-
AUFGABE DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die pharmazeutische
Zusammensetzung, welche diese umfasst, und die Verwendung dieser
zur Herstellung von Medikamenten, die zur Behandlung von Krebstumoren
bestimmt ist.
-
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK.
-
In
den letzten Jahren sind viele Tumorwirkstoffe, wie etwa Anthracycline
und Vinca-Alkaloide, entwickelt worden und sind besonders wirksam
bei der Behandlung von Krebs. Dennoch sind diese Moleküle in vivo oftmals
durch eine hohe Toxizität
gekennzeichnet, insbesondere eine medulläre und Schleimhaut-Toxizität sowie
eine chronische Herztoxizität
bei den Anthraxyclinen und eine neurologische Toxizität bei den
Vinca-Alkaloiden.
-
Es
wurde ebenfalls versucht, spezifischere Antitumorwirkstoffe zu entwickeln,
sodass sie wirksamer gegen die Tumorzellen sind und infolgedessen
die Nebenwirkungen dieser Produkte (Toxizität, Zerstörung der nicht tumorartigen
Zellen...) senken.
-
US-Patentschrift Nr. 4,296,105 beschreibt
Doxorubicinderivate, die an eine gegebenenfalls substituierte Aminosäure gebunden
sind, die in vitro eine höhere
Antitumoraktivität
und eine geringere Toxizität
als Doxorubicin aufweisen.
-
Dennoch
sind diese Moleküle,
da diese Derivate eine aktive intrazelluläre Stelle aufweisen, noch dazu imstande
in die Tumorzellen und in die normalen Zellen einzudringen.
-
In
den letzten Jahren sind ebenfalls neue therapeutische Wirkstoffe
in Form von pro-Arzneimitteln vorgeschlagen worden.
-
Die
pro-Arzneimittel sind Moleküle,
die dazu imstande sind, sich durch gewisse chemische oder enzymatische
Modifikationen ihrer Struktur in Arzneimittel (therapeutische Wirkstoffe)
umzuwandeln.
-
Dennoch
sind diese pro-Arzneimittel ebenfalls durch eine geringe Stabilität im Blut
und Serum, die Enzyme umfassen, welche diese Moleküle inaktivieren,
gekennzeichnet.
-
Die
Dokumente Chemical Abstract 97:150635, Journal of Medicinal Chemistry,
BD. 23, S. 1171–1174 (1980);
Drugs Exp. Clin., Bd. 9, S. 303–311
(1983); Journal of Medical Chemistry, Bd. 23, S. 1166–1170 (1980) und
die Anmeldung
BE-882.541 beschreiben
pro-Arzneimittel, umfassend einen Vektor, der durch einen Peptidarm
an das Arzneimittel gebunden ist. Vorzugsweise besteht der Arm aus
vier Aminosäuren
und ist durch seine freie Carboxylfunktion an die freie Aminfunktion
der Anthracyclinderivate, wie etwa Daunorubicin, gebunden.
-
Des
Weiteren ist der Arm dieses pro-Arzneimittels durch seine freie
Aminfunktion an einen Vektor gebunden, der aus einem Makromolekül (Protein
wie etwa BSA, Immunoglobuline...) besteht, was die selektive Endocytose
des pro-Arzneimittels durch Zielzellen ermöglicht.
-
Es
ist ebenfalls bekannt, dass Methotrexat zur Behandlung von allgemeinen
Entzündungsreaktionen wie
etwa Rheumatismen verwendet werden kann, jedoch schränkt seine
erhöhte
Toxizität
seine Anwendungen ein.
-
ZIELE DER ERFINDUNG.
-
Die
vorliegende Erfindung versucht, neue Verbindungen bereitzustellen,
umfassend einen antitumoralen therapeutischen Wirkstoff, insbesondere
pro-Arzneimittel, die einen antitumoralen therapeutischen Wirkstoff
umfassen, die gegenüber
Produkten des Stands der Technik verbesserte therapeutische Eigenschaften aufweisen,
insbesondere verbesserte therapeutische Eigenschaften bei der Behandlung
von Krebstumoren.
-
Ein
bestimmtes Ziel der vorliegenden Erfindung versucht, pro-Arzneimittel
zu erhalten, die eine erhöhte
aktive Spezifizität,
eine reduzierte Toxizität
und eine verbesserte Stabilität
in Serum und Blut aufweisen.
-
CHARAKTERISTISCHE ELEMENTE DER ERFINDUNG.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verbindungen (W-Z-M) wie in Anspruch
1 definiert. Diese Verbindungen umfassen ein Element, das ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus antitumoralen therapeutischen Wirkstoffen,
die eine aktive intrazelluläre
Stelle (S. A.) besitzen, die an einen Liganden (W-Z) gebunden ist,
der einen Arm (Z) umfasst, der an eine Endgruppe (W) gebunden ist,
wobei die Bindung zwischen dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) und dem
Element (M) die Zelldurchdringung der Verbindung (W-Z-M) verhindert;
wobei diese Bindung selektiv durch Faktoren, die von den Zielzellen
abgesondert werden, derart spaltbar ist, dass die Durchdringung
des therapeutischen Wirkstoffs (M) in die Zielzellen ermöglicht wird,
und wobei die Endgruppe (W) die Stabilität der Verbindung (W-Z-M) im
Serum und Blutkreislauf gewährleisten,
dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen der Endgruppe
(W) und dem Arm (Z) sowie die Bindung zwischen dem Arm (Z) und dem
Element (M) kovalente Bindungen sind, die die Eigenschaften der
Verbindung (W-Z-M) nicht beeinträchtigen,
dadurch, dass der Arm (Z) des Liganden (W-Z) ein Peptid ist, das
aus mindestens zwei gegebenenfalls substituierten besteht, dadurch,
dass die Gruppe (W) das β-Alanin der Formel
H2N-CH2-CH2-CO2H ist, und dadurch,
dass die Bindung zwischen dem Element (M) und dem Arm (Z) des Liganden
(W-Z) eine peptidische Bindung ist.
-
Mit
Faktoren, die von den Zielzellen abgesondert sind, insbesondere
von Tumorzellen, sind Enzyme wie etwa Proteasen oder Peptidasen
gemeint, die auf spezifische Weise in extrazellulärem Medium
von diesen Zellen abgesondert werden.
-
Diese
Enzyme sind daher imstande, selektiv die Bindung zwischen dem Element
(M) und dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) derart zu spalten, dass die
Durchdringung des therapeutischen Wirkstoffs, vorzugsweise in diese
Zellen, ermöglicht
wird und auf diese Weise ihre Zerstörung gewährleistet und/oder ihre Proliferation blockiert
wird.
-
Mit
Endgruppe (W), die die Stabilität
der Verbindung nach der Erfindung in Serum und Blutkreislauf gewährleistet,
ist β-Alanin
gemeint, das die Spaltung der Verbindung nach der Erfindung in Serum
und Blutkreislauf reduziert oder hemmt, insbesondere die Hydrolyse
der Verbindung nach der Erfindung durch Proteinasen und Peptidasen,
die in Serum und/oder Blutkreislauf vorhanden sind, hemmt, insbesondere
die Peptidasen und Proteinasen, die mit roten Blutkörperchen
in Verbindung stehen.
-
Insbesondere
eine Endgruppe (W), die die Stabilität der Verbindung nach der Erfindung
gewährleistet, wenn
weniger als 20%, vorzugsweise weniger als 2% der Verbindung während ihrer
Konservierung in menschlichem Blut von 37°C während mehr als 2 Stunden durch
die Enzyme gespalten werden.
-
Nach
der Erfindung ist die Gruppe (W) β-Alanin
der Formel: NH2-CH2-CH2-COOH, das durch seine Carboxylfunktion
an den Arm (Z) gebunden ist.
-
Nach
der Erfindung besteht die Bindung zwischen dem Element (M) und dem
Arm (Z) des Liganden (W-Z) in einer Peptidbindung, und der Arm (Z)
ist ein Peptid, das aus mindestens zwei gegebenenfalls substituierten
Aminosäuren
besteht.
-
Der
Arm (Z) des Liganden (W-Z) besteht vorzugsweise aus der Aufeinanderfolge
der folgenden Aminosäuren:
L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl,
L-Leucyl-L-Alanyl oder L-Alanyl-L Leucyl-L-Phenylalanyl oder L-Alanyl-L-Leucyl,
die durch ihre Carboxylfunktion an das Element (M) gebunden sind.
-
Nach
der Erfindung ist der therapeutische Wirkstoff (M) ein therapeutischer
Wirkstoff, der in der Krebschemotherapie verwendet wird, der vorzugsweise
ausgewählt
ist aus den therapeutischen Wirkstoffen, die von Bruce A. Chabner
und Jerry M. Collins (Cancer Chemotherapy, Lippincott Ed., ISBN
0-397-50900-6(1990))
beschrieben wurden und dazu imstande sind, sich am Liganden (W-Z)
durch eine Peptidbindung an die Gruppe (Z) des Liganden (W-Z) zu
befestigen.
-
Insbesondere
ist der therapeutische Wirkstoff ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Anthracyclinen, Folsäurederivaten,
Vinca-Alkaloiden, Mitoxanthron, Calicheamycin, Arabinosylcytosinen
(ARA-C), Arabinosyladenosinen (ARA-A), Fludarabinphosphat, Melphalan,
Bleomycin, Mitomycin, L-Canavanin,
Taxoiden, Camptothecin und dessen Derivaten, insbesondere TOPOTECAN® (9-Dimethylaminomethyl-10-hydroxy camptothecinhydrochlorid),
das gegebenenfalls an eine substituierte oder nicht substituierte
Aminosäure
gebunden ist. Die Substitution auf der Aminosäure kann jede beliebige Substitution
sein, die die Eigenschaften der Verbindung (W-Z-M) nach der Erfindung nicht beeinträchtigt.
-
Mit
Derivaten dieser Moleküle
sind die Moleküle
gemeint, die durch eine chemische Gruppe modifiziert werden, was
ihre Befestigung am Arm (Z) des Liganden (W-Z) mittels einer kovalenten
Bindung ermöglicht, die
die therapeutische Aktivität
des ursprünglichen
Moleküls
nicht beeinträchtigt.
-
Vorzugsweise
wird bei der Verbindung nach der Erfindung der therapeutische Wirkstoff
(M) ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Anthracyclinen, insbesondere Doxorubicin
(DOX) und Daunorubicin (DNR), die gegebenenfalls an eine substituierte
oder nicht substituierte Aminosäure
gebunden sind.
-
Vorteilhafterweise
entspricht der therapeutische Wirkstoff der allgemeinen Formel:
wobei:
- – R1 ein Wasserstoffatom oder eine OH-Gruppe
ist,
- – R2 ein Wasserstoffatom oder ein Rest der Formel ist, wobei:
- – R3 ein Wasserstoffatom oder ein gegebenenfalls
substituierter Alkylrest ist,
- – R4 für
ein Wasserstoffatom steht oder mit R3 einen
Alkylrest bildet, der 3 oder 4 Kohlenstoffatome umfasst.
-
Vorzugsweise
ist R
2 ein Rest der Formel
oder eines
ihrer Isomere.
-
Nach
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Verbindung β-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl-Daunorubicin (nachfolgend
durchwegs als β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
bezeichnet), β-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl-
Doxorubicin (nachfolgend durchwegs als β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX), β-Alanyl-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Phenylalanyl-Daunorubicin
(nachfolgend durchwegs als Z-Ala-Ala-Leu-Phe-DNR) oder β-Alanyl-L-Alanyl-L-Leucyl-L-phenylalanyl-doxorubicin
(nachfolgend durchwegs als β-Ala-Ala-Leu-Phe-DOX).
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die pharmazeutische Zusammensetzung,
umfassend die Verbindung nach der Erfindung und gegebenenfalls ein
Adjuvans oder einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
-
Diese
Zusammensetzungen können
zum Beispiel parenteral oder intravenös verabreicht werden. Die Zusammensetzungen
nach der Erfindung zur parenteralen Verabreichung können insbesondere
sterile wässrige
oder nicht wässrige
Lösungen,
Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Lösemittel oder pharmazeutisch akzeptablen
Träger
können
Propylenglycol, Polyethylenglycol, injizierbare organische Ester,
zum Beispiel Ethyloleat, oder Cyclodextrine eingesetzt werden. Diese
Zusammensetzungen können
ebenfalls Feuchthaltemittel, Emulgatoren und/oder Dispergierungsmittel
umfassen.
-
Die
Sterilisierung kann auf verschiedene Weisen erfolgen, zum Beispiel
mithilfe eines bakteriologischen Filters, indem Sterilisiermittel
in die Zusammensetzung inkorporiert werden, oder durch Bestrahlung.
Sie können
ebenfalls in Form von sterilen festen Zusammensetzungen hergestellt
werden, die im Einsatz in sterilem Wasser oder einem beliebigen
anderen injizierbaren sterilen Medium aufgelöst werden können.
-
Die
vorliegende Erfindung kann ebenfalls Adjuvantien umfassen, die dem
Fachmann wohlbekannt sind (Vitamin C, Antioxidantien, ...), die
zusammen mit der Zusammensetzung nach der Erfindung zur Verbesserung
und Verlängerung
der Behandlung von Krebstumoren verwendet werden können.
-
Die
minimalen Verabreichungsdosen der Verbindungen nach der Erfindung
an einen Patienten sind die üblichen
Dosen der oben erwähnten
antitumoralen therapeutischen Wirkstoffe, wie diejenigen, die von
Bruce A. Chabner und Jerry M. Collins (Cancer Chemotherapy, Lippincott
Ed., ISBN 0-397 50900-6(1990))
beschrieben wurden, oder höhere
Verabreichungsdosen.
-
Die
verabreichten Dosen variieren daher in Abhängigkeit des für die Herstellung
der Verbindung nach der Erfindung verwendeten therapeutischen Wirkstoffs.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der pharmazeutischen
Zusammensetzung nach der Erfindung zur Herstellung eines Medikamentes,
das zur Behandlung von Krebstumoren bestimmt ist, bestehend aus
der, insbesondere parenteralen oder intravenösen Verabreichung der pharmazeutischen
Zusammensetzung nach der Erfindung an einen Patienten.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN.
-
1 stellt
den Wirkungsmechanismus der Verbindung nach der Erfindung auf seiner
Wirkungsstelle (S. A.) in einer Zielzelle (C. C.) dar.
-
2 stellt
den Wirkungsmechanismus der Verbindung nach der Erfindung in einer
normalen Zelle (C. N.) dar.
-
3 stellt
die Hydrolyse von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin
in einem konditionierten Medium von menschlichen Brustdrüsenkarzinomzellen
MCF7/6 (Chromatogramm des Anfangszeitpunkts (a) und nach zwei Stunden
Inkubation (b)) dar.
-
4 stellt
die Hydrolyse von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin
in einem konditionierten Medium von menschlichen Brustdrüsenkarzinomzellen
MCF7/ADR (Chromatogramm des Anfangszeitpunkts (a) und nach einer
Stunde Inkubation (b)) dar.
-
5 stellt
die Hydrolyse von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin
in einem konditionierten Medium von Darmkarzinomzellen HT29 (Chromatogramm
des Anfangszeitpunkts (a) und nach zwei Stunden Inkubation (b))
dar.
-
6 stellt
die Akkumulation von Daunorubicin (DNR) in der Konzentration von
10 μg/ml
durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
-
7 stellt
die Akkumulation von N-L-Leucyl-Daunorubicin (Leu-DNR) in der Konzentration
von 10 μg eq.
DNR/ml durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
-
8 stellt
die Akkumulation von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin in der
Konzentration von 10 μg
eq. DNR/ml durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
-
9 stellt
die Akkumulation von Daunorubicin (DNR) in der Konzentration von
10 μg/ml
durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
-
10 stellt
die Akkumulation von N-L-Leucyl Daunorubicin (Leu-DNR) in der Konzentration
von 10 μg
eq. DNR/ml durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
-
11 stellt
die Akkumulation von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin
in der Konzentration von 10 μg
eq. DNR/ml durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
-
12 stellt
die Zytotoxizität
von Daunorubicin (DNR), L-Leu-Daunorubicin
und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin
gegenüber
MCF7/6 Zellen dar, die 72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen
im Wachstum gehalten wurden.
-
13 stellt
die Zytotoxizität
von Daunorubicin (DNR), L-Leu-Daunorubicin
und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin
gegenüber
MCR5 Fibroblastenzellen dar, die 72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen
im Wachstum gehalten wurden.
-
14 stellt
die Sterblichkeitsrate von weiblichen NMRI-Mäusen
nach der intraperitonealen Verabreichung an 5 aufeinanderfolgenden
Tage von Daunorubicin (DNR) in Gesamtdosen zwischen 2,0 und 3,5
mg/kg.
-
15 stellt
die Entwicklung des mittleren Gewichtes der weiblichen NMRI-Mäuse dar,
nachdem sie intraperitoneal an 5 aufeinanderfolgenden Tagen Gesamtdosen
von Daunorubicin zwischen 2,0 und 3,5 mg/kg erhalten haben. Die
Gewichte sind in Prozenten des anfänglichen mittleren Gewichtes
für jeweils
jede Gruppe angegeben.
-
16 stellt
die Sterblichkeitsrate von weiblichen NMRI-Mäusen
nach der Verabreichung an 5 aufeinanderfolgenden Tagen von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin in Gesamtdosen
zwischen 10 und 60 mg/kg dar.
-
17 stellt
die Entwicklung des mittleren Gewichtes von weiblichen NMRI-Mäusen dar,
nachdem sie intraperitoneal an 5 aufeinanderfolgenden Tagen Gesamtdosen
von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin
zwischen 10 und 60 mg/kg erhalten haben. Die Gewichte sind in Prozenten
des anfänglichen
mittleren Gewichtes für
jeweils jede Gruppe angegeben.
-
18 stellt
die Sterblichkeitsrate von weiblichen NMRI-Mäusen
nach der einzelnen intravenösen Verabreichung
Daunorubicin (DNR) in Dosen zwischen 10 und 35 mg/kg dar.
-
19 stellt
die Entwicklung des mittleren Gewichtes von weiblichen NMRI-Mäusen dar,
nachdem sie intravenös
Dosen von Daunorubicin (DNR) zwischen 10 und 35 mg/kg erhalten haben.
Die Gewichte sind in Prozenten des anfänglichen mittleren Gewichtes
für jeweils
jede Gruppe angegeben.
-
20 stellt
die Entwicklung des mittleren Gewichtes von weiblichen NMRI-Mäusen dar,
nachdem sie intravenös
Dosen von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin
zwischen 30 und 60 mg/kg erhalten haben. Die Gewichte sind in Prozenten
des anfänglichen
mittleren Gewichtes für
jeweils jede Gruppe angegeben.
-
21 stellt
die Entwicklung des mittleren Gewichtes von weiblichen NMRI-Mäusen dar,
nachdem sie intravenös
entweder eine Dosis von 30 mg/kg β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin oder
zwei Dosen von 30 mg/kg jeweils an zwei aufeinanderfolgenden Tagen
erhalten haben. Die Gewichte sind in Prozenten des anfänglichen mittleren
Gewichtes für
jeweils jede Gruppe angegeben.
-
22 stellt
die Kinetik der enzymatischen Hydrolyse von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin
in L-Ala-L-Leu-Doxorubicin
und L-Leu-Doxorubicin in einem durch MCF7/6 Zellen konditionierten
Medium dar.
-
23 stellt
die Akkumulation von Doxorubicin (DOX) in der Konzentration von
10 μg/ml
durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
-
24 stellt
die Akkumulation von L-Leu-Doxorubicin in der Konzentration von
10 μg/ml
durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
-
25 stellt
die Akkumulation von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin
in der Konzentration von 10 μg/ml durch
konfluente MCF7/6 Zellen dar.
-
26 stellt
die Akkumulation von Doxorubicin (DOX) in der Konzentration von
10 μg/ml
durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
-
27 stellt
die Akkumulation von L-Leu-Doxorubicin in der Konzentration von
10 μg/ml
durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
-
28 stellt
die Akkumulation von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin
in der Konzentration von 10 μg/ml durch
konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
-
29 stellt
die Zytotoxizität
von Doxorubicin (DOX), L-Leu-Doxorubicin
und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin
gegenüber
MCR5 Fibroblastenzellen dar, die 72 Stunden in Anwesenheit der Anthracyclinderivate im
Wachstum gehalten wurden.
-
30 stellt
die Zytotoxizität
von Doxorubicin (DOX), L-Leu-Doxorubicin
und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin
gegenüber
MCR5 Fibroblastenzellen dar, die 72 Stunden in Anwesenheit der Anthracyclinderivate im
Wachstum gehalten wurden.
-
31 stellt
die Variation der mittleren Tumormasse eines menschlichen Brustdrüsentumors
MCF7/6 dar, der in athyme Mäuse
am Tag T-21 in Abhängigkeit
der Verabreichung von Doxorubicin (DOX) und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin (super DOX) implantiert
wurde.
-
32 stellt
die Variation des mittleren Gewichtes von Mäusen (Gramm), die durch die
Verabreichung von Doxorubicin (DOX) und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin
(super DOX) behandelt wurden.
-
BESCHREIBUNG EINER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORM
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung beruht auf der unerwarteten Entdeckung, dass
es möglich
ist, einen antitumoralen therapeutischen Wirkstoff (M) durch die
Bindung mit einem Liganden (W-Z) zu inaktivieren, der das intrazelluläre Eindringen
des therapeutischen Wirkstoffs (M) in normale Zellen (C. N.) und
Zielzellen (C. C.) verhindert.
-
Nach
der Erfindung sind diese Zielzellen Tumorzellen.
-
Auf
unerwartete Weise setzen die Zielzellen (C. C.) im extrazellulären Medium
von Enzymen, wie etwa Proteasen oder Peptidasen, die dazu imstande
sind, selektiv eine kovalente Bindung zwischen dem Arm (Z) des Liganden
(W-Z) und dem therapeutischen Wirkstoff (M) zu hydrolysieren, um
das Eindringen des therapeutischen Wirkstoffs (M) in die Zielzellen
(C. C.) zu ermöglichen.
In der Zielzelle wirkt der therapeutische Wirkstoff (M) entweder
direkt auf seine spezifische intrazelluläre Wirkungsstelle (S. A.) oder
nach einer Modifizierung unter Einwirkung von intrazellulären Proteasen
wird ein anderer therapeutischer Wirkstoff (M*) modifiziert und
tötet die
Zielzelle (C. C) oder blockiert deren Proliferation (1).
-
Da
die normalen Zellen diese Enzyme in vitro nicht oder nur kaum freisetzen,
wird die Verbindung nach der Erfindung inaktiv gehalten und dringt
nicht in die normalen Zellen ein (2).
-
Die
Verbindung, die in der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben
wird, reagiert auf diesen Wirkungsmechanismus, da er die nötigen Kriterien
zur wirksamen Verabreichung erfüllt.
- 1. Der antitumorale therapeutische Wirkstoff
(M):
– besitzt
eine intrazelluläre
Wirkungsstelle,
– eine
hohe spezifische Aktivität,
– eine chemische
Gruppe, die eine kovalente Bindung mit einem Liganden (W-Z) ermöglicht;
– wenn die
erforderliche chemische Gruppe nicht für die Wirkung des therapeutischen
Wirkstoffs (M) bedeutend ist, muss dieser nach der enzymatischen
Hydrolyse der kovalenten Bindung nicht intakt zurückgegeben
werden.
- 2. Die Bindung mit dem Liganden (W-Z) verhindert das Eindringen
des therapeutischen intrazellulären
Wirkstoffs (M) sowohl in die normalen Zellen als auch in die Zielzellen.
- 3. Die Verbindung nach der Erfindung bleibt in Serum und Blut
stabil und ist gegenüber
der Wirkung der Proteinasen und Peptidasen, welche zirkulieren und
mit den roten Blutkörperchen
in Verbindung stehen, unempfindlich.
- 4. Die kovalente Bindung zwischen dem antitumoralen therapeutischen
Wirkstoff (M) und dem Liganden (W-Z) wird durch die von den Zielzellen
abgesonderten Enzyme teilweise oder vollständig degradiert.
- 5. Die Art des Liganden (W-Z) und seine Bindung mit dem therapeutischen
Wirkstoff (M) werden in Abhängigkeit
der von den Zielzellen abgesonderten Enzymen bestimmt.
- 6. Die Verbindung ist in vivo weniger toxisch als der anfängliche
therapeutische Wirkstoff. Diese Verminderung der Toxizität betrifft
insbesondere die akuten Wirkungen, wie etwa die medulläre und Schleimhaut-Toxizität, sowie
die mögliche
Herz- oder neurologische Toxizität.
-
ANTHRACYCLINDERIVATE
-
Der
therapeutische Wirkstoff (M) nach der Erfindung kann ein Anthracyclinderivat
sein, insbesondere Doxorubicin, Daunorubicin, 4-Epi-Doxorubicin,
4-Demethoxy-Doxorubicin (Idarubicin), 4'-Tetrahydropyranyl-Doxorubicin (Pirarubicin),
Carminomycin, Esorubicin und 4'-Iodo-Doxorubicin.
-
Der
Ligand (W-Z) wird anschließend
durch seine Carboxylfunktion an das α-Aminoende des therapeutischen
Wirkstoffs gebunden.
-
FOLSÄUREDERIVATE
-
Der
antitumorale therapeutische Wirkstoff kann ebenfalls ein Folsäurederivat,
insbesondere Methotrexat (MTX) oder seine Derivate sein, wie etwa
Lysin (e-y)MTX oder Lysine (ε-α)-MTX, wie
von Fitzpatrick et al. (Anti-cancer Drug Design 10, S. 1–9 und S.
11–24
(1995)) beschrieben, oder Aminopterin, insbesondere Lysin (ε-γ)-AMPT und
Lysin (ε-α)-AMPT sein.
-
Der
Ligand (W-Z) wird anschließend
durch seine Carboxylfunktion an das α-Aminoende des therapeutischen
Wirkstoffs gebunden.
-
VINCA-ALKALOIDDERIVATE
-
Die
Vinca-Alkaloidderivate nach der vorliegenden Erfindung sind insbesondere
die Derivate von Vinblastin, Vincristin, Vindesin und Navelbin.
-
A. Bindung an Position 3
-
- 1. Deacetylvincristinsäure, die durch die Zugabe von
Lysin zur Gruppe Amino-e, um ein (e)dAcVCR-Lysin zu erhalten, gebildet
wird. Danach wird der Ligand (W-Z) an seinem Carboxylende an die α-Aminogruppe des
(ε)-dAcVCR-Lysins
gebunden.
- 2. Deacetylvincristinsäure
kann ebenfalls durch das Hinzugeben eines aliphatischen Diamins
zu Vincristin (NH2-Alkyl-NH2)
erhalten werden, um ein NH2-Alkyl-dAcVCR
zu erhalten, wobei der Ligand (W-Z) anschließend an seinem Carboxylende
an die α-Aminogruppe des (e)-dAcVCR-Lysins
gebunden wird.
-
Die
Derivate von Vinblastin (VBL) und Navelbin (5'-Noranhydrovinblastin)
können
auf dieselbe Weise an den Liganden (W-Z) gebunden werden, wie vorhergehend
für Vinc ristin
beschrieben wurde.
-
B. Bindung an Position 4
-
- 1. V4-Hemiaspartat-Vincristin
wird aus Vincristin durch die Bindung von Asparaginsäure durch
ihre γ-Carboxylgruppe
hinweg an die Hydroxylgruppe an Position 4 von Vincristine (V4) gebildet. Anschließend wird der Ligand (W-Z)
durch sein Carboxylende an die α-Aminogruppe
von V4-Hemiaspartat-Vincristin gebunden.
- 2. V4-Lysyl-Vincristin wird aus Vincristin
gebildet, indem Lysin durch seine α-Carboxylgruppe an die Hydroxylgruppe
an Position 4 von Vincristin (V4) gebunden
wird. Anschließend
wird der Ligand (W-Z) durch sein Carboxylende an die α-Aminogruppe
von V4-Lysyl-Vincristin gebunden.
- 3. V4-Lysyl-Vincristin wird aus Vincristin
gebildet, indem Lysin durch seine α-Carboxylgruppe an die Hydroxylgruppe
an Position 4 von Vincristin (V4) gebunden
wird. Anschließend
wird der Ligand (W-Z) durch sein Carboxylende an die e-Aminogruppe
des Lysins von V4-Lysin-Vincristin gebunden.
Nach einer Alternative kann der Ligand (W-Z) zugleich an die α- und e-Aminogruppen von
V4-Lysyl-Vincristin gebunden werden.
- 4. V4-β-Alanyl-Vincristin wird aus
Vincristin gebildet, indem β-Alanyl
durch seine Carboxylgruppe an die Hydroxylgruppe an Position 4 von
Vincristin (V4) gebunden wird. Anschließend wird
der Ligand (W-Z) durch sein Carboxylende an die Aminogruppe des β-Alanyls
von V4-β-Alanyl-Vincristin
gebunden.
-
Die
Derivate von Vinblastin, Vindesin und Navelbin können auf dieselbe Weise an
den Liganden (W-Z) gebunden werden, wie oben für Vincristin beschrieben wurde.
-
CALICHEAMYCINDERIVATE
-
N-Acetyl-dimethylhydrazid,
Derivat von Calicheamycin, wird durch die Reaktion eines Hydrazids,
wie etwa Thiol, auf dem Calicheamycin erhalten.
-
Der
Ligand (W-Z) wird anschließend
durch sein Carboxylende an N-Acetyl-dimethylhydrazid, Derivat von
Calicheamycin, gebunden.
-
MITOXANTHRONDERIVATE
-
Ein β-Alanylderivat
von Mitoxanthron wird durch die Bindung der Carboxylfunktion von β-Alanyl an
die Hydroxylseitenketten von Mitoxanthron hergestellt.
-
Eine
Mono- oder Bisubstitution ist anschließend möglich. Der Ligand (W-Z) wird
anschließend
durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von β-Alanyl-Mitoxanthron gebunden.
-
ARABINOSYLCITOSINDERIVATE(ARA-C)
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von
Arabinosylcitosin gebunden.
-
ARABINOSYLADENOSINDERIVATE(ARA-A).
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von
Arabinosyladenosid gebunden.
-
FLUDARABINPHOTPHATDERIVATE
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von
Fludarabinphosphat gebunden.
-
MELPHALANDERIVATE
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von
Melphalan gebunden.
-
BLEOMYCINDERIVATE
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von
Bleomycin, Peplomycin oder Liblomycin gebunden.
-
MITOMYCINDERIVATE
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe an
Position 7 von Mitomycin gebunden.
-
L-CANAVANINDERIVATE
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die α-Aminogruppe von L-Canavanin
gebunden.
-
TAXOIDDERIVATE
-
Ein β-Alanylderivat
von Taxol wird durch die Bindung in Abhängigkeit der Carboxylfunktion
von β-Alanyl
an die Hydroxylseitenketten an Position 7 von Taxol hergestellt.
-
Die
Hydroxylgruppe von Taxol ist reaktionsfähig aber für die Antitumorwirkung von
Taxol nicht essentiell (Nicalaou K. C. et al., Chemistry and Biology
of Taxol, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1994), 33, S. 15–44).
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von β-Alanyl-Taxol
gebunden.
-
Der
Ligand (W-Z) kann auf vergleichbare Weise an die Derivate von β-Alanyl-Taxol
gebunden werden.
-
CAMPTOTHECINDERIVATE
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die α-Aminogruppe von 9-Amiono-Camptothecin oder
7-Amino-Methyl-Camptothecin
gebunden.
-
Die
vorliegende Erfindung wird auf detaillierter Weise in den nachfolgenden
Beispielen beschrieben, welche beispielhaft und nicht als die vorliegende
Erfindung einschränkend
gegeben sind.
-
BEISPIEL 1
-
N-L-Leucyl-Daunorubicin (Leu-DNR) Synthese
-
L-Leucyl-Daunorubicin
wird durch die Reaktion von Daunorubicin in Form von Base (DNR)
mit L-Leucin synthetisiert, das auf seiner Aminfunktion durch eine
FMOC-Gruppe (Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl) geschützt ist und dessen Carboxylfunktion
durch IBCF (Isobutylchloroformiat) aktiviert wird, dann Entschützen der
Aminfunktion.
-
DNR
in Form von Base wird aus 200 mg Daunorubicinchlorhydrat (R. Bellon)
hergestellt, das in 500 μl DMF
(Dimethylformamid) aufgelöst
ist, denen 1,2 Äquivalente
von N-Methyl-Morpholin
hinzugegeben werden.
-
1,2 Äquivalente
von Fmoc-N-Leucin (NOVA BIOCHEM) werden in 500 μl DMF (Dimethylformamid) aufgelöst und 1,2 Äquivalente
von N-Methyl-Morpholin und 1,2 Äquivalente
von IBCF werden bei –20°C hinzugegeben.
Nach 15 Minuten wird diese Lösung
zu derjenigen der DNR-Base hinzugegeben und die Mischung wird während 16
Stunden unter Rühren
lichtgeschützt
stehen gelassen.
-
Fmoc-N-L-Leucyl-Daunorubicin
wird in 150 ml aus einer Mischung 1:1 von Ether und Petrolether (40–60°C) präzipitiert,
dann auf Sinterglas Nr. 4 gefiltert. Das Produkt wird mittels Chromatografie
in einer mit Chloroform eluierten Siliziumsäule (Silizium Si-60 70–230 Mesh
von E. MERCK) gereinigt. Das restliche DNR wird mit 10% Methanol
eluiert. Die Fraktionen, die FMOC-N-L-Leucyl-DNR enthalten, werden
einrotiert, das Produkt in 500 μl
DMF übernommen.
Die Entschützung
wird durch das Hinzugeben von 5 Äquivalenten
Diethylamin (LAB SCALA) bei –20°C durchgeführt.
-
Nach
1 Stunde wird N-L-Leucyl-DNR mit einer Mischung 1:1 von Ether und
Petrolether (40–60°C) präzipitiert,
dann auf Sinterglas Nr. 4 gefiltert. Das Produkt wird in einer Chloroform/Methanol-Mischung
(4:1 in Volumen) übernommen
und Diethylamin wird mit einem HCl-Äquivalent neutralisiert.
-
Das
Produkt wird anschließend
mittels Chromatografie in einer mit Chloroform, dann mit 15% Methanol
enthaltendem Chloroform eluierten Siliziumsäule (Silizium Si-60 70–230 Mesh
von E. MERCK) gereinigt. Die Fraktionen, die N-L-Leucyl-DNR enthalten,
werden einrotiert, das Produkt in destilliertem Wasser übernommen
und das Chlorhydrat durch die Einstellung des pH-Wertes mittels
HCL 1N gebildet. Das Produkt wird anschließend auf modifiziertem Siliziumgel
(sep-pal C18 von WATERS) gefiltert, das N-L-Leucyl-Daunorubicin wird
mittels Methanol eluiert, dann einrotiert. Die gewöhnliche
Ergiebigkeit liegt bei 70 bis 80%. Charakteristiken der Produkte
Verbindung | Formel | Schmelzpunkt
(°C) | Rf
TLC | Tr
HPLC |
DNR | C27H29NO10,
HCl | 189 | 0,05 | 0,67 |
L-Leu-DNR | C33H40N2O11, HCl | 201 | 0,31 | 0,48 |
Rf TLC:
Chloroformsystem: Methanol: Wasser (120:20:1, in Volumen) Tr HPLC:
Verweilzeit bezüglich
Doxorubicin, HPLC-System:
Säule Si-60,
mit einer Chloroformmischung eluiert: Methanol: Essigsäure: wässrige Lös. aus MgCl2
0,3 mM (1440:420:80:60, in Volumen). |
-
β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin-Synthese
-
β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin
wird durch die Synthese in fester Phase nach der Technik von Merrifield (The
Chemistry of Polypeptides, (P. G. Katsoyannis Ed.), Plenum Press,
New York, S. 336–361
(1973)) hergestellt.
-
Fluorochromderivate
-
Der
Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von
Rhodamin 123 gebunden.
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR-Synthese
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
wird durch Pfropfung von Fmoc-β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin
synthetisiert, das durch Synthese in fester Phase auf N-L-Leucyl-Daunorubicin
hergestellt wurde.
-
Fmoc-β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin
(1,5 Äquivalente),
die in DMF aufgelöst
wurden, werden 1,5 Äquivalenten
(eq.) N-Methyl-Morpholin
und 1,5 eq. Isobutylchloroformiat hinzugegeben. Nach 10 Minuten
bei –20°C werden
1,5 eq. HOBT hinzugegeben. Dann, nach 5 Minuten, wird 1 eq. von
N-L-Leucyl-Daunorubicinbase,
die in DMF aufgelöst
wurde, hinzugegeben. Nach der Reaktion wird Fmoc-β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
mit Ether präzipitiert,
dann mit Diethylamin entschützt. β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR wird mittels
Chromatografie auf einer Säule
aus Silizium und Chlorhydrat, das durch die Zugabe von HCL 1N gebildet
wurde, gereinigt.
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX-Synthese
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
wird durch Pfropfung von β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin
synthetisiert, durch Synthese in fester Phase auf N-L-Leucyl-Doxorubicin
hergestellt, wie für
die Synthese von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
beschrieben wurde.
-
In
dieser Synthese kann das Kopplungsmittel (Isobutylchloroformiat)
ausgelassen werden, sodass die Ergiebigkeit der Herstellung der
Verbindung nach Erfindung im Falle der Formulierung β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX noch
erhöht
wird.
-
BEISPIEL 2
-
Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR in einem
konditionierten Medium von Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7/6
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
wurde bei 37°C
2 Stunden lang in mit MCF7/6 Zellen konditioniertem Medium inkubiert,
das 20 oder 4 Mal konzentriert war, und die Verbindung sowie die
Produkte der Digestion wurden bei einem pH-Wert von 9 extrahiert
und mittels HPLC analysiert (
3).
Ausgangsprodukt
oder Metabolit | Zeit
0 | Nach
1 Stunde | Nach
2 Stunden |
β-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | 100% | 10% | 2,6% |
L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR
oder DNR | 0% | 3,0% | 7,3% |
L-Ala-L-Leu-DNR | 0% | < 1% | < 1% |
L-Leu-DNR | 0% | 83% | 90% |
-
Daraus
folgt, dass L-Leu-DNR der Hauptmetabolit der Endopeptidase ist und
dass seine Bildung aus dem pro-Arzneimittel praktisch nach 1 Stunde
Inkubation bei 37°C
vollständig
ist. In diesen verwendeten experimentellen Bedingungen sind L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR
und DNR nicht ausreichend voneinander getrennt, damit mit Sicherheit
gesagt werden kann, dass das gebildete L-Leu-DNR danach langsamer
in DNR hydrolisiert.
-
BEISPIEL 3
-
Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX im konditionierten
Medium von Brustdrüsenkarzinomzellen
MCF7/6
-
Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
bei 37°C
2 Stunden lang in mit MCF7/6 Zellen konditioniertem Medium, das
20 oder 4 Mal konzentriert war, inkubiert wird, findet sich als
Metabolit lediglich L-Leu-DOX und DOX.
Ausgangsprodukt
oder Metabolit | Zeit
0 | Nach
2 Stunden |
β-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DOX | 100% | 23% |
L-Leu-L-Ala-L-Leu-DOX | 0% | < 1% |
L-Ala-L-Leu-DOX | 0% | < 1% |
L-Leu-DOX | 0% | 68% |
DOX | 0% | 9% |
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
wird weniger schnell als das pro-Arzneimittel
von DNR durch die von den MCF7/6 Zellen abgesonderte(n) Peptidase(n)
hydrolysiert. Dahingegen scheint die Umwandlung von L-Leu-DOX in
DOX etwas wichtiger zu sein als die Umwandlung von L-Leu-DNR in
DNR.
-
BEISPIEL 4
-
Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
in menschlichem Blut
-
Wie
auch β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
ist β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX stabil, wenn
es bei 37°C
in menschlichem Blut inkubiert wird. Tatsächlich werden weniger als 2%
des pro-Arzneimittels nach 2 Stunden in L-Leu-DOX hydrolysiert,
wohingegen die anderen synthetisierten Derivate in Anwesenheit von
menschlichem Blut schnell hydrolysieren (siehe Tabelle 1 unten). Tabelle 1: HYDROLYSE VON DAUNORUBICIN-(DNR)
UND DOXORUBICIN-(DOX)DERIVATEN
VERBINDUNG | Menschliches
Blut | MCF-7/6
konditioniertes Medium | |
L-Leu-DNR | + | – | DNR-Hydrolyse |
D-Leu-DNR | – | – | DNR-Hydrolyse |
diEthyl-β-Ala-DNR | – | – | DNR-Hydrolyse |
L-NorLeu-DNR | – | – | |
L-Ala-L-Leu-DNR | + | + | L-Leu-DNR-Hydrolyse |
L-Ala-L-Ala-DNR | + | – | DNR-Hydrolyse |
L-Ala-L-Ileu-D | + | + | DNR-Hydrolyse |
L-Ala-L-NorLeu-DNR | – | – | DNR-Hydrolyse |
β-Ala-L-Leu-DNR | – | – | DNR-Hydrolyse |
L-Phe-L-Leu-DNR | + | (±) | DNR-Hydrolyse |
L-Ala-L-Ala-L-Leu-DNR | + | – | L-Leu-DNR-Hydrolyse |
L-NLeu-L-Ala-L-Leu-DNR | + | + | L-Leu-DNR-Hydrolyse |
L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | + | + | L-Leu-DNR-Hydrolyse |
L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | + | + | L-Leu-DNR-Hydrolyse |
L-Ala-L-Leu-Gly-L-Leu-DNR | + | (±) | DNR-Hydrolyse |
Gly-L-Leu-Gly-L-Leu-DNR | + | + | DNR-Hydrolyse |
Succ-L-Ala-L-Leu-DNR | – | – | L-Leu-DNR-Hydrolyse |
Succ-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | – | – | L-Leu-DNR-Hydrolyse |
Succ-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | (+) | – | L-Leu-DNR-Hydrolyse |
pGlu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DOX | + | – | L-Leu-DOX-Hydrolyse |
D-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | – | – | L-Leu-DNF-Hydrolyse |
D-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | + | (+) | L-Leu-DNF-Hydrolyse |
D-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | + | + | L-Leu-DNF-Hydrolyse |
D-Leu-D-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | (+) | (+) | L-Leu-DNF-Hydrolyse |
β-L-Ala-L-Leu-DNR | – | – | L-Leu-DNF-Hydrolyse |
L-NLeu-β-L-Ala-L-Leu-DNR | + | + | L-Leu-DNF-Hydrolyse |
β-Ala-L-Ala-L-Leu-DNR | – | – | L-Leu-DNF-Hydrolyse |
β-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR | – | + | L-Leu-D-Hydrolyse |
-
BEISPIEL 5
-
Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR im konditionierten
Medium von Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7/ADR
-
Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
bei 37°C
1 Stunde lang in mit gegenüber
Anthracyclinen widerstandsfähigen
MCF7 Zellen (mit der Linie MCF7/ADR) konditioniertem Medium inkubiert
wird, findet sich als Metabolit lediglich L-Leu-DNR (4).
-
Die
MCF7/6 Zellen, die gegenüber
Anthracyclinen empfindlich und widerstandsfähig sind, sondern beide die
Protease oder die Proteasen ab, welche die Verbindung nach der Erfindung
hydrolysieren kann/können.
-
BEISPIEL 6
-
Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR in konditioniertem
Medium von Heptakarzinomzellen HepG2
-
Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
bei 37°C
2 Stunden lang in mit Hepatokarzinomzellen HepG2 konditioniertem
Medium inkubiert wird, sind die Hauptmetaboliten, die sich finden,
L-Leu-DNR (27% der
gesamten Fluoreszenz) und L-Ala-L-Leu-DNR (8%). Der Prozentsatz
der Hydrolyse kann nicht zwischen den Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7 und
dem Hepatokarzinom HepG2 verglichen werden, da die Anzahl an Zellen,
ab denen die konditionierten Medien wiedererlangt wurden, sowie
die Konzentrationen der konditionierten Medien sind unterschiedlich.
Die qualitative Analyse deutet trotzdem darauf hin, dass die Peptidase(n)
nicht spezifisch für
die MCF7-Zellen ist/sind.
-
BEISPIEL
-
Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR in konditioniertem
Medium von Darmkarzinomzellen HT29
-
Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
bei 37°C
2 Stunden in konditioniertem Medium aus Darmkarzinomzellen HT29,
das 40 Mal konzentriert ist, konditioniert wird, sind die Hauptmetaboliten,
die sich finden, L-Leu-DNR (82% der gesamten Fluoreszenz) und L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR
und/oder DNR (3%), wie in 5 dargestellt.
-
BEISPIEL 8
-
Akkumulation auf tumoralen MCF7/6 Zellen
von DNR, L-Leu-DNR und β-Ala-L-Leu-1-Ala-L-Leu-DNR
-
Die
Zellen des menschlichen Brustdrüsenkarzinoms
MCF7/6 wurden in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
in einer Konzentration von 10 μg
eq. DNR/ml inkubiert. Nach unterschiedlichen Zeiten wurde die Akkumulation
der pro-Arzneimittel
und deren fluoreszenten Metaboliten mittels HPLC nach der Extrahierung
in Produkten mit basischem pH-Wert nach einer im Labor umgesetzten
Methode bestimmt. Die Akkumulationen, die in μg/mg von zellulären Proteinen
ausgedrückt
werden, wurden mit denjenigen von DNR und DOX sowie denjenigen von
L-Leu-DNR und L-Leu-DOX verglichen. Die Metaboliten wurden durch
Bestimmung der Verweilzeit von Referenzprodukten, die im Labor synthetisiert
wurden, identifiziert.
-
DNR
akkumuliert schnell in den MCF7/6 Zellen in im Wesentlichen unveränderter
Form, wobei die maximale Akkumulation (±15 μg/mg zellulärer Proteine) nach 6 Stunden
Inkubation erreicht wurde. Die Akkumulation von DNR nimmt anschließend bis
auf 24 Stunden ab. Der intrazelluläre Hauptmetabolit ist Daunorubicinol,
was in der Reduzierung der Ketonfunktion von DNR, an Position C13,
durch intrazelluläre
Reduktasen (6) resultiert.
-
L-Leu-DNR
akkumuliert ebenfalls sehr schnell durch die MCF7/6 Zellen, jedoch
in geringeren Raten, und die Akkumulation erreicht nach 24 Stunden
Inkubation ein Niveau, das sich bei ±14 μg/mg zellulärer Proteine befindet. DNR
bildet sich progressiv im Laufe der Zeit intrazellulär, um 14%
der gesamten intrazellulären Fluoreszenz
nach 24 Stunden Inkubation zu erreichen (7).
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR,
das während
24 Stunden in Anwesenheit von MCF7/6 Zellen inkubiert wurde, akkumuliert
in unveränderter
Form, und zwar viel weniger als DNR und L-Leu-DNR, wobei die Akkumulationsrate lediglich
bei ±1 μg/mg zellulärer Proteine
liegt (
8). Dies sind im Wesentlichen L-Leu-DNR, das extrazelluläre gebildet
wurde, und DNR, das nach 24 Stunden Inkubation in den Zellen zu
finden ist. DNR, das intrazellulär
gefunden wurde, stellt nach 24 Stunden Inkubation ungefähr 40% der
gesamten Fluoreszenz dar. Tabelle 2: Intrazelluläre Konzentrationen im Ausgangsprodukt
L-Leu-DNR und DNR nach 6 Stunden Inkubation der MCF7/6 Zellen entweder
mit DNR, L-Leu-DNR oder β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
Inkubation mit | Ausgangsprodukt | Gebildetes
Leu-DNR | Gebildetes
DNR |
(μg/mg zelluläre Proteine) |
DNR | 14,9 | - | - |
Leu-DNR | 13,4 | - | 1,5 |
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR | 0,3 | 4,5 | 0,9 |
-
Die
Ergebnisse in Tabelle 1 deuten darauf hin, dass der Durchgang der
Peptidderivate von DNR durch die zellulären Membrane abnimmt, wenn
die Länge
der Peptidkette zunimmt und dass β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR ein
Präkursor
von Leu-DNR ist, der extrazellulär
aktiviert wurde. Das freigesetzte Leu-DNR akkumuliert intrazellulär und wird
selbst ein intrazellulärer
Präkursor
von DNR.
-
BEISPIEL 9
-
Akkumulation auf normalen MRC5 Zellen
von DNR und L-Leu-DNR und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
-
Die
Fibroblastenzellen MRC5 wurden in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
in einer Konzentration von 10 μg
eq. DNR/ml inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeiten wurde die Akkumulation
der pro-Arzneimittel und deren fluoreszenten Metaboliten mittels
HPLC nach der Extrahierung der Produkte bei basischem pH-Wert nach
einer im Labor umgesetzten Methode bestimmt. Die Akkumulationen,
die in μg/mg
von zellulären
Proteinen ausgedrückt
werden, wurden mit denjenigen von DNR und L-Leu-DNR verglichen.
Die Metaboliten wurden durch Bestimmung der Verweilzeiten von Referenzprodukten,
die im Labor synthetisiert wurden, identifiziert.
-
DNR
akkumuliert hauptsächlich
in MRC5 Zellen in unveränderter
Form, und die Akkumulation erreicht nach 6 Stunden ein Niveau, das
sich bei ±76 μg/mg zellulärer Proteine
befindet, wobei der Hauptmetabolit Daunorubicinol ist (9).
-
L-Leu-DNR
akkumuliert ebenfalls sehr schnell durch die MCR5 Zellen, jedoch
in geringeren Raten, und die Akkumulation erreicht nach 24 Stunden
Inkubation ein Niveau, das sich bei ±40 μg/mg zellulärer Proteine befindet. Die
Hauptmetaboliten sind DNR sowie L-Leu-DNR-OL (10).
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR,
das während
24 Stunden in Anwesenheit von MRC5 Zellen inkubiert wurde, akkumuliert
viel weniger als DNR und L-Leu-DNR, wobei sich die Akkumulationsrate
lediglich bei ±3,3 μg/mg zellulärer Proteine
befindet. Im Wesentlichen findet sich L-Leu-DNR, das extrazellulär gebildet
wurde, in den Zellen. Seine Akkumulation nimmt linear bis zu 24
Stunden Inkubation zu.
-
Diese
Ergebnisse bestätigen
jene, die mit den MCF7/6 Zellen erhalten wurden, das heißt, dass
die Verbindung β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR praktisch
nicht in die Zellen eintritt (= 300 Mal weniger als DNR nach 6 Stunden)
und dass L-Leu-DNR, das extrazellulär gebildet wurde, im Wesentlichen
in den MRC5 Zellen akkumuliert (Tabelle 3). Tabelle 3: Intrazelluläre Konzentrationen im Ausgangsprodukt
L-Leu-DNR und DNR nach 6 Stunden Inkubation der MRC5 Zellen entweder
mit DNR, L-Leu-DNR oder β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
Inkubation mit | Ausgangsprodukt | Gebildetes
Leu-DNR | Gebildetes
DNR |
(μg/mg zelluläre Proteine) |
DNR | 77,4 | - | - |
Leu-DNR | 36,0 | - | 1,3 |
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR | 0,03 | 3,1 | 0,08 |
-
In
der Tumorlinie MCF7/6 sind die intrazellulären Raten, die nach 24 Stunden
Inkubation in Anwesenheit der Verbindung β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR erhalten
wurden, 12 Mal höher
als die Fibroblasten MRC5.
-
Wenn
die Zellen in Anwesenheit von Leu-DNR und DNR inkubiert werden,
beträgt
das Verhältnis
der intrazellulären
Raten von DNR jeweils lediglich 0,37 bzw. 0,19.
-
BEISPIEL 10
-
Zytotoxizität von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR gegenüber tumoralen
MCF7/6 und normalen MRC5 Zellen
-
Die
Zytotoxizität
des pro-Arzneimittels DNR, Leu-DNR und DNR wurde auf MCF7/6 und
MRC5 Zellen verglichen, die während
72 Stunden in Anwesenheit von unterschiedlichen Verbindungen im
Wachstum gehalten wurden.
-
Die
Zytotoxizitäten
von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR,
L-Leu-DNR und DNR
wurden auf MCF7/6 Zellen im Wachstum in 96-Well-Platten bestimmt, in Anwesenheit von
wachsenden Konzentrationen von unterschiedlichen Verbindungen inkubiert.
Nach 72 Stunden werden die Zellen während 48 Stunden in Abwesenheit
von Anthracyclin inkubiert und die Zytotoxizität wird durch Messen der zellulären Proteine
mittels der Bradford-Technik bestimmt. Es wird ein Bereich von 9
Konzentrationen verwendet, der von 700 μg/ml bis 0,0035 μg/ml reicht,
und jede Messung stellt ein standardmäßiges Mittel und eine standardmäßige Abweichung
von 6 Werten dar. Die experimentellen Punkte werden auf einer S-Kurve
angepasst, welche das Berechnen des Wendepunktes, der der Dosis
entspricht, bei der die Hälfte
der Zellen überleben,
ermöglicht
(IC50).
-
12 stellt
dar, dass IC50 von DNR bei 0,090 ± 0,004 μg/ml liegt.
Für die
Zellen, die während
72 Stunden in Anwesenheit von L-Leu-DNR inkubiert wurden, liegt
IC50 bei 1,30 ± 0,56 μg/ml. Im Falle von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR,
liegt IC50 bei 22,00 ± 7,31 μg/ml.
-
Leu-DNR
und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
sind also jeweils 14 Mal bzw. 244 Mal weniger zytotoxisch als DNR
für die
Zellen des menschlichen Brustdrüsenkarzinoms
MCF7/6, welche während
72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten
wurden.
-
Die
Zytotoxizitäten
von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR,
L-Leu-DNR und DNR
wurden auf MRC5 Zellen im Wachstum auf 96-Well-Platten bestimmt, die in Anwesenheit
von wachsenden Konzentrationen der unterschiedlichen Verbindungen
inkubiert wurden. Nach 72 Stunden werden die Zellen während 48
Stunden in Abwesenheit von Anthracyclin inkubiert und die Zytotoxizität wird durch
Messen der zellulären
Proteine mittels der Bradford-Technik bestimmt. Es wird ein Bereich
von 9 Konzentrationen verwendet, der von 700 μg/ml bis 0,0035 μg/ml reicht,
und jede Messung stellt ein standardmäßiges Mittel und eine standardmäßige Abweichung
von 6 Werten dar. Die experimentellen Punkte werden auf einer S-Kurve
angepasst, welche das Berechnen des Wendepunktes, der der Dosis
entspricht, bei der die Hälfte
der Zellen überleben,
ermöglicht
(IC50).
-
13 stellt
dar, dass IC50 von DNR bei 0,010 ± 0,006 μg/ml liegt.
Für die
Zellen, die während
72 Stunden in Anwesenheit von L-Leu-DNR inkubiert wurden, liegt
IC50 bei 1,78 ± 0,23 μg/ml. Im Falle von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR,
liegt IC50 bei 23,14 ± 4,81 μg/ml.
-
Leu-DNR
und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
sind also jeweils 172 Mal bzw. 2230 Mal weniger zytotoxisch als
DNR für
die MRC5 Fibroblastenzellen, welche während 72 Stunden in Anwesenheit
von Anthracyclinen im Wachstum gehalten wurden.
-
Der
Präkursor
von DNR ist sowohl für
die tumoralen Zellen als auch die Fibroblastenzellen viel weniger toxisch
als die Mutterverbindung. Es muss nur noch bestimmt werden, ob diese
Verringerung der Toxizität,
die in vitro beobachtet wurde, sich ebenfalls in vivo beobachten
lässt.
-
BEISPIEL 11
-
Akute Toxizität in vivo
-
Die
akute Toxizität
von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
wurde an Mäusen
mit derjenigen von Daunorubicin verglichen. In der Studie in vivo
der akuten Toxizität
eines Medikamentes nimmt die Bestimmung der Letaldosis 50 (Letaldosis
für 50%
der Tiere oder LD50) einen wichtigen Platz
ein. Trotz der Tatsache, dass sie keine biologische Konstante bildet,
deutet sie auf die akute Toxizität
des injizierten Produktes hin. LD50 ist
ein einfacher Test, bei dem ansteigende Mengen des zu testenden
Produktes intravenös
(i. v.) in einer einzigen Injektion und intraperitoneal (i. p.)
in 5 Injektionen bei einer Injektion pro Tag an 5 aufeinanderfolgenden
Tagen verabreicht wird. Die Mortalität der Tiere erfolgt in Abhängigkeit
der Zeit. Am Ende der Beobachtungsperiode, gewöhnlich 30 Tage, wird der Wert
von LD50 mittels linearer Regression des
Prozentsatzes der Mortalität
(auf einer Probitleiter) in Abhängigkeit
des Logarithmus der verabreichten Dosis erhalten (O. K. Chan and
A. W. Hayes, Principles and methods for akute toxicity and eye irritancy,
in Principles and methods of toxicology, zweite Auflage. Ed. von
A W. Hayes. Rauen Press. New-York, USA (1989), S. 169–220; D.
Deprez-De Campeneere and A. Trouet. DNA-Anthracycline Complexes.
I. Toxicity in mice and chemotherapeutic activity against L1210
Leukaemia of Daunorubicin-DNA and Adriamycin DNA, Eur. J. Cancer,
16 (1980), S. 981–986;
H. E. Skipper, L. H. Schmidt, A. Goldin and J. M. Venditti. A manual
an quantitative drug evaluation inexperimental tumor systems, Cancer
Chemother. Rep. 17 (1962), S. 1–178).
-
In
dem Fall, dass LD50 nicht erreicht wird,
deutet die Entwicklung der täglichen
Gewichte der Mäuse ebenfalls
auf die akute Toxizität
der verabreichten Produkte hin.
-
1. Material und Methoden
-
Die
akute Toxizität
dieser beiden Arzneimittel wurde i. v. und i. p. auf einer einzigen
Mäusestamm
studiert. Die weiblichen NMRI-Mäuse
(nicht aus Verwandtschaftszucht IOPS-Han, ungefähr 5 Wochen alt und mit einem
mittleren Gewicht von 14,6 Gramm, aus IFFA-CREDO Belgien stammend)
blieben während
einer Woche in Quarantäne.
Am Vortag des Injektionstages wurden sie in Gruppen von 5 (β-la-Leu-Ala-Leu-DNR)
und 7 (DNR) pro zu injizierender Dosis unterteilt; ihr Gewicht wurde
erneut aufgenommen (ungefähr
22 Gramm im Durchschnitt).
-
Die
Injektionen erfolgten systematisch am morgen (einzige Injektion
in die Kaudalvene für
die i. v. und Injektionen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen in das
Bauchfell für
die i. p.), indem 1,0-ml-Spritzen und sterile Nadeln 30G (i. v.)
und 27G (i. p.) verwendet wurden. Jegliche Handhabungen der Tiere
erfolgten mit Handschuhen und die Pflege der Tiere erfolgte systematisch
jede Woche.
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
wurde i. v. in Dosen von 30, 60 und 120 mg/kg und i. p. in Gesamtdosen
von 10, 15, 20, 25, 30, 45 und 60 mg/kg injiziert. β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
wurde erneut in zusätzliche
zwei Gruppen i. v. in Gesamtdosen von 30 und 60 mg/kg in jeweils
einer und zwei aufeinanderfolgenden Injektionen zu 30 mg/kg injiziert.
-
DNR
wurde i. v. in Dosen von 10, 15, 20, 25, 30 und 35 mg/kg und i.
p. in Dosen von 2,0; 2,5; 3,0 und 3,5 mg/kg injiziert.
-
Die
Lösungen
von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
und DNR erfolgten in physiologischem NaCl, sodass das injizierte
Volumen 0,1 ml für
10 Gramm Maus entspricht. Die Konzentrationen der Lösungen wurden
mittels Spektrofotometrie überprüft.
-
Vom
Tag der Injektionen (JO) an wurden die Mäuse mit einer täglichen
Aufnahme der toten Mäuse
klinisch verfolgt. Das Gewicht der Mäuse wurde fast jeden Tag gemessen.
Die Beobachtungsperiode wurde über einen
Monat hinaus verlängert,
damit die Zeichen verspäteter
Toxizität
besser aufgefunden werden konnten. Am Ende der Studie wurden die überlebenden
Mäuse nach
den Tierversuchnormen getötet
(D. B. McGregor. Ethics in experiments an animals, in Experiments
in toxicology, first edition. Ed. by D. Anderson and D. M. Conning.
The Royal Society of Chemistry and The Universities Press. Belfast,
Irland (1988), S. 512–522).
-
2. Ergebnisse
-
Intraperitoneale Toxizität
-
Wie
in 14 dargestellt, wird betreffend DNR eine starke
Toxizität
in Abhängigkeit
der Konzentration beobachtet, eine Toxizität, die sich durch die Mortalität der Mäuse ab dem
7. Tag bei einer Dosis von 3,5 mg/kg (1 von 7 Mäusen tot), ab dem 9. Tag bei
einer Dosis von 3,0 mg/kg (2 von 7 Mäusen tot) und ab dem 11. Tag bei
einer Dosis von 2,5 und 2,0 mg/kg (jeweils 2 bzw. 1 Maus von 7 tot)
bemerkbar macht.
-
Keine
Maus überlebte
den 12. Tag (Dosis von 3,5 mg/kg), den 19. Tag (Dosis von 3,0 mg/kg)
und den 29. Tag (Dosis von 2,0 mg/kg). Die einzige Maus, die den
43. Tag überlebte,
ist eine derjenigen, der die Dosis von 2,5 mg/kg injiziert wurde.
Diese Ergebnisse bestätigen
die vorhergehend beschriebenen (D. Deprez-De Campeneere and A. Trouet.
DNA-Anthracycline Complexes. I. Toxicity in mice and chemotherapeutic
activity against L1210 Leukaemia of Daunorubicin-DNA and Adriamycin-DNA, Eur. J. Cancer,
16 (1980), S. 981–986).
-
15 deutet
darauf hin, dass bei welcher verabreichten Dosis auch immer die
Mäuse einen
Gewichtsverlust aufweisen, der 30% des ursprünglichen Gewichts erreicht.
Dieser Gewichtsverlust ist im Allgemeinen unumkehrbar mit Ausnahme
einer Maus, die mit 2,5 mg/kg behandelt wurde, die ihr ursprüngliches
Gewicht am 30. Tag wiedererlangte.
-
Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
i. p. während
5 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht wurde, umfassten die Gesamtdosen
10 bis 45 mg/kg, wobei keine Mortalität beobachtet wurde. Bei der
Dosis von 60 mg/kg, starben 2 Mäuse
am 22. Tag und eine dritte am 35. Tag (16).
-
Bei
den Gesamtdosen zwischen 10 und 45 mg/kg wurde kein Gewichtsverlust
beobachtet sondern eher eine Gewichtszunahme von ±40% in
40 Tagen (17). Die Analyse der Gewichtskurven
zeigt keinen bedeutenden Unterschied. Dahingegen ist bei der Dosis
von 45 mg/kg das mittlere Gewicht der Mäuse während den ersten 7 Tagen stabil,
dann erreichte die Gewichtserhöhung
lediglich 20% im Laufe der aufeinanderfolgenden 30 Tage. Bei der
Gesamtdosis von 60 mg/kg verringert sich das mittlere Gewicht der
Mäuse um ±15% in
15 Tagen. Die zwei überlebenden
Mäuse erlangen
ihr ursprüngliches
Gewicht erneut erst am 36. Tag (17).
-
Diese
Daten weisen darauf hin, dass die Dosis von 60 mg/kg von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
nahe bei LD50 liegt und dass daher β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
mindestens 30 Mal weniger toxisch ist als DNR, was die akute Toxizität nach der
i. p. Verabreichung an 5 aufeinanderfolgenden Tagen betrifft.
-
Intravenöse Toxizität
-
Wie
in 18 dargestellt, wird betreffend DNR, das i. v.
in einer einzigen Verabreichung an weibliche NMRI-Mäuse verabreicht
wird, keine Mortalität
bei schwachen Dosen (10, 15 und 20 mg/kg) beobachtet. Bei 25 mg/kg
sterben 6 Mäuse
jeweils an den Tagen 12, 17, 20, 28, 34 und 42. Bei höheren Konzentrationen
von DNR beginnt die Mortalität
am 7. Tag (1 von 7 Mäusen
bei der Dosis von 30 mg/kg) und am 6. Tag (2 von 7 Mäusen bei
der Dosis von 35 mg/kg). Diese Ergebnisse entsprechen den vorhergehen
beschriebenen (D. Deprez-De Campeneere and A. Trouet. DNA-Anthracycline
Complexes. I. Toxicity in mice and chemotherapeutic activity against
L1210 Leukaemia of Daunorubicin-DNA and Adriamycin-DNA, Eur. J.
Cancer, 16 (1980), S. 981–986).
-
Die
Ergebnisse aus 19 deuten darauf hin, dass der
mittlere Gewichtsverlust am 7. Tag am höchsten ist und stärker wird,
je höher
die verabreichte Dosis. Die Mäuse,
die die Dosen von 30 und 35 mg/kg überleben, erlangen ihr ursprüngliches
Gewicht 30 Tage nach der i. v. Injektion von DNR nicht zurück.
-
Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
i. v. bei der Dosis von 30 mg/kg verabreicht wird, wird keine Mortalität beobachtet
und das mittlere Gewicht der Mäuse
nimmt um ±40%
in 40 Tagen (20) zu. Das mittlere Gewicht
der Mäuse
am Ende des Experimentes ist ähnlich
demjenigen, das bei derselben Dosis von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR beobachtet
wurde, das i. p. verabreicht wurde. Dahingegen sterben bei der Dosis
von 60 g/kg 2 Mäuse
innerhalb von 5 Minuten nach der Injektion. Diese Mortalität könnte auf
eine Hypervolämie nach
einer viel zu schnellen Injektion des Produktes zurückgeführt werden.
Die 3 Mäuse,
die nach einer leichten Abmagerung bis zum 2. Tag überleben,
erlangen ihr ursprüngliches
Gewicht wieder, dann erhöhen
sie das Gewicht (±30%
in 40 Tagen). Bei der Dosis von 120 mg/kg sterben die 5 Mäuse innerhalb
von 7 Minuten nach der Injektion mit klinischen Anzeichen von Toxizität.
-
Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
i. v. bei der Gesamtdosis von 60 mg/kg verabreicht wird, i. v. in
zwei Injektionen von jeweils 30 mg/kg über zwei aufeinanderfolgende
Tage fraktioniert wird, wird keine Mortalität beobachtet. Es gibt keine
Unterschiede in der Entwicklung des mittleren Gewichtes der Mäuse, die
1 Mal 30 mg/kg erhielten und denjenigen, die 2 Mal 30 mg/kg β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
erhielten (21).
-
3. Schlussfolgerungen
-
Die
erhaltenen Ergebnisse ermöglichen
das Schlussfolgern, dass betreffend Letalität sowohl intravenös als auch
intraperitoneal β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
eine viel geringere akute Toxizität aufweist als DNR. Diese Ergebnisse
bestätigen
die Reduzierung der Toxizität
des β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR-Derivats.
-
Diese
mit den oben beschriebenen identischen Experimente wurden mit den
Doxorubicin-Derivaten durchgeführt.
-
BEISPIEL 12
-
Die Akkumulation auf tumoralen Zellen
MCF7/6 und den nicht tumoralen Zellen MRC5 von DOX, L-Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
-
Die
Zellen des menschlichen Brustdrüsenkarzinoms
MCF7/6 und die menschliche Fibroblastenlinie MRC5 wurden in Anwesenheit
von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
in einer Konzentration von 10 μg
eq. DOX/ml inkubiert. Nach verschiedenen Zeiten wurde die Akkumulation
von pro-Arzneimitteln mittels HPLC nach der Extrahierung in Produkten
mit basischem pH-Wert nach einer im Labor umgesetzten Methode bestimmt.
Die Akkumulationen, die in μg/mg
von zellulären
Proteinen ausgedrückt
werden, wurden mit denjenigen von DOX und L-Leu-DOX verglichen.
Die Metaboliten wurden durch Bestimmung der Verweilzeit von Referenzprodukten,
die im Labor synthetisiert wurden, identifiziert.
-
DOX
akkumuliert hauptsächlich
in MCF7/6 Zellen in im Wesentlichen unveränderter Form und nach 6 Stunden
wird eine intrazelluläre
Rate von 6,9 μg/mg
zellulärer
Proteine erreicht (
23).
| Akkumulation
nach 6 h (μg/mg
zelluläre
Prot.) | IC50 (μg/ml) |
βA-L-A-L-DOX | Leu-DOX | DOX | (72
h) |
MCF7/6
DOX | - | - | 6,90 | 0,0025 |
Leu-DOX | - | 1,10 | 0,25 | 0,02 |
βA-L-A-L-DOX | 0,10 | 0,65 | 0,22 | 3,0 |
MRC5
DOX | - | - | 11,20 | 0,018 |
Leu-DOX | - | 1,40 | 0,30 | 0,3 |
βA-L-A-L-DOX | 0,10 | 0,10 | 0,01 | 120 |
-
Leu-DOX
und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
akkumulieren 6 Mal bzw. 69 Mal weniger als DOX nach 6 Stunden. Intrazellulär sind die
Raten von DOX 31 Mal weniger erhöht
nach der Inkubation der Zellen in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
(24 und 25).
-
In
den Fibroblastenzellen MRC5, die während 6 Stunden in Anwesenheit
von Anthracyclin in der Konzentration von 10 μg eq. DOX/ml inkubiert wurden,
akkumuliert DOX im Wesentlichen in unveränderter Form und die Akkumulation
erreicht eine Rate von ±11,2 μg/mg von
zellulären
Proteinen nach 6 Stunden (26).
-
L-Leu-DOX
akkumuliert geringere Raten, wobei die Akkumulation 1,4 μg/mg zellulärer Proteine
erreicht. Der Hauptmetabolit ist DOX (0,3 μg/mg zellulärer Proteine) (27).
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
akkumuliert 112 Mal weniger als DOX nach 6 Stunden. Intrazellulär sind die Raten
von DOX 1100 Mal weniger hoch nach der Inkubation der Zellen in
Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
(28).
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
praktisch nicht in die Zellen eintritt und dass es vorher in externem
Medium in Form von Leu-DOX hydrolysiert werden muss, bevor es in
die Zellen eintritt, in denen intrazellulär Leu-DOX danach DOX erzeugen kann (22).
-
Diese
Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass die intrazellulären Raten
des aktiven therapeutischen Wirkstoffs zwei Mal höher in normalen
Zellen ist als in den tumoralen Zellen im Falle von DOX. Dahingegen
sind im Falle von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX die intrazellulären Raten
von DOX 22 Mal höher
in den tumoralen Zellen MCF7 im Vergleich zu den nicht tumoralen
Zellen MRC5.
-
BEISPIEL 13
-
Zytotoxizität in vitro gegenüber den
tumoralen Zellen MCF7/6 und den nicht tumoralen Zellen MRC5
-
Die
Zytotoxizitäten
von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX,
L-Leu- DOX und DOX
wurden auf MCF7/6 und MRCS Zellen im Wachstum auf 96-Well-Platten
bestimmt, in Anwesenheit von wachsenden Konzentrationen der unterschiedlichen
Verbindungen inkubiert. Nach 72 Stunden werden die Zellen während 48
Stunden in Abwesenheit von Anthracyclin inkubiert und die Zytotoxizität wird durch
Messen der zellulären
Proteine mittels der Bradford-Technik bestimmt. Es wird ein Bereich
von 9 Konzentrationen verwendet, der von 700 μg/ml bis 0,0035 μg/ml reicht,
und jede Messung stellt ein standardmäßiges Mittel und eine standardmäßige Abweichung
von 6 Werten dar. Die experimentellen Punkte werden auf einer S-Kurve
angepasst, welche das Berechnen des Wendepunktes, der der Dosis
entspricht, bei der die Hälfte
der Zellen überleben,
ermöglicht
(IC50).
-
Die
Tabelle von Beispiel 12 nimmt IC50 auf,
welche jeweils 0,0025, 0,020 bzw. 3,0 μg/ml für DOX, L-Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
für die
menschlichen Brustdrüsenkarzinomzellen
MCF7/6 betragen. Für
die Zellen der menschlichen Fibroblastenlinie MRC5 betragen die
Werte jeweils 0,018, 0,30 bzw. 120 μg/ml.
-
Diese
Ergebnisse deuten darauf hin, dass Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX jeweils 8 Mal bzw. 1000
Mal weniger toxisch sind als DOX für die menschlichen Brustdrüsenkarzinomfibroblastenzellen
MCF7/6, die während
72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten
werden. Was die Zellen MRC5 betrifft, sind Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX jeweils 17
Mal bzw. 6700 Mal weniger toxisch als DOX für die Zellen, die während 72
Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten werden.
-
β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
ist 40 Mal toxischer für
die tumoralen Zellen MCF7 als für
die nicht tumoralen Zellen MRC5. Dies muss ins Verhältnis mit
den intrazellulären
Raten gesetzt werden, die größer als
DOX sind, die in den Zellen MCF7 beobachtet wurden, welche in Anwesenheit
von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX inkubiert
wurden (29 und 30).
-
Die
Verbindung ist im Allgemeinen durch eine größere Aktivität auf den
festen Tumormodellen gekennzeichnet (zum Beispiel durch subkutane
Injektion der tumoralen Zellen) als auf den Modellen des Typs „Leukämie", welche nach der
intravenösen
Injektion der tumoralen Zellen erhalten wurden.
-
Die
tumoralen Zellen, die subkutan injiziert wurden, bilden einen festen
Tumor an der Stelle der Injektion und die örtliche Konzentration der von
den Zellen abgesonderten Hydrolasen bleibt hoch. Wenn die tumoralen
Zellen intravenös
injiziert werden, lösen
sich die Hydrolasen, welche sie absondern, umgehen im Blutfluss
auf.
-
BEISPIEL 14
-
Akute Toxizität in vivo
-
Des
Weiteren reduziert die Verabreichung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX an athyme Mäuse, in
die ein menschlicher Brustdrüsentumor
MCF7/6 implantiert wurde, die Entwicklung des Krebstumors (31),
ohne dass dabei das mittlere Gewicht der behandelten Mäuse stark
beeinträchtigt
wird (32).
-
Diese
Experimente wurden nach den in Beispiel 11 beschriebenen Protokollen
durchgeführt.
-
Die
Erfinder haben ebenfalls die Protease(n), die im extrazellulären Medium
der menschlichen Brustdrüsenkarzinomzellen
abgesondert wird/werden, gekennzeichnet, die β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX hydrolysieren kann/können. Es
wurde bestätigt,
dass diese Protease(n) keiner bisher beschriebenen Protease entspricht/entsprechen.
-
Tatsächlich ist
das Enzym, das vorübergehend
als „COUM" bezeichnet wird,
eine Metalloprotease, die durch die Chelatbildner von Metallen,
wie etwa EDTA, hemmbar ist und für
ihre Aktivität
Kobaltion erfordert. Ihr optimaler pH-Wert liegt zwischen 7,5 und
8,0, wobei ausgeschlossen wird, dass es sich um ein Cathepsin handelt.
-
Mittels
Hochleistungschromatografie und Elektrophorese in Anwesenheit von
Laurylsulfat werden mehrere Bande höherer Molekulargewichte als
70 kD beobachtet.