DE69531125T2

DE69531125T2 - Nachweis einer Zielsubstanz in einer Probe

Info

Publication number: DE69531125T2
Application number: DE69531125T
Authority: DE
Inventors: David A. King; Jens-Peter Seher
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1994-04-15
Filing date: 1995-04-11
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2015-04-12
Also published as: DE69531125D1; JPH07318483A; US5538850A; JP3659686B2; EP0677734A2; EP0677734B1; EP0677734A3

Description

Diese Erfindung umfaßt ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Erfassen einer Zielsubstanz und einer Probe.
Viele Zweige von Medizin, Chemie und Biologie hängen von einer Fähigkeit ab, chemische, biochemische oder biologische Proben zu untersuchen, oder Änderungen in der chemischen Zusammensetzung solcher Proben zu bestimmen. Die Diagnose von vielen Krankheiten beruht z. B. häufig auf der Fähigkeit, das Vorhandensein von Antikörpern im Blut zu erfassen.
Als ein anderes Beispiel wird unter Verwendung der Fluoreszenzanalyse der Betrag von fluoreszierendem Material bestimmt, der in einer Probe vorhanden ist, durch Messen der Intensität der Fluoreszenz, die von dem Material emittiert wird. Solche Fluoreszenztechniken sind besonders nützlich bei biochemischen Untersuchungen, die nach dem Vorhandensein von Fluorophoren untersuchen.
Entsprechend bestehen viele unterschiedliche Verfahren und Vorrichtungen zum Erfassen des Vorhandenseins oder zum Messen des Betrags von Chemikalien in einer Massenprobe. Diese Vorrichtungen sind weitläufig verständlich und wurden verbreitet verwendet. Beispiele dieser Vorrichtungen sind in den Büchern Laser Spectroscopy, Demtroder, W., Springer-Verlag, Berlin, 1982 und Fluorescence and Phosphorescence, Rendell, D., John Wiley, Chichester, 1987 beschrieben.
Andere bekannte chemische Sensoren umfassen eine optische Absorptionsspektroskopie. Diese Spektralanalysatoren verwenden üblicherweise eine von zwei Techniken: 1) Erfassen von Störungen zwischen mehreren Reflexionen in Dünnfilmen, wie in Internal Reflection Spectroscopy, Harrick, N.J., Wi ley, New York, 1967 beschrieben ist; und 2) Gesamtinnenreflexions-Absorptionsspektroskopie (TIR-Absorptionsspektroskopie) innerhalb eines Laserhohlraums, wie in „Interacavity adsorption spectroscopy of surface-active substances, adsorbed gases, and aerosols", Godlevskii, A.P., und Kopytin, Yu. D., J. Appl. Spect., 29, 1301 (1978) beschrieben ist.
Harrick beschreibt die Verwendung von konstruktiven Interferenzen in Dünnfilm-„Hohlräumen", um die Empfindlichkeit von optischer Absorptionsspektroskopie zu erhöhen. Licht wird in eine Dünnfilm gekoppelt, wo es mehreren (Gesamtinnen-) Reflexionen unterzogen wird. Wenn ein breiter Lichtstrahl verwendet wird, können mehrere reflektierte Strahlen den direkt reflektierten Strahl konstruktiv stören. Harrick stellt jedoch heraus, daß viele Probleme bei dieser Struktur bestehen: präzise Einfallswinkel müssen beibehalten werden, eine effektive Verbesserung wird durch die tatsächliche Größe des Strahls eingeschränkt und eine kritische Anpassung von Oberflächenreflexionsvermögen ist wesentlich für eine optimale Verbesserung.
Neueste Arbeit hat gezeigt, daß die letztgenannte Einschränkung aufgehoben werden kann. Das U.S.-Patent Nr. 4,857,273 (Stewart, 15. August 1989, „Biosensors") stellt z. B. Verbesserungen gegenüber dem Harrick-System dar. Andere Probleme schränken jedoch die Empfindlichkeit dieser Struktur so ein, daß sie dieselbe praktisch nutzlos als einen hochempfindlichen Wandler für kleine Erfassungsbereiche machen. Viele dieser Probleme stammen von der Tatsache, daß der Stewart-Sensor eine Form eines Resonanzwellenleiters verwendet und somit eine lange Interaktionslänge benötigt, so daß Licht häufig genug innerhalb des Wellenleiters „aufprallt". Um die Vorrichtung kleiner zu machen, müßte die Interaktionslänge gekürzt werden. Dies würde jedoch ebenfalls die Länge reduzieren, über die Licht aufprallen könnte, und würde verursachen, daß der Sensor viel von dessen Empfindlichkeit verliert.
Godlevskii und Kopytin beschreiben ein System, bei dem eine Gesamtreflexionszelle innerhalb eines Laserresonators plaziert ist. Es wird dann die Laserausgangsleistung gemessen, wenn Moleküle an der TIR-Oberfläche adsorbiert werden. Es wird angenommen, daß die Moleküle eine optische Absorption bei oder in der Nähe der Laserfrequenz aufweisen, was bedeutet, daß sie als ein zusätzlicher Verlustmechanismus im Inneren eines Hohlraums wirken. Während sowohl das Harrickals auch das Godlevskii-System „optische Hohlräume" verwenden, bietet nur letzteres einen optischen Resonator, der stabil genug ist, um viele der Probleme von Harrick zu lösen.
Andererseits beschränkt sich das Godlevskii/Kopytin-System selbst auf eine Absorptionsspektroskopie einfacher Moleküle. Damit das Godlevskii/Kopytin-System ordnungsgemäß arbeiten kann, muß es daher genug Moleküle des. Analyten aufweisen, um eine erfaßbare Absorption zu liefern. Dadurch ist die Empfindlichkeit des Godlevskii/Kopytin-Systems auf die Erfassung von Oberflächenkonzentrationen beschränkt, die größer als jene sind, bei denen das Feld im Inneren eines Hohlraums bedeutend gestört wird. Da dieses System darauf basiert, daß es ausreichend Absorptionsmoleküle des Analyten aufweist, um das elektrische Feld an der TIR-Grenze zu stören, ist das System nicht in der Lage, Konzentrationen oder Moleküle deutlich unter dieser Grenze zu erfassen.
Gemäß einer anderen bekannten Technik werden Spurenchemikalien unter Verwendung von Fluoreszenz erfaßt. Ein Verfahren zum Erfassen von Biomolekülen unter Verwendung von Fluoreszenz an einer TIR-Oberfläche ist z. B. in dem Artikel „A new immunoassay based on fluorescence excitation by internal reflection spectro-scopy" von Kronick, M.L., und Little, W.A., J. Immunological. Meth., 8, 235 (1975) beschrieben. Gemäß dieser Technik ist ein Prisma im freien Raum befestigt, nicht innerhalb eines Resonanzhohlraums. Aufgrund dieser Struktur wird Licht absichtlich „verworfen", d. h., dessen Energie wird nicht verwendet, um weiter zur Fluoreszenz beizutragen, nachdem dasselbe von der TIR-Oberfläche reflektiert wurde. Dies bedeutet wiederum, daß das Kronick-System große und leistungsstarke Lichtquellen erfordert, um ausreichend Fluoreszenzanregung für hohe Empfindlichkeit zu erreichen.
Andere Erfassungs-Systeme und -Techniken, die eine Fluoreszenzanregung verwenden, sind in den nachfolgenden Referenzen beschrieben:

1) Sloper, A.N., Deacon, J.K., und Flanagan, M.T., „A planar indium phosphate monomode waveguide evanescent field immunosensor", Sensors and Actuators, B1, 589 (1990), (beschreibt die Verwendung von Wellenleitern);
2) Choquette, S.J., Locascio-Brown, L., und Durst, R.A., „Planar waveguide immunosensor with fluorescent liposome amplification", Anal. Chem., 64, 55 (1992), (verwendet ebenfalls Wellenleiter); und
3) Kooyman, R.P.H., de Bruijn, H.E., und Greve, J., „A fiber-optic fluorescence immunosensor", Proc. Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng., 798, 290 (1987), (beschreibt die Verwendung von optischen Fasern).

Wie bei dem Kronick-Verfahren, „Recyclen" diese drei Techniken kein Licht innerhalb eines Hohlraums und sind somit auf ähnliche Weise entweder auf unnötig große Lichtquellen oder reduzierte Empfindlichkeit beschränkt.
Laut Definition, je weniger von einem Material ein Detektor benötigt, um dasselbe zu erfassen, desto empfindlicher ist der Detektor. Folglich ist es ein bestehendes Ziel, die Empfindlichkeit von Detektoren zu erhöhen.
Die EP-0,478,137 offenbart eine Vorrichtung zum Erfassen einer Zielsubstanz in einer Probe, die eine Lichtquelle aufweist; ein optischer Resonator, der einen Resonanzhohlraum für Licht umfaßt, das durch die Lichtquelle erzeugt wird; ein Gesamtinnenreflexion-Bauglied (TIR-Bauglied) als Teil des Resonanzhohlraums, das eine TIR-Oberfläche zum Leiten von Licht in denselben und zum Reflektieren von Licht im wesentlichen ohne Verlust umfaßt. Die Vorrichtung umfaßt einen optischen Sensor zum Erfassen einer Phasenverschiebung in der Polarisierung des Lichts.
Die DE-A-3,718,908 offenbart eine Dispersion einer Probe innerhalb eines optischen Resonators mit Erfassung einer Substanz in einer Probe aufgrund der Absorbanz des Lichts innerhalb des Hohlraums durch die Probe.
Es besteht ein gut erkennbarer Bedarf nach Techniken, die schnell minimale Beträge (z. B. weniger als 10⁵ Moleküle) von Biomolekülen erfassen können, ohne entweder radioaktive Markierung oder chemische Verstärkung (wie z. B. Polymerasekettenreaktion). Einzelne Moleküle wurden optisch unter Verwendung von Verfahren erfaßt, wie in Peck, K., Stryer, L., Glazer, A.N., und Mathies, R.A., „Single molecule fluorescence detection: Autocorrelation criterion and experimental realization with phycoerythrin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4087 (1989), und Soper, S.A., Brooks Shera, E., Martin, J.C., Jett, J.H., Hahn, J.H., Nutter, H.L. und Keller, R.A., „Single-molecule detection of rhodamine 6G in ethanolic solutions using continuous wave laser excitation", Anal. Chem., 63, 432 (1991) beschrieben ist. Das Problem mit diesen Verfahren ist jedoch, daß sie sehr schwierig handelsüblich herzustellen sind, da sie auch große Laser (mit begleitenden großen Leistungsversorgungen und in manchen Fällen Kühlsystemen) erfordern, um ein ausreichend starkes elektrisches Feld zu erzeugen.
Abgesehen von der Frage der Empfindlichkeit leiden viele bestehende Erfassungssysteme ebenfalls unter dem Problem, daß sie groß oder schwierig elektronisch zu steuern sind. Dies bedeutet nicht nur, daß sie weniger zugänglich für kleine Labore sind, die weder den Raum noch das Geld haben, ein solches zu kaufen und zu installieren, sondern ferner daß sie schwerer ordnungsgemäß zu verwenden und zu steuern sind, wenn sie installiert sind.
Die vorliegende Erfindung schafft eine verbesserte Erfassung einer Zielsubstanz in einer Probe.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Erfassen einer Zielsubstanz in einer Probe geschaffen, wie in Anspruch 1 spezifiziert ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Erfassen einer Zielsubstanz in einer Probe geschaffen, wie in Anspruch 6 spezifiziert ist.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren für eine Halbleiterlichtquelle den Schritt des optischen Frequenzverriegelns der Lichtquelle in dem Hohlraum.
Die bevorzugten Ausführungsbeispiele können eine Oberflächenerfassung (und nicht nur eine Mengenerfassung) liefern, die es möglich macht, Probekonzentrationen von Molekülen sogar weniger als jene zu erfassen, für die das Feld im Inneren des Hohlraums gestört ist. Es ist möglich, das Erfassungssystem selbst stabil, kompakt, leicht zu kalibrieren und leicht zu steuern zu machen.
Bevorzugte Ausführungsbeispiele schaffen Verfahren und entsprechende Vorrichtungen zum Erfassen des Vorhandenseins einer Zielsubstanz in einer Probe unter Verwendung von sowohl makroskopischen Eigenschaften (wie z. B. Änderungen im Brechungsindex des Analyten), und mikroskopische Eigenschaften (wie z. B. das Vorhandensein eines Fluoreszenzindikators), mit einer Empfindlichkeit, die zumindest in einer Größenordnung größer als die Empfindlichkeit von Systemen liegt, wie jenen, die oben beschrieben wurden.
Das Erfassungssystem umfaßt eine Lichtquelle, wie z. B. einen Laser, und einen optischen Resonator, der einen Resonanzhohlraum für Licht aufweist, das durch die Lichtquelle erzeugt wird. Die Lichtquelle kann entweder innerhalb des Hohlraums oder außerhalb des Hohlraums angeordnet sein, wobei dieselbe in diesem Fall ein Gewinnmedium sein kann, wie z. B. ein Halbleiterlaser oder eine Superlumineszenzdiode. Der Detektor umfaßt ferner zumindest ein Reflexions-Element oder -Bauglied. Das Reflexions-Element oder -Bauglied, das eine passive Vorrichtung, wie z. B. ein Prisma, ein Wellenleiter oder eine Faser sein kann, oder ein aktives Gewinnelement, wie z. B. eine dotierte optische Faser, weist eine Gesamtinnenreflexions-Oberfläche (TIR-Oberfläche) auf und ist selbst innerhalb des Hohlraums angeordnet. Die TIR-Oberfläche kann alternativ durch ein separates Element gebildet sein, das aus dem Reflexionselement entfernbar ist und optisch mit demselben gekoppelt ist.
Licht aus der Lichtquelle wird in das Reflexionselement geleitet und wird durch die TIR-Oberfläche reflektiert, vorzugsweise an einem einzelnen Reflexionspunkt; eine Abklingendes-Feld-Region wird dadurch an der TIR-Oberfläche gebildet. Die Probe, die getestet werden soll, ist so positioniert, daß sie sich in die Abklingendes-Feld-Region erstreckt. Eine herkömmliche Anordnung kann verwendet werden, um die Probe einzubringen, zu enthalten und zu positionieren.
Der Detektor erfaßt vorbestimmte optische Änderungen, die innerhalb der Abklingendes-Feld-Region entstehen, üblicherweise nicht mehr als ungefähr eine optische Wellenlänge der Lichtquelle weg von der TIR-Oberfläche. Diese Änderungen können eine Anregung von Lichtfrequenzänderungen (wie z. B. Fluoreszenz) innerhalb der Probe, Änderungen in dessen Brechungsindex und Änderungen in der Resonanzfrequenz des optischen Resonators umfassen. Diese Änderungen werden dann erfaßt, um den Betrag oder zumindest das Vorhandensein ei nes Analyten zu erfassen, der an der TIR-Oberfläche angeordnet ist.
Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend Bezug nehmend auf die beiliegenden Zeichnungen ausschließlich beispielhaft beschrieben, in denen:
1 schematisch die Hauptkomponenten eines Ausführungsbeispiels des Detektors mit einem optischen Stehwellenresonator und einer einzelnen Gesamtinnenreflexionsoberfläche (TIR-Oberfläche) darstellt;
2a, 2b und 2c graphisch die Beziehung zwischen Betrag, Phase und Eindringtiefe für Licht darstellen, das auf eine TIR-Oberfläche einfällt;
3 schematisch ein Ausführungsbeispiel eines Detektors zeigt, der die Fluoreszenz von einem Fluoreszenzanalyten erzeugt, der in einem abklingenden Feld angeordnet ist, wobei das abklingende Feld durch eine TIR eines Strahls innerhalb eines Hohlraums in einem Resonator erzeugt wird, gepumpt durch eine Lichtquelle, die sich nicht innerhalb des Resonatorhohlraums selbst befindet;
4 eine TIR-Oberfläche darstellt, die an einem Reflexionselement erzeugt ist, das einen optischen Gewinn aufweist;
5 schematisch ein Ausführungsbeispiel eines Detektors zeigt, ähnlich zu dem, der in 3 gezeigt ist, aber bei dem die Lichtquelle innerhalb des Resonatorhohlraums angeordnet ist;
6 das Prinzip hinter einem bevorzugten Verfahren zum Erfassen eines Analyten darstellt; genauer gesagt ist 6 ein Beispiel einer Skizze des Verhältnisses der Intensität von reflektiertem Licht zu der Einfallintensität von einer TIR-Oberfläche in einem Detektor als eine Funktion der Erhöhung des Brechungsindex aufgrund des Vorhandenseins eines Analyten;
7 graphisch die Auswirkung auf die Empfindlichkeit des Detektors auf Änderungen bei der Spiegelreflexion darstellt; genauer gesagt zeigt 7 das Verhältnis von übertragener Lichtintensität (I_trans) zur einfallenden Lichtintensität (I_trans) für eine TIR-Oberfläche als eine Funktion von Änderungen bei dem Brechungsindex (Δn₈) für eine Familie von unterschiedlichen Spiegelreflexionskoeffizienten;
8 ein Blockdiagramm eines bevorzugten Systems zum Bestimmen von Änderungen der übertragenen Lichtintensität ist, um das Vorhandensein eines Analyten z. B. unter Verwendung der Wirkung zu erfassen, die in 7 dargestellt ist;
9 ein Beispiel einer Skizze von I_trans/I_inc als eine Funktion von n ist, für unterschiedliche Gewinnfaktoren innerhalb des Hohlraums bei dem bevorzugten Detektor; und
10 ein Beispiel einer Skizze einer Resonanzfrequenz (w_m) als eine Funktion von n₈ für einen optischen Resonator ist, der eine TIR-Oberfläche einlagert.
Es wird als angemessen betrachtet, einen Teil der zugrundeliegenden Theorie zu erklären, bevor verschiedene Ausführungsbeispiele beschrieben werden, die eine chemische Erfassung von mikroskopischen und makroskopischen Eigenschaften einer Probe oder genauer gesagt einer Zielsubstanz (chemisch) liefern, die innerhalb der Probe enthalten ist. Beispiele von Zielsubstanzen, für die das vorbereitete Ver fahren außerordentlich gut zur Erfassung geeignet ist, umfassen Antikörper, Medikamente, Polynukleotide, Zellmembranrezeptoren, Zuckerstoffe, Nukleinsäuren oder sogar synthetische Moleküle; die Zielsubstanz kann auch ein Gas sein.
Um die Vorteile des bevorzugten Ausführungsbeispiels zu verstehen ist es hilfreich, zuerst die Struktur und die Funktion eines optischen Resonators zu verstehen, sowie bestimmte Optikprinzipien. Diese Konzepte werden daher kurz umrissen.
Wenn sich Licht durch ein Medium bewegt, kann es vollständig reflektiert werden, wenn es auf eine Schnittstelle mit einem anderen Medium eines geringeren Brechungsindex trifft. Dieses Phänomen wird Gesamtinnenreflexion (TIR = total internal reflection) genannt und tritt bei Einfallswinkeln größer als einem kritischen Winkel, θ_c, auf. Das elektromagnetische Feld breitet sich dann nicht länger in dem zweiten Medium aus sondern zerfällt exponential weg von der Schnittstelle.
In seiner einfachsten Form besteht ein optischer Resonator oder ein Hohlraum aus mehreren Spiegeloberflächen, die so angeordnet sind, daß einfallendes Licht gefangen wird und zurück und vor zwischen den Spiegeln abprallt. Als ein Beispiel wird der Fall betrachtet, in dem einer der Spiegel ein Prisma mit einer Fläche ist (einer TIR-Oberfläche), die den Lichtstrahl innerhalb des Resonatorhohlraums (den Strahl innerhalb des Hohlraums = intracavity beam) vollständig reflektiert. An dem Reflexionspunkt an der Prismaoberfläche wird eine abklingende Welle mit einer charakteristischen Abnahmetiefe erzeugt, die typisch für eine optische Wellenlänge ist. An der TIR-Oberfläche wird das Licht auf die Oberfläche beschränkt und es interagiert nur mit Chemikalien innerhalb der Abnahmetiefe der Oberfläche.
Wie auf dem Gebiet der Optik bekannt ist, ist eine elektromagnetische Welle in einer bestimmten Richtung abklingend, wenn sie eine konstante Phase in dieser Richtung beibehält, weist aber eine sich exponential verringernde Amplitude auf. In dem Fall von TIR, richtet Licht in der Form einer unendlichen ebenen Welle ein sich exponential verringerndes, abklingendes elektromagnetisches Feld über eine unendliche ebene TIR-Oberflächengrenze hinaus ein. Obwohl das elektrische Feld Geschwindigkeitskomponenten in der Ebene der TIR-Grenze aufweist, besteht keine Geschwindigkeitskomponente senkrecht zu der und über diese Grenze hinaus. Anders ausgedrückt, für den idealisierten Fall, wird nur ein potentieller Gradient über eine TIR-Grenze hinaus eingerichtet; keine Energie wird tatsächlich über die Grenze hinaus transportiert.
Bei praktischen Anwendungen natürlich ist weder das einfallende elektromagnetische Feld noch die TIR-Oberfläche unendlich. Für solche endlichen Konfigurationen ist bekannt, daß ein Teil des Lichts innerhalb der Grenze gebeugt wird, d. h., ein Teil der Energie fließt direkt über die Grenze hinaus, „kurvt" zurück hin zu der Grenze, tritt wieder in das Anfangsmedium ein und tritt dann eine geringe Distanz entfernt von dessen Eintrittspunkt wieder aus; dies ist als der Goos-Hänchen-Effekt bekannt. Bei den meisten Vorrichtungen, die TIR-Oberflächen verwenden, ist die Verschiebung vernachlässigbar. Der große elektromagnetische Potentialgradient über die Grenze hinaus verbleibt jedoch.
1 ist eine vereinfachte schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des verwendeten optischen Stehwellenresonators. Bei dem vereinfachten Ausführungsbeispiel, das in 1 gezeigt ist, wird angenommen, daß eine Lichtquelle außerhalb des Resonatorhohlraums angeordnet ist (Beispiele von anderen Systemen sind nachfolgend dargestellt und erörtert). Wie 1 zeigt, umfaßt der einfache optische Resonator einen Eingangsspiegel 20, einen Ausgangsspiegel 22 und ein Reflexionselement 24, das eine TIR- Oberfläche 26 aufweist. Die Spiegel 20, 22 können entweder flach oder gekrümmt sein und werden unter Verwendung von herkömmlichen Kriterien ausgewählt, die geeignet zum Erzeugen eines stabilen Hohlraumfeldes sein sollen, was in der Technik bekannt ist. Geeignete, stabile Hohlraumfelder können ferner unter Verwendung einer Konfiguration erzeugt werden, mit mehr als zwei Spiegeln.
Licht wird durch eine herkömmliche Lichtquelle 25 erzeugt, die vorzugsweise ein kohärentes Gewinnmedium ist. Die Lichtquelle 25 kann entweder extern zu dem Resonatorhohlraum sein, wie in 1 gezeigt ist, oder kann innerhalb des Hohlraums eingelagert sein, wie nachfolgend beschrieben und gezeigt ist. Für Ausführungsbeispiele, die eine externe Lichtquelle verwenden, weist das Licht, das in den Hohlraum eintritt, eine Einfallsintensität I_inc auf. In diesem Fall kann die Lichtquelle ferner andere bekannte optische Komponenten umfassen, die derselben ermöglichen, ein stabiles Hohlraumfeld zu erzeugen. Bei allen Ausführungsbeispielen ist die Intensität des Zirkulationsfeldes direkt innerhalb des Eingangsspiegels 20 I_circ.
Ein Einfallswinkel ist als der Winkel θ zwischen dem Lichteinfallsweg auf der TIR-Oberfläche und der Normalen (angezeigt durch die gestrichelte Linie 28 senkrecht zu der Oberfläche 26) zu der TIR-Oberfläche an dem Einfallspunkt definiert. Ausschließlich der Einfachheit der Erklärung und der Analyse halber ist die TIR-Oberfläche 26 als eine Ebene gezeigt. Dies ist nicht notwendig. Die Definition von Einfallswinkeln für nicht-planare oder stückweise planare Oberflächen ist auf dem Gebiet der Optik bekannt. Es ist bekannt, daß chemische Änderungen an der TIR-Oberfläche 26 die optischen Eigenschaften des Resonators beeinflussen. Diese Eigenschaften, die nachfolgend erklärt werden, liegen zumindest einigen der Ausführungsbeispiele zugrunde und bilden die Basis des bevorzugten Wandlers.
Um eine Grundlage zum Bestimmen der Empfindlichkeit der verschiedenen Ausführungsbeispiele zu liefern, die nachfolgend beschrieben werden, ist es nützlich, die Intensität der elektromagnetischen Felder sowohl innerhalb als auch übertragen durch den Resonator zu bestimmen. Ausschließlich der Einfachheit halber berücksichtigt die nachfolgende Analyse nur eine TIR-Oberfläche innerhalb des Resonatorhohlraums. Fachleute auf dem Gebiet könnten die Analyse jedoch ohne weiteres unter Verwendung von bekannten mathematischen Techniken erweitern, um viele TIR-Oberfläche aufzunehmen. Bei der Struktur, die in 1 gezeigt ist, kann das Reflexionselement 24 z. B. ein Wellenleiter oder eine Faser sein, wobei in diesem Fall mehrere TIR-Oberflächen vorliegen können. Die bevorzugten Erfassungssysteme weisen eine Anzahl von TIR-Oberflächen innerhalb des Hohlraums auf.
1 ist eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung mit einer einzelnen TIR-Oberfläche innerhalb des Resonatorhohlraums. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist das Reflexions-Element oder -Bauglied 24 als ein Prisma gezeigt, so daß die TIR-Oberfläche 26 eine Fläche des Prismas ist. Es wird darauf hingewiesen, daß wenn das Reflexionselement als ein Prisma ausgewählt ist, es nicht notwendig ist, daß dasselbe ein rechtwinkliges Prisma ist. Ferner ist es nicht notwendig, daß die TIR-Oberfläche planar ist; wie oben herausgestellt ist, kann die TIR-Oberfläche gekrümmt sein, (z. B. für bestimmte optische Fasern) oder stückweise planar sein oder beides.
Wie nachfolgend detaillierter erörtert wird, ist ein Prisma nur ein Beispiel eines geeigneten TIR-Elements; andere Beispiele sind Wellenleiter und Fasern. Zusätzlich dazu kann die TIR-Oberfläche 26 auf einer optisch transparenten Substratoberfläche vorliegen, wie z. B. einem Glasdia, einem optischen Film oder einem Wellenleiter, der optisch mit dem TIR-Element auf herkömmliche Weise gekoppelt ist, z. B. unter Verwendung eines komprimierbaren optischen Polymers oder eines Indexanpassungsöls. Die Substratoberfläche kann von dem TIR-Element entfernbar sein und kann sogar ein Einweggegenstand sein. Wenn die Testprobe direkt an dem TIR-Element angebracht ist, wie z. B. das Prisma, kann es notwendig sein, das Prisma vor dem Testen einer anderen Substanz zu reinigen oder zu ersetzen, und die Ausrichtung des Prismas muß dann überprüft und möglicherweise neu angepaßt werden. Ein Bereitstellen eines entfernbaren Substrats beseitigt oder reduziert zumindest die Kosten und den Aufwand zumindest beträchtlich, der beim Sicherstellen umfaßt ist, daß das Prisma sauber und ausgerichtet ist.
Um die Analyse weiter zu vereinfachen sei angenommen, daß alle elektromagnetischen Felder innerhalb des Resonator ebene Wellen sind. Fachleute auf dem Gebiet der Optik werden wiederum ohne weiteres in der Lage sein, die Analyse auf Ausführungsbeispiele der Erfindung zu erweitern, für die diese Annahme nicht gültig ist. Der Leistungsreflexionskoeffizient, R_i, des i-ten Spiegels (in dem allgemeinen Fall mit i Spiegeln) ist gegeben durch R_i = r_i ² (für das Zweispiegelausführungsbeispiel, das in 1 gezeigt ist gilt i = 1, 2). Es sei nun angenommen, daß das Reflexionselement 24 (bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel ein Prisma) Niedrigverlust-Eintritts- und -Austritts-Flächen aufweist. Der Reflexionskoeffizient des Prismas ist daher R_P = |r_p|², und wird nur durch die TIR-Oberfläche 26 bestimmt.
Eine Probe 30, die analysiert werden soll, ist direkt benachbart zu der TIR-Oberfläche 26 angeordnet. Wie nachfolgend erklärt wird, ist die Probe vorzugsweise innerhalb von ungefähr einer Wellenlänge der TIR-Oberfläche angeordnet.
Die optischen Eigenschaften der Probe 30 an der TIR-Oberfläche 26 werden durch den Probenbrechungsindex n_s beschrieben. Der Wert von r_p hängt von n_s ab, von dem Brechungsindex des Prismas (oder eines anderen Reflexionselements), n_p, und schließlich von dem Einfallswinkel, θ. Für TM oder parallel polarisiertes Licht kann gezeigt werden (siehe z. B. Lorrain, P. und Corson, D. Electromagnetic Fields and Waves, W.H. Freeman, San Franzisko, 1970), daß:
wobei n = n_s/n_p. Für sin θ > n (d. h. θ > θ_c, TIR) , ist r_p komplex und das negative Vorzeichen vor der Quadratwurzel trifft zu. Der Wert für r_p kann nützlicher in Zeigerschreibweise ausgedrückt werden: r_p = r·e¹⁰. Wenn TIR auftritt, r = 1, weist das reflektierte Licht eine Phasenverschiebung ϕ auf und R_p = 1. 2a und 2b zeigen r (θ) bzw. ϕ(θ) für eine Schnittstelle zwischen geschmolzenem Silika (n_p = 1,457) und Wasser (n_s = 1,33). Die Eindringtiefe d(θ), ausgedrückt in Einheiten der Wellenlänge, über die die Intensität des abklingenden Feldes abfällt zu dessen Punkt 1/e, ist gegeben durch den Ausdruck d = λ/F(θ), wobei F(θ) = 4πn_p(sin²θ – n²)^1/2, und λ ist die Wellenlänge des einfallenden Lichts. 2 zeigt eine Skizze von 1/F(θ). Die Eindringtiefe ist ungefähr eine Wellenlänge bei großen Einfallswinkeln, während sie bei dem kritischen Winkel unendlich ist (bei dieser Näherung).
Der Leistungsübertragungskoeffizient T₁ für das i-te einer Serie von p Reflexionselementen ist gegeben durch T₁ = 1 – R_i; i = 1, 2,..., p (in 1 ist nur eines gezeigt – das Prisma 24 – so daß p = 1). Für eine gegebene Lichtintensität, I_inc, die auf dem Resonator einfällt, wird die Intensität, I_circ des Zirkulationsfeldes direkt innerhalb des Eingangsspiegels 20 (1) durch folgendes Verhältnis bestimmt
wobei α der Spannungsabsorptionskoeffizient in dem Resonator ist, L die Hin-Rück-Weglänge ist und ω die Winkelfrequenz des Lichts ist. (Siehe z. B. Siegman, A.E., Lasers, University Sciece Books, Mill Valley, California, 1986.) Gleichung 2 gilt strikt nur direkt innerhalb des Eingangsspiegels 20, aber für einen Niedrigverlust-Stehwellenresonator, wie z. B. den, der in 1 gezeigt ist, ist die Durchschnittsintensität ungefähr 2·I_circ irgendwo in dem Resonator ist.
Fortschreitend aus Gleichung 2 kann leicht gezeigt werden, daß wenn r_p ² = 1 (d. h. eine einfache Reflexion von einem Spiegel), dann ist I_circ auf einem Maximum für die Frequenzen ω = ω_m, die die Gleichung erfüllen:
Gleichung 3 definiert die Resonanzmodusfrequenzen, ω_m, des Resonators. Diese Frequenzen sind voneinander durch einen Wert 2πc/L getrennt, der üblicherweise als Modusbeabstandung bezeichnet wird.
Unter der Beobachtung, daß r_p ² = r²e^2jϕ und Einsetzen desselben für r_p in Gleichung 2 ergibt sich:
wobei Ω = ω^∞(2ϕc)/L.
Auf ähnliche Weise ist die Intensität, I_trans, des Lichts, das durch den Resonator übertragen wird, gegeben durch das Verhältnis:
Wie 1 darstellt, ist bei diesen Ausführungsbeispielen der Erfindung, die das Vorhandensein von Chemikalien basierend auf I_trans oder einer anderen Eigenschaft des Lichts erfassen, das aus dem Hohlraum auftritt, ein herkömmlicher Detektor 29 sowie eine Umwandlungs- und Verarbeitungs-Schaltungsanordnung eines begleitenden herkömmlichen Signals (nicht gezeigt) benachbart zu dem Ausgangsspiegel 22 umfaßt. Für Ausführungsbeispiele, die die Intensität I_trans des übertragenen Lichts messen, ist der Detektor 29 eine geeignete Intensitätsmeßvorrichtung. Wie nachfolgend erörtert wird, sind andere Typen von Detektoren umfaßt, wenn andere Eigenschaften gemessen werden.
Die Auswirkung der Phasenverschiebung ? aufgrund von TIR soll die der Resonanzfrequenz ω_m des Resonators erhöhen, was wie folgt ausgedrückt werden kann:
Wie 2b zeigt, liegt eine Phasenverschiebung von π an dem Brewster-Winkel vor (42,4°). Ferner beginnt sich die Phase zu erhöhen sobald TIR auftritt. Die Maximalphasenverschiebung ist 2π, so daß sich die Resonanzfrequenz um maximal zwei Modenbeabstandungen ändert. Es wird darauf hingewiesen, daß diese Analyse die sehr geringen Phasenverschiebungen nicht umfaßt, die bei Reflexionen von echten Spiegeln auftreten können. Die Phasenverschiebungen, die durch die Spiegel verursacht werden, sind viel weniger als π, sind allgemein konstant und können daher in allen praktischen Fällen ignoriert werden.
Wie die Erörterung oben erklärt und wie durch ein Experiment ausgeführt wird, ist das abklingende Feld, das an dem Punkt von TIR erzeugt wird, äußerst empfindlich für die optischen Eigenschaften der umliegenden chemischen Umgebung. Diese Theorie wird angewendet, um einen Detektor zu liefern, der zumindest eine Größenordnung empfindlicher ist als herkömmliche Systeme, und der dies ausschließlich unter Verwendung von Oberflächenproben (im Gegensatz zu Massenproben) durchführen kann.
In der gesamten Literatur wurden viele unterschiedliche Strukturen (wie z. B. die von Harrick) als optische Resonanzhohlräume bezeichnet, ausschließlich basierend auf der Tatsache, daß sie eine konstruktive Interferenz von Lichtwellen verwenden. Eine konstruktive Interferenz allein ist jedoch nicht ausreichend, um einen praktischen optischen Wandler mit hoher Empfindlichkeit zu erzeugen.
Die Figuren zeigen lineare Resonatoren ausschließlich zum Zweck der Darstellung; sogar für nicht-lineare Resonatoren (wie z. B. einen Ringresonator), ist das bevorzugte Verfahren das gleiche: ein Analyt oder eine Probe, die analysiert werden soll, wird innerhalb der Region des abklingenden Feldes einer TIR-Oberfläche plaziert, was eine Oberfläche eines Reflexionselements ist, das innerhalb des Hohlraums eines optischen Resonators angeordnet ist.
Die Wahl des optischen Resonators, der bei einer bestimmten Anwendung verwendet wird, ist eine Entwurfsoption und hängt von den Bedürfnissen und Charakteristika dieser Anwendung ab. Bei vielen Anwendungen können komplexere Resonatoren, wie z. B. jene beschrieben durch Sirgman, besser geeignet sein als der einfache Resonator, der in den Figuren hierin schematisch gezeigt ist.
Beispiele von geeigneten Resonatoren umfassen Fabry-Perot, „V"-förmig, Michaelson-Spiegel, Fox-Smith und Sagnac. Der große Vorteil dieser Strukturen ist, daß sie stabile und optische Niedrigverlust-Modi erzeugen. Dies bedeutet, daß ein größerer Teil des verfügbaren Lichts für Erfassungsanwendungen verwendet werden kann. Ferner, während die meisten nützlichen Resonatoren Gauss-förmige Strahlenprofile aufweisen, geht die oben verwendete Analyse von ebenen Wellen aus. Wie oben erwähnt wurde, wird diese Annahme jedoch nur der Klarheit und Einfachheit halber gemacht und kann auf nicht-planare Ausführungsbeispiele ausgeweitet werden. Anders ausgedrückt sind die Ergebnisse, die unter Verwendung der Annahme von ebenen Wellen erhalten werden, im wesentlichen dieselben wie für kompliziertere Konfigurationen, aber die Analyse wird bedeutend vereinfacht.
Unter Verwendung eines Diodenlasers als eine Lichtquelle könnte ferner ein vollständig integrierter Festkörperwandler aufgebaut werden, der geeignet für eine Verwendung bei den bevorzugten Ausführungsbeispielen ist. Die bevorzugten Ausführungsbeispiele können ferner einen Resonator einlagern, der bei einer Wellenlänge gepumpt wird und der eine andere Wellenlänge innerhalb des Hohlraums erzeugt (siehe z. B. Kozlovsky, W.J. Nabors, C.D. und Byer, R.L., „Efficient second harmonic generation of diode-laser-pumped cw Nd: YAG laser using monolithic MgO:LiNbO3 external resonant cavities. „IEEE J. Quant. Elec., 24, 913 (1988)); dies würde die Verwendung einer Hochleistungsquelle bei unterschiedlichen Wellenlängen möglich machen.
Es bestehen viele Reflexionselemente mit geeigneten TIR-Oberflächen, die innerhalb eines solchen optischen Resonators eingelagert werden könnten. Beispiele umfassen: 1) Prismen (z. B. ein Dove-Prisma): 2) Fasern, entweder mit optischem Gewinn (wie z. B. Faserlaser) oder ohne; und 3) Wellenleiter.
Ausführungsbeispiele der Erfindung zur Erfassung von mikroskopischen und makroskopischen chemischen Probeneigenschaften
Unterschiedliche Konfigurationen des Detektors können für unterschiedliche Typen der Oberflächenchemikalienerfassung verwendet werden, teilweise abhängig von den Eigenschaften des optischen Resonators, der in dem System verwendet wird. Genauer gesagt kann das bevorzugte Verfahren bei Detektorausführungsbeispielen verwendet werden, die die Interaktion von Licht in dem Resonator mit mikroskopischen und makroskopischen Eigenschaften des Analyten erfassen. Mikroskopische Eigenschafen der Proben, die analysiert werden sollen, umfassen Interaktionen von Licht mit einzelnen Atomen oder Molekülen, wie z. B. Fluoreszenz. Makroskopische Eigenschaften umfassen Interaktionen von Licht mit einer Gesamtheit von Atomen oder Molekülen, wie z. B. dem Brechungsindex des Analyten.
Die Empfindlichkeit einer Umwandlungstechnik basierend auf mikroskopischen Eigenschaften ist viel größer als die basierend auf makroskopischen Eigenschaften, einfach weil eine große Anzahl von Partikeln benötigt wird, um ein makroskopisches Phänomen zu erzeugen. Anders ausgedrückt, ist ein Erfassungsverfahren nicht in der Lage, nur ein paar Moleküle zu erfassen, wenn es viele Moleküle benötigt, nur um ein Ergebnis zu erzeugen. In beiden Fällen wird die Empfindlichkeit der Erfindung jedoch verbessert, wenn ein geeignetes Etiketten-Molekül oder ein -komplex, wie z. B. Fluorophor, an den Analyten angewendet wird.
Intensitätsabhängige Abklingerfassung (mikroskopische Erfassungseigenschaften)
Für optikbasierte Umwandlungsverfahren von mikroskopischen Eigenschaften hängt das Signal, z. B. Fluoreszenz, von der Intensität des elektromagnetischen Feldes ab. Die Empfindlichkeit ist häufig durch die Rauschäquivalenzleistung des Detektors eingeschränkt. Eine Erhöhung der Intensität reduziert den Betrag des Analyten, der notwendig ist, um das Rauschäquivalenzsignal zu erzeugen, wodurch die Empfindlichkeit erhöht wird. Einfacher ausgedrückt, je mehr Leistung das System zur Verfügung hat, desto weniger von dem Analyten benötigt es, um denselben zu erfassen. Dies bleibt so, wenn sich die Leistung erhöht, bis Sättigungs- oder Abschnür-Effekte beginnen, eine Rolle zu spielen.
Eine Möglichkeit, die Leistung zu erhöhen, ist eine intensivere Lichtquelle zu verwenden, aber dies erhöht den elektrischen Leistungsverbrauch und die physische Größe des Detektors. Diese Erfindung verwendet jedoch die Eigenschaft, daß die Intensität des elektromagnetischen Feldes innerhalb des Hohlraums eines optischen Resonators häufig viele Größenordnungen größer ist als die Einfallsintensität. Diese Erhöhung der Intensität kann durch Bewerten von Gleichung 2 demonstriert werden, angenommen keine Verluste innerhalb des Hohlraums (α = 0), Gleiche Spiegelreflexionsvermögen, R = R₁ = R₂, θ > θ_i (d. h. TIR) , und daß die Einfallslichtfrequenz auf eine Hohlraumresonanz abgestimmt ist. Für diese Umstände wird Gleichung 2 reduziert auf I_circ/I_inc = 1/ (1 – R).
Es sind ohne weiteres Spiegel erhältlich, die so geringe Verluste aufweisen wie 20 ppm (R = 0,99998), was zu einem theoretischen Verstärkungsfaktor innerhalb des Hohlraums von I_circ/I_inc = 1/1 – R) = 50.000 führt. Obwohl andere Verluste innerhalb des Hohlraums diese Zahl reduzieren, können ohne weiteres Experimentverstärkungsfaktoren größer als 10³ unter Verwendung der Erfindung und handelsüblich erhältlicher Spiegel erreicht werden.
3 stellt schematisch ein Ausführungsbeispiel der Erfindung dar, das eine externe Lichtquelle verwendet. Merkmale dieses Ausführungsbeispiels, die funktional gesehen gleich zu jenen sind, die in 1 beschrieben sind, weisen in 3 dieselben Bezugszeichen auf, die sie in 1 aufweisen. Die Quelle 25 ist an der Resonanzfrequenz des Hohlraums unter Verwendung von Techniken frequenzverriegelt, die in der Technik bekannt sind.
Da der Detektor innerhalb einer Lichtquelle arbeiten kann und dies vorzugsweise tut, die außerhalb aber frequenzverriegelt an dem Hohlraum ist, kann die Lichtquelle ein Halbleiter sein, wie z. B. ein Diodenlaser oder eine Superlumineszenzdiode. Dies ergibt einen bedeutenden Vorteil gegenüber herkömmlichen Systemen, wie z. B. dem, das durch Godlevskii/Kopytin beschrieben ist, bei dem das Lasergewinnmedium innerhalb des optischen Resonators vorliegt. Diodenlaser und andere Halbleiter-Lichterzeugungsvorrichtungen sind Miniaturvorrichtungen, die üblicherweise 10 bis 100 mal weniger Strom benötigen als interne Gewinnmedien, und die wenn sie mit einem externen optischen Resonanzhohlraum gekoppelt sind mit derselben oder einer sogar noch höheren Leistung innerhalb des Hohlraums betrieben werden können. Systeme mit einem internen Gewinnmedium, wie z. B. Godlevskii/Kopytin, können keine solchen kompakten Halbleitervorrichtungen als ihre Lichtquelle verwenden, da diese Vorrichtungen üblicherweise dem starken Feld nicht standhalten können, das innerhalb des Hohlraums erzeugt wird. Systeme wie das von Godlevskii/Kopytin sind somit insofern eingeschränkt, daß sie keine Möglichkeit liefern, Diodenlaser zu verwenden und eine hohe Empfindlichkeit durch eine große Leistung innerhalb des Hohlraums beibehalten. Halbleiterlichtquellen, wie z. B. Diodenlaser, ermöglichen ferner, daß kleine optische Hohlräume verwendet werden. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, daß die Größe des Erfassungssystems insgesamt reduziert werden kann.
Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel wird ein Prisma als das Reflexionselement 24 verwendet. Das Prisma 24 weist eine TIR-Fläche oder -Oberfläche 26 auf, an der ein Erfassen ausgeführt wird, und deren Eingangs- und Ausgangs- Flächen sind vorzugsweise im Winkel von Brewster angeordnet, um einen Verlust zu minimieren. Wie oben erörtert wurde, können andere Bauglieder oder Elemente anstatt eines Prismas verwendet werden, um die TIR-Oberfläche zu liefern. Der Zweiwege-Lichtweg innerhalb des Hohlraums ist durch die Linie 27 angezeigt, die Zweiwegepfeile zeigt. Der Analyt 30 ist auf herkömmliche Weise an der TIR-Oberfläche 26 befestigt, so daß er innerhalb der Region des abklingenden Feldes des Lichtes vorliegt, das durch die TIR-Oberfläche 26 reflektiert wird. Geeignete Befestigungsverfahren umfassen eine direkte, erneuerbare oder nicht-erneuerbare chemische Anbringung und andere erneuerbare Verfahren, wie z. B. das Verwenden von magnetischen Partikeln, die gegen die Oberfläche durch ein Magnetfeld gehalten werden.
Bei dem Ausführungsbeispiel, das in 3 gezeigt ist, bildet der Spiegel 20 weiterhin einen Eingangsspiegel, da das Licht von der Quelle 25 durch denselben in den Resonanzhohlraum geleitet wird, aber das Licht nicht mehr durch den Spiegel 22 übertragen wird. Bei anderen Ausführungsbeispielen der Erfindung, die nachfolgend beschrieben werden, ist die Lichtquelle 25 zwischen den Spiegeln 20, 22 in dem optischen Weg umfaßt. Abhängig von dem Ausführungsbeispiel übertragen keiner, einer oder beide der Spiegel 20, 22 teilweise oder sind teilweise oder vollständig reflektierend.
Bei diesem Ausführungsbeispiel wird angenommen, daß der Analyt entweder natürlich im Vorhandensein einer elektromagnetischen Anregung fluoresziert, oder daß derselbe mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen ist, wie z. B. Fluorophor. Wie oben erwähnt wurde, ist die abklingende Intensität I_circ viele Größenordnungen größer als die einfallende Intensität I_inc. Dadurch ist der Grad von elektromagnetischer Erregung innerhalb der Abklingendes-Feld-Region an der TIR-Oberfläche ebenfalls viele Größenordnungen größer als der Grad der Erregung, der aus dem einfallenden Licht erhalten werden kann. Das abklingende Feld verursacht daher entweder eine erfaßbare Fluoreszenz in viel kleineren Beträgen des Analyten als durch herkömmliche Systeme benötigt werden, oder ist in der Lage, eine äquivalente erfaßbare Fluoreszenz unter Verwendung von weniger optischer Quelleistung zu verursachen.
Eine Fluoreszenz von dem Analyten 30 wird in 3 durch drei nach außen strahlende Pfeile angezeigt und durch einen herkömmlichen Fluoreszenzdetektor 34 erfaßt. Der Fluoreszenzdetektor 34 kann eine bekannte Vorrichtung sein, die ein elektrisches Ausgangssignal erzeugt, das der Lichtintensität von der Fluoreszenz entspricht, die dessen Erfassungs-Oberfläche oder -Element trifft. Der Fluoreszenzdetektor 34 ist vorzugsweise mit einem Prozessor 36 verbunden, der bekannte Verfahren anwendet, um die Signale von dem Detektor 34 in eine Form umzuwandeln, die für eine Übertragung zu einem anderen System und/oder für eine Anzeige auf einer herkömmlichen Anzeigevorrichtung 38 geeignet ist.
Fluoreszenz ist eine nicht-kohärente, lineare Frequenzumwandlung von Licht. Es kann gezeigt werden, daß die Intensität der Fluoreszenz direkt proportional zu dem Betrag der Probe ist, die innerhalb von ungefähr einer optischen Wellenlänge der TIR-Oberfläche 26 vorliegt. Andere Typen einer Lichterzeugung innerhalb der Probe, wie z. B. eine nichtlineare und eine kohärente Lichterzeugung, können ebenfalls erfaßt werden, wobei in diesem Fall geeignete herkömmliche Lichtdetektoren weiterhin als der Detektor 34 verwendet werden können. Der Schlüsselvorteil des bevorzugten Verfahrens unabhängig von dem Typ des Lichts, das innerhalb der Probe erzeugt wird, ist dessen hocheffiziente Verwendung von verfügbarer Laserenergie, was die minimal erfaßbare Oberflächenkonzentration um Größenordnungen reduziert.
4 stellt ein Ausführungsbeispiel der Erfindung dar, das den Verbesserungsfaktor des Resonators durch Einschließen eines Reflexionselements erhöht, das ferner einen opti schen Gewinn (α < 0) aufweist. Bei diesem Ausführungsbeispiel weist der Resonator einen Faserlaser 44 als ein Gewinnmedium auf (der Klarheit halber ist nur ein Abschnitt der Faser dieser anderweitig bekannten Vorrichtung dargestellt), in dem eine TIR-Oberfläche 46 erzeugt wird, durch Entfernen eines Abschnitts einer Umhüllung 48, die üblicherweise die tatsächliche optische Faser 50 umgibt. Die Lichtquelle, Spiegel und Erfassungs- und Verarbeitungs-Schaltungsanordnung sind der Einfachheit halber nicht gezeigt; diese Elemente können dieselben sein – physisch und/oder funktional – wie jene, die oben für das Ausführungsbeispiel beschrieben sind, das in 3 gezeigt ist.
Da ein Faserlaser üblicherweise optischen Gewinn aufweist, ist das abklingende Feld in der nicht-umhüllten Region, die die TIR-Oberfläche bildet, sehr groß. Ein Erfassen der Fluoreszenz (bei Anwendungen, die Fluoreszenzanalyten verwenden) wird üblicherweise unter Verwendung einer Erfassungs- und Verarbeitungs-Schaltungsanordnung ausgeführt, wie für 3 gezeigt und beschrieben wurde, wobei der Analyt 30 benachbart zu dem „Fenster" in der Umhüllung befestigt ist, d. h., benachbart zu der TIR-Oberfläche 46.
Es ist ferner möglich, die Quelle 25 innerhalb des Resonanzhohlraums aus 3 zu bewegen. 5 stellt ein Ausführungsbeispiel dar, bei dem dies durchgeführt wurde. Bei diesem Ausführungsbeispiel kann die Lichtquelle unterschiedliche herkömmliche Optiken erfordern, aber notwendige Änderungen sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Eine geeignete Lichtquelle für dieses Ausführungsbeispiel wäre eine Heliumneonlaserröhre. Heliumneonlaser sind handelsüblich erhältlich und weisen Zirkulationsleistungen höher als 100 W auf, sind jedoch trotzdem relativ kompakt. Eine geeignete Laserröhre wird z. B. von Particle Measurement Systems in Boulder, Colorado, USA hergestellt. Es können jedoch auch andere Lasertypen verwendet werden. Ein Erfassen von Fluoreszenz wird wie bei dem Ausführungsbeispiel ausgeführt, das in 3 gezeigt ist.
Bei den Ausführungsbeispielen, die in 3-5 gezeigt sind, wird die hohe Intensität des abklingenden Feldes innerhalb des Hohlraums verwendet, um die Fluoreszenz von Molekülen in der Nähe der TIR-Oberfläche zu erregen. Daß der Detektor in der Lage ist, Spurenbeträge eines Analyten von einer Oberflächenprobe zu erfassen, liefert große Vorteile an sich, und diese Vorteile werden oben erörtert. Ein wiederum anderer Vorteil ist jedoch, da sogar Spurenbeträge des Fluoreszenzanalyten erfaßt werden können, daß die Fluoreszenz nicht als ein beträchtlicher Verlustmechanismus für den Resonator wirkt, und in jedem Fall weniger Verlust verursacht als die Proben, die in Systemen erforderlich sind, wie z. B. dem von Godlevskii.
Als ein Beispiel eines Verfahrens zum Erfassen von fluoroskopischen Spurenanalyten wird eine biochemische Untersuchung betrachtet, bei der ein tatsächlich positives Ergebnis zu dem Vorhandensein von Fluorophor in dem abklingenden Feld führt. Wenn ein Farbmittel mit einer (hohen) Molabsoroptionskonstante von 200.000 M^–1cm^–1 (wie z. B. CY5) verwendet wird, dann ist die Oberflächenkonzentration, die äquivalent zu einem Streuverlust von 300 ppm ist, ungefähr 0,5 pmole cm^–2 (was ungefähr 6 × 10⁹ Partikel/mm² entspricht). Dieser Streuverlust ist ausreichend, um die Zirkulationsintensität eines praktischen Resonators um 50% zu reduzieren. Diese Farbmittelkonzentration ist nahe an dem theoretischen Maximum, das kovalent an eine geeignete Oberfläche gebunden werden kann. Eine nicht verstärkte DNA-Erfassung verwendet z. B. eine um bis zu drei Größenordnungen niedrigere Konzentration. Es wird darauf hingewiesen, daß wenn die Absorptionskonstante abnimmt, sich die Anzahldichte von Partikeln, die notwendig ist, um das Feld innerhalb des Hohlraums zu stören, erhöht. Dies bestimmt die Empfindlichkeitsgrenze von Techniken, wie z. B. der von Godlevskii, die auf Absorption basieren.
Die Godlevskii/Kopytin-Vorrichtung verwendet eine „verhinderte" Gesamtinnenreflexion (FTIR = frustrated total internal reflection), was bedeutet, daß sie absichtlich Licht aus dem Laserhohlraum läßt. Es muß ein Verlustmechanismus erzeugt werden, da dieses Erfassungsverfahren auf dem Erfassen eines Verlusts basiert. Da die Vorrichtung von Godlevskii absichtlich einen Verlust einbringt, muß Licht so oft wie möglich gegen unterschiedliche Punkte auf der TIR-Oberfläche „aufprallen"; jeder Aufprall wirkt als ein Erfassungspunkt. Dies ist notwendig, damit so viel Licht wie möglich an der TIR-Grenze vorbei und absorbiert werden kann, und dadurch um einen erfaßbaren Verlust zu erzeugen. Es sind mehrere Aufpralle erforderlich für jeden Analyten, der erfaßt werden soll.
Bei Vorrichtungen, wie z. B. der von Godlevskii, ist eine Reduzierung der Intensität aufgrund von Absorption daher nicht nur akzeptabel, es ist ferner notwendig, damit das System ordnungsgemäß arbeiten kann. Da die Godlevskii-Vorrichtung auf dem Erfassen von Absorptionsverlusten basiert, muß genug von dem Material vorhanden sein, wie z. B. dem Farbmittel, um genug Energie zu absorbieren, um das Feld innerhalb des Hohlraums zu stören. Wenn man versuchen würde, den Betrag des Farbmittels auf unterhalb den Punkt zu reduzieren, an dem das Feld gestört wird, dann wäre der Absorptionsverlust so klein, daß er durch das Godlevskii-System nicht erfaßbar wäre. Ferner ist das Godlevskii-System spezifisch für eine Erfassung von Gasen oder Aerosolpartikeln entworfen und nicht für Flüssigkeiten oder biologische Materialien. Aus Gründen der Struktur und des Verfahrens ist das Godlevskii-System daher nicht geeignet für eine Verwendung z. B. bei der nicht verstärkten DNA-Erfassung.
Im Gegensatz dazu erfaßt das bevorzugte Ausführungsbeispiel Konzentrationen weit unter (in den meisten Fällen mehrere Größenordnungen unter) dem Punkt, an dem das Feld gestört wird, und macht eine nicht verstärkte DNA-Erfassung mög lich. Im Gegensatz zu Systemen, wie dem von Godlevskii/Kopytin, ist die Gesamtinnenreflexion nicht verhindert, da kein Vertrauen auf einen Absorptionsverlust zum Erfassen von Fluoreszenz vorliegt. Ferner, da ein Verlust tatsächlich minimiert werden kann, wird nur ein Aufprall auf der TIR-Oberfläche für eine empfindliche Fluoreszenzerfassung oder für die anderen optischen Charakteristika benötigt, die nachfolgend beschrieben werden, die erfaßt werden und eine Anzeige des Vorhandenseins und des Betrags der Zielsubstanz liefern, die innerhalb der Probe an der TIR-Oberfläche enthalten ist. Anders ausgedrückt muß Licht nur an der TIR-Oberfläche an einem Punkt reflektiert werden (der kleinen Region, die in der Größe dem Querschnitt des Lichtstrahls entspricht).
Fluoreszenz ist nur eine einer Klasse von optischen Sondentechniken, die auf Lichtintensität und Änderungen oder Umwandlungen der Lichtfrequenz basieren und die die beschriebenen Ausführungsbeispiele verwenden kann. Andere Beispiele eines linearen Phänomens umfassen die Raman-Streuung oder die oberflächenverbesserte Raman-Streuung, die weit verbreitete Oberflächenerfassungstechniken darstellen. Andere nicht-lineare Techniken in dieser Klasse könnten ebenfalls vorteilhaft verwendet werden. Diese umfassen eine Erzeugung einer zweiten Harmonischen und eine simulierte Raman-Streuung. Nicht-lineare optische Effekte hängen von dem Quadrat oder dem Würfel der Lichtintensität ab und würden daher sogar noch mehr als Fluoreszenz von der Erhöhung der Intensität innerhalb des Hohlraums profitieren, die bereitgestellt wird.
Wenn sie als ein Fluoreszenz-basierter Detektor verwendet wird, wird die TIR-Oberfläche (außerhalb des Hohlraums) zuerst mit Chemikalien oder anderen Substanzen vorbehandelt, von denen bekannt ist, daß dieselben das Material binden, nach dem man testen möchte. Typische Bindeagenten umfassen Nukleinsäure, DNA und Proteine. Eine Fluoreszenzmarkierung wird dann an die Substanz(en) angewendet, die in der Test probe erfaßt werden sollen (die eine bekannte chemische Struktur aufweisen), unter der Annahme, daß die Substanz nicht natürlich fluoresziert. Eine Vorbehandlung in dieser Form erzeugt einen Zielkomplex, der die Zielsubstanz, die erfaßt werden soll, die Fluoreszenzmarkierung und möglicherweise auch Bindeagenten umfaßt. In Fällen, in denen eine Vorbehandlung nicht notwendig ist, z. B. wenn die Zielsubstanz selbst fluoresziert, besteht der Zielkomplex nur aus der Zielsubstanz. Eine Vorbehandlung einer Oberfläche und eine Fluoreszenzmarkierung sind bekannte Techniken bei der Erfassungstechnik und beliebige bekannte Verfahren können für diese Schritte verwendet werden.
Die Probe wird dann auf bekannte Weise in die vorbehandelte TIR-Oberfläche eingebracht. Wenn nichts von dem fluoreszierend markierten Material, das erfaßt werden soll, in der Probe vorhanden ist, wird nichts an die Bindeagenten angebracht und es liegt keine Fluoreszenz an der TIR-Oberfläche vor. Je mehr der Zielsubstanz vorhanden ist, desto mehr wird an den Bindeagenten gebunden und desto größer ist die Fluoreszenz. Der Fluoreszenzdetektor 34 erfaßt die Fluoreszenz und erzeugt ein Ausgangssignal, das der Intensität der erfaßten Fluoreszenz entspricht, die wiederum dem Betrag der Zielsubstanz entspricht, die in der Probe enthalten und an der TIR-Erfassungsoberfläche gebunden ist.
Es wird darauf hingewiesen, daß es möglich ist, eine Fluoreszenz zu erregen und zu erfassen, die sehr nahe an der TIR-Oberfläche erzeugt wird, sogar innerhalb der Dicke von einem Molekül des Bindeagenten und einem Molekül der Zielsubstanz. Natürlich führt eine dickere Schicht der Zielsubstanz zu sogar noch mehr Fluoreszenz, aber da eine bedeutend erhöhte Intensität in dem abklingenden Feld verwendet wird, kann viel weniger von dem Zielmaterial erfaßt werden, als für eine Erfassung unter Verwendung von verlustbasierten Systemen vorhanden sein muß, wie z. B. dem von Godlevskii/Kopytin.
Wie die Erörterung oben ergibt, bietet der verwendete optische Resonator eine Erhöhung um mehrere Größenordnungen bei der Empfindlichkeit für eine intensitätsabhängige Erfassung (wie z. B. Fluoreszenzerfassung) im Vergleich zu bekannten Verfahren und Vorrichtungen. Er ist ferner kompakter und verwendet um Größenordnungen weniger elektrische Leistung.
Ein Ändern des Einfallswinkels des Lichts auf der TIR-Oberfläche innerhalb des Hohlraums ändert die 1/e-Verfallstiefe des abklingenden Feldes. Dies wiederum ändert die Tiefe über der TIR-Oberfläche innerhalb der die Probe nach dem Vorhandensein der Zielsubstanz sondiert wird. Es ist daher vorteilhaft, den Einfallswinkel für eine bestimmte Anwendung der Erfindung zu optimieren. Die Auswahl des Optimierungsverfahrens hängt von der Intensität der verfügbaren Fluoreszenz im Vergleich zu der Intensität des Hintergrundlichts ab. Die Intensität kann während der Kalibrierung entweder mit demselben Detektor 34 gemessen werden, der für die tatsächliche Erfassung verwendet wird, oder mit einem separaten, herkömmlichen Detektor.
In dem einfachsten Fall ist die Fluoreszenz viel größer als das Hintergrundlicht. In diesem Fall wird der Einfallswinkel auf einen Anfangswinkel gesetzt, und dann wird der Winkel verändert (z. B. durch Drehen des Prismas), bis eine Maximalintensität erfaßt wird. Der Einfallswinkel wird dann auf den Winkel eingestellt, für den die Maximalintensität erreicht wurde.
In dem häufigeren Fall jedoch, ist die Intensität der Fluoreszenz jedoch viel geringer als die Hintergrundintensität. In einem solchen Fall kann ein herkömmliches optisches Filter vor dem Detektor verwendet werden. Das Filter läßt die Fluoreszenz passieren, blockiert das Hintergrundlicht jedoch stark. Der gefilterte Hintergrund bildet einen Teil des Fluoreszenzsignals, so daß, um das gefilterte Fluoreszenzsignal zu maximieren, während die ungefilterte Fluoreszenz minimiert wird, ein Anfangswinkel ausgewählt werden kann, die gefilterte und ungefilterte Intensität gemessen werden kann, dann der Winkel geändert werden kann und die Messung wiederholt werden kann, bis ein optimaler Winkel erreicht wird. Experimente zeigen an, daß dieses Verfahren gut funktioniert, sogar wenn der Hintergrund eine Million oder mehr mal intensiver ist als die Fluoreszenz.
Wenn die gefilterte Hintergrundintensität so groß ist, daß dieselbe nach dem Filtern immer noch eine sehr große Komponente ist, kann ein Steuerungsabschnitt (ohne Fluorophor) an der TIR-Oberfläche verwendet werden. In diesem Fall wird das Filter während der Messung vor Ort gelassen. Eine Fluoreszenz von dem Kontrollabschnitt und von einem Abschnitt mit Fluorophor wird als eine Funktion des Einfallswinkels gemessen. Der optimale Winkel wird dann ausgewählt, um der Winkel zu sein, mit dem die Differenz des Signals zwischen dem Steuerungsabschnitt und dem Fluoreszenzabschnitt maximal ist. Dieses Kalibrierungsverfahren erfordert eine TIR-Oberfläche mit zwei Abschnitten, aber dies ist normalerweise kein bedeutender Nachteil, da der Einfallswinkel nur einmal für eine gegebene Anwendung eingestellt werden muß.
Erfassen von makroskopischen Probeneigenschaften
Die bevorzugten Ausführungsbeispiele sind ferner hocheffektiv beim Erfassen von makroskopischen Eigenschaften der Probe, die auf Änderungen des Reflexionsindex der Oberflächenprobe oder auf Änderungen der Resonanzfrequenz des optischen Resonators und nicht auf dem Vorhandensein eines Fluoreszenzmaterials basieren. Beispiele solcher Ausführungsbeispiele folgen.
Brechungsindexerfassung
Wenn eine chemische Änderung an der TIR-Oberfläche erfolgt, ändert sich der Brechungsindex n_s der Probe ebenfalls. Ein Beispiel dieses Phänomens ist eine Untersuchung für Antikörper: ein Antigen ist an die TIR-Oberfläche gebunden und es wird die Antikörperkonzentration bestimmt, durch Messen der Änderung, Δn_s, in n_s, wenn der Antikörper sich an das Antigen bindet. Was folgt sind mehrere Ausführungsbeispiele zum Messen einer solchen Änderung in n_s unter Verwendung eines Resonators ähnlich zu jenen, die in den 1 und 3-5 gezeigt sind.
Gleichung 1 zeigt, daß R_p = 1 für Einfallswinkel größer als dem kritischen Winkel gilt. (Siehe auch 2a.) Für feste Einfallswinkel nahe dem kritischen Winkel, fällt der Wert von R_p plötzlich ab, wenn sich n_s erhöht. Anders ausgedrückt, wenn der Einfallswinkel in der Nähe (aber über) des kritischen Winkels eingestellt wird, führen geringe Änderungen bei n_s zu großen relativen Änderungen bei R_p. Alternativ dazu wird der plötzliche Abfall von R_p verwendet, um eine Empfindlichkeitsschwelle einzurichten.
6 ist eine Skizze des Verhältnisses R_p der reflektierten Intensität zur Einfallsintensität von einer TIR-Oberfläche zwischen Wasser und geschmolzenem Silika, als eine Funktion der Erhöhung Δn_s bei dem Brechungsindex von Wasser aufgrund des Vorhandenseins des Analyten. Bei dem hypothetischen herkömmlichen System, das in 6 gezeigt ist, ist die TIR-Oberfläche nicht innerhalb eines Resonanzhohlraums; daher liegen keine Spiegel vor. Der Einfallswinkel ist bei 70 Grad festgesetzt und die Empfindlichkeit
ist definiert als die Erhöhung des Brechungsindex, die notwendig ist, um das reflektierte Signal um 50% zu verringern. (Andere Schwellenwerte können natürlich verwendet werden.) Der Punkt, an dem R_p auf 50% von dessen Maximalwert abgefallen ist, ist ebenfalls angezeigt.
Wie erwartet liegt unter einem bestimmten Wert von Δ_ns die Gesamtreflexion und R_p = 1. Wenn sich der Betrag des Analyten erhöht, erhöht sich Δn_s weiter, bis bei ungefähr Δ_ns = 0,037, die Reflexionsintensität (und somit R_p) beginnt, schnell abzufallen. Nach einer weiteren Änderung bei Δ_ns von ungefähr 0,01 ist R_p um 50% abgefallen. Wie 6 zeigt, wenn Δn_s ungefähr 0,1 überschreitet, wird die R_p-Kurve flach und ein größerer Teil des Analyten führt zu keiner bedeutenden Änderung von R_p. 6 zeigt somit, daß, wenn die TIR-Oberfläche nicht innerhalb eines Resonanzhohlraums liegt und eine Empfindlichkeitsschwelle von 50% verwendet wird, der Brechungsindex um ungefähr 0,01 geändert werden muß, bevor das System das Vorhandensein des Analyten erfaßt.
Im Gegensatz zu dem spiegellosen Nichtresonanzsystem von 6 zeigt 7 eine Skizze des Verhältnisses der Intensität I_trans, die durch den Resonator übertragen wird, zu der Einfallsintensität I_inc als eine Funktion der Erhöhung von Δn_s bei dem Brechungsindex von Wasser aufgrund des Vorhandenseins des Analyten, auch für eine TIR-Oberfläche zwischen geschmolzenem Silika und Wasser. In diesem Fall wird die TIR-Oberfläche jedoch innerhalb eines Resonators angeordnet; dieser allgemeine Aufbau ist schematisch in 1 gezeigt. Die Ergebnisse von 7 können mit denen aus 6 verglichen werden, um die Erhöhung der Empfindlichkeit zu zeigen, die die Erfindung liefert.
In 7 wird das Verhältnis I_trans/I_inc für verschiedene Spiegelreflexionskoeffizienten, R, bewertet, unter der Annahme, daß beide Spiegel identisch sind. (Diese Annahme ist nicht notwendig, sie wird ausschließlich zu Zwecken der Einfachheit und Klarheit der Erklärung gemacht.) Wie vorher ist der Einfallswinkel der TIR-Oberfläche innerhalb des Hohlraums auf 70 Grad festgelegt (andere Winkel können ebenfalls ausgewählt werden).
Die Intensität, die durch den Resonator übertragen wird, wird als eine Funktion von n₈ gemessen, die unter Verwendung von Gleichung 5 berechnet werden kann.
Es wird darauf hingewiesen, daß für R = 0,995 gilt
= 1,8 × 10^–8. Anders ausgedrückt, sogar unter Verwendung von nur ohne weiteres erhältlichen Medienreflexionsvermögens-Spiegeln (R = 0,9995), demonstriert das System eine theoretische Erhöhung der Empfindlichkeit von mehr als fünf Größenordnungen (0,01/1,8 × 10^–8 = ungefähr 5,5 × 10⁵) im Vergleich zu dem Nichtresonanzsystem, dessen theoretische Ergebnisse in 6 skizziert sind. Da Spiegel mit R = 0,99998 ohne weiteres auf dem Handelsmarkt erhältlich sind, kann diese Erhöhung der Empfindlichkeit sogar noch größer gemacht werden und ist eine bedeutende Verbesserung gegenüber der Auflösung von z. B. bekannten Wellenleiter-Interferometern, die im Bereich von nur 10^–7 liegen.
Wie 7 zeigt, je höher der R-Wert für die ausgewählten Spiegel ist, desto „steiler" ist der Abfall der I_trans/I_inc-Kurve, d. h. desto schmaler ist das
-Band (der Betrag n_s muß sich wiederum ausreichend ändern, um eine Verringerung bei R_p von 50% zu verursachen). Abhängig von der Anwendung ist es jedoch nicht immer so, daß ein höheres R „besser" ist. Es sei z. B. angenommen, daß die Erfahrung zeigt, daß das Vorhandensein eines bestimmten Analyten üblicherweise eine Änderung bei n_s von ungefähr 3,0 × 10^–7 verursacht (was einer Änderung von drei ganzen angezeigten Einheiten auf der Δ_ns-Achse in 7 entspricht). Es sei ferner angenommen, daß eine „Alles-Oder-Nichts"-Anzeige des Vorhandenseins des Analyten für eine bestimmte Anwendung unerwünscht ist.
Spiegel mit einem Reflexionsvermögen R = 0,999 wären dann eine schlechte Wahl, da I_trans/I_inc von 1, 0 auf fast 0, 0 abfallen würde, sobald ein Analyt vorhanden ist. Statt dessen wären Spiegel mit R = 0,990 oder sogar 0,980 oder etwas dazwischen eine bessere Wahl, durch Liefern einer guten Empfindlichkeit gegenüber dem Vorhandensein des Analyten, ohne zu empfindlich gegenüber Rauschen zu sein. Für eine gegebene Anwendung können die angemessenen Spiegelreflexionsver mögen durch standardmäßige Experimentierverfahren ausgewählt werden.
In 7 ist die Frequenz des Eingangslichts auf die Resonanzfrequenz des Resonators abgestimmt, um Gleichung 6 zu erfüllen. Dies kann in der Praxis einfach durch häufiges Verriegeln der Lichtquelle an dem Resonator erreicht werden, wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist.
Die dramatische Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber TIR außerhalb des Hohlraums ist aus einem Vergleich von 6 und 7 offensichtlich und liegt daran, daß das gefangene Licht in dem Resonator denselben Punkt mehrere Male „abtastet". Je höher die Spiegelreflexionsvermögen sind, desto mehr Licht wird gefangen und somit desto größer ist die Empfindlichkeit des Detektors. Für gleiche Spiegelreflexionskoeffizienten R = R₁ = R₂ = 0,995 (was einfach erhältliche und relativ kostengünstige Spiegel darstellt), ist die übertragene Intensität empfindlich gegenüber einer Änderung des Brechungsindex von ungefähr 2 × 10^–x.
8 ist ein Blockdiagramm eines bevorzugten Systems zum Bestimmen von Änderungen der übertragenen Lichtintensität, um das Vorhandensein eines Analyten z. B. unter Verwendung des Effekts zu erfassen, der in 7 dargestellt ist. Elemente ähnlich zu jenen, die in anderen Figuren gezeigt sind, weisen dieselben Bezugszeichen auf. Bei dem System, das in 8 gezeigt ist, ist ein herkömmlicher Sensor 90 bereitgestellt, um die Lichtintensität I_trans zu messen, die durch den Spiegel 22 übertragen wird. Wie vorher wird die Umwandlung des Signals von dem Sensor 90 in eine Form, die zum Bestimmen von I_trans/I_inc geeignet ist, unter Verwendung einer herkömmlichen Umwandlungs- und Verarbeitungs-Schaltungsanordnung 94 ausgeführt, mit Ergebnissen, die in einem zweckgemäßen Format auf einer Anzeige 96 angezeigt werden.
Wenn I_inc nicht aus den Eigenschaften der ausgewählten Lichtquelle 25 bekannt ist, kann ein zusätzlicher herkömmlicher Sensor (nicht gezeigt) zum Messen von I_inc an der Verarbeitungsschaltungsanordnung 94 angeschlossen und zu dem System hinzugefügt werden, das in 8 gezeigt ist, entweder in der Quelle 25 oder zwischen der Quelle 25 und dem Eingangsspiegel 20. Falls notwendig, wenn das System z. B. unterschiedliche Spiegel für unterschiedliche Anwendungen verwenden soll, können die Reflexionskoeffizient en) für die Spiegel 20, 22 in die Verarbeitungsschaltungsanordnung 94 auf herkömmliche Weise eingegeben werden.
Die Erfindung erhöht ferner die Empfindlichkeit eines Resonators mit festen Spiegelreflexionskoeffizienten, wie durch Untersuchen von dessen Empfindlichkeit als eine Funktion von optischem Gewinn innerhalb des Hohlraums, α, ersichtlich ist. 9 ist eine Skizze des Verhältnisses der Intensität I_trans, übertragen durch den Resonator, zu der Einfallsintensität I_inc als eine Funktion der Erhöhung Δn_s bei dem Brechungsindex von Wasser aufgrund des Vorhandenseins des Analyten, wiederum für eine TIR-Oberfläche zwischen geschmolzenem Silika und Wasser, das innerhalb einem Resonator mit einem Gewinnelement plaziert ist, wie in 5 gezeigt ist. Das Verhältnis wird für verschiedene Gewinne, α, innerhalb des Hohlraums bewertet, unter der Annahme, daß beide Spiegel identisch sind und R = 0,99 aufweisen. Der Einfallswinkel der TIR-Oberfläche innerhalb des Hohlraums ist wiederum bei 70 Grad festgelegt. Es wird darauf hingewiesen, daß für α = –0,06
= 1,3 × 10^–8 gilt.
In 9 wird darauf hingewiesen, daß I_trans nun größer ist als I_inc, aufgrund der Verstärkung (α < 0) innerhalb des Resonators. Wie vorher sei angenommen, daß die Frequenz des Einfallslichts die Gleichung 6 erfüllt. Wie 9 zeigt, erhöht sich die Empfindlichkeit des Resonators ebenfalls, wenn sich der Gewinn erhöht.
Bei dem Ausführungsbeispiel der Erfindung, das in 5 dargestellt ist, wird das Prinzip, das in 9 dargestellt ist, durch Bereitstellen eines herkömmlichen Sensors 60, 62 vorzugsweise für jeden Spiegel 20, 22 angewendet, um die Lichtintensität I_trans1>I_trans2 zu messen, die aus den jeweiligen Spiegeln leckt, und nicht die Fluoreszenz des Analyten. Aktuelle Werte des optischen Gewinns α, der Erfassungsschwelle (z. B. 50% Intensitätsverringerung) und des Reflexionsvermögens des oder der Spiegel (sowie von I_inc, wenn vorher bekannt) werden in die Verarbeitungsschaltungsanordnung 64 auf eine herkömmliche und zweckmäßige Weise eingegeben.
Der Resonator könnte entweder in einem alleinstehenden Modus (wie in 3 gezeigt ist) oder als ein degenerativer Verstärker arbeiten (d. h. mit einem hinzugefügten Gewinnmedium, so daß α < 0). Ferner, durch Kombinieren des Ausführungsbeispiels, das in 5 dargestellt ist, mit dem Fluoreszenzerfassungsausführungsbeispiel aus 3 (einfach durch Umfassen des Fluoreszenzdetektors 34 und durch die begleitende Verarbeitungsschaltungsanordnung, wie in 3 gezeigt ist), könnte ein einfaches kombiniertes Ausführungsbeispiel die übertragene Intensität messen, wenn eine niedrige Empfindlichkeit erforderlich ist, und die Fluoreszenz messen, wenn eine hohe Empfindlichkeit erforderlich ist.
Wie zuvor wird die Umwandlung der Signale aus den Sensoren, 60, 62 in eine Form, die zum Bestimmen von I_trans/I_inc geeignet ist, unter Verwendung einer herkömmlichen Umwandlungs- und Verarbeitungs-Schaltungsanordnung 69 durchgeführt, mit den Ergebnissen, die in einem zweckmäßigen Format auf einer Anzeige 66 angezeigt werden. Es ist ferner möglich, keine Lichtübertragung von beiden Enden des Systems zu messen, sondern nur durch einen Spiegel (z . B. I_trans1 durch Spiegel 20); im allgemeinen ist eine solche Konfiguration jedoch für Lichtquellen 25 innerhalb eines Hohlraums nicht so ge nau wie die „doppelendige" Sensoranordnung, die in 5 gezeigt ist.
5 zeigt ein System, bei dem zwei Spiegel und zwei Sensoren und die Lichtquelle 25 innerhalb des Resonanzhohlraums angeordnet sind. Das System kann jedoch ferner mit der Lichtquelle außerhalb des Resonanzwegs konfiguriert sein (siehe z. B. 8 unten), mit einem einzelnen Sensor zum Erfassen des Lichts, das durch den Spiegel übertragen wird, an der anderen Seite des Reflexionselements von der Lichtquelle.
Es werden nun wiederum 5, 7 und 8 betrachtet. Das Verfahren, durch das kalibriert wird, und das Ausführungsbeispiel der Erfindung, das in 7 gezeigt ist, sind wie folgt. Zuerst wird bestimmt, welche Empfindlichkeit
für die bestimmte Anwendung erwünscht ist, und es werden Spiegel mit geeignetem Reflexionsvermögen ausgewählt (z. B. basierend auf theoretischen oder experimentellen Daten, wie z. B. denen, die in 7 gezeigt sind).
Unter Verwendung einer neutralen Probe an der TIR-Oberfläche (d. h. einer Probe die die Moleküle nicht enthält, die erfaßt werden sollen, und somit einen Brechungsindex n_s kleiner als den aufweist, den dieselbe aufweist, wenn sie diese Moleküle enthält), werden nun einige oder alle der Reflexionselemente 24, der/die Spiegel, die Lichtquelle und Zwischenreflexions- oder Reflexions-Elemente (wenn in einer gegebenen Anwendung umfaßt) angepaßt, so daß der Einfallswinkel an der TIR-Oberfläche 26 bei oder etwas größer ist als der kritische Winkel.
Es wird nun wiederum Bezug auf 7 genommen. Eine bevorzugte Art und Weise zum Kalibrieren des Detektors ist das Anpassen des Einfallswinkels, so daß das System auf der TIR-„Ebene" vorliegt (wobei I_trans/I_inc = 1). Es wird dann der Einfallswinkel verringert (hin zu dem kritischen Winkel), bis erkannt wird (entweder durch visuelle Inspektion einer Ausgabeanzeige oder durch eine automatische Einrichtung, wie z. B. die Verarbeitungsschaltungsanordnung 64, 94) , daß I_trans/I_inc gerade beginnt, abzufallen. Der Winkel wird dann erhöht, bis I_trans/I_inc wieder bei einer vorbestimmten Anfangseinstellung ist, die vorzugsweise bei oder etwas unter 1,0 liegt, z. B. ≥ 0,95, ≥ 0,99 oder einem anderen ausgewählten Anfangswert. An diesem Punkt ist das System so kalibriert, daß der Einfallswinkel und die Brechungseigenschaften der Probe, die benachbart zu der TIR-Oberfläche angebracht ist, derart sind, daß das System bei oder in der Nähe (z. B. innerhalb eines Bereichs von 0,1% bis 1,0%) des ausgewählten ungefähren Werts von
ist.
Die tatsächliche Testprobe wird dann benachbart zu der TIR-Oberfläche 26 innerhalb dem abklingenden Feld des Lichts eingebracht. Wenn die Testprobe genug von dem Analyten enthält, wird der Wert von I_trans/I_inc, der durch das System erfaßt wird, unter die gewählte Schwelle abfallen (z. B. 0,5) und das System wird über den Prozessor 64, 94 und die Anzeige 66, 96 (falls umfaßt) anzeigen, daß der Analyt in der Testprobe vorhanden ist.
Es ist nicht notwendig, eine Schwelle festzulegen, und daß das System ein Ergebnis vom Typ „Ja/Nein" ausgibt; statt dessen kann dem Benutzer der tatsächlich gemessene Wert von I_trans/I_inc oder eine Näherung dieses Werts angezeigt werden. In einem solchen „kontinuierlichen" oder „nicht-automatischen" Fall kann der Benutzer dann selbst entscheiden, ob ausreichend Anzeige vorliegt, daß der Analyt vorhanden ist.
Die Empfindlichkeit der oben vorgeschlagenen Ausführungsbeispiele kann mit theoretischen Grenzen von anderen Techniken basierend auf der Brechungsindexänderung verglichen werden. Zum Beispiel hat Lukosz, W. in „Prinziples and sensitivities of integrated optical and surface plasmon sensors for direct affinity sensing and immunosensing", Biosensors and Bioelectronics, 6, 215 (1991) gezeigt, daß interferometrische Wellenleiter empfindlich für Änderungen von n_s von 1 × 10^–6 sind, und Liu, Y., Hering, P., und Scully, M.O., in „An integrated optical sensor for measuring glucose concentration", Appl. Phys., B54, 18 (1992) haben auf ähnliche Weise eine Empfindlichkeit gegenüber Änderungen bei n₈ von 6 × 10^–6 berichtet. Wie 7 anzeigt, ist die erreichbare Empfindlichkeit mehr als eine Größenordnung größer als sogar die theoretischen Grenzen von solchen bekannten Vorrichtungen.
Resonanzfrequenzerfassung
Die Variable, die durch den obigen Lösungsansatz beeinträchtigt wird, ist das Reflexionsvermögen des Prismas, R_p. Ein Hinzufügen des Analyten zu der TIR-Oberfläche wird jedoch ferner die Resonanzfrequenz, ω_m, des optischen Resonators ändern (siehe Gleichung 6). Gemäß einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird diese Änderung bestimmt und wird ferner als ein Maß des Betrags des Analyten verwendet, der vorhanden ist: je größer die Änderung bei ω_m, desto mehr Analyt ist wahrscheinlich vorhanden.
10 stellt die Beziehung zwischen ω_m und Δn_s für eine TIR-Oberfläche zwischen Wasser und geschmolzenem Silika dar, wo der Einfallswinkel θ des Strahls innerhalb des Hohlraums an der TIR-Schnittstelle 70 Grad beträgt. Wenn sich Δn_s erhöht, verringert sich ω_m oder bleibt konstant, aber der kritische Winkel für TIR erhöht sich bis bei Δn_s 0,4 der kritische Winkel gleich dem Einfallwinkel ist, d. h. 70 Grad. über diesen Punkt hinaus liegt kein TIR vor und somit keine Änderung von ω_m. Es wird darauf hingewiesen, daß die Steigung der Kurve in der Nähe von Δn_s ≈ 0,04 am größten ist.
8 stellt ferner ein Ausführungsbeispiel der Erfindung dar, das direkt Änderungen bei ω_m mißt, unter Verwendung eines herkömmlichen Fabry-Perot-Abtastinterferometers (FPI) als Sensor 90. Die Empfindlichkeit dieses Ausführungsbei spiels hängt von der Auflösung oder Finesse, f, des FPI 90 ab, was eine bekannte Eigenschaft gegeben durch f ≈ π/T ist, wobei T die Leistungsübertragung der FPI-Spiegel ist. Es können relativ einfach Spiegel gekauft werden, die T so niedrig wie bei 20 ppm aufweisen; dies ergibt f ≈ 1,5 × 10⁵. Für einen 3 GHz freien Spektralbereich weist der FPI eine Auflösung von 20 kHz auf. Die Empfindlichkeit dieser Technik hängt ferner von δπ_m/δn_s ab ( der „Steigung" der Kurve in 10), die eine Funktion des Einfallswinkels, θ, auf die TIR-Oberfläche ist.
Numerische Berechungen haben gezeigt, daß unter Verwendung dieses Ausführungsbeispiel der Erfindung eine Empfindlichkeit von
= 5 × 10^–6 für θ = 80° erreicht werden kann, und daß
= 7 × 10^–7 aufgelöst werden kann, wenn man näher an dem anfänglich kritischen Winkel von θ = 67° arbeitet.

Claims

Eine Vorrichtung zum Erfassen einer Zielsubstanz in einer Probe, die folgende Merkmale aufweist: eine Lichtquelle; einen optischen Resonator, der einen Resonanzraum für Licht umfaßt, das durch die Lichtquelle erzeugt wird; Ein Gesamtinnenreflexions-Bauglied (TIR-Bauglied) (24), das von dem Resonanzraums getrennt ist und innerhalb des Resonanzraums angeordnet ist und das eine TIR-Oberfläche (26) umfaßt, wobei die TIR-Oberfläche wirksam ist, um Licht im wesentlichen ohne Verlust zu reflektieren, wenn der Einfallswinkel des Lichts auf die TIR-Oberfläche größer ist als ein kritischer Winkel, eine Abklingendes-Feld-Region an der TIR-Oberfläche, wo sich eine Probe in die Abklingendes-Feld-Region erstrecken kann, und eine Erfassungseinrichtung, die wirksam ist, um eine optische Änderung aufgrund der Zielsubstanz in der Probe in der Abklingendes-Feld-Region bei oder innerhalb einer optischen Wellenlänge der TIR-Oberfläche im wesentlichen nicht absorbierend zu erfassen, wobei die optische Änderung, aus der Gruppe ausgewählt wird, die folgendes aufweist: eine Änderung der Fluoreszenz, eine Änderung der Ramanschen Streuung, einer Änderung der oberflächenverbesserten Ramanschen Streuung, eine Änderung der Erzeugung der zweiten Harmonischen, eine Änderung der simulierten Ramanschen Streuung, eine Änderung des Brechungsindex und eine Änderung der Resonanzfrequenz des optischen Resonators.
Eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Erfassungseinrichtung (29; 34; 60, 62; 90) wirksam ist, um eine Frequenzumwandlung des Lichts durch einen Zielkomplex, der die Zielsubstanz umfaßt, im wesentlichen ohne Absorption zu erfassen.
Eine Vorrichtung gemäß Anspruch 2, bei der die Frequenzumwandlung eine lineare Lichterzeugung und/oder Fluoreszenz ist.
Eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, bei der die TIR-Oberfläche (26) einen einzelnen Reflektionspunkt für das Licht liefert.
Eine Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, bei der ein zielsubstanzspezifischer Bindeagent an der TIR-Oberfläche bereitgestellt ist; und bei der die Erfassungseinrichtung benachbart zu der TIR-Oberfläche (26) für eine Erfassung der optischen Änderung angeordnet sein kann.
Ein Verfahren zum Erfassen einer Zielsubstanz in einer Probe, das folgende Schritte aufweist: Befestigen eines vollständig intern reflektierenden Bauglieds (TIR-Bauglieds) (24) innerhalb eines Resonanzraums eines optischen Resonators, wobei das TIR-Bauglied eine TIR-Oberfläche (26) umfaßt, die Licht im wesentlichen ohne Verlust reflektiert, wenn der Einfallswinkel des Lichts auf die TIR-Oberfläche größer ist als ein kritischer Winkel, wobei das TIR-Bauglied (24) getrennt von den Reflexionsoberflächen des Resonanzraums ist; Erzeugen einer Abklingendes-Feld-Region an der TIR-Oberfläche (26) des TIR-Bauglieds durch Richten von Licht von einer Lichtquelle (25) auf die TIR-Oberfläche mit einem Winkel größer als dem kritischen Winkel; Positionieren der Probe, um sich innerhalb der Abklingendes-Feld-Region zu erstrecken; und im wesentlichen nicht-absorbierendes Erfassen einer optischen Änderung aufgrund der Zielsubstanz in der Probe in der Abklingendes-Feld-Region bei oder innerhalb von im wesentlichen einer optischen Wellenlänge der TIR-Oberfläche, wobei die optische Änderung aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgendes aufweist: eine Änderung der Fluoreszenz, eine Änderung der Ramanschen Streuung, eine Änderung der oberflächenverbesserten Ramanschen Streuung, eine Änderung der Erzeugung der zweiten Harmonischen, eine Änderung der simulierten Ramanschen Streuung, eine Änderung des Brechungsindex und eine Änderung der Resonanzfrequenz des optischen Resonators.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem die erfasste Charakteristik eine Frequenzumwandlung des Lichts eines Zielkomplexes ist, der die Zielsubstanz umfaßt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, das den Schritt des Fokussierens des Lichts von der Lichtquelle auf einen einzelnen Reflektionspunkt auf der TIR-Oberfläche umfaßt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, 7 oder 8, das die Schritte des Erzeugens des Lichts unter Verwendung eines Gewinnmediums und des Positionierens des Gewinnmediums außerhalb des Resonanzraums umfaßt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 6, 7, 8, oder 9, das folgende Schritte aufweist: Anlegen eines Bindeagenten an die TIR-Oberfläche, der für die Zielsubstanz spezifisch ist; fluoreszierendes Etikettieren der Zielsubstanz; Fokussieren des Lichts aus der Lichtquelle auf einen einzelnen Reflexionspunkt an der TIR-Oberfläche; und Erfassen der Fluoreszenz der etikettierten Zielsubstanz innerhalb einer optischen Wellenlänge der TIR-Oberfläche.