DE69529235T2

DE69529235T2 - Menschliche dnase i varianten

Info

Publication number: DE69529235T2
Application number: DE69529235T
Authority: DE
Inventors: A. Lazarus; Steven Shak; S. Ulmer
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1995-02-24
Publication date: 2003-09-04
Anticipated expiration: 2015-02-25
Also published as: PT811068E; CZ288633B6; BG64061B1; SK114797A3; MX9706428A; HUT77422A; UA65523C2; NO326612B1; BR9510323A; CZ267797A3; ATE230027T1; DE69529235D1; NO973876L; ZA961419B; EP0811068A1; CA2210871A1; HU223272B1; PL321890A1; SK283850B6; AU1970395A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Forschungsergebnisse betreffend Human-Desoxyribonuclease I (DNase I), eine Phosphodiesterase, die Polydesoxyribonucleinsäure hydrolysieren kann. Sie betrifft allgemein modifizierte Formen (Varianten) von Human-DNase I und ihre Herstellung durch DNA-Rekombinationsmethoden, pharmazeutische Zusammensetzungen, durch die ihre Vorteile klinisch ausgenützt werden können, und Verfahren zur Verwendung dieser DNase I-Varianten sowie von Zusammensetzungen davon.

Hintergrund der Erfindung

DNase I ist eine Phosphodiesterase, die Polydesoxyribonucleinsäure hydrolysieren kann. DNase I wurde mit unterschiedlichen Reinheitsgraden aus verschiedenen Spezies gereinigt.
Rinder-DNase I wurde biochemisch ausgiebig untersucht. Siehe z. B. Moore, in "The Enzymes", Boyer, P. D. (Hg.), S. 281-296, Academic Press, New York (1981). Die komplette Aminosäuresequenz für Rinder-DNase I ist bekannt (Liao et al., j. Biol. Chem. 248, 1489-1495 (1973); Oefner et al., J. Mol. Biol. 192, 605-632 (1986); Lahm et al., J. Mol. Biol. 221, 645-667 (1991)), und für Rinder-DNase I kodierende DNA wurde kloniert und exprimiert (Worrall et al., J. Biol. Chem. 265, 21889-21895 (1990)). Die Struktur von Rinder-DNase I wurde durch Röntgenkristallographie bestimmt. Suck et al., EMBO J. 3, 2423-2430 (194); Suck et al., Nature 321, 620-625 (1986); Oefner et al., J. Mol. Biol. 192, 605-632 (1986).
Für Human-DNase I kodierende DNA wurde isoliert und sequenziert, und diese DNA wurde in rekombinanten Wirtszellen exprimiert, wodurch die Produktion von Human- DNase I in kommerziell nützlichen Mengen ermöglicht wurde. Shak et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87, 9188-9192 (1990).
DNase I besitzt einige bekannte Vorteile und wurde therapeutischen Verwendungszwecken zugeführt. Ihre therapeutische Hauptverwendung ist die Reduktion der Viskoelastizität pulmonaler Sekretionen (Mukus) in Krankheiten wie Lungenentzündung und zystischer Fibrose (CF), wodurch die Atemwege befreit werden können. Siehe z. B. Lourenco et al., Arch. Intern. Med. 142, 2299-2308 (1982); Shak et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87, 9188-9192 (1990); Hubbard et al., New Engl. J. Med. 326, 812-915 (1992); Fuchs et al., New Engl. J. Med. 331, 637-642 (1994); Bryson et al., Drugs 48, 894-906 (1994). Mukus trägt auch zur Morbidität chronischer Bronchitis, asthmatischer Bronchitis, Bronchiektase, Emphysem, akuter und chronischer Sinusitis und sogar zur Erkältung bei.
Die pulmonalen Sekretionen von an solchen Krankheiten leidenden Menschen sind komplexe Materialien, die Mucus-Glykoproteine, Mucopolysaccharide, Proteasen, Actin und DNA enthalten. Einige der Materialien in pulmonalen Sekretionen werden aus Leukozyten (Neutrophilen) freigesetzt, die Lungengewebe als Reaktion auf die Gegenwart von Mikroben (z. B. Stämme von Pseudomonas-, Pneumococcus- oder Staphylococcus- Bakterien) oder anderen Reizstoffen (z. B. Tabakrauch, Pollen) infiltrieren. Im Zuge der Reaktion mit solchen Mikroben oder Reizstoffen können die Leukozyten abbauen und ihren Inhalt freisetzen, was zur Viskoelastizität der pulmonalen Sekretionen beiträgt.
Die Fähigkeit von DNase I, die Viskoelastizität pulmonaler Sekretionen zu reduzieren, wurde auf ihren enzymatischen Abbau der großen Mengen an durch Neutrophilen freigesetzter DNA zurückgeführt. Shak et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87, 9188-9192 (1990); Aitken et al., J. Am. Med. Assoc. 267, 1947-1951 (1992).
In letzter Zeit wurde ein anderer Mechanismus für die mukolytische Wirkung von DNase I vorgeschlagen, der die Disaggregation von Actin umfasst. Vasconcellos et al., Science 263, 969-971 (1994). Actin ist eines der in eukaryotischen Zellen am meisten vorkommenden Proteine (Actin macht z. B. etwa 10% des gesamten Leukozytenproteins aus) und wurde ausgiebig untersucht. Kabsch et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21: 49-76 (1992); Sheterline et al., Prot. Profile 1, 1-121 (1994). Actin besteht in zwei Formen - einer monomeren Form (G-Actin) und einer filamentösen Form (F-Actin), die sich aus G-Actin-Monomeren zusammensetzt. Polymere Actin-Filamente sind hoch viskoelastisch und tragen signifikant zur Viskosität pulmonaler Sekretionen bei. Mornet et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 3680-3684 (1984); Newman et al., Biochemistry 24, 1538- 1544 (1985); Janmey et al., Biochemistry 27, 8218-8226 (1988); Vasconcellos et al., Science 263, 969-971 (1994).
Da sich DNase I bekanntermaßen an Actin bindet (Lazarides et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 71, 4742-4746 (1974); Kabsch et al., Nature 347, 37-44 (1990)) und Actin depolymerisiert (sowie die Polymerisation von G-Actin zu Filamenten hemmt; Mannherz et al., FEBS Lett. 60, 34-38 (1975); Hitchcock et al., Cell 7, 531-542 (1976); Pinder et al., Biochemistry 21, 4886-4890 (1982); Weber et al., Biochemistry 33, 4780-4786 (1994)), wurde vorgeschlagen, dass die mukolytische Wirkung von DNase I auf Sputum und andere pulmonale Sekretionen auf Actin-Disaggregation (Depolymerisation) und nicht auf DNA-Hydrolyse zurückzuführen ist. Vasconcellos et al., Science 263, 969-971 (1994). Damit übereinstimmend ist bekannt, dass in Gegenwart von Actin die DNA-hydrolytische Aktivität von DNase I gehemmt wird. Lazarides et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 71, 4742-4746 (1974); Mannherz et al., Eur. J. Biochem. 104, 367-379 (1980). Damit übereinstimmend wurde berichtet, dass Actin-abtrennende Proteine (z. B. Gelsolin) zur Reduktion der Viskoelastizität von CF-Sputum beitragen. Vasconcellos et al., Science 263, 969-971 (1994); Stossel et al., WO 94/22465 (veröffentlicht am 13. Oktober 1994).
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf den Forschungsarbeiten der Anmelder, die darauf abzielten, die biochemische Grundlage mukolytischer Aktivität von DNase I zu bestimmen. Diese Forschung umfasste die Konstruktion und Synthese verschiedener Human-DNase I-Varianten und das Testen dieser Varianten, um ihre Fähigkeit der DNA- Hydrolyse, der Bindung an Actin und der Reduktion der Viskoelastizität von Sputum in vitro zu bewerten. Die Anmelder schufen verschiedene Klassen an Human-DNase I-Varianten. Eine Klasse von Varianten (Actin-resistente Varianten) besitzt reduzierte Fähigkeit, Actin zu binden, weist aber trotzdem mukolytische Aktivität und in einigen Fällen höhere mukolytische Aktivität als native Human-DNase I auf. Diese Actin-resistenten Varianten besitzen etwa die gleiche DNA-hydrolytische Aktivität als native Human- DNase I, doch eine derartige Aktivität ist weniger für Hemmung durch Actin anfällig. Eine zweite Klasse von Varianten bindet Actin mit ähnlicher Affinität wie native Human- DNase I, weist allerdings geringere mukolytische Akvitität und geringere DNA-hydrolytische Aktivität auf als native Human-DNase I.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die therapeutische Wirksamkeit von Human- DNase I in Bezug auf die Reduktion der Viskoelastizität pulmonaler Sekretionen auf ihre katalytische, DNA-hydrolytische Aktivität und nicht auf ihre Fähigkeit, filamentöses Actin zu depolymerisieren, zurückzuführen ist. Demzufolge sollten Varianten von Human- DNase I, die Actin mit geringerer Affinität binden als native Human-DNase I, jedoch trotzdem DNA-hydrolytische Akvitität besitzen, nützliche Therapeutika sein, insbesondere zur Behandlung von Patienten mit pulmonalen Sekretionen, die relativ große Mengen an Actin umfassen. Da solche Varianten reduzierte Affinität für Actin aufweisen, wird ihre DNA-hydrolytische Aktivität in Gegenwart von Actin weniger gehemmt, weshalb diese Varianten höhere mukolytische Aktivität in Gegenwart von Actin aufweisen als native Human-DNase I.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Human-DNase I-Varianten bereitzustellen, die DNA-hydrolytische Aktivität besitzen, aber Actin mit niedrigerer Affinität binden als native Human-DNase I.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Nucleinsäuren, die für solche Actin-resistenten Varianten von Human-DNase I kodieren, rekombinante Vektoren mit solchen Nucleinsäuren, mit solchen Nucleinsäuren oder Vektoren transformierte rekombinante Wirtszellen und Verfahren zur Produktion von Human-DNase I-Varianten mittels DNA-Rekombinationstechnologie bereitzustellen.
Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die Human-DNase I-Actin-resistenten Varianten, gegebenenfalls gemeinsam mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Verfahren zur Reduktion der Viskoelastizität oder viskosen Konsistenz von DNA-enthaltendem Material in einem Patienten, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Actin-resistenten Variante von DNase I an den Patienten.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer Krankheit wie zystischer Fibrose, chronischer Bronchitis, Pneumonie, Bronchiektase, Emphysem, Asthma oder systemischem Lupus erythematodes leidet, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Actin-resistenten Variante von DNase I an den Patienten.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung Actin-resistenter Varianten von Human-DNase I in diagnostischen in vitro-Tests eines viskosen Materials (z. B. Sputum) aus einem Patienten, um die Menge an vorhandenem Actin zu messen und zu bestimmen, ob der Patient ein geeigneter Kandidat für die Behandlung mit einer Actin-resistenten DNase I-Variante ist.
Diese und andere Ziele der Erfindung ergeben sich für Fachleute auf dem Gebiet nach Durchsicht der gesamten Beschreibung.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von reifer Human-DNase I (Seq.-ID Nr. 1). Die Zahlen geben die Sequenzposition von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz an.
Fig. 2 zeigt die relative spezifische Aktivität nativer Human-DNase I und Varianten. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung (n-gewichtet). Die relative spezifische Aktivität von Pulmozyme® Human-DNase I (Genentechn, Inc., South San Francisco, CA, USA) ist als 1,0 definiert. Die relative spezifische Aktivität nativer Human- DNase I ist höher als jene von Pulmozyme®, was auf das auftreten von Pulmozyme® in deamidierter Form von Human-DNase I zurückzuführen ist, die reduzierte DNA-hydrolytische Aktivität besitzt (Frenz et al., WO 93/25670, veröffentlicht am 23. Dezember 1993).
Fig. 3 zeigt die DNA-hydrolytische Aktivität nativer Human-DNase I und Einzelrest-Varianten von Human-DNase I in Gegenwart von Actin (bestimmt durch Hyperchromie- Test). "Prozentuelle Aktivität" ist die prozentuelle DNA-hydrolytische Aktivität der DNAse I (nativ oder Variante), die wie in Beispiel 3 berechnet wird; Die DNA-hydrolytische Aktivität der DNase I in Abwesenheit von Actin ist als 100% Aktivität definiert. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.
Fig. 4 zeigt die DNA-hydrolytische Aktiviät in nativer Human-DNase I und Varianten von Human-DNase I mit mehreren Resten in Gegenwart von actin (bestimmt in einem Hyperchromie-Test oder einem Methylgrün-Test). "Prozentuelle Aktivität" ist die prozentuelle DNA-hydrolytische Aktivität der DNase I (nativ oder Variante), die wie in Beispiel 3 berechnet wird; die DNA-hydrolytische Aktiviät der DNase I in Abwesenheit von Actin ist als 100% Aktivität definiert. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.
Fig. 5 zeigt die relative Bindungsaffinität von Human-DNase I-Varianten für Actin (bestimmt in einem in Beispiel 3 beschriebenen Actin-Bindungs-ELISA-Test). Der EC&sub5;&sub0;-Wert ist die Konzentration der DNase I (nativ oder Variante), die erforderlich ist, um ein halbmaximales Signal im Test zu ergeben. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Die EC&sub5;&sub0;-Werte für Pulmozyme® und native Human-DNase I betragen 72 ± 21 pM (n = 21) bzw. 85 ± 14 pM (n = 14). Die in der Abbildung dargestellte relative Bindungsaffinität ist der EC&sub5;&sub0;-Wert, der für die Human-DNase I-Variante bestimmt ist, dividiert durch den für native Human-DNase I bestimmten EC&sub5;&sub0;-Wert. Varianten, in denen der EC&sub5;&sub0;-Wert größer war als dies im Test messbar ist, sind als > 35, > 350, > 1750, > 3500 oder > 35.000 angeführt.
Fig. 6 zeigt die mukolytische Aktivität nativer Human-DNase I und Varianten von Human-DNase I in Sputum-Proben aus CF-Patienten (bestimmt durch Kompaktierungstest). Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung des Mittelwerts.
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung des in Beispiel 3 beschriebenen Actin-Bindungs-ELISA-Tests.

Ausführliche Beschreibung

I. Definitionen

Die Ausdrücke "Human-DNase I", "native Human-DNase I" und "DNase I der Wildform" beziehen sich hierin auf das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz reifer Human-DNase I aus Fig. 1.
Eine "Variante" oder "Aminosäuresequenz-Variante" von Human-DNase I ist ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich von jener nativer Human-DNase I unterscheidet. Im Allgemeinen besitzt eine Variante zumindest 80% Sequenzidentität (Homologie), vorzugsweise zumindest 90% Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 95% Sequenzidentität, am bevorzugtesten zumindest 98% Sequenzidentität mit nativer Human-DNase I. Es wird die prozentuelle Sequenzidentität bestimmt, z. B. mittels der von Fitch et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 1382-1386 (1983) entwickelten Version des Algorithmus von Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970), nachdem die Sequenzen ausgerichtet wurden, um für maximale Homologie zu sorgen.
Die Begriffe "Human-DNase I-Actin-resistente Variante", "Actin-resistente Variante" und "Actin-resistente Variante von Human-DNase I" beziehen sich auf eine Variante nativer Human-DNase I mit (1) DNA-hydrolytischer Aktivität und (2) reduzierter Bindungsaffinität für Actin.
"DNA-hydrolytische Aktivität" bezieht sich auf die enzymatische Aktivität von nativer Human-DNase I oder eine Variante davon beim Hydrolysieren (Spalten) von Substrat- DNA, um 5'-phosphorylierte Oligonucleotid-Endprodukte zu liefern. DNA-hydrolytische Aktivität wird durch verschiedene auf dem Gebiet bekannte Verfahren problemlos bestimmt, z. B. durch analytische Polyacrylamid-und-Agarose-Gelelektrophorese, Hyperchromie-Test (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33, 349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33, 363-377 (1950)) oder durch Methylgrün-Test (Kurnick, Arch. Biochem. 29, 41-53 (1950); Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222, 351-358 (1994)).
Die "Bindungaffinität" für native Human-DNase I oder eine Actin-resistente Variante von Human-DNase I für Actin bezieht sich auf die Fähigkeit der DNase I, sich nicht- kovalent an Actin zu binden. Die Bindungsaffinität kann durch verschiedene auf dem Gebiet bekannte Verfahren bestimmt werden; siehe z. B. Mannherz et al., Eur. J. Biochem. 104, 367-379 (1980). Alternativ dazu werden die relativen Bindungsaffinitäten unterschiedlicher DNasen (z. B. nativer Human-DNase I und Varianten davon) bestimmt, indem die Bindung der DNasen an immobilisiertes Actin in einem ELISA-Test (siehe Beispiel 3) gemessen wird oder indem die DNA-hydrolytische Aktivität der DNasen in Gegenwart und Abwesenheit von Actin (ebenfalls in Beispiel 3 beschrieben) verglichen wird. Die in den Beispielen erläuterten Verfahren eignen sich besonders zum Screenen von Varianten von Human-DNase I, um jene Varianten rasch zu identifizieren, die reduzierte Bindungsaffinität für Actin besitzen.
Eine Human-DNase I-Actin-resistente Variante mit "reduzierter Bindungsaffinität für Actin" ist eine, deren Bindungsaffinität für Actin relativ geringer ist als die Affinität, mit der sich native Human-DNase an Actin bindet (bestimmt unter vergleichbaren Bedingungen). Wenn der in Beispiel 3 beschriebene Actin-Bindungs-ELISA-Test dazu dient, die Bindungsaffinität einer Human-DNase I (nativ oder Variante) für Actin zu bestimmen, ist eine Actin-resistente Variante mit "reduzierter Affinität für Actin" eine mit einem EC&sub5;&sub0;-Wert, der höher als jener nativer Human-DNase I ist. In diesem Test besitzt eine Actin-resistente Variante typischerweise einen EC&sub5;&sub0;-Wert, der 5 bis 100 Mal höher ist als jener nativer Human-DNase; doch Actin-resistente Varianten mit einem EC&sub5;&sub0;- Wert, der mehr als das 500fache nativer Human-DNase I ist, werden auch leicht produziert, insbesondere durch Verändern mehrerer Aminosäurereste der nativen Human- DNase I-Aminosäuresequenz (siehe z. B. Fig. 5).
"Mukolytische Aktivität" bezieht sich auf die Reduktion der Viskoelastizität (Viskosität) von Sputum oder anderer biologischer Materialien, z. B. nach Behandlung des Materials mit nativer Human-DNase I oder einer Variante davon. Die mukolytische Aktivität wird durch verschiedene auf dem Gebiet bekannte Verfahren problemlos bestimmt, z. B. durch den Sputum-Kompaktierungstest (WO 94/10567, veröffentlicht am 11. Mai 1994), Tests unter Einsatz eines Torsionspendels (Janhmey, J. Biochem. Biophys. Methods 22, 41-53 (1991)) oder andere rheologische Methodologien.
"Polymerase-Kettenreaktion" oder "PCR" bezieht sich im Allgemeinen auf ein Verfahren zur Amplifikation einer gewünschten Nucleotidsequenz in vitro, wie es z. B. in US-A- 4.683.195 beschrieben ist. Im Allgemeinen umfasst das PCR-Verfahren wiederholte Zyklen an Primer-Extensionssynthesen unter Einsatz von Oligonucleotid-Primern, die vorzugsweise an eine Templat-Nucleinsäure hybridisieren können.
"Zelle", "Wirtszelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" werden hierin austauschbar verwendet, wobei alle diese Ausdrücke auch die Nachkommenschaft umfassen, die sich aus dem Wachstum oder dem Kultivieren einer Zelle ergibt. "Transformation" und "Transfektion" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Verfahren zur Einführung von DNA in eine Zelle.
"Operabel verbunden" bedeutet die kovalente Verknüpfung zweier oder mehrerer DNA-Sequenzen mittels enzymatischer Ligation o. dgl. in einer Konfiguration relativ zueinander, so dass die normale Funktion der Sequenzen erfüllt werden kann. Beispielsweise wird DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Verstärker ist operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass die die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel verbunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend und - im Fall eines sekretorischen Leaders - zusammenhängend und in einer Lesephase angeordnet sind. Die Verbindung erfolgt durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen. Wenn keine derartigen Stellen vorliegen, werden synthetische Oligonucleotid-Adaptoren oder -Linker gemeinsam mit herkömmlichen DNA-Rekombinationsverfahren verwendet.
Aminosäuren werden hierin durch aus drei Buchstaben oder Einzelbuchstaben bestehenden Bezeichnungen identifiziert:

II. Selektion Actin-resistenter Varianten

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Untersuchung der Struktur, Actin-Bindeeigenschaften, DNA-hydrolytischen Aktivität und mukolytischen Aktivität von Aminosäuresequenz-Varianten von Human-DNase I. Die Actin-resistenten Varianten der Erfindung besitzen DNA-hydrolytische Aktivität, binden aber Actin mit weniger Affinität als native Human-DNase I. Die Reduktion der Actin-Bindung wird vorzugsweise erreicht, indem Mutationen an und/oder um jene Aminosäurereste innerhalb nativer Human-DNase I vorgenommen werden, die offenbar die Bindung von Actin beeinflussen, z. B. den Glu13-, His44-, Leu45-, Val48-, Gly49-, Leu52-, Asp53-, Asn56-, Tyr65-, Val67-, Glu69- und Ala114-Resten nativer Human-DNase I (die Zahl nach der aus drei Buchstaben bestehenden Aminosäure-Bezeichnung gibt die spezifische Position des Aminosäurerests innerhalb der Sequenz aus Fig. 1 an).
Es bestehen verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung Actin-resistenter Varianten von Human-DNase I. In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Actin-resistente Variante hergestellt, indem entweder einzelne oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder -Deletionen an oder angrenzend an jene Aminosäurereste nativer Human-DNase I (d. h. innerhalb von etwa fünf Aminosäureresten) eingeführt werden, die Actin-Bindung beeinflussen. Einige Beispiele für solche Mutationen sind D53R, K53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65R, V67E, V67K, E69R, D53R : Y65A, D53R : E69R, H44A : D53R : Y65A, H44A : Y65A : E69R (siehe Fig. 2-6).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Actin-resistente Variante hergestellt, indem eine oder mehrere Mutationen eingesetzt werden, die eine neue Glykosylierungsstelle an oder angrenzend an Aminosäurereste nativer Human-DNase I (d. h. innerhalb von etwa fünf Aminosäuren) schaffen, die Actin-Bindung beeinflussen. Beispielsweise dient stellengerichtete Mutagenese dazu, Tripeptidsequenzen, Asparagin-X- Serin oder Asparagin-X-Threonin (worin X jede Aminosäure mit Ausnahme von Prolin ist) einzusetzen, die Erkennungssequenzen für die enzymatische Befestigung einer Kohlenhydratgruppen an der Asparagin-Seitenkette sind. Creighton, Proteins, S. 76-78 (W. H. Freeman, 1984). Sterische Hinderung zwischen der Kohlenhydratgruppe der resultierenden N-glykosylierten DNase I-Variante und Actin kann die Actin-Bindung und die folgende Hemmung der DNA I-DNA-hydrolytischen Aktivität im Vergleich zu nativer Human-DNase I reduzieren oder verhindern. Einige Beispiele für solche Mutationen zur Einsetzung einer neuen Glykosylierungsstelle sind H44N, D58S, D58T, H64N : V66T, H64N : V66S, V67N : E69S, V67N : E69T.
In Verbindung mit solchen Mutationen zur Schaffung einer neuen Glykosylierungsstelle kann gegebenenfalls die natürlich vorkommende Glykosylierungsstelle an Positionen 18 und/oder 106 innerhalb der nativen Human-DNase I-Aminosäuresequenz je nach dem Ausmaß der in der Actin-resistenten Variante gewünschten Glykosylierung deletiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung dient stellengerichtete Mutagenese dazu, Reste an oder angrezend an jene Aminosäurereste nativer Human-DNase I (d. h. innerhalb von etwa fünf Aminosäureresten) einzusetzen, die an der Actin-Bindung beteiligt sind und sich für die posttranslationale Modifikation entweder auf chemischem oder biologischem Wege eignen (siehe unten). Means et al., Chemical Modificaton of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer et al., Chemical Modification of Proteins: Selected Methods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, S. 70-87 (W. H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Solche posttranslationalen Modifikationen können sterische Hinderung oder geänderte elektroastatische Eigenschaften in die DNase I einbringen, die Actin-Bindung und die anschließende Hemmung DNA-hydrolytischer Aktivität im Vergleich zu nativer Human-DNase I verringern oder verhindern. Beispielsweise kann ein Cysteinrest an oder angrenzend an einen Rest nativer Human-DNase I eingesetzt werden, der an Actin- Bindung beteiligt ist. Das freie Thiol des Cysteinrests kann eine intermolekulare Disulfidbindung mit einer weiterem derartigen DNase I-Variante bilden, um ein DNase I- Dimer zu erzeugen, oder modifiziert werden, z. B. mit einem Thiol-spezifischen Alkylierungsmittel. Einige Beispiele für solche Mutationen sind H44C, L45C, V48C, G49C, L52C, D53C, N56C, Y65C, V67C, E69C, A114C.
Aus praktischen Gründen werden Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen in der Aminosäuresequenz der nativen Human-DNase I üblicherweise gebildet, indem Mutationen in die korrespondierende Nucleotidsequenz der für native Human-DNase I kodierende DNA eingesetzt werden, z. B. mittels stellengerichteter Mutagenese. Die Expression der mutierten DNA führt dann zur Produktion der Human-DNase I-Variante mit der gewünschten (nicht-nativen) Aminosäuresequenz.
Es kann zwar jede auf dem Gebiet bekannt Technik angewendet werden, um die stellengerichtete Mutagenese durchzuführen (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), doch ist Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese das bevorzugte Verfahren zur Erzeugung der Human-DNase I-Varianten der Erfindung. Dieses auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren (Zoller et al., Meth. Enz. 100, 4668-500 (1983); Zoller et al., Meth. Enz. 154, 329-350 (1987); Carter, Meth. Enz. 154, 382-403 (1987); Kunkel et al., Meth. Enzymol. 154, 367-382 (1987); Horwitz et al., Meth. Enz. 185, 599-611 (1990)) eignet sich besonders zur Herstellung von Substitutionsvarianten, obwohl es auch dazu dienen kann, Deletions- und Insertionsvarianten problemlos zu erzeugen.
Die Technik der stellengerichteten Mutagenese verwendet typischerweise einen Phagenvektor, der sowohl in einzel- als auch in doppelstrangiger Form vorliegt. Typische für die stellengerichtete Mutagenese geeignete Vektoren sind Vektoren wie z. B. M13- Phage und Plasmidvektoren, die einen einzelstrangigen Phagen-Replikationsursprung besitzen (Messing et al., Meth. Enzymol. 101, 20-78 (1983); Veira et al., Meth. Enzymol 153, 3-11 (1987); Short et al., Nuc. Acids Res. 16, 7583-7600 (1988)). Die Replikation dieser Vektoren in geeigneten Wirtszellen führt zur Synthese einzelstrangiger DNA, die für stellengerichtete Mutagenese herangezogen werden kann.
Bei der Durchführung stellengerichteter Mutagenese von für native Human-DNase I (oder eine Variante davon) kodierender DNA wird die DNA verändert, indem zunächst ein für die gewünschte Mutation kodierendes Oligonucleotid an einen Einzelstrang der DNA hybridisiert wird. Nach der Hybridisierung dient die DNA-Polymerase dazu, einen gesamten zweiten Strang zu synthetisieren - dies erfolgt unter Einsatz des hybridisierten Oligonucleotids als Primer und des DNA-Einzelstrangs als Templat. Somit wird das für die gewünschte Mutation kodierende Oligonucleotid in die resultierende doppelstrangige DNA inkorporiert.
Oligonucleotide zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer können durch jedes zweckmäßige Verfahren erzeugt werden, z. B. durch Reinigung einer natürlich vorkommenden DNA oder durch in vitro-Synthese. Beispielsweise werden Oligonucleotide unter Anwendung verschiedener Techniken der organischen Chemie problemlos synthetisiert; siehe z. B. Brown et al., Meth. Enzymol. 68, 109-151 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154, 287-313 (1985). Die allgemeine Vorgangsweise zur Auswahl einer geeigneten Hybridisierungssonde oder eines Primers ist allgemein bekannt. Keller et al., DNA Probes, S. 11-18 (Stockton Press, 1989). Typischerweise enthält die Hybridisierungssonde oder der Primer 10-25 oder mehr Nucleotide und zumindest 5 Nucleotide auf beiden Seiten der für die gewünschte Mutation kodierenden Sequenz, um sicherzustellen, dass das Oligonucleotid vorzugsweise an der gewünschten Position an das einzelstrangige DNA-Templatmolekül hybridisiert.
Natürlich kann stellengerichtete Mutagenese dazu dienen, mehrere Substitutions-, Insertions- oder Deletionsmutationen in eine Ausgangs-DNA einzusetzen. Wenn die zu mutierenden Stellen nahe beisammen liegen, können die Mutationen gleichzeitig unter Verwendung eines einzigen Oligonucleotids erfolgen, das für alle gewünschten Mutationen kodiert. Wenn jedoch die zu mutierenden Stellen voneinander entfernt sind (getrennt um mehr als etwa zehn Nucleotide), ist es schwieriger, ein einzelnes Oligonucleotid zu produzieren, das für alle gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei Alternativverfahren angewendet werden.
Im ersten Verfahren wird ein getrenntes Oligonucleotid für jede gewünschte Mutation erzeugt. Die Oligonucleotide werden dann gleichzeitig an einzelstrangige Templat- DNA anneliert, und der zweite aus dem Templat synthetisierte DNA-Strang kodiert für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen.
Das alternative Verfahren umfasst zwei oder mehr Mutagenese-Runden, um die gewünschte Variante zu produzieren. Die erste Runde entspricht der zuvor beschriebenen Einführung einer einzelnen Mutation. Die zweite Runde der Mutagenese verwendet die in der ersten Runde produzierte DNA als Templat. Somit enthält dieses Templat bereits eine oder mehrere Mutationen. Das für die zusätzliche(n) gewünschte(n) Aminosäure- Substitution(en) kodierende Oligonucleotid wird dann an dieses Templat anneliert, und der resultierende DNA-Strang kodiert nun für die Mutationen aus der ersten und der zweiten Mutagenese-Runde. Diese resultierende DNA kann als Templat in einer dritten Mutagenese-Runde verwendet werden usw.
Die PCR-Mutagenese (Higuchi, in PCR Protocols, S. 177-183 (Academic Press, 1990); Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17, 723-733 (1989)) eignet sich auch dazu, die Varianten von Human-DNase I zu erzeugen. Wenn kleine Mengen an Templat-DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR Verwendet werden, können Primer, die sich hinsichtlich ihrer Sequenz geringfügig von der korrespondierenden Region in der Templat-DNA unterscheiden, dazu dienen, relativ große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments zu erzeugen, das sich von der Templatsequenz nur an jenen Positionen unterscheidet, wo sich die Primer vom Templat unterscheiden. Für die Einführung einer Mutation in Plasmid- DNA z. B. enthält die Sequenz eines der Primer die gewünschte Mutation und ist konstruiert, an einen Strang der Plasmid-DNA an der Position der Mutation zu hybridisieren; die Sequenz des anderen Primer muss mit einer Nucleotidsequenz innerhalb des gegenüberliegenden Strangs der Plasmid-DNA identisch sein, doch diese Sequenz kann sich an einer beliebigen Stelle entlang der Plasmid-DNA befinden. Es ist jedoch vorzuziehen, dass die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nucleotiden von jener des ersten angeordnet ist, so dass am Ende die gesamte durch die Primer abgegrente amplifizierte Region der DNA leicht sequenziert werden kann. Die PCR-Amplifikation unter Einsatz eines Primerpaars wie des gerade beschriebenen führt zu einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der vom Primer angegebenen Position der Mutation und möglicherweise an anderen Positionen unterscheiden, da das Templat-Kopieren etwas fehleranfällig ist. Wagner et al., in PCR Topics, S. 69-71 (Springer-Verlag, 1991).
Wenn das Verhältnis zwischen Templat und amplifizierter Produkt-DNA extrem niedrig ist, inkorporieren die meisten Produkt-DNA-Fragmente die gewünschte(n) Mutation(en). Diese Produkt-DNA wird dazu verwendet, die korrespondierende Region im Plasmid, die als PCR-Templat diente, mittels herkömmlicher DNA-Rekombinationsmethoden zu ersetzen. Mutationen an getrennten Positionen können entweder durch Verwendung eines mutierten zweiten Primers oder mittels Durchführung einer zweiten PCR mit unterschiedlichen Primermutanten und gleichzeitiges Ligieren der zwei resultierenden PCR-Fragmente an das Plasmidfragment in einer drei- oder mehrteiligen Ligation gleichzeitig eingeführt werden.
Eine weitere Vorgangsweise zur Herstellung von Varianten, die Kassetten-Mutagenese, beruht auf der von Wells et al., Gene 34, 315-323 (1985) beschriebenen Technik. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder ein anderer Vektor), das die zu mutierende DNA-Sequenz umfasst. Das bzw. die Codon(s) in der zu mutierenden Ausgangs-DNA wird bzw. werden identifiziert. Es muss eine einzelne Restriktions-Endonuclease-Stelle auf jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) vorliegen. Wenn keine derartigen Restriktionsstellen existieren, können sie mittels der oben beschriebenen Oligonucleotid-mediierten Mutagenese erzeugt werden, um sie an geeigneten Positionen in der DNA anzuordnen. Die Plasmid-DNA wird an diesen Stellen geschnitten, um sie zu linearisieren. Ein doppelstrangiges Oligonucleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, aber die gewünschte(n) Mutation(en) enthält, wird mit Standardverfahren synthetisiert, worin die zwei Stränge des Oligonucleotids getrennt synthetisiert und dann mittels Standardtechniken miteinander hybridisiert werden. Dieses doppelstrangige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist konstruiert, 5'- und 3'-Enden aufzuweisen, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie leicht mit dem Plasmid direkt ligiert werden kann. Das resultierende Plasmid enthält die mutierte DNA-Sequenz.
Die Gegenwart von Mutation(en) in einer DNA wird durch auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren bestimmt, z. B. durch Restriktions-Kartierung und/oder DNA-Sequenzierung. Ein bevorzugtes Verfahren für das DNA-Sequenzieren ist das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren nach Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3918-3921 (1979).
Für eine Human-DNase I-Variante kodierende DNA wird in einen replizierbaren Vektor für weitere Klonierung oder Expression insertiert. "Vektoren" sind Plasmide und andere DNAs, die innerhalb einer Wirtszelle replizieren können; sie eignen sich daher zur Erfüllung zweier Funktionen in Verbindung mit kompatiblen Wirtszellen (Vektor-Wirt-System). Eine Funktion besteht darin, die Klonierung der Nucleinsäure zu erleichtern, die für eine Human-DNase I-Variante kodiert, d. h. nützliche Mengen der Nucleinsäure zu produzieren. Die andere Funktion ist die Steuerung der Expression einer Human-DNase I-Variante. Eine oder beide dieser Funktionen werden vom Vektor in der jeweiligen Wirtszelle erfüllt, die für die Klonierung oder Expression herangezogen wird. Die Vektoren enthalten je nach der Funktion, die sie erfüllen, unterschiedliche Komponenten.
Zur Herstellung einer Human-DNase I-Variante umfasst ein Expressionsvektor für die Variante kodierende DNA (siehe oben), die operabel mit einem Promotor und einer Ribosomen-Bindungsstelle verbunden ist. Die Variante wird dann direkt in rekombinanter Zellkultur oder als Fusion mit einem heterologen Polypeptid exprimiert, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle an der Verbindung zwischen dem heterologen Polypeptid und der Human-DNase I-Variante.
Prokaryoten (z. B. E. coli und andere Bakterien) sind die bevorzugten Wirtszellen für die anfänglichen Klonierschritte der Erfindung. Sie eignen sich insbesondere für die rasche Produktion großer Mengen an DNA, für die Produktion einstrangiger DNA-Template für stellengerichtete Mutagenese oder für das DNA-Sequenzieren der erzeugten Varianten. Prokaryotische Wirtszellen können auch zur Expression von für eine Human-DNase I- Variante kodierender DNA verwendet werden. Polypeptide, die in prokaryotischen Zellen produziert werden, sind typischerweise nicht glykosyliert.
Außerdem können die Human-DNase I-Varianten der Erfindung in eukaryotischen Wirtszellen, z. B. in eukaryotischen Mikroben (z. B. Hefe) oder Zellen, die aus einem Tier oder einem anderen multizellulären Organismus (z. B. Chinahamster-Eierstockzelien und anderen Säugetierzellen) stammen, oder in lebenden Tieren (z. B. Kühen, Ziegen, Schafen) exprimiert werden.
Klonierungs- und Expressionsmethodologien sind auf dem Gebiet allgemein bekannt. Beispiele für prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen und Expressionsvektoren, die sich zur Verwendung beim Produzieren der Human-DNase I-Varianten der Erfindung eignen, sind z. B. in Shak, WO 90/07572 (veröffentlicht am 12. Juli 1990) geoffenbart.
Wenn prokaryotische Zellen oder Zellen, die substanzielle Zellwandkonstruktionen enthalten, als Wirte verwendet werden, ist das bevorzugte Verfahren zum Transfizieren der Zellen mit DNA die Calciumbehandlung, beschrieben von Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 2110-2114 (1972), oder das Polyethylenglykol-Verfahren von Chung et al., Nuc. Acids Res. 16, 3530 (1988). Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, erfolgt die Transfektion im Allgemeinen unter Einsatz von Polyethylenglykol; siehe Hinnen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978). Wenn Säugetierzellen als Wirtszellen verwendet werden, erfolgt die Transfektion im Allgemeinen durch das Calciumphosphat- Fällungsverfahren von Graham et al., Virology 52, 546 (1978), Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2, 3-10 (1990). Andere bekannte Verfahren zum Einführen von DNA in prokaryotische und eukaryotische Zellen wie z. B. Kerninjektion, Elektroporation oder Protoplasten-Fusion eignen sich jedoch auch für die vorliegenden Zwecke.
Besonders nützlich sind hierin Expressionsvektoren, die für transiente Expression in Säugetierzellen von für Human-DNase I-Varianten kodierender DNA sorgen. Im Allgemeinen umfasst die transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der sich in einer Wirtszelle effizient replizieren kann, so dass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und ihrerseits hohe Werte eines gewünschten Polypeptids synthetisiert, für das der Expressionsvektor kodiert. Transiente Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die praktische positive Identifikation von Polypeptiden, für die klonierte DNAs kodieren, sowie das rasche Screening solcher Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Wong et al., Science 228, 810-815 (1985); Lee et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 4360-4364 (1985); Yang et al., Cell 47, 3-10 (1986). Somit werden transiente Expressionssysteme für die Expression der für Aminosäuresequenzvarianten nativer Human-DNase I kodierenden DNA günstigerweise in Verbindung mit Tests zur Identifikation jener Varianten, die Actin mit niedrigerer Affinität binden als native Human-DNase I, sowie mit Tests zur Messung jener Varianten mit DNA- hydrolytischer Aktivität verwendet.
Eine Human-DNase I-Variante wird vorzugsweise aus der Wirtszelle sekretiert, in der sie exprimiert wird, in welchem Fall die Variante aus dem Kulturmedium gewonnen wird, indem die Wirtszellen gezüchtet werden. In diesem Fall kann es wünschenswert sein, die Zellen in einem serumfreien Medium zu züchten, da das Fehlen von Serumproteinen und anderer Serumkomponenten im Medium die Reinigung der Variante erleichtern kann. Wenn die Human-DNase I-Variante nicht sekretiert wird, wird sie aus Lysaten der Wirtszellen gewonnen. Wenn die Variante in einer Wirtszelle aus nicht-menschlichem Ursprung exprimiert wird, ist die Variante vollständig frei von Proteinen aus Human-Ursprung. Es ist jedenfalls notwendig, die Variante aus rekombinanten Zellproteinen zu reinigen, um im Wesentlichen homogene Präparate der Human-DNase I-Variante zu erhalten. Für therapeutische Verwendungszwecke ist die gereinigte Variante vorzugsweise zu mehr als 99% rein (d. h. alle anderen Proteine machen weniger als 1% der gesamten Proteinmenge in der gereinigten Zusammensetzung aus).
Im Allgemeinen erfolgt die Reinigung einer Human-DNase I-Variante durch Ausnützen der unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Variante im Vergleich zu den Kontaminanten, mit denen sie assoziiert sein kann. In einem ersten Schritt wird z. B. das Kulturmedium oder das Wirtszell-Lysat zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen. Die Human-DNase I-Variante wird anschließend aus kontaminanten löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, z. B. durch Ammoniumsulfat- oder Ethanol- Fällung, Gelfiltration (molekulare Ausschluss-Chromatographie), Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Immunaffinitäts-Chromatographie (z. B. unter Einsatz einer Säule mit an Sepharose gekoppelten Anti-Human-DNase I-Antikörpern), Tentakel-Kationenaustausch-Chromatographie (Frenz et al., WO 93/25670, veröffentlicht am 23. Dezember 1993), Reversphasen-HPLC und/oder Gelelektrophorese.
Natürlich ist es Fachleuten auf dem Gebiet klar, dass die für native Human-DNase I herangezogenen Reinigungsverfahren möglicherweise eine gewisse Modifikation zur Reinigung einer Human-DNase I-Variante erfordern, um strukturelle und andere Unterschiede zwischen den nativen und varianten Proteinen zu berücksichtigen. Beispielsweise kann in einigen Wirtszellen (insbesondere bakteriellen Wirtszellen) die Human- DNase I-Variante anfänglich in unlöslicher, aggregierter Form exprimiert werden (auf dem Gebiet als "Refraktilkörper" oder "Einschlusskörper" bezeichnet), in welchem Fall es notwendig ist, die Human-DNase I-Variante im Lauf ihrer Reinigung zu solubilisieren und renaturieren. Verfahren zum Solubilisieren und Renaturieren rekombinanter refraktiler Proteinkörper sind auf dem Gebiet bekannt (siehe z. B. Builder et al., US-A- 4.511.502).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Human-DNase I-Varianten erzeugt, indem kovalente Modifikationen direkt in einem nativen oder varianten Human- DNase I-Protein durchgeführt werden. Solche Modifikationen erfolgen zur Beeinflussung der Actin-Bindung oder einer anderen Eigenschaft des Proteins (z. B. Stabilität, biologische Halbwertszeit, Immunogenität) und können anstelle oder zusätzlich zu den oben erwähnten Aminosäuresequenz-Substitutions-, Deletions- und Insertionsmutationen durchgeführt werden.
Kovalente Modifikationen können eingeführt werden, indem gezielte Aminosäurereste der nativen oder varianten Human-DNase I mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das mit ausgewählten Aminosäureseitenketten oder N- oder C-terminalen Resten reagieren kann. Geeignete Derivatisierungsmittel und -verfahren sind auf dem Gebiet allgemein bekannt.
Beispielsweise werden Cysteinylreste am häufigsten mit α-Haloacetaten (und korrespondierenden Aminen) wie z. B. Chloressigsäure oder Chloracetamid umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p- Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5-7,0 derivatisiert, da dieses Mittel für die Histidyl-Seitenkette relativ spezifisch ist. p-Bromphenacylbromid kommt auch in Frage; die Reaktion erfolgt vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln kehrt die Ladung der Lysinylreste um. Andere zweckmäßige Reagenzien für das Derivatisieren von α-Aminohältigen Resten sind Imidoester wie etwa Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsuflonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, z. B. mit Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Reaktion aufgrund des hohen pKa der funktionalen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen stattfindet. Außerdem können diese Reagenzien mit den lysingruppen sowie mit der Arginin-s- Aminogruppe reagieren.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N = C = N-R') selektiv modifiziert, worin R und R' unterschiedliche Alkylgruppen wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia- 4,4-dimethylpentyl)carbodiimid sind. Außerdem werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
Die kovalente Bindung von Glykosiden an Aminosäurereste des Proteins kann dazu dienen, die Anzahl oder das Profil von Kohlenhydrat-Substituenten zu modifizieren oder zu erhöhen, insbesondere an oder angrenzend an jene Reste, die an Actin-Bindung beteiligt sind. Je nach dem verwendeten Kopplungsmodus kann bzw. können der bzw. die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen wie z. B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen wie z. B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste wie z. B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan oder (f) die Amidgruppe von Glutamin befestigt werden. Geeignete Verfahren sind z. B. in WO 87/05330 (veröffentlicht am 11. September 1987) und in Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem, 259-306 (1981) beschrieben.
Die kovalente Befestigung von Mitteln wie etwa Polyethylenglykol (PEG) oder Human- Serumalbumin an Human-DNase I-Varianten kann die Immunogenität und/oder Toxizität der Variante reduzieren und/oder ihre Halbwertszeit verlängern, wie dies für andere Proteine beobachtet wurde. Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3582-3586 (1977); Poznansky et al., FEBS Letters 239, 18-22 (1988); Goodson et al., Biotechnology 8, 343- 346 (1990); Katre, J. Immunol. 144, 209-213 (1990); Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Press, 1992). Außerdem kann die Modifikation nativer Human-DNase I oder einer Variante davon durch diese Mittel an oder angrenzend an einen Actin-Bindung beeinflussenden Aminosäurerest (d. h. innerhalb von etwa fünf Aminosäureresten) zu einer Actin-resistenten Variante führen.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Human-DNase I-Actin-resistente Variante eine Mutation am Asn-Rest umfassen, die an Position 74 der antiven Human-DNase I- Aminosäuresequenz auftritt (z. B. eine N74D-, N74K- oder N74S-Mutation), um die Deamidierung der DNase I-Variante zu reduzieren oder zu verhindern. Frenz et al., WO 93/25670, veröffentlicht am 23. Dezember 1993. Als weiteres Beispiel kann eine Human-DNase I-Actin-resistente Variante eine Aminosäuresequenz-Mutation oder eine andere kovalente Modifikation umfassen, die die Empfänglichkeit der Variante gegenüber Abbau durch Proteasen (z. B. Neutrophil-Elastsase), die im Sputum und anderen biologischen Materialien vorhanden sein können, verringert.
Die DNA-hydrolytische Aktivität und Actin-Bindungsaffinität der wie oben beschriebenen Human-DNase I-Varianten werden mittels auf dem Gebiet bekannter und hierin beschriebener Tests und Methoden problemlos bestimmt. Jede solche Variante mit DNA- hydrolytischer Aktivität und reduzierter Bindungsaffinität für Actin (wie oben definiert) ist eine Actin-resistente Variante innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung.
Die Human-DNase I-Actin-resistenten Varianten der Erfindung dienen dazu, die Viskoelastizität von DNA-hältigem Material wie z. B. Sputum, Mukus oder anderer pulmonaler Sekretionen zu reduzieren. Solche Varianten eignen sich besonders für die Behandlung von Patienten mit Lungenkrankheit, die abnorme viskose oder eingedickte Sekretionen und Zustände wie akute oder chronische bronchiale Lungenkrankheit aufweisen, z. B. infektiöse Pneumonie, Bronchitis oder Tracheobronchitis, Bronchioektase, zystische Fibrose, Asthma, Tuberkulose und Pilzinfektionen. Für solche Therapien wird eine Lösung oder ein feinteiliges trockenes Präparat der Actin-resistenten Variante in herkömmlicher Weise in die Atemwege (z. B. Bronchien) oder die Lungen eines Patienten beispielsweise mittels Aeorosolisierung eingesprüht.
Die Actin-resistenten Varianten eignen sich auch für unterstützende Behandlung von Abszessen oder schwerer Infektionen geschlossener Räume bei Krankheiten wie Empyem, Meningitis, Abszess, Peritonitis, Sinusitis, Otitis, Periodontitis, Perikarditis, Pankreatitis, Cholelithiase, Endokarditis und septischer Arthritis sowie für topische Behandlungen einer Vielzahl entzündlicher und infizierter Läsionen wie z. B. infizierter Läsionen der Haut und/oder Schleimmembranen, chirurgischer Wunden, ulzerativer Läsionen und Verbrennungen. Die Actin-resistente Variante kann die Wirksamkeit von Antibiotika zur Behandlung solcher Infektionen deutlich verbessern (z. B. wird die Gentamicin-Aktivität durch reversible Bindung an intakte DNA deutlich reduziert).
Native Human-DNase I und Actin-resistente Varianten davon können auch für die Behandlung von systemischem Lupus erythematodes (SLE), einer lebensbedrohenden Autoimmunerkrankung, die durch die Produktion unterschiedlicher Autoantikörper gekennzeichnet ist, verwendet werden. DNA ist eine wesentliche antigene Komponente der Immunkomplexe. In diesem Fall kann die Human-DNase I (nativ oder variant) systemisch verabreicht werden, z. B. durch intravenöse, subkutane, intrathekale oder intramuskuläre Verabreichung an den betroffenen Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die therapeutische Zusammensetzung ein trockenes Pulver der Actin-resistenten Variante, vorzugsweise hergestellt durch Sprühtrocknen einer Lösung der Actin-resistenten Variante, wie es vor allem in der laufenden US-A 08/206.020 (eingereicht am 4. März 1994) beschrieben ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die therapeutische Zusammensetzung Zellen, die aktiv eine Actin-resistente Variante von Human-DNase I erzeugen. Solche Zellen können direkt in das Gewebe eines Patienten eingebracht oder innerhalb poröser Membranen eingekapselt werden, die dann im Patienten implantiert werden; in beiden Fällen sorgen sie für die Zufuhr der Actin-resistenten Variante in Bereiche innerhalb des Körpers des Patienten, der erhöhte Konzentrationen DNA-hydrolytischer Aktivität benötigt. Beispielsweise könnten die patienteneigenen Zellen entweder in vivo oder ex vivo mit für eine Actin-resistente Variante von Human-DNase I kodierender DNA transformiert und dann dazu verwendet werden, die DNase I direkt im Patienten zu produzieren.
Die therapeutisch wirksame Menge einer Actin-resistenten Human-DNase I-Variante hängt z. B. von der Menge an DNA und Actin im zu behandelnden Material, dem therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten ab. Demzufolge ist es notwendig, dass der Therapeut die Dosierung titriert und den Verabreichungsweg entsprechend ändert, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Angesichts der reduzierten Bindungsaffinität für Actin und folglich der höheren DNA-hydrolytischen Aktivität in Anwesenheit von Actin relativ zu nativer Human- DNase I kann die Menge an Actin-resistenter Variante, die zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung notwendig ist, niedriger sein als die Menge nativer Human-DNase I, die zur Erzielung dergleichen Wirkung unter den gleichen Bedingungen notwendig ist. Im Allgemeinen ist die therapeutisch wirksame Menge der Actin-resistenten Variante eine Dosis von etwa 0,1 pg bis etwa 5 mg der Variante pro kg Körpergewicht des Patienten, verabreicht innerhalb pharmazeutischer Zusammensetzungen, wie hierin beschrieben.
Eine Actin-resistente DNase I-Variante wird gegebenenfalls mit einem oder mehreren anderen pharmakologischen Mitteln zur Behandlung der oben angeführten Krankheiten kombiniert oder gemeinsam mit ihnen verabreicht; Beispiele sind Antibiotika, Bronchodilatoren, entzündungshemmende Mittel, Mukolytika (z. B. n-Acetylcystein), Actin-bindende oder Actin-lösende Proteine (z. B. Gelsolin; Matsudaira et al., Cell 54, 139-140 (1988); Stossel et al., WO 94/22456, veröffentlicht am 13. Oktober 1994), Protease-Inhibitoren oder Gentherapie-Produkte (z. B. mit dem zystischen Fibrose-Transmembran- Konduktanzregulator- (CFTR-) Gen; Riordan et al., Science 245, 1066-1073 (1989)).
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen die Erfindung keinesfalls einschränken. Alle hierin angeführten Patent- und Literaturhinweise sind ausdrücklich aufgenommen.

BEISPIEL 1

Mutagenese von Human-DNase I

E. coli-Stamm CJ236 (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) wurde mit Plasmid pRK. DNase.3 mittels des Verfahrens von Chung et al., Nuc. Acids Res. 16, 3530 (1988) transformiert. Das zur Herstellung der Erfindung verwendete Plasmid pRK. DNase.3 entspricht dem in WO 90/07572 beschriebenen (veröffentlicht am 12. Juli 1990), außer dass die für Human-DNase I kodierende Nucleotidsequenz wie in Fig. 1 dargestellt ist. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agarplatten mit 50 ug/ml Carbenicillin aufgebracht und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. 2Yt-Brühe (5 ml) mit 50 pg/ml Carbenicillin und 10 ul VCSM13-Helferphagen (Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurde mit einer individuellen Kolonie aus der Agarplatte beimpft und unter Rühren über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Einzelstrangige DNA wurde aus dieser Kultur isoliert und als Templat für die anschließende Mutagenese verwendet.
Stellengerichtete Mutagenese erfolgte mittels synthetischer Oligonucleotide gemäß dem Verfahren von Kunkel et al., Meth. Enzymol. 154, 367-382 (1987). Die mutagenen Oligonucleotide waren 21-Mere oder 24-Mere mit entweder 9 oder 12 präzisen Basenübereinstimmungen 5' vom nicht übereinstimmenden Codon und 9 präzisen Basenübereinstimmungen 3' vom nicht übereinstimmenden Codon. Nach der Mutagenese wurde einzelstrangige DNA aus einzelnen Klonen Didesoxy-Sequenzieren unterworfen (Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)). DNA mit Nucleotidsequenz-Varianten wurde dann wie oben in E. coli-Stamm XL1 Blue MRF' (Stratagene) transformiert. Nach dem Plattieren und Einzelkolonie-Isolieren wie oben wurden individuelle Kolonien dazu verwendet, 0,5 l LB-Brühe mit 50 pg/ml Carbenicillin zu beimpfen. Nach dem Wachstum über Nacht unter Rühren bei 37ºC wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und die DNA-Variante (im Expressionsvektor) mittels Qiagen tip-500- Säulen gereinigt (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA).
Die Fig. 2-6 zeigen die unterschiedlichen erzeugten Human-DNase I-Varianten. In den Abbildungen und der gesamten Beschreibung sind die Aminosäure-Substitutionsmutationen in einer DNase I-variante durch einen ersten Buchstaben, eine Zahl und einen zweiten Buchstaben identifiziert. Der erste Buchstabe ist die Einbuchstaben-Abkürzung des Aminosäurerests in nativer reifer Human-DNase I (oder jener der Wildform), die Zahl gibt die Position dieses Rests in nativer reifer Human-DNase I an (Nummerierung wie in Fig. 1), und der zweite Buchstabe ist die aus Einbuchstaben-Abkürzung des Aminosäurerests an dieser Position in der DNase I-Variante. Beispielsweise wurde in der DNase I-Variante mit einer D53R-Mutation der Asparaginsäure- (D-) Rest an Position 53 in nativer reifer Human-DNaseI durch einen Arginin- (R-) Rest ersetzt. Mehrere Mutationen in einer einzelnen Variante sind ähnlich gekennzeichnet, wobei ein Doppelpunkt (:) jede der Mutationen trennt, die in der Variante vorhanden sind. Beispielsweise gibt die Bezeichnung D53R : Y65A an, dass die Variante eine D53R-Mutation und eine Y65A- Mutation besitzt.

BEISPIEL 2

Expression von Human-DNase I-Varianten

Human-Embryonieren-293-Zellen (ATCC CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) wurden in mediumhältigem Serum in 150 mm-Petrischalen aus Kunststoff gezüchtet. Log-Phasen-Zellen wurden transient mit 22,5 ug gereinigter DNA- Variante (hergestellt wie oben beschrieben) und 17 ug Adenovirus-DNA unter Anwendung des Calciumphosphat-Fällungsverfahrens co-transfiziert (Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2, 3-10 (1990)). Ungefähr 16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und das Medium in serumfreies Medium umgeändert. Zwei Entnahmen des Zellkulturmediums erfolgten aus jeder Platte - die erste entweder 24 oder 72 Stunden und die letzte 96 Stunden nach dem serumfreien Mediumswechsel. Insgesamt etwa 50 ml Zellkulturüberstand mit der DNase I-Variante wurde auf diese Weise erhalten. Der Pool an Kulturüberstand aus jeder Platte wurde mit Centriprep 10-Konzentratoren 5- bis 50fach konzentriert, und die Konzentrate wurden untersucht, um verschiedene biochemische und biologische Aktivitäten der DNase I-Varianten zu bestimmen.
Konzentrat mit nativer Human-DNase I wurde durch das gleiche Verfahren wie oben hergestellt, außer dass 293-Zellen transient mit Plasmid pRK.DNase.3 transfiziert wurden.

BEISPIEL 3

Biochemische und biologische Aktivitäten von Human-DNase I-Varianten

I. Relative spezifische Aktivität

Die relative spezifische Aktivität von DNase I-Varianten wurde durch Vergleichen der Aktivität der Variante mit jener nativer Human-DNase I in zwei unterschiedlichen Tests bewertet. Insbesondere ist die relative spezifische Aktivität der Varianten als Konzentration der Variante (in ug/ml) definiert, bestimmt in einem Methylgrün-Aktivitätstest (Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222, 351-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29, 41-53 (1950)), dividiert durch die Konzentration der Variante (in ug/ml), bestimmt in einem DNase I-ELISA-Test (unten beschrieben). Sowohl im Methylgrün-Aktivitätstest als auch im DNase I-ELISA-Test wurden die Standardkurven mittels Pulmozyme® Human-DNase I ermittelt. Die relative spezifische Aktivität nativer Human-DNase I und Varianten ist aus Fig. 2 ersichtlich.
Der Methylgrün-Aktivitätstest (Sinicropi et al., Anal. Biochem. 222, 351-358 (1994); Kurnick, Arch. Biochem. 29, 41-53 (1950)) verwendet Methylgrün-Farbstoff, der etwa alle 10 Basen in der DNA interkaliert, was zu einem grünen Substrat führt. Wenn die DNA durch die DNase I gespalten wird, wird der Methylgrün-Farbstoff freigesetzt und zu einer farblosen Form oxidiert. Somit ist der Verlust der grünen Farbe proportional zur Menge an DNase I, die der Testprobe zugesetzt wird. Die Menge an im Test vorhandener DNase I wird dann durch Vergleich mit einer Standardkurve quantifiziert, die durch Untersuchen bekannter Mengen an DNase I erstellt wird.
Der DNase I-ELISA-Test umfasst das Beschichten von Mikrotiterplatten mit einem polyklonalen Ziegen-Anti-DNase I-Antikörper, das Zusetzen der zu untersuchenden Probe und das Detektieren resultierender gebundener DNase I mit einem polyklonalen Anti- DNase I-Antikörper, der an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert ist. Wenn HRP-Substrat und Farbentwicklungs-Reagens zugesetzt werden, ist die entwickelte Farbe proportional zur Menge an in der Probe vorhandener DNase I. Die Menge an im Test vorhandener DNase I wird dann durch Vergleich mit einer Standardkurve quantifiziert, die durch Untersuchen bekannter Mengen an DNase I erstellt wird.
In beiden Tests wurden Mehrfachverdünnungen der Proben untersucht, und jene Werte, die in den Mittelbereich der Standardkurve vielen, wurden gemittelt und Standardabweichungen berechnet.
Die DNase I-Konzentration (bestimmt durch den DNase I-ELISA-Test) diente dazu, DNase I-Konzentrationen in anderen Tests zu standardisieren, in denen die DNase I-Varianten charakterisiert waren (z. B. in Tests der Hemmung durch Actin, siehe unten).

II. Actin-Hemmung von hydrolytischer DNase I-Aktivität

G-Actin (Kabsch et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 21, 49-76 (1992)) wurde weniger als 10 Tage vor der Verwendung durch über Nacht erfolgendes Dialysieren einer 1 mg/ml Lösung eines im Handel erhältlichen Actin-Präparats (Sigma, St. Louis, MO, USA) gegen 5 mM HEPES, pH 7,2, 0,2 mM CaCl&sub2;, 0,5 mM ATP, 0,5 mM β-Mercaptoethanol bei 4ºC hergestellt. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 13.000 · g wurde die Menge an G-Actin durch Messen der Extinktion bei 290 nm quantifiziert; eine 1 mg/ml Lösung besaß eine Extinktion von 0,66 OD. Die Menge an G-Actin-Präparat, die erforderlich ist, um die DNA-hydrolytische Aktivität nativer Human-DNase I substanziell (> 50%), aber nicht vollständig zu hemmen, wurde in Vorversuchen unter den gleichen Bedingungen wie für jeden Test bestimmt.
Die Sensitivität gegenüber Actin-Hemmung wurde durch Messen der DNA-hydrolytischen Aktivität der Varianten in Gegenwart und Abwesenheit von Actin in beiden Tests bewertet - im oben beschriebenen Methylgrün-Test und einem Hyperchromie-Test, der auf der Zunahme der Extinktion bei 260 nm nach Denaturieren und Depolymerisieren von DNA basiert (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33, 349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33, 363-377 (1950)). Die prozentuelle Hemmung ausgewählter Varianten in diesen Tests ist aus den Fig. 3 und 4 ersichtlich.
Im Hyperchromie-Test wurden konzentrierte Kulturüberstände (wie oben beschrieben, umfassend DNase I-Varianten) entweder ohne oder mit einem zwei- bis dreifachen Molüberschuss Actin in Puffer A (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM CaCl&sub2;, 4 mM MgCl&sub2;, 0,1% BSA) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie einer Kuvette mit 40 ug DNA in einem gesamten Testvolumen von 1,0 ml zugesetzt wurden. Die Endkonzentration der DNase I-Variante im Test betrug etwa 26 nM (bestimmt durch DNase I-ELISA- Test). Es wurden die Raten der DNA-Hydrolyse durch die DNase I-Varianten in Abwesenheit und Gegenwart von Actin gemessen. Die in den Fig. 3 und 4 gezeigte prozentuelle Aktivität wurde berechnet, indem das Verhältnis der DNA-hydrolytischen Aktivität der Human-DNase I (nativ oder Variante) in Gegenwart von Actin mit seiner DNA-hydrolytischen Aktivität in Abwesenheit von Actin bestimmt und mit 100 multipliziert wurde.
Im Methylgrün-Test wurden konzentrierte Kulturüberstände (hergestellt wie oben, umfassend DNase I-Varianten) entweder ohne zugesetztes Actin oder mit einem 1000fachen Molüberschuss Actin in Puffer B (25 mM HEPES, pH 7,5, 4 mM NaCl&sub2;, 4 mM MgCl&sub2;, 0,1% BSA, 0,01% Thimerosal und 0,05% Tween 20) bei 37ºC 16 Stundenden lang inkubiert. Die Konzentration von aktivem Enzym wurde in jedem Fall durch Vergleich mit der Standardkurve von Pulmozyme geschätzt. Die von der Variante verbleibende "prozentuelle Aktivität" bezieht sich auf das 100fache des Verhältnisses zwischen der Aktivität in Gegenwart von Actin und jener in Abwesenheit von Actin.
Wie aus den Fig. 3 und 4 ersichtlich, ist die DNA-hydrolytische Aktivität nativer Human-DNase in Gegenwart von Actin deutlich reduziert. Im Vergleich dazu sind verschiedene Varianten nativer Human-DNase mit einem oder mehreren Resten gegenüber Hemmung durch Actin relativ resistent, wie sich dies dadurch zeigt, dass sie höhere DNA-hydrolytische Aktivität in Gegenwart von Actin besitzen als native Human-DNase I.

III. Actin-Bindungs-ELISA

Ein Mikrotiter-basierter Test wurde entwickelt, um die Bindung nativer Human-DNase I und DNase I-Varianten an immobilisiertes Actin zu messen. Zunächst wurden die Näpfe einer MaxiSorp-Platte (Nung, Inc., Naperville, IL, USA) mit 100 ul pro Napf Human-GC- Globulin (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), einem Actin-Bindungsprotein (Goldschmidt- Clermont et al., Biochem. J. 228, 471-477 (1985); McLeod et al., J. Biol. Chem. 264, 1260-1267 (1989); Houmeida et al., Eur. J. Biochem. 203, 499-503 (1992)), bei einer Konzentration von 10 ug/ml in 25 mM HEPES, 4 mM MGCl&sub2;, 4 mM CaCl&sub2;, pH 7,2, bei 4ºC 16-24 Stunden lang beschichtet. Nach dem Verwerfen des GC-Globulin-Überschusses wurden reaktive Stellen durch die Zugabe von 200 ul pro Napf Puffer C (Puffer C ist der gleiche wie obiger Puffer B mit der Zugabe von 0,5 mM Adenosintriphosphat; Puffer C wurde in allen nachfolgenden Schritte, sofern nicht anders angeführt, als Test- Verdünner verwendet) und Inkubieren der Plätte auf einem Rührer 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert. Jeder folgende Inkubationsschritt fand bei Raumtemperatur 1 Stunde lang auf einem Mini Orbital Shaker (Bellco Biotechnology, Vineland, NJ, USA) statt; zwischen jedem Schritt wurde die Platte entleert und 6 Mal mit phosphatgepufferter, 0,05º10 Tween enthaltender Kochsalzlösung mit einem Microwash II-Plattenwascher (Skatron A/S. Norwegen) gewaschen. Als nächstes wurde G-Actin (wie oben hergestellt) auf 50 ug/ml in Puffer C verdünnt und 100 ul jedem Napf zugesetzt; die Platten wurden inkubiert und gewaschen, 100 ul verschiedener Verdünnungen von Pulmozyme und Zellkulturmedium, umfassend entweder native Human-DNase I oder Varianten davon, den Näpfen zugesetzt und die Platten inkubiert und gewaschen. Schließlich wurden 100 pl einer 1/25.000-Verdünnung von Anti-Human-DNase I-polyklonalem Kaninchen- Antikörper-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (ursprüngliche Stammkonzentration 465 ug/- ml) jedem Napf zugesetzt. Nach der Inkubation und dem Waschen wurde die Farbentwicklung durch Zugabe von 100 ul Farbentwicklungsreagens (Sigma Fast o-Phenylendiamin und Harnstoff/H&sub2;O&sub2;-Tabletten, solubilisiert gemäß den Empfehlungen des Herstellers) pro Napf eingeleitet und durch die Zugabe von 100 ul 4,5 N H&sub2;SO&sub4; pro Napf gestoppt. Die Extinktion bei 492 nm wurde aufgezeichnet und über der Konzentration der ursprünglich dem Napf zugesetzten Human-DNase I aufgetragen. Sigmoidalkurven ergaben sich für native Human-DNase I und jene Varianten, die sich an Actin banden; diese Kurven wurden in eine Vier-Parameter-Gliechung durch nichtlineare Regressionsanalyse angepasst (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11, 431441 (1963); die Konzentration jeder DNase I (nativ oder Variante), die erforderlich ist, um ein halbmaximales Signal im Test zu liefern, wurde anhand der Kurven berechnet und wird als EC&sub5;&sub0;-Wert bezeichnet. Man nimmt an, dass die Molekularmasse nativer Human-DNase I und der Varianten 37.000 Dalton beträgt.
Die relative Bindungsaffinität jeder Human-DNase I-Variante wurde durch Dividieren des EC&sub5;&sub0;-Werts der Variante durch den EC&sub5;&sub0;-Wert nativer Human-DNase I (bestimmt im ELISA-Test) berechnet, wobei die Ergebnisse aus Fig. 5 ersichtlich sind. Wenn z. B. die relative Bindungsaffinität der Human-DNase I-Variante laut Berechnung 5 betragen sollte, würde dieser Wert angeben, dass der EC&sub5;&sub0;-Wert der Variante um das 5fache größer ist als der EC&sub5;&sub0;-Wert nativer Human-DNase oder, anders gesagt, dass die Variante eine Affinität für Actin besitzt, die 5fach niedriger ist als die Affinität nativer Human-DNase I für Actin in diesem ELISA-Test.

IV. Sputum-Kompaktierungstest

Ein Sputum-Kompaktierungstest (WO 94/10567, veröffentlicht am 11. Mai 1994) diente zur Messung der relativen Viskoelastizität von Sputum aus CF-Patienten ("CF-Sputum") vor und nach Inkubation mit nativer Human-DNase I und unterschiedlichen DNase I- Varianten. Nach dem Mischen von CF-Sputum mit einer DNase I-Probe und 20-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurden die halbfesten Lösungen in Kapillarröhrchen gefüllt, die dann 20 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert wurden. Nach dem Zentrifugieren wurde die Höhe des Pellets gemessen und mit der Höhe der Lösung plus Pellet verglichen. Diese Messungen dienten dazu, die prozentuelle Kompaktierung des Sputums zu berechnen, die mit seiner Viskoelastizität korreliert.
Die nach Behandlung des CF-Sputums mit nativer Human-DNase I und Human-DNase I-Actin-resistenten Varianten bestimmte prozentuelle Kompaktierung ist aus Fig. 6 ersichtlich. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die Human-DNase I-Actin-resistenten Varianten wirksamer sind als native Human-DNase I, die Viskoelastizität von CF-Sputum zu reduzieren (durch Kompaktierungstest bestimmt).

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: Genentech, Inc.
Lazarus, Robert A.
Shak, Steven
Ulmer, Jana S.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Human-DNase I-Varianten
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Genentechn, Inc.
(B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd
(C) STADT: South San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94080
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: 5,25 Zoll, 360 kB Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patin (Genentech)
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHDATUM: 24. Februar 1995
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) PRORITÄTSANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDUNGSDATUM:
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Johnston, Sean A.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 35.910
(C) KENNZAHL/ZEICHEN: P925
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 415/225-3562
(B) TELEFAX; 415/952-9881
(C) TELEX: 910/371-7168
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID NR. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 260 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID NR. 1:

Claims

1. Actin-resistente Variante von Human-DNase I mit DNA-Hydrolyseaktivität, einer Bindungsaffinität für Actin, die geringer als die Bindungsaffinität von nativer Human- DNase I für Actin ist, und einer Aminosäuresequenz, die zumindest 90%ige Identität mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz von nativer Human-DNase I aufweist.

2. Actin-resistente Variante von Human-DNase I nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zumindest 95%ige Identität mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz von nativer Human-DNase I aufweist.

3. Actin-resistente Variante von Human-DNase I nach Anspruch 1 oder 2, die zumindest eine Substitution einer Aminosäure durch eine andere an einer oder mehreren der folgenden Positionen aufweist: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 oder Ala114.

4. Actin-resistente Variante von Human-DNase I nach Anspruch 3, die eine Substitution einer Aminosäure durch eine andere an einer dieser Positionen aufweist.

5. Actin-resistente Variante von Human-DNase I nach Anspruch 1, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die sie von der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz nur durch Aminosäure-Substitution an einer oder mehreren der folgenden Positionen unterscheidet: His44, Leu45, Val48, Gly49, Leu52, Asp53, Asn56, His64, Tyr65, Val66, Val67, Glu69 oder Ala114.

6. Actin-resistente Variante von Human-DNase I nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin die Aminosäure-Substitution innerhalb der Variante ein Glykosylierungsstelle erzeugt, die in nativer Human-DNase I nicht vorhanden ist.

7. Actin-resistente Variante von Human-DNase I nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die eine oder mehrere der folgenden Aminosäure-Substitutionen aufweist: D53R, D53K, D53Y, D53A, Y65A, Y65E, Y65E, Y65R, V67E, V67K oder E69R.

8. Actin-resistente Variante von Human-DNase I nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die zumindest eine der folgenden Aminosäure-Substitutionen aufweist: H44A, H44A : D53R : Y65A, H44A : Y65A : E69R, D53R : Y65A und D53R : E69R.

9. Isolierte Nucleinsäure, die für eine Actin-resistente Variante von Human-DNase I nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.

10. Verwendung einer Variante von Human-DNase I nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Mukoviszidose.

11. Verwendung einer Variante von Human-DNase I nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von chronischer Bronchitis.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Variante von Human-DNase I nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die Zusammensetzung in flüssiger Form vorliegt.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die Zusammensetzung in Pulverform vorliegt.