DE69520880T2

DE69520880T2 - 9-deoxotaxan verbindungen

Info

Publication number: DE69520880T2
Application number: DE69520880T
Authority: DE
Inventors: L. Klein; Leping Li; M. Yeung
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1994-03-09
Filing date: 1995-03-01
Publication date: 2001-12-20
Anticipated expiration: 2015-03-02
Also published as: ATE201019T1; PH31271A; US5440056A; DE69520880D1; US5616740A; CA2182103A1; PT749432E; EP0749432B1; EP0749432A1; AU3104795A; WO1995024402A1; GR3036286T3; IL112880A0; ES2158093T3; DK0749432T3; MX9603891A; JPH09511235A; KR970701708A; AU688946B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft chemotherapeutische Verbindungen pflanzlichen Ursprungs. Genauer bezieht sich die Erfindung auf desoxidierte Paclitaxelverbindungen, hergestellt aus einem natürlichen Produkt, das aus Taxus canadensis isoliert wird, ebenso wie auf neuartige Analoga von Paclitaxel, die daraus hergestellt werden.
Paclitaxel, ein Mitglied der Taxanfamilie der Terpene und bekannt unter dem Handelsnamen "TAXOL", ist als ein chemotherapeutischer Wirkstoff gegen eine breite Spanne von Krebsarten interessant. Das im wesentlichen aus der pazifischen Eibe Taxus brevufolia abgeleitete Paclitaxel ist nachweislich wirksam gegen fortgeschrittene Brust- und Ovarial-Krebsarten in klinischen Versuchen, und zeigte eine vielversprechende Aktivität gegen eine Anzahl anderer Tumorarten in Voruntersuchungen. Eine Zusammenfassung des derzeitigen Status der Paclitaxelerforschung, Entwicklung und klinischen Tests kann ersehen werden in Rotherberg, Curr. Opin. Invest. Drugs, 2(12): 1269-1277 (1993); eine Zusammenfassung der synthetischen Versuche im Paclitaxelbereich wurde vetfaßt von D. G. I. Kingston in Prog. Chem. Org. Nat. Prod., 61: 1-206 (1993).
Obwohl Paclitaxel, welches die folgende Strukturformel aufweist
ein beträchtliches therapeutisches Potential gezeigt hat, haben seine Knappheit in der Natur und das Bedürfnis nach wirksameren cytostatischen Wirkstoffen Forscher dazu gebracht, alternative Quellen ebenso wie auch Analoga der Verbindung zu suchen. Einige Anstrengungen wurden unternommen, um Paclitaxel in Gewebe- und Zellkulturen zu produzieren. Eine gesamte chemische Synthese der Verbindung und seiner verwandten Analoga wurde versucht, wurde allerdings noch nicht erreicht. Die chemische Umwandlung von natürlich auftretenden Paclitaxelvorläuferstoffen, wie beispielsweise Baccatin III und Cephalomannin bis hin zu Paclitaxel selbst oder seinen Analoga, wurde berichtet; jedoch werden alternative Wege zur Herstellung von potentiell aktiven Taxanen weiterhin benötigt.
Eine Forschungsrichtung bezog sich auf einen in größerem Umfang vorhandenen Taxanvorläufer, 13-Acetyl-9-dihydrobaccatin III, das aus der weit verbreiteten canadischen Eibe Taxus canadensis erhalten werden kann, wie beschrieben in der veröffentlichten internationalen Anmeldung Nr. PCT/US93/03532, veröffentlicht am 28. Oktober, 1993 als Publikationsnr. WO 93/21173, und welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Diese 9-Dihydro Modifizierung ermöglicht die Herstellung einer neuen Serie Von Paclitaxel Analoga.
Modifikationen der C-7 und C-10 Positionen der Baccatinkomponente, einschließlich 7-Deoxy, 10-Desacetoxy und 7,10-Didesdxypaclitaxelderivate wurden ebenfalls beschrieben. 7- Desoxybaccatin oder 7-Desoxypaclitaxelderivate wurden beschrieben in der internationalen (PCT) Anmeldung Publicatonsnr. WO 93/02064, veröffentlicht am 4. Februar, 1993 und J. Org. Chem. 58: 3798-3799 (1993). 10- Desacetoxypaclitaxelderivate wurden beschrieben in der internationalen (PCT) Anmeldung Publikationsnr. WO 93/06093, veröffentlicht am 1. April 1993; das United States Patent Nr. 5,248,796, veröffentlicht am 28. September 1993, europäische Patent Anmeldung EP 558959, veröffentlicht am 8. September, 1993; J. Org. Chem. 58: 2927-2928 (1993); und Tetrahedron Lett. 34(31): 4921-24 (1993). 7,10-Dideoxypaclitaxelderivate wurden beschrieben in J. Org. Chem. 58: 5028-5029 (1993) und Tetrahedron Lett. 34(43): 6845-6848 (1993).
Bestimmte Patente und Patentanmeldungen beinhalten ebenfalls allgemein 9-Deoxotaxane, namentlich United States Patent Nr. 4,876,399, 5,015,744 und 5,175,315 und die internationale (PCT) Anmeldung Publikationsnr. WO 93/20036. Während diese Offenlegungen im allgemeinen auf 9-Deoxo Verbindungen Bezug nehmen, enthalten sie keine Beschreibung, wie diese Verbindungen hergestellt werden, und enthalten keine spezifischen Beispiele, prophetisch oder gegenwärtig, von 9- Desoxotaxanen. Demgemäß liefern diese Offenlegungen nicht mehr als einen Ansporn, die Herstellung solcher Verbindungen zu versuchen.
Tatsächlich kann die Fähigkeit, 9-desoxidierte Verbindungen zu synthetisieren mit potentiell verbesserten biologischen oder pharmakologischen Eigenschaften, signifikante Vorteile für den Chemiker oder Pharmakologen bieten. Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solche Verbindungen und Mittel zu deren Herstellung bereitzustellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden 9- desoxidierte Taxanverbindungen offengelegt, die die folgende Strukturformel (I) besitzen:
ebenso wie Prodrugs davon. Es wird erwartet, daß diese Verbindungen nützlich sind in Verbindung mit der Behandlung, oder bei der Herstellung von Paclitaxelderivaten zur Verwendung bei der Behandlung von Krebsarten und Leukämien.
R¹ in Formel (I) ist Alkanoyl oder ein Radikal gemäß der Formel:
wobei R&sup7; Wasserstoff, Alkyl, Phenyl, substituiertes Phenyl, Alkoxy, substituiertes Alkoxy, Amino, substituiertes Amino, Phenoxy oder substituiertes Phenoxy ist; R&sup8; ist Wasserstoff, Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Aminoalkyl, Phenyl, substituiertes Phenyl, α-Napththyl, β-Naphthyl oder Heteroaryl; und R&sup9; ist Wasserstoff, Alkanoyl, substituiertes Alkanoyl oder Aminoalkanoyl.
R², R³ und R&sup6; in Formel (I) sind unabhängig voneinander Hydroxyl, Wasserstoff, Alkoxyl, Alkanoyloxy oder Aminoalkanoyloxy.
R&sup4; in Formel (I) ist Alkyl, Alkanoyl, Aminoalkanoyl oder Aroyl.
R&sup5; in Formel (I) ist Alkyl, Alkanoyl, Aminoalkanoyl oder Aroyl.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden synthetische Verfahren zur Herstellung der obigen Verbindungen bereitgestellt, ebenso wie neuartige Zwischenstoffe, die darin nützlich sind, und die die Formel besitzen:
Methyl 13-Acetyl-9-dihydrobaccatin III 9-O-xanthat;
9-Desoxobaccatin III;
13-{(2R,3S)-N-Benzyloxycarbonyl-N,O-(1-methylethyliden)-3- phenylisoserin}-9-desoxobaccatin III;
7-O-Triethylsilyl-9-desoxobaccatin III;
13-Acetyl-9-desoxobaccatin III 7-Thiocarbonylimidazolid;
7-Deoxy-9-desoxobaccatin III;
13-{(2R,3S)-N-Benzyloxycarbonyl-N,O-(1-methylethyliden)-3- phenylisoserin}-7-desoxy-9-desoxobaccatin III;
7-Desoxy-9-desoxobaccatin III 10-Thiocarbonylimidazolid;
10-Desacetoxy-7-desoxy-9-desoxobaccatin III; und 13-{(2R,3S)-N-Benzyloxycarbonyl-N,O-(1-methylethyliden)-3- phenylisoserin}-10-desacetoxy-7-deoxy-9-deoxobaccatin III.
Solche Zwischenstoffe (Verbindungen 2, 3, 4, 8, 9, 10, 12, 13, 14 und 16) sind dargestellt in Schemata I, II und III.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen 9- Desoxotaxane und Derivate davon, die die Strukturformel (I) besitzen, worin die Gruppen R¹ bis R&sup9; so sind wie oberhalb beschrieben. Insbesondere umfassen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung jene, worin R¹ die C-13 Seitenkette von Paclitaxel ist, oder ein Radikal mit der Strukturformel
oder
Die folgenden Definitionen beziehen sich auf diese Verbindungen und betreffen die vorliegende Veröffentlichung:
Der Ausdruck "Alkyl", wie hierin verwendet, bezeichnet eine monovalente Gruppe die herrührt durch die Entfernung eines einzelnen - Wasserstoffatoms aus einem geraden oder verzweigtkettigen gesättigten Kohlenwasserstoff, der eins bis sechs Kohlenstoffatome enthält, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Nethyl, Ethyl, n- und iso-Propyl, n-, sec-, iso- und tert-Butyl, Pentyl und Hexyl.
Der Ausdruck "Alkanoyl", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkylfunktion wie oben definiert, angeheftet an den Hauptmolekülteil über eine Carbonylgruppe, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Acetyl, Propionyl, Butanoyl und Isobutanoyl.
Der Ausdruck "Alkoxy", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkylfunktion wie oben definiert, angeheftet an den Hauptmolekülteil über ein Sauerstoffatom, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Methoxy, Ethoxy, iso-Propoxy, Butoxy und tert-Butoxy.
Der Ausdruck "Alkoxyalkyl" wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkoxygruppe, wie oben definiert, angeheftet an den Hauptmolekülteil über eine Alkylgruppe, wie oben definiert.
Der Ausdruck "Aroyl", wie hierin verwendet, bezeichnet einen Phenylring, welcher an den Hauptmolekülteil über ein Carbonyl (-C(O)-) oder eine Thiocarbonylgruppe (-C(S)-) angeheftet ist. Der Phenylring kann unsubstituiert oder substituiert sein mit einem bis fünf Substituenten, unabhängig gewählt aus Halo, Haloalkyl, Alkyl, Amino und Alkoxy.
Der Ausdruck "Aminoalkanoyl", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkanoylfunktion wie oben definiert, substituiert mit zwischen einem und drei Aminogruppen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, 2-Aminopropanoyl, 4- Aminobutanoyl und 6-Aminohexanoyl.
Zusätzlich können die Aminogruppen wahlweise substituiert sein mit Peptidylresten von natürlich auftretenden Aminosäuren, ebenso wie mit di- und Tripeptidresten, die daraus gebildet werden.
Der Ausdruck "Aminoalkyl", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkylfunktion wie oben definiert, substituiert mit Amino oder substituiertem Amino, wie unten definiert.
Der Ausdruck "Halogen", wie hierin verwendet, bezeichnet einen Substituenten gewählt aus Brom (Br), Chlor (Cl), Fluor (F) und Jod (I).
Der Ausdruck "Haloalkyl", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkylgruppe wie oben definiert, substituiert mit zwischen einem und drei Halogenatomen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Fluormethyl, Trifluormethyl und 2-Fluorethyl.
Der Ausdruck "Hydroxyalkyl", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkylgruppe, wie oben definiert, substituiert mit einer Hydroxygruppe.
Die Ausdrücke "N-geschützt" und "N-schützend" bezeichnen die Verwendung einer Gruppe in der Absicht, eine Aminofunktion oder den N-Terminus einer Aminosäure oder eines Peptids gegen unerwünschte Reaktionen während eines synthetischen Verfahrens zu schützen, oder um den Angriff von Exopeptidasen an die Verbindung zu verhindern, oder um die Löslichkeit der Verbindung zu erhöhen und schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, die selbe Verwendung bei solchen Gruppen wie Sulfonyl; Acyl, wie z. B. Acetyl, Pivaloyl und Benzoyl; Alkoxycarbonyl, wie z. B. tert-Butyloxycarbonyl (BOC) und Benzyloxycarbonyl (Cbz); und L- oder D-Aminoacylreste, die ihrerseits N-geschützt sein können. Andere Beispiele können gefunden werden in The Peptides, E. Gross und J. Meienhofer, Band 3, Academic Press (1981), welches hierin durch die Referenz eingeschlossen ist.
Der Ausdruck "Prodrug", wie hierin verwendet, bezeichnet Verbindungen, die in vivo rasch umgewandelt werden, um die Hauptverbindungen gemäß Formel (I) zu ergeben, wie beispielsweise durch Hydrolyse im Blut. T. Higuchi und V. Stella liefern eine umfassende Diskussion des Prodrugkonzeptes in "Prodrugs as Novel Delivery Systems", A. C. S. Symposium Series, Band 14, American Chemical Society (1975), welches hier durch die Referenz eingeschlossen ist. Beispiele von Estern, die nützlich sind als Prodrugs für Verbindungen, die Carboxylgruppen enthalten, können eingesehen werden auf den Seiten 14-21 von "Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application", ed. E. B. Roche, Pergamon Press (1987), welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Der Ausdruck "Prodrugestergruppe", wie hierin verwendet, bezieht sich auf irgendeine von verschiedenen esterformenden Gruppen, die unter physiologischen Bedingungen hydrolisiert werden. Beispiele von Prodrugestergruppen umfassen Phosphate, Pivaloyloxymethyl, Acetoxymethyl, Phthalidyl, Indanyl und Methoxymethyl, ebenso wie andere solcher Gruppen, die im Fachgebiet bekannt sind.
Der Ausdruck "schützende Gruppe", wie hierin verwendet, ist ein im Fachgebiet wohlbekannter - Begriff und bezeichnet Substituenten auf funktionalen Gruppen von Verbindungen, welche chemischer Umwandlungen unterworfen sind, die während einer Synthese unerwünschte Reaktionen und Abbauvorgänge verhindern; siehe beispielsweise T. H. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," John Wiley & Sons (1981), welche hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Der Ausdruck "substituiertes Alkanoyl", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkanoylgruppe wie oben definiert, substituiert mit zwischen einer und drei Gruppen wie z. B. Hydroxyl, Sulfhydryl, Alkoxyl, Carboxyl und Halogen.
Der Ausdruck "substituiertes Alkoxy", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkoxygruppe wie oben definiert, substituiert mit zwischen einer und drei Gruppen, wie z. B. Hydroxyl, Sulfhydryl, Alkoxyl, Thioalkoxyl, Carboxyl, Amino und Halogen.
Der Ausdruck "substituiertes Amino", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Aminogruppe, substituiert mit einer oder zwei Alkylgruppen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf t- Butylamino, Benzylamino und N,N-Dimethylamino.
Der Ausdruck "substituiertes Phenyl", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Phenylgruppe, substituiert mit zwischen einem und drei Substituenten, unabhängig gewählt aus Alkyl, Halogen, Haloalkyl, Alkoxy, Benzyloxy, Thioalkoxy, Hydroxy, Alkanoyl, Carboxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Nitro und -OSO&sub3;H.
Der Ausdruck "substituiertes Phenoxy", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Phenoxygruppe, substituiert mit zwischen einem und drei Substituenten, unabhängig gewählt aus Alkyl, Halogen, Haloalkyl, Alkoxy, Benzyloxy, Thioalkoxy, Hydroxy, Alkanoyl, Carboxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Nitro und -OSO&sub3;H.
Der Äusdruck "Thioalkoxy", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Alkoxygruppe wie oben definiert, worin ein Schwefelstoffatom das Wasserstoffatom ersetzt.
Typische Beispiele der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen folgende ein:
13-Acety1-9-desoxobaccatin III;
9-Desoxopaclitaxel;
13-Acetyl-7-desoxy-9-desoxobaccatin III;
7-Desoxy-9-desoxopaclitaxel;
13-Acetyl-10-desacetoxy-7-desoxy-9-desoxobaccatin III; und
10-Desacetoxy-7-desoxy-9-desoxopaclitaxel.
Von diesen Verbindungen werden 9-Desoxopaclitaxel, 7-Desoxy-9- desoxopaclitaxel, und 10-Desacetoxy-7-desoxy-9-desoxopaclitaxel bevorzugt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen eine oder mehrere der obigen Verbindungen in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Mit "pharmazeutisch verträglich" ist innerhalb des Gebietes vernünftiger medizinischer Beurteilung gemeint, geeignet zur Verwendung in Kontakt mit den Geweben von Menschen und niederen Tieren ohne unerwünschte Toxizität, Irritation, allergischer Antwort und ähnlichem, und vereinbar mit einem vernünftigen Nutzen/Risikoverhältnis. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger" einen nichttoxischen, inerten Feststoff, Halbfeststoff oder flüssigen Füllstoff, Verdünner, Kapselmaterial oder Hilfsstoff jeglicher Art. Einige Beispiele von Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, sind Zucker wie z. B. Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken wie z. B. Maisstärke und Kartoffelstärke; Cellulose und seine Derivate, wie z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; pulverisierter Tragant; Malz; Gelatine; Talkum; Bindemittel wie z. B. Kakaobutter und Wachse für Suppositorien; Öle wie Erdnußöl, Baumwollsamenöl, Safloröl; Sesamöl; Olivenöl; Maisöl und Sojabohnenöl; Glykole; wie z. B. Propylenglykol; Ester wie z. B. Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar; puffernde Stoffe wie z. B. Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; Alginsäure; pyrogenfreies Wasser; isotonische Kochsalzlösung; Ringer's Lösung; Ethylalkohol, und Phosphatpufferlösungen, ebenso wie auch andere nichttoxische verträgliche Schmiermittel wie z. B. Natriumlarylsulfat und Magnesiumstearat, ebenso wie Farbstoffe, freisetzende Wirkstoffe, Beschichtungsstoffe, Süßstoffe, Geschmacks- und Geruchsstoffe, Konservierungsstoffe und Antioxidantien, welche ebenfalls in der Zusammensetzung vorhanden sein können, gemäß der Beurteilung desjenigen, der die Zusammensetzung erstellt. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können Menschen oder anderen Tieren oral, rektal, parenteral, intrazisternal, intravaginal, intraperitoneal, topisch (wie durch Puder, Salben oder Tropfen), bukkal oder als ein orales oder nasales Spray verabreicht werden.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu den aktiven Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünner enthalten, die üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden, wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, Lösungsvermittelnde Stoffe und Emulgatoren, wie z. B. Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3- Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Ernuß-, Mais-, Keim-, Oliven-, Rizinus- und Sesamöle), Glycerol, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan und Mischungen davon. Außer inerten Verdünnern können die oralen Zusammensetzungen ebenfalls Adjuvantien umfassen, wie z. B. feuchtigkeitsspendende Wirkstoffe, Emulgatoren und Suspensionsmittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Geruchsstoffe.
Injizierbare Zusammensetzungen, beispielsweise sterile injizierbare wässerige oder ölige Suspensionen können formuliert werden gemäß dem bekannten Fachwissen unter Verwendung von geeigneten - dispergierenden oder feuchtigkeitsspendenden Stoffen und Suspensionsmitteln. Die sterile injizierbare Zusammensetzung kann ebenfalls eine sterile injizierbare Lösung, Suspension oder Emulsion in einem nichttoxischen parenteral verträglichen Verdünner oder Lösungsmittel sein, beispielsweise als eine Lösung in 1,3-Butandiol. Zwischen den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, sind Wasser, Ringer's Lösung, U. S. P, und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden üblicherweise sterile, fette Öle als Lösungsmittel oder suspendierendes Medium verwendet. Zu diesem Zweck kann jedes milde fette Öl verwendet werden, einschließlich synthetische Mono- oder Diglyceride. Zusätzlich werden Fettsäuren wie z. B. Ölsäure bei der Herstellung von Injektabilia verwendet.
Die injizierbaren Zusammensetzungen können sterilisiert werden, beispielsweise durch Filtration durch einen Filter, der Bakterien zurückhält, oder durch das Einbringen sterilisierender Mittel in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium vor der Anwendung aufgelöst oder dispergiert werden können.
Um die Wirkung eines Medikamentes zu verlängern, ist es oft wünschenswert, die Absorption des Medikamentes von subkutaner oder intramuskulärer Injektion zu verlangsamen. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung einer flüssigen Suspension von kristallinem oder amorphem Material mit schlechter Wasserlöslichkeit. Die Absorptionsrate des Medikamentes hängt dann ab von der Rate der Auflösung, welche wiederum abhängig sein kann von der Kristallgröße und der kristallinen Form. Alternativ kann eine verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Arzneiform erzielt werden durch Auflösen oder Suspendieren des Arzneistoffs in einem öligen Vehikel. Injizierbare Depotformen werden hergestellt durch die Bildung von mikroverkapselten Matrizen des Medikamentes in biologisch abbaubaren Polymeren, wie z. B. Polylactid-Polyglycolid. Abhängig von dem Verhältnis von Medikament zu Polymer und der Natur des speziell verwendeten Polymers kann die Geschwindigkeit der Medikamentenfreisetzung gesteuert werden. Beispiele von anderen biologisch abbaubaren Polymeren umfassen poly(Orthoester) und poly(Anhydride). Injizierbare Depotzusammensetzungen werden ebenfalls hergestellt durch das Einschließen des Arzneistoffs in Liposome oder Mikroemulsionen, die verträglich sind mit Körpergeweben.
Zusammensetzungen zur rektalen oder vaginalen Verabreichung sind vorzugsweise Suppositorien, welche hergestellt werden können, indem die Verbindungen dieser Erfindung gemischt werden mit geeigneten nicht-irritierenden Bindemitteln oder Trägern wie z. B. Kakaobutter, Polyethylenglykol oder einem Suppositorienwachs, welche fest sind bei Raumtemperatur, aber flüssig bei Körpertemperatur und daher im Rektum oder in der Vaginalhöhle schmelzen und die aktiven Verbindung freisetzen.
Feste Zusammensetzungen ähnlicher Art können ebenfalls verwendet werden als Füllstoffe in weichen und hartgefülten Gelatinekapseln unter Verwendung solcher Bindemittel wie Lactose oder Milchzucker ebenso wie Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht und ähnliches.
Die aktiven Verbindungen können ebenfalls in einer mikroeingekapselten Form sein, mit einem oder mehreren der Bindemittel, die oben erwähnt sind. Die festen Dosierformen von Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granalien können hergestellt werden mit Beschichtungen und Hüllen wie z. B. darmlöslichen. Beschichtungen, freisetzungssteuernden Beschichtungen und anderen Beschichtungen, die im Fachgebiet der pharmazeutischen Formulierung wohl bekannt sind. Bei solchen festen Dosierungsformen kann die aktive Verbindung beigemischt werden mit mindestens einem inerten Streckmittel wie z. B. Saccharose, Lactose oder Stärke. Solche Dosierformen können ebenfalls, wie es übliche Praxis ist, zusätzliche Substanzen umfassen, die nicht inerte Streckmittel sind, beispielsweise Tablettierschmiermittel und andere Tablettierhilfsstoffe, wie z. B. Magnesiumstearat und mikrokristalline Cellulose. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierformen ebenfalls puffernde Wirkstoffe umfassen. Diese können wahlweise Trübungsmittel enthalten und können ebenfalls von einer solchen Zusammensetzung sein, daß sie die aktive Verbindung(en) nur, oder vorzugsweise, in einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltraktes freisetzen, wahlweise in einer verzögerten Art und Weise. Beispiele von einbettenden Zusammensetzungen, die verwendet werden können, schließen polymere Substanzen und Wachse ein.
Dosierungsformen zur topischen oder transdermalen Verabreichung einer Verbindung gemäß dieser Erfindung schließen ein Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Puder, Lösungen, Sprays, Inhalantien oder Pflaster. Die aktive Verbindung wird unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und jeglichen benötigten Konservierungsstoffen oder Puffern gemischt, wie erforderlich. Ophthalmologische Zusammensetzungen, Ohrentropfen, Augensalben, Puder und Lösungen werden ebenfalls als im Bereich dieser Erfindung liegend betrachtet.
Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zu einer aktiven Verbindung gemäß dieser Erfindung Bindemittel wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid, oder Mischungen davon enthalten. Puder und Sprays können zusätzlich zu den Verbindungen dieser Erfindung Bindemittel, wie z. B. Laktose, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Kalziumsilikate und Polyamidpuder, oder Mischungen dieser Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich übliche Treibmittel wie z. B. Fluorchlorkohlenwasserstoffe enthalten.
Transdermale Pflaster haben den zusätzlichen Vorteil, daß eine gesteuerte Freisetzung einer Verbindung an den Körper ermöglicht wird. Solche Dosierungsformen können hergestellt werden durch das Auflösen oder Dispergieren der Verbindung in dem geeigneten Medium. Absorptionsverstärker können auch verwendet werden, um den Flux der Verbindung durch die Haut zu erhöhen. Das Verhältnis kann gesteuert werden entweder durch das Bereitstellen einer geschwindigkeitssteuernden Membran oder durch das Dispergieren der Verbindung in eine Polymermatrix oder ein -gel.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren - in einem Menschen oder einem niederen Säugetier, einschließlich das Verabreichen an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung der Erfindung in solchen Mengen und für solche Zeiträume, wie es notwendig ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Durch eine "therapeutisch wirksame Menge" der Verbindung der Erfindung ist eine ausreichende Menge der Verbindung gemeint, um einen Tumor zu behandeln, mit einem vernünftigen Nutzen-/Risikoverhältnis, anwendbar auf irgendeine medizinische Behandlung. Es soll jedoch verstanden werden, daß die gesamte tägliche Behandlungsweise der Verbindungen und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung entschieden wird durch den behandelnden Arzt innerhalb des Bereiches von vernünftiger medizinischer Beurteilung. Der spezifische therapeutisch wirksame Dosierlevel für jeden einzelnen Patienten wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängig sein, einschließlich der zu behandelnden Erkrankung und der Schwere der Erkrankung; der Aktivität der spezifisch verwendeten Verbindung; die spezifisch verwendete Zusammensetzung; dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht und Ernährung des Patienten; dem Zeitpunkt der Verabreichung, dem Weg der Verabreichung und der Ausscheidungsrate der spezifisch verwendeten Verbindung; der Behandlungsdauer; der Medikamente, die in Kombination oder gleichzeitig mit der spezifischen Verbindung verwendet werden; und ähnliche Faktoren, die im medizinischen Fachgebiet gut bekannt sind.
Die gesammte tägliche Dosis der Verbindungen dieser Erfindung, die einem Menschen oder einem anderen Säugetier in einzelnen oder in aufgeteilten Dosen verabreicht wird, kann in Mengen sein wie beispielsweise zwischen 0,001 bis 50 mg/kg Körpergewicht oder üblichererweise von 0,01 bis 25 mg/kg Körpergewicht. Einzelne Dosierungszusammensetzungen können solche Mengen oder Bruchteile davon enthalten, um die tägliche Dosierung auszumachen. Im allgemeinen umfassen Behandlungsschemata gemäß der vorliegenden Erfindung die Verabreichung an einen menschlichen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, von etwa 10 mg bis etwa 1000 mg der Verbindung(en) dieser Erfindung pro Tag im einzelnen oder multiplen Dosen.
Im allgemeinen schließen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Hemmung des Wachstums eines Mammakarzinoms ein, indem der Tumor einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ausgesetzt wird, in solchen Konzentrationen und für solche Zeiträume wie es notwendig ist, um die gewünschte Hemmung zu erzielen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung, in denen die obigen Verbindungen gemäß Formel (I) hergestellt werden aus 9- Dihydro-13-acetylbaccatin III (Verbindung 1), umfassen die folgenden Schritte:
(a) Thioacylierung von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III, um eine 9-Thioacylverbindung zu ergeben;
(b) Desoxidierung des Produktes aus Schritt (a);
(c) Desacetylierung an der 13-Position;
(d) Hinzufügen einer geeigneten Seitenkette an die C-13 Position des Produktes aus Schritt (c); und
(e) selektive Deprotektion des Produktes aus Schritt (d).
Ein Verfahren zur Herstellung einer 7-Deoxy-9- deoxotaxanverbindung umfaßt folgende Schritte:
(a) Thioacylierung von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III, um eine 9-Thioacylverbindung zu ergeben;
(b) Desoxidierung des Produktes aus Schritt (a);
(c) Wiederholen der Schritte (a) und (b) an der 7-Position;
(d) Desacetylierung an der 13-Position;
(e) Hinzufügen einer geeigneten Seitenkette an die C-13 Position des Produktes aus Schritt (d); und
(f) selektive Deprotektion des Produktes aus Schritt (e).
Ein Verfahren zur Herstellung einer 7-Desoxy-9-deoxo-10- desacetoxytaxanverbindung umfaßt folgende Schritte:
(a) Thioacylierung von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III, um eine 9-Thioacylverbindung zu ergeben;
(b) Desoxidierung des Produktes aus Schritt (a);
(c) Wiederholen der Schritte (a) und (b) an der 7-Position; (d) Desacetylierung in der 10-Position;
(e) das Wiederholen der Schritte (a) und (b) an der 10- Position;
(f) Desacetylierung an der 13-Position;
(g) Hinzufügen einer geeigneten Seitenkette an die C-13 Position des Produktes aus Schritt (f); und
(h) selektive Deprotektion des Produktes aus Schritt (g).
Genauer gesagt wurde herausgefunden, daß die Verbindung 1 der vorliegenden Erfindung erzielt werden kann durch alkoholische Extraktion aus zerstoßenen Nadeln und Zweigen von Taxus canadensis. Dieser Extrakt wird dann gereinigt unter Verwendung von üblichen Trenntechniken, ausgehend von einer Auftrennung zwischen Lösungssystemen bestehend aus Aceton, Methanol, Hexan, Heptan und Wasser, um Fette und Lipide zu entfernen. Der entfette rohe Extrakt wird weiter aufgetrennt, in mehreren Schritten, zwischen Lösungsmittelsystemen, bestehend aus Methanol, Methylenchlorid, Chloroform, Ethylacetat und Wasser. Jene Fraktionen des Extraktes, welche löslich sind in einem Lösungssystem bestehend entweder aus Methylenchlorid oder aus Chloroform und Ethylacetat enthalten die Verbindung 1.
Die obigen Fraktionen können weiter gereinigt werden durch planet coil countercurrent chromatography (PCCC) unter Verwendung von Lösungssystemen, bestehend aus Hexan, Methanol, Methylenchlorid, Chloroform, Toluen und Wasser oder geeigneten wässerigen Puffern. Die verschiedenen Fraktionen enthalten verschiedene Taxanderivate, einschließlich Paclitaxel, Cephalomannin und Baccatin III. Das Lösungsmittel wird entfernt aus der Fraktion, welche Verbindung 1 enthält, welche rekristallisiert wird aus Methanol oder Ethanol und Wasser, um die reine Verbindung als weiße Kristalle zu ergeben. Falls gewünscht, können Paclitaxel, Baccatin und andere verwandte Verbindungen ebenfalls aus den verschiedenen chromatographischen Fraktionen isoliert werden.
Asymmetrische Zentren können in den Verbindungen der vorliegenden Erfindung vorliegen. Die vorliegende Erfindung umfaßt die verschiedenen Stereoisomere und Mischungen davon. Ausgangsverbindungen einer bestimmten Stereochemie sind entweder kommerziell erhältlich oder werden durch die Verfahren hergestellt, die unterhalb dargestellt sind, und durch Techniken analysiert, die im Fachgebiet der organischen Chemie wohl bekannt sind.
Im allgemeinen können die Verbindungen gemäß Formel (I) dann aus Verbindung 1 synthetisiert werden, durch Behandlung mit einem thioacylierenden Wirkstoff an C-9, gefolgt von Zinnhydridreduktion, um die Verbindungen zu ergeben, welche in Schema I gezeigt sind. Weitere Thioacyl/Reduktionsschritte können durchgeführt werden an 3 für die anderen Hydroxyle an C- 7, C-10 und C-1, wie für 9, 14, usw. Diese Desoxyverbindungen können ebenfalls desacetyliert werden an C-13 wie für 10 und 12; das C-13 Hydroxyl, wie oben behandelt mit Lactamen oder Acetonidformen der geeigneten Seitenkette; die Seitenketten schützenden Gruppen entfernt; und der Seitenkettenstickstoff acyliert, um die endgültigen 9-Desoxoanaloga zu ergeben.
Als ein bestimmtes Beispiel des Verfahrens, das unterhalb in Schema I dargestellt ist, wird 13-Acetyl-9-dihydrobaccatin III (1) mit Lithiumhexamethyldiisilazid, Kohlenstoffdisulfid und Methyljodid behandelt, um das C-9 Methylxanthat 2 zu ergeben. Verbindung 2 wird mit Tributylzinn oder tris(Trimethylsilyl)silan oder anderen trisubstituierten Zinnwirkstoffen behandelt, um eine Desoxidierung zu bewirken, welche die Verbindung 3 ergibt, gefolgt von Methyllithium, um die Acetylgruppe an der 13-Position zu entfernen und die Verbindung 4 zu ergeben, welche dargestellt ist mit einer Hydroxy-schützenden Gruppe an der 7-Position. Die Verbindung 4 wird dann zur Reaktion gebracht mit einem geeigneten geschützten Seitenkettenderivat (wie beispielsweise (3R,4S) -N-Acyl-3-O-(1- ethoxyethyl)-4-phenyl-2-azetidinon (5) oder (2R,3S)-N-geschützt- N,O-(1-Methylethyliden)-3-phenylisoserin (6)). Die schützenden Gruppen können dann entfernt werden mit einer milden Säure, wenn der Zwischenstoff 5 verwendet wird, wie beispielsweise 1%ige HCl in Ethanol oder Methanol, oder katalytisch hydriert, wenn Zwischenstoff 6 verwendet wird. Wenn Zwischenstoff 6 verwendet wird, folgt der Deprotektion eine 3'-Aminoacylierung (wie beispielsweise eine Behandlung mit Benzoesäureanhydrid, um die gewünschten 9-Desoxotaxane gemäß Formel (I) zu erzeugen, in diesem Fall 9-Desoxopaclitaxel (7). (Wenn der Zwischenstoff 5 verwendet wird, ist R die gewünschte Acylgruppe, d. h. Benzoyl im Fall des Paclitaxelanalogons).
Alternativ können die Desoxygenierungsschritte wiederholt werden an der Verbindung 3, um die 9-Desoxo-7-desoxyverbindung 9 zu ergeben.
Die weitere Verarbeitung von Verbindung 9 ist dargestellt in Schema II. Behandlung der Verbindung 9 mit Methyllithium, um die 13-Acetyl-schützende Gruppe zu entfernen, ergibt die Verbindung 10. Die Verbindung 10 kann dann zur Reaktion gebracht werden mit einem geeigneten geschützten Seitenkettenderivat (wie beispielsweise (3R,4S)-N-Acyl-3-O-(1-ethoxyethyl)-4-phenyl-2- azetidinon (5), oder (2R,3S)-N-geschützt-N,O-(1- Methylethyliden)-3-phenylisoserin (6)). Die schützenden Gruppen werden dann entfernt mit einer schwachen Säure (wie beispielsweise 1% HCl in Ethanol oder Methanol) falls Verbindung 5 verwendet wird, oder hydriert, wenn die Verbindung 6 verwendet wird. Wenn der Zwischenstoff 6 verwendet wird, folgt der Deprotektion eine 3'-Aminoacylierung, um das gewünschte 9- Desoxo-7-desoxypaclitaxel gemäß Formel (T) zu erzeugen. Falls Benzoesäureanhydrid verwendet wird, ergibt sich 9-Desoxo-7- desoxypaclitaxel (11). (Wenn Zwischenstoff 5 verwendet wird, ist R die gewünschte Acylgruppe, d. h. Benzoyl im Fall der Paclitaxelanaloga).
Alternativ wird die 13-Acetyl-schützende Gruppe entfernt (wie beispielsweise mit Methyllithium), um die Verbindung 12 zu ergeben. Die Desoxygenierungsschritte können wiederholt werden an der Verbindung 12, um die 9-Deoxo-7,10-dideoxyverbindung 14. zu ergeben. Die Verbindung 14 kann dann zur Reaktion gebracht werden mit einem geeigneten geschützten Seitenkettenderivat (beispielsweise (3R,4S)-N-Acyl-3-O-(1-ethoxyethyl)-4-phenyl-2- azetidinon (5) oder (2R,3S)-N-Acyl-N,O-(1-methylethyliden)-3- phenylisoserin (6)). Die schützenden Gruppen werden dann entfernt mit einer schwachen Säure (beispielsweise 1% HCl in Ethanol oder Methanol), falls Verbindung 5 verwendet wird, oder hydriert, wenn Verbindung 6 verwendet wird. Wenn der Zwischenstoff 6 verwendet wird, folgt der Deprotektion die 3'- Aminoacylierung, um die gewünschten 9-Deoxo-7,10-dideoxytaxane gemäß Formel (I) zu erzeugen. Wenn Benzoesäureanhydrid als acylierendes Mittel verwendet wird, entsteht 9-Desoxo-7-desoxy- 10-desacetoxypaclitaxel (15). (Wenn der Zwischenstoff 5 verwendet wird, ist R die gewünschte Acylgruppe des Endproduktes, d. h. Benzoyl im Falle der Paclitaxelanaloga).
Schema III zeigt die Verwendung von Zwischenstoff 6 ((2R,3S)-N-geschützt-N,O-(1-Methylethyliden)-3-phenylisoserin) bei der Herstellung von 9-Desoxo-7-desoxy-10- desacetoxypaclitaxel. Das desoxidierte 13-deacetylierte Baccatin III (14) wird zur Reaktion gebracht mit dem Seitenkettenvorläufer 6, wobei R* eine Stickstoff-Schutzgruppe wie z. B. Benzyloxycarbonyl ist, um die Verbindung 16 zu ergeben. Die Stickstoff-Schutzgruppe wird entfernt (wie beispielsweise durch katalytische Hydrierung, wenn R* Benzyloxycarbonyl ist) und dann wird die Seitenkettenaminogruppe acyliert (wie beispielsweise mit Benzoesäureanhydrid), um das endgültige Produkt (15) zu ergeben.
Es wird von jemandem, der im Fachgebiet bewandert ist geschätzt werden, daß die Desoxidierungen und die selektiven Schutz- und Deprotektionsschritte, die die verschiedenen Hydroxylgruppen der Baccatin III Struktur betreffen, durchgeführt werden können in variierender Reihenfolge oder Anzahl von Schritten, wie benötigt, und daß die Schemata I und II solche Variationen umfassen sollen. Schema I Schema II Schema III
Das zuvor besagte kann besser verstanden werden unter Bezug auf die folgenden Beispiele, in welchen bestimmte Reagenzien und Bedingungen, die bei diesen Synthesen verwendet werden, im Detail beschrieben sind. Diese Beispiele sollen zum Zweck der Illustration dienen und sollen nicht als eine Einschränkung der Erfindung verstanden werden. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: AIBN für 2,2'-Azobis-(2-methylpropionitril), CH&sub2;Cl&sub2; für Methylenchlorid, DMAP für Dimethylaminopyridin, DMF für Dimethylformamid, EtOAc für Ethylacetat, LHMDS für Lithiumhexamethyldisilazid, MeOH für Methanol und THF für Tetrahydrofuran.

Beispiel 1

Methyl 13-Acetyl-9-dihydrobaccatin III 9-O-Xanthat (Schema I, Verbindung (2))

Zu 13-Acetyl-9-dihydrobaccatin III (1) (1g, 1,58 mmol) aufgelöst in THF (100 ml) bei -25ºC wurde unter Stickstoff LHMDS (3,5 ml, 1M in THF, 3,5 mmol) hinzugefügt, nach 15 Minuten gefolgt durch Kohlenstoffdisulfid (0,33 ml, 5,2 mmol) und nach 5 Minuten durch Methyljodid (0,33 ml, 5,2 mmol). Nach 1 Stunde war die Reaktion vollständig gemäß Analyse durch Dünnschichtchromatographie. Die Reaktion wurde gestillt durch die Zugabe von pH 7 Phosphatpuffer und die organische Schicht wurde vereinigt mit Ethylacetat und getrennt, getrocknet, und in vakuo verdampt. Der Reststoff wurde gereinigt durch Silicagelsäulenchromatographie unter Verwendung von 97 : 3 CHCl&sub3;- MeOH, um 0,66 g (58%) Methyl 13-Acetyl-9-dihydrobaccatin III 9-O- Xanthat (2) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.1 (d, 2H, ArH), 7.62 (t, 1H, ArH), 7.49 (t, 2H, ArH), 6.88 (d, 1H, H-9), 6.43 (d, 1H, H-10), 6.18 (t, 1H, H-13), 5.92 (d, 1H, H-2), 4.99 (d, 1H, H-5), 4.45 (t, 1H, H-7), 4.32 (d, 1H, H-20a), 4.19 (d, 1H, H-20b), 3.1 (d, 1H, H-3), 2.7-2.6 (m, 1H, H-6a), 2.63 (s, 3H, SMe), 2.3 (s, 3H, OAC), 2.22 (d, 1H, H-14a), 2.2 (s, 3H, OAc), 2.01 (s, 3H, OAC), 1.99 (d, 3H, Vinyl-CH&sub3;), 2.05-1.8 (m, 2H, H-6b, H-14b), 1.84 (s, 3H, CH&sub3;), 1.61 (s, 3H, CH&sub3;), 1.25 (s, 3H, CH&sub3;). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 738 (M + H + NH&sub3;)&spplus;.

Beispiel 2

13-Acetyl-9-deoxobaccatin III

(Schema I, Verbindung (3))

Zu einer Lösung der Verbindung die aus Beispiel 1 entsteht (0,66 g, 0,92 mmol) und 2,2'-Azobis(2-methylpropionitril) (AIBN, 30 mg) in Toluen (20 ml) gerührt bei 100ºC unter Stickstoff, wurde tropfenweise tri-n-Butylzinnhydrid (0,3 ml, 1,12 mmol) hinzugefügt. Nach 30 Minuten war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse. Die Reaktion wurde gestillt durch den Zusatz von pH 7 Phosphatpuffer, und die organische Schicht wurde kombiniert mit Ethylacetat und getrennt, getrocknet und in vakuo verdampft. Der Reststoff wurde gereinigt durch Silicagelsäulenchromatographie unter Elution mit 95 : 5 CHCl&sub3;-MeOH, um 0,535 g (95%) der Titelverbindung (3) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.1 (d, 2H, ArH), 7.61 (t, 1H, ArH), 7.48 (1, 2H, ArH), 6.17 (t, 1H, H-13), 5.93 (d, 1H, H-10), 5.77 (d, 1H, H-2), 4.97 (d, 1H, H-5), 4.29 (d, 1H, H-20a), 4.13 (d, 1H, H-20b), 4.04 (t, 1H, H-7), 3.03 (d, 1H, H- 3), 2.58 (ddd, 1H, H-6a), 2.38 (brs, 1H, H-7OH), 2.31-2.26 (m, 2H, H9), 2.27 (s, 3H, 4-OAc), 2.23-2.19 (m, 2H-14), 2.19 (s, 3H, 13-OAc), 2.09 (s, 3H, 10-OAc), 1.85 (d, 3H, Vinyl-CH&sub3;), 1.88-1.8 (m, 1H, H-6b), 1.72 (s, 3H, CH&sub3;), 1.4 (s, 3H, 19-CH&sub3;), 1.26 (s, 3H, CH&sub3;).

Beispiel 3

9-Deoxobaccatin III

Zu einer Lösung der Verbindung die aus Beispiel 2 entsteht (0,188 g, 1,37 mmol) in THF (40 ml) gerührt unter Stickstoff bei -78ºC, wurde Methyllithium (1,4 M in Ether, /ml, 6,2 mmol) tropfenweise hinzugefügt. Nach 45 Minuten war die Reaktion vollständig gemäß Analyse durch Dünnschichtchromatographie. Die Reaktion wurde gestillt in dem sie zu 400 ml pH 7 Phosphatpuffer und Ethylacetat hinzugefügt wurde unt die organische Schicht wurde getrennt, getrocknet und in vakuo verdampft. Der Reststoff wurde gereinigt durch Silicagelsäulenchromatographie unter Elution mit 95 : 5 CHCl&sub3;-MeOH, um 70 mg (40%) der Titelverbindung (4) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.13 (d, 2H, ArH), 7.61 (t, 1H, ArH), 7.48 (t, 2H, ArH), 5.9 (dd, 1H, H-10), 5.73 (d, 1H, H-2), 4.95 (d, 1H, H-5), 4.8 (m, 1H, H-13), 4.3 (d, 1H, H-20a), 4.14 (d, 1H, H-20b), 4.07 (dd, 1H, H-7), 3.1 (d, 1H, H-3), 2.68 (ddd, 1H, H-6a), 2.35-2.0 (m, 4H, H9, H14), 2.27 (s, 3H, OAc), 2.1 (s, 3H, OAC), 2.01 (d, 3H, Vinyl-CH&sub3;), 1.83 (ddd, 1H, H-6b), 1.69 (s, 3H, CH&sub3;), 1.4 (s, 3H, 19-CH&sub3;), 1.26 (s, 3H, CH&sub3;). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 573 (M + H)&spplus;, 590 (M + H + NH&sub3;)&spplus;.

Beispiel 4

7-O-Triethylsilyl-9-deoxobaccatin III

(Schema I, Verbindung (4))

Die Verbindung die aus Beispiel 3 entsteht (4) (70 mg, 0,12 mmol) wurde mit Triethylamin (0,2 ml, 1,43 mmol), 4- Dimethylaminopyridin (DMAP, 5 mg) und Triethylsilylchlorid (0,1 ml, 0,58 mmol) in CHCl&sub3; (/ml) bei 25ºC kombiniert. Nach drei Stunden wurde die Mischung gestillt mit Puffer und Ethylacetat. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet, und in vakuo konzentriert, um einen Reststoff zu ergeben, welcher gereinigt wurde durch Silicagelsäulenchromatographie unter Elution mit 97 : 3 CHCl&sub3;-MeOH, um 76 mg (90%) der Titelverbindung (4) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.13 (d, 2H, ArH), 7.61 (t, 1H, ArH), 7.48 (t, 2H, ArH), 5.82 (dd, 1H, H-10), 5.75 (d, 1H, H- 2), 4.9 (d, 1H, H-5), 4.77 (m, 1H, H-13), 4.3 (d, 1H, H-20a), 4.14 (d, 1H, H-20b), 4.02 (dd, 1H, H-7), 3.13 (d, 1H, H-3), 2.51 (ddd, 1H, H-6a), 2.45-2.0 (m, 4H, H9, H14), 2.27 (s, 3H, OAC), 2.13 (d, 3H, Vinyl-CH&sub3;), 2.05 (s, 3H, OAC), 1.85 (ddd, 1H, H-6b), 1.67 (s, 3H, CH&sub3;), 1.4 (s, 3H, 19-CH&sub3;), 1.18 (s, 3H, CH&sub3;), 0.99 (t, 9H, Si-C-CH&sub3;), 0.6-0.7 (m, 6H, Si-CH&sub2;). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 686 (M + H)&spplus;.

Beispiel 5

9-Deoxopaclitaxel

(Schema I, Verbindung (7))

Zu einer Lösung der Verbindung wie aus Beispiel 4 besteht, 7-0-Triethylsilyl-9-deoxobaccatin III, (45 mg, 0,06 mmol) in THF bei 25ºC, wurde Natriumhydrid (60 Gewichtsprozent, 40 mg, 0,9 mmol), gefolgt durch (3R, 4S)-N-Benzoyl-3-O-(1-ethoxyethyl)-4- phenyl-2-azetidinon (Verbindung 5), hergestellt wie beschrieben durch Georg et al., Biooraanic & Medicinal Chemistry Letters 2(4): 295 (1992) oder Ojima et al., J. Org. Chem. 56: 1681 (1991) [jeweils durch Bezugnahme hiermit eingeschlossen] (133 mg, 0,36 mmol) hinzugefügt. Nach 7 Stunden war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse. Die Mischung wurde mit Puffer und Ethylacetat gestillt. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert, um einen Reststoff zu ergeben, welcher direkt kombiniert wurde mit 1% HCl in Methanol (2 ml) bei 25ºC. Nach 2 stündigem Rührem war die Reaktion vollständig gemäß Dünnschichtchromatographischer Analyse und wurde mit Puffer und Ethylacetat gestillt. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getocknet und in vakuo konzentriert. Vor der Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie (0,5 mm) mit 93 : 7 CHCl&sub3;- MeOH, um 17 mg (30%) der Titelverbindung zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.09 (d, 2H, ArH), 7.82 (d, 2H, ArH), 7.61 (t, 1H, ArH), 7.55-7.3 (m, 11H, ArH, NH), 6.1 (t, 1H, H-13), 5.86 (m, 2H, H-10, H-3'), 5.78 (d, 1H, H-2), 4.93 (d, 1H, H-5), 4.75 (t, 1H, H-2'), 4.39 (d, 1H, 2'-OH), 4.29 (d, 1H, H-20a), 4.15 (d, 1H, H-20b), 3.94 (br t, 1H, H-7), 2.99 (d, 1H, H-3), 2.58 (m, 1H), 2.37 (dd, 1H), 2.29 (s, 3H, OAC), 2.1 (s, 3H, OAC), 2.3-1.5 (m, 7H), 1.7 (d, 3H, Vinyl CH&sub3;), 1.6 (s, 3H, CH&sub3;), 1.4 (s, 3H, CH&sub3;), 1.2 (s, 3H, CH&sub3;). MS (FAB/K&spplus;) m/e 878 (M + K)&spplus;.

Beispiel 6

13-Acetyl-9-deoxobaccatin III 7-Thiocarbonylimidazolid (Schema I, Verbindung (8))

Eine Lösung der Verbindung die aus Beispiel 2 entsteht, 13- Acetyl-9-deoxobaccatin III, (0,78 g, 1,27 mmol), Thiocarbonyldiimidazolid (0,5 g, 2,8 mmol) und DMAP (20 mg) in Toluen (5 ml) wurde auf 100ºC erhitzt. Nach 3 Stunden war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse. Die Mischung wurde gestillt mit Puffer und Ethylacetat. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert vor der Reinigung durch Silicagelsäurechromatographie mit 97 : 3 CHCl&sub3;-MeOH, um 0,81 g (88%) der Titelverbindung zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.4 (br s, 1H, Imid), 8.1 (d, 2H, ArH), 7.67 (br s, 1H, mid), 7.62 (t, 1H, ArH), 7.5 (t, 2H, ArH), 7.1 (br s, 1H, Imid), 6.19 (t, 1H, H-13), 5.94 (dd, 1H, H-7), 5.86 (dd, 1H, H-10), 5.82 (d, 1H, H-2), 5.0 (d, 1H, H-5), 4.38 (d, 1H, H- 20a), 4.19 (d, 1H, H-20b), 3.27 (d, 1H, H-3), 2.95 (ddd, 1H, H-6a), 2.32 (s, 3H, OAC), 2.21 (s, 3H, OAC), 2.0-2.45 (m, 5H), 1.94 (s, 3H, OAC), 1.91 (d, 3H, Vinyl CH&sub3;), 1.71 (m, 1H,), 1.7 (s, 3H, CH&sub3;), 1.69 (s, 3H, CH&sub3;), 1.25 (s, 3H, CH&sub3;). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 725 (M + H)&spplus;.

Beispiel 7

13-Acetyl-7-deoxy-9-deoxobaccatin III

(Schema II, Verbindung (9))

Zu einer Lösung der Verbindung aus Beispiel 6 (0,81 g, 1,12 mmol) und AIBN (20 mg) in Toluen (20 ml) bei 100ºC unter Stickstoff gerührt, wurde tropfenweise tri-n-Butylzinnhydrid (0,33 ml, 1,23 mmol) hinzugefügt. Nach 15 Minuten war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse. Die Mischung wurde gestillt mit Puffer und Ethylacetat. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert vor der Reinigung mit Silicagelsäulenchromatographie mit 98 : 2 CHCl&sub3;-MeOH, um 0,63 g (94%) der Titelverbindung zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.1 (d, 2H, ArH), 7.6 (t, 1H, ArH), 7.49 (t, 2H, ArH), 6.15 (t, 1H, H-13), 6.05 (dd, 1H, H-10), 5.72 (d. 1H, H-2), 4.9 (d, 1H, H-5), 4.3 (d, 1H, H-20a), 4.1 (d, 1H, H-20b), 3.07 (d, 1H, H-3), 2.6 (dd, 1H, H-6a), 2.29 (s, 35-1, OAC), 2.22-1.2 (m, 11H), 2.2 (s, 3H, OAC), 2.07 (s, 3H, OAC), 1.9 (d, 3H, Vinyl.CH&sub3;), 1.7 (s, 3H, CH&sub3;), 1.46 (s, 3H, CH&sub3;), 1.22 (s, 3H, CH&sub3;). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 599 (M + H)&spplus;, 616 (M + H + NH&sub3;)&spplus;.

Beispiel 8

7-Deoxy-9-deoxobaccatin III

(Schema II, Verbindung (10))

Zu einer Lösung der Verbindung die aus Beispiel 7 entsteht (0,817 g, 1,36 mmol) in THF (140 ml) gerührt unter Stickstoff bei -78ºC, wurde Methyllithium (1,4 M in Ether, 2,44 ml, 3,4 mmol) tropfenweise hinzugefügt. Nach 2 Stunden war die Reaktion vollständig gemäß Analyse durch Dünnschichtchromatographie. Die Reaktion wurde gestillt durch den Zusatz der Mischung in pH 7 Phosphatpuffer (400 ml) und Ethylacetat und die organische Schicht wurde getrennt, getrocknet und in vakuo verdampft. Der Reststoff wurde gereinigt durch Silicagelsäulenchromatographie unter Elution mit 96 : 4 CHCl&sub3;-MeOH, um 0,21 g (27%) 7-Deoxy-9- deoxobaccatin III (10) und 0,22 g (31%) 10-Deacetyl-7-deoxy-9- deoxobaccatin III (12) zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 8.1 (d, 2H, ArH), 7.6 (t, 1H, ArH), 7.48 (t, 2H, ArH), 6.02 (dd, 1H, H-10), 5.7 (d, 1H, H-2), 4.94 (d, 1H, H- 5), 4.77 (br t, 1H, H-13), 4.3 (d, 1H, H-20a), 4.13 (d, 1H, H-20b), 3.12 (d, 1H. H-3), 2.58 (dd, 1H, H-6a), 2.27 (s, 3H, OAc), 2.35-1.5 (m, 9H), 2.08 (s 3H, OAc), 2.07 (s, 3H,Vinyl.CH&sub3;), 1.65 (s, 3H, CH&sub3;), 1.46 (s, 3H, CH&sub3;), 1.08 (s, 3H, CH&sub3;). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 557 (M + H)&spplus;, 574 (M + H + NH&sub3;)&spplus;.

Beispiel 9

7-Deoxy-9-deoxopaclitaxel

(Schema II, Verbindung (11))

Zu einer Lösung von 7-Deoxy-9-deoxobaccatin III (10) (24 mg, 0,043 mmol) in THF (/ml) bei 25ºC wurde hinzugefügt Natriumhydrid (60 Gewichtsprozent, 20 mg, 0,46 mmol), gefolgt durch (3R,4S)-N- Benzoyl-3-O-(1-ethoxyethyl)-4-phenyl-2-azetidinon (Verbindung 5), hergestellt wie beschrieben durch Georg et al., Biooraanic & Medicinal Chemistry Letters 2(4): 295 (1992) oder Ojima et al., J. Org. Chem. 56: 1681 (1991), (48 mg, 0,141 mmol). Nach 24 Stunden war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse. Die Reaktion wurde gestillt in dem sie in Puffer (200 ml) und Ethylacetat hinzugefügt wurde. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert, um einen Reststoff zu ergeben, welcher direkt kombiniert wurde mit 1% HCl in Methanol (1 ml) bei 25ºC. Nach 3 stündigem Rühren war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse und wurde gestillt mit Puffer und Ethylacetat. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert vor der Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie (0,25 mm) mit 97 : 3 CHCl&sub3;-MeOH, um 5,76 mg (16,2%) der Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.13 (d, 2H, ArH), 7.82 (d, 2H, ArH), 7.61 (t, 1H, ArH), 753-7.25 (m, 11H, ArH, NH), 6.1 (t, 1H, H- 13), 5.98 (dd, 1H, H-10), 5.83 (dd, 1H, H-3'), 5.85 (d, 1H, H-2), 4.96 (d, 1H, H-5), 4.77 (d, 1H, H-2'), 4.42 (br s, 1H, OH), 4.3 (d, 1H, H-20a), 4.15 (d, 1H, H-20b), 3.03 (d, 1H, H-3), 2.58 (dd, 1H), 2.37 (dd,1H), 2.3 (s, 3H, OAc), 2.25-1.5 (m, 7H), 2.05 (s, 3H, OAC), 1.7 (d, 3H,Vinyl-CH&sub3;), 1.67 (s, 3H, CH&sub3;), 1.48 (s, 3H, CH&sub3;), 1.19 (s, 3H, CH&sub3;). MS (FAB/K&spplus;) m/e 862 (M + K)&spplus;.

Beispiel 10

7-Deoxy-9-deoxobaccatin III 10-thiocarbonylimidazolid (Schema II, Verbindung (13))

Eine Lösung von 10-Deacetyl-7-deoxy-9-deoxobaccatin III (12), welches aus Beispiel 8 entsteht (165 mg, 0,32 mmol), Thiocarbonyldiimidazolid (114 mg, 0,64 mmol) und DMAP (16 mg) in 3 ml Toluen wurde auf 82ºC erhitzt. Nach 1 Stunde war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse. Die Mischung wurde mit Puffer und Ethylacetat gestillt. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert vor der Reinigung durch Silicagelsäulenchromatographie mit 96 : 4 CHCl&sub3;-MeOH, um 180 mg (90%) der Titelverbindung zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.25 (br s, 1H, Imid), 8.12 (d, 2H, ArH), 7.61 (t, 1H, ArH), 7.5 (t, 2H, ArH), 7.49 (br s, 1H, Imid), 7.13 (br s, 1H, Imid), 5.71 (d, 1H, H-2), 5.34 (dd, 1H, H-10), 4.97 (d, 1H, H-5), 4.8 (t, 1H, H-13), 4.32 (d, 1H, H- 20a), 4.13 (d, 1H, H-20b), 3.23 (d, 1H, H-3), 2.8 (ddd, 1H), 2.29 (s, 3H, OAc), 2.4-1.6 (m, 9H), 2.05 (s, 3H, Vinyl.CH&sub3;), 1.65 (s, 3H, CH&sub3;), 1.48 (s, 3H, CH&sub3;), 1.15 (s, 3H, CH&sub3;). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 625 (M + H)&spplus;.

Beispiel 11

10-Desacetoxy-7-deoxy-9-deoxobaccatin III (Schema II, Verbindung (14))

Zu einer Lösung der Verbindung die aus Beispiel 10 entsteht (180 mg, 0,28 mmol) und AIBN (25 mg) in Toluen (5 ml) bei 100ºC unter Stickstoff gerührt, wurde tropfenweise tri-n- Butylzinnhydrid (0,28 ml, 1 mmol) hinzugefügt. Nach 1 Stunde war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse. Die Mischung wurde gestillt mit Puffer und Ethylacetat.
Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert vor einer Reinigung durch Silicagelsäulenchromatographie mit 95 : 5 CHCl&sub3;-MeOH, um 102 mg ('71%) der Titelverbindung zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.14 (d, 2H, ArH), 7.6 (t, 1H, ArH), 7.48 (t, 2H, ArH), 5.72 (d, 1H. H-2), 4.94 (d, 1H, H-5), 4.73 (br q, 1H, H-13), 4.32 (d, 1H, H-20a), 4.16 (d, 1H, H-20b), 3.35 (d, 1H, H-3), 2.79 (dd, 1H), 2.3 (s, 3H, OAc), 2.35-1.5 (m, 9H), 1.9 (s, 3H, Vinyl.CH&sub3;), 1.5 (s, 3H, CH&sub3;), 1.41 (s, 3H, CH&sub3;), 1.1 (s, 3H, CH&sub3;). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 499 (M + H)&spplus;.

Beispiel 12

13-{(2R,3S)-N-Benzyloxycarbonyl-N,O-(1-methylethyliden)-3- phenylisoserin}-10-desacetoxy-7-deoxy-9-deoxopaclitaxel (Schema II, Verbindung (16) worin R Benzyloxycarbonyl ist)

Eine Lösung der Verbindung die aus Beispiel 11 entsteht (20 mg, 0,04 mmol), DMAP (9,8 mg, 0,08 mmol), Dicyclohexylcarbodiimid (32 mg, 0,15 mmol) und (2R,3S)-N- Benzyloxycarbonyl-N,O-(1-methylethyliden)-3-phenylisoserin, hergestellt in einer Art und Weise analog zu dem Verfahren von Commercon, A., Bezard, D., Bernard, EL, Bourzat, J. D. Tetrahedron Lett., 33: 5185 (1992) [hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen] für (2R, 3S)-N-Boc-N,O-(1-Methylethyliden)-3- phenylisoserin, (48 mg, 0,13 mmol) in Toluen (2 ml) wurde für 3 Stunden auf 80ºC unter Stickstoff erhitzt. Die Mischung wurde gestillt mit Puffer und CHCl&sub3;. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert vor Reinigung in Silicagelsäulenchromatographie mit 60 : 40 Hexan-EtOAc, um 10 mg (30%) der Titelverbindung zu ergeben. ¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.07 (d, 2H, ArH), 7.6 (t, 1H, ArH), 7.46 (t, 2H, ArH), 7.4-7.1 (m, 10H, ArH), 6.8 (br s, 1H, H-3'), 6.17 (t, 1H, H-13), 5.87 (dd, 1H), 5.7 (d, 1H, H-2), 5.24 (br d, 1H, H-3'), 5.1-4.8 (br s, 2H, ArCH&sub2;), 4.91 (d, 1H, H-5), 4.88 4.55 (d, 1H, H-2'), 4.25 (d, 1H, H- 20a), 4.08 (d, 1H, H-20b), 3.21 (d, 1H, H-3), 2.82 (m, 1H), 2.25-1.4 (m, 7H), 1.77 (s, 6H), 1.55 (s, 6H), 1.39 (s, 3H), 1.23 (s, 3H). MS (DCI/NH&sub3;) m/e 836 (M + H)&spplus;, 853 (M + NH&sub4;)&spplus;.

Beispiel 13

10-Desacetoxy-7-deoxy-9-deoxopaclitaxel

(Schema II, Verbindung (15))

Eine Suspension der Verbindung die aus Beispiel 12 entsteht (5 mg, 0,006 mmol) und 10% Pd/C (10 mg) in 30% MeOH/Wasser wurde einer Ballonhydrogenolyse 1,5 Stunden lang unterworfen. Die Reaktionsmischung wurde gefiltert und Benzoesäureanhydrid (6 mg, 0,026 mmol) wurde hinzugefügt. Nach 3 stündigem Rühren war die Reaktion vollständig gemäß dünnschichtchromatographischer Analyse und wurde gestillt mit Puffer und CHCl&sub3;. Der organische Extrakt wurde gewaschen, getrocknet und in vakuo konzentriert vor einer Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie (0,25 mm) mit 95 : 5 CHCl&sub3;-MeOH, um 1,6 mg (35%) der Titelverbindung zu ergeben.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz) δ 8.1 (d, 2H, ArH), 7.85 (d, 2H, ArH), 7.6 (t, 1H, ArH), 7.55-7.25 (m, 11H, ArH, NH), 6.05 (1, 1H, H-13), 5.87 (dd, 1H, H-3), 5.76 (d, 1H, H-2), 4.98 (d, 1H, H-5), 4.88 (br s, 1H, H-2'-OH), 4.74 (d, 1H, H-2), 4.3 (d, 1H, H-20a), 4.17 (d, 1H, H-20b), 3.14 (d, 1H, H-3), 2.68 (m, 1H), 2.4-1.5 (m, 9H), 2.29 (s, 3H, OAc), 1.5 (s, 3H, Vinyl.CH&sub3;), 1.43 (s, 3H, CH&sub3;), 1.4 (s, 3H, CH&sub3;), 1.13 (s, 3H, CH&sub3;).

Beispiel 14

Assay hinsichtlich der In Vitro Tumorzell-Cytotoxizität

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden getestet hinsichtlich ihrer in vitro cytotoxischen Aktivität gegen die Tumorlinien A549 (menschlicher Brustkrebs) und P-388 (Leukemie bei der Maus). Die 1050 wurden gemessen in einem kolorimetrischen Assay für cytotoxische Aktivität gegen kultivierte Zellen gemäß dem unten beschriebenen Protokoll:
Ein dreitägiger Mikrotiterassay wurde verwendet, um die Wachstumshemmung von gezüchteten Zellen zu messen, welche einer Spannbreite von Medikamentenkonzentrationen ausgesetzt waren. Die metabolische Aktivität wurde gemessen durch die Fähigkeit der Zellen den Tetrazoliumfarbstoff, MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) zu einem meßbaren gefärbten Endprodukt, welcher bei 570 nm im sichtbaren Spektrum absorbiert, zu reduzieren. Die überlebenden Zellen reduzieren den MTT-Farbstoff.
Die Testverbindungen wurden aufgelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO) und wurden zunächst verdünnt mit Earle's Mineralsalzlösung, gefolgt von dem Kulturmedium die höchste Konzentration der zu testenden Untersuchung zu verdoppeln. Aus dieser konzentrierten Stocklösung wurden zweifache serielle Verdünnungen hergestellt in 96-Kammern Mikrotitertabletts, wobei jede Kammer das doppelte der gewünschten Konzentration der Verbindung enthielt. Ihre Konzentration wurde in dreifacher Ausführung getestet und verglichen mit dreifachen medikamentenfreien Kontrollen.
Die Zellen wurden in dem gleichen Medium gezüchtet, welches verwendet wurde zum Verdünnen der Verbindungen und dann geerntet unter Verwendung von Trypsinierung. Dies umfaßt das Entfernen des Mediums durch Aspiration; das zweifache Spülen der Einzelzellschicht mit Earle's Mineralsalzlösung; den Zusatz von Trypsin (0,05%)/EDTA (0,53 mM; für jede 25 cm², ca. 0,2 ml), das Kippen, um die Einzelschicht zu überdecken, und dann das Entziehen des Trypsins was nur einen dünnen Film der Lösung zurückließ; das Inkubieren bei Raumtemperatur das die Einzelzellschicht sich abhebt, wie nachgewiesen durch visuelle und/oder mikroskopische Beobachtung); den Zusatz von Medium welches fetales Kalbsserum enthält, um die Wirkung des Trypsins zu beenden und das resuspendieren der Zellen; das Zerstoßen, um eine Dissoziation der Zeliklumpen zu unterstützen; und das Bestimmen der Anzahl der Zellen pro Milliliter durch einen elektronischen Zellzähler (z. B. Coulter Counter) oder durch das Mischen eines Aliquots von Zellsuspension mit Trypan Blau (0,4% in normaler Kochsalzlösung) und das Zählen der lebendigen Zellen mittels eines Hemäcytometers.
Nach dem Ernten und der Bestimmung der Anzahl lebendiger Zellen wurde die Zelldichte eingestellt auf 25,000 Zellen/ml. Ein Inoculum (0,1 ml) welche die Zellen enthielt, wurde dann zu jeder Kammer hinzugefügt für eine endgültige Konzentration von 2,500 Zellen pro Kammer. Der Zusatz des Inoculums verdünnte die Testverbindungen auf die gewünschte endgültige Konzentration.
Die Mikrotitertabletts wurden dann drei Tage lang bei 36ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre inkubiert, welche 5% Kohlenstoffdioxid enthielt. Nach drei Tagen wurde 20 Mikrotiter von 5 mg/ml MTT in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zu jeder Kammer hinzugefügt. Die Tabletts wurden erneut in den Inkubator gestellt für zwei bis vier Stunden, um den überlebenden Zellen zu gestatten den Farbstoff zu reduzieren. Medium und unreduzierter Farbstoff wurden durch Aspiration entfernt. DMSO wurde jeder Kammer hinzugefügt, um das wasserunlösliche gefärbte Endprodukt der Farbreduktion aufzulösen, so daß es spektrophotometrisch bei 570 nm gemessen werden konnte. Die ICSo wurde festgestellt als jene Konzentration von getesteter Verbindung, die benötigt wird, um die Absorption bei 570 nm auf 50% der nicht medikamentengetesteten Kontrollwerte zu reduzieren.
Die Ergebnisse der Testung, in Tabelle 3 unterhalb dargestellt, beweisen die cytotoxische Aktivität der Verbindung der vorliegenden Erfindung. Tabelle 3 In vitro Tumorzellcytotoxizität (IC&sub5;&sub0; ug/ml)

Claims

1. Eine Verbindung mit der Formel

oder ein Prodrug davon, worin

R¹ gleich Alkanoyl oder ein Radikal mit der Formel ist

worin R&sup7; gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Phenyl, substituiertem Phenyl, Alkoxy, substituiertem Alkoxy, Amino, substituiertem Amino, Phenoxy und substituiertem Phenoxy; R&sup8; ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, ' Hydroxyalkyl, Alkoxyalkyl, Aminoalkyl, Phenyl, substituiertem Phenyl, α-Naphthyl, β-Naphthyl oder Heteroaryl; und R&sup9; ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkanoyl, substituiertem Alkanoyl und Aminoalkanoyl;

R², R³ und R&sup6; sind unabhängig gewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Alkoxy, Aminoalkanoyloxy und Alkanoyloxy;

R&sup4; ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkanoyl, Aminoalkanoyl und Aroyl;

R&sup5; ist gewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkanoyl, Aminoalkanoyl und Aroyl; und

worin sich Alkyl allein oder als Teil einer anderen Gruppe auf ein Alkyl mit von eins bis sechs Kohlenstoffatomen bezieht.

2. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R¹ ein Radikal ist mit der Formel

3. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R² Wasserstoff ist.

4. Eine Verbindung gemäß Anspruch 2, worin R² Wasserstoff ist.

5. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R³ Wasserstoff ist.

6. Eine Verbindung gemäß Anspruch 2, worin R³ Wasserstoff ist.

7. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R² und R³ beide Wasserstoff sind.

8. Eine Verbindung gemäß Anspruch 2, worin R² und R³ beide Wasserstoff sind.

9. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R¹ und R&sup4; Acetyl sind, R² Acetoxy und R&sup5; Hydroxy ist.

10. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, gewählt aus der Gruppe bestehend aus:

13-Acetyl-9-deoxobaccatin III;

9-Deoxopaclitaxel;

13-Acetyl-7-deoxy-9-deoxobaccatin III;

7-Deoxy-9-deoxopaclitaxel;

13-Acetyl-10-desacetoxy-7-deoxy-9-deoxobaccatin III; und

10-Desacetoxy-7-deoxy-9-deoxopaclitaxel.

11. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Verwendung als ein therapeutischer Wirkstoff.

12. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Karzinomen und Leukämien.

13. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß Anspruch 1 in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.