Mulden. Blockieren für
eine Stunde mit 5% Milchpulver in PBS bei Raumtemperatur.
- 3. Spülen
mit ELISA-Puffer.
- 4. Herstellen von Verdünnungen
des monoklonalen Antikörpers
H11.F1.
- A. Herstellen eines Satzes von Verdünnungen mit zunehmenden Mengen
an HPV6-Derivat-VLPs.
- B. Herstellen eines Duplikatsatzes von Verdünnungen mit zunehmenden Mengen
an HPV6-VLPs.
- C. Herstellen einer Verdünnung
ohne zugesetzte VLPs.
- 5. Zugeben von 50 μl
der Antikörper-Proben
zu den Mulden der ELISA-Platte. Inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur.
- 6. Entfernen von Antikörpern
und dreimaliges Waschen mit ELISA-Puffer.
- 7. Zugeben von 50 μl
Antimaus-Ziegen-IgG (γ)
bei geeigneter Verdünnung.
Inkubieren für
eine Stunde bei Raumtemperatur.
- 8. Dreimaliges Waschen mit ELISA-Puffer. Entwickeln mit einem
Assay mit alkalischer Phosphatase und Ablesen bei 405 nm.
- 9. Ein starkes Signal bei 405 nm, das stark mit HPV6-Derivat-VLPs,
nicht jedoch mit HPV6-VLPs konkurriert, wird die Anwesenheit des
neutralisierenden Epitops auf dem Testansatz von HPV11-VLPs bestätigen.
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BEISPIEL 6
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Überwachung der Neutralisierung
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HPV6-Derivat-VLPs
werden zur Charakterisierung von Testansätzen polyklonaler Seren hinsichtlich neutralisierender
Aktivität
eingesetzt. Ein Ansatz polyklonaler Seren wird beispielsweise durch
einen Testansatz von HPV11-VLPs erzeugt. Alternativ ist es eine
humane Probe, für
die eine Charakterisierung ihres Neutralisationsvermögens erwünscht ist.
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Ein
polyklonales Serum wird mit HPV6-VLPs vorgeklärt. Dies entfernt kreuzreaktive
Antikörper,
sowohl VLP-abhängige
als auch nicht-abhängige.
Das HPV11-neutralisierende Epitop ist Typ 11-spezifisch und dagegen
gebildete Antikörper
werden durch Vorinkubation mit HPV6-VLPs nicht entfernt. Jedoch
binden derivatisierte HPV6-Partikel diese Antikörper und die Beobachtung einer
solchen Bindung, beispielsweise in einem Standard-ELISA, demonstriert
die Anwesenheit neutralisierender Antikörper in der Testserum-Probe.
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Eine
Testprobe polyklonaler Seren wird nach dem folgenden Verfahren geklärt.
- 1. Es wird eine Abschätzung des gesamten VLP-bindenden
Antikörpers
durchgeführt.
VLPs werden auf einer ELISA-Platte im Sandwich-Format unter Verwendung
eines monoklonalen Anti-HPV11-Antikörpers (es stehen mehrere zur
Verfügung)
immobilisiert werden. Die Menge an polyklonalem Antikörper, welche
bindet, wird unter Verwendung eines zweiten Anti-HPV11-Antikörpers bekannter
Konzentration als Standard abgeschätzt. Alternativ wird die IgG-Konzentration
des polyklonalen Antikörpers
bestimmt und angenommen, daß es
alles Anti-HPV11 wäre.
- 2. HPV6-VLPs werden zu einem Aliquot Serum in einem 10fachen Überschuss
in μg gegenüber der
Menge an HPV11-Antikörper
in dem polyklonalen Serum zugegeben, wie sie in Schritt 1 bestimmt
wurde.
- 3. Die Mischung wird über
Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation
bei hoher Geschwindigkeit (300.000 × g) für 5 Stunden, um die VLP-Antikörper-Komplexe
zu pelletieren.
- 4. Das Verfahren wird zwei weitere Male wiederholt.
- 5. Das geklärte
Serum wird hinsichtlich Bindung in einem Sandwich-ELISA getestet.
HPV6- und HPV6-Derivat-VLPs (welche die neutralisierenden monoklonalen
Antikörper
binden) werden durch einen monoklonalen HPV6-Antikörper immobilisiert
werden. Die geklärten
polyklonalen Seren sollten nur eine minimale Bindung an HPV6-VLPs
zeigen. Ein starkes Signal gegen HPV6-derivatisierte VLPs demonstriert
eine Bindung an die haupt sächliche
neutralisierende Domäne
von HPV11 und daß das
polyklonale Serum neutralisierenden Antikörper enthält.
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Ein
zweiter Assay kann etabliert werden, um das Neutralisierungsvermögen in einer
Testserum-Probe unter Anwendung des Xenograph-Neutralisierungsassays
(Christensen et al., 1990, J. Virol. 64: 1936–1944; Christensen et al.,
1994, J. Gen. Virol. 75: 2271–2276)
zu demonstrieren.
- 1. Geklärte Seren gegen HPV6-Derivat-VLPs
werden nach dem oben angegebenen Protokoll hergestellt, wobei HPV6-Derivat-VLPs
HPV6-VLPs ersetzen. Polyklonale Seren, mit HPV6-VLPs geklärt, werden
als Kontrolle hergestellt.
- 2. Es wird eine Reihe von Verdünnungen der polyklonalen Seren
hergestellt und in dem Xenograph-Neutralisierungsassay analysiert,
um die neutralisierenden Titer der Seren festzustellen.
- 3. Parallele Sätze
von Verdünnungen
von HPV6-Derivat-geklärten
und HPV6-geklärten
Seren werden hergestellt und im Xenograph titriert.
- 4. Die Anwesenheit von neutralisierender Aktivität in dem
Xenograph-Assay, welche weitgehend durch Klärung mit HPV6-Derivat-VLPs,
jedoch nicht mit HPV6-VLPs, entfernt wird, demonstriert durch einen
biologischen Assay die Anwesenheit von Antikörpern in den Seren gegen das
HPV11-neutralisierende Epitop.
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BEISPIEL 7
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Transiente Expression
von VLPs in Sf9-Zellen
-
Das
HPV11-L1-Strukturgen wurde durch Anwendung der Polymerasekettenreaktion
(PCR) mit Primern, die anhand der veröfentlichten L1-Sequenz (8,17)
konstruiert worden waren, aus klinischen Isolaten geklont. Das CRPV-L1-Strukturgen
wurde durch PCR aus viraler genomischer DNA kloniert. Die L1-Gene
wurden für
die Expression in Sf9-Zellen in pVL1393 (Stratagene) subkloniert.
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Sf9-Zellen
wurden mit Hilfe des BaculoGold-Transfektionskits (Pharmingen, San
Diego, Ca) cotransfiziert. Die Transfektionen erfolgten nach den
Anweisungen des Herstellers mit der folgenden Modifizierung. 8 × 106 Sf9-Zellen wurden in einer 100-mm-Schale
mit 4 μg
BaculoGold-Virus-DNA und 6 μg
Testplasmid-DNA transfiziert. Zellen wurden nach 6 Tagen geerntet,
soweit nicht anders angegeben, und hinsichtlich VLP-Produktion einem
Westernblot- oder ELISA-Assay (unten) unterworfen.
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BEISPIEL 8
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Herstellung von Sf9-Extrakten
und ELISA-Assays
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Zellen
wurden 6 Tage nach der Transfektion geerntet. Die Platten wurden
abgekratzt, um die Zellen zu resuspendieren, und die Zellen wurden
durch eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gewonnen.
Die Zellen wurden in 300 μl
Aufbruchpuffer (1 M NaCl, 0,2 M Tris, pH 7,6) resuspendiert und
30 Sekunden lang auf Eis mit Hilfe eines Polytron PT 1200 B mit
einer PT-DA 1205/2-A-Sonde (Brinkman) in einem Falcon-2059-Röhrchen homogenisiert.
Die Proben wurden drei Minuten lang bei 2500 UpM in einer GPR-Zentrifuge
(Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) zentrifugiert, um die
Zelltrümmer
zu pelletieren. Die Röhrchen wurden
mit zusätzlichen
150 μl Aufbruchpuffer
gewaschen, die Überstände in einem
1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
gesammelt und erneut fünf
Minuten lang in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge (Brinkman) zentrifugiert. ELISA-Assays
wurden typischerweise am selben Tag begonnen.
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5 μl Extrakt
wurden in 50 μl
1%igem BSA in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, in
Aliquots auf eine 96-Mulden-Immulon 2-Mikrotiterplatte (Dynatech
Laboratories, Inc.) aufgebracht und über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Extrakte wurden entnommen und die Platte mit 5% Milchpulver/PBS
blockiert. Alle anschließenden
Waschschritte wurden mit 1%igem BSA/PBS durchgeführt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur
eine Stunde lang mit primärem
Antikörper
inkubiert. Primäre
Antikörper,
die monoklonalen Antikörper
CRPV.5A und H11.F1, wurden als Ascites-Stammlösung von Dr. Neil Christensen
erhalten. Sie sind VLP-abhängig und
typspezifische Antikörper,
welche CRPV-bzw. HPV11-VLPs erkennen (Neil Christensen, persönliche Mitteilung).
Sie wurden vor der Verwendung 105fach in
1%igem BSA/PBS verdünnt.
Nach dem Waschen in 1%igem BSA/PBS wurden die Platten eine Stunde
lang mit sekundärem
Antikörper,
mit Peroxidase markiertem Antimaus-Ziegen-IgG(g) (Kirkegaard&Perry Laboratories,
Inc.) inkubiert und in einer 103-Verdünnung in 1%igem
BSA in PBS eingesetzt. Nach einem letzten Waschschritt wurde ein
Meerrettichperoxidase-Assay durchgeführt und
die Extinktion bei 405 nm abgelesen.
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BEISPIEL 9
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Übertragung des HPV11-neutralisierenden
Epitops auf HPV6
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Aufgrund
der Untersuchungen in Beispiel 4 mutierten wir das HPV6-L1-Gen an
den Aminosäureresten 131,
245 und 277, um der HPV11-L1-Sequenz zu entsprechen. Darüber hinaus
inserierten wir ein Tyrosin nach Rest 131, was die Länge des
mutierten HPV6-L1-Gens um einen Rest auf 501 Aminosäuren verlängerte.
Wir bezeichneten diesen Klon als HPV6:4. Wir sagten voraus, daß diese
vier Veränderungen,
welche alle der HPV11-L1-Sequenz entsprechen, die Bindung der HPV11-spezifischen
neutralisierenden Antikörper
H11.B2, H11.F1 und H11.G5 erleichtern würden. Dies ist tatsächlich der
Fall, wie in der folgenden Tabelle gezeigt.
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Relative
Affinitätswerte
gegenüber
HPV6 und einem Derivat
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Dies
bestätigt,
daß die
vier Aminosäurereste
131, 132, 245 und 277 die Spezifität der bindenden Stelle für die neutralisierenden
Antikörper
H11.B2, H11.F1 und H11.G5 definieren.
-
Der
Antikörper
H11.H3 kann von den anderen drei neutralisierenden Antikörpern durch
Sensitivität
für die
Bindung an Position 346 und mangelnde Sensitivität für die Bindung an Position 131
unterschieden werden. Dies weist darauf hin, daß sich die Bindung dieses Antikörpers zum
C-Terminus verlagert hat, jedoch immer noch mit der Bindungsstelle
der anderen drei neutralisierenden monoklonalen Antikörper überlappt.
-
Wir
derivatisierten den oben definierten HPV6-Derivat-Klon weiter durch
Hinzufügung
einer zusätzlichen Änderung
an Position 345, um der Sequenz von HPV11 an ihrer Position 346
zu entsprechen. Wir bezeichneten diesen Klon als HPV6:5. Die Voraussage
ist, daß er
an alle vier neutralisierenden Antikörper, einschließlich H11.H3,
binden wird. Die Daten sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
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Relative
Affinitätswerte
gegenüber
HPV6 und ein Derivat
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Wie
erwartet, produzierte dieser Klon VLPs, welche die neutralisierenden
Antikörper
H11.B2, H11.F1 und H11.G5 binden konnten, und bestätigt diese
Beobachtung. Unerwarteterweise band er nicht den Antikörper H11.H3,
welches darauf hinweist, daß eine
zusätzliche
Veränderung
neben der an Position 345 ebenfalls für die Bindung von H11.H3 erforderlich
ist.
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BEISPIEL 10
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Bindung durch den neutralisierenden
monoklonalen Antikörper
H11.H3
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Zur
weiteren Untersuchung der Bindung des Antikörpers H11.H3 wird ein zusätzlicher
Austausch an Rest 438 des HPV6-L1-Gens, um dem Rest von HPV11-L1
an 439 zu entsprechen, vorgenommen. Der zusätzliche Austausch wird sowohl
bei dem Klon HPV6:4b (mit Austauschen bei 132, 245, 277 und 345)
als auch HPV6:5 vorgenommen. Dies wird den Klon HPV5b (132, 245,
277, 345 und 435) sowie HPV6:6 ergeben. Der Klon HPV6:5b bindet
den Antikörper
H11.H3 und der Klon HPV6:6 bindet die Antikörper H11.B2, H11.F1, H11.G5
und H11.H3. Diese Klone zeigten die Sensitivität, welche in den Assays, die
unten in den Ansprüchen 2
und 3 und oben in den Beispielen 7 und 8 ausgeführt sind, erhältlich ist.
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BEISPIEL 11
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Zur
weiteren Untersuchung der Bindung der neutralisierenden monoklonalen
Antikörper
mutierten wir den Klon HPV6:4 an den vier individuellen Positionen
zurück
und demonstrierten, daß die
Rückmutation
an lediglich den Resten 131 und 132 zu einem Verlust der Bindung
führte.
Die Erzeugung eines zusätzlichen HPV6-L1-Klons
mit nur diesen beiden Veränderungen,
HPV6:2, demonstrierte, daß diese
beiden Veränderungen
alleine für
die Bindung der HPV11-neutralisierenden monoklonalen Antikörper ausreichend
sind. Somit legen diese Studien zusammen das minimale Epitop für die neutralisierenden
Antikörper
fest.