DE69628008T2

DE69628008T2 - Regulierung der neutrophil elastase synthese und freisetzung

Info

Publication number: DE69628008T2
Application number: DE69628008T
Authority: DE
Inventors: A. Aarden; A. Creasey; Kirk Johnson
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: EP0831893B1; EP0831893A1; CA2221601A1; ATE239501T1; JPH11507060A; AU708394B2; WO1996040224A1; JP2007145870A; DE69628008D1; AU6154896A

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor (Tissue-Factor-Pathway-Inhibitor = TPFI) bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibition der Synthese und Freisetzung von neutrophiler Elastase und IL-8 und zur Inhibition der Plasmin-Aktivität. Es betrifft ebenfalls ein in-vitro-Verfahren zur Messung der Reaktion eines Patienten auf TPFI.

Hinterrund der Erfindung

Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor (TPFI) inhibiert die Koagulationskaskade auf mindestens zwei Wegen: Verhinderung der Bildung eines Faktor VIIa/Gewebsthrombokinase- Komplexes und durch Bindung an das aktive Zentrum von Faktor Xa. Die Primärsequenz von TPFI, abgeleitet aus der cDNA-Sequenz, deutet darauf hin, dass das Protein drei Enzym- Inhibitor-Domänen des Kunitz-Typs einschließt. Die erste dieser Domänen wird für die Inhibition des Faktor VIIa/Gewebsthrombokinase-Komplexes benötigt. Die zweite Kunitz- Typ-Domäne wird für die Inhibition von Faktor Xa benötigt. Die Funktion der dritten Kunitz- Typ-Domäne ist unbekannt. TFPI besitzt keine bekannte enzymatische Aktivität und es wird angenommen, dass TFPI seine Protease-Angriffsziele auf stöchiometrische Weise inhibiert; nämlich durch Bindung einer TFPI-Domäne des Kunitz-Typs an das aktive Zentrum eines Protease-Moleküls. Es wird angenommen, dass das Carboxy-terminale Ende von TFPI eine Rolle bei der Zelloberflächen-Lokalisierung durch Heparin-Bindung und durch Interaktion mit Phospholipid spielt. TFPI ist auch als Lipoprotein-assoziierter Koagulations-Inhibitor (Lipoprotein Associated Coagulation Inhibitor = LACI), Gewebsthrombokinase-Inhibitor (Tissue Factor Inhibitor = TFI) und Extrinsisches-System-Bahn-Inhibitor (Extrinsic Pathway Inhibitor = EPI) bekannt.
Reifes TFPI ist 276 Aminosäuren lang und besitzt ein negativ geladenes Aminoterminales Ende und ein positiv geladenes Carboxy-terminales Ende. TFPI schließt 18 Cystein-Reste ein und bildet 9 Disulfid-Brücken, wenn es korrekt gefaltet ist. Die Primär- Sequenz enthält ebenfalls drei Asn-X-Ser/Thr-N-verknüpfle Glykosylierungs-Konsensus- Stellen, wobei sich die Asparagin-Reste an den Positionen 145, 195 und 256 befinden. Der Kohlenhydrat-Bestandteil von reifem TFPI beträgt näherungsweise 30% der Proteinmasse.
Daten aus proteolytischer Kartierung und massenspektrometrische Daten implizieren jedoch, dass die Kohlenhydrat-Anteile verschiedenartig sind. TFPI wird ebenfalls am Serin-Rest an Position 2 des Proteins zu verschiedenen Graden phosphoryliert vorgefunden. Die Phosphorylierung scheint die Funktion von TFPI nicht zu beeinflussen.
TFPI wurde aus menschlichem Plasma und menschlichen Zellkultur-Zellen einschließlich HepG2-, Chang Leber- und SK Hepatom-Zellen isoliert. Rekombinantes TFPI wurde in Maus C127-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen, Eierstockzellen vom chinesischen Hamster und menschlichen SK Hepatomzellen exprimiert. Es wurde in Tiermodellen gezeigt, dass rekombinantes TFPI aus den Maus C127-Zellen Gewebsthrombokinase induzierte Koagulation inhibiert.
Eine nicht-glykosylierte Form von rekombinantem TFPI wurde aus Escherichia coli (E. coli)-Zellen hergestellt und isoliert, wie in U.S. Pat. Nr. 5.212.091 offenbart. Es wurde gezeigt, dass diese Form von TFPI aktiv in Bezug auf die Inhibition von Faktor Xa aus Rind und die Inhibition von durch menschliche Gewebsthrombokinase induzierte Koagulation im Plasma ist. Es wurden auch Verfahren zur Reinigung von TFPI aus Hefezellkultur-Nährlösung offenbart, wie zum Beispiel in Petersen et al. J. Biol. Chem. 18: 13344-13351 (1993).
Kürzlich wurde ein weiteres Protein mit einem hohen Grad struktureller Identität zu TFPI identifiziert. Sprecher et al. Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91: 3353-3357 (1994). Die vorhergesagte Sekundärstruktur dieses Proteins, das mit TFPI-2 bezeichnet wurde, ist praktisch identisch zu TFPI mit 3 Kunitz-Typ-Domänen, 9 Cystein-Cystein-Verknüpfungen, einem sauren Amino-Terminus und einem basischen Carboxy-terminalen Schwanz. Die drei Domänen vom Kunitz-Typ in TFPI-2 weisen 43%, 35% und 53% Identität der Primärsequenz mit den jeweiligen Domänen 1, 2 und 3 vom Kunitz-Typ in TFPI auf. Rekombinantes TFPI-2 inhibiert stark die amidolytische Aktivität von Faktor VIIa/Gewebsthrombokinase. Im Gegensatz dazu ist TFPI-2 ein schwacher Inhibitor der amidolytischen Aktivität von Faktor Xa.
Es wurde gezeigt, dass TFPI in einem Escherichia coli (E. coli)-septischer Schock- Lethalitäts-Modell im Pavian die Sterblichkeit verhindert. Creasey et al., J. Clin. Invest. 91: 2850-2860 (1993). Verabreichung von TFPI in einer Menge von 6 mg/kg Körpergewicht kurz nach Infusion einer tödlichen Dosis E. coli hat dazu geführt, dass alle fünf mit TFPI behandelten Tiere im Vergleich mit der durchschnittlichen Überlebenszeit von fünf Kontrolltieren von 39,9 Stunden, bei erheblicher Verbesserung der Lebensqualität überlebt haben. Die Verabreichung von TFPI hat ebenfalls dazu geführt, dass die Koagulations- Reaktion und verschiedene Ausmaße an Zellschäden erheblich schwächer waren, und dass die normalerweise beobachtete pathologische Symptomatik bei von E. coli-Sepsis betroffenen Organen einschließlich Nieren, Nebennieren und Lungen, erheblich vermindert wurde.
Aufgrund seiner gerinnungshemmenden Eigenschaften kann TFPI auch dazu verwendet werden, das Auftreten einer Thrombose während eines mikrovaskulären chirurgischen Eingriffs zu verhindern. Zum Beispiel offenbart U.S. 5.276.015 die Verwendung von TFPI in einem Verfahren zur Verminderung der Thrombogenität mikrovaskulärer Anastomosen, wobei TFPI am Ort der mikrovaskulären Anastomose gleichzeitig zu der mikrovaskulären Rekonstruktion verabreicht wird.
WO 93/24143 offenbart die Verwendung von LACI/TFPI zur Behandlung von Krankheitszuständen, die mit akuter oder chronischer Entzündung einschließlich Sepsis und septischem Schock verbunden sind.
WO 93/14122 offenbart Varianten von menschlicher Kunitz-Typ-Protease-Inhibitor- Domäne I von TFPI zur Verwendung in therapeutischen Anwendungen, die für natives Aprotinin oder Aprotinin-Analoga empfohlen werden. (Siehe auch WO 93/14121 und WO 93/120, welche jeweils Varianten der Kunitz-Typ-Protease-Domänen II und III offenbaren).
WO 9/18830 offenbart Varianten der ersten Kunitz-Domäne von LACI/TFPI, welche Plasmin inhibiert. Es offenbart ebenfalls die Verwendung solcher Mutanten zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheitszuständen, die Plasmin einschließen.
Freisetzung von neutrophiler Elastase ist mit akuten Entzündungskrankheiten einschließlich ARDS und mehrfachem Organversagen verbunden. Idle et al., (1985) Am. Rev. Respire. Ids. 132: 1098. Joshua, M., et al., (1994) Am. J. Respire. Crate. Care Med. 150: S123. Akute Entzündungsreaktionen einschließlich ARDS, Reperfusionsschädigung (einschließlich Lungen-Reperfusionsschädigung), Arthritis und Sepsis sind ebenfalls mit der Produktion von Cytokinen wie zum Beispiel IL-8 verbunden. Es wird angenommen, dass IL-8 eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung und Aktivierung von PMNs an Entzündungsorten spielt.
Gegenwärtig gibt es kein einziges Agens, das sowohl Thrombose aufgrund Aktivierung der extrinsischen Koagulations-Bahn als auch die Freisetzung von Entzündungs- Übertragungssubstanzen wie zum Beispiel neutrophiler Elastase wirkungsvoll inhibieren könnte.

Zusammenfassung der Erfindung

Jetzt wurde herausgefunden, dass Aktivierung der Koagulation und LPS (der aktive Bestandteil von bakteriellem Endotoxin) hinsichtlich der Freisetzung von Elastase synergistisch wirken, und dass TFPI die durch Aktivierung der Koagulation und durch Koagulation in Gegenwart von LPS induzierte Freisetzung von Elastase inhibiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass TFPI die Plasmin-Aktivität in therapeutisch relevanten Dosen inhibiert. Daher wurde gezeigt, dass TFPI bei aus Freisetzung von Elastase hervorgehende Entzündung einschließenden Krankheitszuständen relevant und verwendbar ist. Dementsprechend kann TFPI zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung klinischer Indikationen wie zum Beispiel schwerer akuter Pankreatitis, Emphysem, mehrfachem Organversagen und zystischer Fibrose verwendet werden.
Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass Koagulations-Aktivierung/Gerinnung in normalen menschlichen Vollblut-Kulturen die Produktion von IL-8 induziert. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass Koagulations-Alctivierung/Gerinnung und LPS zusammen in Vollblut-Kulturen synergistisch auf verstärkte Produktion von IL-8 wirken. TFPI ist in der Lage, die unter beiden umständen induzierte Produktion von IL-8 zu blockieren.
Schließlich gestatten die Beobachtungen, dass TFPI die Plasmin-Aktivität und die Synthese und Freisetzung von neutrophiler Elastase und IL-8 inhibiert, die Verwendung von Assays auf Plasmin-Aktivität, Elastase und IL-8, die dazu verwendet werden können, die Patientenreaktion auf TFPI zu bestimmen.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung daher die Verwendung eines Agenses bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit bereit, die mit erhöhter Synthese und Freisetzung von neutrophiler Elastase assoziiert ist, wobei das Agens fähig ist, (1) die Koagulation und (2) die Freisetzung neutrophiler Elastase zu inhibieren, das Mittel Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor (Tissue-Factor-Path-Inhibitor = TPFI) oder ala- TFPI ist, wodurch ein Symptom oder mehrere Symptome, die mit der Krankheit assoziiert sind, abgeschwächt wird/werden und wobei die Krankheit aus
(a) schwerer akuter Pankreatitis;
(b) Emphysem;
(c) mehrfachem Organversagen und
(d) zystischer Fibrose
ausgewählt ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines Agenses bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention eines Symptoms einer Krankheit bereit, die mit erhöhter Synthese und Freisetzung von neutrophiler Elastase assoziiert ist, wobei das Mittel fähig ist, (1) die Koagulation und (2) die Freisetzung neutrophiler Elastase zu inhibieren, das Mittel Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor (Tissue-Factor-Path-Inhibitor = TPFI) oder ala-TFPI ist, wodurch die Gefahr einer Entwicklung des Symptom bei dem Individuum reduziert wird und wobei die Krankheit aus
(a) schwerer akuter Pankreatitis;
(b) Emphysem und
(c) zystischer Fibrose
ausgewählt ist.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein in vitro-Verfahren zur Messung der Reaktion eines Patienten auf TFPI bereit, umfassend: Bestimmen des Spiegels eines oder mehrerer Indikatoren für die Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor (TPFI)-Wirksamkeit in einer Probe, die einem Patienten entnommen wurde, wobei der eine Indikator oder die mehreren Indikatoren aus neutrophiler Elastase, IL-8 und Plasmin ausgewählt wird/werden, wobei ein erniedrigter Spiegel eines Indikators oder mehrerer Indikatoren eine Reaktion des Patienten auf TFPI anzeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde bei dem Patienten, dessen Reaktion in dem in vitro-Verfahren gemessen wird, eine Krankheit oder mehrere Krankheiten diagnostiziert wurde(n), die mit erhöhter Synthese und Freisetzung neutrophiler Elastase assoziiert ist/sind, ausgewählt aus:
(a) schwerer akuter Pankreatitis;
(b) Emphysem;
(c) rheumatoider Arthritis;
(d) mehrfachem Organversagen;
(e) zystischer Fibrose;
(1) Sepsis; und
(g) Atemnotsyndrom bei Erwachsenen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wurde bei dem Patienten, dessen Reaktion in dem in vitro-Verfahren gemessen wird, eine Krankheit oder mehrere Krankheiten diagnostiziert wurde(n), die mit erhöhter Synthese und Freisetzung von IL-8 assoziiert ist/sind, ausgewählt aus:
(a) Atemnotsyndrom bei Erwachsenen;
(b) Reperfusionsschädigung;
(c) Sepsis; und
(d) Arthritis.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt die Produktion neutrophiler Elastase in unverdünnten Vollblut- Kulturen unter den folgenden Bedingungen: Kontrolle (Gerinnsel); TFPI (10 ug/ml); LPS (1 ng/ml) (Gerinnsel); TFPI + LPS und Heparin (50 u/ml).
Abb. 2 zeigt die Produktion neutrophiler Elastase in koagulierenden 1 : 10 Vollblut-Kulturen, die verschiedene Hirudin-Konzentrationen einschließen.
Abb. 3 zeigt die Produktion neutrophiler Elastase in verdünnten (1 : 10) Vollblut- Kulturen, die verschiedene Konzentrationen an TFPI und Hirudin oder Heparin einschließen.
Abb. 4 zeigt die Produktion neutrophiler Elastase in verdünnten (1 : 10) Vollblut- Kulturen, die 1 ng/ml LPS zusätzlich zu verschiedenen Konzentrationen an TFPI und Hirudin oder Heparin einschließen.
Abb. 5 stellt die Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass TFPI die Plasmin-Aktivität inhibiert.
Abb. 6 stellt die Ergebnisse von Experimenten dar, die zeigen, dass IL-8-Spiegel in einer Vollblut-Kultur in Gegenwart von TFPI drastisch reduziert sind.
Abb. 7 zeigt den synergistischen Effekt von Koagulations- Aktivierung/Gerinnung und LPS auf IL-8-Spiegel in Vollblut-Kulturen.
Abb. 8 und 9 zeigen die Ergebnisse von Zeitverlaufs-Experimenten, welche IL-8-Spiegel in Vollblut-Kulturen in der Abwesenheit (Abb. 8) und der Gegenwart (Abb. 9) von LPS messen.
Abb. 10 zeigt den Effekt von TFPI auf die Cytokin-Produktion in Vollblut- Kulturen, die 5 U/ml Hirudin und 1 ng/ml LPS einschließen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Wie es hierin verwendet wird bezieht sich "TFPI" auf den reifen Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor. Wie oben angemerkt wurde, ist TFPI dem Fachmann auch als Lipoprotein-assoziierter Koagulations-Inhibitor (Lipoprotein Associated Coagulation Inhibitor = LACI), Extrinsisches-System-Bahn-Inhibitor (Extrinsic Pathway Inhibitor = EPI) und Gewebsthrombokinase-Inhibitor (Tissue Factor Inhibitor = TFI) bekannt. Für die Herstellung in bakteriellen Zellen leicht modifizierter TFPI ist in der Definition ebenfalls mit eingeschlossen. Zum Beispiel wurde ein TFPI-Analog mit einem Alanin-Rest am Aminoterminalen Ende des TFPI-Polypeptids in Escherichia coli hergestellt. Siehe U.S. 5.212.091.
Wie es hierin verwendet wird bezieht sich "pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung" auf eine Zusammensetzung, welche die biologische Aktivität von formuliertem TFPI nicht negiert oder vermindert, und welche keine nachteiligen biologischen Wirkungen aufweist, wenn formuliertes TFPI einem Patienten verabreicht wird.
Wie es hierin verwendet wird, schließt "Patient" menschliche und tierische Patienten ein.

B. Allgemeine Verfahren

TFPI kann durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, wie in U.S. 5.212.091 offenbart. In Kürze, TFPI wird in Escherichia coli-Zellen exprimiert, und die TFPI einschließenden Einschlusskörper werden aus dem Rest an zellulärem Material isoliert. Die Einschlusskörper werden der Sulfitolyse unterzogen, unter Verwendung von Ionenaustausch- Chromatographie gereinigt, durch Disulfid-Austauschreaktion rückgefaltet, und das rüchgefaltete, aktive TFPI wird durch Kationenaustausch-Chromatographie gereinigt. TFPI kann auch in Hefe hergestellt werden.

Vollblut-Kultur

Das Vollblut-Kultur-System kann wie folgendermaßen durchgeführt werden. Blut von normalen Spendern wird in einem Antikoagulans gesammelt. Venöses Blut von normal gesunden Spendern wurde direkt in klinischen Heparin- oder EDTA (K3)-Vacutainern (Baxter) gesammelt. Alternativ wurde venöses Blut in sterilen Polypropylen-Spritzen gesammelt und unmittelbar darauf in Mikrotiter-Schalen überführt, welche die angegebenen Konzentrationen verschiedener Zusätze einschließen, einschließlich:
a. 20-50 U/ml Heparin (Blut vollständig antikoaguliert, sogar mit 10X- Verdünnung)
b. 50-60 U/ml Hirudin (rekombinante Hefe, American Diagnostica)
c. 10 ug/ml TFPI
d. 1 U/ml Heparin (ESI)
e. 10 mM EDTA (für isolierte Neutrophile)
f. 1 ng/ml LPS (E. coli Rc) (Sigma, St. Louis, MO)
g. 3,8% Citrat (für isolierte PBMC)
TFPI wurde bei 11 mg/ml in 2 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat pH 7,2 und 0,14 M NaCl formuliert. In Vacutainern gesammeltes Blut wurde vor Zugabe in die Kultur-Schalen rasch in Polypropylen-Gefäße überführt.
Vollblut wurde in 96-Schalen-Mikrotiterplatten (Corning) in einem Volumen von 200 ul pro Schale bei 37ºC, 5% CO&sub2; für 2-48 Stunden in einer befeuchteten Atmosphäre kultiviert. Typischerweise liegt das Blut in einer Endverdünnung von 1 : 8 bis 1 : 10 in RPMI 1640-Nährlösung + 0,1% "Niedrig-Endotoxin" fetalem Kälberserum (fetal calf serum = FCS) (Hyclone, Logan, UT) vor. Die Kulturen wurden dann bei 400 · g für 1 Minute bei 4ºC herunter zentrifugiert. Flüssigkeiten im Überstand wurden dann zu verschiedenen Zeitpunkten (typischerweise 2-2,5 Stunden) zur Analyse löslicher Mediatorsubstanzen entfernt. Im Falle dass während der Kultivierung Gerinnung aufgetreten war wurden die Inhalte der geronnenen Schalen und der Vergleichsgruppen in Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und kurz herunter zentrifugiert, um vor der Gewinnung der Überstände Zellen und Fibringerinnsel zu pelletieren. Lösliche Mediatorsubstanzen wurden in den Überständen durch ELISA oder einen anderen Bioassay gemessen.

Peripherblut mononukleare Zellen (Peripheral Blood Mononuclear Cell = PBMC)-Kulturen

Vollblut wurde in EDTA-Vacutainern gesammelt und als Gemisch aus 7-8 ml Blut auf 5 ml NIM-Nährlösung in 15 ml-Polystyren-Gefäßen auf einen Ficoll-Gradienten (NIM- Nährlösung, Cardinal Assoc.) überschichtet. Die Gefäße wurden bei 500 · g für 30 Minuten zentrifugiert, und die Schicht aus mononuklearen Zellen wurde als die oberste Bande in dem Gradienten isoliert. In einigen Experimenten wurden PBMC auch unter Verwendung von mit Citrat versetzten Zellaufbereitungs-Gefäßen (Becton-Dickinson, Mountain View, CA), worin Blut in dem selben Gefäß gesammelt und fraktioniert wird, isoliert. Die Isolierung von PBMC auf beide Arten hat zu identischen Ergebnissen geführt. Nach Waschen mit steriler Salzlösung wurden PBMC bei ~1 · 10&sup5; Zellen pro Schale in RPMI/0,1% FCS wie oben für Vollblut- Zellkulturen beschrieben, kultiviert.

Assay für lösliche Mediatorsubstanzen

ELISA-Assays für Elastase, IL-8, IL-6 und TNF wurden wie folgendermaßen durchgeführt. 96 Schalen-Mikrotiterplatten wurden über Nacht mit den entsprechenden Antikörpern beschichtet. Die Platten wurden gewaschen und jeder Schale wurden Proben zusammen mit Biotin-markiertem Antikörper und Serum zugesetzt. Die Platten wurden dann inkubiert und gewaschen. Streptavidin-Meerettich-Peroxidase wurde dann den Schalen zugesetzt und erlaubt zu inkubieren. Die Schalen wurden erneut gewaschen und mit TMB, Natriumacetat und Peroxid entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 M Schwefelsäure gestoppt, und die Platten wurden bei O. D. 450 nm ausgelesen. Wenn Assays für Elastase durchgeführt werden existiert eine Inkubationsphase zwischen der Zugabe der Proben und den biotinylierten anti-Elastase-Antikörpern. Für TNF werden Poly-Streptavidin- Meerettich-Peroxidase und Milch anstelle von Strep-HRP und Serum verwendet.
Spectrozyme-Plasmin-Assay-Kits wurden von American Diagnostica bezogen. Quantikine-IL-1β-ELISA-Kits wurden von R&D Systems bezogen. Bei der Durchführung der Assays wurde den Anleitungen der Hersteller gefolgt.

Koagulations-Aktivierung

Messung des Ausmaßes der Koagulations-Aktivierung wurde auf qualitative Weise durch Beobachtung der Gerinnung und quantitativ durch immunologischen Nachweis des Thrombin : Antithrombin (TAT)-Komplexes und der Fibrinopeptid A-Spiegel gemäß den Protokollen der Hersteller (Diagnostica Stago, Frankreich) durchgeführt. Überstände wurden ebenfalls routinemäßig auf chromogene Aktivität gegen verschiedene Substrate einschließlich Spectrozym Xa und TH (Thrombin) (American Diagnostica) untersucht zur Korrelation mit den obigen Maßen sowie um die Aktivität gereinigter Faktoren, die zu isolierten PBMC- Kulturen zugesetzt wurden, einschließlich Prothrombin, α-Thrombin und Faktor Xa, zu bestätigen.

C. Beispiele

Beispiel 1

Ein Kultursystem, das normales menschliches Blut verwendet, worin Koagulations- Aktivierung und Gerinnung kontrolliert werden konnten, und Entzündungs-Mediator- Reaktionen in der Gegenwart oder der Abwesenheit von LPS evaluiert werden konnten, wurde etabliert. Im Wesentlichen wird Blut in Antikoagulans-Konzentrationen gesammelt, wie zum Beispiel dem irreversiblen Thrombin-Inhibitor Hirudin. Bei Kultivierung bei Blut- Endverdünnungen von 1 : 10 konnten Koagulations-Aktivierung und Gerinnung beobachtet werden. Das Ausmaß von Koagulations-Aktivierung und Gerinnung können durch angemessene Zugabe von Antikoagulantien bei der Blutverdünnung kontrolliert werden.
Während die meisten Untersuchungen der Auswirkung von Koagulations- Alctivierung/Gerinnung auf die Elastase-Freisetzung in 1 : 10 verdünntem Blut durchgeführt worden sind, wurde das Phänomen in unverdünntem Vollblut beobachtet, wie in Abb. 1 dargestellt. Die Inkubation wurde für zwei Stunden durchgeführt. Gerinnung des Vollbluts hat zu signifikanter Freisetzung von Elastase in den Überstand geführt, verglichen mit Blut, das mit 50 U/ml Heparin behandelt wurde. In unverdünntem Vollblut hat die Zugabe von LPS nur zu einer geringen Erhöhung der Elastase-Produktion geführt, wahrscheinlich weil das Koagulationssignal selbst in der Kultur so stark ist. TFPI-Zugabe bei t = 0 hebt die Koagulation und die durch Koagulation + LPS induzierte Freisetzung von Elastase auf.
Wie in Abb. 2 gezeigt, ist die Verdünnung von Hirudin, so dass Koagulations- Aktivierung/Gerinnung durch Thrombin stattfinden kann, von Elastase-Freisetzung begleitet, welche am deutlichsten bei niedrigen Hirudin-Konzentrationen (5 & 10 U/ml) hervortritt, wobei Gerinnung zum Zeitpunkt der Ernte (t = 2 Stunden) beobachtet werden kann. Die Zugabe von niedrigen Konzentrationen TFPI zu Hirudin-behandelten Blutkulturen (5 U/ml Hirudin) blockiert die Freisetzung von Elastase auf Dosis-abhängige Weise (Abb. 3). Zugabe von LPS in den Kulturen mit niedriger Hirudin-Konzentration führt zu signifikant mehr Elastase-Produktion (Abb. 4). Trotzdem inhibiert TFPI deutlich die Freisetzung von Elastase.
Im Gegensatz zu antikoaguliertem Blut, das in Heparin gesammelt wurde, weist in TFPI gesammeltes Blut keine synergistische Freisetzung von Elastase auf, die bei der Kultivierung mit LPS beobachtet wird. Darüber hinaus kann die durch Koagulation/LPS induzierte Freisetzung von Elastase in Heparin-antikoaguliertem Blut durch Zugabe von TFPI zu der Kultur bei t = 0 inhibiert werden (Abb. 4).
Schließlich wurde der Einfluss der Gegenwart von TFPI in den Kulturen auf die Synthese und Freisetzung von Plasmin bestimmt. Abb. 5 zeigt, dass ansteigende Konzentrationen TFPI zu vermindertem Nachweis von Plasmin-Aktivität in den Kulturen führen. Der inhibitorische Einfluss von TFPI auf Plasmin-Aktivität kann daher als Marker für die Wirksamkeit von TFPI in Patienten dienen.

Beispiel 2

Unter Verwendung des oben beschriebenen Kultur-Systems wurde herausgefunden, dass die IL-8-Produktion infolge der Koagulations-Aktivierung/Gerinnung ansteigt. Koagulations-Aktivierung/Gerinnung und LPS scheinen auch einen synergistischen Effekt auf IL-8-Synthese und -Freisetzung aufzuweisen.
Verdünnung von Hirudin in den Blut-Kulturen gestattet die Thrombin-Verstärkung der Koagulationskaskade, was zu signifikanter Koagulations-Aktivierung und nachweisbarer Gerinnung führt. In Übereinstimmung mit der Koagulations-Alctivierung/Gerinnung steht die durch ELISA nachweisbare IL-8-Produktion in den Kultur-Überstand (Abb. 6). TFPI inhibiert die Koagulations-Aktivierungs/Gerinnungs-induzierte IL-8-Produktion auf Dosis- abhängige Weise (Abb. 6).
Wenn LPS (1 ng/ml) in den Hirudin-behandelten Blut-Kulturen eingeschlossen ist, wird unter Bedingungen, bei denen eine signifikante Koagulations-Aktivierung/Gerinnung stattfindet (d. h. 5-10 U/ml Hirudin) ein synergistischer Anstieg der IL-8-Produktion beobachtet (Abb. 7). Die Reaktion ist synergistisch, da Koagulations- Aktivierung/Gerinnung zu ~350 pg/ml IL-8 führt, und LPS ~450 pg/ml IL-8 induziert unter vollständig antikoagulierten Bedingungen (50 U/ml Hirudin oder 5 U/ml Heparin), aber die Kombination von Koagulations-Aktivierung/Gerinnung und LPS zur Produktion von ~2500 pg/ml IL-8 führt. Wie in Abb. 7 gezeigt, inhibiert TFPI die synergistische IL-8- Produktion auf Dosis-abhängige Weise.
Die Fähigkeit von TFPI, die durch Koagulations-Aktivierung/Gerinnung oder die Kombination von Koagulations-Aktivierung/Gerinnung + LPS induzierte IL-8-Produktion zu unterbinden beruht nicht auf einer veränderten Kinetik der Cytokin-Produktion (Abb. 8 und 9). TFPI inhibiert die induzierte IL-8-Produktion zu allen ausgewerteten Zeitpunkten.
Die beschriebene IL-8-Reaktion auf die Kombination von Koagulations- Aktivierung/Gerinnung + LPS besitzt etwas einzigartiges, da die Kombination nicht zu synergistischer Produktion von TNFα, IL-6 oder IL-1β führt (Abb. 10). Darüber hinaus ist die in niedrig-Hirudin + LPS-Kulturen induzierte Produktion von TNFα oder IL-1ß nicht signifikant inhibiert durch zugesetzte TFPI-Konzentrationen von 10 ug/ml. Während die IL-6- Produktion durch TFPI schwach inhibiert wird, ist die IL-8-Reaktion sehr signifikant durch TFPI vermindert. Der Mechanismus für den TFPI-Einfluss auf die induzierte IL-8-Produktion in diesen Kulturen wurde nicht bestimmt. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein ist es möglich, dass die Fähigkeit von TFPI zur Inhibition der Koagulations-Aktivierung auf direkter Inhibition von Faktor Xa und der Inhibition von Faktor VIIa/Gewebsthrombokinase auf Xa-abhängige Weise beruht. Dennoch ist es möglich, dass TFPI ein wenig die Fähigkeit besitzt, LPS-Aktivität direkt zu inhibieren.

Beispiel 3

Der inhibitorische Effekt von TFPI auf die Synthese und Freisetzung von neutrophiler Elastase, IL-8 und Plasmin kann dazu verwendet werden, die Wirksamkeit einer Behandlung in Patienten mit Thrombose-Funktionsstörungen, Patienten mit Krankheiten, die mit erhöhter neutrophiler Elastase assoziiert sind, und Patienten mit Krankheiten, die mit erhöhtem IL-8 assoziiert sind, zu bestimmen. Es wird angenommen, dass die Spiegel neutrophiler Elastase, IL-8 und Plasmin eine Voraussage über das Ansprechverhalten eines Patienten auf TFPI und eine Prognose zulassen. Patienten, die TFPI bekommen haben, wird Blut entnommen und auf die Spiegel neutrophiler Elastase, IL-8-Spiegel, auf Plasmin-Aktivität oder irgendeine Kombination dieser Indikatoren untersucht. Die Spiegel jeder dieser Indikatoren können mit einem etablierten historischen Grundwert verglichen werden, wie sie durch Durchmusterung von Populationen normaler menschlicher Freiwilliger bestimmt wurden. Alternativ kann der Spiegel an neutrophiler-Elastase, IL-8 oder Plasmin pro Patient über einen Zeitraum vor und nach Verabreichung von TFPI verfolgt werden. Im Falle, dass die Spiegel des Indikators oder der Indikatoren, die getestet wurden, nicht vermindert waren, kann eine zusätzliche Dosierung mit TFPI erforderlich sein.

Claims

1. Verwendung eines Agenses bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, die mit erhöhter Synthese und Freisetzung von neutrophiler Elastase assoziiert ist, wobei das Agens fähig ist, (1) die Koagulation und (2) die Freisetzung neutrophiler Elastase zu inhibieren, das Mittel Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor (Tissue-Factor- Pathway-Inhibitor = TFPI) oder ala-TFPI ist, wodurch ein Symptom oder mehrere Symptome, die mit der Krankheit assoziiert sind, abgeschwächt wird/werden und wobei die Krankheit aus

(a) schwerer akuter Pancreatitis,

(b) Emphysem,

(c) mehrfachem Organversagen und

(d) zystischer Fibrose ausgewählt ist.

2. Verwendung eines Agenses bei der Herstellung eines Medikaments zur Prävention eines Symptoms einer Krankheit, die mit erhöhter Synthese und Freisetzung von neutrophiler Elastase assoziiert ist, wobei das Mittel fähig ist, (1) die Koagulation und (2) die Freisetzung neutrophiler Elastase zu inhibieren, das Mittel Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor (Tissue-Factor-Pathway-Inhibitor = TFPI) oder ala-TFPI ist, wodurch die Gefahr einer Entwicklung des Symptoms bei dem Individuum reduziert wird und wobei die Krankheit aus:

(a) schwerer akuter Pancreatitis,

(b) Emphysem und

(c) zystischer Fibrose ausgewählt ist.

3. In vitro-Verfahren zur Messung der Reaktion eines Patienten auf TFPI, umfassend Bestimmen des Levels eines oder mehrerer Indikatoren für die Gewebsthrombokinase-Bahn-Inhibitor (TFPI)-Wirksamkeit in einer Probe, die einem Patienten entnommen wurde, wobei der eine Indikator oder die mehreren Indikatoren aus neutrophiler Elastase, IL-8 und Plasmin ausgewählt wird/werden, wobei ein erniedrigter Level eines Indikators oder mehrerer Indikatoren eine Reaktion des Patienten auf TFPI anzeigt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Level an neutrophiler Elastase, IL-8 und Plasmin bestimmt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei bei dem Patienten eine Krankheit oder mehrere Krankheiten diagnostiziert wurde(n), die mit erhöhter Synthese und Freisetzung neutrophiler Elastase assoziiert ist/sind, ausgewählt aus:

(a) schwerer akuter Pancreatitis,

(b) Emphysem,

(c) rheumatoider Arthritis,

(d) mehrfachem Organversagen,

(e) zystischer Fibrose,

(f) Sepsis und

(g) Atemnotsyndrom bei Erwachsenen.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei bei dem Patienten eine Krankheit diagnostiziert wurde oder mehrere Krankheiten diagnostiziert wurden, die mit erhöhter Synthese und Freisetzung von IL-8 assoziiert ist/sind, ausgewählt aus:

(a) Atemnotsyndrom bei Erwachsenen,

(b) Reperfusionschädigung,

(c) Sepsis und

(d) Arthritis.

7. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei bei dem Patienten ein mit Thrombose in Verbindung stehendes Syndrom diagnostiziert wurde, das mit erhöhter Synthese und Freisetzung von neutrophiler Elastase oder erhöhter Synthese und Freisetzung von IL-8 assoziiert ist.