DE69622425T2

DE69622425T2 - Optischer apparat zur durchführung eines immunoassays

Info

Publication number: DE69622425T2
Application number: DE69622425T
Authority: DE
Inventors: E. Lyst; Gary Neel
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1995-09-14
Filing date: 1996-08-28
Publication date: 2003-01-30
Anticipated expiration: 2016-08-29
Also published as: EP0864089B1; CA2231186A1; AU6903296A; ES2179949T3; CA2231186C; EP0864089A4; MX9801887A; DE69622425D1; WO1997010506A1; JP3474880B2; EP0864089A1; JP2000506595A; US5639668A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Immungssays und solche Analysen, bei denen eine fluoreszierende Markierung, die imstande ist, Fluoreszenzstrahlung bei Anregung durch noch energiereichere Anregungsstrahlung zu emittieren, in einen Bestandteil eines Antigen/Antikörper-Komplexes oder eines ähnlichen Komplexes eingebracht ist. Insbesondere betrifft die Erfindung optische Vorrichtungen, die zur Durchführung der Analyse verwendet werden, sowie insbesondere verbesserte optische Vorrichtungen, die die Anregungsstrahlung auf ein Substrat fokussieren, das mit dem fluoreszierenden Material beschichtet ist, das im wesentlichen auf den Bereich beschränkt ist, an dem Kopplung einer abklingenden Welle auftritt.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Immungssays, bei denen Aliquote einer Probe mit einem oder mehreren Reagenzien auf verschiedene Weise unter Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen oder ähnlichen Komplexen umgesetzt werden, die dann beobachtet werden können, um die Probe auf Vorhandensein und Titer eines vorbestimmten Teils des Komplexes zu prüfen, sind wohlbekannt. Typisch für solche Analysen sind jene, bei denen ein spezifischer Antikörper verwendet wird, um die Menge des Antigens, für das er spezifisch ist, zu messen oder umgekehrt. Allerdings wurde die Technik auch auf die Quantifizierung von Haptenen ausgedehnt, darunter Hormone, Alkaloide, Steroide und dergleichen sowie Antigene, Antikörper-Fragmente (d. h. Fab), wie auch komplette Antikörper, und in diesem weiteren Sinne soll die vorliegende Erfindung auch verstanden werden.
Wie bekannt, werden bei empfindlichen Immungssays Tracertechniken verwendet, wobei ein markierter Bestandteil des Komplexes in das Reagens eingebracht wird, das nichtkomplexierte, markierte Reagens vom komplexierten Reagens abgetrennt und der Komplex (oder das nichtkomplexierte Reagens) anschließend durch Beobachten der Markierung quantifiziert wird. Es werden sowohl Radioisotope als auch fluoreszierende Markiersubstanzen verwendet, um Bestandteile von Reagenzien für Immungssays zu markieren, wobei die Markierung entweder mit einem Gammastrahlenzähler oder einem Fluorimeter beobachtet wird. Die vorliegende Erfindung betrifft jedoch nur solche Analysen, die auf Fluoreszenz beruhen.
Die Abtrennung des nichtkomplexierten, markierten Teils vom komplexierten wird im allgemeinen dadurch erreicht, daß eine vorbestimmte Komponente des Komplexes an einer festen Phase (etwa der Innenwand eines Reagensröhrchens, Kügelchen aus Glas oder einem Polymer oder dergleichen) in einer Weise immobilisiert wird, daß die Komplexbildungsreaktivität der Komponente nicht behindert wird. Beispielsweise kann ein Antikörper wie Immunglobulin G (IgG) mit Hilfe einer Silyl-Verbindung wie etwa 3-Aminopropyltrimethoxysilan über seine Carboxyl-Enden an eine feste Phase wie etwa Glas gebunden werden, so daß die antigenreaktiven Amino-Enden des Antikörpers frei bleiben. Jeglicher unter Einbringen der immobilisierten Komponente gebildete Komplex kann dann von dem in der Lösung zurückbleibenden, unumgesetzten Komplement physikalisch abgetrennt werden, etwa durch Absaugen oder Dekantieren der Flüssigkeit aus einem Röhrchen oder durch Eluieren der Flüssigkeit durch ein Teilchenbett.
Beim kompetitiven Immungssay besteht das Reagens aus einer bekannten Menge eines markierten Komplements (etwa Antigen) gegen die immobilisierte Komponente des Komplexes (in diesem Fall Antikörper). Das Reagens wird mit einer festeingestellten Menge der Probe vermischt, die das zu quantifizierende, nichtmarkierte Komplement enthält. Sowohl das markierte als auch das nichtmarkierte Komplement binden an die immobilisierte Komponente des Komplexes im Verhältnis ihrer relativen Konzentrationen. Nach Inkubation für eine vorgegebene Zeit werden die flüssige Probe und das Reagens abgetrennt. Der an der festen Phase immobilisierte Komplex wird dann mit Strahlung einer Wellenlänge bestrahlt, die so gewählt ist, daß sie Fluoreszenz bei der Markierung anregt, und diese Fluoreszenz wird gemessen. Die Intensität der Fluoreszenz des immobilisierten Komplexes ist umgekehrt proportional zur Konzentration des nichtmarkierten Komplements, das analysiert wird.
Alternativ kann ein Assay durch Immobilisieren einer Menge eines Analogons der zu quantifizierenden Einheit (d. h. eine Substanz, die immunologisch ähnlich reaktiv ist) und Umsetzen der Probe mit einer bekannten Menge des markierten Komplements durchgeführt werden. Die markierten Komplemente komplexieren sowohl mit der unbekannten Menge der Einheit in der Probe als auch mit dem immobilisierten Analogon. Wiederum ist die Intensität der Fluoreszenz des immobilisierten Komplexes umgekehrt proportional zur Konzentration der zu quantifizierenden (freien) Einheit.
Bei mehrbindigen Komplementen gegen die immobilisierte Komponente können sogenannte "Sandwich"-Immungssays durchgeführt werden, wobei das gebundene Komplement dann mit einem markierten Analogon der immobilisierten Komponente weiter umgesetzt wird. So kann ein zweibindiges Antigen an einen immobilisierten Antikörper gebunden und dann mit einem fluoreszierenden markierten Antikörper umgesetzt werden, wobei ein Sandwich aus Antikörper/Antigen/markierter Antikörper gebildet wird, das dann vom unumgesetzten markierten Antikörper abgetrennt werden kann. Die Intensität der Fluoreszenz des so gebildeten immobilisierten Komplexes ist direkt proportional zur Konzentration der zu quantifizierenden Spezies.
Bei jeder dieser Analysen wird die Genauigkeit der Quantifizierung teilweise durch die Fertigkeiten des Laborpersonals bestimmt, das die Analyse durchführt. So erfordert ein Präzisionsfluoreszenz-Immungssay die fluorimetrische Messung eines vorbestimmten Volumens der Probe, der eine vorbestimmte Menge eines Reagens mit bekannter Verdünnung zugesetzt wurde. Um sicherzustellen, daß die notwendigen Volumenmessungen nicht der genauigkeitsbeschränkende Schritt der Analyse sind, ist es erforderlich, daß die Analyse durch geschultes Fachpersonal und oftmals mit Präzisionsapparaturen oder alternativ mit präzise aufgebauten und vorgefüllten Einweg-Reagenzien-Kits (um die Menge an Reagens sicherzustellen) zusammen mit einem zeitlich genau abgestimmten Diffusionsprozeß (um die Größe des analysierten Probenvolumens sicherzustellen) durchgeführt wird.
Es ist klar, daß der Einsatz von Fachpersonal, Präzisionsapparaturen und die Erfordernis präziser Handhabung oder Abstimmung einen Einfluß sowohl auf die Kosten als auch auf die breite Verfügbarkeit einer Analyse haben.
Es ist wohlbekannt, daß optische Systeme, bei denen das Prinzip der abgeschwächten inneren Totalreflexions(ATR)- Spektroskopie angewandt wird, bei chemischen und biochemischen Analysen oder Assays, darunter auch Immungssays, brauchbar sind. Beispielsweise offenbart US-Patent Nr. 4 133 639 ein System, das auf der Absorption einer abklingenden Welle durch den Analyten beruht; die US-Patente Nr. 4 321 057 und 4 399 099 offenbaren beide Systeme, die Änderungen der durch eine Faser gehenden Strahlung erfassen; und US-Patent Nr. 4 447 546 beschreibt ein Fluoreszenzimmungssay-System.
Bei der im obengenannten US-Patent Nr. 4 447 546 beschriebenen Vorrichtung wird eine optische Faser in einem Kapillarröhrchen in ungefähr konzentrischer Ausrichtung dazu gehalten. Eine flüssige Probe wird in den Zwischenraum zwischen Faser und Röhrchen gegeben und durch Kapillarwirkung in den Zwischenraum gezogen und gehalten. Um die Empfindlichkeit und Leistungsfähigkeit einer solchen Immungssay- Vorrichtung zu maximieren, ist es wichtig, daß die Faser einen Abstand von der Innenwand des Kapillarröhrchens beibehält. Berührt die Faser die Kapillarwand, kann es vorkommen, daß die kapillare Wirkung beeinträchtigt und innere Totalreflexion nicht erzielt wird, da die Strahlung die Faser am Berührungspunkt zwischen Faser und Kapillarwand verläßt, was mit einem Verlust an Empfindlichkeit verbunden ist.
Es ist wichtig, daß das Faserende, in das optische Strahlung ein- und aus dem Fluoreszenzstrahlung austritt, in einer fixen axialen Position zu einem optischen System zum Durchlassen optischer Strahlung in die Faser und aus derselben heraus gehalten wird. Falls das Faserende nicht in einer fixen Position zu diesem optischen System liegt, können Menge und Ausrichtung der durchgelassenen Strahlung, die in die Faser eintritt, variieren, so daß Genauigkeit und Empfindlichkeit der Vorrichtung beeinträchtigt werden.
Bei den bekannten Immungssay-Vorrichtungen wurden etliche Techniken zum exakten Ausrichten einer optischen Faser in einem Kapillarröhrchen entwickelt. Bei der ältesten Technik wird das nahe Ende (d. h., das Ende, in das zuerst Strahlung eintritt) der optischen Faser unter Verwendung eines herkömmlichen faseroptischen Anschlusses gehalten. Bei Verwendung dieser Anschlüsse ist die Außenfläche der Faser in der Nähe ihres nahen Endes mit einem Umhüllungsmaterial bedeckt, das typischerweise aus einem durchsichtigen Polymer hohen Molekulargewichts besteht. Bekannte Umhüllungsmaterialien haben typischerweise einen Brechungsindex, der größer ist als derjenige der Probe, z. B. 1,40 bis 1,45, so daß die numerische Apertur der Faser auf ein Niveau abgesenkt wird, bei dem annehmbare Empfindlichkeitsgrade mit der Vorrichtung nicht ohne weiteres erreicht werden können.
Bei einer anderen, in US-Patent Nr. 4 671 938 beschriebenen Technik wird die Faser am entfernten Ende, d. h. am entgegengesetzten Ende des Endes, an dem die optische Strahlung in die Faser durchgelassen wird, freistehend getragen. Das nahe Ende einer auf diese Weise getragenen optischen Faser ist jedoch sowohl axial als auch radial verschiebbar, und eine solche Verschiebung verursacht ebenfalls einen Verlust an instrumenteller Empfindlichkeit. Ist die Faser des weiteren so in einem Kapillarröhrchen eingeschlossen, daß die zu analysierende flüssige Probe in den Raum zwischen Faser und Kapillarröhrchen eingeführt werden kann, so war es bislang nicht möglich, das Röhrchenende, das das nahe Faserende umgibt, problemlos abzudichten, um ein Auslaufen der Probe zu verhindern. Der am Röhrchenende sich bildende ringwulstförmige Flüssigkeitsmeniskus kann dazu dienen, das Ausfließen von Flüssigkeit an diesem Ende des Kapillarröhrchens zu verhindern, doch wird er natürlich bei Schlag, Schwingung, hohem Druck und dergleichen leicht abreißen. Ist die zu analysierende Probe hochgradig toxisch oder infektiös, so ist eine solche zufällige Abdichtung nicht annehmbar.
Bei einer anderen Technik zum Halten der Faser befinden sich Faser und umgebendes Kapillarröhrchen in einer Haltevorrichtung zur Befestigung an einer optischen Baugruppe zum Durchlassen der Anregungsstrahlung in das nahe Ende der Faser und zur Aufnahme der Fluoreszenzstrahlung, die vom nahen Ende der Faser emittiert wird. Zur Vorrichtung gehört eine Halterbaugruppe zum Zentrieren der Faser im Kapillarröhrchen und zum Neigen der Faser in eine erste Richtung gegen eine ringförmige Auflagefläche. Letztere ist so ausgelegt, daß sie das eine Faserende so hält, daß nichts von der in die Faser gelangenden Strahlung von der Auflagefläche abgefangen wird.
Bei solchen Systemen mit innerer Totalreflexion nimmt die abklingende Zone um die Faser an Tiefe zu, und auch die Empfindlichkeit des Systems erhöht sich mit zunehmender numerischer Apertur der Faser. Auch die Intensität des Fluoreszenzsignals, das zurück in die Faser gelangt, ist proportional zu einer sehr hohen Energie der numerischen Apertur (teilweise definiert durch den Brechungsindex der Probe, in der die Fluoreszenz angeregt wird). So wird bevorzugt, die numerische Apertur des Systems zu maximieren, insbesondere durch Bereitstellung einer Eingangsstrahlung mit größtmöglichem Fluß über einen maximalen Einfangraumwinkel. Eine solche Maximierung wurde bislang durch die erste der vorstehend beschriebenen Techniken zum Festmachen und Halten der Faser eingeschränkt, besonders wenn der Durchmesser der eingesetzten Faser sehr klein ist, z. B. 300-400 Mikron. Um eine sehr hohe numerische Apertur mit Hilfe einer separaten Haltebaugruppe zu erhalten, wurden in der Fachwelt bisher typischerweise stark korrigierte Linsen mit geringer Tiefenschärfe eingesetzt. Solche Linsen sind teuer, problematisch in der Herstellung und bei der Beibehaltung der Ausrichtung.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Angesichts des eben beschriebenen Standes der Technik wurde die vorliegende Erfindung konzipiert und jetzt zur praktischen Anwendung gebracht.
In einer Ausführungsform umfaßt ein optisches System zum Umformen eines kreisförmig festkörperkollimierten Lichtstrahls in einen ringförmig kollimierten Lichtstrahl ein erstes lichtdurchlässiges lichtbrechendes Element zum Abfangen eines kreisförmig kollimierten Lichtstrahls und zum Umformen desselben in einen divergierenden, kegelförmigen und ringförmigen Lichtstrahl und ein zweites lichtdurchlässiges lichtbrechendes Element zum Abfangen des divergierenden, ringförmigen Lichtstrahls vom ersten lichtbrechenden Element und Umformen des kegelförmigen und ringförmigen Lichtstrahls in einen ringförmigen Lichtstrahl mit im wesentlichen konstantem Innen- und Außendurchmesser. Erstes und zweites lichtbrechendes Element weisen einen Abstand zueinander auf und sind coaxial zur Längsachse des kreisförmig kollimierten Lichtstrahls. In einer anderen Ausführungsform umfaßt ein optischer Umformer einen festen lichtdurchlässigen Körper mit einer ersten Brechungsfläche zum Umlenken eines festkörperkollimierten Lichtstrahls in einen divergierenden Lichtstrahl, der einen ringförmigen Querschnitt aufweist, und einer zweite Brechungsfläche zum Umlenken des divergierenden Lichtstrahls in einen Lichtstrahl, der einen ringförmigen Querschnitt von im wesentlichen konstantem Durchmesser aufweist.
Bei beiden Ausführungsformen kann dieses optische System eine Komponente einer Vorrichtung zum Analysieren einer flüssigen Probe mit Strahlung sein, die imstande ist, Fluoreszenz in fluoreszierendem Material anzuregen, wobei die Vorrichtung einheitliche längliche Substrate mit innerer Totalreflexion umfaßt, die sowohl für die Anregungsstrahlung als auch für die Fluoreszenz durchlässig sind. In solch einem Fall enthält das fluoreszierende Material wenigstens eine Einheit eines Antigen/Antikörper-Komplexes, der eine Markierung enthält, die Fluoreszenz ergibt, wenn sie durch eine abklingende Welle angeregt wird, die von der Anregungsstrahlung erzeugt wird. Das Substrat enthält eine längliche Faser und eine integrale Linse, die so geformt ist, daß die optische Strahlung in die Faser innerhalb der Grenzen eines kritischen Winkels geführt wird, um innere Totalreflexion sicherzustellen. Eine hohle längliche Umschließung ist konzentrisch um die Faser in einem Abstand zu derselben angeordnet, um einen Zwischenraum mit kapillaren Dimensionen zu ergeben. Ein Testhilfsmittel trägt das längliche Substrat in einer Weise, daß die flüssige Probe veranlaßt wird, in die Faser und durch Kapillarwirkung in den Zwischenraum zwischen Faser und Umschließung zu fließen. Die Vorrichtung enthält des weiteren eine Anregungsstrahlungsquelle, lichtbrechende Einrichtungen zum Fokussieren der Strahlung auf die Linse im wesentlichen in dem Bereich, an dem Kopplung einer abklingenden Welle auftritt, Detektoreinrichtungen zur Erfassung der Fluoreszenzstrahlung, die als Reaktion auf die Anregungsstrahlung von einem Ende der Faser emittiert wird, und Optikhalteeinrichtungen zum Befestigen aller Komponenten in einem festgelegten Verhältnis zur Linse zum Einstrahlen der Anregungsstrahlung in die Linse innerhalb des kritischen Winkels.
Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines verbesserten faseroptischen Analysensystems, das die Leistungsfähigkeit und das Ergebnis eines Immungssays verbessert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines solchen Analysensystems, bei dem die Energie der Lichtquelle in der wirkungsvollsten Weise genutzt wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Systems zum Analysieren einer flüssigen Probe mit Anregungsstrahlung aus einer Strahlenquelle, wobei die Strahlung imstande ist, eine Fluoreszenz in fluoreszierendem Material anzuregen, umfassend eine innen totalreflektierende, einheitliche, längliche Faser, die sowohl für die Anregungsstrahlung als auch für die Fluoreszenz durchlässig ist, wobei die Faser ein Ende aufweist, in das die Strahlung eingeführt wird, sowie eine periphere Oberfläche, von der wenigstens ein Teil so angepaßt ist, daß sie die Probe berührt, und eine Anregungsstrahlungsquelle und einen optischen Mechanismus zur Führung der Anregungsstrahlung in die Faser innerhalb der Grenzen eines kritischen Winkels, um innere Totalreflexion sicherzustellen, und zum Fokussieren der Anregungsstrahlung auf das Substrat im wesentlichen auf den Bereich desselben, an dem Kopplung einer abklingenden Welle auftritt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Analysensystems, bei dem die Quelle der Anregungsstrahlung einen festkörperkollimierten Lichtstrahl liefert, wobei die optischen Hilfsmittel einen optischen Umformer zum Umlenken des festkörperkollimierten Strahls in einen Strahl mit ringförmigem Querschnitt von im wesentlichen konstantem Querschnitt und eine Konvexlinse zwischen dem optischen Umformer und dem Einführungsende der Faser zum Fokussieren des Strahls mit ringförmigem Querschnitt vom optischen Umformer in die Faser umfassen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Analysensystems, wobei der optische Umformer ein erstes lichtdurchlässiges lichtbrechendes Element mit einer ersten Vorderfläche umfaßt, die so angeordnet ist, daß der kreisförmig kollimierte Lichtstrahl abgefangen wird, um den kreisförmig kollimierten Lichtstrahl in einen divergierenden ringförmigen Lichtstrahl umzuformen, und eine Grundfläche, die in einer Ebene senkrecht zur Achse des kollimierten Lichtstrahls liegt, und ein zweites durchsichtiges lichtbrechendes Element, das eine zweite Vorderfläche aufweist, die so angeordnet ist, daß der divergierende ringförmige Lichtstrahl vom ersten lichtbrechenden Element abgefangen wird, um den kegelförmigen und ringförmigen Lichtstrahl in einen ringförmigen Lichtstrahl mit einem im wesentlichen konstanten Innen- und Außendurchmesser umzuformen, wobei das erste und das zweite lichtbrechende Element einen Abstand zueinander aufweisen und coaxial zur Längsachse des kreisförmig kollimierten Lichtstrahls sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Analysensystems, wobei das erste lichtbrechende Element eine Vorderfläche aufweist, bei der es sich um einen Kreiskegel handelt, der zum kollimierten Lichtstrahl hingewandt ist, und wobei das zweite lichtbrechende Element eine Vorderfläche aufweist, bei der es sich um einen Kreiskegel handelt, der zum divergierenden ringförmigen Lichtstrahl hingewandt ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Analysensystems, wobei die längliche Faser zylindrisch ist und so angepaßt ist, daß sie eine Beschichtung mit fluoreszierendem Material auf wenigstens einem Teil ihrer peripheren Oberfläche erhält.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Analysensystems, wobei die längliche Faser zylindrisch ist und so angepaßt ist, daß sie eine Beschichtung mit fluoreszierendem Material auf wenigstens einem Teil ihrer peripheren Oberfläche erhält, das wenigstens einen Teil eines Antigen/Antikörper-Komplexes umfaßt, der eine Markierung enthält, die die Fluoreszenz liefert, wenn sie durch eine abklingende Welle angeregt wird, die von der Anregungsstrahlung erzeugt wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Analysensystems, wobei eine hohle längliche Umschließung um die Faser und in einem Abstand von derselben angeordnet ist, so daß sich ein Zwischenraum zwischen der Faser und der Umschließung ergibt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Analysensystems, wobei die längliche Faser zylindrisch ist und konzentrisch innerhalb der Umschließung angeordnet ist, und wobei der Zwischenraum zwischen der Umschließung und der Faser kapillare Dimensionen aufweist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines optischen Systems zum Umformen eines kreisförmigen festkörperkollimierten Lichtstrahls in einen ringförmig kollimierten Lichtstrahl, umfassend ein erstes lichtdurchlässiges lichtbrechendes Element mit einer ersten Vorderfläche, die so angeordnet ist, daß der kreisförmig kollimierte Lichtstrahl abgefangen wird, um den kreisförmig kollimierten Lichtstrahl in einen divergierenden ringförmigen Lichtstrahl umzuformen, und eine Grundfläche, die in einer Ebene senkrecht zur Achse des kollimierten Lichtstrahls liegt, und ein zweites lichtdurchlässiges lichtbrechendes Element mit einer zweiten Vorderfläche, die so angeordnet ist, daß der divergierende ringförmige Lichtstrahl vom ersten lichtbrechenden Element abgefangen wird, um den kegelförmigen und ringförmigen Lichtstrahl in einen ringförmigen Lichtstrahl umzuformen, der einen im wesentlichen konstanten Durchmesser aufweist, wobei das zweite lichtbrechende Element eine Grundfläche aufweist, die in einer Ebene senkrecht zur Achse des kollimierten Lichtstrahls liegt, wobei das erste und das zweite lichtbrechende Element einen Abstand zueinander aufweisen und coaxial zur Längsachse des kreisförmig kollimierten Lichtstrahls sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines optischen Systems, wobei das erste lichtbrechende Element eine Vorderfläche aufweist, die zum kollimierten Lichtstrahl hingewandt ist, bei dem es sich um einen Kreiskegel handelt, und wobei das zweite lichtbrechende Element eine Vorderfläche aufweist, bei der es sich um einen Kreiskegel handelt, der zum divergierenden ringförmigen Lichtstrahl hingewandt ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines optischen Umformers, der einen festen lichtdurchlässigen Körper mit einer ersten lichtbrechenden Oberfläche zum Umlenken eines festkörperkollimierten Lichtstrahls in einen divergierenden Lichtstrahl umfaßt, der einen ringförmigen Querschnitt aufweist, und mit einer zweiten lichtbrechende Oberfläche zum Umlenken des divergierenden Lichtstrahls in einen Lichtstrahl, der einen ringförmigen Querschnitt von im wesentlichen konstantem Durchmesser aufweist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines optischen Systems, wobei der optische Umformer ein erstes lichtbrechendes Element mit einer ersten kegelförmigen Oberfläche umfaßt, auf die der festkörperkollimierte Lichtstrahl gerichtet wird, um den Lichtstrahl in einen divergierenden ringförmigen Lichtstrahl umzulenken, und ein zweites lichtbrechendes Element mit einer zweiten kegelförmigen Oberfläche, um den divergierenden ringförmigen Lichtstrahl vom ersten Linsenelement aufzunehmen und den divergierenden ringförmigen Lichtstrahl in einen Lichtstrahl umzulenken, der einen ringförmigen Querschnitt von im wesentlichen konstantem Querschnitt aufweist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines optischen Systems, wobei erstes und zweitens lichtbrechendes Element einen Abstand zueinander aufweisen und coaxial zur Längsachse des kreisförmig kollimierten Lichtstrahls sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines optischen Systems, wobei das erste lichtbrechende Element eine Vorderfläche aufweist, die zum kollimierten Lichtstrahl hingewandt ist, bei dem es sich um einen Kreiskegel handelt, und wobei das zweite lichtbrechende Element eine Vorderfläche aufweist, die zum divergierenden ringförmigen Lichtstrahl hingewandt ist, bei dem es sich um einen Kreiskegel handelt.
Weitere Merkmale, Vorteile und Nutzbarkeiten der Erfindung sind aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit den nachstehenden Zeichnungen ersichtlich. Es sei klar, daß die vorhergehende allgemeine Beschreibung und die nachfolgende ausführliche Beschreibung beispielhaft und erläuternd sind, jedoch die Erfindung nicht einschränken sollen. Die begleitenden Zeichnungen, die zur Erfindung gehören und einen Teil der Erfindung bilden, erläutern eine der Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Erfindung allgemein zu erklären. Für die gesamte Offenbarung gilt, daß sich gleiche Ziffern auf gleiche Teile beziehen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung, die ein Immungssaysystem als eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildlich darstellt, wobei bestimmte Teile zur Klarheit im Querschnitt gezeigt sind;
Fig. 2 ist eine detaillierte Querschnittansicht eines Teils der in Fig. 1 gezeigten optischen Faser und beschreibt die Reflexion eines Lichtstrahls an der Grenzfläche der Faser und einer Probe, die darin zum Analysieren aufgenommen ist;
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die relative Absorption des eingestrahlten Lichts in der optischen Faser über den gesamten Bereich der Einfallswinkel θ beschreibt;
Fig. 4 ist eine detaillierte Querschnittansicht der optischen Faser und der Objektivlinse, wie in Fig. 1 gezeigt, und beschreibt die innere Reflexion der Lichtstrahlen in der Faser bei Verwendung herkömmlicher Lichtstrahlung;
Fig. 5 ist eine detaillierte Querschnittansicht der optischen Faser und der Objektivlinse, ähnlich wie in Fig. 4, beschreibt jedoch die innere Reflexion der Lichtstrahlen in der Faser bei Verwendung von Lichtstrahlung, die vom erfindungsgemäßen optischen Umformer modifiziert wurde;
Fig. 6A ist eine schematische Ansicht, die die in Fig. 1 gezeigten Komponenten näher beschreibt;
Fig. 6B ist eine schematische Aufrißseitenansicht einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen optischen Umformers wie in Fig. 6A gezeigt;
Fig. 7 ist eine Aufrißseitenansicht, die eine Komponente des optischen Umformers von Fig. 6B beschreibt, die beispielhaft für eine handelsübliche Ausführung ist;
Fig. 8 ist eine Aufrißseitenansicht, die eine andere Komponente des optischen Umformers von Fig. 6B beschreibt, die beispielhaft für eine handelsübliche Ausführung ist;
Fig. 9A ist eine schematische Ansicht, die eine andere Ausführungsform bestimmter, in Fig. 1 gezeigter Komponenten näher erläutert;
Fig. 9B ist eine schematische Aufrißseitenansicht einer anderen Ausführungsform eines erfindungsgemäßen optischen Umformers, wie in Fig. 9A erläutert; und
Fig. 10 ist eine Aufrißseitenansicht, die den optischen Umformer von Fig. 9B beschreibt, der beispielhaft für eine handelsübliche Ausführung ist.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Immungssay-System anwendbar, das mit Fluoreszenz unter Totalreflexion in Verbindung mit der Kanalisierung der Fluoreszenzstrahlung arbeitet.
Betrachtet man Fig. 1, so ist eine Längsschnittansicht eines Immungssay-Kits 10 zu erkennen, das eine optische Faser 12, ein mit einer zu analysierenden, flüssigen Probe 15 gefülltes Kapillarröhrchen 14 und einen Stopfen 16 umfaßt.
Die Faser 12 ist ein länglicher, im wesentlichen zylindrischer, optisch transparenter Körper, der so angepaßt ist, daß sich optische Strahlung entlang seiner Länge durch mehrfache, innere Totalreflexion fortpflanzen kann, die in ein Faserende in einem bestimmten räumlichen Winkel im wesentlichen rotationssymmetrisch zur Faserachse eintritt. Wie in der Technik der Faseroptik wohlbekannt, wird der maximale Einfangwinkel B bezüglich der Faserachse für die Strahlung, die in die Faser eintritt und sich so darin fortpflanzt, von den Brechungsindizes der Faser und des umgebenden Mediums bestimmt. Für Strahlung, die sich zunächst durch ein Medium mit dem Brechungsindex n&sub0; fortpflanzt und auf eine Faser mit dem Brechungsindex n&sub1; auftrifft, die mit einem Material mit dem Brechungsindex n&sub2; umgeben ist, kann der maximale Einfangwinkel aus Gleichung 1 abgeleitet werden:
N.A. = n&sub0; sin B = (n&sub1;² - n&sub2;²)1/2 (1)
worin:
N.A. die sogenannte numerische Apertur der Faser ist;
B der maximale Einfangwinkel für Strahlung ist, die in die Faser 12 eintritt;
N der Brechungsindex der Faser ist;
n&sub2; der Brechungsindex der Probe ist; und
n&sub0; der Brechungsindex des umgebenden Mediums ist.
Beispielsweise, jedoch nicht einschränkend, kann die Faser 12 aus einer Reihe optisch transparenter Materialien wie etwa Glas, Quarz, Polypropylen, Polyolefin, Nylon oder dergleichen sein, die so ausgewählt sind, daß der Brechungsindex größer ist als der der flüssigen Probe, die analysiert wird (normalerweise eine wäßrige Lösung, die einen Brechungsindex um 1,33 aufweist, oder eine Serumprobe, die einen Brechungsindex um 1,35 aufweist), und des weiteren so ausgewählt sind, daß sie relativ unlöslich sind und mit der Flüssigkeit nicht reagieren. Zwar können auch andere Faserdurchmesser verwendet werden, doch wurde gefunden, daß 200 Mikron zufriedenstellend sind. Für die meisten Analysen scheint eine Faser mit 25 mm Länge geeignet; es sei jedoch klar, daß die Faserlänge an die durchzuführende Analyse angepaßt werden kann.
Die Faser 12 wird mit einer Oberflächenbeschichtung 18 versehen, die Hilfsmittel für die Bindung ausgewählter Teile eines Antigen/Antikörper-Komplexes umfaßt. Wie hierin verwendet, gehören zu den "Antigen/Antikörper-Komplexen" nicht nur Komplexe aus kompletten Antikörpern und Antigenen, sondern auch Komplexe, die immunologisch reaktive Fragmente von einem oder beiden enthalten.
Das Kapillarröhrchen 14 ist bevorzugt ein optisch lichtdurchlässiges Röhrchen, wobei dessen Baumaterial so ausgewählt ist, daß es relativ unlöslich ist und nicht mit den zu analysierenden Flüssigkeiten reagiert. So wird das Kapillarröhrchen 14 bevorzugt aus Materialien wie etwa Glas, Quarz, Polypropylen, Polyolefin oder dergleichen hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Kapillarröhrchen 14 eine rechtwinklige kreisförmige zylindrische Bohrung auf, wobei der Innendurchmesser einige hundert Mikron größer ist als der Durchmesser der Faser 12 (für einen Faserdurchmesser von 200 Mikron z. B. kann das Kapillarröhrchen 14 einen Innendurchmesser von etwa 800 Mikron haben).
Der Stopfen 16 ist so ausgestaltet und bemessen, daß er in ein Ende des Kapillarröhrchens 14 paßt und einen Endteil 19 der Faser 12 im wesentlichen coaxial im Kapillarröhrchen trägt. Zu diesem Zweck ist der Stopfen 16 bevorzugt mit einem Flansch 20 mit einem Außendurchmesser in der Größenordnung des Außendurchmessers des Kapillarröhrchens 14 und einer mittig angeordneten stutzenartigen Erweiterung 22 coaxial zur Mittelbohrung 24 versehen. Die Bohrung 24 geht durch den Stopfen 16 hindurch und ist so bemessen, daß sie den Endteil der Faser 12 festhält. Der Stopfen 16 kann tatsächlich an Ort und Stelle um die Faser 12 geformt werden, wobei der Stopfen bevorzugt aus einem Material mit niedrigem Brechungsindex wie etwa Siloxan hergestellt wird. Der Stopfen 16 kann des weiteren mit einer oder mehreren Durchgangsöffnungen 26 versehen sein, die in Verbindung zum Inneren des Kapillarröhrchens 14 stehen.
Die Faser 12 geht durch den Stopfen 16 hindurch und wird von demselben so gehalten, daß im wesentlichen die gesamte Faser außer ihrem Endteil im Inneren des Kapillarröhrchens 14 freiliegt, so daß eine Endfläche 28 unbedeckt bleibt und mit dem äußersten Ende der Bohrung 24 außen am Kapillarröhrchen gemeinsam abschließt. Die Endfläche 28 ist vorzugsweise planar und senkrecht zur Achse der Faser 12 angeordnet. Bevorzugt ist die Endfläche 28 zudem hochgradig lichtdurchlässig und frei von Oberflächenfehlern, die das auf die Endfläche 28 einfallende Licht leicht streuen könnten. Hierzu kann die Endfläche 24 optisch geschliffen werden, wenn sich auch gezeigt hat, daß eine Faser aus geschmolzenem Quarz so gespalten werden kann, daß sich eine optisch geeignete Oberfläche ergibt. Gegebenenfalls kann die zur Endfläche 28 distal gelegene Endfläche 30 der Faser 12 ebenfalls plangeschliffen oder gespalten und des weiteren mit einer Spiegelbeschichtung 31 (oder einem separaten Spiegel) versehen werden, die im wesentlichen senkrecht zur Faserachse aufgebracht ist, wodurch die in der Faser eingefangene Strahlung die Faser zweimal passiert. Um sicherzustellen, daß die untere Endfläche der Faser ebenfalls innerhalb des Kapillarröhrchens liegt, sind die Gesamtabmessungen von Faser 12, Kapillarröhrchen 14 und Stopfen 16 entsprechend gewählt.
Vor dem Zusammenbau zu Kit 10 wird die Faser 12 mit einer Beschichtung 18 versehen, die einen Bereich ihrer zylindrischen Oberfläche für die durchzuführende Analyse aktiviert. Dabei kann der aktivierte Bereich in jeder geeigneten Weise auf eine vorbestimmte Länge der Faser 12 beschränkt sein. Die Abmessungen des aktivierten Bereichs können zum Beispiel durch Maskieren der Faser während des Beschichtens gesteuert werden, oder alternativ kann die gesamte Länge der Faser 12 aktiviert und die Länge der Faser, die innerhalb Kapillarröhrchens 14 zu liegen kommt, sorgfältig gesteuert werden.
Zu einer ausführlichen Beschreibung der Analysenarbeitsgänge, die mit Hilfe des Kits 10 durchgeführt werden und in ihm ablaufen, sei der Leser auf die Offenbarung in US-Patent Nr. 4 447 546 an Hirshfeld verwiesen.
Das Kit 10 ist für die Verwendung in einem Immungssay- System 32 vorgesehen, das eine Lichtquelle 34, einen dichroitischen Strahlenteiler 3, eine Objektivlinse 40, einen Photodetektor 42, einen Referenzdetektor 44, einen Quotientenverstärker 46 und ein Display 48 umfaßt.
Die Lichtquelle 34 stellt optische Strahlung der passenden Frequenz bereit, die auf Grundlage des Fluorophors der in der fraglichen Analyse verwendeten Markierung gewählt wird, um Fluoreszenz in der markierten Komponente des Reagens anzuregen. Die Lichtquelle 34 stellt diese Strahlung bevorzugt nur über ein enges Wellenlängenband bereit, das so gewählt ist, daß die Fluoreszenz maximiert wird. Typischerweise umfaßt die Lichtquelle 34 daher neben der bevorzugten Wolfram-Halogen-Lampe und der dazugehörigen Stromversorgung ein Bandpaß- oder Anregungsfilter 50. Es sei klar, daß die Lichtquelle 34 alternativ auch andere Quellen wie etwa eine Quecksilberlampe, eine Blitzlampe oder einen Laser umfassen kann. In diesem Zusammenhang sollte beachtet werden, daß eine Festkörperlichtquelle einer weißen Lichtquelle vorzuziehen ist, was aber für die vorliegende Erfindung nicht kritisch ist. Dies liegt daran, daß diese weniger Wärme erzeugt, eine kleinere Einheitsgröße aufweist, eine größere optische Leistung hat, monochromatisch ist, so daß nur die gewünschten Wellenlängen bereitgestellt werden, und ausrichtbar ist, so daß sich der Lichtstrahl leicht steuern läßt. Der optische Umformer, der nachstehend ausführlicher beschrieben wird, ergibt eine passende Apertur und Optik zur Ausformung des Strahls, wie Fachleuten klar sein wird, um die Objektivlinse 40 mit einem passend begrenzten Strahl zu beleuchten, wodurch die Objektivlinse imstande ist, die Quellenöffnung auf die Endfläche 28 der Faser 12 abzubilden, wobei auf die Endfläche kein Strahl mit einem Einfallswinkel einfällt, der größer ist als derjenige, der der numerischen Apertur der Faser entspricht.
Zwischen Lichtquelle 34 und Objektivlinse 40 befindet sich der dichroitische Strahlenteiler 38. In der bevorzugten Ausführungsform ist der Strahlenteiler 38 ein Tiefpaß- Interferenzfilter mit einer Grenzfrequenz, die so gewählt ist, daß sie zwischen den Frequenzen der maximalen Absorption und der maximalen Fluoreszenzemission des fraglichen Fluorophors liegt. Somit reflektiert der Strahlenteiler 38 die hochfrequente (kurzwellige) Fluoreszenzanregungsstrahlung von Lichtquelle 34 und läßt die niederfrequente Strahlung durch, die dem Fluoreszenzmaximum des Fluorophors entspricht.
Die Objektivlinse 40 ist so gewählt, daß die Lichtquelle 34 auf der Endfläche 28 der Faser 12 abgebildet wird, so daß die Endfläche mit einem Abbild der strahlformenden Öffnung der Quelle ausgefüllt ist, wobei der maximale Einfallswinkel des Strahls so gewählt ist, daß er kleiner ist als derjenige, der der numerischen Apertur der Faser entspricht. Die Objektivlinse 40 ist ebenfalls so gewählt, daß sie im wesentlichen die gesamte Strahlung sammelt, die die Endfläche 28 über die numerische Apertur der Faser verläßt und die Endfläche am Photodetektor 42 abbildet. Als Hilfsmittel zur Festlegung der korrekten Lage der Faser 12 ist das Immungssaysystem 32 bevorzugt mit einem Positionierungshilfsmittel, etwa der Blendenplatte 52 versehen, die so bemessen ist, daß sie die stutzenartige Erweiterung 22 des Stopfens 16 aufnimmt, und so angebracht ist, daß die Endfläche 24 passend zur Objektivlinse 40 ausgerichtet ist.
Der Photodetektor 42 ist so angeordnet, daß er durch den Strahlenteiler 38 ein Abbild der Endfläche 28 der Faser 12 empfängt, das durch die Objektivlinse 40 auf den Photodetektor projiziert wird. Der Photodetektor 42 umfaßt bevorzugt einen Photomultiplier (der mit einer entsprechenden Stromversorgung und Feldoptik versehen ist, um, wie in der Fachwelt bekannt, das Blickfeld des Detektors auf die Endfläche 28 zu beschränken), der so ausgewählt ist, daß er maximale Empfindlichkeit im Bereich der höchsten Fluoreszenz des Fluorophors aufweist. Der Photodetektor 42 ist vorzugsweise auch mit einem Sperrfilter versehen, das dem Bandpaßfilter 50 entspricht, das mit der Lichtquelle 34 versehen ist.
Der Referenzdetektor 44, bevorzugt eine Photodiode, ist so angeordnet, daß er die durch den dichroitischen Strahlenteiler 30 gehende Strahlung von der Lichtquelle 34 abfängt. Der Referenzdetektor 44 ist so ausgewählt, daß höchste Empfindlichkeit im Spektralbereich der Lichtquelle 34 besteht, der den dichroitischen Strahlenteiler 38 passiert, und umfaßt entsprechende Feldbegrenzungen und eine Optik, um dessen Blickfeld auf die Quelle zu begrenzen.
Der Quotientenverstärker 46 ist irgendeine aus einer Reihe bekannter elektronischer Vorrichtungen, die ein Ausgabesignal ergibt, das proportional zum Verhältnis eines Paars von Eingangssignalen ist, und so an die Ausgänge des Photodetektors 42 und Referenzdetektors 44 angeschlossen ist, daß sich ein Signal ergibt, das proportional zum Verhältnis der Ausgangsleistung von Photodetektor zu Referenzdetektor ist. Zum Beispiel kann der Quotientenverstärker 46 ein variabler Vorverstärker sein, der die Ausgangsleistung des Photodetektors 42 verstärkt und eine Verstärkung aufweist, die umgekehrt proportional zur Ausgangsleistung des Referenzdetektors 44 ist.
Der Ausgang des Quotientenverstärkers 46 ist an das Display 48 angeschlossen und dient als Eingang für das Display 48. Das Display 48 kann irgendeine aus einer Reihe von Vorrichtungen sein, die ein visuelles Signal liefert, das proportional ist zu einer elektrischen Eingangsleistung und kann zum Beispiel ein Meßgerät, eine Digitalanzeige, ein Streifendiagrammschreiber oder dergleichen sein.
Beim Gebrauch wird das Kit 10 in die zu analysierende Probe getaucht. Durch Öffnungen wird ermöglicht, daß sich das Kapillarröhrchen 14 durch Kapillarwirkung füllt, sobald sein Ende in die Probe eingetaucht wird. So wird jedesmal wenn das Kapillarröhrchen 14 in die Lösung getaucht wird und sich soweit füllen kann, daß der aktive Bereich der Faser 12 bedeckt ist, ein bestimmtes Probenvolumen in das Kapillarröhrchen 14 gezogen.
Nach der Inkubation wird das Kit 10 in das System 32 gestellt, wobei der Stopfen 16 so mit der Blendenplatte 52 zusammenwirkt, daß sich die Endfläche 28 der Faser 12 am entsprechenden Ort relativ zum optischen Weg des Systems 32 befindet. Strahlung einer Wellenlänge, die so gewählt ist, daß sie Fluoreszenz im Fluorophor in der Probe 15 anregt, wird von der Lichtquelle 34 über den dichroitischen Strahlenteiler 38 und die Objektivlinse 40 so herangeführt, daß die Endfläche 28 der Faser 12 innerhalb des durch die numerische Apertur der Faser definierten Kegelwinkels beleuchtet wird. Diese Strahlung wird folglich in der Faser 12 am oder oberhalb des kritischen Winkels so weitergeleitet, daß sie über die Länge der Faser innen total reflektiert wird. Dadurch wird eine abklingende Welle in der flüssigen Probe 15 erzeugt, die der Faser benachbart ist. Zu einer ausführlichen Diskussion der diagnostischen Kenndaten der durchgeführten Analyse sei wiederum auf Patent Nr. 4 447 546 verwiesen.
Der optische Umformer 36, mit dem der Lichtstrahl 34 von einem kreisförmig kollimierten Lichtstrahl in einen ringförmig kollimierten Lichtstrahl mit klar definierten Innen- und Außenabmessungen umgeformt wird, soll nun beschrieben werden. Es ist das gesteckte und erreichte Ziel der Erfindung, die von der Lichtquelle 34 bereitgestellte Ausgangsleistung oder das Signal zu maximieren, oder umgekehrt, ihre erforderliche Intensität zu minimieren, wobei die Analyse noch durchführbar sein soll.
Fig. 2 beschreibt die Reflexion eines Lichtstrahl 54 an der Grenzfläche Glas(oder Kunststoff)/Probe für die Faser 12. Im Sinne der Erfindung muß der Einfallswinkel A des ankommenden Lichtstrahls und des reflektierten Lichtstrahls 54 gleich oder größer als der kritische Winkel sein. Das heißt, der Lichtstrahl 54 dringt nicht in die periphere Wandung 56 der Faser ein, sondern wird von der peripheren Wand auf seinem Weg weiter abgelenkt, bis er die Spiegelbeschichtung 31 an der Endfläche 30 erreicht und zur Endfläche 28 zurückkehrt. Die Größe a stellt die Eindringtiefe der abklingenden Welle dar, die sich aus der Bewegung des Lichtstrahls 54 durch die Faser 12 ergibt.
Fig. 3 ist ein Diagramm der relativen Absorption des eingestrahlten Lichts bei einem Abstand a von der peripheren Wandung 56, das heißt, von der Grenzfläche zwischen Faser 12 und Probe 15. Für Werte von θ kleiner als der kritische Winkel ist die Absorption I durch die folgende Gleichung definiert:
I = u(k)²·4[1 + (1-n²sin²θ)/ncosθ] (2)
Für Werte von θ größer als der kritische Winkel ist die Absorption I durch die folgende Gleichung definiert:
I = u(k)²·4[n²cos²θ/(n&sub2; - 1)][-2aK ] (3)
worin jeweils:
n = n&sub1;/n&sub2; ein einfaches Verhältnis ist, das in den Gleichungen (2) und (3) verwendet wird, worin
n&sub1; = Brechungsindex der Faser 12 und
n&sub2; = Brechungsindex der Probe 15;
k und K Wellenvektoren sind; und
u eine komplexe Amplitude als Funktion von k ist.
Bei gegebenem a, n&sub1; und n&sub2; kann ein ähnliches Diagramm konstruiert werden, das die Absorption der E-Welle als Funktion von θ erklärt. In jedem Fall beschreibt das in Fig. 3 gezeigte Relativdiagramm, wie wichtig es ist, Licht nahe am kritischen Winkel einzustrahlen, da die Absorption in diesem Bereich am größten ist. Einfach ausgedrückt, bedeutet stärkere Absorption stärkere Fluoreszenz.
Dieses Konzept ist noch deutlicher erkennbar in Fig. 4, die die Wirkung eines herkömmlichen festkörperkollimierten Lichtstrahls 200 erläutert, wenn dieser über die Objektivlinse 40 in die optische Faser 12 eingestrahlt wird. Die mittleren Bereiche des Lichtstrahls 200, beispielhaft anhand eines Lichtstrahls 202 dargestellt, treffen in einem flachen Einfallswinkel auf die Seitenwandung der Faser 12, so daß nur minimale Absorption erreicht wird. Periphere Bereiche des Lichtstrahls 200, beispielhaft anhand eines Lichtstrahls 204 dargestellt, treffen jedoch in einem Einfallswinkel auf die Seitenwandung von Faser 12, der ungefähr gleich dem im Diagramm der Fig. 3 gezeigten optimalen Winkel ist. Leider ist ein Großteil der Lichtenergie in Strahl 200 für die Zwecke des Immungssays unwirksam und führt gar zu zusätzlichem Rauschen aufgrund der Streuung und den Unvollkommenheiten im optischen Weg.
Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 5 einen ringförmig kollimierten Lichtstrahl 206, wenn über die Objektivlinse 40 in die optische Faser 12 eingestrahlt wird. In diesem Fall treffen die Lichtstrahlen 208 aus dem konzentrierten kollimierten Lichtstrahl 206 alle in einem Einfallswinkelbereich auf die Seitenwandung der Faser 12, der ungefähr gleich dem im Diagramm der Fig. 3 gezeigten optimalen Winkel, aber in keinem Falle kleiner als der kritische Winkel ist. Folglich wird die Wirksamkeit der Energie aus der Lichtquelle 34 optimiert. Eine (nicht gezeigte) Sperrscheibe könnte im mittleren Bereich einer Rückfläche 210 der Objektivlinse 40 verwendet werden, um einen Weg ähnlich dem der Lichtstrahlen 208 zu erreichen, doch würde ein derartiger Notbehelf Lichtenergie vergeuden und das Rücksignal von der distalen Endfläche der Faser erheblich blockieren. Bei dieser Erfindung tritt kein Licht in einem flachen Winkel in die Faser ein, und alles Licht dient einem nützlichen Zweck.
Unter Umsetzung der vorhergehenden Prinzipien wurde der optische Umformer 36 entworfen. In einer Ausführungsform, wie in den Fig. 6A und 6B erläutert, werden erstes und zweites lichtbrechendes Element 58, 60, die einen Abstand zueinander aufweisen, in geeigneter Weise durch die jeweiligen Halterungen 62 beziehungsweise 64 auf einem Gehäuse 66 zwischen Filter 50 und Strahlenteiler 38 gehalten. Die lichtbrechenden Elemente 58, 60 sind lichtdurchlässig, bestehen aus optischem Glas oder Kunststoff, die im wesentlichen frei sind von Verunreinigungen und Fehlern. Beim lichtbrechenden Element 58 ist eine erste Vorderfläche 68 vorhanden, die so positioniert ist, daß sie den kreisförmig kollimierten Lichtstrahl 70 mit dem Radius rP aus der Lichtquelle 34 abfängt und dazu dient, den Lichtstrahl in einen divergierenden oder kegelförmigen, ringförmigen Lichtstrahl 72 umzuformen. Der divergierende ringförmige Lichtstrahl 72 verläßt das lichtbrechende Element 58 durch eine Grundfläche 74, die, sofern planar, senkrecht zur Achse 76 des kollimierten Lichtstrahls 70 ist.
Das zweite lichtbrechende Element 60 weist einen Abstand vom lichtbrechenden Element 58 auf und hat eine zweite Vorderfläche 78, die so positioniert ist, daß sie den divergierenden ringförmigen Lichtstrahl 72 abfängt, während er sich vom lichtbrechenden Element 58 wegbewegt. Die lichtbrechenden Elemente 58, 60 sind ebenfalls coaxial zur Längsachse 76 des kreisförmig kollimierten Lichtstrahls 70. Die Vorderfläche 78 dient dazu, den ringförmigen Lichtstrahl 72 in einen ringförmigen oder ringwulstförmigen Lichtstrahl 80 mit im wesentlichen konstanten Innen- und Außenradien Ri beziehungsweise Ro umzuformen. Das zweite lichtbrechende Element 60 weist wie im Falle des lichtbrechenden Elements 58 eine Grundfläche 82 auf, die, sofern planar, in einer Ebene senkrecht zur Achse 76 des kollimierten Lichtstrahls 70 liegt, und der weiter modifizierte, ringförmige Lichtstrahl 80 mit konstantem Durchmesser verläßt das lichtbrechende Element 60 durch die Grundfläche 82. Zwar sind die Flächen 74 und 82 nicht notwendigerweise planar, doch tragen nichtplanare Bauweisen wesentlich zur Komplexität des Aufbaus der Optik beim optischen Umformer 36 bei. Zur Erhöhung des optischen Durchsatzes des optischen Umformers können jedoch nichtplanare Aufbauten durchaus erwünscht sein.
Mit Trigonometrie und dem Snelliusschen Gesetz
n&sub1;sinθ&sub1; = n&sub0;sinθ&sub0; (4)
worin:
n0 = Brechungsindex des lichtbrechenden Elements;
n&sub1; = Brechungsindex des umgebenden Mediums;
θ&sub0; = ursprünglicher Winkel zwischen dem Lichtstrahl und der Normalen der Grenzfläche zwischen lichtbrechendem Element und umgebendem Medium; und
θ&sub1; = resultierender Winkel aus dem Lichtstrahl und der Normalen der Grenzfläche zwischen lichtbrechendem Element und umgebendem Medium;
können die Gleichungen für die erfindungsgemäße Optik gelöst werden. Das Snelliussche Gesetz beschreibt die Beugung des Lichts an der jeweiligen Grenzfläche, das heißt, zwischen dem umgebenden Medium und dem jeweiligen lichtbrechenden Element. Der Spitzenwinkel Φ&sub1; gegenüber der Vorderfläche 68 des ersten lichtbrechenden Elements 58 kann jeder gewünschte Winkel sein, obgleich es für einfache Herstellung wünschenswert sein kann, daß er 45º beträgt, so daß die Vorderfläche 68 tatsächlich einen rechtwinkligen Kreiskegel definiert.
Es soll nun die aus dem Aufbau des optischen Umformers 36 der Fig. 6A und 6B resultierende Wirkungsweise beschrieben werden. Nach beliebiger Auswahl von Spitzenwinkel Φ&sub1; und Brechungsindex der lichtbrechenden Elemente 58, 60 kann der Spitzenwinkel Φ&sub2; für das lichtbrechende Element wie folgt berechnet werden:
Φ&sub2; = tan&supmin;¹((n-cos(sin&supmin;¹k))/k) (5)
worin
k = n( (1-cos²Φ&sub1;/n²)cosΦ&sub1;-sinΦ&sub1;cosΦ&sub1;/n)
Sind die Spitzenwinkel Φ&sub1; und Φ&sub2;, die Dicke oder Höhe t&sub1; des lichtbrechenden Elements 58 und der gewünschten äußere Radius Ro des ringförmigen Lichtstrahls 80 mit konstanten Durchmesser oder des "Lichtrings" bekannt, kann der Abstand D zwischen den lichtbrechenden Elementen 58, 60 berechnet werden. Im einzelnen wird der Abstand D entlang der Achse 76 zwischen der Grundfläche 74 und der Spitze 84 des lichtbrechenden Elements 60 gemessen. Die Berechnung ist wie folgt:
D = (Ro-ro)/tanθ'-x (6)
worin θ = sin&supmin;¹(cosΦ&sub1;/n);
θ' = sin&supmin;¹(ncos(Φ&sub1;+Θ));
ro = t&sub1;(cot(Φ&sub1;+θ)); und
x = Ro/tanΦ&sub2;
Sind die Spitzenwinkel Φ&sub1; und Φ&sub2;, ein dazwischenliegender Winkel θ' (oben), und der gewünschte Innenradius Ri des "Lichtrings" 80 bekannt, so kann der Radius rP des eingestrahlten kollimierten Lichtstrahls 70 wie folgt berechnet werden:
ro = (Ro - R&sub1;)sin(Φ&sub2;-θ')sinΦ&sub1;/(sinΦ&sub2;cosθ') (7)
Zwar sind die Formen der lichtbrechenden Elemente 58, 60, gezeigt in Fig. 6B, zum Zwecke der Erklärung der Entwurfsüberlegungen beim Aufbau des optischen Umformers 36 annehmbar, doch können sie im tatsächlichen Fall so aussehen, wie in Fig. 7 bzw. 8 dargestellt. Was zum Beispiel das lichtbrechende Element 58 anbetrifft, so kann die kegelförmige erste Vorderfläche 68 in eine zylindrische Fläche 86 und von dort aus in einen zylindrischen Flansch 88 übergehen, der als Befestigung zur Aufnahme im Halter 62 des Gehäuses 66 dienlich ist. Was zum Beispiel das lichtbrechende Element 60 anbetrifft, so kann die kegelförmige zweite Vorderfläche 78 in eine zylindrische Fläche und von dort aus in einen zylindrisches Flansch übergehen, der als Befestigung zur Aufnahme im Halter 64 des Gehäuses 66 dienlich ist. In diesem letzteren Fall kann es wünschenswert sein, die Spitze 84 zu entfernen, um eine gekürzte, nach vorne gerichtete Fläche 94 bereitzustellen, die in einer Ebene senkrecht zur Achse 76 liegt. Die Fläche 94 kann mit einer geeigneten lichtundurchlässigen Beschichtung versehen sein und dadurch als Sperrscheibe fungieren, um unerwünschtes Streulicht abzuhalten, das sonst zu einer niedrigeren Systemauflösung führen würde. Bemerkenswert ist, daß bei Verwendung der Fläche 94 in dieser Weise die gewünschte Fluoreszenz aus Faser 12 nicht blockiert wird.
In einer anderen Ausführungsform, beschrieben in den Fig. 9A und 9B, umfaßt ein optischer Umformer 36A einen lichtdurchlässigen zylindrischen Festkörper aus optischem Glas oder Kunststoff, die im wesentlichen frei sind von Verunreinigungen und Fehlern. Der modifizierte optische Umformer 36A weist eine erste kegelförmige lichtbrechende Fläche 96 gegenüber einem Spitzenwinkel Φ&sub1; zum Umlenken des festkörperkollimierten Lichtstrahls 70 in einen divergierenden oder kegelförmigen Lichtstrahl 98 auf. Der optische Umformer 36A besitzt auch eine zweite, gegenüberliegende, kegelförmige lichtbrechende Fläche 100 zum Umlenken des divergierenden Lichtstrahls 98 in einen austretenden Lichtstrahl 102, der ringwulstförmig ist, mit einem ringförmigen Querschnitt von im wesentlichen konstantem nominalen Durchmesser und konstantem Querschnitt und im wesentlichen konstantem Innen- und Außenradius Ri beziehungsweise Ro. Der modifizierte optische Umformer 36A wird in einem geeigneten Halter 104 auf einem Gehäuse 66A zwischen Filter 50 und Strahlenteiler 38 gehalten.
Wie im Falle des optischen Umformers 36 kann der Spitzenwinkel Φ&sub1; gegenüber der Vorderfläche 96 des modifizierten optischen Umformers 36A jeder gewünschte Winkel sein, obgleich es für einfache Herstellung wünschenswert sein kann, daß er 45º beträgt, so daß die Vorderfläche 96 tatsächlich einen rechtwinkligen Kreiskegel definiert.
Es soll nun die aus dem Aufbau des optischen Umformers 36 der Fig. 6A und 6B resultierende Funktionsweise beschrieben werden. Nach beliebiger Auswahl von Spitzenwinkel Φ&sub1;, Brechungsindex und gewünschtem Außenradius Ro des resultierenden ringförmigen Lichtstrahls 102 - oder des "Lichtrings" - kann die (imaginäre) Spitze/Spitze-Dicke T der Vorrichtung wie folgt berechnet werden:
T = Ro(cotΦ&sub1; + tan(Φ&sub1; + sin&supmin;¹(90-θ&sub1;)/n))) (8)
Der Radius rP des eingestrahlten Strahls kann dann mit Hilfe der gewünschten Außen- und Innenradien Ro beziehungsweise Ri des "Lichtrings" wie folgt berechnet werden:
rp = Ro - R&sub1; (9)
Zwar ist die Form des modifizierten optischen Umformers 36A, gezeigt in Fig. 9B, zum Zwecke der Erklärung der Entwurfsüberlegungen bei dessen Aufbau annehmbar, doch kann sie im tatsächlichen Fall so aussehen wie in Fig. 10 dargestellt. Die rechtwinklige, kegelförmige erste lichtbrechende Fläche 96 kann in eine zylindrische Fläche 86 zum Tragen im Halter 104 im Gehäuse 66A übergehen. Die kegelförmige hintere oder zweite lichtbrechende Fläche 100 kann in eine gekürzte rückwärtige Fläche 108 übergehen, die in einer Ebene senkrecht zur Achse 76 liegt. Wie im Falle der gekürzten Fläche 94 des optischen Umformers 36 kann die Fläche 108 mit einer geeigneten lichtundurchlässigen Beschichtung versehen sein und dadurch als Sperrscheibe fungieren, um unerwünschtes Streulicht abzuhalten, das sonst zu einer niedrigeren Systemauflösung führen würde. Bemerkenswert ist wiederum, daß bei Verwendung der Fläche 108 in dieser Weise die gewünschte Fluoreszenz aus Faser 12 nicht blockiert wird.
Zwar wurden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ausführlich offenbart, doch sollte Fachleuten klar sein, daß verschiedene andere Abwandlungen an den beschriebenen Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, der in der Beschreibung erläutert und in den beigefügten Patentansprüchen definiert ist.

Claims

1. System zum Analysieren einer flüssigen Probe mit Anregungsstrahlung aus einer Strahlenquelle, wobei die Strahlung imstande ist, eine Fluoreszenz in fluoreszierendem Material anzuregen, umfassend:

eine innen totalreflektierende, einheitliche, längliche Faser, die sowohl für die Anregungsstrahlung als auch für die Fluoreszenz durchlässig ist, wobei die Faser ein Ende aufweist, in das die Strahlung eingeführt werden soll, sowie eine periphere Oberfläche, von der wenigstens ein Teil eine solche Lage einnimmt, daß die Probe berührt wird; eine Anregungsstrahlungsquelle, die einen fest kollimierten Lichtstrahl liefert; und

optische Hilfsmittel zur Führung der Anregungsstrahlung in die Faser, um innere Totalreflexion sicherzustellen und die Anregungsstrahlung auf das Substrat zu fokussieren, die im wesentlichen auf den Bereich desselben beschränkt ist, an dem Kopplung einer abklingenden welle auftritt, wobei die optischen Hilfsmittel einen optischen Umformer zum Umlenken eines festkollimierten Lichtstrahls in einen Strahl mit ringförmigem Querschnitt und konstantem Innen- und Außendurchmesser und eine Konvexlinse zwischen dem optischen Umformer und der Faser zur Fokussierung des Strahls mit ringförmigem Querschnitt vom optischen Umformer in die Faser umfassen.

2. Analysensystem nach Anspruch 1, wobei der optische Umformer folgendes umfaßt:

ein erstes lichtbrechendes Element mit einer ersten Vorderfläche, die eine solche Lage einnimmt, daß der kreisförmig kollimierte Lichtstrahl abgefangen wird, um den kreisförmig kollimierten Lichtstrahl in einen divergierenden, kegelförmigen und ringförmigen Lichtstrahl umzuformen, und einer Grundfläche, die in einer Ebene senkrecht zur Achse des kollimierten Lichtstrahls liegt; und

ein zweites lichtbrechendes Element mit einer zweiten Vorderfläche, die eine solche Lage einnimmt, daß der divergierende, kegelförmige und ringförmige Lichtstrahl aus dem ersten lichtbrechenden Element abgefangen wird, um den kegelförmigen und ringförmigen Lichtstrahl in einen ringförmigen Lichtstrahl mit im wesentlichen konstantem Innen- und Außendurchmesser umzuformen;

wobei erstes und zweites lichtbrechendes Element einen Abstand voneinander aufweisen und coaxial zur Längsachse des kreisförmig kollimierten Lichtstrahls sind.

3. Analysensystem nach Anspruch 2, wobei erstes und zweites lichtbrechendes Element lichtdurchlässig sind.

4. Analysensystem nach Anspruch 3, wobei das erste lichtbrechende Element eine Vorderfläche aufweist, bei der es sich um einen Kreiskegel handelt, der zum kollimierten Lichtstrahl hingewandt ist; und das zweite lichtbrechende Element eine Vorderfläche aufweist, bei der es sich um einen Kreiskegel handelt, der zum divergierenden ringförmigen Lichtstrahl hingewandt ist.

5. Analysensystem nach Anspruch 1, wobei die längliche Faser zylindrisch ist, die längliche Faser eine solche Lage einnimmt, daß sie eine Beschichtung mit fluoreszierendem Material auf wenigstens einem Teil ihrer peripheren Oberfläche erhält.

6. Analysensystem nach Anspruch 1, wobei die längliche Faser zylindrisch ist, die längliche Faser eine solche Lage einnimmt, daß sie auf wenigstens einem Teil ihrer peripheren Oberfläche eine Beschichtung mit fluoreszierendem Material erhält, das wenigstens einen Teil eines Antikörper/Antigen-Komplexes umfaßt, der eine Markierung enthält, die die Fluoreszenz liefert, wenn sie durch eine abklingende Welle angeregt wird, die von der Anregungsstrahlung erzeugt wird.

7. Analysensystem nach Anspruch 1, umfassend: eine hohle längliche Umschließung, die um die Faser und in einem Abstand von derselben angeordnet ist, so daß sich ein Zwischenraum zwischen der Faser und der Umschließung ergibt.

8. Analysensystem nach Anspruch 7, wobei die Faser konzentrisch innerhalb der Umschließung angeordnet ist.

9. Analysensystem nach Anspruch 7, wobei der Zwischenraum zwischen Umschließung und Faser kapillare Dimensionen aufweist.

10. Analysensystem nach Anspruch 1, umfassend: Detektoreinrichtungen zur Erfassung der Fluoreszenzstrahlung, die als Reaktion auf die Anregungsstrahlung vom Einführungsende der Faser emittiert wird.

11. Analysensystem nach Anspruch 1, umfassend: eine hohle längliche Umschließung, die um die Faser und in einem Abstand von derselben angeordnet ist, so daß sich ein Zwischenraum mit kapillaren Dimensionen zwischen der Faser und der Umschließung ergibt, wobei die Faser coaxial zur Umschließung angeordnet ist.