DE69535665T2 - Konjugate enthaltend ein antitumorales mittel und deren verwendung - Google Patents

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Description

  • AUFGABE DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die pharmazeutische Zusammensetzung, welche diese umfasst, und die Verwendung dieser zur Herstellung von Medikamenten, die zur Behandlung von Krebstumoren bestimmt ist.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK.
  • In den letzten Jahren sind viele Tumorwirkstoffe, wie etwa Anthracycline und Vinca-Alkaloide, entwickelt worden und sind besonders wirksam bei der Behandlung von Krebs. Dennoch sind diese Moleküle in vivo oftmals durch eine hohe Toxizität gekennzeichnet, insbesondere eine medulläre und Schleimhaut-Toxizität sowie eine chronische Herztoxizität bei den Anthraxyclinen und eine neurologische Toxizität bei den Vinca-Alkaloiden.
  • Es wurde ebenfalls versucht, spezifischere Antitumorwirkstoffe zu entwickeln, sodass sie wirksamer gegen die Tumorzellen sind und infolgedessen die Nebenwirkungen dieser Produkte (Toxizität, Zerstörung der nicht tumorartigen Zellen...) senken.
  • US-Patentschrift Nr. 4,296,105 beschreibt Doxorubicinderivate, die an eine gegebenenfalls substituierte Aminosäure gebunden sind, die in vitro eine höhere Antitumoraktivität und eine geringere Toxizität als Doxorubicin aufweisen.
  • Dennoch sind diese Moleküle, da diese Derivate eine aktive intrazelluläre Stelle aufweisen, noch dazu imstande in die Tumorzellen und in die normalen Zellen einzudringen.
  • In den letzten Jahren sind ebenfalls neue therapeutische Wirkstoffe in Form von pro-Arzneimitteln vorgeschlagen worden.
  • Die pro-Arzneimittel sind Moleküle, die dazu imstande sind, sich durch gewisse chemische oder enzymatische Modifikationen ihrer Struktur in Arzneimittel (therapeutische Wirkstoffe) umzuwandeln.
  • Dennoch sind diese pro-Arzneimittel ebenfalls durch eine geringe Stabilität im Blut und Serum, die Enzyme umfassen, welche diese Moleküle inaktivieren, gekennzeichnet.
  • Die Dokumente Chemical Abstract 97:150635, Journal of Medicinal Chemistry, BD. 23, S. 1171–1174 (1980); Drugs Exp. Clin., Bd. 9, S. 303–311 (1983); Journal of Medical Chemistry, Bd. 23, S. 1166–1170 (1980) und die Anmeldung BE-882.541 beschreiben pro-Arzneimittel, umfassend einen Vektor, der durch einen Peptidarm an das Arzneimittel gebunden ist. Vorzugsweise besteht der Arm aus vier Aminosäuren und ist durch seine freie Carboxylfunktion an die freie Aminfunktion der Anthracyclinderivate, wie etwa Daunorubicin, gebunden.
  • Des Weiteren ist der Arm dieses pro-Arzneimittels durch seine freie Aminfunktion an einen Vektor gebunden, der aus einem Makromolekül (Protein wie etwa BSA, Immunoglobuline...) besteht, was die selektive Endocytose des pro-Arzneimittels durch Zielzellen ermöglicht.
  • Es ist ebenfalls bekannt, dass Methotrexat zur Behandlung von allgemeinen Entzündungsreaktionen wie etwa Rheumatismen verwendet werden kann, jedoch schränkt seine erhöhte Toxizität seine Anwendungen ein.
  • ZIELE DER ERFINDUNG.
  • Die vorliegende Erfindung versucht, neue Verbindungen bereitzustellen, umfassend einen antitumoralen therapeutischen Wirkstoff, insbesondere pro-Arzneimittel, die einen antitumoralen therapeutischen Wirkstoff umfassen, die gegenüber Produkten des Stands der Technik verbesserte therapeutische Eigenschaften aufweisen, insbesondere verbesserte therapeutische Eigenschaften bei der Behandlung von Krebstumoren.
  • Ein bestimmtes Ziel der vorliegenden Erfindung versucht, pro-Arzneimittel zu erhalten, die eine erhöhte aktive Spezifizität, eine reduzierte Toxizität und eine verbesserte Stabilität in Serum und Blut aufweisen.
  • CHARAKTERISTISCHE ELEMENTE DER ERFINDUNG.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbindungen (W-Z-M) wie in Anspruch 1 definiert. Diese Verbindungen umfassen ein Element, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus antitumoralen therapeutischen Wirkstoffen, die eine aktive intrazelluläre Stelle (S. A.) besitzen, die an einen Liganden (W-Z) gebunden ist, der einen Arm (Z) umfasst, der an eine Endgruppe (W) gebunden ist, wobei die Bindung zwischen dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) und dem Element (M) die Zelldurchdringung der Verbindung (W-Z-M) verhindert; wobei diese Bindung selektiv durch Faktoren, die von den Zielzellen abgesondert werden, derart spaltbar ist, dass die Durchdringung des therapeutischen Wirkstoffs (M) in die Zielzellen ermöglicht wird, und wobei die Endgruppe (W) die Stabilität der Verbindung (W-Z-M) im Serum und Blutkreislauf gewährleisten, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung zwischen der Endgruppe (W) und dem Arm (Z) sowie die Bindung zwischen dem Arm (Z) und dem Element (M) kovalente Bindungen sind, die die Eigenschaften der Verbindung (W-Z-M) nicht beeinträchtigen, dadurch, dass der Arm (Z) des Liganden (W-Z) ein Peptid ist, das aus mindestens zwei gegebenenfalls substituierten besteht, dadurch, dass die Gruppe (W) das β-Alanin der Formel H2N-CH2-CH2-CO2H ist, und dadurch, dass die Bindung zwischen dem Element (M) und dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) eine peptidische Bindung ist.
  • Mit Faktoren, die von den Zielzellen abgesondert sind, insbesondere von Tumorzellen, sind Enzyme wie etwa Proteasen oder Peptidasen gemeint, die auf spezifische Weise in extrazellulärem Medium von diesen Zellen abgesondert werden.
  • Diese Enzyme sind daher imstande, selektiv die Bindung zwischen dem Element (M) und dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) derart zu spalten, dass die Durchdringung des therapeutischen Wirkstoffs, vorzugsweise in diese Zellen, ermöglicht wird und auf diese Weise ihre Zerstörung gewährleistet und/oder ihre Proliferation blockiert wird.
  • Mit Endgruppe (W), die die Stabilität der Verbindung nach der Erfindung in Serum und Blutkreislauf gewährleistet, ist β-Alanin gemeint, das die Spaltung der Verbindung nach der Erfindung in Serum und Blutkreislauf reduziert oder hemmt, insbesondere die Hydrolyse der Verbindung nach der Erfindung durch Proteinasen und Peptidasen, die in Serum und/oder Blutkreislauf vorhanden sind, hemmt, insbesondere die Peptidasen und Proteinasen, die mit roten Blutkörperchen in Verbindung stehen.
  • Insbesondere eine Endgruppe (W), die die Stabilität der Verbindung nach der Erfindung gewährleistet, wenn weniger als 20%, vorzugsweise weniger als 2% der Verbindung während ihrer Konservierung in menschlichem Blut von 37°C während mehr als 2 Stunden durch die Enzyme gespalten werden.
  • Nach der Erfindung ist die Gruppe (W) β-Alanin der Formel: NH2-CH2-CH2-COOH, das durch seine Carboxylfunktion an den Arm (Z) gebunden ist.
  • Nach der Erfindung besteht die Bindung zwischen dem Element (M) und dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) in einer Peptidbindung, und der Arm (Z) ist ein Peptid, das aus mindestens zwei gegebenenfalls substituierten Aminosäuren besteht.
  • Der Arm (Z) des Liganden (W-Z) besteht vorzugsweise aus der Aufeinanderfolge der folgenden Aminosäuren: L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl, L-Leucyl-L-Alanyl oder L-Alanyl-L Leucyl-L-Phenylalanyl oder L-Alanyl-L-Leucyl, die durch ihre Carboxylfunktion an das Element (M) gebunden sind.
  • Nach der Erfindung ist der therapeutische Wirkstoff (M) ein therapeutischer Wirkstoff, der in der Krebschemotherapie verwendet wird, der vorzugsweise ausgewählt ist aus den therapeutischen Wirkstoffen, die von Bruce A. Chabner und Jerry M. Collins (Cancer Chemotherapy, Lippincott Ed., ISBN 0-397-50900-6(1990)) beschrieben wurden und dazu imstande sind, sich am Liganden (W-Z) durch eine Peptidbindung an die Gruppe (Z) des Liganden (W-Z) zu befestigen.
  • Insbesondere ist der therapeutische Wirkstoff ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Anthracyclinen, Folsäurederivaten, Vinca-Alkaloiden, Mitoxanthron, Calicheamycin, Arabinosylcytosinen (ARA-C), Arabinosyladenosinen (ARA-A), Fludarabinphosphat, Melphalan, Bleomycin, Mitomycin, L-Canavanin, Taxoiden, Camptothecin und dessen Derivaten, insbesondere TOPOTECAN® (9-Dimethylaminomethyl-10-hydroxy camptothecinhydrochlorid), das gegebenenfalls an eine substituierte oder nicht substituierte Aminosäure gebunden ist. Die Substitution auf der Aminosäure kann jede beliebige Substitution sein, die die Eigenschaften der Verbindung (W-Z-M) nach der Erfindung nicht beeinträchtigt.
  • Mit Derivaten dieser Moleküle sind die Moleküle gemeint, die durch eine chemische Gruppe modifiziert werden, was ihre Befestigung am Arm (Z) des Liganden (W-Z) mittels einer kovalenten Bindung ermöglicht, die die therapeutische Aktivität des ursprünglichen Moleküls nicht beeinträchtigt.
  • Vorzugsweise wird bei der Verbindung nach der Erfindung der therapeutische Wirkstoff (M) ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Anthracyclinen, insbesondere Doxorubicin (DOX) und Daunorubicin (DNR), die gegebenenfalls an eine substituierte oder nicht substituierte Aminosäure gebunden sind.
  • Vorteilhafterweise entspricht der therapeutische Wirkstoff der allgemeinen Formel:
    Figure 00060001
    wobei:
    • – R1 ein Wasserstoffatom oder eine OH-Gruppe ist,
    • – R2 ein Wasserstoffatom oder ein Rest der Formel
      Figure 00070001
      ist, wobei:
    • – R3 ein Wasserstoffatom oder ein gegebenenfalls substituierter Alkylrest ist,
    • – R4 für ein Wasserstoffatom steht oder mit R3 einen Alkylrest bildet, der 3 oder 4 Kohlenstoffatome umfasst.
  • Vorzugsweise ist R2 ein Rest der Formel
    Figure 00070002
    oder eines ihrer Isomere.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung β-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl-Daunorubicin (nachfolgend durchwegs als β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR bezeichnet), β-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl- Doxorubicin (nachfolgend durchwegs als β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX), β-Alanyl-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Phenylalanyl-Daunorubicin (nachfolgend durchwegs als Z-Ala-Ala-Leu-Phe-DNR) oder β-Alanyl-L-Alanyl-L-Leucyl-L-phenylalanyl-doxorubicin (nachfolgend durchwegs als β-Ala-Ala-Leu-Phe-DOX).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung nach der Erfindung und gegebenenfalls ein Adjuvans oder einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  • Diese Zusammensetzungen können zum Beispiel parenteral oder intravenös verabreicht werden. Die Zusammensetzungen nach der Erfindung zur parenteralen Verabreichung können insbesondere sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen sein. Als Lösemittel oder pharmazeutisch akzeptablen Träger können Propylenglycol, Polyethylenglycol, injizierbare organische Ester, zum Beispiel Ethyloleat, oder Cyclodextrine eingesetzt werden. Diese Zusammensetzungen können ebenfalls Feuchthaltemittel, Emulgatoren und/oder Dispergierungsmittel umfassen.
  • Die Sterilisierung kann auf verschiedene Weisen erfolgen, zum Beispiel mithilfe eines bakteriologischen Filters, indem Sterilisiermittel in die Zusammensetzung inkorporiert werden, oder durch Bestrahlung. Sie können ebenfalls in Form von sterilen festen Zusammensetzungen hergestellt werden, die im Einsatz in sterilem Wasser oder einem beliebigen anderen injizierbaren sterilen Medium aufgelöst werden können.
  • Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls Adjuvantien umfassen, die dem Fachmann wohlbekannt sind (Vitamin C, Antioxidantien, ...), die zusammen mit der Zusammensetzung nach der Erfindung zur Verbesserung und Verlängerung der Behandlung von Krebstumoren verwendet werden können.
  • Die minimalen Verabreichungsdosen der Verbindungen nach der Erfindung an einen Patienten sind die üblichen Dosen der oben erwähnten antitumoralen therapeutischen Wirkstoffe, wie diejenigen, die von Bruce A. Chabner und Jerry M. Collins (Cancer Chemotherapy, Lippincott Ed., ISBN 0-397 50900-6(1990)) beschrieben wurden, oder höhere Verabreichungsdosen.
  • Die verabreichten Dosen variieren daher in Abhängigkeit des für die Herstellung der Verbindung nach der Erfindung verwendeten therapeutischen Wirkstoffs.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach der Erfindung zur Herstellung eines Medikamentes, das zur Behandlung von Krebstumoren bestimmt ist, bestehend aus der, insbesondere parenteralen oder intravenösen Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach der Erfindung an einen Patienten.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN.
  • 1 stellt den Wirkungsmechanismus der Verbindung nach der Erfindung auf seiner Wirkungsstelle (S. A.) in einer Zielzelle (C. C.) dar.
  • 2 stellt den Wirkungsmechanismus der Verbindung nach der Erfindung in einer normalen Zelle (C. N.) dar.
  • 3 stellt die Hydrolyse von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin in einem konditionierten Medium von menschlichen Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7/6 (Chromatogramm des Anfangszeitpunkts (a) und nach zwei Stunden Inkubation (b)) dar.
  • 4 stellt die Hydrolyse von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin in einem konditionierten Medium von menschlichen Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7/ADR (Chromatogramm des Anfangszeitpunkts (a) und nach einer Stunde Inkubation (b)) dar.
  • 5 stellt die Hydrolyse von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin in einem konditionierten Medium von Darmkarzinomzellen HT29 (Chromatogramm des Anfangszeitpunkts (a) und nach zwei Stunden Inkubation (b)) dar.
  • 6 stellt die Akkumulation von Daunorubicin (DNR) in der Konzentration von 10 μg/ml durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
  • 7 stellt die Akkumulation von N-L-Leucyl-Daunorubicin (Leu-DNR) in der Konzentration von 10 μg eq. DNR/ml durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
  • 8 stellt die Akkumulation von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin in der Konzentration von 10 μg eq. DNR/ml durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
  • 9 stellt die Akkumulation von Daunorubicin (DNR) in der Konzentration von 10 μg/ml durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
  • 10 stellt die Akkumulation von N-L-Leucyl Daunorubicin (Leu-DNR) in der Konzentration von 10 μg eq. DNR/ml durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
  • 11 stellt die Akkumulation von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin in der Konzentration von 10 μg eq. DNR/ml durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
  • 12 stellt die Zytotoxizität von Daunorubicin (DNR), L-Leu-Daunorubicin und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin gegenüber MCF7/6 Zellen dar, die 72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten wurden.
  • 13 stellt die Zytotoxizität von Daunorubicin (DNR), L-Leu-Daunorubicin und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin gegenüber MCR5 Fibroblastenzellen dar, die 72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten wurden.
  • 14 stellt die Sterblichkeitsrate von weiblichen NMRI-Mäusen nach der intraperitonealen Verabreichung an 5 aufeinanderfolgenden Tage von Daunorubicin (DNR) in Gesamtdosen zwischen 2,0 und 3,5 mg/kg.
  • 15 stellt die Entwicklung des mittleren Gewichtes der weiblichen NMRI-Mäuse dar, nachdem sie intraperitoneal an 5 aufeinanderfolgenden Tagen Gesamtdosen von Daunorubicin zwischen 2,0 und 3,5 mg/kg erhalten haben. Die Gewichte sind in Prozenten des anfänglichen mittleren Gewichtes für jeweils jede Gruppe angegeben.
  • 16 stellt die Sterblichkeitsrate von weiblichen NMRI-Mäusen nach der Verabreichung an 5 aufeinanderfolgenden Tagen von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin in Gesamtdosen zwischen 10 und 60 mg/kg dar.
  • 17 stellt die Entwicklung des mittleren Gewichtes von weiblichen NMRI-Mäusen dar, nachdem sie intraperitoneal an 5 aufeinanderfolgenden Tagen Gesamtdosen von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin zwischen 10 und 60 mg/kg erhalten haben. Die Gewichte sind in Prozenten des anfänglichen mittleren Gewichtes für jeweils jede Gruppe angegeben.
  • 18 stellt die Sterblichkeitsrate von weiblichen NMRI-Mäusen nach der einzelnen intravenösen Verabreichung Daunorubicin (DNR) in Dosen zwischen 10 und 35 mg/kg dar.
  • 19 stellt die Entwicklung des mittleren Gewichtes von weiblichen NMRI-Mäusen dar, nachdem sie intravenös Dosen von Daunorubicin (DNR) zwischen 10 und 35 mg/kg erhalten haben. Die Gewichte sind in Prozenten des anfänglichen mittleren Gewichtes für jeweils jede Gruppe angegeben.
  • 20 stellt die Entwicklung des mittleren Gewichtes von weiblichen NMRI-Mäusen dar, nachdem sie intravenös Dosen von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin zwischen 30 und 60 mg/kg erhalten haben. Die Gewichte sind in Prozenten des anfänglichen mittleren Gewichtes für jeweils jede Gruppe angegeben.
  • 21 stellt die Entwicklung des mittleren Gewichtes von weiblichen NMRI-Mäusen dar, nachdem sie intravenös entweder eine Dosis von 30 mg/kg β-Ala-Leu-Ala-Leu-Daunorubicin oder zwei Dosen von 30 mg/kg jeweils an zwei aufeinanderfolgenden Tagen erhalten haben. Die Gewichte sind in Prozenten des anfänglichen mittleren Gewichtes für jeweils jede Gruppe angegeben.
  • 22 stellt die Kinetik der enzymatischen Hydrolyse von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin in L-Ala-L-Leu-Doxorubicin und L-Leu-Doxorubicin in einem durch MCF7/6 Zellen konditionierten Medium dar.
  • 23 stellt die Akkumulation von Doxorubicin (DOX) in der Konzentration von 10 μg/ml durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
  • 24 stellt die Akkumulation von L-Leu-Doxorubicin in der Konzentration von 10 μg/ml durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
  • 25 stellt die Akkumulation von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin in der Konzentration von 10 μg/ml durch konfluente MCF7/6 Zellen dar.
  • 26 stellt die Akkumulation von Doxorubicin (DOX) in der Konzentration von 10 μg/ml durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
  • 27 stellt die Akkumulation von L-Leu-Doxorubicin in der Konzentration von 10 μg/ml durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
  • 28 stellt die Akkumulation von β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin in der Konzentration von 10 μg/ml durch konfluente MRC5 Fibroblastenzellen dar.
  • 29 stellt die Zytotoxizität von Doxorubicin (DOX), L-Leu-Doxorubicin und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin gegenüber MCR5 Fibroblastenzellen dar, die 72 Stunden in Anwesenheit der Anthracyclinderivate im Wachstum gehalten wurden.
  • 30 stellt die Zytotoxizität von Doxorubicin (DOX), L-Leu-Doxorubicin und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin gegenüber MCR5 Fibroblastenzellen dar, die 72 Stunden in Anwesenheit der Anthracyclinderivate im Wachstum gehalten wurden.
  • 31 stellt die Variation der mittleren Tumormasse eines menschlichen Brustdrüsentumors MCF7/6 dar, der in athyme Mäuse am Tag T-21 in Abhängigkeit der Verabreichung von Doxorubicin (DOX) und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin (super DOX) implantiert wurde.
  • 32 stellt die Variation des mittleren Gewichtes von Mäusen (Gramm), die durch die Verabreichung von Doxorubicin (DOX) und β-Ala-Leu-Ala-Leu-Doxorubicin (super DOX) behandelt wurden.
  • BESCHREIBUNG EINER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der unerwarteten Entdeckung, dass es möglich ist, einen antitumoralen therapeutischen Wirkstoff (M) durch die Bindung mit einem Liganden (W-Z) zu inaktivieren, der das intrazelluläre Eindringen des therapeutischen Wirkstoffs (M) in normale Zellen (C. N.) und Zielzellen (C. C.) verhindert.
  • Nach der Erfindung sind diese Zielzellen Tumorzellen.
  • Auf unerwartete Weise setzen die Zielzellen (C. C.) im extrazellulären Medium von Enzymen, wie etwa Proteasen oder Peptidasen, die dazu imstande sind, selektiv eine kovalente Bindung zwischen dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) und dem therapeutischen Wirkstoff (M) zu hydrolysieren, um das Eindringen des therapeutischen Wirkstoffs (M) in die Zielzellen (C. C.) zu ermöglichen. In der Zielzelle wirkt der therapeutische Wirkstoff (M) entweder direkt auf seine spezifische intrazelluläre Wirkungsstelle (S. A.) oder nach einer Modifizierung unter Einwirkung von intrazellulären Proteasen wird ein anderer therapeutischer Wirkstoff (M*) modifiziert und tötet die Zielzelle (C. C) oder blockiert deren Proliferation (1).
  • Da die normalen Zellen diese Enzyme in vitro nicht oder nur kaum freisetzen, wird die Verbindung nach der Erfindung inaktiv gehalten und dringt nicht in die normalen Zellen ein (2).
  • Die Verbindung, die in der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben wird, reagiert auf diesen Wirkungsmechanismus, da er die nötigen Kriterien zur wirksamen Verabreichung erfüllt.
    • 1. Der antitumorale therapeutische Wirkstoff (M): – besitzt eine intrazelluläre Wirkungsstelle, – eine hohe spezifische Aktivität, – eine chemische Gruppe, die eine kovalente Bindung mit einem Liganden (W-Z) ermöglicht; – wenn die erforderliche chemische Gruppe nicht für die Wirkung des therapeutischen Wirkstoffs (M) bedeutend ist, muss dieser nach der enzymatischen Hydrolyse der kovalenten Bindung nicht intakt zurückgegeben werden.
    • 2. Die Bindung mit dem Liganden (W-Z) verhindert das Eindringen des therapeutischen intrazellulären Wirkstoffs (M) sowohl in die normalen Zellen als auch in die Zielzellen.
    • 3. Die Verbindung nach der Erfindung bleibt in Serum und Blut stabil und ist gegenüber der Wirkung der Proteinasen und Peptidasen, welche zirkulieren und mit den roten Blutkörperchen in Verbindung stehen, unempfindlich.
    • 4. Die kovalente Bindung zwischen dem antitumoralen therapeutischen Wirkstoff (M) und dem Liganden (W-Z) wird durch die von den Zielzellen abgesonderten Enzyme teilweise oder vollständig degradiert.
    • 5. Die Art des Liganden (W-Z) und seine Bindung mit dem therapeutischen Wirkstoff (M) werden in Abhängigkeit der von den Zielzellen abgesonderten Enzymen bestimmt.
    • 6. Die Verbindung ist in vivo weniger toxisch als der anfängliche therapeutische Wirkstoff. Diese Verminderung der Toxizität betrifft insbesondere die akuten Wirkungen, wie etwa die medulläre und Schleimhaut-Toxizität, sowie die mögliche Herz- oder neurologische Toxizität.
  • ANTHRACYCLINDERIVATE
  • Der therapeutische Wirkstoff (M) nach der Erfindung kann ein Anthracyclinderivat sein, insbesondere Doxorubicin, Daunorubicin, 4-Epi-Doxorubicin, 4-Demethoxy-Doxorubicin (Idarubicin), 4'-Tetrahydropyranyl-Doxorubicin (Pirarubicin), Carminomycin, Esorubicin und 4'-Iodo-Doxorubicin.
  • Der Ligand (W-Z) wird anschließend durch seine Carboxylfunktion an das α-Aminoende des therapeutischen Wirkstoffs gebunden.
  • FOLSÄUREDERIVATE
  • Der antitumorale therapeutische Wirkstoff kann ebenfalls ein Folsäurederivat, insbesondere Methotrexat (MTX) oder seine Derivate sein, wie etwa Lysin (e-y)MTX oder Lysine (ε-α)-MTX, wie von Fitzpatrick et al. (Anti-cancer Drug Design 10, S. 1–9 und S. 11–24 (1995)) beschrieben, oder Aminopterin, insbesondere Lysin (ε-γ)-AMPT und Lysin (ε-α)-AMPT sein.
  • Der Ligand (W-Z) wird anschließend durch seine Carboxylfunktion an das α-Aminoende des therapeutischen Wirkstoffs gebunden.
  • VINCA-ALKALOIDDERIVATE
  • Die Vinca-Alkaloidderivate nach der vorliegenden Erfindung sind insbesondere die Derivate von Vinblastin, Vincristin, Vindesin und Navelbin.
  • A. Bindung an Position 3
    • 1. Deacetylvincristinsäure, die durch die Zugabe von Lysin zur Gruppe Amino-e, um ein (e)dAcVCR-Lysin zu erhalten, gebildet wird. Danach wird der Ligand (W-Z) an seinem Carboxylende an die α-Aminogruppe des (ε)-dAcVCR-Lysins gebunden.
    • 2. Deacetylvincristinsäure kann ebenfalls durch das Hinzugeben eines aliphatischen Diamins zu Vincristin (NH2-Alkyl-NH2) erhalten werden, um ein NH2-Alkyl-dAcVCR zu erhalten, wobei der Ligand (W-Z) anschließend an seinem Carboxylende an die α-Aminogruppe des (e)-dAcVCR-Lysins gebunden wird.
  • Die Derivate von Vinblastin (VBL) und Navelbin (5'-Noranhydrovinblastin) können auf dieselbe Weise an den Liganden (W-Z) gebunden werden, wie vorhergehend für Vinc ristin beschrieben wurde.
  • B. Bindung an Position 4
    • 1. V4-Hemiaspartat-Vincristin wird aus Vincristin durch die Bindung von Asparaginsäure durch ihre γ-Carboxylgruppe hinweg an die Hydroxylgruppe an Position 4 von Vincristine (V4) gebildet. Anschließend wird der Ligand (W-Z) durch sein Carboxylende an die α-Aminogruppe von V4-Hemiaspartat-Vincristin gebunden.
    • 2. V4-Lysyl-Vincristin wird aus Vincristin gebildet, indem Lysin durch seine α-Carboxylgruppe an die Hydroxylgruppe an Position 4 von Vincristin (V4) gebunden wird. Anschließend wird der Ligand (W-Z) durch sein Carboxylende an die α-Aminogruppe von V4-Lysyl-Vincristin gebunden.
    • 3. V4-Lysyl-Vincristin wird aus Vincristin gebildet, indem Lysin durch seine α-Carboxylgruppe an die Hydroxylgruppe an Position 4 von Vincristin (V4) gebunden wird. Anschließend wird der Ligand (W-Z) durch sein Carboxylende an die e-Aminogruppe des Lysins von V4-Lysin-Vincristin gebunden. Nach einer Alternative kann der Ligand (W-Z) zugleich an die α- und e-Aminogruppen von V4-Lysyl-Vincristin gebunden werden.
    • 4. V4-β-Alanyl-Vincristin wird aus Vincristin gebildet, indem β-Alanyl durch seine Carboxylgruppe an die Hydroxylgruppe an Position 4 von Vincristin (V4) gebunden wird. Anschließend wird der Ligand (W-Z) durch sein Carboxylende an die Aminogruppe des β-Alanyls von V4-β-Alanyl-Vincristin gebunden.
  • Die Derivate von Vinblastin, Vindesin und Navelbin können auf dieselbe Weise an den Liganden (W-Z) gebunden werden, wie oben für Vincristin beschrieben wurde.
  • CALICHEAMYCINDERIVATE
  • N-Acetyl-dimethylhydrazid, Derivat von Calicheamycin, wird durch die Reaktion eines Hydrazids, wie etwa Thiol, auf dem Calicheamycin erhalten.
  • Der Ligand (W-Z) wird anschließend durch sein Carboxylende an N-Acetyl-dimethylhydrazid, Derivat von Calicheamycin, gebunden.
  • MITOXANTHRONDERIVATE
  • Ein β-Alanylderivat von Mitoxanthron wird durch die Bindung der Carboxylfunktion von β-Alanyl an die Hydroxylseitenketten von Mitoxanthron hergestellt.
  • Eine Mono- oder Bisubstitution ist anschließend möglich. Der Ligand (W-Z) wird anschließend durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von β-Alanyl-Mitoxanthron gebunden.
  • ARABINOSYLCITOSINDERIVATE(ARA-C)
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von Arabinosylcitosin gebunden.
  • ARABINOSYLADENOSINDERIVATE(ARA-A).
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von Arabinosyladenosid gebunden.
  • FLUDARABINPHOTPHATDERIVATE
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von Fludarabinphosphat gebunden.
  • MELPHALANDERIVATE
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von Melphalan gebunden.
  • BLEOMYCINDERIVATE
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von Bleomycin, Peplomycin oder Liblomycin gebunden.
  • MITOMYCINDERIVATE
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe an Position 7 von Mitomycin gebunden.
  • L-CANAVANINDERIVATE
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die α-Aminogruppe von L-Canavanin gebunden.
  • TAXOIDDERIVATE
  • Ein β-Alanylderivat von Taxol wird durch die Bindung in Abhängigkeit der Carboxylfunktion von β-Alanyl an die Hydroxylseitenketten an Position 7 von Taxol hergestellt.
  • Die Hydroxylgruppe von Taxol ist reaktionsfähig aber für die Antitumorwirkung von Taxol nicht essentiell (Nicalaou K. C. et al., Chemistry and Biology of Taxol, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1994), 33, S. 15–44).
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von β-Alanyl-Taxol gebunden.
  • Der Ligand (W-Z) kann auf vergleichbare Weise an die Derivate von β-Alanyl-Taxol gebunden werden.
  • CAMPTOTHECINDERIVATE
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die α-Aminogruppe von 9-Amiono-Camptothecin oder 7-Amino-Methyl-Camptothecin gebunden.
  • Die vorliegende Erfindung wird auf detaillierter Weise in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, welche beispielhaft und nicht als die vorliegende Erfindung einschränkend gegeben sind.
  • BEISPIEL 1
  • N-L-Leucyl-Daunorubicin (Leu-DNR) Synthese
  • L-Leucyl-Daunorubicin wird durch die Reaktion von Daunorubicin in Form von Base (DNR) mit L-Leucin synthetisiert, das auf seiner Aminfunktion durch eine FMOC-Gruppe (Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl) geschützt ist und dessen Carboxylfunktion durch IBCF (Isobutylchloroformiat) aktiviert wird, dann Entschützen der Aminfunktion.
  • DNR in Form von Base wird aus 200 mg Daunorubicinchlorhydrat (R. Bellon) hergestellt, das in 500 μl DMF (Dimethylformamid) aufgelöst ist, denen 1,2 Äquivalente von N-Methyl-Morpholin hinzugegeben werden.
  • 1,2 Äquivalente von Fmoc-N-Leucin (NOVA BIOCHEM) werden in 500 μl DMF (Dimethylformamid) aufgelöst und 1,2 Äquivalente von N-Methyl-Morpholin und 1,2 Äquivalente von IBCF werden bei –20°C hinzugegeben. Nach 15 Minuten wird diese Lösung zu derjenigen der DNR-Base hinzugegeben und die Mischung wird während 16 Stunden unter Rühren lichtgeschützt stehen gelassen.
  • Fmoc-N-L-Leucyl-Daunorubicin wird in 150 ml aus einer Mischung 1:1 von Ether und Petrolether (40–60°C) präzipitiert, dann auf Sinterglas Nr. 4 gefiltert. Das Produkt wird mittels Chromatografie in einer mit Chloroform eluierten Siliziumsäule (Silizium Si-60 70–230 Mesh von E. MERCK) gereinigt. Das restliche DNR wird mit 10% Methanol eluiert. Die Fraktionen, die FMOC-N-L-Leucyl-DNR enthalten, werden einrotiert, das Produkt in 500 μl DMF übernommen. Die Entschützung wird durch das Hinzugeben von 5 Äquivalenten Diethylamin (LAB SCALA) bei –20°C durchgeführt.
  • Nach 1 Stunde wird N-L-Leucyl-DNR mit einer Mischung 1:1 von Ether und Petrolether (40–60°C) präzipitiert, dann auf Sinterglas Nr. 4 gefiltert. Das Produkt wird in einer Chloroform/Methanol-Mischung (4:1 in Volumen) übernommen und Diethylamin wird mit einem HCl-Äquivalent neutralisiert.
  • Das Produkt wird anschließend mittels Chromatografie in einer mit Chloroform, dann mit 15% Methanol enthaltendem Chloroform eluierten Siliziumsäule (Silizium Si-60 70–230 Mesh von E. MERCK) gereinigt. Die Fraktionen, die N-L-Leucyl-DNR enthalten, werden einrotiert, das Produkt in destilliertem Wasser übernommen und das Chlorhydrat durch die Einstellung des pH-Wertes mittels HCL 1N gebildet. Das Produkt wird anschließend auf modifiziertem Siliziumgel (sep-pal C18 von WATERS) gefiltert, das N-L-Leucyl-Daunorubicin wird mittels Methanol eluiert, dann einrotiert. Die gewöhnliche Ergiebigkeit liegt bei 70 bis 80%. Charakteristiken der Produkte
    Verbindung Formel Schmelzpunkt (°C) Rf TLC Tr HPLC
    DNR C27H29NO10, HCl 189 0,05 0,67
    L-Leu-DNR C33H40N2O11, HCl 201 0,31 0,48
    Rf TLC: Chloroformsystem: Methanol: Wasser (120:20:1, in Volumen) Tr HPLC: Verweilzeit bezüglich Doxorubicin, HPLC-System: Säule Si-60, mit einer Chloroformmischung eluiert: Methanol: Essigsäure: wässrige Lös. aus MgCl2 0,3 mM (1440:420:80:60, in Volumen).
  • β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin-Synthese
  • β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin wird durch die Synthese in fester Phase nach der Technik von Merrifield (The Chemistry of Polypeptides, (P. G. Katsoyannis Ed.), Plenum Press, New York, S. 336–361 (1973)) hergestellt.
  • Fluorochromderivate
  • Der Ligand (W-Z) wird durch sein Carboxylende an die Aminogruppe von Rhodamin 123 gebunden.
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR-Synthese
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR wird durch Pfropfung von Fmoc-β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin synthetisiert, das durch Synthese in fester Phase auf N-L-Leucyl-Daunorubicin hergestellt wurde.
  • Fmoc-β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin (1,5 Äquivalente), die in DMF aufgelöst wurden, werden 1,5 Äquivalenten (eq.) N-Methyl-Morpholin und 1,5 eq. Isobutylchloroformiat hinzugegeben. Nach 10 Minuten bei –20°C werden 1,5 eq. HOBT hinzugegeben. Dann, nach 5 Minuten, wird 1 eq. von N-L-Leucyl-Daunorubicinbase, die in DMF aufgelöst wurde, hinzugegeben. Nach der Reaktion wird Fmoc-β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR mit Ether präzipitiert, dann mit Diethylamin entschützt. β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR wird mittels Chromatografie auf einer Säule aus Silizium und Chlorhydrat, das durch die Zugabe von HCL 1N gebildet wurde, gereinigt.
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX-Synthese
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX wird durch Pfropfung von β-L-Alanyl-L-Leucyl-L-Alanin synthetisiert, durch Synthese in fester Phase auf N-L-Leucyl-Doxorubicin hergestellt, wie für die Synthese von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR beschrieben wurde.
  • In dieser Synthese kann das Kopplungsmittel (Isobutylchloroformiat) ausgelassen werden, sodass die Ergiebigkeit der Herstellung der Verbindung nach Erfindung im Falle der Formulierung β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX noch erhöht wird.
  • BEISPIEL 2
  • Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR in einem konditionierten Medium von Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7/6
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR wurde bei 37°C 2 Stunden lang in mit MCF7/6 Zellen konditioniertem Medium inkubiert, das 20 oder 4 Mal konzentriert war, und die Verbindung sowie die Produkte der Digestion wurden bei einem pH-Wert von 9 extrahiert und mittels HPLC analysiert (3).
    Ausgangsprodukt oder Metabolit Zeit 0 Nach 1 Stunde Nach 2 Stunden
    β-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR 100% 10% 2,6%
    L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR oder DNR 0% 3,0% 7,3%
    L-Ala-L-Leu-DNR 0% < 1% < 1%
    L-Leu-DNR 0% 83% 90%
  • Daraus folgt, dass L-Leu-DNR der Hauptmetabolit der Endopeptidase ist und dass seine Bildung aus dem pro-Arzneimittel praktisch nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C vollständig ist. In diesen verwendeten experimentellen Bedingungen sind L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR und DNR nicht ausreichend voneinander getrennt, damit mit Sicherheit gesagt werden kann, dass das gebildete L-Leu-DNR danach langsamer in DNR hydrolisiert.
  • BEISPIEL 3
  • Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX im konditionierten Medium von Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7/6
  • Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX bei 37°C 2 Stunden lang in mit MCF7/6 Zellen konditioniertem Medium, das 20 oder 4 Mal konzentriert war, inkubiert wird, findet sich als Metabolit lediglich L-Leu-DOX und DOX.
    Ausgangsprodukt oder Metabolit Zeit 0 Nach 2 Stunden
    β-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DOX 100% 23%
    L-Leu-L-Ala-L-Leu-DOX 0% < 1%
    L-Ala-L-Leu-DOX 0% < 1%
    L-Leu-DOX 0% 68%
    DOX 0% 9%
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX wird weniger schnell als das pro-Arzneimittel von DNR durch die von den MCF7/6 Zellen abgesonderte(n) Peptidase(n) hydrolysiert. Dahingegen scheint die Umwandlung von L-Leu-DOX in DOX etwas wichtiger zu sein als die Umwandlung von L-Leu-DNR in DNR.
  • BEISPIEL 4
  • Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX in menschlichem Blut
  • Wie auch β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR ist β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX stabil, wenn es bei 37°C in menschlichem Blut inkubiert wird. Tatsächlich werden weniger als 2% des pro-Arzneimittels nach 2 Stunden in L-Leu-DOX hydrolysiert, wohingegen die anderen synthetisierten Derivate in Anwesenheit von menschlichem Blut schnell hydrolysieren (siehe Tabelle 1 unten). Tabelle 1: HYDROLYSE VON DAUNORUBICIN-(DNR) UND DOXORUBICIN-(DOX)DERIVATEN
    VERBINDUNG Menschliches Blut MCF-7/6 konditioniertes Medium
    L-Leu-DNR + – DNR-Hydrolyse
    D-Leu-DNR – – DNR-Hydrolyse
    diEthyl-β-Ala-DNR – – DNR-Hydrolyse
    L-NorLeu-DNR – –
    L-Ala-L-Leu-DNR + + L-Leu-DNR-Hydrolyse
    L-Ala-L-Ala-DNR + – DNR-Hydrolyse
    L-Ala-L-Ileu-D + + DNR-Hydrolyse
    L-Ala-L-NorLeu-DNR – – DNR-Hydrolyse
    β-Ala-L-Leu-DNR – – DNR-Hydrolyse
    L-Phe-L-Leu-DNR + (±) DNR-Hydrolyse
    L-Ala-L-Ala-L-Leu-DNR + – L-Leu-DNR-Hydrolyse
    L-NLeu-L-Ala-L-Leu-DNR + + L-Leu-DNR-Hydrolyse
    L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR + + L-Leu-DNR-Hydrolyse
    L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR + + L-Leu-DNR-Hydrolyse
    L-Ala-L-Leu-Gly-L-Leu-DNR + (±) DNR-Hydrolyse
    Gly-L-Leu-Gly-L-Leu-DNR + + DNR-Hydrolyse
    Succ-L-Ala-L-Leu-DNR – – L-Leu-DNR-Hydrolyse
    Succ-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR – – L-Leu-DNR-Hydrolyse
    Succ-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR (+) – L-Leu-DNR-Hydrolyse
    pGlu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DOX + – L-Leu-DOX-Hydrolyse
    D-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR – – L-Leu-DNF-Hydrolyse
    D-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR + (+) L-Leu-DNF-Hydrolyse
    D-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR + + L-Leu-DNF-Hydrolyse
    D-Leu-D-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR (+) (+) L-Leu-DNF-Hydrolyse
    β-L-Ala-L-Leu-DNR – – L-Leu-DNF-Hydrolyse
    L-NLeu-β-L-Ala-L-Leu-DNR + + L-Leu-DNF-Hydrolyse
    β-Ala-L-Ala-L-Leu-DNR – – L-Leu-DNF-Hydrolyse
    β-Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR – + L-Leu-D-Hydrolyse
  • BEISPIEL 5
  • Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR im konditionierten Medium von Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7/ADR
  • Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR bei 37°C 1 Stunde lang in mit gegenüber Anthracyclinen widerstandsfähigen MCF7 Zellen (mit der Linie MCF7/ADR) konditioniertem Medium inkubiert wird, findet sich als Metabolit lediglich L-Leu-DNR (4).
  • Die MCF7/6 Zellen, die gegenüber Anthracyclinen empfindlich und widerstandsfähig sind, sondern beide die Protease oder die Proteasen ab, welche die Verbindung nach der Erfindung hydrolysieren kann/können.
  • BEISPIEL 6
  • Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR in konditioniertem Medium von Heptakarzinomzellen HepG2
  • Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR bei 37°C 2 Stunden lang in mit Hepatokarzinomzellen HepG2 konditioniertem Medium inkubiert wird, sind die Hauptmetaboliten, die sich finden, L-Leu-DNR (27% der gesamten Fluoreszenz) und L-Ala-L-Leu-DNR (8%). Der Prozentsatz der Hydrolyse kann nicht zwischen den Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7 und dem Hepatokarzinom HepG2 verglichen werden, da die Anzahl an Zellen, ab denen die konditionierten Medien wiedererlangt wurden, sowie die Konzentrationen der konditionierten Medien sind unterschiedlich. Die qualitative Analyse deutet trotzdem darauf hin, dass die Peptidase(n) nicht spezifisch für die MCF7-Zellen ist/sind.
  • BEISPIEL
  • Zerlegung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR in konditioniertem Medium von Darmkarzinomzellen HT29
  • Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR bei 37°C 2 Stunden in konditioniertem Medium aus Darmkarzinomzellen HT29, das 40 Mal konzentriert ist, konditioniert wird, sind die Hauptmetaboliten, die sich finden, L-Leu-DNR (82% der gesamten Fluoreszenz) und L-Leu-L-Ala-L-Leu-DNR und/oder DNR (3%), wie in 5 dargestellt.
  • BEISPIEL 8
  • Akkumulation auf tumoralen MCF7/6 Zellen von DNR, L-Leu-DNR und β-Ala-L-Leu-1-Ala-L-Leu-DNR
  • Die Zellen des menschlichen Brustdrüsenkarzinoms MCF7/6 wurden in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR in einer Konzentration von 10 μg eq. DNR/ml inkubiert. Nach unterschiedlichen Zeiten wurde die Akkumulation der pro-Arzneimittel und deren fluoreszenten Metaboliten mittels HPLC nach der Extrahierung in Produkten mit basischem pH-Wert nach einer im Labor umgesetzten Methode bestimmt. Die Akkumulationen, die in μg/mg von zellulären Proteinen ausgedrückt werden, wurden mit denjenigen von DNR und DOX sowie denjenigen von L-Leu-DNR und L-Leu-DOX verglichen. Die Metaboliten wurden durch Bestimmung der Verweilzeit von Referenzprodukten, die im Labor synthetisiert wurden, identifiziert.
  • DNR akkumuliert schnell in den MCF7/6 Zellen in im Wesentlichen unveränderter Form, wobei die maximale Akkumulation (±15 μg/mg zellulärer Proteine) nach 6 Stunden Inkubation erreicht wurde. Die Akkumulation von DNR nimmt anschließend bis auf 24 Stunden ab. Der intrazelluläre Hauptmetabolit ist Daunorubicinol, was in der Reduzierung der Ketonfunktion von DNR, an Position C13, durch intrazelluläre Reduktasen (6) resultiert.
  • L-Leu-DNR akkumuliert ebenfalls sehr schnell durch die MCF7/6 Zellen, jedoch in geringeren Raten, und die Akkumulation erreicht nach 24 Stunden Inkubation ein Niveau, das sich bei ±14 μg/mg zellulärer Proteine befindet. DNR bildet sich progressiv im Laufe der Zeit intrazellulär, um 14% der gesamten intrazellulären Fluoreszenz nach 24 Stunden Inkubation zu erreichen (7).
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR, das während 24 Stunden in Anwesenheit von MCF7/6 Zellen inkubiert wurde, akkumuliert in unveränderter Form, und zwar viel weniger als DNR und L-Leu-DNR, wobei die Akkumulationsrate lediglich bei ±1 μg/mg zellulärer Proteine liegt (8). Dies sind im Wesentlichen L-Leu-DNR, das extrazelluläre gebildet wurde, und DNR, das nach 24 Stunden Inkubation in den Zellen zu finden ist. DNR, das intrazellulär gefunden wurde, stellt nach 24 Stunden Inkubation ungefähr 40% der gesamten Fluoreszenz dar. Tabelle 2: Intrazelluläre Konzentrationen im Ausgangsprodukt L-Leu-DNR und DNR nach 6 Stunden Inkubation der MCF7/6 Zellen entweder mit DNR, L-Leu-DNR oder β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
    Inkubation mit Ausgangsprodukt Gebildetes Leu-DNR Gebildetes DNR
    (μg/mg zelluläre Proteine)
    DNR 14,9 - -
    Leu-DNR 13,4 - 1,5
    β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR 0,3 4,5 0,9
  • Die Ergebnisse in Tabelle 1 deuten darauf hin, dass der Durchgang der Peptidderivate von DNR durch die zellulären Membrane abnimmt, wenn die Länge der Peptidkette zunimmt und dass β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR ein Präkursor von Leu-DNR ist, der extrazellulär aktiviert wurde. Das freigesetzte Leu-DNR akkumuliert intrazellulär und wird selbst ein intrazellulärer Präkursor von DNR.
  • BEISPIEL 9
  • Akkumulation auf normalen MRC5 Zellen von DNR und L-Leu-DNR und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
  • Die Fibroblastenzellen MRC5 wurden in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR in einer Konzentration von 10 μg eq. DNR/ml inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeiten wurde die Akkumulation der pro-Arzneimittel und deren fluoreszenten Metaboliten mittels HPLC nach der Extrahierung der Produkte bei basischem pH-Wert nach einer im Labor umgesetzten Methode bestimmt. Die Akkumulationen, die in μg/mg von zellulären Proteinen ausgedrückt werden, wurden mit denjenigen von DNR und L-Leu-DNR verglichen. Die Metaboliten wurden durch Bestimmung der Verweilzeiten von Referenzprodukten, die im Labor synthetisiert wurden, identifiziert.
  • DNR akkumuliert hauptsächlich in MRC5 Zellen in unveränderter Form, und die Akkumulation erreicht nach 6 Stunden ein Niveau, das sich bei ±76 μg/mg zellulärer Proteine befindet, wobei der Hauptmetabolit Daunorubicinol ist (9).
  • L-Leu-DNR akkumuliert ebenfalls sehr schnell durch die MCR5 Zellen, jedoch in geringeren Raten, und die Akkumulation erreicht nach 24 Stunden Inkubation ein Niveau, das sich bei ±40 μg/mg zellulärer Proteine befindet. Die Hauptmetaboliten sind DNR sowie L-Leu-DNR-OL (10).
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR, das während 24 Stunden in Anwesenheit von MRC5 Zellen inkubiert wurde, akkumuliert viel weniger als DNR und L-Leu-DNR, wobei sich die Akkumulationsrate lediglich bei ±3,3 μg/mg zellulärer Proteine befindet. Im Wesentlichen findet sich L-Leu-DNR, das extrazellulär gebildet wurde, in den Zellen. Seine Akkumulation nimmt linear bis zu 24 Stunden Inkubation zu.
  • Diese Ergebnisse bestätigen jene, die mit den MCF7/6 Zellen erhalten wurden, das heißt, dass die Verbindung β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR praktisch nicht in die Zellen eintritt (= 300 Mal weniger als DNR nach 6 Stunden) und dass L-Leu-DNR, das extrazellulär gebildet wurde, im Wesentlichen in den MRC5 Zellen akkumuliert (Tabelle 3). Tabelle 3: Intrazelluläre Konzentrationen im Ausgangsprodukt L-Leu-DNR und DNR nach 6 Stunden Inkubation der MRC5 Zellen entweder mit DNR, L-Leu-DNR oder β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR
    Inkubation mit Ausgangsprodukt Gebildetes Leu-DNR Gebildetes DNR
    (μg/mg zelluläre Proteine)
    DNR 77,4 - -
    Leu-DNR 36,0 - 1,3
    β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR 0,03 3,1 0,08
  • In der Tumorlinie MCF7/6 sind die intrazellulären Raten, die nach 24 Stunden Inkubation in Anwesenheit der Verbindung β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR erhalten wurden, 12 Mal höher als die Fibroblasten MRC5.
  • Wenn die Zellen in Anwesenheit von Leu-DNR und DNR inkubiert werden, beträgt das Verhältnis der intrazellulären Raten von DNR jeweils lediglich 0,37 bzw. 0,19.
  • BEISPIEL 10
  • Zytotoxizität von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR gegenüber tumoralen MCF7/6 und normalen MRC5 Zellen
  • Die Zytotoxizität des pro-Arzneimittels DNR, Leu-DNR und DNR wurde auf MCF7/6 und MRC5 Zellen verglichen, die während 72 Stunden in Anwesenheit von unterschiedlichen Verbindungen im Wachstum gehalten wurden.
  • Die Zytotoxizitäten von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR, L-Leu-DNR und DNR wurden auf MCF7/6 Zellen im Wachstum in 96-Well-Platten bestimmt, in Anwesenheit von wachsenden Konzentrationen von unterschiedlichen Verbindungen inkubiert. Nach 72 Stunden werden die Zellen während 48 Stunden in Abwesenheit von Anthracyclin inkubiert und die Zytotoxizität wird durch Messen der zellulären Proteine mittels der Bradford-Technik bestimmt. Es wird ein Bereich von 9 Konzentrationen verwendet, der von 700 μg/ml bis 0,0035 μg/ml reicht, und jede Messung stellt ein standardmäßiges Mittel und eine standardmäßige Abweichung von 6 Werten dar. Die experimentellen Punkte werden auf einer S-Kurve angepasst, welche das Berechnen des Wendepunktes, der der Dosis entspricht, bei der die Hälfte der Zellen überleben, ermöglicht (IC50).
  • 12 stellt dar, dass IC50 von DNR bei 0,090 ± 0,004 μg/ml liegt. Für die Zellen, die während 72 Stunden in Anwesenheit von L-Leu-DNR inkubiert wurden, liegt IC50 bei 1,30 ± 0,56 μg/ml. Im Falle von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR, liegt IC50 bei 22,00 ± 7,31 μg/ml.
  • Leu-DNR und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR sind also jeweils 14 Mal bzw. 244 Mal weniger zytotoxisch als DNR für die Zellen des menschlichen Brustdrüsenkarzinoms MCF7/6, welche während 72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten wurden.
  • Die Zytotoxizitäten von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR, L-Leu-DNR und DNR wurden auf MRC5 Zellen im Wachstum auf 96-Well-Platten bestimmt, die in Anwesenheit von wachsenden Konzentrationen der unterschiedlichen Verbindungen inkubiert wurden. Nach 72 Stunden werden die Zellen während 48 Stunden in Abwesenheit von Anthracyclin inkubiert und die Zytotoxizität wird durch Messen der zellulären Proteine mittels der Bradford-Technik bestimmt. Es wird ein Bereich von 9 Konzentrationen verwendet, der von 700 μg/ml bis 0,0035 μg/ml reicht, und jede Messung stellt ein standardmäßiges Mittel und eine standardmäßige Abweichung von 6 Werten dar. Die experimentellen Punkte werden auf einer S-Kurve angepasst, welche das Berechnen des Wendepunktes, der der Dosis entspricht, bei der die Hälfte der Zellen überleben, ermöglicht (IC50).
  • 13 stellt dar, dass IC50 von DNR bei 0,010 ± 0,006 μg/ml liegt. Für die Zellen, die während 72 Stunden in Anwesenheit von L-Leu-DNR inkubiert wurden, liegt IC50 bei 1,78 ± 0,23 μg/ml. Im Falle von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR, liegt IC50 bei 23,14 ± 4,81 μg/ml.
  • Leu-DNR und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR sind also jeweils 172 Mal bzw. 2230 Mal weniger zytotoxisch als DNR für die MRC5 Fibroblastenzellen, welche während 72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten wurden.
  • Der Präkursor von DNR ist sowohl für die tumoralen Zellen als auch die Fibroblastenzellen viel weniger toxisch als die Mutterverbindung. Es muss nur noch bestimmt werden, ob diese Verringerung der Toxizität, die in vitro beobachtet wurde, sich ebenfalls in vivo beobachten lässt.
  • BEISPIEL 11
  • Akute Toxizität in vivo
  • Die akute Toxizität von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR wurde an Mäusen mit derjenigen von Daunorubicin verglichen. In der Studie in vivo der akuten Toxizität eines Medikamentes nimmt die Bestimmung der Letaldosis 50 (Letaldosis für 50% der Tiere oder LD50) einen wichtigen Platz ein. Trotz der Tatsache, dass sie keine biologische Konstante bildet, deutet sie auf die akute Toxizität des injizierten Produktes hin. LD50 ist ein einfacher Test, bei dem ansteigende Mengen des zu testenden Produktes intravenös (i. v.) in einer einzigen Injektion und intraperitoneal (i. p.) in 5 Injektionen bei einer Injektion pro Tag an 5 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht wird. Die Mortalität der Tiere erfolgt in Abhängigkeit der Zeit. Am Ende der Beobachtungsperiode, gewöhnlich 30 Tage, wird der Wert von LD50 mittels linearer Regression des Prozentsatzes der Mortalität (auf einer Probitleiter) in Abhängigkeit des Logarithmus der verabreichten Dosis erhalten (O. K. Chan and A. W. Hayes, Principles and methods for akute toxicity and eye irritancy, in Principles and methods of toxicology, zweite Auflage. Ed. von A W. Hayes. Rauen Press. New-York, USA (1989), S. 169–220; D. Deprez-De Campeneere and A. Trouet. DNA-Anthracycline Complexes. I. Toxicity in mice and chemotherapeutic activity against L1210 Leukaemia of Daunorubicin-DNA and Adriamycin DNA, Eur. J. Cancer, 16 (1980), S. 981–986; H. E. Skipper, L. H. Schmidt, A. Goldin and J. M. Venditti. A manual an quantitative drug evaluation inexperimental tumor systems, Cancer Chemother. Rep. 17 (1962), S. 1–178).
  • In dem Fall, dass LD50 nicht erreicht wird, deutet die Entwicklung der täglichen Gewichte der Mäuse ebenfalls auf die akute Toxizität der verabreichten Produkte hin.
  • 1. Material und Methoden
  • Die akute Toxizität dieser beiden Arzneimittel wurde i. v. und i. p. auf einer einzigen Mäusestamm studiert. Die weiblichen NMRI-Mäuse (nicht aus Verwandtschaftszucht IOPS-Han, ungefähr 5 Wochen alt und mit einem mittleren Gewicht von 14,6 Gramm, aus IFFA-CREDO Belgien stammend) blieben während einer Woche in Quarantäne. Am Vortag des Injektionstages wurden sie in Gruppen von 5 (β-la-Leu-Ala-Leu-DNR) und 7 (DNR) pro zu injizierender Dosis unterteilt; ihr Gewicht wurde erneut aufgenommen (ungefähr 22 Gramm im Durchschnitt).
  • Die Injektionen erfolgten systematisch am morgen (einzige Injektion in die Kaudalvene für die i. v. und Injektionen an 5 aufeinanderfolgenden Tagen in das Bauchfell für die i. p.), indem 1,0-ml-Spritzen und sterile Nadeln 30G (i. v.) und 27G (i. p.) verwendet wurden. Jegliche Handhabungen der Tiere erfolgten mit Handschuhen und die Pflege der Tiere erfolgte systematisch jede Woche.
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR wurde i. v. in Dosen von 30, 60 und 120 mg/kg und i. p. in Gesamtdosen von 10, 15, 20, 25, 30, 45 und 60 mg/kg injiziert. β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR wurde erneut in zusätzliche zwei Gruppen i. v. in Gesamtdosen von 30 und 60 mg/kg in jeweils einer und zwei aufeinanderfolgenden Injektionen zu 30 mg/kg injiziert.
  • DNR wurde i. v. in Dosen von 10, 15, 20, 25, 30 und 35 mg/kg und i. p. in Dosen von 2,0; 2,5; 3,0 und 3,5 mg/kg injiziert.
  • Die Lösungen von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR und DNR erfolgten in physiologischem NaCl, sodass das injizierte Volumen 0,1 ml für 10 Gramm Maus entspricht. Die Konzentrationen der Lösungen wurden mittels Spektrofotometrie überprüft.
  • Vom Tag der Injektionen (JO) an wurden die Mäuse mit einer täglichen Aufnahme der toten Mäuse klinisch verfolgt. Das Gewicht der Mäuse wurde fast jeden Tag gemessen. Die Beobachtungsperiode wurde über einen Monat hinaus verlängert, damit die Zeichen verspäteter Toxizität besser aufgefunden werden konnten. Am Ende der Studie wurden die überlebenden Mäuse nach den Tierversuchnormen getötet (D. B. McGregor. Ethics in experiments an animals, in Experiments in toxicology, first edition. Ed. by D. Anderson and D. M. Conning. The Royal Society of Chemistry and The Universities Press. Belfast, Irland (1988), S. 512–522).
  • 2. Ergebnisse
  • Intraperitoneale Toxizität
  • Wie in 14 dargestellt, wird betreffend DNR eine starke Toxizität in Abhängigkeit der Konzentration beobachtet, eine Toxizität, die sich durch die Mortalität der Mäuse ab dem 7. Tag bei einer Dosis von 3,5 mg/kg (1 von 7 Mäusen tot), ab dem 9. Tag bei einer Dosis von 3,0 mg/kg (2 von 7 Mäusen tot) und ab dem 11. Tag bei einer Dosis von 2,5 und 2,0 mg/kg (jeweils 2 bzw. 1 Maus von 7 tot) bemerkbar macht.
  • Keine Maus überlebte den 12. Tag (Dosis von 3,5 mg/kg), den 19. Tag (Dosis von 3,0 mg/kg) und den 29. Tag (Dosis von 2,0 mg/kg). Die einzige Maus, die den 43. Tag überlebte, ist eine derjenigen, der die Dosis von 2,5 mg/kg injiziert wurde. Diese Ergebnisse bestätigen die vorhergehend beschriebenen (D. Deprez-De Campeneere and A. Trouet. DNA-Anthracycline Complexes. I. Toxicity in mice and chemotherapeutic activity against L1210 Leukaemia of Daunorubicin-DNA and Adriamycin-DNA, Eur. J. Cancer, 16 (1980), S. 981–986).
  • 15 deutet darauf hin, dass bei welcher verabreichten Dosis auch immer die Mäuse einen Gewichtsverlust aufweisen, der 30% des ursprünglichen Gewichts erreicht. Dieser Gewichtsverlust ist im Allgemeinen unumkehrbar mit Ausnahme einer Maus, die mit 2,5 mg/kg behandelt wurde, die ihr ursprüngliches Gewicht am 30. Tag wiedererlangte.
  • Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR i. p. während 5 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht wurde, umfassten die Gesamtdosen 10 bis 45 mg/kg, wobei keine Mortalität beobachtet wurde. Bei der Dosis von 60 mg/kg, starben 2 Mäuse am 22. Tag und eine dritte am 35. Tag (16).
  • Bei den Gesamtdosen zwischen 10 und 45 mg/kg wurde kein Gewichtsverlust beobachtet sondern eher eine Gewichtszunahme von ±40% in 40 Tagen (17). Die Analyse der Gewichtskurven zeigt keinen bedeutenden Unterschied. Dahingegen ist bei der Dosis von 45 mg/kg das mittlere Gewicht der Mäuse während den ersten 7 Tagen stabil, dann erreichte die Gewichtserhöhung lediglich 20% im Laufe der aufeinanderfolgenden 30 Tage. Bei der Gesamtdosis von 60 mg/kg verringert sich das mittlere Gewicht der Mäuse um ±15% in 15 Tagen. Die zwei überlebenden Mäuse erlangen ihr ursprüngliches Gewicht erneut erst am 36. Tag (17).
  • Diese Daten weisen darauf hin, dass die Dosis von 60 mg/kg von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR nahe bei LD50 liegt und dass daher β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR mindestens 30 Mal weniger toxisch ist als DNR, was die akute Toxizität nach der i. p. Verabreichung an 5 aufeinanderfolgenden Tagen betrifft.
  • Intravenöse Toxizität
  • Wie in 18 dargestellt, wird betreffend DNR, das i. v. in einer einzigen Verabreichung an weibliche NMRI-Mäuse verabreicht wird, keine Mortalität bei schwachen Dosen (10, 15 und 20 mg/kg) beobachtet. Bei 25 mg/kg sterben 6 Mäuse jeweils an den Tagen 12, 17, 20, 28, 34 und 42. Bei höheren Konzentrationen von DNR beginnt die Mortalität am 7. Tag (1 von 7 Mäusen bei der Dosis von 30 mg/kg) und am 6. Tag (2 von 7 Mäusen bei der Dosis von 35 mg/kg). Diese Ergebnisse entsprechen den vorhergehen beschriebenen (D. Deprez-De Campeneere and A. Trouet. DNA-Anthracycline Complexes. I. Toxicity in mice and chemotherapeutic activity against L1210 Leukaemia of Daunorubicin-DNA and Adriamycin-DNA, Eur. J. Cancer, 16 (1980), S. 981–986).
  • Die Ergebnisse aus 19 deuten darauf hin, dass der mittlere Gewichtsverlust am 7. Tag am höchsten ist und stärker wird, je höher die verabreichte Dosis. Die Mäuse, die die Dosen von 30 und 35 mg/kg überleben, erlangen ihr ursprüngliches Gewicht 30 Tage nach der i. v. Injektion von DNR nicht zurück.
  • Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR i. v. bei der Dosis von 30 mg/kg verabreicht wird, wird keine Mortalität beobachtet und das mittlere Gewicht der Mäuse nimmt um ±40% in 40 Tagen (20) zu. Das mittlere Gewicht der Mäuse am Ende des Experimentes ist ähnlich demjenigen, das bei derselben Dosis von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR beobachtet wurde, das i. p. verabreicht wurde. Dahingegen sterben bei der Dosis von 60 g/kg 2 Mäuse innerhalb von 5 Minuten nach der Injektion. Diese Mortalität könnte auf eine Hypervolämie nach einer viel zu schnellen Injektion des Produktes zurückgeführt werden. Die 3 Mäuse, die nach einer leichten Abmagerung bis zum 2. Tag überleben, erlangen ihr ursprüngliches Gewicht wieder, dann erhöhen sie das Gewicht (±30% in 40 Tagen). Bei der Dosis von 120 mg/kg sterben die 5 Mäuse innerhalb von 7 Minuten nach der Injektion mit klinischen Anzeichen von Toxizität.
  • Wenn β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR i. v. bei der Gesamtdosis von 60 mg/kg verabreicht wird, i. v. in zwei Injektionen von jeweils 30 mg/kg über zwei aufeinanderfolgende Tage fraktioniert wird, wird keine Mortalität beobachtet. Es gibt keine Unterschiede in der Entwicklung des mittleren Gewichtes der Mäuse, die 1 Mal 30 mg/kg erhielten und denjenigen, die 2 Mal 30 mg/kg β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR erhielten (21).
  • 3. Schlussfolgerungen
  • Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen das Schlussfolgern, dass betreffend Letalität sowohl intravenös als auch intraperitoneal β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR eine viel geringere akute Toxizität aufweist als DNR. Diese Ergebnisse bestätigen die Reduzierung der Toxizität des β-Ala-Leu-Ala-Leu-DNR-Derivats.
  • Diese mit den oben beschriebenen identischen Experimente wurden mit den Doxorubicin-Derivaten durchgeführt.
  • BEISPIEL 12
  • Die Akkumulation auf tumoralen Zellen MCF7/6 und den nicht tumoralen Zellen MRC5 von DOX, L-Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX
  • Die Zellen des menschlichen Brustdrüsenkarzinoms MCF7/6 und die menschliche Fibroblastenlinie MRC5 wurden in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX in einer Konzentration von 10 μg eq. DOX/ml inkubiert. Nach verschiedenen Zeiten wurde die Akkumulation von pro-Arzneimitteln mittels HPLC nach der Extrahierung in Produkten mit basischem pH-Wert nach einer im Labor umgesetzten Methode bestimmt. Die Akkumulationen, die in μg/mg von zellulären Proteinen ausgedrückt werden, wurden mit denjenigen von DOX und L-Leu-DOX verglichen. Die Metaboliten wurden durch Bestimmung der Verweilzeit von Referenzprodukten, die im Labor synthetisiert wurden, identifiziert.
  • DOX akkumuliert hauptsächlich in MCF7/6 Zellen in im Wesentlichen unveränderter Form und nach 6 Stunden wird eine intrazelluläre Rate von 6,9 μg/mg zellulärer Proteine erreicht (23).
    Akkumulation nach 6 h (μg/mg zelluläre Prot.) IC50 (μg/ml)
    βA-L-A-L-DOX Leu-DOX DOX (72 h)
    MCF7/6 DOX - - 6,90 0,0025
    Leu-DOX - 1,10 0,25 0,02
    βA-L-A-L-DOX 0,10 0,65 0,22 3,0
    MRC5 DOX - - 11,20 0,018
    Leu-DOX - 1,40 0,30 0,3
    βA-L-A-L-DOX 0,10 0,10 0,01 120
  • Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX akkumulieren 6 Mal bzw. 69 Mal weniger als DOX nach 6 Stunden. Intrazellulär sind die Raten von DOX 31 Mal weniger erhöht nach der Inkubation der Zellen in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX (24 und 25).
  • In den Fibroblastenzellen MRC5, die während 6 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclin in der Konzentration von 10 μg eq. DOX/ml inkubiert wurden, akkumuliert DOX im Wesentlichen in unveränderter Form und die Akkumulation erreicht eine Rate von ±11,2 μg/mg von zellulären Proteinen nach 6 Stunden (26).
  • L-Leu-DOX akkumuliert geringere Raten, wobei die Akkumulation 1,4 μg/mg zellulärer Proteine erreicht. Der Hauptmetabolit ist DOX (0,3 μg/mg zellulärer Proteine) (27).
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX akkumuliert 112 Mal weniger als DOX nach 6 Stunden. Intrazellulär sind die Raten von DOX 1100 Mal weniger hoch nach der Inkubation der Zellen in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX (28).
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX praktisch nicht in die Zellen eintritt und dass es vorher in externem Medium in Form von Leu-DOX hydrolysiert werden muss, bevor es in die Zellen eintritt, in denen intrazellulär Leu-DOX danach DOX erzeugen kann (22).
  • Diese Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass die intrazellulären Raten des aktiven therapeutischen Wirkstoffs zwei Mal höher in normalen Zellen ist als in den tumoralen Zellen im Falle von DOX. Dahingegen sind im Falle von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX die intrazellulären Raten von DOX 22 Mal höher in den tumoralen Zellen MCF7 im Vergleich zu den nicht tumoralen Zellen MRC5.
  • BEISPIEL 13
  • Zytotoxizität in vitro gegenüber den tumoralen Zellen MCF7/6 und den nicht tumoralen Zellen MRC5
  • Die Zytotoxizitäten von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX, L-Leu- DOX und DOX wurden auf MCF7/6 und MRCS Zellen im Wachstum auf 96-Well-Platten bestimmt, in Anwesenheit von wachsenden Konzentrationen der unterschiedlichen Verbindungen inkubiert. Nach 72 Stunden werden die Zellen während 48 Stunden in Abwesenheit von Anthracyclin inkubiert und die Zytotoxizität wird durch Messen der zellulären Proteine mittels der Bradford-Technik bestimmt. Es wird ein Bereich von 9 Konzentrationen verwendet, der von 700 μg/ml bis 0,0035 μg/ml reicht, und jede Messung stellt ein standardmäßiges Mittel und eine standardmäßige Abweichung von 6 Werten dar. Die experimentellen Punkte werden auf einer S-Kurve angepasst, welche das Berechnen des Wendepunktes, der der Dosis entspricht, bei der die Hälfte der Zellen überleben, ermöglicht (IC50).
  • Die Tabelle von Beispiel 12 nimmt IC50 auf, welche jeweils 0,0025, 0,020 bzw. 3,0 μg/ml für DOX, L-Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX für die menschlichen Brustdrüsenkarzinomzellen MCF7/6 betragen. Für die Zellen der menschlichen Fibroblastenlinie MRC5 betragen die Werte jeweils 0,018, 0,30 bzw. 120 μg/ml.
  • Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX jeweils 8 Mal bzw. 1000 Mal weniger toxisch sind als DOX für die menschlichen Brustdrüsenkarzinomfibroblastenzellen MCF7/6, die während 72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten werden. Was die Zellen MRC5 betrifft, sind Leu-DOX und β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX jeweils 17 Mal bzw. 6700 Mal weniger toxisch als DOX für die Zellen, die während 72 Stunden in Anwesenheit von Anthracyclinen im Wachstum gehalten werden.
  • β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX ist 40 Mal toxischer für die tumoralen Zellen MCF7 als für die nicht tumoralen Zellen MRC5. Dies muss ins Verhältnis mit den intrazellulären Raten gesetzt werden, die größer als DOX sind, die in den Zellen MCF7 beobachtet wurden, welche in Anwesenheit von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX inkubiert wurden (29 und 30).
  • Die Verbindung ist im Allgemeinen durch eine größere Aktivität auf den festen Tumormodellen gekennzeichnet (zum Beispiel durch subkutane Injektion der tumoralen Zellen) als auf den Modellen des Typs „Leukämie", welche nach der intravenösen Injektion der tumoralen Zellen erhalten wurden.
  • Die tumoralen Zellen, die subkutan injiziert wurden, bilden einen festen Tumor an der Stelle der Injektion und die örtliche Konzentration der von den Zellen abgesonderten Hydrolasen bleibt hoch. Wenn die tumoralen Zellen intravenös injiziert werden, lösen sich die Hydrolasen, welche sie absondern, umgehen im Blutfluss auf.
  • BEISPIEL 14
  • Akute Toxizität in vivo
  • Des Weiteren reduziert die Verabreichung von β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX an athyme Mäuse, in die ein menschlicher Brustdrüsentumor MCF7/6 implantiert wurde, die Entwicklung des Krebstumors (31), ohne dass dabei das mittlere Gewicht der behandelten Mäuse stark beeinträchtigt wird (32).
  • Diese Experimente wurden nach den in Beispiel 11 beschriebenen Protokollen durchgeführt.
  • Die Erfinder haben ebenfalls die Protease(n), die im extrazellulären Medium der menschlichen Brustdrüsenkarzinomzellen abgesondert wird/werden, gekennzeichnet, die β-Ala-Leu-Ala-Leu-DOX hydrolysieren kann/können. Es wurde bestätigt, dass diese Protease(n) keiner bisher beschriebenen Protease entspricht/entsprechen.
  • Tatsächlich ist das Enzym, das vorübergehend als „COUM" bezeichnet wird, eine Metalloprotease, die durch die Chelatbildner von Metallen, wie etwa EDTA, hemmbar ist und für ihre Aktivität Kobaltion erfordert. Ihr optimaler pH-Wert liegt zwischen 7,5 und 8,0, wobei ausgeschlossen wird, dass es sich um ein Cathepsin handelt.
  • Mittels Hochleistungschromatografie und Elektrophorese in Anwesenheit von Laurylsulfat werden mehrere Bande höherer Molekulargewichte als 70 kD beobachtet.

Claims (9)

  1. Verbindung (W-Z-M), die einen antitumoralen therapeutischen Wirkstoff (M) umfasst, der eine aktive intrazelluläre Stelle (S. A.) besitzt, die an einen Liganden (W-Z) gebunden ist, der einen Arm (Z) umfasst, der an eine Endgruppe (W) gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung zwischen der Endgruppe (W) und dem Arm (Z) sowie die Verbindung zwischen dem Arm (Z) und dem Element (M) kovalente Bindungen sind, die die Eigenschaften der Verbindung (W-Z-M) nicht beeinträchtigen, dadurch dass der Arm (Z) des Liganden (W-Z) ein Peptid ist, das aus mindestens zwei gegebenenfalls substituierten Aminosäuren besteht, dadurch, dass die Gruppe (W) das β-Alanin der Formel: NH2-CH2-CH2-COOH ist, und dadurch, dass die Verbindung zwischen dem Element (M) und dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) eine peptidische Verbindung ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Arm (Z) des Liganden (W-Z) ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden peptidischen Sequenzen: L-Leucyl-L-Alanyl-L-Leucyl-, L-Leucyl-L-Alanyl-, L-Alanyl-L-Leucyl-L-Phenylalanyl-, L-Alanyl-L-Leucyl-.
  3. Verbindung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der antitumorale therapeutische Wirkstoff (M) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Anthracyclinen, Folsäurederivaten, Vinca-Alkaloiden, Calicheamycinen, Mitoxanthronen, Arabinosylcytosinen (ARA-C) oder Arabinosyladenosinen (ARA-A), Fudarabinphosphat, Melphalan, Bleomycin, Mitomycin, L-Canavanin, Taxoiden, Camptothecin und dessen Derivaten, insbesondere TOPOTECAN® (9-Dimethylaminomethyl-10-hydroxycamptothecinhydrochlorid), das gegebenenfalls an eine substituierte oder nicht substituierte Aminosäure gebunden ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der therapeutische Wirkstoff (M) Doxorubicin oder Daunorubicin ist, die gegebenenfalls an eine substituierte oder nicht substituierte Aminosäure gebunden sind.
  5. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der therapeutische Wirkstoff (M) der allgemeinen Formel:
    Figure 00460001
    entspricht, worin: R1 ein Wasserstoffatom oder eine OH-Gruppe ist, R2 ein Wasserstoffatom oder ein Rest der Formel
    Figure 00460002
    ist, worin: R3 ein Wasserstoffatom oder ein gegebenenfalls substituierter Alkylrest ist, R4 für ein Wasserstoffatom steht oder mit R3 einen Alkylenrest bildet, der 3 oder 4 Kohlenstoffatome umfasst.
  6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass R2 ein Rest der Formel
    Figure 00460003
    oder eines ihrer Isomere ist.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung (W-Z-M) umfasst, die einen antitumoralen therapeutischen Wirkstoff (M) umfasst, der eine aktive intrazelluläre Stelle (S. A.) besitzt, die an einen Liganden (W-Z) gebunden ist, der einen Arm (Z) umfasst, der an eine Endgruppe (W) gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung zwischen der Endgruppe (W) und dem Arm (Z) sowie die Verbindung zwischen dem Arm (Z) und dem Element (M) kovalente Bindungen sind, die die Eigenschaften der Verbindung (W-Z-M) nicht beeinträchtigen, dadurch dass der Arm (Z) des Liganden (W-Z) ein Peptid ist, das aus mindestens zwei gegebenenfalls substituierten Aminosäuren besteht, dadurch, dass die Gruppe (W) das β-Alanin der Formel: NH2-CH2-CH2-COOH ist, und dadurch, dass die Verbindung zwischen dem Element (M) und dem Arm (Z) des Liganden (W-Z) eine peptidische Verbindung ist, und gegebenenfalls ein Adjuvans oder pharmazeutisch unbedenkliches Vehikel.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung als Medikament.
  9. Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 oder 8 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von Krebstumoren bestimmt ist.
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