DE69434974T2 - alpha-2,8 SIALYLTRANSFERASE - Google Patents

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Katsutoshi Machida-shi SASAKI
Kazumi Fujisawa-shi KURATA
Nobuo Sagamihara-shi Hanai
Tatsunari Nishi
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft α-2,8-Sialyltransferase, eine die α-2,8-Sialyltransferase codierende cDNA, einen die cDNA als Insert enthaltenden rekombinanten Vektor und eine den rekombinanten Vektor beherrbergende Zelle sowie auch Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydratketten unter Verwendung der α-2,8-Sialyltransferase und ein Verfahren zur Herstellung von Kohlenhydratketten über Herstellung der α-2,8-Sialyltransferase in transformierten Zellen. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis der α-2,8-Sialyltransferase und ein Verfahren zur Inhibierung der Herstellung der α-2,8-Sialyltransferase, die beide die erfindungsgemäße a-2,8-Sialyltransferase codierende DNA verwenden. Die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase ist insbesondere brauchbar bei der Herstellung von Kohlenhydratketten mit nützlicher physiologischer Aktivität, beispielsweise des Gangliosids GD3, und Modifikationen davon.
  • STAND DER TECHNIK
  • Während in Prokaryoten wie beispielsweise Escherichia coli hergestellte Proteine keine Kohlenhydratketten aufweisen, weisen in Eukaryoten wie beispielweise Hefe, Pilzen, Pflanzenzellen und Tierzellen hergestellte Proteine und Lipide in vielen Fällen eine daran gebundene Kohlenhydratkette auf.
  • Kohlenhydratketten, die in Tierzellen an Proteine gebunden sind, umfassen Kohlenhydratketten vom Typ der N-glykosidischen Bindung (auch N-Glykane genannt), die an einen Asparaginrest (Asn-Rest) im Protein gebunden sind, und Kohlenhydratketten vom Typ der O-glykosidischen Bindung (auch O-Glykane genannt), die an einen Serinrest (Ser-Rest) oder Threoninrest (Thr-Rest) gebunden sind.
  • Kürzlich wurde gezeigt, dass eine bestimmte Art von Lipid, die eine Kohlehydratkette enthält, kovalent an eine Reihe von Proteinen gebunden ist, und dass diese Proteine über das Lipid an die Zellmembran gebunden sind. Dieses Kohlenhydratkette enthaltende Lipid wird Glycosylphosphatidylinositol-Anker genannt.
  • Weitere Kohlenhydratketten, einschließlich Glycosaminoglycane, liegen ebenfalls in Tierzellen vor. Verbindungen, die ein kovalent an ein Glycosaminoglycan gebundenes Protein umfassen, werden Proteoglycane genannt. Die Glycosaminoglycane der Kohlenhydratketten von Proteoglycanen ähneln in ihrer Struktur O-Glycanen, die Kohlenhydratketten von Glycoproteinen sind, aber unterscheiden sich chemisch von diesen.
  • Glycosaminoglycane umfassen sich wiederholende Disaccharideinheiten, die aus Glucosamin oder Galactosamin und einer Uronsäure (mit Ausnahme von Keratansulfat, das keinen Uronsäurerest aufweist) aufgebaut sind und weisen einen kovalent gebundenen Sulfatrest auf (mit Ausnahme von Hyaluronsäure, bei der kein Sulfatrest vorliegt).
  • Weiterhin liegen Kohlenhydratketten in Tierzellen in Substanzen vor, die Glycolipide genannt werden. Sphingoglycolipide sind eine Art von in Tierzellen vorkommendem Glycolipid. Sphingoglycolipide bestehen aus einem Kohlenhydrat, einer langkettigen Fettsäure und Sphingosin, einer langkettigen Base, die kovalent miteinander verbunden sind. Glycerolipide bestehen aus einer Kohlehydratkette und Glycerin, die kovalent miteinander verbunden sind.
  • Fortschritte, die in neuerer Zeit in der Molekularbiologie und Zellbiologie gemacht wurden, haben es ermöglicht, die Funktionen von Kohlenhydratketten aufzuklären. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt wurde eine Vielzahl von Funktionen of Kohlenhydratketten aufgeklärt. Kohlehydratketten spielen erstens eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von Glycoproteinen im Blut. Es ist bekannt, dass durch Einführung des betreffenden Gens in Escherichia coli hergestelltes Erythropoietin seine Aktivität in vitro beibehält, in vivo aber schnell beseitigt wird [(Dordal et al.: Endocrinology, 116, 2293 (1985) und Browne et al.: Cold Spring Harbor Symposia an Quantitative Biology, 51, 693 (1986)]. Es ist bekannt, dass menschlicher Granulocyten-Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (hGM-CSF) zwei Kohlenhydratketten vom N-glycosidischen Bindungstyp aufweist, wohingegen eine Verringerung der Zahl der Kohlehydratketten zu einem proportionalen Anstieg der Geschwindigkeit der Clearance aus Rattenplasma führt [(Donahue et al.: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 51, 685 (1986)]. In Abhängigkeit von der Struktur der betreffenden Kohlehydratkette können die Geschwindigkeit und der Ort der Clearance variieren oder sich unterscheiden. Es ist beispielsweise bekannt, dass hGM-CSF mit einem Sialylsäurerest der Clearance in der Niere unterliegt, während hGM-CSF ohne Sialylsäure eine erhöhte Clearance-Geschwindigkeit aufweist und die Clearance in der Leber erfolgt. Alphai-säureglycoproteine, die sich in der Kohlenhydratstruktur unterscheiden und in Gegenwart verschiedener Inhibitoren der Biosynthese von Kohlehydratketten des N-glycosidischen Typs unter Verwendung eines Rattenleber-Primärkultursystems biosynthetisiert wurden, wurden hinsichtlich ihrer Clearance-Geschwindigkeit aus Rattenplasma und ihrer Clearance-Geschwindigkeit aus Rattenperfusat untersucht. In beiden Fällen war die Clearance-Geschwindigkeit in dieser Reihenfolge verringert: Hoch-Mannose-Typ, Typ mit fehlender Kohlehydratkette, Hybrid-Typ und zusammengesetzter Typ (natürlicher Typ). Es ist bekannt, dass die Clearance von Gewebe-Typ Plasminogenaktivator (t-PA), der medizinisch als thrombolytisches Agens verwendet wird, in hohem Maße von der Struktur seiner Kohlehydratkette beeinflusst wird.
  • Es ist bekannt, dass Kohlenhydratketten Proteinen Resistenz gegenüber Proteasen verleihen. Wenn beispielsweise die Kohlenhydrat-Bildung auf Fibronectin durch Tunicamycin inhibiert wird, erhöht sich die Abbaugeschwindigkeit des intrazellulären Kohlenhydratkettendefizienten Fibronectins. Weiterhin ist bekannt, dass das Hinzufügen einer Kohlenhydratkette zu erhöhter Hitzestabilität oder Widerstandsfähigkeit beim Einfrieren führen kann. Es ist bekannt, dass unter anderem die Kohlehydratkette von Erythropoietin und β-Interferon zu erhöhter Löslichkeit des Proteins beiträgt.
  • Kohlenhydratketten dienen auch der Aufrechterhaltung der Tertiärstruktur des Proteins. Wenn dem Membranbindungsprotein des veskulären Stomatitis-Virus die zwei natürlicherweise vorkommenden Kohlenhydratketten vom Typ der N-glycosidischen Bindung fehlen, so ist bekannt, dass der Transport des Proteins zur Zelloberfläche inhibiert ist, und dass das Protein transportiert wird, wenn neue Kohlenhydratketten dem Protein hinzugefügt werden. Es wurde gezeigt, dass in diesem Fall nachfolgend auf die Eliminierung von Kohlenhydratketten eine intermolekulare Assoziierung des Proteins über Disulfidbrücken induziert wird und als Ergebnis der Proteintransport inhibiert wird. Wenn Kohlenhydratketten hinzugefügt werden, ist die Assoziierung inhibiert, die korrekte Tertiärstruktur des Proteins wird aufrechterhalten und ein Proteintransport wird möglich. Es wurde gezeigt, dass es einen großen Spielraum hinsichtlich der Stelle gibt, an der das neue Kohlenhydrat hinzugefügt wird. Im Gegensatz dazu wurde in bestimmten Fällen auch gezeigt, dass in Abhängigkeit von der Stelle der Einführung der Kohlenhydratkette der Transport eines Proteins mit einer natürlichen Kohlenhydratkette oder natürlichen Kohlenhydratketten vollständig inhibiert sein kann.
  • Es sind auch Beispiele bekannt, bei denen eine Kohlenhydratkette dazu dient, die antigene Stelle eines Polypeptids zu maskieren. Im Falle von hGM-CSF, Prolactin, lnterferon-γ, Rauscher Leukämievirus gp70 und Influenza Hämagglutinin legen Experimente unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers oder eines monoklonalen Antikörpers gegen eine bestimmte Stelle auf dem Peptid nahe, dass Kohlenhydratketten dieser Proteine die Antikörperbindung inhibieren. Es sind auch Fälle bekannt, in denen Kohlenhydratketten selbst direkt an der Expression einer Aktivität eines Glycoproteins beteiligt sind. Beispielsweise nimmt man an, dass Kohlenhydrate mit der Expression von Aktivität von Glycoproteinhormonen wie beispielsweise dem luteinisierenden Hormon, dem Follikel stimulierenden Hormon und Chorion-Gonadotropin in Zusammenhang stehen.
  • Kohlenhydratketten dienen einer wichtigen Funktion beim Phänomen der Erkennung zwischen Zellen, zwischen Proteinen oder zwischen einer Zelle und einem Protein. Es ist beispielsweise bekannt, dass die Clearance strukturell unterschiedlicher Kohlenhydratketten in vivo an unterschiedlichen Stellen erfolgt. Kürzlich wurde gezeigt, dass der Ligand des Proteins ELAM-1, der während einer inflammatorischen Antwort spefizisch auf Gefäßendothelzellen exprimiert wird und die Adhäsion an Neutrophile fördert, eine Kohlenhydratkette ist, die bezeichnet wird als Sialyl Lewis × [NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc; worin NeuAc: Sialylsäure; Gal: Galactose; Fuc: Fucose; GlcNAc: N-Acetylglucosamin sind]. Die mögliche Verwendung von Kohlenhydratketten selbst oder deren Modifikationen als Arzneimittel wird dementsprechend vorgeschlagen [Phillips et al.: Science 250, 1130 (1990); Goelz et al.: Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 4, 14–24 (1992)]. Wie ELAM-1 stehen L-Selectin, das in einigen T-Lymphozyten oder Neutrophilen exprimiert wird, und GMP-140 (auch P-Selectin genannt), das in Plättchen oder auf der Membranoberfläche von Gefäßendothelzellen nach inflammatorischer Stimulierung exprimiert wird, im Zusammenhang mit inflammatorischen Antworten. Es wird vorgeschlagen, dass deren Ligand analog zu Sialyl Lewis x eine Kohlehydratkette sein könnte, der ELAM-1 Ligand [Rosen et al.: Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 4, 1 (1992); Larsen et al.: Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 4, 25 (1992); Aruffo et al.: Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 4, 146 (1992)].
  • Es wurde vorgeschlagen, dass bei der Metastase von Krebs, wie bei inflammatorischen Antworten, ELAM-1 und GMP-140 eine Adhäsion von Krebszellen an das Gefäßendothel oder eine Aggregation von Krebszellen mit Plättchen verursachen und dadurch die Metastase von Krebs fördern [Goelz et al.: Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 4, 14 (1992), Larsen et al.: Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 4, 25 (1992)]. Dies stimmt überein mit dem Befund, dass der Expressionsgrad der Sialyl Lewis × Kohlenhydratkette hoch ist in Krebszellen, die in hohem Maße metastatisch sind [Irimura et al.: Jikken Igaku (Experimental Medicine), 6, 33 (1988)].
  • Ganglioside stellen eine Gruppe von Glycolipid-Zellmembranbestandteilen dar. Sie sind Mokeküle, die aus einer Sialylsäurerest-enthaltenden Kohlenhydratkette, die eine hydrophile Seitenkette darstellt, aus Sphingosin, das eine hydrophobe Seitenkette darstellt, und aus einer Fettsäure bestehen. Es ist bekannt, dass nicht nur die Expression von Gangliosiden in Abhängigkeit von der Zelle, dem Organ und der Tierart variiert, sondern auch, dass bei Gangliosiden quantitative und qualitative Veränderungen während des Prozesses der Zelldifferenzierung oder der Onkogenese vorkommen [Hakomori: Cancer Research, 45, 2405 (1985)]. Bisher wurde eine große Anzahl von Gangliosiden entdeckt, einschließlich GM3, das in einer Vielzahl von normalen Zellen exprimiert wird, und Gangliosiden, die in extrem geringen Mengen vorkommen [Wiegand: Gangliosides and Cancer, Verlagsgesellschaft, 1989, Seiten 5–15]. Beispielsweise kommt GD3 in normalen Geweben in geringen Mengen vor, wird jedoch in neuroectodermalen Tumoren, beispielsweise in malignem Melanom, in hohen Mengen exprimiert. Man nimmt daher an, dass es eine Art von Krebsantigen ist [Tsuchida et al.: Journal of the National Cancer Institute, 78, 45–54 (1987)]. Eine vor kurzem erschienene Veröffentlichung zeigt, dass die Anteile von GD3 und GM3 in Abhängigkeit vom Grad der Malignität von malignem Melanom variieren [Ravindranath et al: Cancer, 67, 3029 (1991)], und es ist allgemein bekannt, dass GD3 ein wichtiges Krebsantigen ist. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Expression von GD3 in Zellen induziert ist, in die ein Onkogen eingeführt wurde, was die enge Beziehung zwischen Zelltransformation und der Expression von GD3 unterstützt [Sanai et al.: Journal of Biochemistry, 107, 740–742 (1990)]. Hinsichtlich der Funktionen von GD3 wurde vorgeschlagen, dass es eine wichtige Rolle bei der Adhäsion von Krebszellen an extrazelluläre Substrate spielt [Burns et al.: Journal of Cell Biology, 107, 1225–1230 (1988)].
  • Es wurde vorgeschlagen, dass die abnormale Expression von GD3 auf eine α-2,8-Sialyltransferase zurückzuführen ist, die eine GD3-Synthetase ist [Yusuf et al., Biological Chemistry Hoppe-Segler, 368, 455–462 (1987)]. Bisher wurde nur die partielle Aufreinigung von GD3-Synthetase veröffentlicht [Gu et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 166, 387–393 (1990)]. Bislang wurde keine GD3-Synthetase isoliert.
  • Es wurden Versuche unternommen, durch Verabreichung eines monoklonalen Antikörpers gegen GD3 eine passive Immunisierung von Krebspatienten [Houghton et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 82, 1242 (1985)] und durch Verabreichung von GD3 per se als Vakzin eine aktive Immunisierung von Krebspatienten [Portoukalian et al. International Journal of Cancer, 49, 893–899 (1991); Ritter et al., International Journal of Cancer, 48, 379–385 (1991)] herbeizuführen. GD3 stellt somit ein wertvolles Krebsantigen dar. Die Menge an GD3, die durch Aufreinigung aus Geweben gewonnen werden kann, ist jedoch begrenzt [Takamizawa et al.: Journal of Biological Chemistry, 261, 5625–5630 (1986)]. Eine chemische Synthese von GD3 erfordert ausgefeilte Techniken, und die Ausbeuten sind sehr gering [Ito et al.: Journal of the American Chemical Society, 111, 8508–8510 (1989)].
  • Angesichts des oben beschriebenen Zusammenhangs von GD3 mit der Onkogenese oder der Metastase von Krebs vermutet man, dass Krebs durch Inhibierung der enzymatischen Aktivität der GD3-Synthetase α-2,8-Sialyltransferase oder durch Unterdrückung der Expression des entsprechenden Gens behandelt werden könnte. Antisense RNA/antisense DNA-Techniken [Tokuhisa: Bioscience and Industry, 50, 322 (1992); Murakami, Kagaku (Chemistry), 46, 681 (1991)] und Tripelhelix-Techniken [Chubb und Hogan: Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)] können zur spezifischen Unterdrückung der Genexpression eingesetzt werden. Zur Unterdrückung der Expression einer spezifischen Glycosyltransferase unter Verwendung der antisense RNA/DNA-Technik werden das fragliche Gen oder Informationen über die Basensequenz des Gens benötigt. Somit ist es wichtig, das gewünschte Glycosyltransferase-Gen zu klonieren und dessen Basensequenz zu bestimmen.
  • Wie oben erwähnt steht die GD3-Synthetase α-2,8-Sialyltransferase im Zusammenhang mit der Onkogenese, und man nimmt somit an, dass sie bei der Diagnose von Krebs verwendet werden könnte, das heisst, dass der Grad der Expression der Snythase zum Nachweis des Vorliegens eines Tumors verwendet werden könnte. Die nachfolgenden Techniken können verwendet werden, um die Expression des α-2,8-Sialyltransferase-Gens (GD3-Synthetase-Gens) zu bestimmen: Northern-Hybridisierung unter Verwendung des Gens in einer markierten Form, beispielsweise in einer radiomarkierten Form, als Sonde [Sambrook, Fritsch und Maniatis: Molecular Cloning – A laboratory manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbour Press, 1989] und die Polymerase-Kettenreaktion (nachfolgend hier als „PCR" bezeichnet) [Innis et al.: PCR Protocols, Academic Press, 1990]. Bei der Anwendung dieser Techniken ist das Gen für die GD3-Synthetase α-2,8-Sialyltransferase oder die Kenntnis von dessen Basensequenz erforderlich. Auch unter diesem Gesichtspunkt ist es wichtig, das Gen für die GD3-Synthetase α-2,8-Sialyltransferase zu klonieren und dessen Basensequenz zu bestimmen.
  • Die JP-A-2-227075 offenbart die Möglichkeit der Verbesserung der Eigenschaften physiologisch aktiver, nützlicher Proteine, beispielsweise Granulocyten-Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF) und Prourokinase (pro-UK) durch künstliche Einführung einer Kohlenhydratkette in die Proteine unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie.
  • Vom industriellen Standpunkt gesehen stellt es ein wichtiges Problem dar, die Struktur der Kohlenhydratkette eines Glycoproteins oder eines Glycolipids zu modifizieren oder eine spezifische Kohlenhydratkette oder eine Modifizierung davon in großen Mengen herzustellen, wobei die α-2,8-Sialyltransferase-Aktivität der GD3-Synthetase verwendet wird.
  • In den vergangenen Jahren wurden deutliche Fortschritte hinsichtlich der Mittel zur Modifizierung von Kohlenhydratstrukturen erzielt. Insbesondere ist es nun möglich, Kohlehydratketten strukturell zu modifizieren unter Verwendung hochspezifischer Enzyme (Exoglucosidasen), die eine Kohlenhydrateinheit nach der anderen vom Ende der Kohlenhydratkette freizusetzen vermögen, oder unter Verwendung von Glycopeptidasen oder Endoglycosidasen, welche die Stelle der Bindung an die Peptidkette zu spalten vermögen, ohne eine Veränderung entweder des Peptids oder den Kohlenhydratketten zu verursachen, und dementsprechend die biologischen Rollen von Kohlenhydratketten im Detail zu untersuchen. Die vor kurzem gemachte Entdeckung von Endoglycoceramidasen, welche die Glycolipide an der Stelle zwischen der Kohlenhydratkette und dem Ceramid zu spalten vermögen [Ito und Yamagata: Journal of Biological Chemistry, 261, 14278 (1986)], erleichterte nicht nur die Herstellung von Kohlenhydratketten von Glycolipiden, sondern förderte auch Untersuchungen hinsichtlich der Funktionen von Glycolipiden, insbesondere von Glycolipiden, die auf Zelloberflächen vorkommen. Weiterhin wurde es möglich, unter Verwendung von Glycosyltransferasen neue Kohlenhydratketten hinzuzufügen. Somit kann beispielsweise unter Verwendung von Sialyltransferase Sialylsäure zum Ende einer Kohlenhydratkette hinzugefügt werden [Sabesan und Paulson: Journal of the American Chemical Society, 108, 2068 (1986)]. Unter Verwendung verschiedener Glycosyltransferasen- oder Glycosidase-Inhibitoren ist es auch möglich, Kohlenhydratketten zu modifizieren, die hinzugefügt werden sollen [Allan et al.: Annual Review of Biochemistry, 56 497 (1987)]. Jedoch ist kein Mittel zur Herstellung von Glycosyltransferasen zur Verwendung bei der Synthese von Kohlenhydratketten verfügbar. Es ist wünschenswert, Glycosyltransferasen in großen Mengen herzustellen, indem man Glyosyltransferase-Gene kloniert und unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie eine effiziente Expression of Glycosyltransferasen in Wirtszellen herbeiführt.
  • Was die Sialyltransferase betrifft, so wurde ein Gen für ein Enzym mit einer β-Galactosid-α-2,6-Sialyltransferase-Aktivität isoliert und dessen Basensequenz veröffentlicht. [Weinstein et al: Journal of Biological Chemistry, 262, 17735 (1987)]. Hinsichtlich eines Enzyms mit β-Galactosid-α-2,3-Sialyltransferase-Aktivität wurde von Gillespie et al. über die Klonierung eines Gens berichtet, das ein Enzym codiert, welches die Addition von Sialylsäure an Galactose in einer Kohlenhydratkette von Glycoproteinen vom Typ der O-glycosidischen Bindung (an einen Serin- oder Threonin-Rest angehängte Kohlenhydrat-Kette), jedoch wurde die Basensequenz dieses Gens nicht veröffentlicht [Gillespie et al.: Glycoconjugate Journal, 7, 469 (1990)]. Weinstein et al. veröffentlichten ein Verfahren zur Aufreinigung eines Enzyms mit β-Galactosid-α-2,3-Sialyltransferase-Aktivität aus Rattenleber [Weinstein et al.: Journal of Biological Chemistry, 257, 13835 (1982)]. Durch dieses Verfahren wird das Enzym jedoch nur in sehr geringen Mengen bereitgestellt. Das Gen dieser β-Galactosid-α-2,3-Sialyltransferase wurde von Wen et al. [Wen et al.: Journal of Biological Chemistry, 267, 21011 (1992)] kloniert. Jedoch gibt es keine Berichte über die Klonierung eines Gens für menschliche Galactosid-α-2,8-Sialyltransferase. Über die Aufreinigung in großem Maßstab einer Sialyltransferase-Species mit α-2,8-Sialyltransferase-Aktivität oder die Klonierung eines Gens, das ein Produkt mit Sialyltransferase-Aktivität codiert, wurde bisher nicht berichtet. Daher sind gegenwärtig keine Mittel für die Bereitstellung von Sialyltransferase mit α-2,8-Sialyltransferase-Aktivität, insbesondere menschlicher Galactosid-α-2,8-Sialyltransferase, in großem Maßstab verfügbar. Verfahren zum Nachweis oder zur Unterdrückung der Expression der Enzyme wurden bisher auch noch nicht bereitgestellt.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer neuen Art von α-2,8-Sialyltransferase, welche die effiziente Herstellung des Gangliosids GD3 ermöglichen würde, einer α-2,8-Sialyltransferase codierenden cDNA, und eines diese cDNA enthaltenden Vektors. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis von α-2,8-Sialyltransferase-Aktivität, wobei das Verfahren brauchbar wäre für die Diagnose oder die Behandlung von Krankheiten wie beispielsweise Krebs, und eines Verfahrens zur Unterdrückung der Expression von α-2,8-Sialyltransferase.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung extrahierten mRNA aus der menschlichen Melanom-Zelllinie WM266-4, synthetisierten unter Verwendung der mRNA als Template cDNA, insertierten die cDNA in einen Expressionsklonierungsvektor, führten die auf diese Weise konstruierte cDNA-Bibliothek in Zellen ein, selektierten unter den erhaltenen Zellen solche Zellen, die stark reagierten mit einem für das Gangliosid GD3 spezifischen Antikörper, wobei ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (nachfolgend hier als „FACS" bezeichnet) verwendet wurde, und klonierten auf diese Weise erfolgreich ein Gen, das eine neue Art von α-2,8-Sialyltransferase codiert. Weiterhin führten sie das α-2,8-Sialyltransferase codierende Gen in Namalwa-Zellen ein, um die Expression des Gens herbeizuführen, und stellten fest, dass die neue α-2,8-Sialyltransferase in den Zellen exprimiert wurde, und stellten weiterhin fest, dass die auf der Zelloberfläche vorliegende Menge des Gangliosids GD3 zunahm. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse wurde die vorliegende Erfindung nun abgeschlossen.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend im Detail beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft, in einer Ausführungsform, eine neue Art von α-2,8-Sialyltransferase, welche die in SEQ ID NO:2 definierte Aminosäuresequenz umfasst. Die Erfindung betrifft weiterhin eine α-2,8-Sialyltransferase codierende cDNA und einen die cDNA tragenden Vektor. Die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase katalysiert die Addition eines Sialylsäure-Rests, in α2 → 8-Verküpfung, an einen Sialylsäure-Rest, der in dem Gangliosid GD3 enthalten ist, das einen Akzeptor darstellt.
  • Die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase codierende DNA-Sequenzen umfassen, (a) DNA, welche die in SEQ ID NO:1 definierte Basensequenz umfasst; (b) DNA, die eine Basensequenz umfasst, welche sich von der in SEQ ID NO:1 definierten Basensequenz unterscheidet, wobei der Unterschied auf der Verfügbarkeit einer Vielzahl von Codons für eine Aminosäure oder auf spontanen, in einzelnen Tieren einschließlich des Menschen auftretenden Mutationen beruht; und (c) DNA, die von der in (a) oder (b) definierten DNA abgeleitet ist durch Mutation, wie beispielsweise Substitutions-, Deletions- oder Insertionsmutation, die keinen Verlust an α-2,8-Sialyltransferase-Aktivität bewirkt, beispielsweise zur in (a) oder (b) definierten DNA homologe DNA, die über Hybridisierung isoliert werden kann. Homologe DNA bedeutet DNA, die durch die Koloniehybridisierungs- oder Plaquehybridisierungstechnik erhältlich ist, wobei eine DNA, welche die in SEQ ID NO:1 definierte Basensequenz enthält, als Probe verwendet wird. Homologe DNA bedeutet insbesondere eine DNA, die identifizierbar ist durch Durchführung einer Hybridisierung bei 65°C in Gegenwart von 0,7–1,0 M NaCl unter Verwendung eines Filters mit darauf fixierter DNA, die von einer Kolonie oder einem Plaque stammt, und anschließendes Waschen des Filters bei 65°C in einer 0,1fach bis 2fach konzentrierten SSC-Lösung (wobei eine 1fach konzentrierte SSC-Lösung 150 mM NaCl und 15 mM Natriumcitrat umfasst). Das Hybridisierungsverfahren ist beschrieben in Molecular Cloning – A Laboratory Manual., 2. Aufl., herausgegeben von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Die vorliegende Erfindung umfasst jede Art von α-2,8-Sialyltransferase, die durch die oben unter (a), (b) oder (c) definierten DNAs codiert wird.
  • Nachfolgend wird ein Verfahren zur Herstellung von DNA beschrieben, die eine erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase codiert, wobei die oben unter (a) beschriebene DNA als Beispiel dient.
  • Eine cDNA-Bibliothek wird konstruiert, indem cDNA in einen Expressionsklonierungsvektor insertiert wird, die unter Verwendung von aus der Tierzellen extrahierter mRNA als Template synthetisiert wurde. Diese cDNA-Bibliothek wird in Tierzellen oder Insektenzellen eingeführt, anschließend werden Zellen, die stark mit einem für das Gangliosid GD3 spezifischen Antikörper reagieren, angereichert und isoliert, wobei ein FACS verwendet wird. Die gewünschte α-2,8-Sialyltransferase codierende cDNA wird aus den Zellen isoliert.
  • Für die Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren geeignete Tierzellen können beliebige Zellen sein, sofern sie Tierzellen sind, in denen die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase exprimiert wird. Somit kann beispielsweise die menschliche Melanom-Zelllinie WM266-4 (ATCC CRL 1676) verwendet werden. Der Vektor, in den die mRNA insertiert werden soll, die unter Verwendung der aus diesen Zellen extrahierten mRNA als Template synthetisiert wurde, kann jeder beliebige Vektor sein, sofern er die Insertion der cDNA und deren Expression ermöglicht. Somit können beispielsweise pAMoPRC35c oder dergleichen verwendet werden. Die Tierzellen oder Insektenzellen, in welche die unter Verwendung des Vektors konstruierte cDNA-Bibliothek eingeführt wird, können beliebige Zellen sein, sofern sie die Einführung der cDNA-Bibliothek und deren Expression ermöglichen. Somit können beispielsweise menschliche Namalwa-Zellen [Hosoi et al.: Cytotechnology, 1, 151 (1988)] oder dergleichen verwendet werden. Insbesondere ist ein direktes Klonierungs-Expressionssystem unter Verwendung von Namalwa-Zellen als Wirt vorteilhaft, da die Effizienz der Einführung einer cDNA-Bibliothek in Namalwa-Wirtszellen sehr hoch ist und die einführten Plasmide (cDNA-Bibliothek) in dem System extrachromosomal erhalten und von den erhaltenen Zellen durch Screening unter Verwendung eines Kohlenhydratketten-spezifischen Antikörpers und eines FACS einfach gewonnen werden können. Aus diesem Grund ist dieses System bevorzugt. Der bei der Durchführung der Erfindung zu verwendende anti-Gangliosid GD3-Antikörper kann jeder beliebige Antikörper sein, sofern er mit dem Gangliosid GD3 reagiert. Somit kann beispielsweise KM 643 ( EP-A-0493686 ) verwendet werden. Die Tierzellen werden unter Verwendung des anti-Gangliosid GD3-Antikörpers Fluoreszenz-markiert, nachdem die cDNA-Bibliothek in sie eingeführt wurde, und anschließend werden Zellen, die eine erhöhte Bindung an den Antikörper zeigen, unter Verwendung eines FACS abgetrennt und angereichert. Von den auf diese Weise erhaltenen Zellen wird, beispielsweise über bekannte Methoden, z.B. der Hart-Methode [Rober F. Margolskee et al.: Molecular and Cellular Biology, 8, 2837 (1988)], ein Plasmid oder ein DNA-Fragment gewonnen, das die für die α-2,8-Sialyltransferase kodierende cDNA enthält. Erfindungsgemäße Plasmide, die eine das Enzym kodierende cDNA enthalten, umfassen pUC119-WP1R. Escherichia coli JM105/pUC119-WP1R, ein pUC119-WP1R tragender Escherichia coli-Stamm, wurde am 18. Februar 1993 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4192 beim National Institute for Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt.
  • Auf der Grundlage der α-2,8-Sialyltransferase kodierenden cDNA, die über die oben beschriebene Methode erhalten wurde, kann die oben unter (b) oder (c) definierte DNA hergestellt werden über dem Fachmann allgemein bekannte Techniken rekombinanter DNA [ JP-A-2-227075 ; Molecular Cloning – A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989; usw.], wie beispielsweise Hybridisierungstechniken und Methoden zur Einführung von Mutationen in DNA. Die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase codierende cDNA kann auch über chemische Synthese hergestellt werden.
  • Die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase kann hergestellt werden durch Konstruieren eines rekombinanten Vektors, indem man die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase kodierende DNA, die beispielsweise über die oben beschriebene Methode erhalten wurde, in einen geeigneten Vektor und in operativer Verknüpfung mit einem geeigneten Promotor insertiert, den rekombinanten Vektor in Wirtszellen einführt und die erhaltenen Zellen kultiviert. Die dabei zu verwendenden Zellen können beliebige Zellen sein, die für die Verwendung in der rekombinanten DNA-Technologie geeignet sind, beispielsweise prokaryotische Zellen, Tierzellen, Hefen, Pilze und Insektenzellen. Ein Beispiel für eine geeignete prokarytische Zelle ist Escherichia coli. CHO-Zellen (Zellen des chinesischen Hamsters), COS-Zellen (Affenzellen) und Namalwa-Zellen (menschliche Zellen) sind Beispiele für geeignete Tierzellen.
  • Vektoren, in die für die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase kodierende DNA insertiert werden, können beliebige Vektoren sein, sofern der Vektor die Insertion der α-2,8-Sialyltransferase kodierenden DNA und die Expression der DNA in Wirtszellen erlaubt. pAGE107 [ JP-A-3-22979 ; Miyaji et al.: Cytotechnology, 3, 133 (1990], pAS3-3 ( JP-A-2-227075 ), pAMoERC3Sc, und CDM8 [Brian Seed et al.: Nature, 329, 840 (1987)] sind Beispiele dafür. Für die Expression des erfindungsgemäßen Enzyms in Escherichia coli wird vorzugsweise ein Plasmid verwendet. Die Fremd-DNA wird so in das Plasmid insertiert, dass sie operativ mit einem Promotor mit starker Transkriptionsaktivität verknüpft ist, beispielsweise dem trp Promotor, und dass die Entfernung zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz (nachfolgend „SD-Sequenz") und dem Initiierungskodon von geeigneter Länge ist (beispielsweise 6–18 Basen). Die Plasmide pKYP10 ( JP-A-58-110600 ), pLSA1 [Miyaji et al.: Agricultural and Biological Chemistry, 53, 277 (1989)] und pGEL1 [Sekine et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 82, 4306 (1985] sind spezfische Beispiele.
  • Bei der Ausführung der Erfindung zu verwendende Techniken rekombinanter DNA umfassen die in der JP-A-2-227075 oder die in Sambrook, Fritsch, Maniatis et al.: Molecular Cloning – A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989, beschriebenen Techniken. Für die Isolierung von mRNA und die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken kann eine Reihe kommerziell erhältlicher Kits verwendet werden. Für die Einführung der DNA in Tierzellen können bekannte Methoden verwendet werden. Die Elektroporationsmethode [Miyaji et al.: Cytotechnolgoy, 3, 133 (1990)], die Calciumphosphatmethode ( JP-A-2-227075 ) und die Lipofektionsmethode [Philip L. Felgner et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 84, 7413 (1987] sind Beispiele dafür. Die Isolierung und Kultivierung von Transformanten kann im wesentlichen gemäß der in der JP-A-2-227075 oder der JP-A-2-257891 beschriebenen Methode durchgeführt werden.
  • Geeignete Verfahren zur Herstellung der α-2,8-Sialyltransferase umfassen das Verfahren der intrazellulären Herstellung in einem Wirt, das Verfahren der extrazellulären Herstellung oder das Verfahren der Herstellung auf der äußeren Schicht einer Wirtszellmembran. Der Ort der Herstellung variiert in Abhängigkeit von der Art der Wirtszelle und der Form der herzustellenden Glycosyltransferase. Wenn Tierzellen als Wirt verwendet werden und eine Glycosyltransferase in ihrer nativen Form hergestellt wird, wird das Enzym im allgemeinen innerhalb der Wirtszellen oder auf der äußeren Schicht der Wirtszellmembran hergestellt und ein Teil des produzierten Proteins wird durch Protease gespalten und extrazellulär sekretiert. Die Genrekombinationstechnik von Paulson et al. [Paulson et al.: The Journal of Biological Chemistry, 264, 17619 (1989)] und Lowe et al. [John B. Lowe et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 86, 8227 (1989); John B. Lowe et al.: Genes & Development, 4, 1288 (1990)] kann verwendet werden, um die Herstellung des Enzyms in einer Form zu bewirken, die aus einem die aktive Stelle enthaltenden Glycosyltransferase-Teil und einem daran hinzugefügten Signalpeptid besteht.
  • Die Herstellung des Enzyms kann gesteigert werden durch Verwendung eine Genamplifizierungssystems, das beispielsweise das Dihydrofolatreduktase-Gen verwendet, wie in der JP-A-227075 beschrieben.
  • Alpha-2,8-Sialyltransferase, die erfindungsgemäß hergestellt wurde, kann über gewöhnliche Methoden der Aufreinigung von Glycosyltransferase aufgereinigt werden [J. Evan. Sadler et al.: Methods of Enzymology, 83, 458]. Bei Herstellung in Escherichia coli kann das Enzym durch eine Kombination der oben genannten Methode und der in der JP-A-63-267292 beschriebenen Methode effizient aufgereinigt werden. Weiterhin ist es möglch, das erfindungsgemäße Enzym in Form eines Fusionsproteins herzustellen und dieses über Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Substanz, die eine Affinität für das fusionierte Protein aufweist, aufzureinigen. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein mit Protein A fusioniert hergestellt werden. Ein solches Protein kann über Affinitätschromatographie unter Verwendung von Immunglobulin G aufgereinigt werden, wobei im wesentlichen die Methode von Lowe et al: (John B. Lowe et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 86, 8227 (1989); John B. Lowe et al.: Genes & Development, 4, 1288 (1990) verwendet wird. Weiterhin ist es möglich, das Enzyme über Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Enzym aufzureinigen.
  • Die Sialyltransferaseaktivität kann über bekannte Methoden bestimmt werden [J. Evan. Sadler et al.: Methods in Enzymology, 83, 458; Bo E. Samuelson: Methods in Enzymology, 138, 567; Manju Basu et al.: Methods in Enzymology, 138, 575; und Naoyuki Taniguti et al.: Methods in Enzymology, 179, 397].
  • Kohlehydratketten können in vitro unter Verwendung der erfindungsgemäßen α-2,8-Sialyltransferase synthetisiert werden. Beispielsweise kann das nicht-reduzierende Ende der Oligosaccharide NeuAc α2 → 3Galβ1 → 4Glc mit einem Sialylsäure-Rest in α2 → 8-Verknüpfung bereitgestellt werden. Weiterhin kann das als Substrtat dienende Gangliosid GM3 zum Gangliosid GD3 modifiziert werden, wenn es mit der erfindungsgemäßen α-2,8-Sialyltransferase behandelt wird.
  • Unter Verwendung der erfindungsgemäßen α-2,8-Sialyltransferase codierenden DNA und Herbeiführung der gleichzeitigen Herstellung von α-2,8-Sialyltransferase und einer Kohlenhydratkette (eines Glycoproteins, Glycolipids oder Oligosaccharids), die in den die Kohlenhydratkette herstellenden Tierzellen oder Insektenzellen als Substrat der α-2,8-Sialyltransferase dienen soll, ist es möglich zu bewirken, dass die hergestellte α-2,8-Sialyltransferase auf die Kohlenhydratkette in den Zellen einwirkt, wobei ein Sialylsäure-Rest mit einem nicht-reduzierenden Ende der Kohlenhydratkette bereitgestellt wird. Beispielsweise kann das Gangliosid GD3 hergestellt werden durch Herbeiführen der gleichzeitigen Herstellung der α-2,8-Sialyltransferase in Zellen, die das Gangliosid GM3 herstellen.
  • Weiterhin ist es auch möglich, über bekannte enzymatische oder chemische Techniken, einen Teil des Oligosaccharids aus dem wie oben beschrieben hergestellten, eine modifizierte Kohlehydratkettenstruktur aufweisenden Glycoprotein, Glycolipid oder Oligosaccharid auszuschneiden.
  • Die für die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase kodierende DNA kann nicht nur dazu verwendet werden, um die Modifizierung einer Kohlehydratkette eines Proteins oder Glycolipids oder die effiziente Herstellung einer spezifischen Kohlehydratkette herbeizuführen, sondern auch für die Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise Entzündung und Metastase von Krebs, wobei beispielsweise Antisense-RNA/DNA-Techniken verwendet werden. Diese DNA kann auf für die Diagnose solcher Krankheiten verwendet werden, wobei beispielsweise Northern Hybridisierung oder PCR-Techniken verwendet werden.
  • Beispielsweise kann die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase kodierende DNA verwendet werden, um über Antisense-RNA/DNA-Technologie [Tokuhisa: Biosciences and Industry, 50, 322–326 (1992); Murakami: Kagaku (Chemistry), 46, 681–684 (1991); Miller: Biotechnology, 9, 358–362 (1992); Cohen: Trends in Biotechnology, 10, 87–91 (1992); Agrawal: Trends in Biotechnology, 10, 152–158 (1992)] oder Tripelhelix-Techniken [Chubb und Hogan: Trends in Biotechnology, 10, 132–136 (1992)] eine Expression der α-2,8-Sialyltransferase zu verhindern. Insbesondere kann auf der Grundlage eines Teils der Basensequenz der die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase kodierenden DNA, vorzugsweise einer in der Translationsinitiierungsregion vorkommenden Basensequenz mit einer Länge von 10–50 Basen, ein Oligonukleotid entworfen und hergestellt und in vivo unter Bedingungen verabreicht werden, unter denen die Herstellung der α-2,8-Sialyltransferase unterdrückt ist. Die Basensequenz des synthetischen Oligonukleotids kann eine Basensequenz sein, die mit einem Teil der Basensequenz des Antisense-Strangs der erfindungsgemäßen Sequenz übereinstimmt, oder eine Basensequenz, die ohne Verlust ihrer Fähigkeit zur Inhibition der Expression der α-2,8-Sialyltransferase modifiziert ist. Wenn die Tripelhelix-Technik verwendet wird, kann die Basensequenz des synthetischen Oligonukleotids auf der Grundlage der Basensequenz sowohl der Sense- als auch der Antisense-Stränge entworfen werden.
  • Weiterhin ist es möglich, unter Verwendung der Hybridisierungs- oder der PCR-Technik die Herstellung der erfindungsgemäßen α-2,8-Sialyltransferase nachzuweisen. Zum Nachweis der Herstellung der erfindungsgemäßen α-2,8-Sialyltransferase unter Verwendung der Northern Hybridisierung oder der PCR-Technik kann die für die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase kodierende DNA oder ein auf der Grundlage von deren Basensequenz synthetisiertes synthetisches Oligonukleotid verwendet werden. Die Northern Hybridisierung und PCR können auf übliche Weise durchgeführt werden [Sambrook, Fritsch und Maniatis: Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Innis et al.: PCR protocols, Academic Press, 1990].
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAGEL106.
  • 2 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pASLB3-3-1.
  • 3 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pASLB3-3.
  • 4 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pASLBE3-3.
  • 5 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pASLBC.
  • 6 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pASLBEC.
  • 7 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pASLBEC2.
  • 8 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoEC2.
  • 9 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoEC3.
  • 10 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoERC3.
  • 11 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAGE207.
  • 12 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAGE207ScN.
  • 13 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoC3Sc.
  • 14 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoERC3Sc.
  • 15 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoPRC3Sc.
  • 16 zeigt ein Konstruktionsschema für die Plasmide pUC119-WP1 und pUC119- WP1R.
  • 17 zeigt die Ergebnisse der Analyse mit einem EPICS Elite Durchflusscytometer (Coulter) nach indirekter Immunfluoreszenzfärbung des Stammes KJM-1 nach Einführung von pAMoPRC3Sc (Kontrollplasmid) oder pAMoPRWP1 (α-2,8-Sialyltransferase-Expressionsplasmid) unter Verwendung von KM-643. Die Ergebnisse, die erhalten wurden, nachdem mit dem Stamm KJM-1 nach Einführung von pAMoPRC35Sc (Kontrollplasmid) eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung von normalem Mausserum durchgeführt wurde, sind als Kontrollen gezeigt.
  • 18 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAGE147.
  • 19 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAGE247.
  • 20 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMN6hyg.
  • 21 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoERSA.
  • 22 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoPRSA.
  • 23 zeigt ein Konstruktionsschema für das Plasmid pAMoPRSAWP1.
  • 24 zeigt die Ergebnisse der Messung der Sialyltransferase-Aktivität von α-2,8-Sialyltransferase bei Verwendung verschiedener Glycolipide als Substrate, wobei die α-2,8-Sialyltransferase unter Verwendung von IgG-Sepharose aus einem Kulturüberstand von Namalwa-Zellen aufgereinigt wurde, die das darin eingeführte Plasmid pAMoPRSAWP1 tragen. Die Ergebnisse sind gezeigt als analytisches Muster, das erhalten wurde durch Auftragen auf eine HPTLC-Platte nach HPTLC-Behandlung auf einen „Bioimaging Analyser" des Modells BAS2000 (Fujix).
  • Die in den Figuren jeweils verwendeten Symbole haben die folgenden Bedeutungen:
    • dhfr:
    Dihydrofolatreduktase-Gen
    hG-CSF:
    menschlicher Granulocyten-Kolonie stimulierender Faktor-Gen
    bp:
    Basenpaare
    kb:
    Kilobasenpaare
    G418/Km:
    Transposon 5 (Tn 5)-abgeleitetes G418/Kanamycin-Resistenzgen
    hyg:
    Hygromycin-Resisenzgen
    Ap:
    pBR322-abgeleitetes Ampicillin-Resistenzgen
    Tc:
    pBR322-abgeleitetes Tetracyclin-Resistenzgen
    P1:
    pBR322-abgeleiteter Promotor
    Ptk:
    Promotor der Thymidinkinase-Gens (tk-Gen) des Herpes simplex-Virus (HSV)
    Sp.βG:
    Spleißsignal des β-Globin-Gens des Kaninchens
    A.βG:
    Poly(A)-Additionssignal des β-Globin-Gens des Kaninchens
    ASE:
    Poly(A)-Additionssignal des frühen Gens des Simian Virus 40 (SV40)
    Atk:
    Poly(A)-Additionssignal der Thymidinkinase des Herpes simplex-Virus (HSV)
    Pse:
    Promotor des frühen Gens des Simian Virus 40 (SV40)
    Pmo:
    Promotor des Long Terminal Repeat (LTR) des "Moloney murine leukemia virus"
    HTLV-1:
    Gene des menschlichen T-Zell-Leukämie-Virus Typ-1 (HTLV-1)
    EBNA-1:
    Epstein-Barr-Virus EBNA-1-Gen
    oriP:
    Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus
    ori:
    Replikationsursprung von pUC119
    Lac'Z:
    Teil des β-Galactosidase-Gens von Escherichia coli
    IG:
    intergenische Region der M13-Phagen-DNA
    G-CSF
    der.: von menschlichem Granulocyten-Kolonie stimulierender Faktor abgeleitetes Gen
    S:
    Teil des Gens, das für das Signalpeptid des menschlichen Granulocyten-Kolonie stimulierenden Faktor kodiert
    A oder ProA:
    Teil des Gens, das für die Bindungsregion of Protein A von Staphylococcus aureus an IgG codiert
    WP1:
    aus WM266-4-Zellen erhaltenes GD3-Synthetase-Gen (Gen voller Länge oder Gen der aktiven Region)
  • BEVORZUGTE AUSFOHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Beispiel 1
  • Klonierung von α-2,8-Sialyltransferase-cDNA (WP1) aus Zellen der menschlichen Melanom-Zelllinie WM266-4
  • 1. Konstruktion der direkten Expressionsvektoren pAMoERC3Sc und pAMoPRC3Sc
  • pAMoERC3SC wurde gemäß den unten beschriebenen Schritten (1) bis (14) konstruiert.
  • (1) Konstruktion von pAGEL106 (s. 1)
  • Ein Plasmid, pAGEL106, mit einem Promotor, der aus der Fusion des Promotors des frühen Gens des Simian Virus 40 (SV40) und Teilen der Regionen R und U5 des Long Terminal Repeat (LTR) des menschlichen T-Zell-Leukämie-Virus Typ 1 (HTLV-1) stammte, wurde konstruiert. Ein DNA-Fragment [BanII-Sau3A-Fragment (0,27 kb)], das Teile der Regionen R und U5 enthielt, wurde aus pATK03 ausgeschnitten und über einen synthetischen Linker in pAGE106 zwischen die BglI-BamHI-Schnittstellen insertiert.
  • pAGE106 ( JP-A-2-227075 ) (1 μg) wurde in 30 μl eines Puffer gelöst, der 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt (nachfolgend „Y-100-Puffer"), 10 Einheiten BglI (Takara Shuzo; soweit nicht anders angegeben, waren die hier erwähnten Restriktionsenzyme Produkte von Takara Shuzo) und 10 Einheiten BamHI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 4,9 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurden 1 μg pATK03 [Shimizu et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 80, 3618 (1983)] in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten BanII zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 0,4 wurde gewonnen. Das gewonnene DNA-Fragment wurde in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten Sau3Al wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 0,27 kb wurde gewonnen.
  • Weiterhin wurde unabhängig davon folgender DNA-Linker synthetisiert und verwendet, um die BglI- und BanII-Schnittstellen miteinander zu verbinden.
    5'-CGGGCT-3' (6mer)
    3'-GGAGC-5' (5mer)
  • Die einzelsträngigen 5mer- und 6mer-DNAs für die Herstellung des DNA-Linkers wurden mit einem Applied Biosystem Modell 380A DNA-Synthesizer synthetisiert. Die synthetisierte DNA (jeweils 0,2 μg) wurde in 40 μl eines Puffers gelöst, der 50 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM Dithiothreitol (nachfolgend DTT), 0,1 nM EDTA und 1 mM Adenosintriphosphat (nachfolgend ATP) enthielt (nachfolgend „T4 Kinase-Puffer") gelöst, 30 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (Takara Shuzo; nachfolgend ebenfalls dieser Hersteller) wurden zugegeben und die Phosphorylierungsreaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
  • Das aus pAGE106 stammende BglI-BamHI-Fragment (4,9 kb; 0,2 μg) und das aus pATK03 stammende BanII-Sau3A-Fragment (0,27 kb; 0,01 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl eines Puffers gelöst, der 66 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,1 mM ATP (nachfolgend „T4 Ligase-Puffer") enthielt, 0,01 μg des oben beschriebenen DNA-Linkers und 175 Einheiten T4 DNA-Ligase (Takara Shuzo, nachfolgend ebenfalls dieser Hersteller) wurden zugegeben und die Ligationsreaktion 16 Stunden bei 12°C durchgeführt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 [Bolivar et al.:, Gene, 2, 75 (1977)] gemäß der Methode von Cohen et al. [S.N. Cohen et al.: Proceedings of the National Academy of Science of the U.S.A., 69, 2110 (1972)] (nachfolgend wurde diese Methode verwendet, um Escherichia coli zu transformieren) zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Von dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode [H. Birnboim et al.: Nucleic Acids Research, 7, 1513 (1979)] (nachfolgend wurde diese Methode verwendet, um Plasmide zu isolieren) ein Plasmid isoliert. Dieses Plasmid wurde als pAGEL106 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsnenzymen identifiziert.
  • (2) Konstruktion von pASL63-3-1 (s. 2)
  • Ein Expressionsplasmid für menschlichen Granulocyten-Kolonie stimulierenden Faktor (hG-CSF), pASL63-3-1, mit einem Promotor, der aus der Fusion des Promotors des frühen Gens von SV40 und Teilen der Regionen R und U5 des Long Terminal Repeat (LTR) von HTLV-1 stammte, wurde auf folgende Weise konstruiert.
  • In (1) erhaltenes pAGEL106 (0,5 μg) wurde in 30 μl eines Puffers gelöst, der 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid, 20 mM Kaliumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt (nachfolgend als „K-20-Puffer" bezeichnet), 10 Einheiten SmaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl T4 Ligase-Puffer gelöst, 0,01 μg eines SalI-Linkers (5'-pGGTCGACC-3'; Takara Shuzo) und 175 Einheiten T4 Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl eines Puffers gelöst, der 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid, 175 mM Natriumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt (nachfolgend als „Y-175-Puffer" bezeichnet), 10 Einheiten SalI und 10 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 1,7 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg pAS3-3 ( JP-A-2-227075 ) in 30 μl Y-175-Puffer gelöst, 10 Einheiten SalI und 10 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 6,7 kb gewonnen.
  • Das aus pAGEL106 stammende MluI-SalI-Fragment (1,7 kb; 0,1 μg) und das aus pAS3-3 stammende MluI-SalI-Fragment (6,7 kb; 0,2 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4 Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Von dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Dieses Plasmid wurde als pASL63-3-1 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (3) Konstruktion von pASLB3-3 (s. 3)
  • Zur Konstruktion eines Plasmids, pASLB3-3, durch Einführen des Ampicillin-Resistenzgens in pASLB3-3-1, wurde ein Ampicillin-Resistenzgen enthaltendes DNA-Fragment [XhoI-MluI-Fragment (7,26 kb)] von pAS3-3 zwischen den XhoI- und MluI-Schnittstellen in pASL6-3-3-1 eingeführt.
  • Das in (2) erhaltene pASLB3-3-1 (1 μg) wurde in 30 μl eines Puffer gelöst, der 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid, 150 mM Natriumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt (nachfolgend als „Y-150-Puffer" bezeichnet), 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 7,26 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg pAS3-3 ( JP-A-2-227075 ) in 30 μl Y-150-Puffer gelöst, 10 Einheiten XhoI und 10 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 2,58 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pASLB3-3-1 stammende XhoI-MluI-Fragment (7,26 kb; 0,2 μg) und das aus pAS3-3 stammende XhoI-MluI-Fragment (2,58 kb; 0,1 μg) wurden in 30 μl T4 Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktio 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über ein bekanntes Verfahren ein Plasmid isoliert und als pASLB3-3 bezeichnet. Die Struktur des Plasmids wurde durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (4) Konstruktion von pASLBE3-3 (s. 4)
  • Ein Plasmd, pASLBE3-3, wurde auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem die Dihydrofolatreduktase (dhrf)-Expressionseinheit aus pASLB3-3 entfernt wurde und stattdessen gleichzeitig der Replikationsursprung (oriP) und das EBNA-1-Gen (das trans auf oriP einwirkt, wodurch die Replikation induziert wird) des Epstein-Barr-Virus darin eingeführt wurde. Der oriP und das EBNA-1-Gen, die verwendet wurden, waren ausgeschnitten aus dem Plasmid p220.2, das hergestellt worden war durch Einbau eines eine Multicloning Site enthaltenden SmaI-HaeIII-Fragments, das aus pUC12 [Messing et al.: Methods in Enzymology, 101 20 (1983)] stammte, in p201 [Bill Sugden et al.: Nature, 313, 812 (1985)] an dessen NarI-Schnittstelle.
  • p220.2 (1 μg) wurde in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten EcoRI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase I-Puffer [50 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM dATP (Deoxyadenosintriphosphat), 0,1 mM dCTP (Deoxycytidintriphosphate), 0,1 mM dGTP (Deoxyguanosintriphosphat), 0,1 mM TTP (Thymidintriphosphat)) gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment von DNA Polymerase I, die aus Escherichia coli stammte, wurden zugegeben und die Reaktion 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, um das nach Verdau mit EcoRI gebildete 5'-kohäsive Ende in ein stumpfes Ende zu überführen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach Extraktion mit Chloroform und Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 20 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 0,05 μg eines XhoI-Linkers (5'-pCCTCGAGG-3'; Takara Shuzo) und 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten BamHI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase I-Puffer gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment von DNA Polymerase I, die aus Escherichia coli stammte, wurden zugegeben und die Reaktion 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, um das nach Verdau mit BamHI gebildete 5'-kohäsive Ende in ein stumpfes Ende zu überführen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach Extraktion mit Chloroform und Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 4,9 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde in (3) erhaltenes pASLB3-3 (1 μg) in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase I-Puffer gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment von DNA Polymerase I, die aus Escherichia coli stammte, wurden zugegeben, und die Reaktion 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, um das nach Verdau mit XhoI gebildete 5'-kohäsive Ende in ein stumpfes Ende zu überführen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach Extraktion mit Chloroform und Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl eines Puffers gelöst, der 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol (nachfolgend als „Y-0-Puffer" bezeichnet) umfasste, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb wurde gewonnen.
  • Weiterhin wurde unabhängig davon 1 μg pAGE107 ( JP-A-3-22979 ; Miyaji et al.: Cytotechnology, 3, 133 (1990)] in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 100 mM zugegeben, 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion weitere 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 6,0 kb wurde gewonnen.
  • Das aus p220.2 stammende XhoI-BamHI-Fragment (mit stumpfen Enden) (4,9 kb; 0,2 μg), das aus pASLB3-3 stammende XhoI-(mit stumpfem Ende)-KpnI-Fragment (1,3 kb; 0,1 μg) und das aus pAGE107 stammende KpnI-XhoI-Fragment (6,0 kb; 0,2 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pASLBE3-3 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (5) Konstruktion von pASLBC (s. 5)
  • Ein Plasmid, pASLBC, wurde konstruiert, indem das hG-CSF-Gen aus pASLB3-3 entfernt wurde und stattdessen eine Multicloning Site darin eingeführt wurde. Die Multicloning Site wurde unter Verwendung synthetischer DNAs hergestellt.
  • In (3) erhaltenes pASLB3-3 (1 μg) wurde in 30 μl Y-175-Puffer gelöst, 20 Einheiten SalI und 20 Einheiten MluI wurden zugegeben und wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 3,1 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg des gleichen Plasmids in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben und die Verdaureaktion 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde Natriumchlorid bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 150 mM zugegeben, 20 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion weitere 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 6,0 kb wurde gewonnen.
  • Weiterhin wurde unabhängig davon der unten angegebene DNA-Linker als Linker zum Verbinden der SalI-Schnittstelle mit der KpnI-Schnittstelle synthetisiert. In diesen Linker sind die folgenden Schnittstellen für Restriktionsenzyme eingebaut: HindIII, EcoRV, SfiI, StuI und NotI.
  • Figure 00220001
  • Die 52mer (SEQ ID NO:3) und 44mer (SEQ ID NO:4) einzelsträngigen DNAs des DNA-Linkers wurden jeweils mit einem Applied Biosystems Modell 380A DNA-Synthesizer synthetisiert. Die auf diese Weise synthetisierten DNAs (jeweils 0,2 μg) wurden in 20 μl T4-Kinase-Puffer gelöst, 30 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (Takara Shuzo; nachfolgend ebenfalls dieser Hersteller) wurden zugegeben und die Phosphorylierungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
  • Das SalI-MluI-Fragment (3,1 kb; 0,1 μg) und das KpnI-MluI-Fragment (6,0 kb; 0,2 μg), die jeweils wie oben beschrieben aus pASL63-3 stammten, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 0,01 μg des oben beschriebenen DNA-Linkers und 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillinresistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pASLBC bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (6) Konstruktion von pASLBEC (s. 6)
  • Ein Plasmid, pASLBEC, wurde konstruiert, indem man aus pASLBC die Dihydrofolatreduktase (dhfr)-Expressionseinheit entfernte und stattdessen den oriP und das EBNA-1-Gen darin einführte.
  • In (4) erhaltenes pASLBE3-3 (1 μg) wurde in 30 μl Y-150-Puffer gelöst, 20 Einheiten MluI und 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg des gleichen Plasmids in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 150 mM zugegeben, 5 Einheiten MluI wurden zugegeben und weiterhin ein Partialverdau 20 Minuten bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 9,6 kb wurde gewonnen.
  • Weiterhin wurde unabhängig davon in (5) erhaltenes pASLBC (1 μg) in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 100 mM zugegeben, 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion weitere 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 0,6 kb wurde isoliert.
  • Das MluI-XhoI-Fragment (1,3 kb; 0,2 μg) und das KpnI-MluI-Fragment (9,6 kb; 0,2 μg), die jeweils wie oben beschrieben von pASLBE3-3 stammten, und das von pASLBC stammende KpnI-XhoI-Fragment (0,6 kb; 0,05 μg) wurden in 30 μl T4-Ligase-Pffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pASLBEC bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (7) Konstruktion von pASLBEC2 (s. 7)
  • Ein Plasmid, PASLBEC2, wurde auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem ein BamHI-Linker in die StuI-Schnittstelle der Multicloning Site von pASLBEC eingeführt wurde. Bei pASBEC2 fehlt die StuI-Schnittstelle in der Multicloning Site.
  • In (6) erhaltenes pASLBEC (1 μg) wurde in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 5 Einheiten StuIq wurden zugegeben und ein Partialverdau 20 Minuten bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 11,5 kb wurde gewonnen. Die erhaltene DNA wurde in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 0,01 μg BamHI-Linker (5'-pCCGGATCCGG-3'; Takara Shuzo) und 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten BamHI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 11,5 kb wurde gewonnen. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in 20 μl T4 Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pASLBEC2 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (8) Konstruktion von pAMoEC2 (s. 8)
  • Ein Plasmid, pAMoEC2, wurde auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem der Promoter in pASLBEC2 [der aus der Fusion des Promotors des frühen Gens von SV40 und Teilen der Regionen R und U5 des Long Terminal Repeat (LTR) von HTLV-1 stammende Promotor] durch den Promotor des LTR des Moloney Murine Leukemia Virus ersetzt wurde. Der Promotor des LTR des Moloney Murine Leukemia Virus wurde zur Verwendung aus dem Plasmid Molp-1 [Akinori Ishimoto et al.: Virology, 141, 30 (1985)] ausgeschnitten.
  • In (7) erhaltenes pASLBEC2 (1 μg) wurde in 30 μl eines Puffers gelöst, der 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Kaliumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol enthielt (nachfolgend „K-50-Puffer"), 20 Einheiten HindIII und 20 Einheiten AatII (Toyobo) wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 4,8 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg des gleichen Plasmids in 30 μl K-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten AatII wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurden 5 Einheiten XhoI zugegeben und weiterhin ein Partialverdau 20 Minuten bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 6,1 kb wurde gewonnen.
  • Anschließend wurde der unten gezeigte Linker als Linker für das Verbinden der XhoI-Schnittstelle mit der ClaI-Schnittstelle synthetisiert.
    5'-TCGAGGACC-3' (9mer)
    3'-CCTGGGC-5' (7mer)
  • Die einzelsträngigen 9mer und 7mer DNAs zur Herstellung des obengenannten DNA-Linkers wurden mit einem Applied Biosystems Modell 380A DNA-Synthesizer synthetisiert. Die synthetisierte DNA (jeweils 0,2 μg) wurde in 40 μl T4-Kinase-Puffer gelöst, 30 Einheiten T4 Polynukleotidkinase wurden zugegeben und die Phosphorylierungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt.
  • Weiterhin wurde unabhängig davon 1 μg Molp-1 [Akinori Ishimoto et al.: Virology, 141, 30 (1985) in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 0,01 μg des oben beschriebenen DNA-Linkers und 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl K-20-Puffer gelöst, 20 Einheiten SmaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 0,6 kb wurde gewonnen. Das gewonnene DNA-Fragment wurde in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 0,03 μg eines HindIII-Linkers (5'-pCAAGCTTG-3'; Takara Shuzo) und 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl eines Puffers gelöst, der 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 6 mM 2-Mercaptoethanol umfasste (nachfolgend „Y-50-Puffer"), 10 Einheiten HindIII wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 100 mM zugegeben, 10 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde weitere 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 0,6 kb wurde gewonnen.
  • Das HindIII-AatII-Fragment (4,8 kb; 0,2 μg) und das AatII-XhoI-Fragment (6,1 kb; 0,2 μg), die jeweils wie oben beschrieben aus pASLBEC2 stammten, und das aus Molp-1 stammende HindIII-Xhol-Fragment (0,6kb; 0,05 μg) wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoEC2 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (9) Konstruktion von pAMoEC3 (s. 9)
  • Ein Plasmid, pAMoEC3, wurde auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem als Stuffer-DNA ein DNA-Fragment [Dral-PvuII-Fragment (2,5 kb)], welches das Tetracyclin-Resistenzgen von pBR322 enthielt, in die BamHI-Schnittstelle in der Multicloning Site von pAMoEC2 insertiert wurde.
  • In (8) erhaltenes pAMoEC2 (1 μg) wurde in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten BamHI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase I-Puffer gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment von DNA Polymerase I, die aus Escherichia coli stammte, wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, und das aus dem Verdau mit BamHI stammende 5'-kohäsive Ende in ein stumpfes Ende zu überführen. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 11,5 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg pBR322 [Bolivar et al.: Gene, 2, 95 (1977)] in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten DraI und 20 Einheiten PvuII wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 2,5 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAMoEC2 abgeleitete BamHI (stumpfes Ende)-Fragment (11,5 kb; 0,1 μg) und das aus pBR322 stammende DraI-PvuI-Fragment (2,5 kb; 0,2 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin- und Tetracyclin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoEC3 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (10) Konstruktion von pAMoERC3 (s. 10)
  • Ein Plasmid, pAMoERC3, wurde auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem die Richtung der oriP- und EBNA-1-Geneinheit in pAMoEC3 umgedreht wurde.
  • In (9) erhaltenes pAMoEC3 (1 μg) wurde in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurden 30 μl 1 M Tris-Hydrochlorid (pH 8,0) und 1 Einheit aus Escherichia coli stammender Alkalische Phosphatase (Takara Shuzo) zugegeben und die Dephosphorylierungsreaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl eines Puffers gelöst, der 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 8,0) und 1 mM EDTA (Natriumethylendiamintetraacetat) enthielt (nachfolgend als „TE-Puffer" bezeichnet), eine Agarose-Gelelektrophorese damit durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 9,1 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg des gleichen Plasmids in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 4,9 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAMoEC3- stammende XhoI-Fragment (9,1 kb; 0,1 μg) und das aus dem gleichen Plasmid stammende XhoI-Fragment (4,9 kb; 0,2 μg), die jeweils auf die oben beschriebene Weise erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillinresistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoERC3 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (11) Konstruktion von pAGE207 (s. 11)
  • Ein Plasmid, pAGE207, wurde auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem das G418-Resistenzgen in pAGE107 durch das Hygromycin (hyg)-Resistenzgen ersetzt wurde. Das hyg-Resistenzgen wurde zur Verwendung aus p201 [Bill Sugden et al.: Nature, 311, 812 (1985)] ausgeschnitten.
  • pAGE107 (1 μg) wurde in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 150 mM zugegeben, 20 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde weitere 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 4,6 kb wurde gewonnen.
  • p201 [Bill Sugden et al.: Nature, 311, 812 (1985); 0,5 μg] wurden in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten Narl (New England Biolabs) wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase I-Puffer gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment von DNA Polymerase I, die von Escherichia coli stammte, wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, um das durch den Verdau mit NarI gebildete 5'-kohäsive Ende in ein stumpfes Ende umzuwandeln. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach Extraktion mit Chloroform und Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 20 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 0,05 μg eines ClaI-Linkers (5'-pCATCGATG-3'; Takara Shuzo) und 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 10 Einheiten ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 150 mM zugegeben, 10 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde weitere 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 1,6 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAGE107 stammende ClaI-MluI-Fragment (4,6 kb; 0,2 μg) und das aus p201 stammende ClaI-MluI-Fragment (1,6 kb; 0,1 μg), die jeweils auf die oben beschriebene Weise erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Dieses Plasmid wurde als pAGE207 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (12) Konstruktion von pAGE207ScN (s. 12)
  • Zum Entfernen der mit der SfiI-Schnittstelle in Zusammenhang stehenden Sequenz, die in dem β-Globin-Gen des Kaninchens vorkommt, wurde ein Plasmid, pAGE207ScN, auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem ein ScaI-Linker an der BalI-Schnittstelle in pAGE207 insertiert wurde. In pAGE207ScN ist die Zahl der insertierten ScaI-Linker nicht bekannt.
  • In (11) erhaltenes pAGE207 (0,5 μg) wurde in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 10 Einheiten Ball wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 20 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 0,01 μg eines ScaI-Linkers (5'-pAAGTACTT-3'; Takara Shuzo) und 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAGE207ScN bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (13) Konstruktion von pAMoC3Sc (13)
  • Zum Entfernender mit der SfiI-Schnittstelle in Zusammenhang stehenden Sequenz, die in dem β-Globin-Gen des Kaninchens in pAMoERC3 vorkommt, wurde ein Plasmid, pAMoERC3Sc, auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem das β-Globin-Gen des Kaninchens in pAMoERC3 durch das β-Globin-Gen in pAGE207ScN ersetzt wurde, welches die fragliche Sequenz nicht mehr aufwies. Der Einfachheit halber wurde zuerst pAMoC3Sc und dann pAMoERC3Sc konstruiert. Während in dem oben beschriebenen pAGE207ScN die Zahl der ScaI-Linker, die zum Entfernen der mit der SfiI-Schnittstelle in Zusammenhang stehenden Sequenz insertiert wurden, unbekannt ist, beträgt im Fall von pAMoERC3Sc die Zahl der insertierten Scal-Schnittstellen vermutlich 1, da pAGE207ScN durch ScaI einmal geschnitten wurde.
  • In (12) erhaltenes pAGE207ScN (1 μg) wurde in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 100 mM zugegeben, 20 Einheiten ScaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde weitere 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 0,7 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg des gleichen Plasmids in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten ScaI und 20 Einheiten ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 0,9 kb wurde gewonnen.
  • Weiterhin wurde unabhängig davon 1 μg des in (10) erhaltenen pAMoERC3 in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde Natriumchlorid bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 100 mM zugegeben, 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C weiter durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 3,2 kb wurde gewonnen.
  • Dann wurde 1 μg pAGE107 ( JP-A-227075 ) in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten XhoI und 20 Einheiten ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 4,3 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAGE207ScN stammende KpnI-ScaI-Fragment (0,7 kb; 0,1 μg), das aus pAGE207ScN stammende ScaI-ClaI-Fragment (0,9 kb; 0,1 μg), das aus pAMoERC3 stammende KpnI-XhoI-Fragment (3,2 kb; 0,3 μg) und das aus pAGE107 stammende XhoI-ClaI-Fragment (4,3 kb; 0,3 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoC3Sc bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (14) Konstruktion von pAMoERC3Sc (s. 14)
  • Das in (10) erhaltene pAMoERC3 (1 μg) wurde in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde Natriumchlorid bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 150 mM zugegeben, 20 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C weiter durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 6,8 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg des gleichen Plasmids in 30 μl Y-150-Puffer gelöst, 20 Einheiten XhoI und 20 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb wurde gewonnen.
  • Weiterhin wurde unabhängig davon 1 μg pAMoC3Sc, das in (3) erhalten worden war, in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten KpnI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde Natriumchloridl bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 100 mM zugegeben, 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C weiter durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 5,9 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAMoERC3 stammende KpnI-MluI-Fragment (6,8 kb; 0,2 μg), das aus pAMoERC3 stammende XhoI-MluI-Fragment (1,3 kb; 0,05 μg) und das aus pAMoC3Sc stammende KpnI-XhoI-Fragment (5,9 kb; 0,2 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoERC3Sc bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • pAMoERC3Sc weist den Long Terminal Repeat des Moloney Murine Leukemia Virus als Promotor für heterologe Genexpression auf. Es ist so gestaltet, dass für effiziente heterologe Genexpression sich dem insertierten heterologen Gen das Spleißsignal des β-Globin-Gens des Kaninchens, das PolyA-Additionssignal des β-Globin-Gens des Kaninchens und das PolyA-Additonssignal des frühen Gens von SV40 anschließen soll. Weiterhin trägt es das G418-Resistenzgen als Wirkstoffresistenzmarker für Tierzellen und das Kanamycin-Resistenzgen (dasselbe wie das G418-Resistenzgen) und das Ampicillin-Resistenzgen als Wirkstoffresistenzmarker für Escherichia coli. Weiterhin trägt es den Replikationsursprung (oriP) des Epstein-Barr-Virus und das EBNA-1-Gen (das zur Induktion der Replikation trans auf den oriP einwirkt), so dass es seinen Plasmidzustand in Namaiwa-Zellen und vielen anderen Zellen mit Ausnahme von Nagetierzellen beibehalten kann, ohne in das Chromosom eingebaut zu werden.
  • Die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung von pAMoERC3Sc kann durchgeführt werden durch Hinzufügen eines SfiI-Linkers an beide Enden einer cDNA und anschließendes Einbauen des Additionsprodukts in die SfiI-Schnittstelle in pAMoERC3Sc.
  • (15) Konstruktion von pAMoPRC3Sc (s. 15)
  • Wenn Zellen, die EBNA-1 natürlicherweise exprimieren, beispielsweise Namalwa-Zellen, als Wirt verwendet werden, so nimmt man an, dass das in einen solchen Wirt eingeführte Plasmid pAMoERC3Sc im Zustand des Plasmid vorliegen könnte, ohne in das Chromosom eingebaut zu werden, selbst wenn ihm das EBNA-1-Gen fehlen würde. Deshalb wurde ein Plasmid, pAMoPRC3Sc, auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem das EBNA-1-Gen aus pAMoERC3Sc entfernt wurde. Wie pAMoERC3Sc kann pAMOPRC3Sc als direkter Expressionsklonierungsvektor verwendet werden.
  • In (14) erhaltenes pAMoERC3Sc (2 μg) wurde in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten NsiI (New England Biolabs) wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase Puffer-I gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment aus DNA Polymerase 1, die aus Escherichia coli stammte, wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, und das 3'-kohesive Ende, das sich nach dem Verdau mit NsiI gebildet hatte, in ein stumpfes Ende zu überführen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach Extraktion mit Chloroform und Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten NotI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 8,1 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurden 2 μg des gleichen Plasmids in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase I-Puffer gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment von DNA Polymerase I, die aus Escherichia coli stammte, wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, um das 5'-kohäsive Ende, das sich nach dem Verdau mit XhoI gebildet hatte, in ein stumpfes Ende zu überführen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach Extraktion mit Chloroform und Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten NotI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 3,2 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAMoERCSc abgeleitete NsiI (mit stumpfem Ende)-NotI-Fragment (8,1 kb; 0,1; μg) und das XhoI (mit stumpfem Ende)-NotI-Fragment (3,2 kb; 0,1 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillinesistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoPRC3Sc bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • 2. Klonierung von α-2,8-Sialyltransferase codierender cDNA (WP1)
  • (1) Extraktion vom mRNA aus Zellen der menschlichen Melanomzellline WM266-4
  • Unter Verwendung des mRNA-Extraktionskits Fast Track (Invitrogen; Artikelnummer K1593-02) wurden etwa 30 μg mRNA aus 1 × 108 WM266-4-Zellen (ATCC CRL 1676) gewonnen. Die verwendeten Reagenzien und Verfahren waren die in dem Handbuch, das dem Kit beilag, beschriebenen Reagenzien und Verfahren.
  • (1) Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
  • Unter Verwendung des Kits cDNA Synthesis System von GIBCO BRL wurde mit oligo-dT als Primer aus 8 μg der mRNA, die wie oben beschrieben erhalten worden war, doppelsträngige cDNA synthetisiert. Dabei wurde anstelle der zum Kit gehörigen Reverse Transkriptase des Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Super ScriptTM RNase H– Reverse Transkriptase von GIBCO BRL verwendet. Dann wurde die cDNA an beiden Enden mit dem unten gezeigten SfiI-Linker bereitgestellt, und damit eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, um die cDNA nach der Größe zu fraktionieren. Auf diese Weise wurden cDNA-Fragmente mit nicht weniger als etwa 1,6 kb gewonnen.
    SfiI-Linker
    5'-CTTTAGAGCAC-3' (11mer)
    3'-GAAATCTC-5' (8mer)
  • Die oben angegebenen 11mer-(SEQ ID NO:5) und 8mer-einzelsträngigen DNAs wurden jeweils mit einem Applied Biosystems Modell 380A DNA-Synthesizer synthetisiert. Jede synthetisierte DNA (50 μg) wurde einzeln in 50 μl T4-Kinase-Puffer gelöst, 30 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben und die Phosphorylierungsreaktion wurde 16 Stunden bei 37°C durchgeführt. Die doppelsträngige, wie oben beschriebene cDNA und die phosphorylierten Linker (4 μg des 11mers und 2,9 μg des 8mers), die wie oben beschrieben phosphoryliert worden waren, wurden in 45 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 1050 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 16°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und cDNA-Fragmente mit einer Größe von nicht weniger als 1,6 kb wurden gewonnen.
  • Unabhängig davon wurden 24 μg des in 1-(14) erhaltenen direkten Expressionsklonierungsvektors pAMoPRC3Sc in 590 μl Y-50-Puffer gelöst, 80 Einheiten SfiI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 16 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde mit einem Aliquot (5 μq) des Reaktionsgemisches eine Agarose-Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Nachdem auf diese Weise die vollständige Spaltung bestätigt worden war, wurden 40 Einheiten BamHI zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt, um den Hintergrund (Klone ohne irgendein cDNA-Insert) zu verringern, der von der Konstruktion der cDNA-Bibliothek herrührte. Mit dem Reaktionsgemisch wurde dann eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 8,8 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAMoPRC3Sc stammende SfiI-Fragment (8,8 kb; 2 μg), das wie oben beschrieben erhalten worden war, und die auf die oben beschriebene Weise aufgereinigte cDNA wurden in 250 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 2.000 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 16°C durchgeführt. Dann wurde nach Zugabe von 5 μg Transfer-RNA (tRNA) durch Zugabe von Ethanol eine Fällung durchgeführt und das Präzipitat in 20 μl TE-Puffer gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli LE392 [Maniatis et al. (Herausgeber): Molecular Cloning, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory; 1989] über Elektroporation [William J. Dower et al.: Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)] zu transformieren, und man erhielt etwa 260.000 Ampicillin-resistente Stämme.
  • (3) Klonierung von α-2,8-Sialyltransferase-cDNA (WP1)
  • Die auf die oben beschriebene Weise erhaltenen Ampicillin-resistenten Stämme (etwa 260.000 Stämme; cDNA-Bibliothek) wurden vermischt und Plasmide unter Verwendung des Plasmidherstellungskits > Plasmid < maxi kit (Artikelnummer 41031) von Quiagen hergestellt. Die Plasmide wurden durch Zugabe von Ethanol gefällt und dann in TE-Puffer mit einer Konzentration von 1 μg/μl gelöst.
  • Das oben beschriebene Plasmid wurden über Elektroporation [Miyaji et al.: Cytotechnology, 3, 133 (1990)]) in Namalwa-Zellen eingeführt, die in serumfreiem Medium konditioniert worden waren (KJM-1-Zelllinie [Hosoi et al.: Cytotechnology, 1, 151 (1988)]. Nach Einführung von 4 μg Plasmid pro 1,6 × 106 Zellen wurden die Zellen in 8 ml RPMI1640-ITPSGF-Medium [RPMI1640-Medium, supplementiert mit 1/40 Volumen 7,5% NaHCO3, 3% 200 mM L-Glutamin-Lösung (Gibco); 0,5% einer Penicillin-Streptomycin-Lösung (Gibco; 5.000 Einheiten/ml Penicillin, 5.000 μg/ml Streptomycin), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-hydroxypropan-3-sulfonsäure (HEPES) (10 mM), Insulin (3 μg/ml), Transferrin (5 μg/ml), Natriumpyruvat (5 mM), Natriumselenit (125 nM), Galactose (1 mg/ml) und Pluronic F68 (0,1 g/v); Nissui Pharmaceutical] suspendiert und 24 Stunden bei 37°C in einem CO2-Inkubartor kultiviert. Anschließend wurde G418 (Gibco) bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugegeben und die Inkubation 7 Tage weiter fortgesetzt, wodurch man Transformanten erhielt. Die erhaltenen Transformanten wurden in RPMI1640-ITPSGF-Medium kultiviert, das 0,5 mg/ml G418 enthielt, und dann wurde mit etwa 3 × 107 Zellen eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Gangliosid GD3, KM-643 ( EP-A-0493686 ) durchgeführt. Genauer gesagt wurde bei der indirekten Immunfluoreszenzfärbung die unten beschriebene Vorgehensweise angewendet.
  • Etwa 3 × 107 Zellen wurden in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen (Röhrchen 2059; Falcon) gegeben und die Zellen über Zentrifugation geerntet (130 × g, 10 Minuten). Dann wurden die Zellen mit 20 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS), die 0,1% Natriumazid enthielt (A-PBS; 8 g/l Natriumchlorid, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,15 g/l Dinatriumhydrogenphosphat (wasserfrei), 0,2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Natriumazid] gewaschen. Zu den geernteten Zellen wurden 0,8 ml KM-643 (10 μg/ml) gegeben, um die geernteten Zellen darin zu suspendieren, und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden mit zwei Aliquoten A-PBS gewaschen, und anschließend wurden 320 μl anti-Maus IgG-Antikörper und anti-Maus-IgM-Antikörper, die mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Kirkegaad & Perry Laborstories; 16fach mit A-PBS verdünnt) fluoreszenzmarkiert waren, zugegeben, um die Zellen darin zu suspendieren, und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden mit zwei Aliquoten A-PBS gewaschen und in 1 ml A-PBS suspendiert, und Zellen mit hoher Fluoreszenzintensität (höchster Wert 1 %) wurden mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (EPICS Elite Flow Cytometer; Coulter) gewonnen. Die gewonnenen Zellen wurden zur Vermehrung in RPMI1640-ITPSGF-Medium kultiviert, das 0,5 mg/ml G418 enthielt. Die auf diese Weise gezogenen Zellen wurden wiederholt auf die gleiche Weise behandelt, um Zellen mit hoher Fluoreszenzintensität abzutrennen und aufzukonzentrieren. Bei den zweiten, dritten, vierten und fünften Behandlungen wurden Zellen mit hoher Fluoreszenzintensität (höchster Werte 1,5%, 3%, 3% bzw. 8%) gewonnen. Als Ergebnis konnten Zellen mit erhöhter Fluoreszenzintensität, nämlich Zellen mit erhöhter Expression des Gangliosids GD3, erhalten werden. Diese Zellen wurden in RPMI1640-ITPSGF-Medium kultiviert, das 0,5 mg/ml G418 enthielt, und dann wurde das Plasmid mit der Hart-Methode [Robert F. Margolskee et al.: Molecular and Cellular Biology, 8, 2837 (1988)] von etwa 5 × 106 Zellen gewonnen. Das gewonnene Plasmid wurde über Elektroporation [William J. Dower et al.: Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)] in Escherichia coli LE392 eingeführt, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Von dieser Transformante wurde mit dem Plasmidherstellungskit von Quiagen ein Plasmid hergestellt und dessen Struktur durch Schneiden mit verschiedenen Restriktionsenzymen untersucht. Man fand, dass das Plasmid eine cDNA von etwa 2,1 kb enthält. Dieses Plasmid wurde als pAMoPRWP1 bezeichnet und über die oben beschriebene Methode wieder in die Zelllinie KJM-1 eingeführt. Indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit KM-643 zeigte, dass der Expressionsgrad des Gangliosids GD3 in der dieses Plasmid tragenden Zelllinie KJM-1 etwa 30mal höher war als bei der Zelllinie KJM-1, die das Kontrollplasmid (pAMoPRC3Sc) trug. Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass diese cDNA die cDNA ist, die für α-2,8-Sialyltransferase codiert, welche die Herstellung des Gangliosids GD3 verstärkt.
  • 3. Sequenzierung von cDNA (WP1), die für α-2,8-Sialyltransferase codiert
  • (1) Insertion von α-2,8-Sialyltransferase codierender cDNA (WP1) in pUC119 (s. 16)
  • Das in Abschnitt 2-(3) erhaltene Plasmid pAMoPRWP1 (2 μg) wurde in 50 μl Y-80-Puffer gelöst, 30 Einheiten HindIII und 30 Einheiten Asp718 wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase I-Puffer gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment von DNA Polymerase I, die aus Escherichia coli stammte, wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten durchgeführt, um das nach Verdau mit HindIII gebildete 5'-kohäsive Ende beziehungsweise das durch den Verdau mit Asp718 gebildete 5'-kohäsive Ende in stumpfe Enden zu überführen. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 2,2 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg pUC119 [Messing et al.: Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)] in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten HindIII wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurden 30 μl 1 M Tris-Hydrochlorid (pH 8,0) und 1 Einheit aus Escherichia coli stammender Alkalische Phosphatase (Takara Shuzo) zugegeben und die Reaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl TE-Puffer gelöst, mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 3,16 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAMOPRWP1 abgeleitete HindIII-(mit stumpfem Ende)-Asp718 (mit stumpfem Ende)-Fragment (2,2 kb; 0,05 μg) und das aus pUC119 abgeleitete HincII-Fragment (3,16 kb; 0,05 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM105 (Yanisch-Perron et al.: Gene, 33, 103 (1985)] gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt Ampicillin-resistente Stämme. Aus diesen Transformanten wurde über bekannte Methoden Plasmide isoliert und deren Strukturen durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert. Zwei Plasmide, die sich in pUC119 durch die Richtung des aus pAMOPRWP1 abgeleiteten HindIII-(mit stumpfem Ende)-Asp718 (mit stumpfem Ende)-Fragments unterschieden, wurde isoliert. Die Plasmide wurden als pUC119-WP1 beziehungsweise UC119-WP1R bezeichnet.
  • (2) Konstruktion eines deletionsmutierten Plasmids für die Sequenzierung
  • Die Gesamtbasensequenz der α-2,8-Sialyltransferase codierenden cDNA (WP1) wurde über die nachfolgend beschriebene Vorgehensweise bestimmt.
  • pUC119-WP1R (2 μg) wurde in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 40 Einheiten SacI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 16 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Natriumchlorid-Konzentration von 80 mM zugeben, 40 Einheiten Asp718 wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C weiter durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde jedes Präzipitat in 100 μl ExoIII-Puffer (dem Deletionskit für Kilosequenzierung von Takara Shuzo beiliegend) gelöst.
  • Unabhängig davon wurden 2 μg des gleichen Plasmids pUC119-WP1R in 30 μl Y-150-Puffer gelöst, 40 Einheiten SphI und 40 Einheiten NotI zugegeben und die Verdaureaktion 16 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 100 μl ExoIII-Puffer (dem Deletionskit für Kilosequenzierung von Takara Shuzo beiliegend) gelöst.
  • Beginnend mit dem aus pUC119-WP1R stammenden SacI-Asp718-Fragment und dem aus pUC119-WP1R stammenden SphI-NotI-Fragment, die auf die oben beschriebene Weise erhalten worden waren, wurden unter Verwendung des Deletionskits für Kilosequenzierung von Takara Shuzo insgesamt 13 deletionsmutierte Plasmide hergestellt. Die tatsächlich verwendeten Reagenzien und Verfahren waren die in dem Handbuch, das dem Kit beilag, beschriebenen Reagenzien und Verfahren.
  • Die Basensequenzen der auf die oben beschriebene Weise erhaltenen deletionsmutierten Plasmide wurden unter Verwendung eines Sequenzierungskits von Applied Biosystems (Taq DyeDEoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit; Artikelnummer 401113) bestimmt. Die Sequenz des Segments, die unter Verwendung der oben beschriebenen deletionsmutierten Plasmide nicht bestimmt werden konnte, wurde ermittelt, indem als Primer DNAs auf der Grundlage der Basensequenz verwendet wurden, die unter Verwendung des deletionsmutierten Plasmide bestimmt wurde. Die auf diese Weise bestimmte Basensequenz von WP1 ist als SEQ ID NO:1 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass WP1 ein Protein kodiert, das aus 356 Aminosäureresten zusammengesetzt ist. Die Aminosäuresequenz zeigte, dass das Protein eine Struktur aufweist, die Glycosyltransferasen (GTs) gemeinsam ist. Somit weist das Protein offenbar eine Struktur dergestalt auf, dass die 27 N-terminalen Aminosäurereste um Cytoplasma sind, die nachfolgende, in hohem Maße hydrophobe Region, die aus 22 Aminosäuren aufgebaut ist, membrangebunden ist und den verbleibenden C-terminalen Teil (einschließlich der katalytischen Stelle) dem Inneren des Golgi-Apparates exponiert. Ein Vergleich mit den bekannten Aminosäuresequenzen von Glycosyltransferasen zeigte, dass das Protein zum Teil homolog ist zu zwei Species von 2,3-Sialyltransferase [Dawn X. Wen et al.: Journal of Biological Chemistry, 267, 21011 (1992); William Gillespie et al.: Journal of Biological Chemistry, 267, 21004 (1992)] und 2,6-Sialyltransferase [Jasminder Weinstein et al.: Journal of Biological Chemistry, 262, 17735 (1987)]. Auf der Grundlage der Erkenntnisse, dass die Expression von WP1 in Namalwa-Zellen zu einer gesteigerten Expression des Gangliosids GD3 führt, dass das von WP1 codierte Protein zu Sialyltransferasen homolog ist und dass das von WP1 codierte Protein sich in der Aminosäuresequenz von bekannten Sialyltransferase-Spezies unterscheidet, wird angenommen, dass WP1 eine neue Sialyltransferase-Spezies codiert.
  • Als Wirt verwendete Namalwa-Zellen ermöglichen die Expression des Gangliosids GM3, jedoch nicht die Expression des Gangliosids GD3. Das Gangliosid GD3 wird aus dem Gangliosid GM3 gebildet, nachdem über eine α-2,8-Verknüpfung eine Addition eines Sialylsäurerests an den terminalen Sialylsäurerest von GM3 erfolgte. Ein Enzym, das diese Reaktion katalysiert, ist α-2,8-Sialyltransferase. In Anbetracht der oben genannten Ergebnisse wird daher angenommen, dass WP1 eine α-2,8-Sialyltransferase codiert.
  • Beispiel 2
  • Synthese des Gangliosids GD3 in einem KJM-1-Stamm, der ein α-2,8-Sialyltransferase-Expressionsplasmid trägt
  • Die Plasmide pAMoPRC3Sc (direkter Expressionsklonierurigsvektor; Kontrolle) und pAMoPRWP1 (α-2,8-Sialyltransferase-Expressionsplasmid) wurden unter Verwendung des Plasmidherstellungskits > Plasmid < maxi kit (Artikelnummer 41031) von Quiagen hergestellt. Die erhaltenen Plasmide wurden mit Ethanol gefällt und dann in TE-Puffer mit einer Konzentration von 1 μg/μl gelöst. Anschließend wurde jedes Plasmid über die Elektroporationstechnik [Miyaji et al.: Cytotechnology, 3, 133 (1990)] in Namalwa KJM-1-Zellen eingeführt. Nach Einführung von 4 μg Plasmid pro 1,6 × 106 Zellen wurden die Zellen in 8 ml RPMI1640-ITPSGF-Medium suspendiert und 24 Stunden bei 37°C in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert. Anschließend wurde G418 (Gibco) bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugegeben und die Kultivierung 7 Tage fortgesetzt. Danach wurden 22 ml RPMI1640-ITPSGF-Medium (das 0,5 mg/ml G418 enthielt) zugegeben und die Kultivierung 5 Tage weiter durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltenen Transformanten wurden in RPMI1640-ITPSGF-Medium kultiviert, das 0,5 mg/ml G418 enthielt. Etwa 1 × 106 Zellen wurden in ein Mikrogefäß (1,5 ml; Eppendorf) gegeben und Zellen durch Zentrifugation geerntet (550 × g, 7 Minuten). Die Zellen wurden anschließend mit 1 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen, die 0,1% Natriumazid enthielt (A-PBS; 8 g/l Natriumchloridl, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,15 g/l Dinatriumhydrogenphosphat (wasserfrei), 0,2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Natriumazid). Mit den geernteten Zellen wurde unter Verwendung von KM-643 ( EP-A-0493686 ), einem Antikörper gegen das Gangliosid GD3, eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um die Expression von GD3 in diesen Zellen zu überprüfen. Dementsprechend wurde jeder Charge der geernteten Zellen 50 μl (10 μg/ml) KM-643 zur Supendierung der Zellen darin zugegeben und die Reaktion 1 Stunde bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden mit 3 Aliquoten A-PBS gewaschen, 20 μl eines mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Fluoreszenz-markierten anti-Maus-IgG-Antikörpers und IgM-Antikörpers (Produkt von Kirkegaad & Perry Laborstories; 16fach verdünnt mit A-PBS) zugegeben, um die Zellen zu suspendieren, und die Reaktion wurde 30 Minuten bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden mit 3 Aliquoten A-PBS gewaschen, erneut in A-PBS suspendiert und mit einem EPICS Elite Durchflusscytometer (Coulter) analysiert. Als Kontrolle wurde die gleiche Vorgehensweise wie oben beschrieben angewendet, wobei ein normales Mausserum (500fach mit A-PBS verdünnt) anstelle von KM-643-verwendet wurde.
  • Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in 17 gezeigt. In den KJM-1-Zellen nach Einführung des direkten Expressionsklonierungsvektors pAMoPRC3Sc (Kontrollplasmid) war die Fluoreszenzintensität der mit KM-643 gefärbten Zellen ungefähr dieselbe wie die Fluoreszenzintensität in der Kontrolle, was bestätigt, das es in den KJM-1-Zellen keine Expression des Gangliosids GD3 gab. Die Fluoreszenzintensität der KJM-1-Zellen, die pAMoPRWPI (α-2,8-Sialyltransferase-Expressionsplasmid) tragen, erwies sich bei Färbung mit KM-643 als etwa 25 Mal höher im Vergleich mit der Fluoreszenzintensität der pAMoPRC38c (Kontrollplasmid) tragenden Zellen bei Färbung mit KM-643. Die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass das Gangliosid GD3 durch Bewirken einer intrazellulären Expression von α-2,8-Sialyltransferase, die durch WP1 codiert wird, neu synthetisiert werden kann.
  • Beispiel 3
  • Sekretorische Herstellung von α-2,8-Sialyltransferase
  • 1. Herstellung des sekretorischen Expressionsvektors pAMoPRSA
  • (1) Konstruktion von pAGE147 (s. 18)
  • Ein Plasmid, pAGE147, wurde konstruiert, indem der Promotor des frühen Gens von SV40 in pAGE107 durch den Long Terminal Repeat (nachfolgend: LTR)-Promotor des Moloney Murine Leukemia Virus ersetzt wurde. Das Plasmid pMOL1 ( JP-A-1-63394 ; 2 μg) wurde in 30 μl Y-0-Puffer gelöst, 20 Einheiten SmaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 3 Stunden bei 30°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 50 mM zugegeben, 20 Einheiten ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment (etwa 0,6 kb), das den LTR-Promotor des Moloney Murine Leukemia Virus enthielt, wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurden 25 Picomol (pmol) jedes der zwei in Beispiel 1, Abschnitt 1-(8) synthetisierten DNA-Linker in 10 μl T4-Kinase-Puffer gelöst, 5 Einheiten T4 DNA-Kinase wurden zugegeben und die Reaktion zur Phosphorylierung am 5'-Ende wurde 30 Minuten bei 37°C durchgeführt.
  • Das aus pPMOL1 stammende ClaI-SmaI-Fragment (0,6 kb; 0,05 μg) und zwei 5'-phosphorylierte DNAs (jeweils 1 Picomol), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, und ein HindIII-Linker (5'-pCAAGCTTG-3'; Takara Shuzo; 1 Picomol) wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 200 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde durch Fällung mit Ethanol gewonnen und in Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol und Chloroform beendet und das DNA-Fragment durch Fällung mit Ethanol gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde 1 μg pAGE107 [ JP-A-3-22979 ; Miyaji et al.: Cytotechnolgy, 3, 133 (1990)] in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment (etwa 6,0 kb), welches das G418-Resistenzgen und das Ampicillin-Resistenzgen enthielt, wurde gewonnen.
  • Das aus pAGE107 stammende HindIII-Xhol-Fragment (6,0 kb; 0,3 μg) und das aus pMOL1 stammende HindIII-Xhol-Fragment (0,6 kb; 0,01 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 20 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 200 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillinresistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAGE147 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (2) Konstruktion von pAGE247 (s. 19)
  • Ein Plasmid, pAGE247, wurde auf die unten beschriebene Weise konstruiert, indem der Promotor des frühen Gens von SV40 in pAGE207 durch den LTR-Promotor des Moloney Murine Leukemia Virus ersetzt wurde.
  • Oben erhaltenes pAGE147 (2 μg) wurde in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment (etwa 0,63 kb), welches den LTR-Promotor des Moloney Murine Leukemia Virus enthielt, wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde das in Beispiel 1, Abschnitt 1-(11) konstruierte pAGE207 (2 μg) in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten HindIII und 10 Einheiten XhoI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment (etwa 5,84 kb), welches das Hygromycin-Resistenzgen und das Ampicillin-Resistenzgen enthielt, wurde gewonnen.
  • Das aus pAGE147 stammende HindIII-Xhol-Fragment (0,63 kb; 0,05 μg) und das aus pAGE207 stammende HindIII-Xhol-Fragment (5,84 kb; 0,1 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 100 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAGE247 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (3) Konstruktion von pAMNohyg (s. 20)
  • Ein Expressionsplasmid, pAMN6hyg, für ein Derivat des menschlichen Granulocyten-Kolonie stimulierenden Faktors wurde auf folgende Weise mit dem LTR des Moloney Murine Leukemia Virus als Promotor und dem Hygromycin-Resistenzgen als Marker konstruiert.
  • Wie oben beschrieben erhaltenes pAGE247 (2 μg) wurde in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 175 mM zugegeben, 20 Einheiten SalI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment (etwa 4,8 kb), das den LTR-Promotor des Moloney Murine Leukemia Virus, das Ampicillin-Resistenzgen und das Hygromycin-Resistenzgen enthielt, wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurde das über das in der JP-A-2-227075 offenbarte Verfahren gewonnene Plasmid pASN6 (2 μg) in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 175 mM zugegeben, 20 Einheiten SalI und 20 Einheiten MluI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment (etwa 45,0 kb), welches das Derivat-Gen des menschlichen Granulocyten-Kolonie stimulierenden Faktors enthielt, wurde gewonnen.
  • Das aus pAGE247 stammende ClaI-SalI-Fragment (4.8 kb; 0,1 μg) und das aus pASN6 stammende ClaI-SalI-Fragment (5,0 kb; 0,1 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 20 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 200 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillinresistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMN6hyg bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (4) Konstruktion von pAMoERSA (s. 21)
  • Ein Vektor, pAMoERSA, für die sekretorische Expression von α-2,8-Sialyltransferase in an die Immunglobulin G (IgG)-Bindungsregion von Protein A von Staphylococcus aureus fusionierter Form wurde auf folgende Weise konstruiert.
  • Oben erhaltenes pAMN6hyg (2 μg) wurde in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheiten SnaBI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Dann wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 100 mM zugegeben, 20 Einheiten XbaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment (etwa 0,33 kb), das die Signalsequenz des menschlichen Granulocyten-Kolonie stimulierenden Faktors enthielt, wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurden 2 μg pPrAS1 [Saito et al.: Protein Engineering, 2, 481 (1989)] in 30 μl Y-50-Puffer gelöst, 20 Einheit ClaI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Nach Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl DNA Polymerase I-Puffer gelöst, 6 Einheiten Klenow-Fragment von DNA Polymerase I, die aus Escherichia coli stammte, wurden zugegeben und die Reaktion wurde 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, um das nach Verdau mit ClaI gebildete 5'-kohäsive Ende in ein stumpfes Ende zu überführen. Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol beendet. Nach Extraktion mit Chloroform und Fällung mit Ethanol wurde das Präzipitat in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten BamHI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment (etwa 0,21 kb), das die IgG-Bindungsregion von Protein A enthielt, wurde gewonnen.
  • Weiterhin wurden unabhängig davon 2 μg pAMOERC3Sc, das in Beispiel 1, Abschnitt 1-(13) gewonnen worden war, in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten XbaI und 20 Einheiten BamHI wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 12,1 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAMN6hyg stammende SnaBI-XbaI-Fragment (0,33 kb; 0,05 μg), das aus pPrAS1 abgeleitete ClaI-(stumpfes Ende)-BamHI-Fragment (0,21 kb; 0,05 μg) und das aus pAMOERC3Sc stammende XbaI-BamHI-Fragment (12,1 kb; 0,1 μg), die jeweils wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoERSA bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • (5) Konstruktion von pAMoPRSA (s. 22)
  • Ein Plasmid, pAMoPRSA, wurde auf folgende Weise durch Entfernen des EBNA-1-Gens aus pAMoERSA hergestellt. pAMoPRSA kann wie pAMoERSA als sekretorischer Expressionsvektor verwendet werden.
  • pAMoERSA (2 μg) wurde in 30 μl eines Puffer gelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 80 mM NaCl und 6 mM 2-Mercaptoethanol umfassten (nachfolgend hier als „Y-80-Puffer" bezeichnet), 20 Einheiten XbaI und 20 Einheiten Asp718 (Boehringer Mannheim) wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 1,3 kb wurde gewonnen. Unabhängig davon wurden 2 μg pAMoPRC3Sc in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten XbaI und 20 Einheiten Asp718 wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 8,5 kb wurde gewonnen.
  • Das aus pAMoERSA stammende Xbal-Asp718-Fragment (1,3 kb; 0,05 μg) und das aus pAMoPRC3Sc stammende Xbal-Asp718-Fragment (8,5 kb; 0,1 μg), die wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli HB101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillin-resistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoRPSA bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • 2. Konstruktion des Plasmids pAMOPRSAWP1 zur sekretorischen Expression von α- 2,8-Sialyltransferase (s. 23)
  • Auf der Grundlage seiner Primärsequenz weist die klonierte α-2,8-Sialyltransferase vermutlich eine Struktur dergestalt auf, dass die N-terminalen 29 Aminosäurereste sich in das Cytoplama erstrecken, die anschließende Region, die aus 19 Aminosäureresten besteht und hohe Hydrophobizität aufweist, an die Membran bindet, und der verbleibende C-terminale Teil (einschließlich der katalytischen Stelle) im Inneren des Golgi-Apparates exponiert ist. Aus diesem Grund wurde ein Versuch unternommen, die sekretorische Herstellung von α-2,8-Sialyltransferase herbeizuführen, indem der N-terminale Teil einschließlich der Membran bindenden Region entfernt wurde und stattdessen die Signalsequenz des menschlichen Granulocyten-Kolonie stimulierenden Faktors und die IgG-Bindungsregion von Protein A hinzugefügt wurde. Für die vermutliche katalytische Stelle. [vom 57. Aminosäurerest (Isoleucin) bis zum 356. Aminosäurerest (Serin) in SEQ ID NO:1] codierende DNA wurde über die PCR-Methode hergestellt und in den sekretorischen Expressionsvektor pAMoPRSA insertiert, der auf die oben beschriebene Weise hergestellt worden war.
  • Die folgenden zwei synthetischen DNAs [P1-N (36mer) und P1-C (37mer)] wurden mit einem Applied Biosystem Modell 380A DNA-Synthesizer zur Verwendung als Primer für die PCR synthetisiert.
    P1-N (36mer)
    5'-CTCTCGGATATCCGATCGTGCAGGGGGTGCTGCAAC-3'
    P1-C (37mer)
    5'-GTCAACGGTACCTTCCTAGGAAGTGGGCTGGAGTGAG-3'
  • Da P1-N (36mer; SEQ ID NO:6) dafür entworfen ist, dass eine EcoRV-Schnittstelle darin eingeführt wird, und P1-C (37mer; SEQ ID NO:7) dafür entworfen ist, dass eine Asp718-Schnittstelle darin eingeführt wird, kann nach Schneiden mit EcoRV und Asp718 das über PCR amplifizierte DNA-Fragment zwischen den StuI- und Asp718-Schnittstellen in pAMOPRSA insertiert werden. Die PCR wurde unter Verwendung eines Kits von Takara Shuzo durchgeführt (GeneAmpTM DNA Amplification Reagent Kit mit AmpliTaqTM Recombinant Taq DNA Polymerase). Die Reaktionslösung wurde gemäß der Beschreibung in dem Handbuch, das dem Kit beilag, hergestellt, und die Reaktionsschritte (94°C, 1 Minute; 65°C, 1 Minute; und 72°C, 3 Minuten), für die ein Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler (von Takara Shuzo bezogen) verwendet wurde, wurden für insgesamt 20 Zyklen wiederholt, und die Reaktion wurde anschließend 7 Minuten bei 72°C weiter durchgeführt. Das Plasmid pUC119-WP1R (70 ng) wurde als Template verwendet. Nach Abschluss der Reaktion wurden eine Chloroform-Extraktion und eine Ethanolfällung durchgeführt. Das Präzipitat wurde in 30 μl Y-80-Puffer gelöst, 20 Einheiten Asp718 wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 150 mM zugegeben, 20 Einheiten EcoRV wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 0,9 kb wurde gewonnen.
  • Unabhängig davon wurden 2 μg pAMoPRSA in 30 μl Y-100-Puffer gelöst, 20 Einheiten StuI und 20 Einheiten Asp718 wurden zugegeben und die Verdaureaktion wurde 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Mit dem Reaktionsgemisch wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt und ein DNA-Fragment von etwa 9,06 kb wurde gewonnen.
  • Das aus der PCR-amplifzierten DNA stammende EcoRV-Asp718-Fragment (0,9 kb; 0,1 μg) und das aus pAMoPRSA stammende StuI-Asp718-Fragment (9,06 kb; 0,1 μg), die wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden in 30 μl T4-Ligase-Puffer gelöst, 175 Einheiten T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligationsreaktion wurde 16 Stunden bei 12°C durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli 101 gemäß der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und man erhielt einen Ampicillinresistenten Stamm. Aus dieser Transformante wurde über eine bekannte Methode ein Plasmid isoliert. Das Plasmid wurde als pAMoPRSAWP1 bezeichnet und seine Struktur durch Verdau mit Restriktionsenzymen identifiziert.
  • 3. Sekretorische Herstellung von α-2,8-Sialyltransferase unter Verwendung von Namalwa-KJM-1-Zellen als Wirt
  • Die Plasmide pAMoPRSA (sekretorischer Herstellungsvektor) und pAMoPRSAWP1 (Plasmid für sekretorische Expression von α-2,8-Sialyltransferase), die wie oben beschrieben erhalten worden waren, wurden unter Verwendung des Plasmidherstellungskits > Plasmid < maxi kit (Artikelnummer 41031) von Quiagen gewonnen. Die hergestellten Plasmide wurden in TE-Puffer in einer Konzentration von 1 μg/μl gelöst. Dann wurden beide Plasmide durch Elektroporation [Miyaji et al.: Cytotechnology, 3, 133 (1990)] in Namalwa-KJM-1-Zellen eingeführt. Nach Einführung von 4 μg Plasmid pro 1,6 × 106 Zellen wurden die Zellen in 8 ml RPM11640-ITPSGF-Medium suspendiert und 24 Stunden bei 37°C in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert. Dann wurde G418 (Gibco) bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugegeben und die Kultivierung 7 Tage fortgesetzt. Danach wurden 22 ml RPM11640-ITPSGF-Medium (die 0,5 mg/ml G418 enthielten) zugegeben und die Kultivierung 5 Tage weiter fortgesetzt. Die auf diese Weise erhaltenen Transformanten wurden in einer Konzentration von 5 × 104 Zellen/ml in 30 ml RPM11640-ITPSGF-Medium suspendiert, das 0,5 mg/ml G418 enthielt, und 8 Tage bei 37°C in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation (160 × g, 10 Minuten) geerntet und der Überstand wurde gewonnen und erneut zentrifugiert (1.500 × g, 10 Minuten), woraufhin der Überstand gewonnen wurde. Die auf diese Weise erhaltenen Kulturüberstände wurden bis zur Verwendung bei –80°C aufbewahrt.
  • Die vom Plasmid pAMoPRSAWP1 codierte α-2,8-Sialyltransferase wird auf die sektretorische Weise in Form eines Proteins exprimiert, das mit der IgG-Bindungsregion von Protein A fusioniert ist, und kann daher unter Verwendung von IgG Sepharose einfach aufgereinigt werden. Daher wurde zu dem auf die oben beschriebene Weise erhaltenen Kulturüberstand Natriumazid bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben, 15 μl IgG Sepharose (Pharmacia), die gemäß dem beiliegenden Handbuch vorbehandelt war, wurden zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C leicht gerührt. Anschließend wurde die IgG Sepharose durch Zentrifugation (160 × g, 10 Minuten) gewonnen und mit drei 1 ml-Aliquoten phosphatgepufferter Saline [PBS; 8 g/l Natriumchlorid, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,15 g/l Dinatriumhydrogenphosphat (wasserfrei), 0,2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Natriumazid] gewaschen und in 20 μl RPMI1640-Medium (serumfrei) suspendiert. Unter Verwendung dieser IgG-Sepharose-Suspension wurde die GD3-Synthetase-Aktivität über die herkömmliche Methode bestimmt [Samuelson: Methods in Enzymology, 138, 567; Basu et al.: Methods in Enzymology, 138, 575]. Nach 4-stündiger Durchführung der Reaktion in 10 μl eines Assay-Gemisches [0,1 M Cacodylsäure-Hydrochlorid (pH 6,0), 20 mM Manganchlorid, 1% Triton, 120 μM CMP-[14C]-Sialylsäure (Amersham), 10 μg Substrat-Glycolipid, die oben erwähnte IgG-Sepharose-Suspension (5 μl)] bei 37°C wurden 200 μl PBS zugegeben und das erhaltene Gemisch auf eine C-18-Säule (100 mg; Whatman) aufgetragen. Nach Waschen mit 3 ml Wasser wurde das an die Säule adsorbierte Glycolipid mit 1 ml Methanol und 1 ml Chloroform-Methanol (1:1) eluiert und das Lösungsmittel mit gasförmigem Stickstoff abdestilliert. Anschließend wurde das Glycolipid in 10 μl Chloroform gelöst und damit eine Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (nachfolgend hier als „HPTLC" bezeichnet) unter Verwendung von Chloroform-Methanol-Kaliumchlorid (55:45:10) als Entwicklungslösungsmittel-System durchgeführt. Die HPTLC-Platte nach der Chromatographie wurde mit einem Bioimaging-Analyser des Modells BAS2000 (Fujix) zur Identifizierung und Quantifizierung des radiomarkierten Produkts analysiert. Die verwendeten Substrate waren Lactosylceramid (nachfolgend hier als „LacCer" bezeichnet) und die Ganglioside GM3, GM2, GM1b, GD3, GD1a, GD1b und GT1b. GM3 und GD3 wurden über die herkömmliche Methode [Hanai et al.: Journal of Biological Chemstry, 263, 10915–10921 (1988); Hanai et al.: Anticancer Reserach, 10, 1579–1586 (1990)] hergestellt. LacCer, GM2, GM1b, GD1a und GD1b wurden von Sigma bezogen. GT1b wurde von der Biosynth AG bezogen. Die Produktidentifizierung erfolgte durch Vergleich der Position nach Entwicklung mit der Position von Standard-Glycolipiden. Die Standard-Glycolipide wurden unter Verwendung von Oricinol-Schwefelsäure nachgewiesen. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in 24 gezeigt. Bei Verwendung der IgG-Sepharose, die durch Mischen mit Kulturüberstand von Namalwa-Zellen, die das darin eingeführte pAMoPRSAWP1 tragen, behandelt wurde, wurde GD3-Synthetase-Aktivität (Aktivität, welche die Synthese von GD3 aus GM3 synthetisiert) nachgewiesen (das in 1 ml Medium hergestellte sekretorische Enzym bewirkte die Herstellung von 0,1 Picomol GD3 pro Stunde), während keine derartige Aktivität nachgewiesen wurde, wenn die IgG-Sepharose verwendet wurde, die vom Kulturüberstand von Namalwa-Zellen, die den darin eingeführten Vektor pAMoPRSA trugen, abgeleitet wurde. Da kein anderes Glycolipid außer GM3 als Substrat der von pAMoPRSAWP1 codierten Sialyltransferase fungierte, wurde weiterhin gezeigt, dass die Sialyltransferase eine α-2,8-Sialyltransferase (GD3-Synthetase) mit hoher Substratspezifität für GM3 ist (24).
  • Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäße α-2,8-Sialyltransferase fusioniert mit der IgG-Bindungsregion von Protein A von Staphylococcus aureus im Kulturüberstand hergestellt werden kann und dass das Sekretionsprodukt unter Verwendung von IgG-Sepharose einfach gewonnen und aufgereinigt werden kann.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Wie hier im Detail oben beschrieben wird durch die vorliegende Erfindung eine α-2,8-Sialyltransferase bereitgestellt, die beispielsweise brauchbar ist für die Herstellung von Kohienhydratketten mit einer nützlichen physiologischen Aktivität, beispielsweise des Gangliosids GD3 und Modifikationen davon.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
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  • Figure 00530001
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
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  • Figure 00590001
  • Figure 00600001

Claims (20)

  1. α-2,8-Sialyltransferase in isolierter Form, umfassend die in SEQ ID NO. 2 definierte Aminosäurensequenz.
  2. cDNA, codierend die α-2,8-Sialyltransferase nach Anspruch 1 oder eine dazu homologe DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit α-2,8-Sialyltransferaseaktivität codiert.
  3. DNA, umfassend die in SEQ ID NO. 1 definierte Basensequenz.
  4. Rekombinanter Vektor, enthaltend eine die α-2,8-Sialyltransferase nach Anspruch 1 codierende cDNA-Sequenz als Insert.
  5. Rekombinanter Vektor, enthaltend als Insert eine DNA-Sequenz, welche die in SEQ ID NO. 1 definierte Basensequenz umfasst.
  6. Verfahren zur Herstellung der DNA nach Anspruch 2 oder 3, umfassend: die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek durch Einfügung von unter Verwendung von aus Tierzellen extrahierter mRNA als Template hergestellter cDNA in einen Expressionsklonierungsvektor; die Einführung dieser cDNA-Bibliothek in Zellen; die Auswahl von mit einem für das Gangliosid GD3 spezifischen Antikörper stark reaktiven Zellen unter den so erhaltenen Zellen; und die Isolation einer eine α-2,8-Sialyltransferase codierenden cDNA aus diesen Zellen.
  7. Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Vektors nach Anspruch 4 oder 5, umfassend: die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek durch Einfügung von unter Verwendung von aus Tierzellen extrahierter mRNA als Template hergestellter cDNA in einen Expressionsklonierungsvektor; die Einführung dieser cDNA-Bibliothek in Zellen; die Auswahl von mit einem für das Gangliosid GD3 spezifischen Antikörper stark reaktiven Zellen unter den so erhaltenen Zellen; die Isolation einer eine α-2,8-Sialyltransferase codierenden cDNA aus diesen Zellen; und die Einfügung dieser cDNA in einen Vektor an einer von dem darin enthaltenen Promotor stromabwärts gelegenen Stelle.
  8. Verfahren zur Herstellung der α-2,8-Sialyltransferase nach Anspruch 1, umfassend die Kultivierung der den rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 oder 5 beherbergenden Zellen in einem Medium unter solchen Bedingungen, dass die DNA-Sequenz exprimiert und dadurch α-2,8-Sialyltransferase gebildet und in der Kultur akkumuliert wird, und die Gewinnung der α-2,8-Sialyltransferase aus der Kultur.
  9. Verfahren zur Herstellung einer cDNA nach Anspruch 6, wobei die Tierzellen menschliche WM266-4-Melanomzellen sind.
  10. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 7, wobei die Tierzellen menschliche WM266-4-Melanomzellen sind.
  11. Das Plasmid pUC119-WP1R, das von Escherichia coli JM105/pUC119-WP1R (FERM BP-4192) getragen wird.
  12. Eine den rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 oder 5 beherbergende Zelle.
  13. Verfahren zur Herstellung des Gangliosids GD3, umfassend: die Einführung des rekombinanten Vektors nach Anspruch 4 oder 5 in Zellen, die das Gangliosid GM3 bilden; die Kultivierung der Zellen in einem Medium unter solchen Bedingungen, dass das Gangliosid GD3 gebildet und im Medium akkumuliert wird; und die Gewinnung des Gangliosids GD3 aus der Kultur.
  14. Verfahren zur Umwandlung des Gangliosids GM3 in das Gangliosid GD3, umfassend die Verwendung der Zelle nach Anspruch 12.
  15. Verfahren zur Umwandlung des Gangliosids GM3 in das Gangliosid GD3, umfassend die Verwendung der α-2,8-Sialyltransferase nach Anspruch 1.
  16. Verfahren zur Detektion der α-2,8-Sialyltransferase nach Anspruch 1, umfassend eine Hybridisierung unter Verwendung der DNA nach Anspruch 2 oder 3.
  17. Verfahren zur Detektion der α-2,8-Sialyltransferase nach Anspruch 1, umfassend die Polymerasenkettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotiden basierend auf der Basensequenz der DNA nach Anspruch 2 oder 3.
  18. Verfahren zur Inhibition der Bildung der α-2,8-Sialyltransferase nach Anspruch 1, umfassend die Verwendung eines Oligonukleotids, das einen Teil oder die Gesamtheit der Basensequenz der DNA nach Anspruch 2 oder 3 umfasst.
  19. Ein Escherichia coli-Stamm, der den rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 oder 5 trägt.
  20. Escherichia coli JM105/pUC119-WP1R (FERM BP-4192).
DE69434974T 1993-03-29 1994-03-28 alpha-2,8 SIALYLTRANSFERASE Expired - Lifetime DE69434974T2 (de)

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JP6998893 1993-03-29
JP6998893 1993-03-29
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