DE69434465T2

DE69434465T2 - Verfahren zur Regulierung der Immunantwort durch den Gebrauch von CTLA4-Bindungsmolekülen und IL4-Bindungsmolekülen

Info

Publication number: DE69434465T2
Application number: DE69434465T
Authority: DE
Inventors: Peter S. Linsley; Jeffrey A. Ledbetter; Nitin K. Monmount Junction New Jersey Damle; William Brady; Philip M. Wallace
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2014-01-22
Also published as: JP3833723B2; EP0613944A3; ES2247585T3; PT613944E; FI940270A0; DK0613944T3; ATE302846T1; FI940270A; EP0613944A2; CA2113744C; DE69434465D1; EP0613944B1; NO940228L; IL108374A0; US5770197A; AU682325B2; IL108374A; NO940228D0; AU5390194A; NO316223B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein B7-bindendes Molekül und ein IL4-bindendes Molekül umfassende Zusammensetzungen sowie die Verwendung eines B7-bindenden Moleküls und eines IL4-bindenden Moleküls zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Regulierung von Immunantworten.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Expression des CTLA4-Rezeptorgens, die Identifizierung der Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und B7-Antigen exprimierenden Zellen, und Verfahren zur Regulierung zellulärer Wechselwirkungen, an denen der CTLA4-Rezeptor und das B7-Antigen beteiligt sind.
Hintergrund der Erfindung
Das besondere Kennzeichen des Wirbeltier-Immunsystems ist die Fähigkeit, zwischen "eigen" und "nicht eigen" (fremd) zu unterscheiden. Diese Eigenschaft hat zur Evolution eines Systems geführt, das multiple Signale benötigt, um eine optimale Immunaktivierung zu erreichen (Janeway, Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 54: 1–14 (1989)). T-Zell-B-Zell-Wechselwirkungen sind für die Immunantwort essentiell. Die Mengen vieler kohäsiver, auf T-Zellen und B-Zellen zu findender Moleküle nehmen während einer Immunantwort zu (Springer et al., (1987), s. oben; Shaw und Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Kindt und Long (Hrsg.), 1: 92–97 (1988)); und Hemler, Immunology Today 9: 109–113 (1988). Erhöhte Mengen dieser Moleküle können bei der Erklärung behilflich sein, warum aktivierte B-Zellen effektiver die antigenspezifische T-Zell-Proliferation stimulieren als ruhende B-Zellen (Kaiuchi et al., J. Immunol. 131: 109–114 (1983); Kreiger et al., J. Immunol. 135: 2937–2945 (1985); McKenzie, J. Immunol. 141: 2907–2911 (1988); und Hawrylowicz und Unanue, J. Immunol. 141: 4083–4088 (1988)).
Die Erzeugung einer T-Lymphozyt-Immunantwort ("T-Zell-Immunantwort") ist ein komplexer Prozess, an dem Zell-Zell-Wechselwirkungen (Springer et al., A. Rev. Immunol. 5: 223–252 (1987)), insbesondere zwischen T-Zellen und akzessorischen Zellen, wie B-Zellen, und die Produktion löslicher Immunmediatoren (Cytokine und Lymphokine) (Dinarello und Mier, New Engl. Jour. Med 317: 940–945 (1987)) beteiligt sind. Reguliert wird diese Antwort durch mehrere T-Zell-Oberflächenrezeptoren, zu denen der T-Zell-Rezeptorkomplex (Weiss et al., Ann. Rev. Immunol. 4: 593–619 (1986)) und andere "akzessorische" Oberflächenmoleküle (Springer et al., (1987), s. oben) gehören. Viele dieser akzessorischen Moleküle sind natürlich vorkommende Oberflächen-Differenzierungsantigene (CD-Antigene), die durch die Reaktivität monoklonaler Antikörper auf den Zelloberflächen definiert sind (McMichael (Hrsg.), Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)).
Antigenunabhängige intrazelluläre Wechselwirkungen, an denen Lymphozyt-akzessorische Moleküle beteiligt sind, sind essentiell für eine Immunantwort (Springer et al., (1987), s. oben). Beispielsweise ist die Bindung des T-Zell-assoziierten Proteins CD2 an dessen Liganden LFA-3, einem häufig exprimierten Glycoprotein (Zusammenstellung in Shaw und Shimuzu, s. oben), für die Optimierung der antigenspezifischen T-Zellaktivierung wichtig (Moingeon et al., Nature 339:314 (1988)).
An einem weiteren wichtigen Adhäsionssystem beteiligt ist die Bindung des auf Lymphozyten, Makrophagen und Granulozyten zu findenden LFA-1-Glycoproteins (Springer et al., (1987), s. oben; Shaw und Shimuzu (1988), s. oben) an dessen Liganden ICAM-1 (Makgoba et al., Nature 331: 86–88 (1988)) und ICAM-2 (Staunton et al., Nature 339: 61–64 (1989)). Die T-Zell-akzessorischen Moleküle CD8 und CD4 verstärken die T-Zelladhäsion durch Wechselwirkung mit MHC-Molekülen der Klasse I (Norment et al., Nature 336: 79–81 (1988)) bzw. der Klasse II (Doyle und Strominger, Nature 330: 256–259 (1987)). "Homing-Rezeptoren" sind für die Kontrolle der Lymphozytenmigration wichtig (Stoolman, Cell 56: 907–910 (1989)).
VLA-Glycoproteine sind Integrine, die eine Adhäsion an extrazelluläre Matrixkomponenten erfordernde Lymphozytenfunktionen zu vermitteln scheinen (Hemler, s. oben): Die CD2/LFA-3-, LFA-1/ICAM-1- und ICAM-2- sowie VLA-Adhäsionssysteme sind weit verbreitet bei einer Vielzahl von Zelltypen (Springer et al., (1987), s. oben; Shaw und Shimuzu, (1988), s. oben und Hemler, (1988), s. oben).
Zahlreiche in vitro-Studien haben gezeigt, dass Cytokine an der Erzeugung alloreaktiver Effektorzellen beteiligt sind. Beispielsweise wurden membrangebundenes IL4 und löslicher IL4-Rezeptor Mäusen getrennt voneinander verabreicht, und es wurde gezeigt, dass diese die lymphoproliferative Antwort verstärken (William C. Fanslow et al., „Regulation of Alloreactivity in vivo by IL4 and the soluble IL4 receptor" J. Immunol. 147: 535–540 (1991)). Genauer gesagt, führte die Verabreichung von IL4 an BALB/c-Mäuse zu einer leichten Verstärkung der lymphoproliferativen Antwort. Der lösliche IL4-Rezeptor dagegen unterdrückte diese Antwort auf allogene Zellen in einer dosisabhängigen Weise. Wirksame Inhibitoren der lymphoproliferativen Antwort waren des Weiteren ein neutralisierender Antikörper gegen IL4 und ein weiterer gegen löslichen IL4-Rezeptor.
Vor vielen Jahren schlug man vor, dass die B-Lymphozytenaktivierung zwei Signale erfordert (Bretscher und Cohn, Science 169:1042–1049 (1970)); nunmehr glaubt man, dass sämtliche Lymphozyten zwei Signale für ihre optimale Aktivierung benötigen, nämlich ein antigenspezifisches oder klonales Signal sowie ein zweites antigenunspezifisches Signal (Janeway, s. oben). Freeman et al. (J. Immunol. 143(8): 2714–2722 (1989)) isolierten und sequenzierten einen cDNA-Klon, der für ein vom mAk B7 erkanntes B-Zell-Aktivierungsantigen kodierte (Freeman et al., J. Immunol. 138: 3260 (1987)). Es wurde gezeigt, dass mit dieser cDNA transfizierte COS-Zellen sowohl mit markiertem mAk B7 als auch mit markiertem mAk BB-1 angefärbt werden konnten (Clark et al., Human Immunol. 16:100–113 (1986); Yokochi et al., J. Immunol. 128: 823 (1981); Freeman et al., (1989), s. oben; und Freeman et al., (1987), s. oben)). Überdies konnte die Expression dieses Antigens auf Zellen anderer Abstammung wie Monozyten nachgewiesen werden (Freeman et al., s. oben).
Die für eine T-Helferzell-Antigenantwort (T_h-Antigenantwort) erforderlichen Signale werden von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) zur Verfügung gestellt. Das erste Signal wird durch die Wechselwirkung des T-Zell-Rezeptorkomplexes (Weiss, J. Clin. Invest. 86:1015 (1990)) mit einem in Zusammenhang mit Haupthistokompatibilitätskomplex-Molekülen (MHC-Molekülen) auf der APC präsentierten Antigen initiiert (Allen, Immunol. Today 8: 270 (1987)). Dieses antigenspezifische Signal reicht nicht aus, um eine vollständige Antwort zu erzeugen; das Fehlen eines zweiten Signals kann durchaus zur klonalen Inaktivierung oder Anergie führen (Schwartz, Science 248:1349 (1990)). Das Erfordernis eines zweiten "costimulierenden", durch den MHC zur Verfügung gestellten Signals wurde in mehreren experimentellen Systemen belegt (Schwartz, s. oben; Weaver und Unanue, Immunol. Today 11:49 (1990)). Die molekulare Art dieses zweiten Signals (oder Signale) wird nicht ganz verstanden, obwohl es in einigen Fällen klar ist, dass sowohl wasserlösliche Moleküle, wie Interleukin-1 (IL-1) (Weaver und Unanue, s. oben) als auch an intrazellulärer Adhäsion beteiligte Membranrezeptoren (Springer, Nature 346: 425 (1990)) costimulierende Signale zur Verfügung stellen können.
CD28-Antigen, ein homodimeres Glycoprotein der Immunglobulin-Superfamilie (Aruffo und Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8573–8577 (1987)) ist ein auf den meisten reifen humanen T-Zellen zu findendes akzessorisches Molekül (Damle et al., J. Immunol. 131: 2296–2300 (1983)). Derzeit spricht einiges dafür, dass dieses Molekül in einem alternativen T-Zell-Aktivierungsweg arbeitet, der sich von demjenigen unterscheidet, der durch den T-Zell-Rezeptorkomplex initiiert wird. (June et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4472–4481 (1987)). Gegenüber CD28-Antigen reaktive monoklonale Antikörper (mAk) können durch verschiedene polyklonale Stimuli initiierte T-Zellantworten verstärken (Zusammenstellung durch June et al., s. oben). Diese stimulierenden Wirkungen können von einer mAk-induzierten Cytokinproduktion (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 1333–337 (1989); und Lindsten et al., Science 244: 339–343 (1989)) in Folge erhöhter mRNA-Stabilisierung (Lindsten et al., (1989), s. oben) herrühren. Anti-CD28-mAk können auch hemmend wirken, d.h. sie können autologe gemischte Lymphozytenreaktionen (Damle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5096–6001 (1981)) und die Aktivierung antigenspezifischer T-Zellklone (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 16: 1289–1296 (1986)) blockieren.
Untersuchungen haben gezeigt, dass CD28 ein Gegenrezeptor für das B-Zell-Aktivierungsantigen B7/BB-1 ist (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87: 5031–5035 (1990)). Zur Vereinfachung wird das B7/BB-1-Antigen nachfolgend als "B7-Antigen" bezeichnet.
Man hat Wechselwirkungen zwischen CD28 und B7-Antigen charakterisiert, indem man extrazelluläre Abschnitte des B7-Antigens und CD28-Rezeptors mit Immunglobulin (Ig) Cγ1 (konstante Region der schweren Ketten) genetisch fusioniert hat (Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721–730 (1991)). Es wurde gezeigt, dass immobilisiertes B7Ig-Fusionsprotein ebenso wie B7-positive CHO-Zellen die T-Zellproliferation costimulieren.
Auch die T-Zellstimulation mit B7-positiven CHO-Zellen stimuliert spezifisch erhöhte Spiegel an Transkripten für IL-2. Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass anti-CD28-mAk die durch zelluläre Wechselwirkungen mit einer B-Zell-Leukämie-Linie induzierte IL-2-Produktion in gewissen T-Zell-Leukämie-Zelllinien inhibierte (Kohno et al., Cell. Immunol. 131: 1–10 (1990)).
CD28 besitzt eine einzelne extrazelluläre, der variablen (V)-Region ähnliche Domäne (Aruffo und Seed, s. oben). Ein homologes Molekül, CTLA4, wurde durch differentielles Screenen einer murinen, cytologischen T-Zell-cDNA-Bank identifiziert (Brunet et al., Nature 328: 267–270 (1987)).
Es wurden Transkripte für dieses Molekül in T-Zellpopulationen mit cytotoxischer Aktivität gefunden, was nahe legt, dass CTLA4 bei der cytolytischen Antwort wirken könnte (Brunet et al., s. oben; und Brunet et al., Immunol. Rev. 103: 21–36 (1988)). Forscher haben über die Klonierung und Kartierung eines Gens für das humane Gegenstück von CTLA4 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901–1905 (1988)) in demselben chromosomalen Abschnitt (2q33–34) wie CD28 berichtet (Lafage-Pochitaloff et al., Immunogenetics 31: 198–201 (1990)).
Ein Sequenzvergleich zwischen dieser humanen CTLA4-DNA und derjenigen für CD28-Proteine kodierenden ergibt signifikante Sequenzhomologien, wobei das Maß an Homologie im Zwischenmembranbereich und in cytoplasmatischen Abschnitten am größten ist (Brunet et al., 1988, s. oben; Dariavach et al., 1988, s. oben)).
Das hohe Maß an Homologie zwischen CD28 und CTLA4 zusammen mit der Colokalisierung ihrer Gene wirft die Frage auf, ob diese Moleküle auch funktionell miteinander in Beziehung stehen. Da allerdings das Proteinprodukt von CTLA4 noch nicht mit Erfolg exprimiert werden konnte, bleibt die Frage unbeantwortet.
Die Expression löslicher Derivate von Zelloberflächen-Glycoproteinen der Immunglobulingen-Superfamilie wurde für CD4, dem Rezeptor für HIV-1, und für CD28- und B7-Rezeptoren vollbracht, indem man Hybridfusionsmoleküle verwendete, die aus DNA-Sequenzen bestanden, welche Aminosäuren kodierten, die Abschnitten der mit Antikörperdomänen (Immunglobulin γ1) fusionierten extrazellulären Domäne des CD4-Rezeptors entsprachen (Capon et al., Nature 337: 525–531 (1989) (CD4) und Linsley et al., J. Exp. Med., s. oben (CD28 und B7)).
Es besteht ein Bedarf für die vorliegende Erfindung. Gegenwärtig basieren die Haupttherapien zur Verhinderung einer Organtransplantatabstoßung auf panimmunsuppressiven Wirkstoffen wie Cyclosporin A oder monoklonalen Antikörpern (mAk) gegen CD3. Diese Wirkstoffe müssen von dem Individuum häufig ein Leben lang genommen werden, unterdrücken das gesamte Immunsystem und führen oftmals zu sekundären Gesundheitsbeeinträchtigungen wie dem vermehrten Auftreten von Infektionen und Krebs.
WO-A-93/00431 stellt die vollständige und korrekte DNA-Sequenz zur Verfügung, welche die dem CTLA4-Rezeptorprotein entsprechende Aminosäuresequenz kodiert, und identifiziert das B7-Antigen als einen natürlichen Liganden für den CTLA4-Rezeptor. Es ist beschrieben, dass das humane CTLA4-Rezeptorprotein von 187 Aminosäuren kodiert ist und eine neu identifizierte N-verknüpfte Glykosilierungsstelle beinhaltet. Dieses Dokument beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Expression der DNA als CTLA4-Immunglobulin-(Ig)-Fusionsproteinprodukt. Zu den Ausführungsformen gehören CTLA4Ig-Fusionsprotein und Hybridfusionsproteine, einschließlich von CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionsproteinen. Auch werden Verfahren zur Verwendung des CTLA4-Fusionsproteins, B7Ig-Fusionsproteins, der Hybridfusionsproteine, und von Fragmenten und/oder Derivaten davon, wie monoklonalen Antikörpern, die mit CTLA4 und dem B7-Antigen reaktiv sind, zur Regulation zellulärer Wechselwirkungen und Immunantworten zur Verfügung gestellt.
Es sind eine Vielzahl von Molekülen beschrieben worden, die in B-Zell/T-Zell-Wechselwirkungen, die über den (die) B7/CD28/CTLA4-Weg(e) vermittelt sind, einzugreifen vermögen. Unter diesen finden sich B7-bindende Moleküle wie CTLA4Ig-Fusionsproteine (WO-A-93/00431; Tan et al., J. Exp. Med. 177: 165–173; Linsley e al, Science 257: 792–795 (1992); Lenschow et al., Science 257: 789–792 (1992); Schwarz et al., Cell 71: 1065–1068 (1992)), lösliches CD28 und lösliche Derivate und Analoga davon (WO-A-92/15671), CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsproteine (WO-A-93/00431), anti-B7 monoklonale Antikörper (WO-A-93/00431) sowie CTLA4-bindende Moleküle wie B7Ig-Fusionsproteine und mit CTLA4 reaktive monoklonale Antikörper (WO-A-93/00431).
Besagte B7- oder CTLA4-bindende Moleküle sollen für die Regulation von Immunantworten in vivo und in vitro nützlich sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die ein B7-bindendes Molekül und ein IL4-bindendes Molekül umfassen, zur Verwendung bei der Regulierung einer Immunantwort durch Blockieren einer B7-Wechselwirkung mit Lymphozyten, insbesondere B7-positiven Lymphozyten. Die Immunantwort ist insbesondere eine B-Zellantwort, was zur Inhibierung der Antikörperproduktion führt, eine T-Zellantwort, was zur Inhibierung der zellvermittelten Immunität führt, oder die Immunantwort ist eine Inhibierung der Lymphozytenproliferation.
Einer besonderen Ausführungsform zufolge ist die Zusammensetzung bei der Inhibierung der Transplantatabstoßung in einem Wesen zu verwenden, wobei das Wesen ein Empfänger eines transplantierten Gewebes ist.
Einer weiteren besonderen Ausführungsform zufolge ist die Zusammensetzung bei der Inhibierung der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung zu verwenden.
Einer Ausführungsform zufolge ist das B7-bindende Molekül ein CTLA4Ig-Fusionsprotein. Insbesondere ist das CTLA4Ig-Fusionsprotein ein Fusionsprotein, das eine erste Aminosäuresequenz, welche die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 125 der der extrazellulären Domäne von CTLA4 entsprechenden Aminosäuresequenz enthält, und eine zweite Aminosäuresequenz, welche den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem Immunglobulin Cγ1 entsprechende Aminosäurereste enthält, aufweist.
Einer weiteren Ausführungsform zufolge ist das B7-Molekül ein CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsprotein. Insbesondere ist das CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsprotein ein Hybridfusionsprotein, das eine erste, einem Abschnitt der extrazellulären Domäne des CD28-Rezeptors entsprechende Aminosäuresequenz in Fusion mit einer zweiten, einem Abschnitt der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors entsprechenden Aminosäuresequenz und eine dritte, den Hinge, CH2- und CH3-Regionen von humanem Immunglobulin Cγ1 entsprechende Aminosäuresequenz aufweist.
Einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zufolge ist das IL4-bindende Molekül ein monoklonaler Antikörper, der IL4 spezifisch erkennt und bindet. Alternativ ist das IL4-bindende Molekül ein löslicher IL4-Rezeptor, der IL4 erkennt und bindet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines B7-bindenden Moleküls und eines IL4-bindenden Moleküls zur Herstellung einer wie oben definierten pharmazeutischen Zusammensetzung zur Regulierung einer Immunantwort durch Blockieren einer B7-Wechselwirkung mit Lymphozyten, insbesondere B7-positiven Lymphozyten. Insbesondere ist die Immunantwort eine B-Zellantwort, was zur Inhibierung der Antikörperproduktion führt, eine T-Zellantwort, was zur Inhibierung der zellvermittelten Immunität führt, oder die Immunantwort ist eine Inhibition der Lymphozytenproliferation.
Das erfindungsgemäße CTLA4Ig-Fusionsprotein bindet an das auf aktivierten B-Zellen und Zellen anderer Linien exprimierte B7-Antigen, einen Liganden für den CD28-Rezeptor auf T-Zellen. CTLA4Ig bindet B7-Antigen mit signifikant höherer Affinität als B7 an den CD28-Rezeptor bindet. Das CTLA4Ig-Konstrukt besitzt eine erste Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors entspricht und mit einer zweiten Aminosäuresequenz fusioniert ist, die der humanen Ig-Cγ1-Domäne entspricht. Die erste Aminosäuresequenz enthält Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entspricht, und ist mit einer zweiten Aminosäuresequenz verbunden, die Aminosäurereste enthält, welche den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des humanen IgCγ1 entspricht. Das Fusionsprotein wird vorzugsweise in dimerer Form hergestellt. Lösliches CTLA4Ig ist in vitro ein starker Inhibitor von T- und B-Lymphozytenantworten.
Ebenfalls von der Erfindung mitumfasst sind Hybridfusionsproteine, wie CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionsproteine, mit einer ersten Aminosäuresequenz, die Fragmenten der extrazellulären Domäne von CD28 entspricht, und die verbunden ist mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die Fragmenten der extrazellulären Domäne von CTLA4Ig entspricht, und einer dritten Aminosäuresequenz, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des humanen IgCγ1 entspricht. Eine Ausführungsform des Hybridfusionsproteins ist ein CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionskonstrukt mit einer ersten Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 94 derjenigen Aminosäuresequenz enthält, die der extrazellulären Domäne von CD28 entspricht, und die verbunden ist mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste von etwa Position 94 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz enthält, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entspricht, und die verbunden ist mit einer dritten Aminosäuresequenz, die diejenigen Aminosäurereste enthält, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des humanen IgCγ1 entsprechen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Regulierung von T-Zell-Wechselwirkungen mit B7-positiven Zellen, wobei man einen Liganden für das B7-Antigen verwendet. Ein derartiger Ligand ist das erfindungsgemäße CTLA4Ig-Fusionsprotein, dessen Fragmente oder Derivate, das CD28Ig/CTLA4Ig- Hybridfusionsprotein, oder ein gegenüber dem B7-Antigen reaktiver monoklonaler Antikörper.
Des weiteren umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, die über T-Zell-Wechselwirkungen mit B7-positiven Zellen vermittelt werden, wobei man einen gegenüber B7-Antigen reaktiven Liganden zur Regulierung von T-Zell-Wechselwirkungen mit B7-positiven Zellen verabreicht. Der Ligand ist das CTLA4Ig-Fusionsprotein, oder das CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsprotein, oder ein gegenüber B7-Antigen reaktiver monoklonaler Antikörper.
Eine Ovarzelllinie von chinesischen Hamstern, die CTLA4Ig-Fusionsprotein stabil exprimiert, wird ebenfalls offenbart.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Diagrammdarstellung des CTLA4Ig-Fusionskonstrukts, so unten in Beispiel 2 beschrieben.
2 ist eine Fotografie eines Gels, das durch SDS-PAGE-chromatographische Reinigung von CTLA4Ig erhalten wurde, so unten in Beispiel 2 beschrieben.
3 zeigt die komplette Aminosäuresequenz, die den mit dem Oncostatin M-Signalpeptid (Position –25 bis –1) fusionierten, humanen CTLA4-Rezeptor (SEQ ID Nrn: 13 und 14) kodiert und die neu identifizierte N-verknüpfte Glycosylierungsstelle (Position 109–111) mit einbezieht, so unten in Beispiel 3 beschrieben.
4 zeigt die Resultate der FACS^R-Analyse für die Bindung des B7Ig-Fusionsproteins an CD28- und CTLA4-transfizierte COS-Zellen, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
5 zeigt die Resultate der FACS^R-Analyse für die Bindung von gereinigtem CTLA4Ig an B7-Antigen-positive (B7⁺) CHO-Zellen und an eine lymphoblastoide Zellinie (PM-LCL), so unten in Beispiel 4 beschrieben.
6 ist ein Graph, der die kompetitive Bindungsanalyse von ¹²⁵I-markiertem B7Ig an immobilisiertes CTLA4Ig veranschaulicht, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
7 ist ein Graph, der die Resultate der Scatchard-Analyse für die Bindung von ¹²⁵I-markiertem B7Ig an immobilisiertes CTLA4Ig zeigt, so in Beispiel 4 unten beschrieben.
8 ist eine Fotografie eines Gels aus der SDS-PAGE-Chromatographie der Immunpräzipitationsanalyse von B7-positiven CHO-Zellen und ¹²⁵I-markierten PM-LCL-Zellen, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
9 ist ein Graph, der die mit [³H]-Thymidin-Einbau gemessenen Wirkungen von CTLA4Ig auf die Proliferation von T-Zellen zeigt, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
10 ist ein Balkendiagramm, das die mit Enzym-Immunoassay (ELISA) bestimmten Wirkungen von CTLA4Ig auf die T-Helferzell (T_h)-induzierte Immunglobulinsekretion durch humane B-Zellen veranschaulicht, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
Die 11A, 11B und 11C sind Kurvendiagramme, die das Überleben von humanen Pankreasinsel-Xenotransplantaten zeigen.
Die 12A, 12B, 12C und 12D sind Fotografien histopathologischer Schnitte humaner Inseln, die unter die Nierenkapsel von B10-Mäusen transplantiert wurden.
13 ist ein Kurvendiagramm, das das verlängerte Überleben von Inseltransplantaten mit monoklonalem Antikörper gegen humanes B7 zeigen.
14 ist ein Kurvendiagramm, das die Induktion eines donorspezifischen Nichtansprechens auf Inseltransplantatantigene durch CTLA4Ig zeigt.
15 ist ein Kurvendiagramm, das die Antikörper-Serumspiegel von Mäusen zeigt, denen Schaferythrozyten (SRBC), mAk L6 und Ratten-Ig, mAk L6 und anti-IL4, CTLA4Ig und Ratten-Ig, CTLA4Ig und anti-IL4 injiziert wurden. Die X-Achse stellt ein Maß für den Antikörperserumtiter dar. Die Y-Achse stellt ein Maß für die Zeit in Tagen dar. Die ausgefüllten Vierecke stehen für Mäuse, denen SRBC an Tag 0 und Tag 46 injiziert wurden. Die nicht ausgefüllten Vierecke stehen für Mäuse, denen SRBC an Tag 46 injiziert wurden. Die ausgefüllten Kreise stehen für Mäuse, denen mAk L6 und Ratten-Immunglobulin injiziert wurden. Die nicht ausgefüllten Kreise stehen für Mäuse, denen mAk L6 und anti-IL4-Antikörper injiziert wurden. Die ausgefüllten Dreiecke stehen für Mäuse, denen CTLA4Ig und Ratten-Immunglobulin injiziert wurden. Die nicht ausgefüllten Dreiecke stehen für Mäuse, denen CTLA4Ig und anti-IL4-Antikörper injiziert wurden.
16 ist ein Kurvendiagramm, das die Antikörperserumtiter von Mäusen zeigt, denen KLH, mAk L6 und Ratten-Ig, mAk L6 und anti-IL4, CTLA4Ig und Ratten-Ig, CTLA4Ig und anti-IL4 injiziert wurden. Die X-Achse ist ein Maß für den Antikörperserumtiter. Die Y-Achse ist ein Maß für die Zeit in Tagen. Die ausgefüllten Vierecke stehen für Mäuse, denen Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) an Tag 46 injiziert wurde. Die ausgefüllten Kreise stehen für Mäuse, denen mAk L6 und Ratten-Immunglobulin injiziert wurden. Die nicht ausgefüllten Kreise stehen für Mäuse, denen mAk L6 und anti-IL4-Antikörper injiziert wurden. Die ausgefüllten Dreiecke stehen für Mäuse, denen CTLA4Ig und Ratten-Immunglobulin injiziert wurden. Die nicht ausgefüllten Dreiecke stehen für Mäuse, denen CTLA4Ig und anti-IL4-Antikörper injiziert wurden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die folgenden Worte oder Begriffe werden in dieser Anmeldung mit den angegebenen Bedeutungen verwendet.
Mit dem „Blockieren einer B7-Wechselwirkung" meint man in der vorliegenden Verwendung den Eingriff in die Bindung der B7-Antigene an ihre Liganden, wie CD28 und/oder CTLA4, wodurch die T-Zell- und B-Zell-Wechselwirkung behindert wird.
Mit einem „B7-bindenden Molekül" meint man in der vorliegenden Verwendung ein beliebiges Molekül, das an das B7-Antigen bindet.
Mit einem „IL4-bindenden Molekül" meint man in der vorliegenden Verwendung ein beliebiges Molekül, das IL4 erkennt und bindet.
Zum besseren Verständnis der hier beschriebenen Erfindung wird die folgende Beschreibung gegeben.
Die Isolierung und Expression des auf T-Zelloberflächen anzutreffenden humanen CTLA4-Rezeptors, der an das auf aktivierten B-Zellen und Zellen anderer Linien exprimierte B7-Antigen bindet, und die Expression löslicher Fusionsproteinprodukte des CTLA4-Rezeptorgens wird beschrieben. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren für die Verwendung des exprimierten CLTA4-Rezeptors zur Regulierung zellulärer Wechselwirkungen, zu denen T-Zell-Wechselwirkungen mit B7-positiven Zellen gehören.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die komplette und korrekte DNA-Sequenz, die diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die dem erfindungsgemäßen humanen CTLA4-Rezeptorprotein entspricht, unter Verwendung der PCR kloniert. Wie ausführlich unten in den Beispielen beschrieben, wurde die cDNA, welche die komplette vorhergesagte kodierende Sequenz von CTLA4 enthielt, aus zwei PCR-Fragmentamplifikaten von H38-RNA zusammengesetzt und in den Expressionsvektor CDM8 insertiert. Isolate wurden in COS-Zellen transfiziert und auf die Bindung von B7Ig, einem löslichen Fusionsprotein mit einer Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne von B7 und einer humanen Immunglobulin (Ig)-Cγ1-Region entsprach, getestet, wie von Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721–730 (1991) beschrieben.
Die DNA-Sequenz eines Isolats, OMCTLA4 genannt, wurde dann bestimmt, und man fand, dass sie exakt der vorhergesagten, am N-Terminus mit dem Oncostatin M-Signalpeptid fusionierten, humanen CTLA4-Sequenz entsprach. Der CTLA4-Rezeptor wird von 187 Aminosäuren kodiert (ohne Signalpeptid und Stop-Codons) und beinhaltet eine neu identifizierte N-verknüpfte Glycosylierungsstelle an den Aminosäurepositionen 109–111 (siehe 3 unten). Der CTLA4-Rezeptor wird exprimiert, indem man das Oncostatin M-Signalpeptid verwendet.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden lösliche Formen des Proteinprodukts des CTLA4-Rezeptorgens (CTLA4Ig) hergestellt, indem man Fusionsproteine mit einer ersten Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entspricht, und einer zweiten Aminosäuresequenz, die der humanen IgCγ1- Domäne entspricht, verwendet. Klonierungs- und Expressionsplasmide (CDM8 und πLN) wurden konstruiert, die cDNAs enthalten, welche Aminosäuresequenzabschnitte kodieren, die auf Basis der hier beschriebenen cDNA-Sequenz dem humanen CTLA4-Rezeptor entsprechen, worin die cDNA, die eine erste, einem Fragment der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptorgens entsprechende Aminosäuresequenz kodiert, verbunden ist mit DNA, die eine zweite, einer IgC-Region entsprechenden Aminosäuresequenz kodiert, was die Expression des CTLA4-Rezeptorgens durch Veränderung der Löslichkeit des exprimierten CTLA4-Proteins zulässt. Somit wird lösliches CTLA4Ig-Fusionsprotein durch eine erste Aminosäuresequenz kodiert, die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz enthält, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entspricht, und die mit einer zweiten Aminosäuresequenz verbunden ist, welche Aminosäurereste enthält, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem IgCγ1 entsprechen. Das Fusionsprotein wird vorzugsweise in dimerer Form hergestellt. Das Konstrukt wurde dann in COS- oder CHO-Zellen transfiziert, und CTLA4Ig wurde gereinigt und als Dimer identifiziert.
Im Rahmen der praktischen Durchführung dieser Erfindung können CTLA4Ig und CTLA4Ig/CD28-Hybridfusionsproteine in der der externen CTLA4-Domäne entsprechenden Aminosäuresequenz Aminosäuresubstitutionen aufweisen, um Moleküle zu ergeben, die noch die funktionelle Eigenschaft von CTLA4 aufweisen, d.h. das Molekül mit solchen Substitutionen bindet immer noch das B7-Antigen. Zu diesen Aminosäuresubstitutionen gehören Aminosäuresubstitutionen, die dem Fachmann als „konservativ" bekannt sind, allerdings ohne hierauf beschränkt zu sein.
Beispielsweise ist es ein hinlänglich etabliertes proteinchemisches Prinzip, dass bestimmte Aminosäuresubstitutionen, die als „konservative Aminosäuresubstitutionen" bezeichnet werden, in einem Protein häufig vorgenommen werden können, ohne die Konformation oder die Funktion des Proteins zu verändern. Zu solchen Veränderungen gehören die Substitution eines Isoleucins (I), Valins (V) und Leucins (L) mit einer beliebigen anderen dieser hydrophoben Aminosäuren; einer Asparaginsäure (D) mit Glutaminsäure (E) und umgekehrt; eines Glutamins (Q) mit einem Asparagin (N) und umgekehrt; und eines Serins (S) mit einem Threonin (T) und umgekehrt. Weitere Substitutionen, die man ebenfalls als konservativ ansehen kann, hängen von der Umgebung der betroffenen Aminosäure und deren Funktion in der dreidimensionalen Struktur des Proteins ab. Beispielsweise können Glycin (G) und Alanin (A) genauso wie Alanin und Valin (V) häufig gegeneinander austauschbar sein.
Methionin (M), eine relativ hydrophobe Aminosäure, kann häufig gegen Leucin und Isoleucin und manchmal gegen Valin ausgetauscht werden. Lysin (K) und Arginin (R) sind an Stellen, in denen das signifikante Merkmal des Aminosäurerests seine Ladung ist und die unterschiedlichen pKs dieser beiden Aminosäurereste nicht signifikant sind, häufig gegeneinander austauschbar. In bestimmten Umgebungen können noch weitere Änderungen als „konservativ" anzusehen sein.
Tatsächlich wurden mit der hier offenbarten Methodik Mutanten der B7-bindenden Moleküle hergestellt. Eine Mutante umfasst (1) eine mit der Aminosäure an Position 1 beginnende und mit der Aminosäure an Position 95 des CD28-Rezeptorproteins (Aruffo und Seed, 1987) endende Sequenz; (2) eine mit der Aminosäure an Position 95 beginnende und mit der Aminosäure an Position 125 der extrazellulären Domäne von CTLA4 (Brunet et al., 1987) endende Sequenz; und (3) eine der humanen IgCγ1-Domäne entsprechenden Sequenz.
Die zweite Mutante umfasst (1) eine mit der Aminosäure an Position 1 beginnende und mit der Aminosäure an Position 95 des CD28-Rezeptorproteins (Aruffo und Seed, 1987) endende Sequenz; (2) eine mit der Aminosäure an Position 95 beginnende und mit der Aminosäure an Position 120 der extrazellulären Domäne von CTLA4 (Brunet et al., 1987) endende Sequenz; und (3) eine der humanen IgCγ1-Domäne entsprechenden Sequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Blockieren einer B7-Wechselwirkung, um die Immunantwort zu regulieren, wobei man Lymphozyten mit einem B7-bindenden Molekül und einem IL4-bindenden Molekül in Kontakt bringt. Die Lymphozyten können B7-positive Lymphozyten sein.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Regulieren einer Immunantwort, wobei man B7-positive Lymphozyten mit einem B7-bindenden Molekül und einem IL4-bindenden Molekül in Kontakt bringt.
Die Immunantwort kann eine B-Zellantwort sein, was zur Inhibierung der Antikörperproduktion führt. Darüber hinaus kann die Immunantwort eine T-Zellantwort sein, was zur Inhibierung der zellvermittelten Immunität führt. Des Weiteren kann die Immunantwort eine Inhibition der Lymphozytenproliferation sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Inhibieren der Gewebetransplantatabstoßung eines Wesens, wobei das Wesen ein Empfänger eines transplantierten Gewebes ist. Dieses Verfahren kann beinhalten, dass man dem Wesen ein B7-bindendes Molekül und ein IL4-bindendes Molekül verabreicht.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Inhibierung der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung eines Wesens, wobei man dem Wesen ein B7-bindendes Molekül und ein IL4-bindendes Molekül verabreicht.
Im Rahmen der praktischen Durchführung dieser Erfindung kann das CTLA4-bindende Molekül ein CTLA4Ig-Fusionsprotein sein. Beispielsweise kann das CTLA4Ig-Fusionsprotein ein Fusionsprotein sein, das eine erste Aminosäuresequenz, welche die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 125 der der extrazellulären Domäne von CTLA4 entsprechenden Aminosäuresequenz enthält, und eine zweite Aminosäuresequenz, welche den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem Immunglobulin Cγ1 entsprechende Aminosäurereste enthält, aufweist.
Alternativ kann das CTLA4-bindende Molekül ein CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsprotein sein. Beispielsweise kann das CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsprotein ein Hybridfusionsprotein sein, das eine erste, einem Abschnitt der extrazellulären Domäne des CD28-Rezeptors entsprechende Aminosäuresequenz in Fusion mit einer zweiten, einem Abschnitt der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors entsprechenden Aminosäuresequenz und eine dritte, den Hinge, CH2- und CH3-regionen von humanem Immunglobulin Cγ1 entsprechende Aminosäuresequenz aufweist.
Des Weiteren kann das IL4-bindende Moleül ein monoklonaler Antikörper sein, der spezifisch IL4 erkennt und bindet. Alternativ kann das IL4-bindende Molekül ein löslicher IL4-Rezeptor sein, der IL4 erkennt und bindet (Fanslow et al., 1991).
DNA, die diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die dem CTLA4Ig-Fusionsprotein entspricht, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrags am 31. Mai 1991 hinterlegt; ihr wurde die ATCC-Hinterlegungsnummer 68629 zugeteilt.
Erfindungsgemäß wird ein Proteinprodukt eines CTLA4-Transkripts in Form eines löslichen Fusionsproteins verwendet. Das CTLA4Ig-Protein bildet ein Disulfid-gekoppeltes Dimer aus Untereinheiten mit einem M_r von annähernd 50000, ein Hinweis darauf, dass natives CTLA4 wahrscheinlich als ein Disulfid-gekoppeltes Homodimer auf der T-Zelloberfläche vorkommt.
Es wurde gezeigt, dass B7-Antigen ein Ligand für den CD28-Rezeptor auf T-Zellen ist (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, s. oben). Das CTLA4-Rezeptormolekül scheint funktionell und strukturell mit dem CD28-Rezeptor verwandt zu sein; beides sind Rezeptoren für das B-Zell-Aktivierungsantigen B7, während CTLA4 eine höhere Affinität für B7 zu haben scheint, die zu den höchsten gehört, über die jemals für lymphoide Adhäsionssysteme berichtet wurde. Es wurde allerdings gezeigt, dass CTLA4Ig stärker an B7-positive (B7⁺) Zelllinien bindet als CD28Ig. Weitere Experimente zeigten, dass CTLA4 ein Rezeptor mit höherer Affinität für B7-Antigen ist als der CD28-Rezeptor. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass CTLA4Ig an ein einzelnes Protein auf Lymphoblastoidzellen bindet, welches dem B7-Antigen in der Größe ähnlich ist. CTLA4Ig inhibierte die T-Zellproliferation und inhibierte die T_h-induzierte IgM-Produktion.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wurden Hybridfusionsproteine mit Aminosäuresequenzen, die den Fragmenten verschiedener Rezeptorproteine entsprachen, konstruiert. Beispielsweise wurden Aminosäuresequenzen, die ausgewählten Fragmenten extrazellulärer Domänen von CD28 und CTLA4 entsprachen, miteinander verknüpft, um CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsproteine zu bilden. So wurde ein CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionsprotein mit einer ersten Aminosäuresequenz erhalten, welche Aminosäurereste enthielt, die einem Fragment der extrazellulären Domäne von CD28 entsprachen, und die mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die einem Fragment der extrazellulären Domäne von CTLA4Ig entsprach, und mit einer dritten Aminosäuresequenz, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem IgCγ1 entsprach, verbunden war. Eine Ausführungsform des Hybridfusionsproteins ist ein CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionskonstrukt mit einer ersten Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 94 derjenigen Aminosäuresequenz enthielt, die der extrazellulären Domäne von CD28 entsprach, und die mit einer zweiten Aminosäuresequenz verbunden war, welche Aminosäurereste von etwa Position 94 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz enthielt, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entsprach, und die mit einer dritten Aminosäuresequenz verbunden war, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem IgCγ1 entsprach.
Techniken zur Klonierung und Expression von DNA-Sequenzen, die für diejenigen Aminosäuresequenzen kodieren, die dem CTLA4-Rezeptorprotein, den löslichen Fusionsproteinen und Hybridfusionsproteinen entsprechen, beispielsweise Oligonukleotidsynthesen, PCR, Zelltransformation, Vektorkonstruktion, Expressionssysteme und dergleichen sind dem Fachmann bekannt, und die meisten Praktiker sind mit den Standardmaterialien für spezifische Bedingungen und Vorgehensweisen vertraut. Allerdings werden die folgenden Ausführungen zweckmäßigerweise und zur Aufzeichnung gegebenenfalls erforderlicher Modifikationen zur Verfügung gestellt; sie können als Richtlinie dienen.
Klonierung und Expression von kodierenden Sequenzen für Rezeptoren und Fusionsproteine
Wie von Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721–730 (1991) beschrieben, wurden CD28IgCγ1 und B7IgCγ1 entsprechende Fusionsprotein-Konstrukte zur Charakterisierung des erfindungsgemäßen CTLA4Ig und zur Herstellung von CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionshybriden hergestellt. Alternativ können cDNA-Klone aus RNA hergestellt werden, die aus B7-Antigen und CD28-Rezeptor exprimierenden Zellen erhalten wurde, und zwar auf Grundlage des Wissen über die publizierten Sequenzen dieser Proteine (Aruffo und Seed sowie Freeman, s. oben), wobei man standardmäßig vorgeht.
CTLA4Ig-Fusionen aus DNA, die für diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 und den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem IgCγ1 entsprachen, wurden durch Ligation von PCR-Fragmenten konstruiert. Die Aminosäuresequenzen-kodierende cDNA wird unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktionstechnik ("PCR-Technik") amplifiziert (siehe U.S. Patent Nrn. 4,683,195 und 4,683,202 an Mullis et al. und Mullis & Faloona, Methods Enzymol. 154: 335–350 (1987)). Es wurden CTLA4Ig-Fusionspolypeptide erhalten, die DNA aufwiesen, die Aminosäuresequenzen mit Aminosäureresten von etwa Position 1 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz kodierte, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entsprach, und die DNA aufwiesen, welche Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von IgCγ1 entsprachen.
Da zuvor noch nicht über die Expression von CTLA4-Rezeptorprotein in humanen Lymphoidzellen berichtet worden war, war es erforderlich, eine Quelle für CTLA4-mRNA auszumachen. PCR-cDNA aus zellulärer Gesamt-RNA mehrerer humaner Leukämiezelllinien wurde gescreent, wobei man als Primer Oligonukleotide der veröffentlichten Sequenz des CTLA4-Gens verwendete (Dariavach et al., s. oben). Von der getesteten cDNA ergaben H38-Zellen (eine HTLV II-assoziierte Leukämielinie) die besten Ausbeuten an PCR-Produkten mit der erwarteten Größe. Da ein Signalpeptid für CTLA4 im CTLA4-Gen nicht identifiziert wurde, wurde der N-Terminus der vorhergesagten Sequenz von CTLA4 mit dem Signalpeptid des Oncostatin M (Malik et al., Molec. und Cell. Biol. 9: 2847 (1989)) in zwei Schritten fusioniert, wobei man unten in den Beispielen beschriebene Oligonukleotide verwendete. Das Produkt aus der PCR-Reaktion wurde mit cDNA, die diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von IgCγ1 entsprachen, in einen Expressionsvektor, wie CDM8 oder πLN, ligiert.
Um eine DNA zu erhalten, die humanes "full-length" CTLA4 kodierte, wurde aus H38-Zellen durch PCR eine cDNA erhalten, die die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen von CTLA4 kodierte, und mit einem in Anlehnung an obige Beschreibung erhaltenen Fragment aus CTLA4Ig, welches das mit dem N-Terminus von CTLA4 fusionierte Oncostatin M-Signalpeptid kodierte, verbunden, wobei man Oligonukleotid-Primer in Anlehnung an die Beschreibung unten in den Beispielen verwendete. PCR-Fragmente wurden in den Plasmid CDM8 ligiert, was zu einem Expressionplasmid führte, der das "full-length" CTLA4-Gen kodierte, und der OMCTLA4 genannt wurde.
Zwecks Konstruktion von DNA, die Hybridfusionsproteinen entsprechende Aminosäuresequenzen kodierte, wurde DNA, die diejenigen Aminosäuren kodierte, die den Abschnitten der extrazellulären Domäne eines Rezeptorgens entsprachen, mit DNA, die diejenigen Aminosäuren kodierte, die Abschnitten der extrazellulären Domäne eines weiteren Rezeptorgens entsprachen, und mit DNA, die diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem IgCγ1 entsprachen, verbunden, indem man wie oben für die B7Ig-, CD28Ig- und CTLA4Ig-Konstrukte beschrieben vorging. So wurde beispielsweise DNA, die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 94 derjenigen Aminosäuresequenz kodierte, die der extrazellulären Domäne des CD28-Rezeptors entsprach, mit DNA, die Aminosäurereste von etwa Position 94 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz kodierte, die der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors entsprach, und mit DNA, die diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem IgCγ1 entsprach, verbunden.
Um große Mengen klonierter DNA herzustellen, werden Vektoren, die DNA enthalten, die für die erfindungsgemäßen Fusionskonstrukte kodiert, in geeignete Wirtszellen, wie die Bakterienzelllinie E. coli-Stamm MC1061/p3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) transformiert, wobei man standardmäßig vorgeht, und Kolonien werden auf zweckmäßige Plasmide gescreent.
Die in Anlehnung an obige Beschreibung erhaltenen, Fusionskonstrukt-kodierende DNA enthaltenden Klone werden dann in geeignete Wirtszellen zur Expression transfiziert. Je nach verwendeter Wirtszelle werden standardmäßige Techniken, die für derartige Zellen zweckmäßig sind, verwendet, um die Transfektion durchzuführen. Beispielsweise gelingt die Transfektion in Säugetierzellen, indem man die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, die "CaPO₄"-Copräzipitation, die Lipofektion, die Elektroporation oder die Protoplastfusion, und andere dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet, zu denen die Lysozymfusion oder Erythrozytenfusion, das "Scraping", die Direktaufnahme, der osmotische oder Sucrose-Schock, die direkte Mikroinjektion, die indirekte Mikro-injektion beispielsweise über Erythrozyten-vermittelte Techniken, und/oder das Anlegen von elektrischen Strömen an Wirtszellen gehören. Die obige Liste von Transfektions-Techniken soll nicht als abschließend betrachtet werden, da weitere Vorgehensweisen zur Einführung genetischer Information in Zellen ohne Zweifel entwickelt werden.
Bevorzugt wird die Expression in eukaryotischen Wirts-Zellkulturen, die sich von vielzelligen Organismen ableiten (siehe Tissue Cultures, Academic Press, Cruz und Patterson, Hrsg. (1973)). Diese Systeme besitzen den zusätzlichen Vorteil, Introne splicen zu können; sie können daher direkt zur Expression genomischer Fragmente verwendet werden. Zu den brauchbaren Wirtszelllinien gehören Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Affennierenzellen (COS), VERO- und HeLa-Zellen. Erfindungsgemäß sind Zelllinien bevorzugt, die das Fusionskonstrukt stabil exprimieren.
Üblicherweise beinhalten Expressionsvektoren für derartige Zellen Promotoren und Kontrollsequenzen, die mit Säugetierzellen kompatibel sind, wie beispielsweise der CMV-Promotor (CDM8-Vektor) und der Avian-Sarkoma-Virus (ASV) (πLN-Vektor). Zu weiteren üblicherweise verwendeten, frühen und späten Promotoren gehören diejenigen des Simian-Virus-40 (SV 40) (Fiers, et al., Nature 273: 113 (1973)), oder weitere virale Promotoren, wie diejenigen, die sich von Polyoma, Adenovirus 2 und Rinder-Papilloma-Virus ableiten. Der steuerbare Promotor hMTII (Karin, et al., Nature 299: 797–802 (1982)) kann ebenfalls verwendet werden. Allgemeine Aspekte zu Transformationen mit Säugetierzell-Wirtssystemen wurden von Axel (U.S. Patent Nr. 4,399,216, erteilt am 16. August 1983) beschrieben. Mittlerweile scheinen "Enhancer"-Regionen für eine Optimierung der Expression wichtig zu sein; dies sind im allgemeinen stromaufwärts oder stromabwärts von der Promotorregion zu findende Sequenzen in nichtkodierenden DNA-Regionen. Replikationsstartpunkte können erforderlichenfalls aus viralen Quellen erhalten werden. Allerdings ist die Integration in das Chromosom ein allgemeiner Mechanismus für die DNA-Replikation in Eukaryoten.
Wenngleich zu den bevorzugten Wirtszellen für die Expression der Fusionskonstrukte eukaryotische Zellen, wie COS- oder CHO-Zellen, gehören, können andere eukaryotische Mikroben als Wirte verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, werden meistens verwendet, wenngleich andere Stämme, wie Schizosaccharomyces pombe verwendet werden können. Verwendet werden können Vektoren, die beispielsweise auf den 2μ Replikations-Startpunkt von Broach, Meth. Enz. 101: 307 (1983), oder auf andere Hefe-kompatible Replikationsstartpunkte zurückgreifen (siehe beispielsweise Stinchcomb et al., Nature 282: 39 (1979); Tschempe et al., Gene 10: 157 (1980); und Clarke et al., Meth. Enz. 101: 300 (1983)). Zu den Kontrollsequenzen für Hefevektoren gehören Promotoren für die Synthese glycolytischer Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17: 4900 (1978)). Zu weiteren, dem Fachmann bekannten Promotoren gehören der in dem CDM8-Vektor zur Verfügung gestellte CMV-Promotor (Toyama und Okayama, FEBS 268: 217–221 (1990); der Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) und diejenigen für andere glycolytische Enzyme. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotorregionen für die Alkohodehydrogenase 2, das Isocytochrom C, die Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus zusammenhängende degra dierende Enzyme, sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galaktoseverwertung zuständig sind. Ebenfalls glaubt man, dass Terminatorsequenzen am 3'-Ende der kodierenden Sequenzen wünschenswert sind. Derartige Terminatoren werden in der 3'-nichttranslatierten Region im Anschluss an die kodierenden Sequenzen in Hefe-abgeleiteten Genen gefunden.
Alternativ können prokaryotische Zellen als Expressionswirte verwendet werden. Am häufigsten sind Prokaryoten durch verschiedene Stämme von E. coli vertreten. Allerdings können auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden. Zu üblicherweise verwendeten prokaryotischen Kontrollsequenzen, die hier definitionsgemäß Promotoren zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator und zusammen mit Sequenzen für Ribosombindungsstellen miteinbeziehen sollen, gehören üblicherweise verwendete Promotoren, wie die beta-Lactamase(Penicillinase)- und Laktose (lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198: 1056 (1977)), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)) und der von Lambda abgeleitete P_L-Promotor und die N-Gen-Ribosombindungsstelle (Shimatake et al., Nature 292: 128 (1981)).
Die Nukleotidsequenzen, die CD28Ig- und CTLA4Ig-Proteine und Fusionshybridproteine, wie CD28Ig/CTLA4Ig, kodieren, können in einer Vielzahl von nachfolgend beschriebenen Systemen exprimiert werden. Die cDNA kann mit geeigneten Restriktionsenzymen herausgeschnitten werden und in geeignete prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren für eine derartige Expression ligiert werden. Da CD28- und CTLA4-Rezeptorproteine in der Natur als Dimere vorkommen, glaubt man, dass eine erfolgreiche Expression dieser Proteine ein Expressionssystem erfordert, dass diese Proteine als Dimere zu bilden vermag. Verkürzte Versionen dieser Proteine (d.h. durch Einführung eines Stop-Codons in die Sequenz an einer Position stromaufwärts der Transmembran-Region des Proteins gebildet) scheinen nicht exprimiert zu werden. Durch die Expression von CD28- und CTLA4-Rezeptoren als Fusionsproteine vermag man Dimere dieser Proteine zu bilden. Die Expression von CTLA4-Protein als Fusionsprodukt ist daher erfindungsgemäß bevorzugt.
Eine erfindungsgemäße stabile CHO-Linie, Ovarzelllinie des chinesischen Hamsters CTLA4Ig-24 genannt, wird zur Expression von CTLA4Ig bevorzugt und ist gemäß dem Budapester Vertrag bei der ATCC am 31. Mai 1991 hinterlegt worden; ihr wurde die ATCC-Hinterlegungsnummer 10762 zugeteilt.
Die Expression des erfindungsgemäßen CTLA4-Rezeptors gelingt, indem man eine Zelllinie, wie COS-Zellen, transfiziert und die Expression über die Bindung der CTLA4-transfizierten Zellen an einen Liganden für den CTLA4-Rezeptor nachweist, beispielsweise indem man auf die Bindung der Zellen an B7Ig-Fusionsprotein testet.
Sequenzen der resultierenden Konstrukte werden durch DNA-Sequenzierung bestätigt, indem man bekanntermaßen vorgeht, beispielsweise wie von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977), oder auch von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) beschrieben, oder mit dem Verfahren von Maxam et al., Methods Enzymol. 65: 499 (1980)).
Gewinnung der Proteinprodukte
Wie oben erläutert werden CD28- und CTLA4-Rezeptorgene nicht ohne weiteres als reife Proteine exprimiert, wenn man die für das verkürzte Protein kodierende DNA direkt exprimiert. Um die Bildung eines Homodimers zu ermöglichen, wird DNA, die diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die den extrazellulären Domänen von CD28 und CTLA4 entspricht und die Codons für eine Signalsequenz, wie derjenigen des Oncostatin M, in zur zweckmäßigen Prozessierung befähigten Zellen mit einbezieht, mit DNA fusioniert, die diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die der Fc-Domäne eines natürlich vorkommenden dimeren Proteins entspricht. Die Reinigung dieser Fusionsproteinprodukte nach Sekretion aus den Zellen wird also erleichtert, indem man Antikörper verwendet, die gegenüber dem anti-Immunglobulin-Abschnitt der Fusionsproteine reaktiv sind. Bei Sekretion in das Medium wird das Fusionsproteinprodukt gewonnen, indem man Standardtechniken zur Proteinreinigung verwendet, beispielsweise indem man Protein A-Säulen einsetzt.
Verwendung
CTLA4Ig-Fusionsprotein und/oder Fragmente des Fusionsproteins können für die Reaktion mit B7-positiven Zellen, wie B-Zellen, verwendet werden, um durch T-Zell-Wechselwirkungen mit B7-Antigen-positiven Zellen vermittelte Immunantworten zu regulieren.
CTLA4Ig-Fusionsprotein und CTLA4Ig/CD28Ig-Hybridproteine und/oder Fragmente und Derivate dieser Proteine können ebenfalls für die Reaktion mit B7-positiven Zellen, einschließlich B-Zellen, verwendet werden, um durch T-Zell-abhängige B-Zellantworten vermittelte Immunantworten zu regulieren. Der Ausdruck "Fragment" meint hier einen Abschnitt derjenigen Aminosäuresequenz, die das als "CTLA4" bezeichnete Protein kodiert. Ein verwendbares Fragment des CTLA4Ig-Fusionsproteins ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einem Abschnitt derjenigen Aminosäuresequenz entspricht, die dem CTLA4-Rezeptor entspricht, der verwendet wurde, um das hier beschriebene CTLA4Ig-Fusionsprotein zu erhalten.
Das auf aktivierten B-Zellen und Zellen anderer Linien exprimierte B7-Antigen und der auf T-Zellen exprimierte CD28-Rezeptor können direkt aneinander binden, und diese Wechselwirkung kann Zell-Zell-Wechselwirkungen vermitteln. Derartige Wechselwirkungen triggern direkt den CD28-Aktivierungsweg in T-Zellen, was zur Cytokinproduktion, zur T-Zellproliferation und B-Zelldifferenzierung in Immunglobulin produzierenden Zellen führt. Die stattfindende Aktivierung von B-Zellen kann eine erhöhte Expression von B7-Antigen und eine weitere CD28-Stimulation verursachen, was zu einem chronischen Entzündungszustand führt, wie bei Autoimmunerkrankungen, der Allotransplantatabstoßung, der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung oder chronischen allergischen Reaktionen. Diese Reaktionen können effektiv blockiert oder inhibiert werden, indem man die Cytokinproduktion durch T-Zellen verhindert und damit entzündliche Reaktionen verhindert oder umkehrt.
Hier wird gezeigt, dass CTLA4Ig ein starker Inhibitor von in vitro-Lymphozytenfunktionen ist, die T- und B-Zell-Wechselwirkungen erfordern. Dies ist ein Hinweis auf die Wichtigkeit von Wechselwirkungen zwischen dem B7-Antigen und dessen Gegenrezeptoren CTLA4 und/oder CD28. Die cytoplasmatischen Domänen von murinem und humanem CTLA4 sind sich ähnlich (Dariavach et al., s. oben, 1988), was nahe legt, dass diese Region wichtige funktionelle Eigenschaften besitzt. Auch die cytoplasmatischen Domänen von CD28 und CTLA4 weisen Homologie auf.
CTLA4 ist in vitro ein stärkerer Inhibitor von Lymphozytenantworten, als anti-BB1- oder anti-CD28-mAk. CTLA4Ig besitzt keine seinen inhibitorischen Wirkungen entgegenwirkenden, direkt stimulierenden Wirkungen auf die T-Zellproliferation. Daher kann CTLA4Ig-Fusionsprotein in vivo als besserer Inhibitor als monoklonale anti-CD28-Antikörper eingesetzt werden. Die immunsuppressiven Wirkungen von CTLA4Ig in vitro legen dessen Verwendung in der Therapie zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen nahe, an denen eine anormale T-Zellaktivierung oder Ig-Produktion beteiligt ist.
Es wird erwartet, dass das CTLA4Ig-Fusionsprotein in vivo inhibitorische Eigenschaften besitzt. So wird erwartet, dass CTLA4Ig inhibitorisch auf T-Zellen in einer Weise wirkt, die der für den anti-CD28-Antikörper unter ähnlichen Bedingungen in vivo beobachteten Wirkung ähnlich ist. Bei Bedingungen, unter denen T-Zell/B-Zell-Wechselwirkungen in Folge von Kontakten zwischen T-Zellen und B-Zellen auftreten, kann die Bindung von zur Reaktion mit B7-Antigen-positiven Zellen, beispielsweise B-Zellen, eingeführtem CTLA4Ig eingreifen, d.h. die T-Zell/B-Zell-Wechselwirkungen inhibieren, was zu einer Regulation von Immunantworten führt. Aufgrund dieser ausschließlich inhibitorischen Wirkung wird erwartet, dass CTLA4Ig in vivo als Inhibitor der T-Zellaktivierung im Gegensatz zu unspezifischen Inhibitoren, wie Cyclosporin und Glucosteroiden, nützlich ist.
Gemäß einer Ausführungsform können das CTLA4Ig-Fusionsprotein oder CTLA4Ig/CD28Ig-Hybridproteine in vivo in einen geeigneten pharmazeutischen Träger eingebracht werden, d.h. einer humanen Person zur Behandlung pathologischer Zustände, wie Immunsystemerkrankungen oder Krebs, verabreicht werden.
Es wird erwartet, dass die Einführung des Fusionsproteins in vivo zum Eingriff in T-Zell-Wechselwirkungen mit anderen Zellen wie B-Zellen in Folge einer Bindung des Liganden an B7-positive Zellen führt. Die Unterbindung normaler T-Zell-Wechselwirkungen kann zu verminderter T-Zellaktivität, beispielsweise zu verminderter T-Zellproliferation, führen. Darüber hinaus erwartet man, dass die Verabreichung des Fusionsproteins in vivo zu einer Regulierung der in vivo-Spiegel von Cytokinen führt, wozu in nicht abschließender Aufzählung Interleukine z.B. Interleukin ("IL")-2, IL-3, IL-4, IL-6 und IL-8, Wachstumsfaktoren einschließlich des Tumorwachstumsfaktors ("TGF"), Kolonie stimulierende Faktoren ("CSF"), Interferone ("IFNs") und der Tumornekrosefaktor ("TNF") gehören, um die erwünschten Wirkungen in einer Person zu begünstigen. Wird beispielsweise das Fusionsprotein in vivo eingeführt, so kann es die Produktion von Cytokinen blockieren, die zu bösartigem Wachstum, z.B. von Tumorzellen, beitragen. Das Fusionsprotein kann ebenfalls die Proliferation von Viren blockieren, die von der T-Zellaktivierung abhängen, wie das AIDS, HTLV1 verursachende Virus.
Wie oben erläutert wirkt unter gewissen Umständen die Verabreichung des CTLA4Ig-Fusionsproteins oder von dessen Fragmenten in vivo inhibitorisch, eine Folge der Blockierung des durch T-Zell/B-Zellkontakt hervorgerufenen CTLA4- und CD28-Triggerns durch das Fusionsprotein. Beispielsweise kann das CTLA4Ig-Protein die T-Zellproliferation blockieren. Die Einführung des CTLA4Ig-Fusionsproteins in vivo wird daher sowohl Wirkungen auf T- als auch auf B-Zell-vermittelte Immunantworten hervorrufen. Das Fusionsprotein kann einem Wesen ebenfalls in Kombination mit der Einführung von Cytokinen oder anderen therapeutischen Reagenzien verabreicht werden.
Monoklonale Antikörper zur Regulierung zellulärer Wechselwirkungen können durch Hybridome produziert werden, indem man bekanntermaßen, beispielsweise wie von Kohler und Milstein (siehe Kohler und Milstein, Nature 256: 495-97 (1975)) eingeführt, oder unter Modifizierungen vorgeht.
Diese Techniken beinhalten die Verwendung eines Tieres, das zur Herstellung eines bestimmten Antikörper sensibilisiert wird (Primen). Das Tier kann durch Injektion eines Immunogens (z.B. des B7Ig-Fusionsproteins, CTLA4Ig-Fusionsproteins oder CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsproteins) sensibilisiert werden, um die erwünschte Immunantwort, d.h. die Produktion von Antikörpern durch das sensibilisierte Tier, auszulösen. Ein sensibilisiertes Tier ist auch ein Tier, das eine Erkrankung exprimiert. Für die Suche nach einem bestimmten Antikörper können Lymphozyten verwendet werden, die aus den Lymphknoten, der Milz und dem peripheren Blut von sensibilisierten, erkrankten Tieren stammen. Die Lymphozytenchromosome, die die erwünschten Immunglobuline kodieren, werden durch Fusion der Lymphozyten mit Myelomzellen üblicherweise in Gegenwart eines Fusionsagens, wie Polyethylenglycol (PEG), immortalisiert. In Anlehnung an Standardtechniken kann jede einer Vielzahl von Myelom-Zelllinien als Fusionspartner verwendet werden, beispielsweise die Myelomlinien P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653, Sp2/0-Ag14, oder HL1-653. Diese Myelomlinien sind bei der ATCC, Rockville, Maryland erhältlich.
Die resultierenden Zellen, die die gewünschten Hybridome beinhalten, werden dann in einem selektiven Medium, wie HAT-Medium, aufgezogen, wobei gegebenenfalls nichtfusionierte Myelom- oder Lymphozyten-Ausgangszellen sterben. Nur die Hybridomzellen überleben und können unter Grenzverdünnungsbedingungen aufgezogen werden, um isolierte Klone zu erhalten. Die Überstände der Hybridome werden auf die vorhandene erwünschte Spezifität beispielsweise mit Immunoassay-Techniken gescreent, wobei man das CTLA4Ig-Protein verwendet, das zur Immunisierung verwendet worden ist. Positive Klone können dann unter Grenzverdünnungsbedingungen subkloniert werden, und der produzierte monoklonale Antikörper kann isoliert werden.
Verschiedene herkömmliche Verfahren zur Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper können verwendet werden, um sie frei von anderen Proteinen und Verunreinigungen zu erhalten. Zu üblicherweise für die Reinigung monoklonaler Antikörper verwendeten Verfahren gehören die Ammoniumsulfatfällung, die Ionenaustauschchromatographie und die Affinitätschromatographie (siehe Zola et al., in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell (Hrsg.) S. 51–52 (CRC Press, 1982)). In Anlehnung an diese Verfahren produzierte Hybridome können in vitro oder in vivo (in Ascitesflüssigkeit) vermehrt werden, indem man dem Fachmann bekannte Techniken verwendet (siehe allgemein Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9: 121-33 (1984), 6–1 auf S. 123).
Im Allgemeinen kann die individuelle Zelllinie in vitro vermehrt werden, beispielsweise in Laborkulturgefäßen, und das hohe Konzentrationen eines einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörpers enthaltende Kulturmedium kann durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen werden.
Darüber hinaus können Fragmente dieser Antikörper, welche die gegenüber der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors reaktive, aktive Bindungsregion enthalten, wie Fab-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente, hergestellt werden. Derartige Fragmente können mit Hilfe von Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind (siehe z.B. Rousseaux et al., in Methods Enzymol., 121: 663-69, Academic Press (1986)).
In Anlehnung an obige Beschreibung hergestellte monoklonale anti-B7-Antikörper können zur Bindung an B7-Antigen verwendet werden, um Wechselwirkungen von CD28-positiven oder CTLA4-positiven T-Zellen mit B7-positiven Zellen zu inhibieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das CTLA4Ig-Fusionsprotein verwendet werden, um weitere Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen CTLA4 und dem B7-Antigen zu regulieren. Zu derartigen Verbindungen können kleine, natürlich vorkommende Moleküle gehören, die für die Reaktion mit B-Zellen und/oder T-Zellen verwendet werden können. Beispielsweise können Fermentationsbrühen auf die Fähigkeit, CTLA4/B7-Wechselwirkungen zu inhibieren, getestet werden. Darüber hinaus können Derivate des CTLA4Ig-Fusionsproteins, wie oben beschrieben, zur Regulierung der T-Zellproliferation verwendet werden. Beispielsweise können die Fragmente oder Derivate zur Blockierung der T-Zellproliferation bei einer Transplantat-gegen-Wirt (GVH)-Erkrankung, die allogene Knochenmarkstransplantationen begleitet, verwendet werden.
Der CD28-vermittelte T-Zell-Proliferationsweg ist im Gegensatz zu der durch den CD3/Ti-Zell-Rezeptorkomplex getriebenen Proliferation Cyclosporin-resistent (June et al., 1987, s. oben). Als Behandlung der GVH-Erkrankung ist Cyclosporin relativ ineffektiv (Storb, Blood 68: 119–125 (1986)). Man nimmt an, dass die GVH-Erkrankung durch T-Lymphozyten vermittelt wird, die CD28-Antigen exprimieren (Storb und Thomas, Immunol. Rev. 88: 215–238 (1985)). Daher kann das CTLA4Ig-Fusionsprotein alleine oder in Kombination mit immunsuppressiven Mitteln, wie Cyclosporin, zur Blockierung der T-Zellproliferation bei der GVH-Erkrankung nützlich sein.
Die Regulierung der Wechselwirkungen von CTLA4-positiven T-Zellen mit B7-positiven Zellen, einschließlich B-Zellen, durch die erfindungsgemäßen Verfahren kann daher verwendet werden, pathologische Zustände, wie Autoimmunität, Transplantationen, Infektionskrankheiten und Neoplasien, zu behandeln.
Die hier beschriebenen mutierten CTLA4-bindenden Moleküle und IL4-bindenden Moleküle können in einer Vielzahl von Dosierungsformen formuliert werden, wozu flüssige Lösungen oder Suspensionen, Tabletten, Pillen, Pulver, Suppositorien, polymere Mikrokapseln oder Mikrovesikel, Liposome und injizierbare oder infundierbare Lösungen gehö ren, ohne allerdings darauf beschränkt zu sein. Die bevorzugte Form hängt von der Verabreichungsart und der therapeutischen Anwendung ab.
Die wirksamste Verabreichungsart und der wirksamste Dosierungsplan für die erfindungsgemäßen Moleküle hängt von der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung, der Gesundheit und dem Ansprechen des Wesens auf die Behandlung und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Dementsprechend sollten die Dosierungen der Moleküle dem Wesen individuell angepasst werden.
Die Wechselbeziehung von Dosierungen für Tiere verschiedener Größe und Arten und Menschen auf Basis der Oberfläche in mg/m² ist von Freireich, E.J., et al. ("Quantitative Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey und Man", Cancer Chemother, Rep., 50, No. 4, 219–244, Mai 1966) beschrieben.
Am Dosierungsplan können Einstellungen vorgenommen werden, um die wachstumsinhibierende Antwort zu optimieren. Die Dosen können aufgeteilt und auf Tagesbasis verabreicht werden, oder die Dosis kann je nach Situation proportional reduziert werden. Beispielsweise kann man mehrere aufgeteilte Dosen täglich verabreichen oder die Dosis, wie durch die spezifische therapeutische Situation indiziert, proportional reduzieren.
Der Ausführung der Erfindung entsprechend kann eine zur Behandlung eines Wesens wirksame Menge in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht des Wesens liegen. Die wirksame Menge kann auch in einem Bereich von etwa 1 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht des Wesens liegen.
Vorteile der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung löst die mit derzeitigen Therapien, die auf die Vorbeugung von Gewebe- oder Organtransplantatabstoßungen gerichtet sind, verbundenen Probleme. Im Gegensatz zu gegenwärtigen Therapien wirkt sich die vorliegende Erfindung nur auf immunologische Antworten aus, die durch B7-Wechselwirkungen vermittelt sind.
Beispielsweise wirkt sich die vorliegende Erfindung auf antigenspezifische T-Zellen des Transplantats aus, wodurch donorspezifische und antigenspezifische Toleranz induziert wird. Die Bindung von CD28 durch seinen Liganden B7/BB1 (B7) während der Einschaltung des T-Zellrezeptors ist für eine korrekte T-Zellsignalgebung in manchen Systemen kritisch (M. K. Jenkins, P. S. Taylor, S.D. Norton, K. B. Urdahl, J. Immunol. 147: 2461 (1991); C. H. June, J. A. Ledbetter, P. S. Linsley, C. B. Thompson, Immunol. Today 11: 211 (1990); H. Reiser, G. J. Freeman, Z. Razi-Wolf, C.D. Gimmi, B. Benacerraf, L. M. Nadler, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 271 (1992); N. K. Damie, K. Klussman, P. S. Linsley, A. Aruffo, J. Immunol. 148: 1985 (1992)).
Wird die Wechselwirkung von CD28 mit seinem Liganden blockiert, erfolgt eine nicht zweckmäßige Induktion antigenspezifischer T-Zellen hin zu einem Zustand antigenspezifischer T-Zell-Anergie (M. K. Jenkins, P. S. Taylor, S.D. Norton, K. B. Urdahl, J. Immunol. 147: 2461 (1991); F. A. Harding, J. G. McArthur, J. A. Gross, D. H. Raulet, J. P. Allison, Nature 356: 607 (1992)).
CTLA4Ig-Fusionsprotein bindet sowohl an humanes als auch murines B7 (mit einer 20-fach höheren Affinität als CD28), blockiert die Bindung von CD28 an B7, inhibiert die T-Zellaktivierung und induziert das Nichtansprechen von T-Zellen in vitro (F. A. Harding, J. G. McArthur, J. A. Gross, D. H. Raulet, J. P. Allison, Nature 356: 607 (1992); P. S. Linsley et al., J. Exp. Med. 174: 561 (1991)).
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und unterstützen den Fachmann bei ihrer Ausführung und Verwendung. Die Beispiele sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung begrenzen.
BEISPIEL 1
Herstellung von B7Ig- und CD28-Fusionsproteinen
Rezeptor-Immunglobulin C gamma (IgCγ)-Fusionsproteine B7Ig und CD28Ig wurden hergestellt in Anlehnung an die Beschreibung von Linsley et al., in J. Exp. Med. 173: 721–730 (1991). Kurzum, DNA, die Aminosäuresequenzen kodierte, die dem jeweiligen Rezeptorprotein (z.B. B7) entsprachen, wurde mit DNA verbunden, die Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem IgCγ1 entsprachen. Dies wurde wie folgt bewerkstelligt.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Für die PCR wurden DNA-Fragmente amplifiziert, wobei man unten beschriebene Primerpaare für jedes Fusionsprotein verwendete. Durchgeführt wurden PCR-Reaktionen (0,1 ml Endvolumen) in Tag-Polymerasepuffer (Stratagene, La Jolla, CA), der jeweils 20 μmol dNTP; 50–100 pmol der angegebenen Primer; Templat (1 ng Plasmid oder cDNA, hergestellt aus ≤ 1 μg Gesamt-RNA, wobei man Random-Hexamer-Primer verwendete, so beschrieben von Kawasaki in PCR Protocols, Academic Press, S. 21–27 (1990), worauf Bezug genommen wird); und Tag-Polymerase (Stratagene) enthielt. Die Reaktionen wurden auf einem Thermocycler (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) bei 16–30 Zyklen durchgeführt (ein typischer Zyklus bestand aus folgenden Schritten: 1 min bei 94°C, 1–2 min bei 50°C und 1–3 min bei 72°C).
Plasmid-Konstruktion. CD28-kodierende cDNA enthaltende Expressionsplasmide, so beschrieben von Aruffo und Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573 (1987), wurden von Drs. Aruffo und Seed (Mass General Hospital, Boston, MA) zur Verfügung gestellt. CD5-kodierende cDNA enthaltende Plasmide, so beschrieben von Aruffo, Cell 61: 1303 (1990), wurden von Dr. Aruffo zur Verfügung gestellt. B7-kodierende cDNA enthaltende Plasmide, so beschrieben von Freeman et al., J. Immunol. 143: 2714 (1989), wurden von Dr. Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA) zur Verfügung gestellt. Für anfängliche Versuche, lösliche Formen von CD28 und B7 zu exprimieren, wurden in Anlehnung an die Beschreibung von Linsley et al., J. Exp. Med., s. oben, Konstrukte (OMCD28 und OMB7) hergestellt, in denen stromaufwärts der Transmembrandomänen Stop-Codons eingefügt und das native Signalpeptid durch das Signalpeptid aus Oncostatin M (Malik et al., Mol. Cell. Biol. 9: 2847 (1989)) ersetzt wurde. Deren Herstellung erfolgte unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide zur Rekonstruktion (OMCD28) oder als Primer (OMB7) für die PCR. OMCD28 ist eine CD28-cDNA, die im Hinblick auf eine effizientere Expression durch Ersatz des Signalpeptids mit der analogen Region aus Oncostatin M modifiziert ist. CD28Ig- und B7Ig-Fusionskonstrukte wurden in zwei Teilen hergestellt. Die 5'-Abschnitte stellte man her, indem man OMCD28 und OMB7 als Template und das Oligonukleotid,
CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC (SEQ ID NO:1), (welches die Aminosäuresequenz kodierte, die dem Oncostatin M-Signalpeptid entsprach) als vorwärts gerichteten Primer und entweder
TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA (SEQ ID NO:2) bzw. TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT (SEQ ID NO:3) als rückwärts gerichteten Primer verwendete. Die Produkte aus der PCR-Reaktion wurden mit Restriktionsendonukleasen (Hindlll und Bcll) an mit den PCR-Primern eingeführten Stellen geschnitten und gelgereinigt.
Der 3'-Abschnitt des Fusionskonstruktes, der humanen IgCγ1-Sequenzen entsprach, wurde mit einer Reverse Transcriptase- (aus Avian Myeloplastosevirus; Life Sciences Associates, Bayport, NY) und PCR-gekoppelten Reaktion hergestellt, wobei man RNA aus einer Mensch-Maus-chimären mAk L6 produzierenden Myelomzelllinie (zur Verfügung gestellt von Dr. P. Fell und M. Gayle, Bristol-Myers Squibb Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA) als Templat verwendete. Das Oligonukleotid,
AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACAC
ATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG (SEQ ID NO:4), wurde als vorwärts gerichteter Primer und
CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (SEQ ID NO:5) als rückwärts gerichteter Primer verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden mit Bcll und Xbal geschnitten und gelgereinigt. Die fertigen Konstrukte wurden zusammengesetzt, indem man die CD28- oder B7-Sequenzen enthaltenden Hindlll/Bcll-geschnittenen Fragmente zusammen mit dem IgCγ1-Sequenzen enthaltenden Bcll/Xbal-geschnittenen Fragment in Hindlll/Xbal-geschnittenes CDM8 ligierte. Die Ligationsprodukte wurden in MC1061/p3-E. coli-Zellen transformiert, und es wurden Kolonien auf die zweckmäßigen Plasmide gescreent. Die Sequenzen der resultierenden Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Das B7-kodierende Konstrukt enthielt DNA, die Aminosäuren kodierte, welche den Aminosäureresten von etwa Position 1 bis etwa Position 215 der extrazellulären Domäne von B7 entsprachen. Das CD28-kodierende Konstrukt enthielt DNA, die Aminosäuren kodierte, welche den Aminosäureresten von etwa Position 1 bis etwa Position 134 der extrazellulären Domäne von CD28 entsprachen.
CD5Ig wurde genauso hergestellt, wobei man
CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (SEQ ID NO:6)
als vorwärts gerichteten Primer und
ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC (SEQ ID NO:7)
als rückwärts gerichteten Primer verwendete. Das PCR-Produkt wurde mit Restriktionsendonuklease verdaut und mit dem IgCγ1-Fragment, wie oben beschrieben, ligiert. Das resultierende Konstrukt (CD5Ig) kodierte ein reifes Protein mit einer die Aminosäurereste von Position 1 bis Position 347 der CD5 entsprechenden Sequenz enthaltenden Aminosäuresequenz, zwei durch das Konstruktionsverfahren eingeführten Aminosäuren (Aminosäuren DQ) und einer sich anschließenden DNA, die für Aminosäuren kodierte, die der IgCγ1-Hinge-Region entsprachen.
Zellkultur und Transfektionen. COS (Affennierenzellen) wurden mit CD28 und B7 exprimierenden Expressionsplasmiden transfiziert, indem man ein modifiziertes Protokoll von Seed und Aruffo (Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 3365 (1987)) verwendete. 18 bis 24 h vor der Transfektion wurden Kulturschalen mit Zellen (10⁶ pro 10 cm Durchmesser) beimpft. Plasmid-DNA wurde in einem Volumen von 5 ml serumfreiem DMEM, das 0,1 mM Cloroquin und 600 μg/ml DEAE-Dextran enthielt, zugegeben (etwa 15 μg/Schale), und die Zellen wurden bei 37°C 3–3,5 h inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden dann kurz (etwa 2 min) mit 10%-igem Dimethylsulfoxid in PBS behandelt und 16–24 h bei 37°C in 10% FCS enthaltendem DMEM inkubiert. 24 h nach Transfektion wurde das Kulturmedium entfernt und durch serumfreies DMEM (6 ml/Schale) ersetzt. Es wurde drei Tage bei 37°C weiter inkubiert; dann wurde das verbrauchte Medium eingesammelt, und frisches serumfreies Medium wurde zugegeben. Nach weiteren drei Tagen bei 37°C wurde das verbrauchte Medium erneut eingesammelt, und die Zellen wurden verworfen.
CD28, CD5 oder B7 exprimierende CHO-Zellen wurden in Anlehnung an die Beschreibung von Linsley et al., (1991), s. oben, wie folgt isoliert: kurzum, CD28, CD5 oder B7 exprimierende stabile Transfektanden wurden isoliert, nachdem man Dihydrofolatreduktase-defiziente Ovarzellen chinesischer Hamster (dhfr^–-CHO-Zellen) mit einem Gemisch aus zweckmäßigem Expressionsplasmid und selektierbarem Marker, pSV2dhfr (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5031 (1990)), cotransfiziert hatte. Die Transfektanden wurden dann in bis auf ein Endniveau von 1 μM ansteigenden Konzentrationen an Methotrexat aufgezogen, und sie wurden in mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 0,2 mM Prolin und 1 μM Methotrexat ergänztem DMEM gehalten. Große Mengen an CD28 (CD28⁺-CHO) oder B7 (B7⁺-CHO) exprimierende CHO-Linien wurden im Anschluss an eine indirekte Immunfärbung mit den mAkn 9.3 oder BB-1 durch mehrere Durchgänge fluoreszenzaktivierter Zelltrennung (FACS^R) isoliert. Im Hinblick auf die Oberflächenexpression von CD28 oder B7 negative, amplifizierte CHO-Zellen (dhfr⁺-CHO) wurden ebenfalls mit FACS^R aus CD28-transfizierten Populationen isoliert.
Immunfärbung und FACS^R-Analyse. Transfizierte CHO- oder COS-Zellen oder aktivierte T-Zellen wurden mit indirekter Immunfärbung untersucht. Bevor man färbte, wurden die CHO-Zellen aus ihren Kulturgefäßen durch Inkubation in 10 mM EDTA enthaltendem PBS entfernt. Die Zellen wurden zunächst mit murinem mAkn 9.3 (Hansen et al., Immunogenetics 10: 247 (1980)) oder BB-1 (Yokochi et al., Immunol. 128:823 (1981)), oder mit Ig-Fusionsproteinen (alle bei 10 μg/ml in 10 % FCS enthaltendem DMEM) 1–2 h bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und weitere 0,5–2 h bei 4°C mit einem FITC-konjugierten Zweitstufenreagenz (Ziege-anti-Maus-Ig-Serum für murine mAk oder Ziege-anti-Mensch-Ig-Cγ-Serum für Fusionsproteine (Tago, Inc., Burlingame, CA)) inkubiert. Die Fluoreszenz wurde auf einem FACS IV^R-Zellsorter (Becton Dickinson und Co., Mountain View, CA) untersucht, der mit einer logarithmischen Verstärkungseinheit (vier Zehner-Potenzen) ausgestattet war.
Reinigung von Ig-Fusionsproteinen. Die erste, zweite und dritte Ansammlung von verbrauchtem, serumfreien Kulturmedium aus transfizierten COS-Zellen wurden als Quellen für die Reinigung von Ig-Fusionsproteinen verwendet. Nachdem man Zelltrümmer durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt hatte, wurde das Medium auf eine mit 0,05 M Natriumcitrat, pH 8,0, äquilibrierte Säule (etwa 200–400 ml Medium/ml gepacktes Bettvolumen) von immobilisiertem Protein A (Repligen Corp., Cambridge, MA) aufgetragen. Nachdem man das Medium aufgetragen hatte, wurde die Säule mit 1 M Kaliumphosphat, pH 8, gewaschen, und gebundenes Protein wurde mit 0,05 M Natriumcitrat, pH 3, eluiert. Es wurden Fraktionen gesammelt, und diese wurden durch Zugabe von 1/10 Volumen von 2 M Tris, pH 8, sofort neutralisiert. Diejenigen Fraktionen, die den Peak von A₂₈₀-absorbierendem Material enthielten, wurden zusammengegeben und gegen PBS vor Gebrauch dialysiert. Extinktionskoeffizienten von 2,4 und 2,8 ml/mg für CD28Ig bzw. B7Ig wurden durch Aminosäureanalyse von Lösungen bekannter Extinktion ermittelt. Die Bindungsaktivitäten von gereinigtem CD28Ig und B7Ig konnten nahezu quantitativ wiedergewonnen werden, wie die FACS^R-Analyse nach indirekter Fluoreszenzfärbung von B7⁺- und CD28⁺-CHO-Zellen belegte.
BEISPIEL 2
Herstellung von CTLA4Ig-Fusionsprotein
Eine lösliches CTLA4Ig kodierende genetische Fusion zwischen der extrazellulären Domäne von CTLA4 und einer IgCγi-Domäne wurde in ähnlicher Weise konstruiert, wie oben für das CD28Ig-Konstrukt beschrieben ist. Die extrazelluläre Domäne des CTLA4-Gens wurde mit PCR kloniert, wobei man synthetische Oligonukleotide verwendete, die der veröffentlichten Sequenz entsprachen (Dariavach et al., Eur. Jour. Immunol. 18: 1901–1905 (1988)).
Da ein Signalpeptid für CTLA4 im CTLA4-Gen nicht identifiziert werden konnte, wurde der N-Terminus der vorhergesagten Sequenz von CTLA4 an das Signalpeptid von Oncostatin M (Malik et al., Mol. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989)) in zwei Schritten gebunden, wobei man überlappende Oligonukleotide verwendete. Für den ersten Schritt wurde das Oligonukleotid
CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTG GCCCAGCC (SEQ ID NO:8)
(welches die mit den 7 N-terminalen Aminosäuren von CTLA4 fusionierten 15 C-terminalen Aminosäuren des Oncostatin M-Signalpeptids kodierte) als vorwärts gerichteter Primer, und
TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (SEQ ID NO:9)
(welches die Aminosäurereste 119–125 derjenigen Aminosäuresequenz, die den CTLA4-Rezeptor kodierte und eine restriktionsenzymatische Bcll-Stelle enthielt) als rückwärts gerichteter Primer verwendet. Das Templat für diesen Schritt war cDNA, die ausgehend von 1 μg Gesamt-RNA aus H38-Zellen (eine HTLV II-infizierte T-Zell-Leukämiezelllinie, durch die Drs. Salahudin und Gallo, NCI, Bethesda, MD zur Verfügung gestellt) synthetisiert worden war. Ein Teil des PCR-Produkts aus der ersten Stufe wurde erneut amplifiziert, wobei man einen überlappenden vorwärts gerichteten Primer, der den N-terminalen Abschnitt des Oncostatin M-Signalpeptids kodierte und eine Hindlll-Restriktionsendonukleasestelle enthielt, nämlich
CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGT CTGGTCCTTGCACTC (SEQ ID NO:10),
und den gleichen rückwärts gerichteten Primer verwendete. Das Produkt der PCR-Reaktion wurde mit Hindlll und Bcll verdaut und zusammen mit einem Bcll/Xbalgeschnittenen cDNA-Fragment, das diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von IgCγ1 entsprachen, in den Hindlll/Xbal-geschnittenen Expressionsvektor CDM8 oder Hindlll/Xbal-geschnittenen Expressionsvektor πLN (durch Dr. Aruffo zur Verfügung gestellt) ligiert.
Eine Karte des resultierenden CTLA4Ig-Fusionskonstrukts ist in 1 gezeigt. Die in dieser Figur aufgeführten Sequenzen zeigen die Verbindungen zwischen CTLA4 (obere Buschstabenreihe, nicht schattierte Regionen) und dem Signalpeptid SP von Oncostatin M (dunkel schattierte Regionen), und dem Hinge H von IgCγ1 (gepunktete Regionen). Die Aminosäure in Klammern wurde während der Konstruktion eingeführt. Sternchen (*) verweisen auf Cystein-zu-Serin-Mutationen, die in der IgCγ-Hinge-Region eingeführt wurden. Die in CTLA4 vorhandene V-artige Domäne der Immunoglobulin-Superfamilie ist genauso gezeigt wie die CH2- und CH3-Domänen von IgCγ1.
Dann wurden CTLA4Ig enthaltende Expressionsplasmide CDM8 in COS-Zellen transfiziert, wobei man eine modifizierte DEAE/Dextran-Transfektion (Linsley et al., 1991, s. oben) nach dem von Seed und Aruffo, 1987, s. oben beschriebenen Protokoll verwendete.
Expressionsplasmid-Konstrukte (πLN oder CDM8), welche die für die Aminosäuresequenz von CTLA4Ig kodierende cDNA enthielten, wurden durch Lipofektion nach Standardmethoden in dhfr^–-CHO-Linien transfiziert, wodurch CTLA4Ig stabil exprimierende, neue Zelllinien erhalten wurden.
DNA, die für die CTLA4Ig entsprechende Aminosäuresequenz kodierte, wurde bei der ATCC gemäß dem Budapester Vertrag am 31. Mai 1991 hinterlegt; ihr wurde die ATCC-Hinterlegungsnummer 68629 zugeteilt.
Ein bevorzugter stabiler Transfektand, der CTLA4Ig exprimiert und als Ovarzelllinie chinesischer Hamster CTLA4Ig-24 bezeichnet wird, wurde hergestellt, indem man B7-positive CHO-Zelllinien im Medium auf B7-Bindungsaktivität screente, wobei man Immunfärbung verwendete. Es wurden Transfektanden erhalten in DMEM, das mit 10%-igem fötalem Rinderserum (FBS), 0,2 mM Prolin und 1 μM Methotrexat ergänzt war.
Die CHO-Zelllinie CTLA4Ig-24 wurde bei der ATCC gemäß dem Budapester Vertrag am 31. Mai 1991 hinterlegt; ihr wurde die Hinterlegungsnummer ATCC 10762 zugeteilt.
CTLA4Ig wurde mit Protein A-Chromatographie aus serumfreien konditionierten Überständen gereinigt (2). Es wurden die Konzentrationen von CTLA4Ig bestimmt, wobei man einen Extinktionskoeffizienten bei 280 nm von 1,6 annahm (experimentell durch Aminosäureanalyse einer Lösung mit bekannter Extinktion bestimmt). Molekulargewichtsstandards (Spur 1 und Spur 3, 2) und Proben (1 μg) von CTLA4Ig (Spur 2 und Spur 4) wurden einer SDS-PAGE (4–12%-iger Acrylamidgradient) unter nicht reduzierenden Bedingungen (–βME, Spur 1 und Spur 2) oder unter reduzierenden Bedingungen (+βME, Spur 3 und Spur 4) unterzogen. Proteine wurden durch Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau sichtbar gemacht.
Unter nicht reduzierenden Bedingungen wanderte CTLA4Ig wie eine Spezies mit einem M_r von etwa 100000, und unter reduzierenden Bedingungen wie eine Spezies mit einem M_r von etwa 50000 (2). Da die IgCγ-Hinge-Disulfide während der Konstruktion entfernt worden waren, ist CTLA4Ig wie CD28Ig ein Dimer, das vermutlich durch eine native Disulfidbrücke verbunden ist.
BEISPIEL 3
CTLA4-Rezeptor
Zur Rekonstruktion von DNA, die diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die dem vollständigen humanen CTLA4-Gen entspricht, wurde eine cDNA, die diejenigen Aminosäuren kodierte, die einem Fragment der Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen von CTLA4 entsprachen, mit PCR kloniert und dann mit cDNA verbunden, die diejenigen Aminosäuren kodierte, die einem Fragment aus CTLA4Ig entsprachen, welches wiederum dem mit dem N-Terminus von CTLA4 fusionierten Oncostatin M-Signalpeptid entsprach. Die Vorgehensweisen bezüglich PCR, Zellkultur und Transfektionen entsprachen obiger Beschreibung in Beispiel 1, wobei man COS-Zellen und die DEAE-Dextran-Transfektion verwendete.
Da über die Expression von CTLA4-Rezeptorprotein in humanen Lymphoidzellen bisher noch nicht berichtet worden war, ist es erforderlich gewesen, eine Quelle für CTLA4-mRNA auszumachen. Wie oben erläutert, wurde aus der gesamten zellulären RNA von H38-Zellen revers transkribierte PCR-cDNA für die PCR-Klonierung verwendet. Zu diesem Zweck wurde das Oligonukleotid
GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (SEQ ID NO:11)
(welches die ersten 11 Aminosäuren der vorhergesagten kodierenden Sequenz kodierte) als vorwärts gerichteter Primer und
TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (SEQ ID NO:12)
(welches zu den letzten 8 Aminosäuren in CTLA4 homolog war und eine Xbal-Stelle enthielt) als rückwärts gerichteter Primer verwendet. Das Templat war wiederum eine cDNA, die ausgehend von 1μ RNA aus H38-Zellen synthetisiert worden war. Die Produkte der PCR-Reaktion wurden mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und Xbal geschnitten, und das resultierende 316 bp-Produkt wurde gelgereinigt. Ein Hindlll/Ncol-Fragment (340 bp) aus der oben beschriebenen CTLAIg-Fusion wurde ebenfalls gelgereinigt, und die beiden Restriktionsfragmente wurden in Hindlll/Xbal-geschnittenes CDM8 ligiert, was OMCTLA ergab.
Das resultierende Konstrukt entsprach vollständigem CTLA4 (SEQ ID Nrn:13 und 14) und dem Oncostatin M-Signalpeptid. Das Konstrukt ist in 3 gezeigt und wurde als OMCTLA4 bezeichnet. Die in 3 gezeigte Sequenz für CTLA4 unterscheidet sich von der vorhergesagten humanen CTLA4-DNA-Sequenz (Dariavach et al., s. oben) durch einen Basenaustausch derart, dass das zuvor berichtete Alanin an Aminosäureposition 111 der gezeigten Aminosäuresequenz durch ein Threonin ersetzt ist. Dieses Threonin ist Teil einer neu identifizierten N-verknüpften Glycosylierungsstelle, die für eine erfolgreiche Expression des Fusionsproteins wichtig sein kann.
Die Ligationsprodukte wurden in E. coli-Zellen MC1061/p3 transformiert, und es wurden Kolonien auf die geeigneten Plasmide gescreent. Sequenzen der resultierenden Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
BEISPIEL 4
Charakterisierung von CTLA4Ig
Zur Charakterisierung des CTLA4Ig-Konstrukts wurden mehrere Isolate, nämlich CD28Ig, B7Ig und CD5Ig, in Anlehnung an obige Beschreibung hergestellt, in COS-Zellen in Anlehnung an die Beschreibung in den Beispielen 2 und 3 transfiziert und durch FACS^R-Analyse auf die Bindung von B7Ig untersucht. Zusätzlich zu den oben erwähnten Konstrukten wurden auch CD7-kodierende cDNAs enthaltende CDM8-Plasmide verwendet, so beschrieben von Aruffo und Seed, (EMBO Jour. 6:3313–3316 (1987)).
mAk. Murine monoklonale Antikörper (mAk) 9.3 (anti-CD28) und G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), BB-1 (anti-B7-Antigen) und Ratten-mAk 187.1 (anti-Maus-K-Kette) sind zuvor beschrieben worden (Ledbetter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1384–1388 (1987); Ledbetter et al., Blood 75:1531 (1990); Yokochi et al., s. oben) und wurden aus Ascites vor Gebrauch gereinigt. Das mAk OKT8 produzierende Hybridom wurde von der ATCC, Rockville, MD erhalten, und der mAk wurde ebenfalls aus Ascites vor Gebrauch gereinigt. Der mAk 4G9 (anti-CD19) wurde durch Dr. E. Engleman, Stanford University, Palo Alto, CA zur Verfügung gestellt. Gereinigter Mensch-Maus-chimärer mAk L6 (mit humanem Cγ1-Fc-Abschnitt) war ein Geschenk von Dr. P. Fell und M. Gayle (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).
Immunfärbung und FACS^R-Analyse. Vor der Färbung wurden COS- oder CNO-Zellen aus Kulturgefäßen durch Inkubation in 10 mM EDTA enthaltendem PBS entfernt. Die Zellen wurden zunächst mit mAkn oder Ig-Fusionsproteinen bei 10 μg/ml in 10 % FBS enthaltendem DMEM ein bis zwei Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und weitere 0,5–2 Stunden bei 4°C mit FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin oder mit FITC-konjugiertem Ziege-anti-Mensch-IgCγ-Serum (beides von Tago, Burlingame, CA) inkubiert. Wurde die Bindung sowohl von mAkn als auch von Ig-Fusionsproteinen in demselben Experiment gemessen, so wurden FITC-konjugierte anti-Maus- und anti-Mensch-Zweitstufenreagenzien vor Gebrauch zusammengemischt. Die Fluoreszenz wurde dann an insgesamt 10 000 Zellen mit FACS^R analysiert.
Abtrennung und Stimulation peripherer Blutlymphozyten. Periphere Blutlymphozyten (PBLs) wurden durch Zentrifugation mit "Lymphocyte Separation Medium" (Litton Bionetics, Kensington, MD) isoliert. Alloreaktive T-Zellen wurden durch Stimulation von PBLs in einer primären gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) isoliert. PBLs wurden mit 10⁶/ml bestrahlten (5 000 rad) T51-LCLs kultiviert. EBV-transformierte Lymphoblastoid-Zelllinien (LCL), PM (Bristol-Myers Squibb Co.) und T51 (Bristol-Myers Squibb Co.), wurden in RPMI gehalten, das mit 10 % FBS ergänzt war. Nach 6 Tagen wurden alloreaktive "Blasten"-Zellen gefriergetrocknet. Es wurde eine sekundäre MLR durchgeführt, indem man aufgetaute alloreaktive Blasten zusammen mit frischen bestrahlten T51-LCLs mit oder ohne mAk und Ig-Fusionsproteinen kultivierte. Die Zellen wurden in Platten mit 96 flachbödigen Näpfen (4 × 10⁴ alloreaktive Blasten und 1 × 10⁴ bestrahlte T51-LCL-Zellen/Napf in einem Volumen von 0,2 ml) in 10 % FBS enthaltendem RPMI kultiviert. Die zelluläre Proliferation von 4-fach-Kulturen wurde anhand der Aufnahme von [³H]-Thymidin während der letzten 6 Stunden einer 2–3-tägigen Kultur gemessen.
PHA-aktivierte T-Zellen wurden hergestellt, indem PBLs 5 Tage mit 1 μg/ml PHA (Wellcome, Charlotte, NC) und einen Tag in Medium ohne PHA kultivierte. Lebensfähige Zellen wurden durch Sedimentation in "Lymphocyte Separation Medium" vor Gebrauch eingesammelt. Die Zellen wurden mit mAkn oder transfizierten CHO-Zellen 4–6 Stunden bei 37°C stimuliert, durch Zentrifugation eingesammelt und zur Präparation von RNA verwendet.
CD4⁺-T-Zellen wurden aus PBLs isoliert, indem PBLs aus gesunden Spendern in T- und Nicht-T-Zellen auftrennte, wobei man die Schaferythrozyten-Rosettentechnik verwendete, und des Weiteren T-Zellen durch "panning" in CD4⁺-Zellen auftrennte, so beschrieben von Damle et al., J. Immunol. 139: 1501 (1987). B-Zellen wurden ebenfalls aus peripherem Blut durch "panning" gereinigt, so beschrieben von Wysocki und Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 2844 (1978), wobei man den anti-CD19-mAk 4G9 verwendete. Zur Messung der T_h-induzierten Ig-Produktion wurden 10⁶ CD4⁺-T-Zellen mit 10⁶ CD19⁺-B-Zellen in 1 ml 10 % FBS enthaltendem RPMI vermischt. Im Anschluss an die 6-tägige Kultur bei 37°C wurde die Produktion von humanem IgM in den Kulturüberständen gemessen, wobei man einen Festphasen-ELISA verwendete, so beschrieben von Volkman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2528 (1981). Kurzum, Mikrotiter-ELISA-Platten mit 96 flachbödigen Näpfen (Corning, Corning, NY) wurden mit 200 μl/Napf Natriumcarbonatpuffer (pH 9,6), der 10 μg/ml affinitätsgereinigte Ziege-anti-Mensch-IgG- oder -IgM-Antikörper (Tago, Burlingame, CA) enthielt, beschichtet, über Nacht bei 4°C inkubiert und dann mit PBS gewaschen; des Weiteren wurden die Näpfe mit 2%-igem BSA in PBS (BSA-PBS) blockiert. Die zu prüfenden Proben wurden in geeigneter Verdünnung in diese Näpfe gegeben und mit 200 μl/Napf von 1:1000 verdünnter Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierter F(ab')₂-Fraktion von affinitätsgereinigtem Ziege-anti-Mensch-IgG- oder -IgM-Antikörper (Tago) inkubiert. Die Platten wurden dann gewaschen, und 100 μl/Napf einer Lösung (0,6 mg/ml in Citratphosphatpuffer mit pH 5,5 und 0,045 % Wasserstoffperoxid) von o-Phenylendiamin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden zugegeben. Die Farbentwicklung wurde mit 2 N Schwefelsäure gestoppt. Es wurde die Extinktion bei 490 nm mit einem automatischen ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Test- und Kontrollproben wurden 3-fach vorgenommen, und die Extinktionswerte wurden mit denjenigen verglichen, die mit bekannten IgG- oder IgM-Standards erhalten wurden, die gleichzeitig mit den Überstandproben vorgenommen wurden, um die Eichkurve zu erstellen, anhand derer die Konzentrationen von Ig im Kulturüberstand quantifiziert wurden. Die Daten sind ausgedrückt in ng/ml von Ig ± SEM von entweder 3-fach- oder 4-fach-Kulturen.
Immunpräzipitations-Analyse und SDS-PAGE. Zellen wurden mit ¹²⁵I oberflächenmarkiert und einer Immunpräzipitations-Analyse unterzogen. Kurzum, PHA-aktivierte T-Zellen wurden mit ¹²⁵I oberflächenmarkiert, wobei man Lactoperoxidase und H₂O₂ verwendete, so beschrieben von Vivetta et al., J. Exp. Med. 134: 242 (1971). Die SDS-PAGE-Chromatographie wurde auf Gelen mit linearen Acrylamidgradienten mit Sammelgelen aus 5 % Acrylamid durchgeführt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt, entfärbt und fotografiert, oder getrocknet und ein Röntgenfilm bestrahlt (Kodak XAR-5).
Bindungs-Untersuchungen. B7Ig wurde mit ¹²⁵I bis zu einer spezifischen Aktivität von etwa 2 × 10⁶ cpm/pmol markiert. Plastikschalen mit 96 Näpfen wurden 16–24 Stunden mit einer CTLA4Ig enthaltenden Lösung (0,5 μg in einem Volumen von 0,05 ml 10 mM Tris, pH 8) beschichtet. Die Näpfe wurden mit Bindungspuffer (50 mM BES (Sigma Chemical Co.) enthaltendem DMEM, pH 6,8, 0,1 % BAS und 10 % FCS) blockiert, bevor man eine ¹²⁵I-B7Ig (etwa 5 × 10⁵cpm) enthaltende Lösung (0,09 ml) mit oder ohne Kompetitor zugab. Im Anschluss an eine 2–3-stündige Inkubation bei 23°C wurden die Vertiefungen einmal mit Bindungspuffer und viermal mit PBS gewaschen. Gebundene Radioaktivität wurde dann durch Zugabe von 0,5 N NaOH solubilisiert und mit einem Gammazähler quantifiziert.
Bindung an B7Ig. Die funktionelle Aktivität des OMCTLA4-Konstrukts, welches für das komplette humane CTLA4-DNA-Gen kodiert, wird in dem in 4 dargestellten Experiment gezeigt. COS-Zellen wurden in Anlehnung an obige Beschreibung mit den Expressionsplasmiden CD7, OMCD28 und OMCTLA4 transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen eingesammelt und nur mit Medium (ohne Zusatz) oder mit den mAkn 9.3, B7Ig, CD5Ig oder G3-7 inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und die Bindung wurde mit einem Gemisch aus FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Ig- und FITC-konjugiertem Ziege-anti-Mensch-Ig-Zweitstufenreagenz detektiert. Die transfizierten Zellen wurden auf die Expression des geeigneten Zelloberflächenmarkers mit indirekter Immunfärbung untersucht, und die Fluoreszenz wurde in Anlehnung an obige Beschreibung mit der FACS^R-Analyse gemessen.
Wie in 4 gezeigt ist, band mAk 9.3 an CD28-transfizierte COS-Zellen, jedoch nicht an CTLA4-transfizierte Zellen. Dagegen band das B7Ig-Fusionsprotein (jedoch nicht das Kontroll-CD5Ig-Fusionsprotein) sowohl an CD28- als auch an CTLA4-transfizierte Zellen. CD7-transfizierte COS-Zellen banden weder an mAk 9.3 noch an die Fusionsproteine. Dies zeigt, dass sowohl CD28 als auch CTLA4 an das B-Zell-Aktivierungsantigen B7 binden. Darüber hinaus konnte keine Bindung von mAk 9.3 an CTLA4 nachgewiesen werden.
Bindung von CTLA4Ig an B7-positive CHO-Zellen. Zur weiteren Charakterisierung der Bindung von CTLA4Ig und B7 wurde die Bindungsaffinität von gereinigtem CTLA4Ig an B7⁺-CHO-Zellen und an eine Lymphoblastoidzelllinie (PM-LCL) in dem in 5 gezeigten Experiment gemessen. Amplifizierte, transfizierte CHO-Zelllinien und PM-LCLs wurden nur mit Medium (ohne Zusatz) oder einer äquivalenten Konzentration von humanes IgCγ1 enthaltenden Proteinen (10 μg/ml) von CD5Ig, CD28Ig oder CTLA4Ig inkubiert. Nachdem man FITC-konjugierte Ziege-anti-Mensch-Ig-Zweitstufenreagenzien zugegeben hatte, wurde die Bindung mit FACS^R detektiert. Insgesamt 10000 gefärbte Zellen wurden mit FACS^R untersucht.
Wie in 5 gezeigt ist, band CD28Ig an B7⁺-CHO-Zellen, jedoch nicht an PM-LCL, einer Zelllinie, die relativ geringe Mengen an B7-Antigen exprimierte (Linsley et al., s. oben, 1990). CTLA4Ig band stärker an beide Zelllinien als CD28Ig, was nahe legt, dass es mit höherer Affinität band. Weder CD28Ig noch CTLA4Ig band an CD28⁺-CHO-Zellen.
Bindungsaffinität von CTLA4Ig und B7Ig. Dann wurde die scheinbare Wechselwirkungsaffinität zwischen CTLA4Ig und B7Ig gemessen, indem man einen Festphasen-Kompetitionsbindungstest verwendete. Plastikschalen mit 96 Näpfen wurden in Anlehnung an obige Beschreibung mit CTLA4Ig beschichtet. B7Ig wurde mit ¹²⁵I (5 × 10⁵ cpm, 2 × 10⁶ cpm/pmol) radiomarkiert und in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen (siehe 6) an unmarkiertem, chimären mAk L6, mAk 9.3, mAk BB-1 oder B7Ig in einer Konzentration von 4 nM zugesetzt. Es wurde die an die Platte gebundene Radioaktivität bestimmt, und diese wurden als prozentualer Anteil derjenigen Radioaktivität ausgedrückt, die in den ohne Kompetitor behandelten Vertiefungen gebunden war (28300 cpm). Jeder Punkt steht für den Mittelwert einer Doppelbestimmung; Wiederholungen variierten im Allgemeinen mit ≤ 20 % um den Mittelwert. Die Konzentrationen wurden auf der Grundlage eines M_r von 75000 pro Bindungsstelle für mAk und 51000 pro Bindungsstelle für B7Ig berechnet.
Wie in 6 gezeigt ist, konkurrierten nur der mAk BB-1 und unmarkiertes B7Ig signifikant um die ¹²⁵I-B7Ig-Bindung (halbmaximale Wirkungen bei etwa 22 nM bzw. etwa 175 nM). Weder der chimäre mAk L6 noch der mAk 9.3 konkurrierten wirksam bei den getesteten Konzentrationen. In weiteren Experimenten reichten die Konzentrationen von mAk 9.3 aus, um die Bindung von ¹²⁵I-B7Ig an immobilisiertes CD28Ig oder an oberflächenexprimiertes CD28 mit ≥ 90 % zu inhibieren.
Trägt man die Kompetitionsdaten aus 6 als Scatchard-Plot auf, wurde eine Dissoziationskonstante K_d von etwa 12 nM für die Bindung von ¹²⁵I-B7 an immobilisiertes CTLA4Ig berechnet (7). Dieser Wert liegt etwa 20-mal niedriger als die zuvor für die Bindung zwischen ¹²⁵I-B7Ig und CD28 bestimmte K_d (etwa 200 nM) (Linsley et al., (1991), s. oben), ein Hinweis darauf, dass CTLA4 ein Rezeptor mit höherer Affinität für das B7-Antigen ist als der CD28-Rezeptor.
Zur Identifizierung der CLTA4Ig bindenden Moleküle auf Lymphoblastoidzellen (7) wurden ¹²⁵I-oberflächenmarkierte Zellen einer Immunpräzipitations-Analyse unterzogen (8). B7⁺-CHO- und PM-LCL-Zellen wurden mit ¹²⁵I oberflächenmarkiert und in Anlehnung an obige Beschreibung mit einer nichtionischen Detergenzlösung extrahiert. Aliquots von etwa 1,5 × 10⁷ cpm in einem Volumen von 0,1 ml enthaltenden Extrakten wurden in Anlehnung an obige Beschreibung einer Immunpräzipitations- Analyse ohne Zusatz oder mit jeweils 2 μg CD28Ig, CTLA4Ig oder CD5Ig unterzogen. Die gewaschenen Immunpräzipitate wurden dann mit SDS-PAGE (10–20%iger Acrylamidgradient) unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Das Gel wurde dann getrocknet und autoradiographiert. Der linke Teil der 8 zeigt ein nach 1-tägiger Bestrahlung erhaltenes Autoradiogramm. Der rechte Teil der 8 zeigt ein Autoradiogramm desselben Gels nach 10-tägiger Bestrahlung. Das Autoradiogramm im mittleren Teil der 8 wurde ebenfalls 10 Tage bestrahlt. Die Positionen der Molekulargewichtsstandards sind ebenfalls in dieser Figur angezeigt.
Wie von 8 gezeigt ist, wurde ein diffus wanderndes (M_r von etwa 50000–75000; Zentrum bei etwa 60000), radiomarkiertes Protein durch CTLA4Ig, jedoch nicht durch CD28Ig oder CD5Ig immunpräzipitiert. Dieses Molekül wanderte mit B7, das aus B7⁺-CHO-Zellen durch CTLA4Ig und wesentliche schwächer durch CD28Ig immunpräzipitiert worden war. Diese Befunde zeigen, dass CTLA4Ig an ein einzelnes Protein auf Lymphoblastoidzellen bindet, dessen Größe derjenigen des B7-Antigens ähnlich ist.
Inhibition von Immunantworten in vitro durch CTLA4Ig
Inhibition der Proliferation. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der anti-CD28-mAk 9.3 und der anti-B7-mAk BB-1 die Proliferation von Alloantigen-spezifischen T_h-Zellen ebenso wie die Immunglobulinsekretion durch Alloantigen-präsentierenden B-Zellen inhibieren (Damle, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5096 (1981); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 16: 1289 (1986)). Da CTLA4 – wie hier gezeigt – ein hochaffiner Rezeptor für das B7-Antigen ist, wurde lösliches CTLA4Ig dahingehend untersucht, ob es diese Antworten inhibieren kann. Die Wirkungen von CTLA4Ig auf die T-Zellproliferation wurden in dem in 9 gezeigten Experiment untersucht.
Blasten aus der primären gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) wurden mit bestrahlten T51-Lymphoblastoidzellen (LC) mit oder ohne Konzentrationen an Fab-Fragmenten des murinen mAk 9.3, oder an B7Ig-, von CD28Ig- oder CTLA4Ig-Immunglobulin-Cγ-Fusionsproteinen stimuliert. Die zelluläre Proliferation wurde durch [³H]-Thymidin-Aufnahme nach 4 Tagen gemessen und als der prozentuale Anteil des Einbaus durch unbehandelte Kulturen (21 000 cpm) ausgedrückt. 9 zeigt die Mittelwerte von 4-fach-Bestimmungen (SEM < 10 %).
Wie in 9 gezeigt ist, inhibierte CTLA4Ig die MLR-Reaktion dosisabhängig mit einem Maximum von > 90 % und einer halbmaximalen Antwort bei etwa 30 ng/ml (etwa 0,8 nM). Das Fab-Fragment des mAks 9.3, von dem zuvor gezeigt worden war, dass es ein stärkerer Inhibitor der MLR war als der voll-ständige mAk 9.3 (Damle et al., J. Immunol. 140:1753–1761 (1988)), inhibierte ebenfalls die MLR, jedoch bei höheren Konzentrationen (etwa 800 ng/ml oder etwa 30 nM für eine halbmaximale Antwort). B7Ig und CD28Ig inhibierten die MLR selbst bei höheren Konzentrationen nicht signifikant. In weiteren Experimenten hob die Zugabe von B7Ig zusammen mit CTLA4Ig teilweise die Inhibition der MLR durch CTLA4Ig auf, ein Hinweis darauf, dass die Inhibition spezifisch der Wechselwirkung mit B7-Antigen zuzuschreiben war.
Inhibition der Immunglobulinsekretion. Die Wirkungen von CTLA4Ig auf T-Helferzellen (T_h)-induzierte Immunglobulinsekretion wurde ebenfalls untersucht (10). CD4⁺-T-Zellen wurden mit allogenen CD19⁺-B-Zellen in Anlehnung an obige Beschreibung mit oder ohne den angegebenen Immunglobulinmolekülen vermischt. Murine mAk OKT8, 9.3 und BB-1 wurden mit 20 μg/ml und Ig-Fusionsproteine mit 10 μg/ml zugegeben. Nach 6-tägiger Kultur wurden die Konzentrationen von humanem IgM (SEM < 5 %) in den Kulturüberständen durch Enzymimmunoassay (ELISA) in Anlehnung an obige Beschreibung bestimmt. Die IgM-Produktion durch B-Zellen, die ohne CD4⁺-T-Zellen kultiviert worden waren, betrug 11 ng/ml.
Wie in 10 gezeigt ist, stimulierten CD4⁺-T-Zellen die IgM-Produktion durch allogene CD19⁺-B-Zellen (ohne CD4⁺-T-Zellen wurden IgM-Spiegel um 93% reduziert). Die mAk 9.3 und BB-1 inhibierten signifikant die T_h-induzierte IgM-Produktion (6% bzw. 65% Inhibition). CTLA4Ig war sogar noch effektiver als Inhibitor (89% Inhibition) als die mAk. Die Inhibition durch die Kontroll-Ig-Moleküle, dem mAk OKT8 und CD5Ig, war wesentlich geringer (≤ 30 % Inhibition). Keines dieser Moleküle inhibierte signifikant die Ig-Produktion, die in Gegenwart von Staphylococcal aureus-Enterotoxin B gemessen wurden. Ähnliche Resultate wurden mit CD4⁺-T-Zellen und B-Zellen aus anderen Spendern erhalten. Diese Resultate zeigen, dass die Inhibition durch CTLA4Ig spezifisch ist.
Die obigen Daten zeigen ebenfalls, dass die CTLA4- und CD28-Rezeptoren sowohl funktionell als auch strukturell verwandt sind. Wie CD28 ist auch CTLA4 ein Rezeptor für das B-Zell-Aktivierungsantigen B7. CTLA4Ig band an ¹²⁵I-B7 mit einer Affinitätskonstante K_d von etwa 12 nM, einem etwa 20-mal höheren Wert als die Affinität zwischen CD28 und B7Ig (etwa 200 nM). Man kann daher von CTLA4 und CD28 als hoch- bzw. niedrigaffinem Rezeptor für denselben Liganden, nämlich das B7-Antigen, sprechen.
Die scheinbare Affinität zwischen CD28 und B7 ähnelt derjenigen Affinität, die für die Bindung von löslichem Alloantigen an den T-Zellrezeptor eines murinen T-Zell-Hybridoms berichtet worden ist (etwa 100 nM; Schnek et al., Cell 56: 47 (1989)); sie ist höher als die Wechselwirkungen zwischen CD2 und LFA3 (Recny et al., J. Biol. Chem. 265: 8542 (1990)) oder zwischen CD4 und MHC-Klasse-II-Molekülen (Clayton et al., Nature 339: 548 (1989)). Die scheinbare Affinitätskonstante K_d zwischen CTLA4 und B7 ist sogar noch größer und vergleichbar mit hochaffinem mAkn (K_d 2–10000 nM; Alzari et al., Ann. Rev. Immuno. 6: 555 (1988)). Die K_d zwischen CTLA4 und B7 ist ähnlich groß oder größer als die K_d-Werte von Integrinrezeptoren und deren Liganden (10–2000 nM; Hautanen et al., J. Biol. Chem. 264: 1437–1442 (1989)); Di Minno et al., Blood 61: 140–148 (1983); Thiagarajan und Kelley, J. Biol. Chem. 263: 3035–3038 (1988)). Die Affinität der Wechselwirkung zwischen CTLA4 und B7 ist daher eine der höchsten, über die jemals für lymphoide Adhäsionssysteme berichtet worden ist.
Diese Resultate zeigen die erste Expression eines funktionellen Proteinprodukts des CTLA4-Transkripts. CTLA4Ig, ein Fusionskonstrukt, das die an eine IgCγ1-Domäne fusionierte extrazelluläre Domäne von CTLA4 enthält, bildet ein Disulfid-gekoppeltes Dimer aus Untereinheiten mit einem M_r von etwa 50000 (1). Da in dem Ig-Abschnitt dieses Fusionsproduktes keine Disulfide zwischen den Ketten erwartet werden, scheint es sehr wahrscheinlich zu sein, dass Cysteine aus CTLA4 an der Disulfidbindungsbildung beteiligt sind. Das analoge CD28Ig-Fusionsprotein (Linsley et al., s. oben, 1991) enthält ebenfalls Disulfidbrücken zwischen den Ketten. Diese Resultate legen nahe, dass der CTLA4-Rezeptor wie CD28 (Hansen et al., Immunogenetics 10: 247–260 (1980)) auf der T-Zelloberfläche als Disulfid-gekoppeltes Homodimer vorkommt. Obwohl CD28 und CTLA4 hoch homologe Proteine sind, unterscheiden sie sich immunologisch, da der anti-CD28-mAk 9.3 CTLA4 nicht erkennt (4 und 5).
Es ist nicht bekannt, ob CTLA4 T-Zellen aktivieren kann, indem es CD28-analoge Wege signalisiert. Die cytoplasmatischen Domänen von murinem und humanem CTLA4 sind identisch (Dariavach et al., s. oben, 1988), ein Hinweis darauf, dass diese Region wichtige funktionelle Eigenschaften besitzt. Die cytoplasmatischen Domänen von CD28 und CTLA4 teilen ebenfalls Homologien, obwohl unklar ist, ob dies ausreicht, um den beiden Molekülen ähnliche signalisierende Eigenschaften zu verleihen.
CTLA4Ig ist ein starker Inhibitor von in vitro-Lymphozytenfunktionen, die eine T-Zell- und B-Zellkollaboration erfordern (9 und 10). Diese Befunde zusammen mit früheren Untersuchungen zeigen, dass Wechselwirkungen zwischen B7-Antigen und dessen Gegenrezeptoren CD28 und/oder CTLA4 von fundamentaler Bedeutung bei der Regulierung von T- und B-Lymphozytenantworten sind. CTLA4Ig sollte ein brauchbares Reagens für zukünftige Untersuchungen im Hinblick auf die Rolle dieser Wechselwirkungen im Verlaufe von Immunantworten sein. CTLA4Ig ist ein stärkerer Inhibitor der in vitro-Lymphozytenantworten als der mAk BB-1 oder der mAk 9.3 (9 und 10). Die größere Potenz von CTLA4Ig verglichen mit mAk BB-1 ist höchstwahrscheinlich den zwischen diesen Molekülen bestehenden Unterschieden in den Affinitäten für B7 zuzuschreiben (6). CTLA4Ig ist auch stärker als der mAk 9.3, wahrscheinlich, weil es anders als der mAk keine direkten stimulierenden Wirkungen auf die T-Zellproliferation ausübt (June et al., Immunology Today 11: 211 (1989)), was dessen inhibierenden Wirkungen zuwiderlaufen würde. Die immunsuppressiven Wirkungen von CTLA4Ig in vitro legen nahe, dass zukünftige Untersuchungen im Hinblick auf mögliche therapeutische Wirkungen dieses Moleküls zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, an denen eine aus dem Gleichgewicht geratene T-Zellaktivierung oder Ig-Produktion beteiligt ist, erforderlich sein werden.
Die Reichweite der vorliegenden Erfindung ergibt sich aus den anhängenden Ansprüchen und ist nicht auf die in obiger Beschreibung gegebenen Beispiele beschränkt.
BEISPIEL 5
Weibliche BALB/c (H-2^d)- und C57BL/6 (H-2^d)-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten.
Humane Pankreas-Inselzellen wurden nach Collagenaseverdau wie beschrieben aufgereinigt (C. Ricordi et al., Transplantation 52: 519 (1991); A. G. Tzakis et al., Lancet 336: 402 (1990); C. Ricordi. P.E. Lacy, E.H. Finke, B. J. Olack, D. W. Scharp, Diabetes 37: 413 (1988)).
Als Empfänger verwendete man B6- oder B10-Mäuse, die 3 bis 5 Tage vor Transplantation mit Streptozotocin (175 mg pro kg Körpergewicht) behandelt worden waren und ohne zu hungern Plasmaglukosespiegel von mehr als 280 mg/dl (überwiegend über 300 mg/ml) aufwiesen.
Jedes Tier bekam etwa 800 frische humane Inseln mit einem Durchmesser von 150 μm unterhalb der linken Nierenkapsel (D. Faustman und C. Coe, Science 252: 1700 (1991); Y. J. Zeng et al., Transplantation 53: 277 (1992)). Mit der Behandlung begann man unmittelbar nach der Transplantation.
Unmittelbar nach der Transplantation behandelte man die Kontrolltiere 14 Tage lang jeden zweiten Tag mit PBS (durchgehende Kurven) oder mit 50 μg L6 (gepunktete Kurven) (11A). Man betrachtete die Inseltransplantate als abgestoßen, wen die Glukosespiegel an drei aufeinander folgenden Tagen mehr als 250 mg/dl betrugen. Mit PBS (n = 14) und L6 (n = 8) behandelte Tiere besaßen mittlere Überlebenszeiten von 5,6 bzw. 6,4 Tagen.
Unmittelbar nach Transplantation behandelte man Tiere an 14 aufeinanderfolgenden Tagen mit 10 μg CTLA4Ig (n = 7) (11B). Drei von sieben Tieren behielten ihre Transplantate für mehr als 80 Tage. Die übrigen vier Tiere besaßen mittlere Transplantat-Überlebenszeiten von 12,75 Tagen.
Unmittelbar nach der Transplantation humaner Inseln behandelte man Tiere jeden zweiten Tag 14 Tage lang mit 50 μg CTLA4Ig. Sämtliche mit dieser Dosis behandelte Tiere (n = 12) behielten die Transplantate während der Dauer der Analyse (11C). Ausgewählte Mäuse wurden an den Tagen 21 und 29 nach Transplantation einer Nephrektomie unterzogen, um die Funktion des Transplantats zu überprüfen (11C).
Nieren, die mit humanen Inselzellen transplantiert waren, wurden histologisch untersucht (12A, 12B, 12C, 12D). Die Schnitte wurden blind analysiert.
Die Färbung mit Hematoxylin und Eosin einer mit humanen Inseln transplantierten Kontrollmaus zeigte 29 Tage nach Transplantation eine massive Lymphozyteninfiltration (12A). Auf Insulin gefärbt, zeigte dasselbe Gewebe keine nachweisbare Insulinproduktion (12B).
Die histologische Untersuchung von Gewebe aus einer CTLA4Ig-behandelten Maus 21 Tage nach Transplantation zeigte intakte Inseln unter der Nierenkapsel, wobei sehr wenig Lymphozyten das transplantierte Gewebe infiltrierten (12C). Das Gewebe wurde mit Hematoxylin und Eosin angefärbt. Auf Insulin gefärbt, zeigte das gleiche Gewebe aus der CTLA4Ig-behandelten Maus die Produktion von Insulin durch die transplantierten Inseln (12D). Ähnliche Resultate beobachtete man in Transplantatgewebe, das zu späteren Zeitpunkten untersucht wurde. Die oberen, mittleren und unteren Pfeilköpfe lassen die Nierenkapsel, das Inseltransplantat bzw. das Nierenparenchym erkennen.
Bei der histopathologischen Untersuchung wurden alle Gewebe in 10 % gepuffertem Formalin fixiert und behandelt, und Schnitte von 5 μm wurden entweder mit Hematoxylin und Eosin oder auf Insulin mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren gefärbt (S. M. Hsu, L. Raine, H. Fanger, J. Histochem. Cytochem. 19: 577 (1981)). Die Vergrößerung betrug 122 x.
13 zeigt Streptozotocin-behandelte Tiere, die wie oben für 11 beschrieben transplantiert wurden. Die Mäuse wurden entweder mit PBS (gepunktete Kurven) oder mit monoklonalem Antikörper gegen humanes B7 (durchgehende Kurven) mit einer Dosis von 50 μg jeden zweiten Tag 14 Tage lang behandelt (13). Die Kontrolltiere (mit PBS behandelt) (n = 3) besaßen eine mittlere Transplantatüberlebenszeit von 3,5 Tagen, während die mit anti-B7-behandelten Tiere (n = 5) die Transplantate zwischen 9 und mehr als 50 Tagen behielten (13).
Die in 14 gezeigten, normal glykämischen, CTLA4Ig-behandelten, transplantierten Mäuse (gepunktete Kurven) wurden am Tag 44 nach Transplantation einer Nephrektomie unterzogen und unmittelbar danach entweder mit 1000 Inseln des ersten Spenders (gepunktete Linien, ausgefüllte Kreise) oder mit 1000 Inseln eines zweiten Spenders (gepunktete Linien, nicht ausgefüllte Kreise) unterhalb der verbleibenden Nierenkapsel erneut transplantiert.
Diese zum Zeitpunkt der ersten Transplantation eingefrorenen Inseln wurden aufgetaut und drei Tage vor Transplantation kultiviert, um die Funktion der Inseln sicherzustellen. B10-Mäuse, die mit Streptozotocin behandelt waren und ohne zu hungern Glukosespiegel von mehr als 280 mg/dl aufwiesen, wurden als Kontrollen verwendet (durchgehende Kurven) (14). Es wurde keine Behandlung nach der Transplantation gegeben.
Am 4. Tag nach der Transplantation stießen die Kontrolltiere sowohl die Inseltransplantate des ersten Spenders (durchgehende Kurven, ausgefüllte Kreise) als auch die Inseltransplantate des zweiten Spenders (durchgehende Linien, nicht ausgefüllte Kreise) ab (14). Die CTLA4Ig-behandelten und mit Inseln des zweiten Spenders erneut transplantierten Mäuse besaßen eine mittlere Transplantatüberlebenszeit von 4,5 Tagen, während die mit Inseln des ersten Spenders erneut transplantierten Tiere die Transplantate für die Dauer der Analyse behielten (> 80 Tage) (14).
CTLA4Ig verlängert das Überleben humaner Inseltransplantate in Mäusen signifikant in einer donorspezifischen Weise, wodurch ein Ansatz zur Immunsuppression bereitgestellt wird.
C57BL/6 (B6)- oder C57BL/10 (B10)-Mäuse wurden mit Streptozotocin behandelt, um die B-Zellfunktion der murinen Pankreasinseln aufzuheben. Diabetische Tiere wurden unter der Nierenkapsel mit einem Transplantat versehen, und mit der Behandlung wurde unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff begonnen. Man beobachtete das Überleben der Inseltransplantate, wobei man die Blutglukose-Konzentrationen analysierte.
Transplantierte Kontrolltiere, die entweder mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (n = 14) oder mit L6 (einem humanen chimären monoklonalen Antikörper vom IgG1-Typ; n = 8) behandelt worden waren, besaßen eine mittlere Transplantatüberlebenszeit von 5,6 bzw. 6,4 Tagen (11A).
Im Gegensatz dazu war die Inselabstoßung in Tieren, die mit CTLA4Ig behandelt worden waren (14 Tage lang 10 μg pro Tag), verzögert, wobei 4 von den 7 Tieren eine moderat verlängerte mittlere Transplantatüberlebenszeit (12,75 Tage) aufwiesen, wohingegen die übrigen drei Tiere für mehr als 80 Tage normale Glukosespiegel beibehielten (11B). Dieser eventuelle Anstieg der Glukosekonzentration kann das Ergebnis einer Erschöpfung der Inseln sein, da man keinerlei Beleg für eine aktive zelluläre Abstoßung beobachtete.
In den drei Mäusen, welche die Inseltransplantate langzeitig behielten, kann der vorübergehende Anstieg der Glukosekonzentrationen an etwa Tag 21 nach der Transplantation für eine selbst eingeschränkte Abstoßungsepisode gestanden haben, was mit den Pharmakokinetiken der CTLA4Ig-Clearance nach der Therapie übereinstimmt (P. S. Linsley et al., Science 257: 792 (1992)).
In anschließenden Experimenten wurde die CTLA4Ig-Dosis 14 Tage lang jeden zweiten Tag auf 50 μg pro Tier erhöht. Diese Behandlung führte dazu, dass 100 % der Tiere während des Experiments eine normale Inselfunktion beibehielten, ohne dass es Anzeichen für eine Abstoßungskrise gab (11C).
Um zu bestätigen, dass die Insulinproduktion von den transplantierten Inseln und nicht von der nativen Mauspankreas herrührte, wurden ausgewählte Tiere an den Tagen 21 und 29 einer Nephrektomie unterzogen, um die Inseltransplantate zu entfernen ( 11C). In diesen Tieren nahm die Glukosekonzentration innerhalb von 24 Stunden auf etwa 350 mg/dl zu, ein Hinweis darauf, dass das Inselxenotransplantat für das Beibehalten normaler Glukosespiegel verantwortlich war. Es sieht so aus, dass das Blockieren der CD28-B7-Wechselwirkung die Abstoßung xenogener Inseltransplantate hemmt.
Die Wirkungen der Behandlung mit dem löslichen Rezeptor, nämlich CTLA4Ig-Fusionsprotein, waren nicht das Ergebnis einer Fc-Bindung (L6 beeinflusste die Transplantatabstoßung nicht) oder allgemeiner Wirkungen auf die T-Zell- oder B-Zellfunktion in vivo.
Es wurden histologische Analysen der Inselxenotransplantate aus Kontrollmäusen (mit PBS behandelt) und CTLA4Ig-behandelten Mäusen durchgeführt (12A, 12B, 12C, 12D). Das Inselgewebe aus dem Kontrolltier zeigte Anzeichen einer Immunabstoßung mit einer starken Lymphozyteninfiltration in das Transplantat und wenigen verbliebenen Inseln (12A).
Die immunhistochemische Färbung zeigte, dass insulinpositive Zellen nur selten und Somatostatin-positive Zellen überhaupt nicht zugegen waren (12B). Transplantatgewebe aus den CTLA4Ig-behandelten Mäusen war hingegen frei von jeglicher Lymphozyteninfiltration (12C).
Die Transplantate waren intakt und viele Inseln sichtbar. Hinzu kommt, dass die in dem humanen Inselgewebe beobachteten B-Zellen Humaninsulin (12D) und Somatostatin produzierten.
Das in dieser Untersuchung verwendete humane CTLA4Ig reagiert sowohl mit murinem als auch humanem B7. Ein Vorteil des xenogenen Transplantatmodells ist die Verfügbarkeit eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes B7, das nicht mit murinem B7 reagiert (T. Yokochi, R. D. Holly, E. A. Clark, J. Immunol. 127: 823 (1982)). Es konnte daher die Rolle von humanen B7 aufweisenden Antigen-präsentierenden Zellen (APC) direkt untersucht werden.
Die Mäuse wurden wie beschrieben transplantiert und dann nach Transplantation 14 Tage lang jeden zweiten Tag mit 50 μg eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes B7 behandelt. Im Vergleich zu Kontrollmäusen verlängerte diese Behandlung die Transplantatüberlebenszeit in behandelten Mäusen (9 bis > 50 Tage) (13). Der anti-B7 monoklonale Antikörper ist nicht in der Lage, die Abstoßung so effektiv zu blockieren wie CTLA4Ig.
Die CTLA4Ig-Therapie führte bei der Mehrzahl der Mäuse zu einer Annahme des Transplantats. Allerdings mögen die Mäuse nicht tolerant sein. Eine vorübergehende Immunsuppression kann aufgrund einer Transplantatadaptation (des Verlusts der Immunogenizität als Folge des Verlusts der APC-Funktion) zu einer permanenten Akzeptanz des Inseltransplantats führen (L. Hao, Y. Wang, R.G. Gill, K. H. Lafferty, J. Immunol. 139 :4022 (1987); K. H. Lafferty, S.J. Prowse, M. Simeonovic, Annu. Rev. Immunol. 1: 143 (1983)).
Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden ausgewählte xenotransplantierte CTLA4Ig-behandelte Mäuse einer Nephrektomie unterzogen (Tag 40) und sie wurden unter der verbleibenden Nierenkapsel entweder mit den ursprünglichen Spenderinseln (erster Spender) oder nicht verwandten humanen Inseln eines zweiten Spenders erneut transplantiert (14).
Streptozotocin-behandelte Kontrolltiere, die kein Inseltransplantat bekommen hatten, wurden auch transplantiert, und zwar entweder mit Inseln des ersten oder zweiten Spenders. Nach der Transplantation wurde keine Behandlung gegeben. Die Kontrolltiere stießen an Tag 4 die Inseln des ersten und zweiten Spenders ab. Die CTLA4Ig-behandelten Tiere, welche die Inseln des zweiten Spenders bekommen hatten, stießen diese Inseln an Tag 5 ab, wohingegen die Tiere, welche die Inseln des ersten Spenders bekommen hatten, die Transplantate für mehr als 80 Tage behielten (14).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die CTLA4Ig-Behandlung zu einem verlängerten donorspezifischen Nichtansprechen auf die xenogenen Inseln führte. Das Vermögen der murinen Immunantwort, Unterschiede zwischen den humanen Inselspendern auszumachen, steht auch für die direkte Erkennung der auf den humanen Inselzellen exprimierten polymorphen MHC-Produkte.
BEISPIEL 6
Weibliche BALB/c (H-2^d)- und C57BL/6 (N-2^d)-Mäuse, 6 bis 8 Wochen alt, wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten.
Der monoklonale Antikörper 11B11 ist ein gegen murines IL-4 gerichteter Ratten-IgG1-Antikörper (Ohara, J., und W. E. Paul, 1985, „Production of a monoclonal antibody to and molecular characterization of B-cell stimulatory factor-1" Nature 315: 333) (Verax (Lebanon, NH)).
BALB/c-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden intravenös mit 10⁸ SRBC alleine oder zusammen mit 200 μg chimärem L6-mAk oder humanem CTLA4Ig-Fusionsprotein immunisiert. Die indizierten Gruppen wurden 2 Stunden vor Injektion der SRBC durch intraperitoneale Injektion von 2 ml entweder des Ratten-Immunglobulins oder des gegen murines IL-4 gerichteten monoklonalen Ratten-Antikörpers 11B11 mit 5 mg/ml behandelt. Die Behandlung mit chimärem L6-mAk oder CTLA4Ig wurde an 4 zusätzlichen Tagen täglich wiederholt.
Alle Tiere bekamen an Tag 46 intravenöse Injektionen von SRBC (15) oder KLH (16). Genauer gesagt, in 15 stehen die ausgefüllten Vierecke für Mäuse, denen an Tag 0 und Tag 46 nur SRBC verabreicht wurden. Die nicht ausgefüllten Vierecke stehen für Mäuse, denen an Tag 46 nur SRBC verabreicht wurden. Den übrigen in 15 dargestellten Mäusen wurden des Weiteren an Tag 46 SRBC verabreicht. Den Mäusen aus 16 hingegen wurde an Tag 46 lediglich ein unterschiedliches Immunogen, KLH, verabreicht.
Die Serumkonzentrationen der Mäuse wurden dahingehend bestimmt, ob gegen SRBC oder KLH gerichtete Antikörper zugegen waren, indem man ein ELISA wie beschrieben verwendete (Linsley et al., Science 1992).
Die Serumantikörpertiter wurden als diejenige Verdünnung berechnet, die eine A₄₅₀ von fünffachem Hintergrund ergab. Die Serumantikörpertiterwerte aus 15 wurden anhand der vereinigten Seren von fünf Mäusen pro Gruppe bestimmt, während die Serumantikörpertiterwerte aus 16 mittlere Titer von 5 Einzelseren darstellen. Die Pfeile weisen auf eine SRBC- oder KLH-Injektion an Tag 46 hin.
Die 15 und 16 zeigen, dass die immunologische Antwort in Mäusen, denen sowohl CTLA4Ig als auch anti-IL4 (nicht ausgefüllte Dreiecke) gleichzeitig injiziert wurden, in antigenspezifischer Weise unterdrückt ist.
15 zeigt, dass es in Mäusen, denen gleichzeitig CTLA4Ig und anti-IL4 sowie SRBC an Tag 0 und Tag 46 injiziert worden waren, keinen Anstieg der Serumantikörpertiter gab (d.h. keine primäre oder sekundäre immunologische Antwort). Die Kombination von CTLA4Ig und anti-IL4 unterdrückt primäre und sekundäre Immunantwort und induziert ein lang anhaltendes immunologisches Nichtansprechen auf SRBC.
Darüber hinaus zeigt 15, dass es in Mäusen, denen gleichzeitig CTLA4Ig und das Ratten-Ig als Kontrolle (Cappel, Organotecknika, Palo Alto, CA) injiziert worden waren, keine primäre immunologische Antwort gab. Allerdings zeigten diese Mäuse nach Injektion mit SRBC an Tag 46 eine sekundäre immunologische Antwort (ausgefüllte Dreiecke, 15).
16 zeigt, dass die Verabreichung von CTLA4Ig und anti-IL4, und daran anschließend von einem unterschiedlichen Immunogen, KLH, an Tag 46 in Mäusen die primäre Immunantwort gegen KLH in Mäusen nicht unterdrückt. Statt dessen zeigen diese Mäuse eine primäre Immunantwort gegen KLH (nicht ausgefüllte Dreiecke, 16). Die mit CTLA4Ig und anti-IL4 behandelten Mäuse zeigen daher eine hoch spezifische Immunantwort, die von dem verabreichten Antigen abhängt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung umfassend ein B7-bindendes Molekül und ein IL4-bindendes Molekül zur Verwendung bei der Regulierung einer Immunantwort durch Blockieren einer B7-Wechselwirkung mit Lymphozyten.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das B7-bindende Molekül ein CTLA4Ig-Fusionsprotein ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das CTLA4Ig-Fusionsprotein ein Fusionsprotein ist, das eine erste Aminosäuresequenz, welche die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 125 der der extrazellulären Domäne von CTLA4 entsprechenden Aminosäuresequenz enthält, und eine zweite Aminosäuresequenz, welche den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem Immunglobulin Cγ1 entsprechende Aminosäurereste enthält, aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das B7-bindende Molekül ein CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsprotein ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 4, wobei das CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsprotein ein Hybridfusionsprotein ist, das eine erste einem Abschnitt der extrazellulären Domäne des CD28-Rezeptors entsprechende Aminosäuresequenz in Fusion mit einer zweiten einem Abschnitt der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors entsprechenden Aminosäuresequenz und eine dritte den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von humanem Immunglobulin Cγ1 entsprechende Aminosäuresequenz aufweist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das IL4-bindende Molekül ein monoklonaler Antikörper ist, der IL4 spezifisch erkennt und bindet.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das IL4-bindende Molekül ein löslicher IL4-Rezeptor ist, der IL4 erkennt und bindet.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Lymphozyten B7-positive Lymphozyten sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Immunantwort eine B-Zellantwort ist, was zur Inhibierung der Antikörperproduktion führt, eine T-Zellantwort ist, was zur Inhibierung der zellvermittelten Immunität führt, oder die Immunantwort eine Inhibierung der Lymphozytenproliferation ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zusammensetzung bei der Inhibierung der Transplantatabstoßung in einem Wesen zu verwenden ist und das Wesen ein Empfänger eines transplantierten Gewebes ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zusammensetzung bei der Inhibierung der Transplantat-gegen-Wirf-Erkrankung zu verwenden ist.
Verwendung eines B7-bindenden Moleküls und eines IL4-bindenden Moleküls zur Herstellung einer in einem der Ansprüche 1 bis 7 definierten pharmazeutischen Zusammensetzung zur Regulierung einer Immunantwort durch Blockieren einer B7-Wechselwirkung mit Lymphozyten.
Verwendung eines B7-bindenden Moleküls und eines IL4-bindenden Moleküls zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Lymphozyten B7-positive Lymphozyten sind.
Verwendung eines B7 bindenden Moleküls und eines IL4 bindenden Moleküls zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Immunantwort eine B-Zellantwort ist, was zur Inhibierung der Antikörperproduktion führt, eine T-Zellantwort ist, was zur Inhibierung der zellvermittelten Immunität führt, oder die Immunantwort eine Inhibition der Lymphozytenproliferation ist.