DE69535094T2 - PROTEIN MARKING WITH RADIOACTIVE PHOSPHORUS AND TARGETED RADIO THERAPY - Google Patents

Abstract

32P- and 33P-labeled proteins which are useful for radiotherapy are prepared by stably linking 32P- or 33P- containing molecules to targeting proteins in such a way that the targeting protein retains the ability to bind to a cellular target. Methods for preparing the labeled proteins and their use in methods of radiotherapy are described.

Description

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft Phosphor-32- und Phosphor-33-markierte Proteine, die für die Radiotherapie geeignet sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zum stabilen Verknüpfen von ³²P- und ³³P-enthaltenden Molekülen mit Targeting Proteinen, derart, dass das Targeting Protein die Fähigkeit zum Binden an eine Zielzelle beibehält. Die Erfindung betrifft auch eine Therapie unter Verwendung der markierten Proteine.The present invention relates to phosphorus-32- and phosphor-33-labeled proteins suitable for radiotherapy. In particular, the invention relates to methods of stably linking ³² P- and ³³ P-containing molecules to targeting proteins such that the targeting protein retains the ability to bind to a target cell. The invention also relates to a therapy using the labeled proteins.

Viele Radionuklide wurden bereits auf ihre Eignung in der Radiotherapie zur internen Verabreichung an Patienten untersucht. Einige Radionuklid-Verbindungen, die Isotope wie ¹³¹I enthalten, können systemisch verabreicht werden, wobei die Tatsache genutzt wird, dass diese Elemente auf Grund ihrer chemischen Eigenschaften zur Lokalisierung in bestimmten Geweben neigen. Andere Radionuklide, wie ¹⁹⁸Au und ¹⁰³Pd, werden lokal, beispielsweise an einer Tumorstelle, verabreicht. Die neueren Versuche haben sich allerdings auf Verfahren zur Verabreichung von Radionukliden an ein vorher ausgewähltes Gewebe durch Verknüpfen des Radionuklids mit einem Targeting Protein, in der Regel einem Antikörper, der sodann in diesem Gewebe lokalisiert wird, konzentriert.Many radionuclides have already been tested for their suitability in radiotherapy for internal administration to patients. Some radionuclide compounds containing isotopes such as ¹³¹ I can be administered systemically, taking advantage of the fact that, due to their chemical properties, these elements tend to localize in certain tissues. Other radionuclides, such as ¹⁹⁸ Au and ¹⁰³ Pd, are administered locally, for example at a tumor site. The more recent attempts, however, have focused on methods for administering radionuclides to a previously selected tissue by linking the radionuclide to a targeting protein, usually an antibody, which is then localized in that tissue.

Eine große Anzahl von Verfahren zur Verknüpfung von Radionukliden mit Antikörpern wurde bereits entwickelt. Die chemische Toxizität vieler Radionuklide bedeutet, dass oft komplexe Verfahren zur Stabilisierung der Bindung des Isotops an einen Antikörper angewandt werden müssen.A size Number of linking methods of radionuclides with antibodies has already been developed. The chemical toxicity of many radionuclides means that often complex procedures to stabilize the binding of the isotope to an antibody must be applied.

Beispielsweise muss zur Verwendung von ⁹⁰Y, das viele wünschenswerte radiochemische Eigenschaften aufweist, ein Chelat synthetisiert und kovalent an den Antikörper gebunden werden, um das Radioisotop stabil mit dem Antikörper zu verknüpfen.For example, to use ⁹⁰ Y, which has many desirable radiochemical properties, a chelate must be synthesized and covalently linked to the antibody to stably link the radioisotope to the antibody.

Ein Isotop, das viele der gleichen wünschenswerten Merkmale wie ⁹⁰Y zeigt, dem allerdings hinsichtlich einer gezielten Radiotherapie bisher wenig Aufmerksamkeit zuteil wurde, ist ³²P. ³²P ist kostengünstig, wird nicht leicht ausgeschieden und ist darum zur Verwendung bei ambulanten Patientenverfahren geeignet. Zusätzlich emittiert ³²P nur β-Strahlung, die eine ausgezeichnete Tiefeneindringung von etwa 6 mm in das Gewebe aufweist. Im Gegensatz zu vielen anderen Radionukliden, die für die gezielte Radiotherapie in Betracht gezogen werden, ist es nicht von Natur aus toxisch und wird derzeit bei einigen nicht zielgerichteten Anwendungen klinisch verwendet, beispielsweise für die Behandlung von Eierstockkrebs und Polycythemia rubra vera.An isotope exhibiting many of the same desirable features as ⁹⁰ Y, but little attention has been paid to targeted radiotherapy so far, is ³² P. ³² P is inexpensive, is not easily excreted, and is therefore suitable for use in ambulatory patient procedures. In addition, ³² P emits only β-radiation, which has an excellent depth penetration of about 6 mm into the tissue. Unlike many other radionuclides considered for targeted radiotherapy, it is not inherently toxic and is currently used clinically in some non-targeted applications, such as the treatment of ovarian cancer and polycythemia rubra vera.

Einem weiteren Phosphor-Radioisotop, ³³P, wurde noch weniger Aufmerksamkeit als ³²P zuteil. ³³P weist die gleichen chemischen Eigenschaften wie ³²P auf und besitzt ebenfalls wünschenswerte radiochemische Merkmale. Es ist mit hoher spezifischer Aktivität verfügbar und weist eine 25tägige Halbwertszeit mit einer β-Teilchenemissionsenergie von 0,25 MeV auf, ungefähr 15 % des Wertes der β-Emissionsenergie von ³²P.Another phosphorus radioisotope, ^33P, was even less attention than ³² P granted. ^33P has the same chemical properties as ^32P and also possesses desirable radiochemical features. It is available with high specific activity and has a 25-day half-life with a β-particle emission energy of 0.25 MeV, about 15% of the value of the β-emission energy of ³² P.

Der Grund, warum radioaktiver Phosphor für gezielte radiotherapeutische Anwendungsmöglichkeiten relativ wenig Aufmerksamkeit erfahren hat bestand in der Schwierigkeit, es mit Targeting Proteinen zu verknüpfen. Die meisten der derzeit bekannten Verfahren sind nicht spezifisch und langsam und bauen das Radionuklid nicht wirksam in das Targeting Protein ein.Of the Reason why radioactive phosphorus for targeted radiotherapeutic Possible applications relative Little attention has been given to the difficulty to associate it with targeting proteins. Most of the currently known methods are not specific and slow and build the radionuclide is not effective in the targeting protein.

Ein sehr allgemeines Verfahren der Markierung von Proteinen mit ³²P besteht einfach in der Inkubation des Proteins mit α-³²P-markierten Nucleosidtriphosphaten. Schmidt et al., FEBS Lett., 194:305 (1986). Der Mechanismus für die Markierungsreaktion ist unbekannt. Das Verfahren ist langsam und ergibt nur einen schlechten Einbau der Markierung (weniger als 1 % der Proteinmoleküle sind markiert), und es ist somit zur therapeutischen Anwendung zu unwirksam.A very general method of labeling proteins with ³² P is simply incubation of the protein with α- ³² P-labeled nucleoside triphosphates. Schmidt et al., FEBS Lett., 194: 305 (1986). The mechanism for the labeling reaction is unknown. The process is slow and results in poor label incorporation (less than 1% of the protein molecules are labeled), and thus is ineffective for therapeutic use.

Ein zweites allgemeines Verfahren der ³²P-Markierung besteht in der Inkubation von Proteinen mit [γ-³²P]ATP oder H₃ ³²PO₄ in Gegenwart von Chromionen. Hwang et al., Biochim. Biophys. Acta 882:331 (1986). Dieses Verfahren ist relativ schnell, ergibt allerdings ein unbekanntes Niveau des Markierungseinbaus und hinterlässt auch toxische, an die Proteine gebundene Chromionen, was therapeutisch unverträglich ist.A second general method of ³² P labeling is to incubate proteins with [γ- ³² P] ATP or H ₃ ³² PO ₄ in the presence of chromium ions. Hwang et al., Biochim. Biophys. Acta 882: 331 (1986). This process is relatively fast but gives an unknown level of label incorporation and also leaves toxic chromium ions bound to the proteins, which is therapeutically incompatible.

Ein drittes allgemeines Verfahren ist die Verwendung von ³²P-Diphenylphosphinothionchlorid als reaktive Markierungsverbindung. De Boer et al., Clin. Exp. Immunol. 3:865 (1968). Es wird angenommen, dass dieses Reagens mit den Lysinresten in Proteinen unspezifisch unter Bildung eines hoch stabilen Konjugats reagiert, dass allerdings auch ungefähr 50 % der Radioaktivität mit dem markierten Protein nichtkovalent assoziieren. Obwohl sich durch dieses Verfahren Proteine mit hoher spezifischer Aktivität markieren lassen, ist das markierende Mittel nur schlecht wasserlöslich, und um gute Markierungsausbeuten zu erreichen, müssen große Reagens-Überschüsse eingesetzt werden, wobei relativ große Mengen an gefährlichen radioaktiven Materialien verbraucht werden.A third general method is the use of ³² P-diphenylphosphinothionic chloride as a reactive labeling compound. De Boer et al., Clin. Exp. Immunol. 3: 865 (1968). It is believed that this reagent reacts nonspecifically with the lysine residues in proteins to form a highly stable conjugate, but also noncovalently associates about 50% of the radioactivity with the labeled protein ming. Although high specific activity proteins can be labeled by this method, the labeling agent is poorly soluble in water and, in order to achieve good labeling yields, large excesses of reagent must be used, consuming relatively large amounts of hazardous radioactive materials.

Ein weniger übliches Verfahren der ³²P-Markierung ist die Verwendung von Periodat-oxidiertem [α-³²P]ATP zur Affinitätsmarkierung von Proteinen, die eine ATP-Bindungsstelle enthalten. Clertant et al., J. Biol. Chem. 257:6300 (1982). Da viele Targeting Proteine, die von therapeutischem Interesse sind, insbesondere Antikörper, keine ATP-Bindungsstellen enthalten, ist dieses Verfahren darum von geringem allgemeinem Nutzen.A less common method of ³² P labeling is the use of periodate-oxidized [α- ³² P] ATP for affinity labeling of proteins containing an ATP binding site. Clertant et al., J. Biol. Chem. 257: 6300 (1982). Since many targeting proteins of therapeutic interest, especially antibodies, do not contain ATP binding sites, this method is therefore of little general use.

Ein neueres Verfahren, das zur Markierung von Antikörpern zur Radiotherapie beabsichtigt ist, umfasst die chemische Konjugation von Proteinkinase-Substratpeptiden an Antikörper, wie bei Foxwell et al., Brit. J. Cancer 57:489 (1988) und GB 2,186,579 beschrieben. Die UK-Patentanmeldung GB 2,262,528 offenbart verbesserte Verfahren zur Konjugation von Proteinkinase-Substratpeptiden mit Antikörpern. Die Konjugate werden anschließend durch Behandlung mit [γ-³²P]ATP in Gegenwart der katalytischen Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA), die ³²P-Phosphat auf einen Serinrest in dem Substratpeptid überträgt, markiert. Dieses Verfahren zeigte Unterschiede in der β-Phasen-Halbwertszeit zwischen dem ³²P-markierten Antikörper und einem entsprechenden ¹³¹I-markierten Antikörper und auch eine hohe ³²P-Aufnahme in den Knochen von Tieren, denen der markierte Antikörper injiziert wurde. Creighton et al., "The development of ³²P technology for radioimmunotherapy" in MONOCLONAL ANTIBODIES 2. APPLICATIONS IN CLINICAL ONCOLOGY, A.A. Epenetos, Hrsg. Chapman und Hall, (1993) S. 103–109. Die Ergebnisse zeigen die in vitro Instabilität der Markierung, vermutlich auf Grund der Wirkung von Proteinphosphatasen, die in eukariotischen Zellen ubiquitär sind.A recent method intended to label antibodies to radiotherapy involves chemical conjugation of protein kinase substrate peptides to antibodies as described by Foxwell et al., Brit. J. Cancer 57: 489 (1988) and GB 2,186,579 described. The UK patent application GB 2,262,528 discloses improved methods for conjugating protein kinase substrate peptides to antibodies. The conjugates are then labeled by treatment with [γ- ³² P] ATP in the presence of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase (protein kinase A, PKA), which transfers ³² P-phosphate to a serine residue in the substrate peptide. This method showed differences in the β-phase half-life between the ³² P-labeled antibody and a corresponding ¹³¹ I-labeled antibody and also high ³² P uptake in the bones of animals injected with the labeled antibody. Creighton et al., "The development of ^32P technology for radioimmunotherapy" in MONOCLONAL ANTIBODIES 2. APPLICATIONS IN CLINICAL ONCOLOGY, AA Epenetos, ed. Chapman and Hall, (1993) pp 103-109. The results indicate the in vitro instability of the label, presumably due to the action of protein phosphatases that are ubiquitous in eukaryotic cells.

Es ist darum offensichtlich, dass neue Verfahren der ³²P- und ³³P-Markierung von Targeting Proteinen sehr wünschenswert sind. Insbesondere werden neue Verfahren, wobei die ³²P- oder ³³P-Markierung in vivo stabil ist und die die Bindungsfähigkeiten dieser Proteine nicht beeinträchtigen, benötigt.It is therefore apparent that new methods of ³² P and ³³ P labeling of targeting proteins are highly desirable. In particular, new methods wherein ³² P or ³³ P labeling is stable in vivo and which do not interfere with the binding capabilities of these proteins are needed.

Zusammenfassung der ErfindungSummary the invention

Darum besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, Verfahren zum stabilen Markieren von Targeting Proteinen mit ³²P oder ³³P bereitzustellen.Therefore, it is an object of the invention to provide methods for stably labeling ³² P or ³³ P targeting proteins.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Targeting Proteine bereitzustellen, die mit ³²P oder ³³P stabil markiert und zur Radiotherapie geeignet sind.It is a further object of the invention to provide targeting proteins stably labeled with ³² P or ³³ P and suitable for radiotherapy.

Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von pharmazeutischen Zubereitungen, die ³²P- oder ³³P-markierte Proteine enthalten, zur Radiotherapie von Patienten, die an einem Tumor oder an einer infektiösen Läsion leiden.Still another object of the invention is to provide pharmaceutical preparations containing ³² P- or ³³ P-labeled proteins for radiotherapy of patients suffering from a tumor or an infectious lesion.

Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Testsätzen zur stabilen Markierung von Targeting Proteinen mit ³²P oder ³³P.Yet another object of the invention is to provide kits for the stable labeling of ³² P or ³³ P targeting proteins.

Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Radiotherapieverfahrens für einen Patienten, der an einem Tumor oder einer infektiösen Läsion leidet, wobei ein Targeting Protein, das spezifisch an ein komplementäres Molekül oder eine Struktur, die von einem Tumor oder einer infektiösen Läsion produziert wird oder damit zusammenhängt, bindet und mit ³²P oder ³³P radioaktiv markiert ist, einem menschlichen Patienten, der an dem Tumor oder der infektiösen Läsion leidet, parenteral injiziert wird.Yet another object of the invention is to provide a radiotherapy method for a patient suffering from a tumor or an infectious lesion, wherein a targeting protein specific to a complementary molecule or a structure produced by a tumor or an infectious lesion is or is related, binds and radiolabeled with ³² P or ³³ P, is parenterally injected into a human patient suffering from the tumor or infectious lesion.

Bereitgestellt gemäß diesen Aufgaben werden ein radioaktiv markiertes Targeting Protein der Formel Q-(S)_m-L-NR'-P(O)(OH)Y-R, wobei P das ³²P- oder ³³P-Isotop ist, Q ein Protein ist, das in der Lage ist, spezifisch an eine komplementäre Zielmolekülspezies auf Grund einer Komplementaritäts-bestimmenden Region davon zu binden, L eine Linkergruppierung ist, Y Sauerstoff oder eine Einfachbindung zu R ist oder Y NR'' ist, R, R' und R'' gleich oder verschieden sind und jeweils eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, oder heterozyklische Gruppe, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält, oder Wasserstoff sind, und wobei m 1 oder 2 ist, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon.Provided in accordance with these objects, a radiolabeled targeting protein of the formula Q- (S) _m -L-NR'-P (O) (OH) Y R, wherein P is the ³² P or ³³ P isotope, is a protein which is capable of specifically binding to a complementary target species due to a complementarity determining region thereof, L is a linker moiety, Y is oxygen or a single bond to R, or Y is NR '', R, R 'and R' are the same or different and each represents an optionally substituted straight-chain or branched alkyl, cycloalkyl, aryl, or heterocyclic group containing 1-20 carbon atoms, or hydrogen, and wherein m is 1 or 2, or a physiologically acceptable salt from that.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist Q ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment, und bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Thiolgruppe an Q durch Reduktion einer Disulfidbindung in der Hinge-Region dieses monoklonalen Antikörpers oder Antikörperfragments erzeugt.In a preferred embodiment, Q is a monoclonal antibody or antibody fragment, and in another preferred embodiment, the thiol group on Q is reduced by reduction of a Disulfide bond in the hinge region of this monoclonal antibody or antibody fragment generated.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist L -S-A-, wobei A eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylen- oder zweiwertige heterocyclische Gruppe ist, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält. Bei wieder einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist L -CH₂-CO-BD-, wobei B O, NH ist oder B eine Einfachbindung mit C ist und D eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylen- oder zweiwertige heterocyclische Gruppe ist, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält.In another preferred embodiment, L is -SA-, wherein A is an optionally substituted saturated or unsaturated straight or branched alkylene, cycloalkylene, arylene or divalent heterocyclic group containing 1-20 carbon atoms. In yet another preferred embodiment, L is -CH ₂ -CO-BD- wherein BO, NH is or B is a single bond with C and D is an optionally substituted saturated or unsaturated straight or branched chain alkylene, cycloalkylene, arylene or divalent heterocyclic group containing 1-20 carbon atoms.

Bei wieder einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Lat Yet another preferred embodiment is L

Bei wieder einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist L

wobei E und F gleich oder verschieden sind und jeweils eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylen- oder zweiwertige heterocyclische Gruppe sind, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält. Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist diejenige, bei der E aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

besteht, und F (CH₂)₂ ist.In yet another preferred embodiment, L is

wherein E and F are the same or different and each is an optionally substituted saturated or unsaturated straight or branched alkylene, cycloalkylene, arylene or divalent heterocyclic group containing 1-20 carbon atoms. Yet another preferred embodiment is that in which E is selected from the group consisting of

exists, and F is (CH ₂ ) ₂ .

Bei wieder einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist YR aus der Gruppe, bestehend aus 5'-O-Adenosin, 5'-O-Guanosin, 5'-O-Thymidin, 5'-O-Cytidin, 5'-O-Deoxyadenosin, 5'-O-Deoxyguanosin, 5'-O-Uridin, 5'-O-Deoxycytidin, 5-O-Inosit-1,4-bisphosphat und 5-O-Inosit-1,3,4-triphosphat ausgewählt.at In another preferred embodiment, YR is selected from the group consisting of consisting of 5'-O-adenosine, 5'-O-guanosine, 5'-O-thymidine, 5'-O-cytidine, 5'-O-deoxyadenosine, 5'-O-deoxyguanosine, 5'-O-uridine, 5'-O-deoxycytidine, 5-O-inositol 1,4-bisphosphate and 5-O-inositol 1,3,4-triphosphate.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutische Zubereitung bereitgestellt, die eine wirksame Menge eines radioaktiv markierten Targeting Proteins, wie vorstehend beschrieben, in einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Vehikel umfasst.According to one another embodiment the invention provides a pharmaceutical preparation, an effective amount of a radiolabelled targeting protein, as described above, in a pharmaceutically acceptable sterile vehicle.

Gemäß wieder einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Targeting Proteins durch Zusammenbringen eines Proteins, das in der Lage ist, spezifisch an eine komplementäre Zielmolekülspezies auf Grund einer Komplementaritäts-bestimmenden Region davon zu binden, und das mindestens eine freie Thiolgruppe enthält, mit einem Komplex der Formel L'-NR'-P(O)(OH)Y-R, wobei P das ³²P- oder ³³P-Isotop ist, L' eine Linkergruppe ist, die eine Gruppe enthält, die in der Lage ist, spezifisch mit Thiolgruppen an dem Targeting Protein unter Bildung einer Disulfid- oder Thioetherverknüpfung zu reagieren, Y Sauerstoff oder eine Einfachbindung zu R ist oder Y NR'' ist und R, R' und R'' gleich oder verschieden sind und jeweils eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, oder heterozyklische Gruppe, die 1–20 Kohlenstoffatome enthält, oder Wasserstoff sind, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon, bereitgestellt.According to yet another embodiment of the invention, there is provided a method for producing a radiolabeled targeting protein by contacting a protein capable of specifically binding to a complementary target molecule species due to a complementarity-determining region thereof, and the at least one free thiol group containing a complex of the formula L-NR'-P (O) (OH) Y R, where P is the ³² P or ³³ P isotope, L 'is a linker group containing a group capable of is specifically to react with thiol groups on the targeting protein to form a disulfide or thioether linkage, Y is oxygen or a single bond to R, or Y is NR '' and R, R 'and R''are the same or different and each is optionally substituted straight-chain or branched alkyl, cycloalkyl, aryl, or heterocyclic group containing 1-20 carbon atoms, or are hydrogen, or a physiologically compatible I salt of it, provided.

Gemäß wieder einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit in einem Säuger bereitgestellt, das die Verabreichung an einen Säuger, der dessen bedarf, eines radioaktiv markierten Targeting Proteins, das ein radioaktiv markiertes Targeting Protein, wie vorstehend beschrieben, einschließt, umfasst.According to again a further embodiment The invention provides a method of treating a disease in a mammal which provides for administration to a mammal in need thereof of a radioactive labeled targeting protein, which is a radiolabelled targeting Protein as described above.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Testsatz zur Herstellung eines radioaktiv markierten Targetinsproteins der Formel Q-(S)_m-L-NR'-P(O)(OH)Y-R, das bereits auf den Seiten 4–5 definiert wurde, bereitgestellt, umfassend in geeigneten Behältern (1) ein Präparat eines bifunktionellen Vernetzungsmoleküls, umfassend: eine funktionelle Gruppe oder Gruppe, die eine Gruppe umfasst, die in der Lage ist, spezifisch mit Thiolgruppen an einem Protein unter Bildung einer Disulfid- oder Thioetherverknüpfung zu reagieren, und eine primäre oder sekundäre Amingruppe; (2) ein Targeting Protein, das mindestens eine Thiolgruppe enthält; und (3) mindestens ein Reagens zur Bewirkung der Kopplung zwischen einem Phosphat, Phosphonat oder Phosphoramidat P-OH und der primären oder sekundären Amingruppe.According to another embodiment, there is provided a kit for preparing a radiolabeled target protein of the formula Q- (S) _m -L-NR'-P (O) (OH) Y R, already defined on pages 4-5 in suitable containers (1) a preparation of a bifunctional crosslinking molecule comprising: a functional group or group comprising a group capable of reacting specifically with thiol groups on a protein to form a disulfide or thioether linkage, and a primary or secondary amine group; (2) a targeting protein containing at least one thiol group; and (3) at least one reagent for effecting the coupling between a phosphate, phosphonate or phosphoramidate P-OH and the primary or secondary amine group.

Ausführliche BeschreibungDetailed description

Die vorliegende Erfindung stellt ein einfaches Verfahren zur Markierung von Targeting Proteinen mit ³²P oder ³³P bereit. Eine ³²P- oder ³³P-markierte Phosphatverbindung wird mit einem Linkermolekül gekoppelt, das mit reaktiven Gruppen an dem Targeting Protein konjugiert ist. Die Protein-Phosphor-Verknüpfung ist in vivo sowohl gegen chemischen als auch enzymatischen Abbau stabil. Die markierten Targeting Proteine binden spezifisch an erkrankte Zellen oder erkranktes Gewebe, die durch die Strahlung aus dem ³²P oder ³³P abgetötet werden. Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zubereitungen, die eine wirksame Menge von mindestens einem der erfindungsgemäßen ³²P- oder ³³P-markierten Targeting Proteine in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Vehikel, wie beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences; Drug Receptors Theory, 18. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) beschrieben, umfassen. Die Erfindung umfasst auch Testsätze zur Markierung von Targeting Proteinen, die in einer klinischen Umgebung zweckmäßig und leicht zu verwenden sind.The present invention provides a simple method for labeling ³² P or ³³ P targeting proteins. A ³² P- or ³³ P-labeled phosphate compound is coupled to a linker molecule conjugated to reactive groups on the targeting protein. The protein-phosphorus linkage is stable in vivo against both chemical and enzymatic degradation. The labeled targeting proteins bind specifically to diseased cells or diseased tissue, which are killed by radiation from the ³² P or ³³ P. The invention also includes pharmaceutical compositions containing an effective amount of at least one of the ³² P- or ³³ P-labeled targeting proteins of the present invention in combination with a pharmaceutically acceptable sterile vehicle, such as in Remington's Pharmaceutical Sciences; Drug Receptors Theory, 18th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). The invention also encompasses kits for labeling targeting proteins that are convenient and easy to use in a clinical setting.

Die bei der Erfindung verwendeten Targeting Proteine binden bevorzugt an Zellen und Gewebe, die mit einem Krankheitszustand zusammenhängen und lindern durch Abtöten dieser Zellen oder Gewebe den Krankheitszustand. Dieses Binden erfolgt mit komplementären Molekülen und Strukturen, die mit der Oberfläche der erkrankten Zellen oder des erkrankten Gewebes assoziiert sind oder darauf exprimiert werden, die vorzugsweise nicht mit der Oberfläche von gesunden Zellen assoziiert sind oder darauf exprimiert werden. Typischer sind die komplementären Gruppierungen auf gesunden Zellen jedoch zu einem geringeren Ausmaß als im erkrankten Zustand festgestellt, vorhanden. Beispielsweise zeigen viele Tumore starke Zunahmen in der Expression des epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptors im Vergleich zu normalem Gewebe. ³²P- oder ³³P-markierte Proteine, die auf den EGF-Rezeptor ausgerichtet sind, binden bevorzugt an solche Tumorzellen und führen zu einer hoch wirksamen Konzentration an ³²P oder ³³P und verursachen eine bevorzugte Zell-Abtötung an der Stelle des Tumors. Ein weiteres Beispiel ist das karzinoembryonale Antigen (CEA), das auf der Oberfläche von vielen Tumoren stark exprimiert wird. Ein ³²P- oder ³³P-markierter Antikörper oder ein Antikörperfragment, das an CEA bindet, verursacht eine bevorzugte Zell-Abtötung an der Tumorstelle.The targeting proteins used in the invention preferentially bind to cells and tissues associated with a disease state and relieve the disease state by killing those cells or tissues. This binding occurs with complementary molecules and structures that are associated with or expressed on the surface of the diseased cells or diseased tissue, which are preferably not associated with or expressed on the surface of healthy cells. More typically, however, the complementary moieties on healthy cells are present to a lesser extent than found in the diseased state. For example, many tumors show strong increases in epidermal growth factor (EGF) receptor expression relative to normal tissue. ³² P- or ³³ P-labeled proteins targeting the EGF receptor preferentially bind to such tumor cells and result in a highly effective concentration of ³² P or ³³ P and cause preferential cell killing at the site of the tumor. Another example is carcinoembryonic antigen (CEA), which is highly expressed on the surface of many tumors. A ³² P- or ³³ P-labeled antibody or an antibody fragment that binds to CEA causes preferential cell killing at the tumor site.

Für die Zwecke der chemischen und enzymatischen Reaktivität verhalten sich ³²P- und ³³P-markierte Moleküle identisch. Es ist darum selbstverständlich, dass die Bezugnahme auf Markieren mit ³²P im Anschluss hieran auch das Markieren mit ³³P einschließt.For the purposes of chemical and enzymatic reactivity, ³² P- and ³³ P-labeled molecules behave identically. It is therefore to be understood that reference to ³² P tags following this also includes ³³ P marking.

A. Verfahren zur Herstellung von ³²P-markierten Verbindungen, die zur Kopplung mit Targeting Proteinen geeignet sindA. Methods of Making ³² P-labeled Compounds Suitable for Coupling with Targeting Proteins

Die ³²P-markierten Verbindungen, die an die Targeting Proteine gekoppelt werden sollen, werden durch Verknüpfen einer Gruppierung, die spezifisch mit reaktiven Gruppen an einem Protein reagiert, über eine Phosphoramidat-Verknüpfung mit einem ³²P-Phosphatester hergestellt. Dies erfordert die Herstellung eines bifunktionellen Linkers, der sowohl eine nucleophile Amingruppe zur Ermöglichung der Bildung der Phosphoramidat-Verknüpfung als auch eine Gruppe, die zur Kopplung an das Protein in der Lage ist, enthält.The ³² P-labeled compounds to be coupled to the targeting proteins are prepared by linking a moiety that specifically reacts with reactive groups on a protein via a phosphoramidate linkage with a ³² P phosphate ester. This requires the preparation of a bifunctional linker containing both a nucleophilic amine group to facilitate the formation of the phosphoramidate linkage and a group capable of coupling to the protein.

Der bifunktionelle Linker kann mit dem Protein durch aus der Technik bekannte Mittel gekoppelt werden. Beispielsweise kann ein Linker, der eine aktive Estergruppierung enthält, wie ein N-Hydroxysuccinimidester, zur Kopplung an Lysinreste in dem Protein über eine Amidverknüpfung verwendet werden. Bei einem weiteren Beispiel kann ein Linker, der einen nukleophilen Amin- oder Hydrazinrest enthält, mit Aldehydgruppen gekoppelt werden, die durch glykolytische Oxidation von Protein-Kohlehydratresten erzeugt werden. Siehe US-Patentanmeldung Nr. 08/162,912. Zusätzlich zu diesen direkten Kopplungsverfahren kann der Linker mittels eines intermediären Trägers, wie Aminodextran, indirekt mit dem Protein gekoppelt werden. Siehe beispielsweise US-Patentschrift Nr. 5,057,313. Bei diesen Ausführungsformen stellt die modifizierte Formel Q-NH-L-NR'-P(O)(OH)Y-R die Verknüpfung entweder über Lysin, Kohlehydrat oder einen intermediären Träger dar.Of the bifunctional linker may be linked to the protein by the technique known means are coupled. For example, a linker, containing an active ester moiety, such as an N-hydroxysuccinimide ester, used for coupling to lysine residues in the protein via an amide linkage become. In another example, a linker that is nucleophilic Contains amine or hydrazine radical, Coupled with aldehyde groups by glycolytic oxidation produced by protein carbohydrate residues. See US patent application No. 08 / 162,912. additionally For these direct coupling methods, the linker can be identified by means of a intermediate support such as aminodextran, are indirectly coupled to the protein. Please refer For example, U.S. Patent No. 5,057,313. In these embodiments the modified formula Q-NH-L-NR'-P (O) (OH) Y-R represents the linkage via either lysine, Carbohydrate or an intermediate Carrier.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Linker mit freien Thiolresten in dem Protein ortsselektiv gekoppelt. Gruppierungen, die zur selektiven Kopplung an Thiolgruppen an Proteinen geeignet sind, sind aus der Technik gut bekannt. Beispiele umfassen Disulfid-Verbindungen, α-Halogencarbonyl- und α-Halogencarboxyl-Verbindungen und Maleimide. Wenn eine nukleophile Aminfunktion in dem gleichen Molekül wie eine α-Halogencarbonyl- oder -carboxylgruppe vorhanden ist, besteht die Möglichkeit, dass die Zyklisierung über eine intramolekulare Alkylierung des Amins erfolgt. Verfahren zur Verhinderung dieses Problems sind dem Fachmann gut bekannt, beispielsweise Herstellen von Molekülen, wobei die Amin- und α-Halogenfunktionen durch starre Gruppen, wie Arylgruppen oder Transalkene, die die unerwünschte Zyklisierung stereochemisch ungünstig machen, getrennt sind. Ein Beispiel für einen α-Halogencarboxyl-Linker, der für die Praxis der Erfindung geeignet ist, ist Succinimidyl-4-(iodacetylamido)benzoat (1).at a preferred embodiment For example, the linker becomes site selective with free thiol residues in the protein coupled. Groups that are selective for coupling to thiol groups are suitable for proteins are well known in the art. Examples include disulfide compounds, α-halocarbonyl and α-halo-carboxylic compounds and maleimides. If a nucleophilic amine function in the same molecule like an α-halocarbonyl or carboxyl group, it is possible to that the cyclization over a intramolecular alkylation of the amine takes place. Method of prevention This problem is well known to those skilled in the art, for example manufacturing of molecules, wherein the amine and α-halogen functions by rigid groups, such as aryl groups or transalkenes, which inhibit the unwanted cyclization stereochemically unfavorable make, are separated. An example of an α-halo-carboxyl linker, the for the Practice of the invention is succinimidyl-4- (iodoacetylamido) benzoate (1).

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die thiol-selektive Kopplungsgruppierung ein Maleimid. Maleimid-enthaltende Linker sind aus der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise Wong, "CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING" (CRC Press, Boca Raton, 1991) S. 152–164. Mehrere geeignete Maleimid-Verbindungen sind von der Fa. Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) im Handel erhältlich. Beispiele für diese Verbindungen sind SMCC (2), SMPB (3), MBS (4) und EMCS (5).at a preferred embodiment The present invention is the thiol-selective coupling moiety a maleimide. Maleimide-containing linkers are well-known in the art known. For example, see Wong, "CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING "(CRC Press, Boca Raton, 1991) pp. 152-164. Several suitable maleimide compounds are commercially available from Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). examples for these compounds are SMCC (2), SMPB (3), MBS (4) and EMCS (5).

Die Maleimid-enthaltenden, aus der Technik bekannten Linker enthalten nicht die nukleophile Amingruppe, die bei der vorliegenden Erfindung erforderlich ist. Somit muss, wenn bekannte Linker verwendet werden sollen, die Aminfunktion eingeführt werden. Die meisten aus der Technik bekannten Linker, einschließlich der Verbindungen (1)–(5), enthalten eine Gruppe, typischerweise ein N-Hydroxysuccinimidester, die vorzugsweise mit einem Amin unter Bildung einer Amidfunktion reagiert. Die Reaktion des Linkers mit einer Diamin-Verbindung dient darum der Einführung der gewünschten Aminofunktion. Beispielsweise ergibt die Reaktion von SMCC mit Ethylendiamin die Verbindung (6), die eine Thiol-spezifische Maleimidgruppe und eine nukleophile Amingruppe enthält. Die Verwendung eines Diamin-Überschusses dient der Verhinderung der Bildung von vernetzten Maleimiden, die durch die Reaktion von zwei SMCC-Molekülen mit einer einzigen Diamingruppe gebildet werden. Diamine, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen Verbindungen, wobei die beiden Aminogruppen über eine geradkettige oder verzweigte Alkyl- oder Zykloalkylgruppe, die bis zu 20 Kohlenstoffe enthält, oder über eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe verknüpft sind.The Containing maleimide-containing linkers known in the art not the nucleophilic amine group used in the present invention is required. Thus, if known linkers must be used should be introduced, the amine function become. Most linkers known in the art, including the Compounds (1) - (5), contain a group, typically an N-hydroxysuccinimide ester, preferably with an amine to form an amide function responding. The reaction of the linker with a diamine compound serves therefore the introduction the desired Amino function. For example, the reaction of SMCC with ethylenediamine Compound (6) containing a thiol-specific maleimide group and contains a nucleophilic amine group. The use of a diamine excess serves to prevent the formation of crosslinked maleimides, which by the reaction of two SMCC molecules with a single diamine group be formed. Diamines for which are suitable for use in the present invention The person skilled in the art and include compounds, the two Amino groups via a straight-chain or branched alkyl or cycloalkyl group, containing up to 20 carbons, or over a substituted or unsubstituted aryl group are linked.

Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann der gewünschte bifunktionelle Linker durch Umsetzung eines einfach geschützten Diamins mit Maleinsäureanhydrid unter Bildung eines Maleimid und anschließende Entschützung des Amins synthetisiert werden. Diese Reaktion ist in Reaktionsschema I, nachstehend, erläutert. Die Aminschutzgruppe ist vorzugsweise eine Butoxycarbonyl (Boc)-Gruppe, die durch Behandlung mit Trifluoressigsäure entfernt wird. Das mono-Boc-geschützte Diamin wird vorzugsweise durch Umsetzung eines Überschusses eines Diamins mit Dibutyldicarbonat hergestellt. Die zur Kopplung mit bekannten Linkern, wie vorstehend beschrieben, geeigneten Diamine sind ebenfalls zur Verwendung in Reaktionsschema I geeignet. Schema I

Reaktionsschema I In an alternative preferred embodiment, the desired bifunctional linker can be synthesized by reacting a monoprotected diamine with maleic anhydride to form a maleimide and then deprotecting the amine. This reaction is illustrated in Reaction Scheme I, below. The amine protecting group is preferably a butoxycarbonyl (Boc) group which is removed by treatment with trifluoroacetic acid. The mono-Boc-protected diamine is preferably prepared by reacting an excess of a diamine with dibutyl dicarbonate. The diamines suitable for coupling with known linkers as described above are also suitable for use in Reaction Scheme I. Scheme I

Reaction scheme I

Nach Herstellung des bifunktionellen Linkers muss er unter Bildung einer Verknüpfungsverbindung, die eine Phosphoramidatbindung enthält, mit einer reaktiven ³²P-Verbindung gekoppelt werden. Die Erfindung kann mit jeder P^III oder P^V Phosphorverbindung ausgeführt werden, die in der Lage ist, eine Phosphoramidatbindung zu bilden, die unter in vivo Bedingungen stabil ist und nur durch die käufliche Verfügbarkeit von ³²P- oder ³³P-markierten Materialien beschränkt ist. Käuflich verfügbare Radiophosphorverbindungen sind derzeit auf ³²P-markierte Nucleosid Mono-, Di-, und Triphosphate, Inositphosphate, Phosphorsäure und Natriumphosphat und ³³P-markierte Nukleosidtriphosphate und Phosphorsäure beschränkt, jedoch ist es die Absicht der Erfinder, dass die vorliegende Erfindung die Verwendung aller geeigneten neuen ³²P- oder ³³P-markierten Verbindungen einschließt, die verfügbar werden.Upon production of the bifunctional linker, it must be coupled to a reactive ³² P compound to form a linking compound containing a phosphoramidate linkage. The invention can be practiced with any P ^III or P ^V phosphorus compound capable of forming a phosphoramidate linkage that is stable under in vivo conditions and limited only by the commercial availability of ³² P- or ³³ P-labeled materials , Commercially available radiophosphorus compounds are currently limited to ³² P-labeled nucleoside mono-, di- and triphosphates, inositol phosphates, phosphoric acid and sodium phosphate, and ³³ P-labeled nucleoside triphosphates and phosphoric acid, however, it is the intention of the inventors that the present invention contemplates the use of all suitable new ³² P- or ³³ P-labeled compounds that become available.

Geeignete Verfahren, die P^III-Verbindungen zur Bildung der Phosphoramidatbindung verwenden, sind aus der Technik gut bekannt. Beispielsweise wird die Phosphoramidatbindung mit dem bifunktionellen Linker durch oxidatives Koppeln des Linker-Amins mit einem Phosphittriester in Gegenwart von Iod (Jager et al., Biochem. 27:7237 (1988)) oder Tetrachlorkohlenstoff/Pyridin (Froehler et al., Nucl. Acids. Res. 14:3487 (1986); id. 16:4831 (1988)) gebildet. Die Verwendung von β-Cyanoethylphosphitestern gestattet die anschließende selektive Entschützung der Ester unter mild basischen Bedingungen, die die Maleimidgruppierung nicht beeinflussen.Suitable methods using P ^III compounds to form the phosphoramidate linkage are well known in the art. For example, phosphoramidate linkage with the bifunctional linker is achieved by oxidative coupling of the linker amine with a phosphite triester in the presence of iodine (Jager et al., Biochem 27: 7237 (1988)) or carbon tetrachloride / pyridine (Froehler et al., Nucl Res. 14: 3487 (1986); id. 16: 4831 (1988)). The use of β-cyanoethyl phosphite esters allows the subsequent selective deprotection of the esters under mildly basic conditions which do not affect the maleimide moiety.

Verfahren zur Kopplung von Aminen an Phosphate unter Bildung von Phosphoramidaten sind dem Fachmann gut bekannt. Alle bekannten Verfahren umfassen die vorübergehende Aktivierung der Phosphatgruppe durch Umwandlung von einer der Phosphatsauerstoffgruppen in eine Abgangsgruppe, die durch das Amin verdrängt wird. Die Kopplung kann unter Verwendung von Triphenylphosphin und Dipyridyldisulfid als Kopplungsmittel durchgeführt werden, währenddessen ein Phosphat-Sauerstoff durch die Bildung einer Bindung mit dem Phosphoratom des Triphenylphosphins aktiviert wird. Siehe beispielsweise Greene et al., Nucl. Acids Res. 2:1123 (1975). Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kopplung unter Verwendung eines Carbodiimids als Kopplungsmittel durchgeführt. Siehe Moffat et al., J. Amer. Chem. Soc. 83:649 (1961); Bergstrom et al., Biochim et Biophys. Acta 1061:95 (1991); Ohtsuka et al., Nucl. Acids Res. 3:653 (1976). Das Carbodiimid ist vorzugsweise ein wasserlösliches Carbodiimid, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC), das von der Fa. Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) erhältlich ist. Die Reaktion wird durch Mischen des ³²P-markierten Phosphats mit dem bifunktionellen Linker und Carbodiimid in einem stöchiometrischen Verhältnis in einem wässrigen Lösungsmittel durchgeführt. Nach 1–2 h (die Reaktionsdauer ist unkritisch) wird das Gemisch direkt zur Kopplung mit dem Targeting Protein eingesetzt. Die Wahl des Lösungsmittels ist unkritisch, allerdings müssen die Reaktanten in ihm löslich sein, es darf nicht in die Reaktion eingreifen und muss für den Protein-Verknüpfungsschritt mit Wasser mischbar sein. Bevorzugte Lösungsmittel umfassen DMF, DMSO und Butylalkohol. Die Reaktion von Adenosinmonophosphat mit der verknüpfenden Verbindung (6) ist in Reaktionsschema II gezeigt und dient der Erläuterung der Kopplungsreaktion. Die Nebenprodukte der Reaktion brauchen in diesem Stadium nicht entfernt zu werden, da sie während des schnellen Reinigungsschrittes nach dem Verknüpfen der radioaktiv-markierten Verbindung mit dem Targeting Protein entfernt werden. Schema II

Reaktionsschema II Methods for coupling amines to phosphates to form phosphoramidates are well known to those skilled in the art. All known methods involve the transient activation of the phosphate group by conversion of one of the phosphate oxygen groups to a leaving group displaced by the amine. The coupling can be carried out using triphenylphosphine and dipyridyl disulfide as the coupling agent, during which a phosphate oxygen is activated by the formation of a bond with the phosphorus atom of triphenylphosphine. See, for example, Greene et al., Nucl. Acids Res. 2: 1123 (1975). In a preferred embodiment, the coupling is carried out using a carbodiimide coupling agent. See Moffat et al., J. Amer. Chem. Soc. 83: 649 (1961); Bergstrom et al., Biochim et Biophys. Acta 1061: 95 (1991); Ohtsuka et al., Nucl. Acids Res. 3: 653 (1976). The carbodiimide is preferably a water-soluble carbodiimide such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) available from Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). The reaction is carried out by mixing the ³² P-labeled phosphate with the bifunctional linker and carbodiimide in a stoichiometric ratio in an aqueous solvent. After 1-2 h (the reaction time is not critical), the mixture is used directly for coupling with the targeting protein. The choice of solvent is not critical, but the reactants must be soluble in it, it must not interfere with the reaction and must be miscible with water for the protein-linking step. Preferred solvents include DMF, DMSO and butyl alcohol. The reaction of adenosine monophosphate with the linking compound (6) is shown in Reaction Scheme II and serves to illustrate the coupling reaction. The by-products of the reaction need not be removed at this stage as they are removed during the rapid purification step after linking the radiolabelled compound to the targeting protein. Scheme II

Reaction scheme II

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Phosphat aus ³²P-markiertem Adenosin-5'-monophosphat, Thymidin-5'-monophosphat, Guanosin-5'-monophosphat, Cytosin-5'-monophosphat, Uridin-5'-monophosphat, und Inosit-1-monophosphat ausgewählt, wovon alle von DuPont-NEN (Boston, MA), Amersham International (Airlington Heights, IL) oder ICN (Costa Mesa, CA) erhältlich sind.In a preferred embodiment, the phosphate is selected from ³² P-labeled adenosine 5'-monophosphate, thymidine 5'-monophosphate, guanosine 5'-monophosphate, cytosine 5'-monophosphate, uridine 5'-monophosphate, and inositol 1-monophosphate, all of which are available from DuPont-NEN (Boston, MA), Amersham International (Airlington Heights, IL) or ICN (Costa Mesa, CA).

Die Erfindung kann auch mit Phosphonaten durchgeführt werden, die in der Lage sind, stabile Amidophosphonat-Verbindungen zu bilden. Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Kopplung von Aminen mit Phosphatverbindungen können auch zur Herstellung von Amidophosphonaten verwendet werden.The Invention can also be performed with phosphonates that are capable are to form stable amidophosphonate compounds. The above described method for the coupling of amines with phosphate compounds can also be used for the preparation of amidophosphonates.

B. Kopplung von ³²P-markierten Verbindungen mit dem Targeting ProteinB. Coupling of ³² P-labeled Compounds with the Targeting Protein

Die erfindungsgemäßen Targeting Proteine umfassen jedes Protein, das mit Spezifität an Moleküle oder Gewebestrukturen bindet, die krankheitsbeteiligt sind. Beispiele für solche Targeting Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Antikörper und Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern, Lymphokine, Cytokine und Peptidwachstumsfaktoren; und Lymphokin- oder Cytokin-Rezeptorantagonisten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Targeting Protein ein monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment eines monoklonalen Antikörpers.The Targeting according to the invention Proteins include any protein that has specificity to molecules or proteins Tissue structures binds that are disease-involved. Examples for such Targeting proteins include, but are not limited to: antibody and antigen-binding fragments of antibodies, lymphokines, cytokines and peptide growth factors; and lymphokine or cytokine receptor antagonists. In a preferred embodiment For example, the targeting protein is a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment a monoclonal antibody.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Targeting Protein Thiolgruppen, die mit den ³²P-markierten, wie vorstehend beschrieben hergestellten Verbindungen reagieren können. Die Thiolgruppe kann als Cysteinrest vorhanden sein oder kann entweder über die Reduktion von Disulfid (Cystin)-Resten oder über die Thiolierung des Proteins eingebaut werden. Die Thiolierung von Proteinen wird leicht durch aus der Technik gut bekannte Verfahren erreicht. Beispielsweise können Lysinreste mit Traut's Reagens (2-Iminothiolan) unter Bildung freier Thiolreste an dem Protein reagieren. Alternativ kann das Protein durch die in der US-Patentanmeldung Nr. 08/253,772 beschriebenen Verfahren thioliert werden.In a preferred embodiment, the targeting protein contains thiol groups that can react with the ³² P-labeled compounds prepared as described above. The thiol group may be present as a cysteine residue or may be incorporated either via the reduction of disulfide (cystine) residues or through the thiolation of the protein. The thiolation of proteins is readily accomplished by methods well known in the art. For example, lysine residues can react with Traut's reagent (2-iminothiolane) to form free thiol residues on the protein. Alternatively, the protein can be thiolated by the methods described in US Patent Application No. 08 / 253,772.

In vielen Fällen ist die Aminosäuresequenz des Proteins zugänglich, und es kann somit leicht eine Bestimmung vorgenommen werden, ob ein Cystein- oder Lysinrest oder eine Disulfidbindung zur Derivatisierung des Proteins durch Konjugation mit dem markierenden Mittel verwendet werden kann. In einigen Fällen müssen allerdings die Thiolierung, die Disulfidreduktion und die direkten Kopplungsreaktionen alle empirisch getestet werden, um den bestmöglichen Weg zu bestimmen. Das Ausmaß der Konjugation kann leicht durch Messen der pro Gewicht Protein gebundenen Radioaktivität nach dem Abtrennen des Proteins von dem Markierungsreagens über Größenausschlusshromatographie bestimmt werden.In many cases, the amino acid sequence of the protein is accessible, and thus a determination can easily be made whether a cysteine or lysine residue or a disulfide bond for derivatization of the protein can be used by conjugation with the labeling agent. In some cases, however, thiolation, disulfide reduction, and direct coupling reactions must all be tested empirically to determine the best possible pathway. The extent of conjugation can be readily determined by measuring the radioactivity bound per weight of protein after separating the protein from the labeling reagent via size exclusion chromatography.

Der häufigste Fall, wobei die Aminosäuresequenz des Targeting Proteins unbekannt ist, liegt dann vor, wenn das Targeting Protein ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment ist. In solchen Fällen allerdings tragen die Strukturmerkmale der Antikörper in der Praxis der Erfindung zu einem besonderen Vorteil bei. Antikörpermoleküle bestehen aus 2 identischen Kopien von schweren Ketten und leichten Ketten, die über Disulfidbindungen kovalent aneinander gebunden sind. Für eine allgemeine Diskussion siehe Schultz et al., "Proteins II: Structure-Function Relationship of Protein Families", in TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 3. Ausg., T.M. Devlin (Hrsg.), Wiley & Sons, S. 92–134 (1992); Turner et al., "Antigen Receptor Molecules," in IMMUNOLOGY, 3. Ausg., Roitt et al., (Hrsg.), Mosby, S. 4.1–4.20 (1993). Die Carboxyl-terminale einer Hälfte der leichten Ketten und die Carboxyl-terminalen Dreiviertel der schweren Ketten sind in der Aminosäuresequenz unter den Antikörpern mit verschiedenen Antigen-Spezifitäten hoch konserviert und werden als "konstante Regionen" bezeichnet. Im Gegensatz dazu sind die restlichen Regionen der leichten und der schweren Ketten unter den Antikörpern mit verschiedenen Antigen-Spezifitäten hochvariabel. Bestimmte Regionen innerhalb dieser variablen Abschnitte bilden die Antigen-bindende Stelle, die zu der Topologie der Antigenstruktur komplementär ist.Of the common Case, wherein the amino acid sequence of the targeting protein is unknown, if the targeting Protein is a monoclonal antibody or an antibody fragment is. In such cases however, the structural features of the antibodies are in the practice of the invention to a special advantage. Antibody molecules consist of 2 identical ones Copies of heavy chains and light chains via disulfide bonds covalently bonded to each other. For a general discussion see Schultz et al., "Proteins II: Structure-Function Relationship of Protein Families ", in TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS, 3rd ed., T.M. Devlin (ed.), Wiley & Sons, Pp. 92-134 (1992); Turner et al., "Antigen Receptor Molecules, "in IMMUNOLOGY, 3rd Ed., Roitt et al., (Ed.), Mosby, pp. 4.1-4.20 (1993). The carboxyl-terminal one half the light chains and the carboxyl-terminal three-quarters of the Heavy chains are among the antibodies in the amino acid sequence different antigen specificities highly conserved and are called "constant Regions ". In contrast, the remaining regions are the light and Of the heavy chains among the antibodies with different antigen specificities highly variable. Certain regions within these variable sections form the antigen-binding site leading to the topology of the antigenic structure complementary is.

Die proteolytische Spaltung kann angewandt werden, um einen Antikörper in kleine funktionelle Einheiten zu fragmentieren. Beispielsweise spaltet die proteolytische Spaltung eines IgG-Moleküls mit Papain den Antikörper in das Hinge-Peptid jeweils der schweren Kette und erzeugt ein nicht Antigen-bindendes "Fc"-Fragment, das aus der C-terminalen Hälfte der schweren Ketten aufgebaut ist, und ein identischen Paar von Antigen-bindenden "Fab"-Fragmenten, die aus einem Amino-terminalen Abschnitt einer schweren Kette, der eine vollständige leichte Kette beigefügt ist, bestehen. Die Fab-Fragmente können das Antigen mit einer derjenigen des intakten Antikörpermoleküls entsprechenden Affinität binden.The Proteolytic cleavage can be used to target an antibody to fragment small functional units. For example, splits the proteolytic cleavage of an IgG molecule with papain the antibody in the hinge peptide of each heavy chain and does not produce one Antigen-binding "Fc" fragment that is out the C-terminal half the heavy chain is built, and an identical pair of Antigen-binding "Fab" fragments consisting of an amino-terminal Section of a heavy chain attached to a complete light chain, consist. The Fab fragments can the antigen corresponding to one of those of the intact antibody molecule affinity tie.

Antikörper enthalten in der Hinge-Region mindestens 2 Disulfidbindungen, die die beiden schweren Ketten verknüpfen, sowie Disulfid-Bindungen, die die leichten und schweren Ketten miteinander verbinden. Die Hinge-Region-Disulfid-Bindungen sind im Allgemeinen für Disulfid-Reduktionsmittel zugänglicher und können normalerweise selektiv gespalten werden. Mit der Maßgabe, dass die Reduktion unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen durchgeführt wird, behalten die reduzierten Fragmente ihre Immunspezifität und Fähigkeit zum Binden an Antigen bei. Da zudem Sulfhydrylgruppen, die in der Hinge-Region eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments erzeugt worden sind, von der Antigen-bindenden Stelle sterisch entfernt liegen, beeinträchtigt die Kopplung von Chelat-Bildnern mit diesen Gruppen nicht die Bindungsaktivität des Antikörpers. Die Reduktion eines Antikörpers oder F(ab')₂-Fragments mit bekannten Disulfidbindung-Reduktionsmitteln, beispielsweise Dithiothreitol, Cystein, Mercaptoethanol und dergleichen, ergibt, gemäß Analyse, nach kurzer Zeit, typischerweise weniger als 1 h, einschließlich Reinigung, einen Antikörper mit 1–10 freien Sulfhydrylgruppen. Es ist zu beachten, dass, wenn die reduzierenden Bedingungen zu drastisch sind oder das Reduktionsmittel zu lange mit den Fragmenten in Kontakt belassen wird, gegebenenfalls die normalerweise weniger reaktiven Disulfidbindungen, die die leichten und die schweren Ketten verknüpfen, reduziert werden, mit nachteiligen Auswirkungen auf die Bindungseigenschaften des Antikörpers. Die sorgfältig kontrollierte Reduktion von Antikörpern führt zu der bevorzugten Reduktion von Disulfidbindungen in der Hinge-Region des Antikörpers, und die resultierenden Cysteinreste können sodann für die erfindungsgemäße Konjugationsreaktion eingesetzt werden.Antibodies in the hinge region contain at least 2 disulfide bonds linking the two heavy chains, as well as disulfide bonds connecting the light and heavy chains. The hinge-region disulfide bonds are generally more accessible to disulfide reducing agents and can normally be selectively cleaved. Provided the reduction is carried out under carefully controlled conditions, the reduced fragments retain their immunospecificity and ability to bind to antigen. In addition, since sulfhydryl groups generated in the hinge region of an antibody or an antibody fragment are sterically remote from the antigen-binding site, the coupling of chelating agents with these groups does not interfere with the binding activity of the antibody. Reduction of an antibody or F (ab ') ₂ fragment with known disulfide bond reducing agents, for example, dithiothreitol, cysteine, mercaptoethanol and the like, results in an antibody of 1, after analysis, after a short time, typically less than 1 h, including purification -10 free sulfhydryl groups. It should be noted that if the reducing conditions are too drastic or the reducing agent is left in contact with the fragments too long, the normally less reactive disulfide bonds linking the light and heavy chains may be adversely affected the binding properties of the antibody. The carefully controlled reduction of antibodies leads to the preferential reduction of disulfide bonds in the hinge region of the antibody, and the resulting cysteine residues can then be used for the conjugation reaction of the invention.

Wenn das Targeting Protein durch DNA-Rekombinationsmittel erzeugt werden kann, kann durch Mutagenese des Gens, das die Aminosäuresequenz des Proteins codiert, eine zur Konjugation geeignete Stelle eingebracht werden. Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese von Genen sind aus der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise Ausubel et al., (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1987), Kap. 15.7, und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Typischerweise bringt die Mutation mindestens einen Cysteinrest in das Targeting Protein an einer Stelle beabstandet von der für die Targeting-Aktivität des Proteins erforderlichen Region ein. Werden mehrere Cysteinreste durch die vorstehend beschriebenen Verfahren gentechnisch in das Targeting Protein eingebracht, kann die Konjugation des Targeting Proteins mit einer Mehrzahl von ³²P-markierten Mitteln erreicht und somit die spezifische Aktivität (Radioaktivität/Mol Protein) des Proteins gesteigert werden. Alternativ kann das durch DNA-Rekombinationsmittel produzierte Protein ein IgG₃- oder IgG₃-artiges Gerüst aufweisen. Ein solches Gerüst mit mehreren Hinge-Region-Disulfidbindungen ist besonders reduktiven Verfahren zugänglich, um eine Vielzahl von freien Thiolgruppen zu erzeugen. Dies ist zur Abgabe der größtmöglichsten Dosis an Radioaktivität an eine erkrankte Zelle oder ein erkranktes Gewebe zweckmäßig.If the targeting protein can be produced by recombinant DNA, a site suitable for conjugation can be introduced by mutagenesis of the gene encoding the amino acid sequence of the protein. Methods for site-directed mutagenesis of genes are well known in the art. See, for example, Ausubel et al., (Ed.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1987), Ch. 15.7, and Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Typically, the mutation introduces at least one cysteine residue into the targeting protein at a location spaced from the region required for the targeting activity of the protein. When several cysteine residues are genetically engineered into the targeting protein by the methods described above, conjugation of the targeting protein to a variety of ³² P-labeled agents can be achieved, thus increasing the specific activity (radioactivity / mole of protein) of the protein. Alternatively, the protein produced by recombinant DNA may have an IgG ₃ or IgG ₃ like skeleton. Such a framework with several hinge re Gion disulfide bonds are particularly accessible to reductive processes to generate a variety of free thiol groups. This is useful for delivering the highest possible dose of radioactivity to a diseased cell or diseased tissue.

Die Kopplungsreaktion wird durch Mischen des Markierungsmittels und des Targting Proteins in einem geeigneten Puffer und durch ein Ablaufenlassen der Reaktion bis zur Vollständigkeit durchgeführt. Zum Erreichen eines stöchiometrischen Markierens des Proteins kann das Markierungsmittel in einem ein- bis zweifachen Überschuss verwendet werden. Geeignete Puffer zur Durchführung der Kopplungsreaktion sind aus der Technik gut bekannt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Puffer eine Phosphat-gepufferte Salzlösung. Der Reaktionsablauf wird zweckmäßigerweise unter Verwendung einer HPLC-Größenausschlusssäule mit einem online Strahlungsdetektor überwacht. Die Radioaktivitätsverschiebung von dem Markierungsmittel auf das Protein zeigt die erfolgreiche Konjugation an. Das Protein kann auch auf die Gegenwart von restlichen nicht umgesetzten Thiolgruppen durch Umsetzung mit Ellman's Reagens getestet werden.The Coupling reaction is by mixing the marker and of the targting protein in a suitable buffer and drained the reaction to the point of completeness carried out. To reach a stoichiometric Labeling of the protein, the labeling agent can be prepared in a up to double the surplus be used. Suitable buffers for carrying out the coupling reaction are well known in the art. In a preferred embodiment the buffer is a phosphate-buffered one Saline. The course of the reaction is expediently using an HPLC size exclusion column with monitored by an online radiation detector. The radioactivity shift from the labeling agent to the protein shows the successful Conjugation. The protein also can not respond to the presence of residual reacted thiol groups by reaction with Ellman's reagent become.

Wenn die Konjugation vollständig ist, wird das markierte Protein von dem Markierungsmittel-Überschuss durch Größenausschlusschromatographie, beispielsweise über ein Sephadex G-50-80-Harz in einer Spinsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ), abgetrennt. Das Ausmaß der Markierung wird durch Bestimmen der spezifischen Radioaktivität des Proteins, d. h. der Radioaktivität pro mg Protein, und durch ihren Vergleich mit dem Wert, der auf der Basis der spezifischen Aktivität des Markierungsmittels, des Molekulargewichts des Proteins und der Anzahl der für die Konjugation verfügbaren Thiolgruppen berechnet wird, gemessen. Die chemische Reinheit des markierten Proteins kann unter Anwendung von Größenaussschluss-HPLC, beispielsweise einer BioSil 250-Säule (Biorad, Hercules, CA), unter Verwendung von UV-Detektion bestimmt werden. Die UV-Detektionsspur kann mit der Spur verglichen werden, die von einem online Radioaktivitätsdetektor während der gleichen Abtrennung hervorgerufen wird.If complete the conjugation is the labeled protein from the marker excess by size exclusion chromatography, for example about a Sephadex G-50-80 resin in a spin column (Pharmacia, Piscataway, NJ), separated. The extent of Labeling is performed by determining the specific radioactivity of the protein, d. H. the radioactivity per mg of protein, and by their comparison with the value on the basis of the specific activity of the marker, the Molecular weight of the protein and the number of conjugation available Thiol groups is calculated. The chemical purity of the labeled protein may be prepared using size exclusion HPLC, such as BioSil 250 column (Biorad, Hercules, CA), using UV detection become. The UV detection track can be compared to the track, that of an online radioactivity detector during the same separation is caused.

In sämtlichen Fällen darf die Konjugation des Proteins die Targeting-Aktivität des Proteins nicht nachteilig beeinflussen. In vielen Fällen wurden aus dem Targeting Protein mutierte Proteine mit voller Targeting Fähigkeit hergestellt, was diejenigen Regionen des Moleküls angibt, die für die Targeting Fähigkeit essentiell sind. Ob eine geeignete Konjugationsstelle in eine solche Region fällt oder ob es bekannt ist, dass die Disulfid-Reduktion ein Targeting Protein inaktiv macht, wird zur Steuerung dafür angewandt, welcher bestimmte Weg zur Konjugation anzuwenden ist.In all make The conjugation of the protein may be the targeting activity of the protein not adversely affect. In many cases were from the targeting Protein mutant proteins with full targeting ability produced what those Regions of the molecule indicating that for the targeting ability are essential. Whether a suitable conjugation site in such Region falls or whether it is known that the disulfide reduction is a targeting Making protein inactive is used to control which particular pathway is to be used for conjugation.

Wenn das Targeting Protein ein Antikörper oder ein Antikörperfragment ist, das durch die vorstehend beschriebene Verfahrensweise reduziert wurde, sind die neu freigelegten Thiolgruppen von der Antigen-bindenden Stelle des Antikörpers räumlich entfernt, und darum kann vorausgesagt werden, dass die Konjugation mit den markierenden Mitteln die Bindungsaktivität des Antikörpers nicht nachteilig beeinflusst.If the targeting protein is an antibody or an antibody fragment that is reduced by the procedure described above was the newly released thiol groups from the antigen-binding Site of the antibody spatial removed, and therefore it can be predicted that the conjugation with the labeling agents do not adversely affect the binding activity of the antibody.

In sämtlichen Fällen ist es bevorzugt, dass bei der Konjugation die Retention der Bindungaktivität des Targeting Proteins empirisch bestätigt wird. Dies erfolgt durch Messen der Bindungsaktivität des Proteins vor und nach der Konjugation und durch Vergleich der Ergebnisse. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gibt die postkonjugative Bindungsaktivität von 70 % oder mehr der präkonjugativen Aktivität eine annehmbare Bindungsretention an. Verfahren zum quantitativen Messen der Bindungsaktivität von Targeting Proteinen sind aus der Technik gut bekannt. Wenn beispielsweise das Targeting Protein ein Wachstumsfaktor ist, können Standardzellkulturtests der Wachtumsfaktoraktivität angewandt werden. Wenn das Targeting Protein ein rekombinanter Antikörper ist, können aus der Technik gut bekannte Verfahren zum Messen der Antikörperaffinität angewandt werden, wie ein quantitativer ELISA-Test.In all make it is preferred that in conjugation retention of binding activity of targeting Protein empirically confirmed becomes. This is done by measuring the binding activity of the protein before and after conjugation and by comparing the results. For the Purpose of the present invention is the post-conjugative binding activity of 70 % or more of the preconjugative activity an acceptable binding retention. Procedure for quantitative Measuring the binding activity Targeting proteins are well known in the art. If, for example The targeting protein is a growth factor, standard cell culture tests the growth factor activity be applied. If the targeting protein is a recombinant antibody, can method well known in the art for measuring antibody affinity like a quantitative ELISA test.

Einfache Testsätze zur Targeting-Protein-Markierung, um das bereits auf den Seiten 4–5 definierte radioaktiv markierte Targeting Protein der Formel Q-(S)m-L-NR'-P(O)(OH)Y-R zu erhalten, können zur leichteren Durchführung der Erfindung in einer klinischen Einrichtung oder in einer Forschungseinrichtung ohne das Erfordernis einer hoch komplizierten Laborausrüstung hergestellt werden. Das Targeting Protein wird in einem zur Kopplung geeigneten Format, wie vorstehend beschrieben, wie durch Thiolierung oder Disulfid-Reduktion, sofern notwendig, hergestellt. Das Markierungsprotein wird vorzugsweise in gefrorener oder lyophylisierten Form in einem Röhrchen bereitgestellt, dessen Inhalt unter Vakuum oder unter einer Inertatmosphäre gehalten wird, um sicherzustellen, dass die freien Thiolgruppen nicht oxidiert werden. Das Röhrchen ist vorzugsweise mit einem luftdichten Septumverschluss oder mit anderen Mitteln verschlossen, durch die Lösungen durch Injektion steril oder halbsteril zugesetzt werden können. In einigen Fällen kann ein Tangeting Protein, welches Disulfidbindungen enthält, in unreduzierter Form zusammen mit Reduktionsmittel und einem einfachen Protokoll zur Durchführung der Reduktion und Reinigung, wie vorstehend beschrieben, bereitgestellt werden. In solchen Fällen werden Reinigungsmaterialien, wie Größenausschluss-Spinsäulen, wie Sephadex G-50-80-Spinsäulen (Pharmacia), zusammen mit dem Testsatz bereitgestellt.Simple targeting protein labeling assays to obtain the radiolabelled targeting protein of the formula Q- (S) mL -NR'-P (O) (OH) YR, already defined on pages 4-5, may be used to facilitate their performance of the invention in a clinical facility or in a research facility without the need for highly complex laboratory equipment. The targeting protein is prepared in a coupling-suitable format as described above, such as by thiolation or disulfide reduction, if necessary. The labeling protein is preferably provided in frozen or lyophilized form in a tube, the contents of which are kept under vacuum or under an inert atmosphere to ensure that the free thiol groups are not oxidized. The tube is preferably closed with an airtight septum closure or other means by which solutions may be added by injection sterile or semi-sterile. In some cases, a tangling protein containing disulfide bonds may be provided in unreduced form along with reducing agent and a simple protocol for carrying out the reduction and purification as described above. In such cases, cleaning materials, such as size exclusion spin columns, such as Sephadex G-50-80 spin columns (Pharmacia), provided with the kit.

Der Testsatz enthält auch den bifunktionellen Linker in einer zur ³²P- oder ³³P-Markierung gebrauchsfertigen Form. Beispielsweise wird das Mittel in dem Röhrchen aus einem geeigneten Puffer zur Rekonstitution mit der ³²P- oder ³³P-Phosphatvenbindung in wässriger Lösung lyophylisiert. Obwohl das Röhrchen auch vorzugsweise das Vernetzungsmittel zur Kopplung des Phosphats mit dem bifunktionellen Linker enthält, kann ein getrenntes Röhrchen vorgesehen sein, um das Vernetzungsmittel zu enthalten. Der Vernetzer wird dem bifunktionellen Linker im trockenen Zustand zugesetzt, und darum tritt keine Reaktion ein, bis die Inhalte des Röhrchens mit der wässrigen Lösung des Phosphats rekonstituiert werden. Der Testsatz kann auch ein Röhrchen eines ³²P- oder ³³P-markierten Phosphats, das zur Durchführung der Reaktion geeignet ist, enthalten. Allerdings ist es auf Grund der kurzen Halbwertszeiten von ³²P und ³³P bevorzugt, dass das radioaktive Material frisch von kommerziellen Lieferanten, kurz bevor es verwendet wird, bezogen wird. Kommerzielle Lieferanten für zur Durchführung der Erfindung geeignete ³²P- und ³³P-Verbindungen sind aus der Technik gut bekannt und umfassen DuPont-NEN (Boston, MA), Amersham International (Arlington Heights, IL) und ICN Biomedicals (Costa Mesa, CA).The kit also contains the bifunctional linker in a ³² P or ³³ P ready-to-use form. For example, the agent in the tube is lyophilized from a suitable buffer for reconstitution with the ³² P or ³³ P phosphate covalent bond in aqueous solution. Although the tube also preferably contains the crosslinking agent for coupling the phosphate to the bifunctional linker, a separate tube may be provided to contain the crosslinking agent. The crosslinker is added to the bifunctional linker in the dry state, and therefore no reaction occurs until the contents of the tube are reconstituted with the aqueous solution of the phosphate. The kit may also contain a tube of ³² P- or ³³ P-labeled phosphate suitable for carrying out the reaction. However, due to the short half lives of ³² P and ³³ P, it is preferred that the radioactive material be sourced fresh from commercial suppliers just prior to use. Commercial suppliers of ³² P and ³³ P compounds useful in the practice of the invention are well known in the art and include DuPont-NEN (Boston, MA), Amersham International (Arlington Heights, IL), and ICN Biomedicals (Costa Mesa, CA). ,

Die markierte Phosphatverbindung wird dem Röhrchen, das den bifunktionellen Linker und den Vernetzer enthält, zugesetzt, und nach einer vorgeschriebenen Zeit (vorher unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren bestimmt) werden die Inhalte des Röhrchens dem Röhrchen, das das Protein enthält, zugesetzt. Nach dem Mischen wird eine bestimmte Zeitdauer verstreichen lassen, und das markierte Protein wird über die vorgesehene Größenausschlusssäule gereinigt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Spinsäule verwendet und wird mit einem physiologisch verträglichen Puffer, wie Phosphat-gepufferte Salzlösung, eluiert, so dass das Eluat direkt zur Verabreichung an den Patienten verwendet werden kann.The labeled phosphate compound becomes the tube which is the bifunctional Contains linker and the crosslinker, added, and after a prescribed time (before using determined by the method described here) the contents of the tube the tube, that contains the protein, added. After mixing, a certain amount of time will pass and the labeled protein is purified over the designated size exclusion column. In a preferred embodiment becomes a spin column It is used with a physiologically acceptable buffer, such as phosphate-buffered Saline, eluted, allowing the eluate directly for administration to the patient can be used.

C. Stabilität und Bioverteilung des markierten AntikörpersC. Stability and biodistribution of the labeled antibody

Die Stabilität des radioaktiv markierten Proteinkonjugats kann unter den physiologischen Bedingungen, unter denen es verwendet wird, durch Inkubation des Proteins in Humanserum bei 37 °C bestimmt werden. Die Inkubation wird vorzugsweise in einer Atmosphäre durchgeführt, die 5 % CO₂ enthält, um den physiologischen pH aufrecht zu erhalten. In regelmäßigen Zeitabständen werden Proben entnommen und durch Polyacrylamidgelelektrophorese und Größenausschlusschromatographie analysiert, und die Mengen an proteingebundener und nichtproteingebundener Radioaktivität werden quantitativ bestimmt.The stability of the radiolabelled protein conjugate can be determined under the physiological conditions under which it is used by incubating the protein in human serum at 37 ° C. The incubation is preferably carried out in an atmosphere containing 5% CO ₂ to maintain the physiological pH. At regular intervals, samples are taken and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and size exclusion chromatography, and the amounts of protein bound and non-protein bound radioactivity are quantified.

Die Biodistribution des markierten Proteins in vivo kann durch Experimente an Nagern unter Anwendung von aus der Technik gut bekannten Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise wird Mäusen das Protein injiziert, und eine zuvor festgelegte Anzahl der Mäuse wird nach festgelegten Zeiträumen zur Untersuchung getötet. Knochen wird durch Dissektion isoliert und in einem Ethanol/Salpetersäure-Gemisch solubilisiert. Gewebe wird unter Verwendung eines Gewebesolubilisierungsmittels (wie das TS-1, erhältlich von Research Products International (Mount Prospect, IL)), solubilisiert. Die Radioaktivität in der Knochen- und Gewebefraktion wird verglichen, um festzustellen, welcher Anteil an ³²P vom Knochen, vermutlich durch einen nicht spezifischen Mechanismus nach dem Abbau des Konjugats, aufgenommen wurde.The biodistribution of the labeled protein in vivo can be determined by rodent experiments using techniques well known in the art. For example, mice are injected with the protein, and a predetermined number of the mice are sacrificed for testing after specified periods of time. Bone is isolated by dissection and solubilized in an ethanol / nitric acid mixture. Tissue is solubilized using a tissue solubilizing agent (such as TS-1, available from Research Products International (Mount Prospect, IL)). The radioactivity in the bone and tissue fraction is compared to determine what proportion of ³² P was taken up by the bone, presumably by a non-specific mechanism after degradation of the conjugate.

Bei einem anderen Beispiel wird das markierte Protein Mäusen injiziert, die xenotransplantierte menschliche Tumore tragen, die das Antigen exprimieren, das von dem Targeting Protein erkannt wird. Nach verschiedenen Zeitintervallen werden die Mäuse getötet und seziert, und das Verhältnis der in dem Tumor und in dem anderen Gewebe festgestellten Radioaktivität wird gemessen.at In another example, the labeled protein is injected into mice, The xenografted human tumors carry the antigen expressed by the targeting protein. After different Time intervals become the mice killed and dissected, and the relationship the radioactivity detected in the tumor and in the other tissue is measured.

D. Verabreichung des ³²P-markierten Targeting ProteinsD. Administration of ³² P-labeled targeting protein

Im Allgemeinen variiert die Dosis des verabreichten ³²P-markierten Proteins abhängig von solchen Faktoren, wie Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht, allgemeinem medizinischen Zustand und bisheriger medizinischer Historie des Patienten. Typischerweise ist die Versorgung des Empfängers mit einer Dosis an markiertem Protein, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Menge des Mittels/Körpergewicht des Patienten) liegt, erwünscht, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann.In general, the dose of administered ³² P-labeled protein will vary depending on such factors as age, weight, height, sex, general medical condition, and previous medical history of the patient. Typically, delivery of the receptor to a dose of labeled protein that ranges from about 1 pg / kg to 10 mg / kg (patient's agent / body weight) is desired, although a lower or higher dose may be administered ,

Für therapeutische Anwendungen werden normalerweise etwa 1–50 mg ³²P-markiertes Protein täglich für die Dauer von mehreren Tagen verabreicht.For therapeutic applications, normally about 1-50 mg of ³² P-labeled protein is administered daily for a period of several days.

Die Verabreichung von markierten Proteinen an einen Patienten kann intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrapleural, intrathekal durch Perfusion über einen regionalen Katheter oder durch direkte intraläsionale Injektion erfolgen. Bei Verabreichung des Proteins durch Injektion kann die Verabreichung die kontinuierliche Infusion sein, oder es können ein oder mehrere Boli sein.Administration of labeled proteins to a patient may be intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intrapleural, intrathecal by perfusion via a regional catheter or by direct intralesional injection. When administering the protein by injection, the administration may be continuous infusion, or it may be one or more boluses.

Die erfindungsgemäßen markierten Proteine können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch geeignete Zubereitungen herzustellen, wobei Immunkonjugate in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert werden. Es wird gesagt, dass eine Zubereitung ein "pharmazeutisch verträglicher Träger" ist, wenn ihre Verabreichung von einem Empfänger-Patienten vertragen werden kann. Sterile Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) ist ein Beispiel für einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Weitere geeignete Träger sind den Fachleuten gut bekannt. Siehe beispielsweise REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Ausg. (1990).The marked according to the invention Proteins can be formulated according to known methods to pharmaceutically suitable Preparing preparations, wherein immunoconjugates in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier be combined. It is said that a preparation is a "pharmaceutically acceptable Carrier "is when its administration from a recipient patient can be tolerated. Sterile phosphate-buffered saline (PBS) is an example of a pharmaceutically acceptable carrier. Further suitable carrier are well known to the professionals. For example, see REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th ed. (1990).

Für therapeutische die Zwecke werden ein ³²P-markiertes Protein und ein pharmazeutisch verträglicher Träger an einen Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Es wird gesagt, dass eine Kombination eines ³²P-markierten Proteins und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers in einer "therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht wird, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart zu einer nachweisbaren Veränderung in der Physiologie eines Empfängerpatienten führt. Ein zielgerichtetes therapeutisches Mittel ist therapeutisch wirksam, wenn es einen höheren Anteil der verabreichten Dosis an das beabsichtigte Ziel abgibt als bei systemischer Verabreichung des entsprechenden nicht zielgerichteten Mittels am Ziel aufgenommen wird.For therapeutic purposes, a ³² P-labeled protein and a pharmaceutically acceptable carrier are administered to a patient in a therapeutically effective amount. It is said that a combination of a ³² P-labeled protein and a pharmaceutically acceptable carrier is administered in a "therapeutically effective amount" when the amount administered is physiologically significant. An agent is physiologically significant if its presence results in a detectable change in the physiology of a recipient patient. A targeted therapeutic agent is therapeutically effective when it delivers a higher proportion of the administered dose to the intended target than is absorbed upon systemic administration of the corresponding non-targeted agent at the target.

Um therapeutisch wirksam zu sein, könnte es der Verabreichung des markierten Proteins und des Trägers in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln oder als Teil eines breiteren Behandlungsregimes bedürfen. Ärzte sind derzeit der Meinung, dass die Wirksamkeit von zielgerichteten Therapeutika bei kombinationstherapeutischer Verwendung oft stark erhöht werden kann. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass die hoch dosierte Radioimmuntherapie für B-Zellen-Lymphome, die bei alleiniger Verwendung schwere hämatologische Toxizität hervorruft, bei Verwendung in Kombination mit einer autologen Knochenmark-Reinfusion hoch wirksam ist. Press et al., "Treatment of Relapsed B Cell Lymphomas with High Dose Radioimmunotherapy and Bone Marrow Transplantation" in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, Hrsg. (CRC Press, Boca Raton, 1995) Kap. 17. Bei einem anderen Beispiel wird eine fünffach verstärkte Tumoraufnahme eines radioaktiv markierten Antikörpers festgestellt, wenn der Tumor zuvor bestrahlt wird. Leichner et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 14:1033 (1987). Die Mechanismen, die sich für die Verbesserung der klinischen Wirksamkeit der Radioimmuntherapie als potentiell erwiesen haben, sind auch bei DeNardo et al., "Overview of Obstacles and Opportunities for Radioimmunotherapy of Cancer" in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, Hrsg. (CRC Press, Boca Raton, 1995) Kap. 11 erläutert. Anstrengungen zur Entwicklung solcher Kombinationsprotokolle sowie zur Untersuchung von Dosis-einschränkenden Nebenwirkungen und zur Potenzierung und Ausweitung von Zielrichtung, Aufnahme und günstigen Nebenwirkungen werden nun in vielen Laboratorien und Krankenhäusern durchgeführt, und von ihnen wird eine weitere Verbesserung der Brauchbarkeit von zielgerichteten therapeutischen Mitteln erwartet.Around could be therapeutically effective administration of the labeled protein and carrier in Combination with other therapeutic agents or as part of a require wider treatment regimes. Doctors are currently believe that the effectiveness of targeted therapeutics often be greatly increased in combination therapeutic use can. For example, it has been shown that high-dose radioimmunotherapy for B-cell lymphomas, which causes severe hematological toxicity when used alone, when used in combination with autologous bone marrow reinfusion is highly effective. Press et al., "Treatment of Relapsed B Lymphoma Lymphoma with High Dose Radioimmunotherapy and Bone Marrow transplantation "in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, eds. (CRC Press, Boca Raton, 1995) Chap. 17. In another example will a fivefold increased Tumor uptake of a radiolabeled antibody detected when the Tumor is previously irradiated. Leichner et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 14: 1033 (1987). The mechanisms that work for the improvement of Clinical efficacy of radioimmunotherapy has been shown to be potential are also in DeNardo et al., "Overview of Obstacles and Opportunities for Radioimmunotherapy of Cancer "in CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, Goldenberg, eds. (CRC Press, Boca Raton, 1995) Chap. 11 explained. Development efforts such combination protocols and for the study of dose-limiting Side effects and potentiation and extension of targeting, Recording and favorable Side effects are now being carried out in many laboratories and hospitals, and from them will further improve the usefulness of targeted expected therapeutic agents.

Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können zur Kontrolle der Wirkungsdauer des markierten Proteins bei einer therapeutischen Anwendung eingesetzt werden. Kontrolliert freisetzende Zubereitungen können durch die Verwendung von Polymeren zur Komplexierung oder Adsorption eines Proteins hergestellt werden. Beispielsweise umfassen biokompatible Polymere Poly(ethylen-covinylacetat)-Matrices und Polyanhydrid-Copolymer-Matrices eines Stearinsäuredimers und von Sebacinsäure. Sherwood et al., Bio/Technology 10:1446–1449 (1992). Die Freisetzungsgeschwindigkeit eines ³²P-markierten Proteins aus einer solchen Matrix hängt von dem Molekulargewicht des Proteins, der Menge des Proteins innerhalb der Matrix und der Größe der dispergierten Teilchen ab. Saltzman et al., Biophysical. J. 55: 163–171 (1989); und Sherwood et al., supra. Weitere feste Dosierungsformen sind in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Ausg. (1990) beschrieben.Additional pharmaceutical methods can be used to control the duration of action of the labeled protein in a therapeutic application. Controlled release formulations can be prepared by the use of polymers to complex or adsorb a protein. For example, biocompatible polymers include poly (ethylene covinylacetate) matrices and polyanhydride copolymer matrices of a stearic acid dimer and sebacic acid. Sherwood et al., Bio / Technology 10: 1446-1449 (1992). The rate of release of a ³² P-labeled protein from such a matrix depends on the molecular weight of the protein, the amount of protein within the matrix, and the size of the dispersed particles. Saltzman et al., Biophysical. J. 55: 163-171 (1989); and Sherwood et al., supra. Other solid dosage forms are described in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th ed. (1990).

Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird diese nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verstanden.To the general description of the invention, this is now under Reference to the following examples more easily understood.

BEISPIEL 1EXAMPLE 1

Synthese von 1-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-4-(2-aminoethylacetamid) (MCAA) (6)

Synthesis of 1- (N-Maleimidomethyl) cyclohexane-4- (2-aminoethylacetamide) (MCAA) (6)

Sulfo-SMCC (1 Äquivalent) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wird in Natriumacetatpuffer (pH 7) gelöst, und Ethylendiamindihydrochlorid (5 Äq.) wird zugesetzt. Die Umsetzung wird durch TLC aufgezeichnet und mit Fluorescamin sichtbar gemacht. Wenn die Umsetzung vollständig ist, wird das Reaktionsgemisch direkt auf eine C₁₈-Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgetragen und mit einem Gradient von Acetonitril in Triethanolamin/Wasser, pH 7, eluiert. Überschüssiges Ethylendiamin eluiert an der Lösungsmittelfront, gefolgt von dem gewünschten Produkt. Eine kleine Menge von doppelt gekoppeltem Material, das durch Kondensation von einem Molekül Ethylendiamin mit 2 Molekülen Sulfo-SMCC gebildet wird, eluiert zuletzt. Das gewünschte Material wird durch ¹H-NMR und IR-Spektroskopie, Massenspektrometrie und Elementaranalyse charakterisiert.Sulfo-SMCC (1 equivalent) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) is dissolved in sodium acetate buffer (pH 7) and ethylenediamine dihydrochloride (5 eq.) Is added. The reaction is monitored by TLC and visualized with fluorescamine. When the reaction is complete, the reaction mixture was loaded directly onto a C ₁₈ reversed phase HPLC column and eluted with a gradient of acetonitrile in triethanolamine / water, pH 7. Excess ethylene diamine elutes at the solvent front followed by the desired product. A small amount of doubly coupled material formed by condensation of one molecule of ethylenediamine with 2 molecules of sulfo-SMCC elutes last. The desired material is characterized by ¹ H-NMR and IR spectroscopy, mass spectrometry and elemental analysis.

BEISPIEL 2EXAMPLE 2

Kondensation von MCAA mit ³²P-markiertem Adenosinmonophosphat (AMP) unter Bildung von ³²P-AMP-MCAA (7)

Condensation of MCAA with ³² P-labeled adenosine monophosphate (AMP) to give ³² P-AMP-MCAA (7)

MCAA (1 Äq.) und ³²P-AMP (1 Äq.) werden in wässrigem Butanol gemischt, und EDC (1 Äq.) wird zugesetzt. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und durch Umkehrphasen-HPLC über eine C₁₈-Säule aufgezeichnet. Wenn die Ausgangsmaterialien verschwunden sind, wird das Reaktionsgemisch unter Verwendung einer präparativen Umkehrphasen-C₁₈-Säule unter Elution mit einem Gradienten von Acetonitril in Natriumphosphatpuffer, pH 7, gereinigt.MCAA (1 eq.) And ³² P-AMP (1 eq.) Are mixed in aqueous butanol and EDC (1 eq.) Is added. The reaction is allowed to proceed at room temperature and monitored by reverse phase HPLC on a C ₁₈ column. When the starting materials have disappeared, the reaction mixture is purified using a preparative reverse phase C ₁₈ column eluting with a gradient of acetonitrile in sodium phosphate buffer, pH 7.

BEISPIEL 3EXAMPLE 3

Kopplung von ³²P-AMP-MCAA an den monoklonalen anti-CEA-MN14-AntikörperCoupling of ³² P-AMP-MCAA to the monoclonal anti-CEA-MN14 antibody

MN14 ist ein IgG, das das karzinoembryonale Antigen (CEA) spezifisch erkennt. MN14 wird durch Zugabe von 2-Mercaptoethanol bei pH 8,7 10 min bei 4 °C reduziert, um 2 freie Thiolgruppen in der Hinge-Region des Antikörpers zu erzeugen. Das reduzierte MN14 wird in Natriumphosphatpuffer (pH6) gelöst, und ³²P-AMP-MCAA (0,5 Äq.) wird zugesetzt. Der Reaktionsverlauf wird durch Größenausschlusschromato graphie über eine BioSil 250-Säule (Biorad, Hercules, CA) unter Verwendung eines in-line Strahlungsdetektors aufgezeichnet.MN14 is an IgG that specifically recognizes the carcinoembryonic antigen (CEA). MN14 is reduced by addition of 2-mercaptoethanol at pH 8.7 for 10 min at 4 ° C to produce 2 free thiol groups in the hinge region of the antibody. The reduced MN14 is dissolved in sodium phosphate buffer (pH6) and ³² P-AMP-MCAA (0.5 eq.) Is added. The course of the reaction is recorded by size exclusion chromatography on a BioSil 250 column (Biorad, Hercules, CA) using an in-line radiation detector.

BEISPIEL 4EXAMPLE 4

Messung der Immunreaktivität von ³²P-markiertem MN14Measurement of immunoreactivity of ³² P-labeled MN14

Der wie vorstehend in Beispiel 3 hergestellte konjugierte Antikörper wird auf eine mit Affigel (Biorad, Hercules, CA) kovalent verknüpfte CEA-Säule (Calbiochem, La Jolla, CA) aufgebracht. Die Säule wird mit PBS eluiert, und die Radioaktivität, die aus der Säule eluiert, wird gemessen und mit der Menge an Radioaktivität verglichen, die auf die Säule aufgebracht wurde. ¹³¹I-markiertes MN14, welches bekanntlich die gleiche Immunreaktivität wie natives MN14 zeigt, wird ebenfalls auf die Säule aufgebracht, und derselbe Vergleich wird vorgenommen. Der Vergleich der Verhältnisse von gebunden/nicht gebunden für beide markierte Antikörper liefert ein Maß für die Wirkung der Kopplung des ³²P-Markierungsmittels auf die Immunreaktivität von MN14.The conjugated antibody prepared as in Example 3 above is applied to a CEA column covalently linked to Affigel (Biorad, Hercules, CA) (Calbiochem, La Jolla, CA). The column is eluted with PBS and the radioactivity eluted from the column is measured and with the amount of radioactivity compared to that applied to the column. ¹³¹ I-labeled MN14, which is known to exhibit the same immunoreactivity as native MN14, is also applied to the column and the same comparison is made. Comparison of the bound / unbound ratios for both labeled antibodies provides a measure of the effect of coupling the ³² P label to the immunoreactivity of MN14.

BEISPIEL 5EXAMPLE 5

Messung der Biodistribution von ³²P-markiertem MN14Measurement of the biodistribution of ³² P-labeled MN14

Der konjugierte Antikörper wird in einer Konzentration von 10 mg/kg Körpergewicht in 35 BALB/C-Mäuse injiziert. 5 Tiere werden zu jedem Zeitpunkt von 2 h, 4 h, 1, 2, 3, 7 und 14 Tagen getötet. Zu jedem Zeitpunkt werden die Mäuse zur Entfernung sämtlichen Knochengewebes seziert, welches in Ethanol/Salpetersäure solubilisiert wird. Nichtknochengewebe wird in TS-1 (Research Products International) solubilisiert. Beide solubilisierten Proben werden zu Scintillationsfluid zugesetzt, und die Radioaktivität wird unter Verwendung eines Scintillationszählers gemessen. Die Knochen- und die Nichtknochen-Radioaktivität werden zu jedem Zeitpunkt verglichen. Zunehmende Mengen an im Knochen festgestellter Radioaktivität geben einen verstärkten Abbau des Konjugats an.Of the conjugated antibodies is injected at a concentration of 10 mg / kg body weight in 35 BALB / C mice. 5 animals will be at any time from 2 h, 4 h, 1, 2, 3, 7 and 14 Days killed. At any point in time, the mice will to remove all Bone tissue, which solubilizes in ethanol / nitric acid becomes. Non-bone tissue is used in TS-1 (Research Products International) solubilized. Both solubilized samples become scintillation fluid added, and the radioactivity is measured using a scintillation counter. The bones- and the non-bone radioactivity will be at any time compared. Give increasing amounts of radioactivity detected in the bone a reinforced Degradation of the conjugate.

BEISPIEL 6EXAMPLE 6

Messung der Gewebespezifität von ³²P-markiertem MN14Measurement of tissue specificity of ³² P-labeled MN14

60 weiblichen, athymischen, aus der Kreuzung entfernter Verwandter gezüchteten Nacktmäuse, (Harlan, Indianapolis, IN) werden menschliche LS-174T-Tumorzellen injiziert. Nach Entwicklung der Tumore in den Mäusen wird ³²P-markiertes Antikörperkonjugat in einen Pool von 30 Mäusen injiziert, und ¹³¹I-markiertes MN14 (hergestellt durch das Chloramin-T-Verfahren) wird in die anderen 30 Mäuse injiziert, beides in Dosen von 10 mg/kg Körpergewicht. 5 Tiere aus jedem Pool werden jeweils zum Zeitpunkt von 4 h, 1, 2, 3, 7 und 14 Tagen getötet, und die Tumore durch Dissektion entfernt. Der Tumor und das Nichttumorgewebe werden gewogen und solubilisiert, und das Verhältnis von Radioaktivität, das in jeder Fraktion gefunden wird, durch β-Zählung (für ³²P-Markierung) und durch γ-Zählung (für ¹³¹I-Markierung) bestimmt. Die Iodmarkierung von MN14 weist bekanntlich keine nennenswerte Wirkung auf die Immunreaktivität von MN14 auf, und darum kann die Wirkung der ³²P-Markierung auf das MN14-Tumortargeting durch Vergleich der Tumor/Nichttumorverhältnisse, die mit jeder Markierungsmethode festgestellt werden, bestimmt werden.Sixty female, athymic nude mice bred from the offspring of distant relatives (Harlan, Indianapolis, IN) are injected with human LS-174T tumor cells. After development of the tumors in the mice, ³² P-labeled antibody conjugate is injected into a pool of 30 mice, and ¹³¹ I-labeled MN14 (prepared by the chloramine T method) is injected into the other 30 mice, both at doses of 10 mg / kg body weight. 5 animals from each pool are sacrificed at the time of 4 h, 1, 2, 3, 7 and 14 days, and the tumors are removed by dissection. The tumor and non-tumor tissue are weighed and solubilized, and the ratio of radioactivity found in each fraction is determined by β-count (for ³² P-labeling) and by γ-counting (for ¹³¹ I-labeling). The iodine labeling of MN14 is known to have no appreciable effect on the immunoreactivity of MN14, and therefore the effect of ³² P-labeling on MN14 tumor targeting can be determined by comparing the tumor / non-tumor ratios found with each labeling method.

Claims (13)

Radioaktiv markiertes Targeting Protein, umfassend einen Komplex der Formel Q-(S)m-L-NR'-P(O)(OH)Y-R, wobei P das ³²P- oder das ³³P-Isotop ist, Q ein Protein ist, das in der Lage ist, spezifisch an eine komplementäre Zielmolekülspezies aufgrund einer Komplementaritätsbestimmenden Region davon zu binden, L eine Linkergruppe ist, Y Sauerstoff oder eine Einfachbindung zu R ist, oder Y NR'' ist, R, R' und R'' gleich oder verschieden sind und jedes eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, oder Wasserstoff ist, und m 1 oder 2 ist, oder ein physiologisch verträgliches Salz davon.A radiolabeled targeting protein comprising a complex of the formula Q- (S) mL -NR'-P (O) (OH) YR, where P is the ³² P or ³³ P isotope, Q is a protein capable of specifically binding to a complementary target molecule species due to a complementarity determining region thereof, L is a linker group, Y is oxygen or a single bond to R or Y is NR '', R, R 'and R''are the same or different and each is an optionally substituted straight-chain or branched alkyl, cycloalkyl, aryl or heterocyclic group containing 1 to 20 carbon atoms, or is hydrogen, and m is 1 or 2, or a physiologically acceptable salt thereof. Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei Q ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment ist.Radiolabeled targeting protein according to claim 1, wherein Q is a monoclonal antibody or an antibody fragment is. Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 2, wobei die Thiolgruppe an Q durch Reduktion einer Disulfidbindung in der Hinge Region des monoklonalen Antikörpers oder des Antikörperfragments erzeugt wird.Radiolabeled targeting protein according to claim 2, wherein the thiol group on Q by reducing a disulfide bond in the hinge region of the monoclonal antibody or antibody fragment is produced. Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei L -S-A- ist, wobei A eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylengruppe oder zweiwertige heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, ist.A radiolabelled targeting protein according to claim 1, wherein L is -SA-, wherein A is a given when substituted is saturated or unsaturated straight or branched alkylene, cycloalkylene, arylene or divalent heterocyclic group containing 1 to 20 carbon atoms. Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei L -CH₂-CO-BD- ist, wobei B O, NH oder B eine Einfachbindung zu C ist, und wobei D eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylengruppe oder zweiwertige heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, ist.A radiolabeled targeting protein according to claim 1, wherein L is -CH ₂ -CO-BD-, wherein BO, NH or B is a single bond to C, and wherein D is an optionally substituted saturated or unsaturated straight or branched alkylene, cycloalkylene, Arylene group or divalent heterocyclic group containing 1 to 20 carbon atoms. Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei L

ist.A radiolabelled targeting protein according to claim 1, wherein L

is. Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei L

ist, wobei E und F gleich oder verschieden sind und jedes eine gegebenenfalls substituierte gesättigte oder ungesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylen-, Cycloalkylen-, Arylengruppe oder zweiwertige heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, ist.A radiolabelled targeting protein according to claim 1, wherein L

wherein E and F are the same or different and each is an optionally substituted saturated or unsaturated straight or branched alkylene, cycloalkylene, arylene or divalent heterocyclic group containing 1 to 20 carbon atoms. Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 7, wobei E aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus

und F (CH₂)₂ ist.A radiolabeled targeting protein according to claim 7, wherein E is selected from the group consisting of

and F is (CH ₂ ) ₂ . Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1, wobei YR aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 5'-O-Adenosin, 5'-O-Guanosin, 5'-O-Thymidin, 5'-O-Cytidin, 5'-O-Deoxyadnosin, 5'-O-Deoxyguanosin, 5'-O-Uridin, 5'-O-Deoxycytidin, 5-O-Inosit-1,4-bisphosphat und 5-O-Inosit-1,3,4-trisphosphat.Radiolabeled targeting protein according to claim 1, wherein YR is selected from the group consisting of 5'-O-adenosine, 5'-O-guanosine, 5'-O-thymidine, 5'-O-cytidine, 5'-O-deoxyadnosine, 5'-O-deoxyguanosine, 5'-O-uridine, 5'-O-deoxycytidine, 5-O-inositol-1,4-bisphosphate and 5-O-inositol 1,3,4-trisphosphate. Pharmazeutische Zubereitung, die eine wirksame Menge einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch verträglichen sterilen Vehikel umfasst.Pharmaceutical preparation containing an effective amount A composition according to claim 1 in a pharmaceutically acceptable sterile vehicle. Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Targeting Proteins, umfassend das Zusammenbringen eines Proteins, das in der Lage ist, spezifisch an eine komplementäre Zielmolekülspezies auf Grund einer Komplementaritäts-bestimmenden Region davon zu binden, und das mindestens eine freie Thiolgruppe enthält, mit einem Komplex der Formel L'-NR'-P(O)(OH)Y-R, wobei P das ³²P- oder ³³P-Isotop ist, L' eine Linkergruppe ist, die eine Gruppe umfasst, die in der Lage ist, mit den Thiolgruppen an dem Targeting Protein spezifisch unter Bildung einer Disulfid- oder Thioetherverknüpfung zu reagieren, Y Sauerstoff oder eine Einfachbindung zu R ist oder Y NR'' ist, und R, R' und R'' gleich oder verschieden sind und jedes eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl-, Cycloalkyl-, Arylgruppe oder heterocyclische Gruppe, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome enthält, oder Wasserstoff ist, oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon.A method for producing a radiolabeled targeting protein, comprising contacting a protein capable of specifically binding to a complementary target molecule species for a complementarity-determining region thereof and containing at least one free thiol group, with a complex of the formula L'-NR'-P (O) (OH) Y R, where P is the ³² P or ³³ P isotope, L 'is a linker group comprising a group capable of reacting with the thiol groups on the Targeting protein specifically to form a disulfide or thioether linkage, Y is oxygen or a single bond to R or Y is NR ", and R, R 'and R" are the same or different and each is an optionally substituted straight chain or branched alkyl , Cycloalkyl, aryl or heterocyclic group containing 1 to 20 carbon atoms, or is hydrogen, or a physiologically acceptable salt thereof. Radioaktiv markiertes Targeting Protein nach Anspruch 1 zur Verwendung als Medikament.Radiolabeled targeting protein according to claim 1 for use as a drug. Kit zur Herstellung eines radioaktiv markierten Targeting Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend in geeigneten Behältnissen, (1) eine Präparation eines bifunktionellen Linkers, umfassend: eine Gruppierung, die eine Gruppe umfasst, die in der Lage ist, spezifisch mit Thiolgruppen an einem Protein unter Bildung einer Disulfid- oder Thioetherverknüpfung zu reagieren, und eine primäre oder sekundäre Amingruppe; (2) ein Targeting Protein, das mindestens eine Thiolgruppe enthält; und (3) mindestens ein Vernetzungsmittel zur Herbeiführung der Kupplung zwischen einem Phosphat, Phosphonat oder Phosphoramidat P-OH, das ein ³²P- oder ³²P-Isotop enthält, und der primären und sekundären Amingruppe.A kit for the production of a radiolabeled targeting protein according to any one of claims 1 to 9 comprising, in suitable containers, (1) a preparation of a bifunctional linker comprising: a moiety comprising a group capable of specific with thiol groups reacting a protein to form a disulfide or thioether linkage, and a primary or secondary amine group; (2) a targeting protein containing at least one thiol group; and (3) at least one crosslinking agent to effect coupling between a phosphate, phosphonate or phosphoramidate P-OH containing a ³² P or ³² P isotope and the primary and secondary amine groups.