DE69433661T2 - Genetische modifikation von neuralen stammzellen - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Zellen gerichtet, welche bei der Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) geeignet sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die genetische Veränderung von neuralen Stammzellen, die auf einen Wachstumsfaktor ansprechen, und von differenzierten neuronalen und Gliazellen, die von neuralen Stammzellen, die auf einen Wachstumsfaktor ansprechen, abstammen, und die Verwendung dieser Zellen zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.
  • ZNS-Erkrankungen umfassen zahlreiche Beschwerden wie etwa neurodegenerative Erkrankungen (z.B. Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit), eine akute Gehirnverletzung (z.B. Schlaganfall, Kopfverletzung, Zerebralparese) und eine große Zahl von ZNS-Funktionsstörungen (z.B. Depression, Epilepsie und Schizophrenie). In den letzten Jahren sind neurodegenerative Erkrankungen zu einer wichtigen Sorge geworden aufgrund der größer werdenden älteren Population, die dem größten Risiko für diese Erkrankungen ausgesetzt ist. Die Erkrankungen, welche die Alzheimer-Krankheit, multiple Sklerose, Chorea Huntington, amyotrophe Lateralsklerose und die Parkinson-Krankheit umfassen, sind mit der Degeneration von neuralen Zellen in bestimmten Stellen des ZNS in Verbindung gebracht worden, was zur Unfähigkeit dieser Zellen oder der Gehirnregion führt, ihre vorgesehene Funktion durchzuführen. Neben den neurodegenerativen Erkrankungen resultieren akute Hirnverletzungen oft im Verlust von neuralen Zellen, in der unpassenden Funktion der betroffenen Gehirnregion in und nachfolgende Verhaltensanomalien. Das größte Gebiet der ZNS-Funktionsstörung (im Hinblick auf die Zahl der betroffenen Menschen) ist wahrscheinlich nicht durch einen Verlust von neuralen Zellen charakterisiert, sondern vielmehr durch eine anormale Funktion von bestehenden neuralen Zellen. Dies kann durch unangemessenes Feuern von Neuronen oder der anormalen Synthese, Freisetzung und Processing von Neurotransmittern begründet sein. Diese Funktionsstörungen können das Ergebnis sein von gut untersuchten und charakterisierten Erkrankungen wie etwa einer Depression und Epilepsie, oder von weniger verstandenen Erkrankungen wie etwa einer Neurose und Psychose.
  • Bislang wurde die Behandlung von ZNS-Erkrankungen primär durch die Verabreichung von pharmazeutischen Verbindungen durchgeführt. Unglücklicherweise steckte diese Art der Behandlung voller Komplikationen, einschließlich der beschränkten Fähigkeit, Arzneimittel durch die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren und der Arzneimitteltoleranz, welche von Patienten erlangt wird, an welche diese Arzneimittel langfristig verabreicht werden. Eine teilweise Wiederherstellung der dopaminergen Aktivität bei Parkinson-Patienten ist erreicht worden mit Levodopa, was ein Dopaminvorläufer ist, der die Blut-Hirn-Schranke durchqueren kann. Aber Patienten werden gegen die Wirkungen von Levodopa widerstandsfähig und deswegen sind ständig ansteigende Dosierungen nötig, um deren Wirkungen beizubehalten. Außerdem gibt es eine Vielzahl von Nebeneffekten, die mit Levodopa in Verbindung stehen, wie etwa eine gesteigerte und unkontrollierbare Bewegung.
  • Kürzlich ist das Konzept der neurologischen Gewebeverpflanzung bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie etwa die Parkinson-Krankheit angewendet worden. Nerventransplantate können nicht nur den Bedarf an einer konstanten Verabreichung von Arzneimitteln abwenden, sondern auch komplizierte Verabreichungssysteme für Arzneimittel, welche aufgrund der Blut-Hirn-Schranke auftreten.
  • Bei der neurologischen Gewebetransplantation sind genetisch veränderte Zellen verwendet worden, um verlorene Zellen zu ersetzen, welche normalerweise einen Neurotransmitter erzeugen. Beispielsweise sind Fibroblasten mit einem retroviralen Vektor, der eine cDNA für Tyrosinhydroxylase enthält, genetisch verändert worden, was ihnen ermöglicht, Dopamin zu erzeugen, und sind in ein Tiermodell der Parkinson-Krankheit implantiert worden (Gage et al., US-Patent Nr. 5,082,670).
  • Obwohl die Verwendung von genetisch veränderten Fibroblasten zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen bei der Verbesserung einiger Verhaltensdefizite in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit vielversprechend war und einen neuen Ansatz zur Bereitstellung eines benötigten Transmitters an das ZNS darstellt, leidet sie unter mehreren wesentlichen Nachteilen als Behandlung für die Parkinson-Krankheit und im Allgemeinen als therapeutischer Ansatz zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und einer Gehirnverletzung. Erstens ist das ZNS hauptsächlich aus drei Zelltypen zusammengesetzt – Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Fibroblasten liegen nicht vor. Die Implantation einer fremden Zelle in das ZNS und deren direkte und indirekte Wirkungen auf die Funktion der Wirtszellen ist noch nicht untersucht worden. Aber es ist wahrscheinlich, dass die Expression von membrangebundenen Faktoren und die Freisetzung von löslichen Molekülen wie etwa Wachstumsfaktoren und Proteasen das normale Verhalten des umgebenden Gewebes verändern. Dies kann in einem Bruch der neuronalen Feuerungsmuster entweder durch eine direkte Wirkung auf Neuronen oder durch eine Veränderung der normalen Funktion von Gliazellen resultieren.
  • Eine andere Sorge, welche bei der Implantation von Fibroblasten in das ZNS auftritt, ist die Möglichkeit, dass die implantierten Zellen zu einer Tumorbildung führen, da die intrinsische Inhibition der Fibroblastenteilung schlecht gesteuert ist. Stattdessen spielen intrinsische Signale eine Hauptrolle bei der Kontrolle der Anzahl der Teilungen, welche die Zelle durchläuft. Die Wirkung der ZNS-Umgebung auf die Teilung von implantierten Fibroblasten und die hohe Wahrscheinlichkeit einer fibroblastischen Tumorbildung ist langfristig noch nicht untersucht worden.
  • Eine dritte Sorge bei der Transplantation von Fibroblasten in das ZNS ist die, dass Fibroblasten sich nicht in die ZNS-Zellen integrieren, wie es Astrozyten, Oligodendrozyten oder Neuronen tun. Fibroblasten sind intrinsisch auf ihre Fähigkeit beschränkt, Neuronen-ähnliche Prozesse auszuweiten und Synapsen mit Wirtsgewebe zu bilden. Obwohl die genetische Veränderung und Implantation von Fibroblasten in das ZNS eine Verbesserung gegenüber der gegenwärtigen Technologie zur Verabreichung von bestimmten Molekülen an das ZNS darstellt, beschränkt das Unvermögen der Fibroblasten, zu integrieren und als ZNS-Gewebe zu fungieren, ihre potenziellen negativen Effekte auf die ZNS-Zellen und ihre beschränkte intrinsische Kontrolle der Proliferation ihren praktischen Gebrauch zur Implantation für die Behandlung von einer akuten oder chronischen ZNS-Verletzung oder Erkrankung.
  • Ein bevorzugtes Gewebe für eine genetische Veränderung und Implantation sind ZNS-Zellen – Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten. Eine Quelle von ZNS-Zellen ist humanes fötales Gewebe. Mehrere Untersuchungen haben bei Patienten mit der Parkinson-Krankheit nach dem Erhalten von Implantaten von fötalem ZNS-Gewebe Verbesserungen gezeigt. Implantate von embryonalem Mesencephalongewebe, das Dopaminzellen enthält, in das Caudatum und Putamen von humanen Patienten von Freed et al. (N. Engl. J. Med. 327: 1549-1555 (1992)) zeigten langfristig einen klinischen Nutzen für einige Patienten mit fortgeschrittener Parkinson-Krankheit. Ein ähnlicher Erfolg wurde von Spencer et al. (N. Engl. J. Med. 327: 1541–1548 (1992)) gezeigt. Widner et al. (N. Engl. J. Med. 327: 1556–1563 (1992)) zeigten langfristige funktionelle Verbesserungen bei Patienten mit MPTP-induziertem Parkinson-Syndrom, welche eine bilaterale Implantation von fötalem Mesencephalongewebe erhielten.
  • Obwohl die oben beschriebenen Untersuchungen ermutigend sind, wirft die Verwendung von abortivem fötalem Gewebe zur Behandlung einer Erkrankung ethische Bedenken und politische Hindernisse auf. Es gibt auch andere Bedenken. Fötales ZNS-Gewebe ist aus mehr als einem Zelltyp zusammengesetzt, und ist somit keine gut definierte Gewebequelle. Außerdem gibt es ernsthafte Zweifel daran, ob eine adäquate und konstante Versorgung mit fötalem Gewebe für eine Transplantation verfügbar ist. Bei der Behandlung von MPTP-induziertem Parkinson-Syndrom (Widner siehe oben) wurde beispielsweise Gewebe von 6 bis 8 Föten zur Implantation in das Gehirn eines einzelnen Patienten verwendet. Es gibt auch das zusätzliche Problem, dass während der Präparation des fötalen Gewebes die Möglichkeit einer Kontamination besteht. Außerdem kann das Gewebe bereits mit einem Bakterium oder Virus infiziert sein, folglich sind für jeden verwendeten Fötus teure diagnostische Tests erforderlich. Aber sogar diagnostische Tests können nicht jedes infizierte Gewebe aufdecken. Beispielsweise ist die Diagnose von HIV-freiem Gewebe nicht garantiert, da Antikörper gegen den Virus im Allgemeinen bis zu mehreren Wochen nach der Infektion nicht vorhanden sind.
  • Anstelle von fötalem Gewebe wäre es mehr bevorzugt, eine gut definierte, reproduzierbare Gewebequelle für eine Transplantation zu besitzen, welche in unbeschränkten Mengen verfügbar ist. Da neurales Gewebe eine minimale Teilung durchläuft, erfüllt es diese Kriterien nicht ohne weiteres. Obwohl Astrozyten die Fähigkeit zur Teilung beibehalten und wahrscheinlich einer Infektion mit fremden Genen zugänglich sind, ist ihre Fähigkeit der Bildung von Synapsen mit Nervenzellen beschränkt, und folglich ist ihre extrinsische Regulierung der Expression und Freisetzung des fremden Genprodukts beschränkt.
  • Oligodendrozyten leiden unter einigen der gleichen Probleme. Außerdem teilen sich reife Oligodendrozyten nicht, was die Infektion von Oligodendrozyten auf ihre Vorläuferzellen (d.h. auf O2A-Zellen) beschränkt. Aber aufgrund der beschränkten Fähigkeit zur Proliferation von Oligodendrozytenvorläufern, stellt die Infektion und Ernte dieser Zellen keine tatsächliche Quelle dar.
  • Die Infektion von Neuronen mit fremden Genen und die Implantation in das ZNS wären ideal aufgrund deren Fähigkeit, Prozesse auszudehnen, Synapsen zu bilden und durch die Umgebung reguliert zu werden. Aber differenzierte Neuronen teilen sich nicht und eine Transfektion mit fremden Genen durch chemische und physikalische Mittel ist weder effizient, noch sind sie über lange Zeiträume stabil. Die Infektion von primären neuronalen Vorläufern mit retroviralen Vektoren in vitro ist nicht praktikabel, da Neuroblasten intrinsisch so kontrolliert werden, dass sie eine beschränkte Zahl von Teilungen durchlaufen, was die Selektion einer großen Zahl von Neuronen, die das fremde Gen einbauen und exprimieren, nahezu unmöglich macht. Es gibt eine Anzahl von Berichten von immortalisierten neuralen Zellen mit Oncogenen, siehe beispielsweise Renfranz et al. (Cell, 1991, Vol. 6, S. 713–729), Snyder et al. (Cell, 1992, Vol. 68, S. 33–51), Galiana et al. (Journal of Neuroscience Research, 1990, Vol. 26, S. 269–277), Constance L. Cepho (Ann. Rev. Neurosci. 1989, Vol. 12, S. 47–65) und WO 89/03872). Die Möglichkeit der Immortalisierung von neuronalen Vorläufern durch retroviralen Transfer von Oncogenen und ihre nachfolgende Infektion eines gewünschten Gens ist nicht bevorzugt aufgrund des Potenzials zur Tumorbildung durch die implantierten Zellen.
  • Das Wachstum von nicht-immortalisierten Striatumzellen, welche aus embryonalem Mäusegehirn und dem Gehirn von adulten Mäusen in Gegenwart von Wachstumsfaktoren isoliert wurden, wird von Reynolds et al. in „Society for Neurosciences", 16, 1147 Co 2, Abstrakt Nr. 474.2 und in Science, 1992, Vol. 255, S. 1707–1710 beschrieben.
  • Ein Versuch zur Bewältigung der Probleme, welche mit dem Unvermögen von Neuronen verbunden sind, eine wesentliche Anzahl von Teilungen zu durchlaufen, wird von Ronnett et al. offenbart, welche eine neuronale Zelllinie etabliert haben (Science, 248: 603–605 (1990)). Die Zelllinie ist nicht maligne, stammt aber von cerebralem Cortexgewebe, das aus einem Patienten mit einer unilateralen Megalenzephalie erhalten wurde, einer Proliferationserkrankung niederen Grades und Migrationserkrankung der Neuronen. Aber im Hinblick auf die Charakteristika dieser Zelllinie ist es fraglich, ob die Zellen die Zellteilung stoppen können, wenn sie einmal in ein Wirts-ZNS implantiert worden sind.
  • Ein anderer Ansatz zum Einbringen von fremden Genen in das ZNS wird von Morshead und Van Der Koy vorgeschlagen (J. of Neurosci. 12(1): 249–256 (1992)). Subependymzellen wurden mit einem replikationsdefizienten rekombinanten Retrovirus infiziert, welcher das Gen für die β-Galactosidase aus E-coli trägt. Unter Verwendung eines 3H-Thymidin- und BrdU-Einbaus wurde gefunden, dass in dieser Region des ZNS eine kontinuierliche mitotische Teilung auftritt. Morshead und Van Der Koy schlagen vor, dass die proliferierenden Zellen Stammzellen sind, basierend auf der Tatsache, dass die Zellen sich in einer Art und Weise asymmetrischer Stammzellen kontinuierlich teilen; das bedeutet, die sich teilende Zelle ergibt eine multipotente Zelle, während das Schicksal der anderen Tochter der Zelltod ist. Die Grundlage für diese Idee ist die, dass obwohl eine konstante Teilungsrate vorliegt, es keinen relativen Anstieg der Zellzahl in dieser Region des ZNS gibt. Die Transfektion von primären Cerebellumkulturen der Ratte mit einem Retrovirus, welcher das E-coli LacZ-Gen trägt, wird von McKay et al auch beschrieben (Cold Spring Harbor Symposia on quantitative Biology, 1990, Vol. LV, Cold Spring Laboratory Press). Ein ähnlicher Ansatz wurde von Geller und Breakfield unternommen (1988), Vol. 241, S. 1667–1669, worin adulte Neuronen mit einem defektiven Herpes Simplex Virus transfiziert wurden, welcher das E-coli LacZ-Gen trägt.
  • Die Tatsache, dass sich die endogenen Stammzellen kontinuierlich teilen, machen sie zu geeigneten Zielen für eine genetische Veränderung durch eine retrovirale Infektion. Aber diese Zellen existieren innerhalb des ZNS mit einer Dichte von weniger als 5 Zellen/100 Kubikmikrometer und ihre Rate und Zahl der Teilungen liegt wahrscheinlich zumindest teilweise unter epigenetischer Kontrolle. Folglich ist eine Hauptbeschränkung der endogen proliferierenden Subependym-Stammzellen die, dass sie im ZNS in einer festen Zahl vorliegen und das Einbringen von neuen Genen schwer zu kontrollieren ist. Eine zweite Hauptbeschränkung ist die, dass die Zellen bei Nagetieren und Primaten räumlich auf die Subependymschicht beschränkt zu sein scheinen und weder die Stammzelle noch deren Nachkommen in andere Regionen des ZNS migrieren (Smart, J. of Comp. Neurology, 116:325-347 (1961); Lewis, Nature, 217:974–975, (1968)). Ähnliche Zellen sind in anderen ZNS-Regionen nicht beschrieben worden, und falls sie existieren, sind sie nicht charakterisiert.
  • Das Unvermögen im Stand der Technik, Nicht-ZNS-Gewebetransplantate völlig in das Wirtsgewebe zu integrieren und der Mangel an Verfügbarkeit von nicht tumorigenen, integrierbaren ZNS-Zellen in unbeschränkten Mengen von einer zuverlässigen Quelle für eine Transplantation sind vielleicht die größten Beschränkungen der Neurotransplantation.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Im Hinblick auf die zuvor genannten Mängel, die mit dem Stand der Technik verbunden sind, einschließlich Verfahren zum Kultivieren und zur Transplantation von neuralen Zellen, sollte offensichtlich sein, dass im Fachgebiet noch immer ein Bedarf für eine verlässliche Quelle von unbeschränkten Zahlen von nicht transformierten Zellen für eine Neurotransplantation besteht, welche genetisch verändert werden können und welche sich in Neuronen und Gliazellen differenzieren können, und in das Säugetier-ZNS integrieren können.
  • Entsprechend ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, eine verlässliche Quelle von genetisch veränderten und epigenetisch regulierten Zellen für eine Transplantation bereitzustellen, die bei Transplantation in das ZNS weiter in Neuronen und Gliazellen differenzieren und in die existierende ZNS-Struktur integrieren.
  • Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, zum Zweck der genetischen Veränderung eine reichliche Quelle von Zellen bereitzustellen, welche in höchstem Maß manipulierbar sind.
  • Es ist noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung, genetisch veränderte Zellen bereitzustellen, welche leicht an nahezu jede Stelle im ZNS implantiert werden können.
  • Diese und andere Ziele und Merkmale der Erfindung werden für einen Fachmann durch die folgenden ausführlichen Beschreibungen und angefügten Ansprüchen ersichtlich werden.
  • Es wird ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Zellen offenbart, welche bei der Behandlung von Erkrankungen des ZNS verwendbar sind. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) Isolieren von neuralen Stammzellen aus einem Spendergewebe, (b) Proliferieren der neuralen Stammzellen in einem Kulturmedium mit einem oder mehreren Wachstumsfaktoren um Präkursorzellen zu erhalten, und (c) genetisches Verändern der Stammzellen und Präkursorzellen, um Zellen herzustellen, welche bei der Behandlung von Erkrankungen des ZNS verwendbar sind.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von nicht tumorigenen, genetisch veränderten, multipotenten Stammzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), umfassend die Schritte:
    • (a) Isolieren von multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS aus neuralem Gewebe unter Ausschluss von humanem Embryonalgewebe/Embryonalzellen, worin die neuralen Stammzellen nicht mit einem Oncogen immortalisiert wurden, wobei die neuralen Stammzellen des ZNS Nachkommen erzeugen können, die sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren können;
    • (b) Proliferieren der multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS in einem serumfreien Kulturmedium, das einen Wachstumsfaktor enthält, welcher eine Induktion der Proliferation der multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS bewirken kann,
    • (c) weiteres Vermehren der proliferierten Zellen und
    • (d) genetisches Verändern der vermehrten Zellen durch Einbringen eines exogenen Polynukleotids in die prolifierten Zellen.
  • Die nicht tumorigenen, genetisch veränderten neuralen Stammzellen des ZNS der Erfindung sind verwendbar bei einem Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen des ZNS, wobei genetisch veränderte Präkursorzellen, welche eine biologisch wirksame Substanz erzeugen, die zur Behandlung einer ZNS-Erkrankung nützlich ist, in das ZNS eines Empfängers transplantiert werden.
  • Es wird angenommen, dass keine der vorhergehenden Referenzen die vorliegende Erfindung wie beansprucht offenbart und diese kein Stand der Technik sind. Die Referenzen werden zum Zweck der Hintergrundinformation bereitgestellt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Fotografie von genetisch veränderten Präkursorzellen, infiziert mit einem Retrovirus, welcher das β-Galactosidasegen enthält. Zellen, die das Gen enthalten, weisen ein charakteristisches blaues Reaktionsprodukt auf.
  • 2: Fotografie eines Schnitts des Cortex einer neugeborenen Maus 2–4 Wochen nach einer Implantation, in welchen β-Galactosidase enthaltende Präkursorzellen implantiert wurden. Implantierte Zellen, die das β-Galactosidasegen enthalten, weisen ein charakteristisches blaues Reaktionsprodukt auf.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Über neurale Stammzellen (NSC, „neural stem cells") ist berichtet worden und ihre potenzielle Verwendung ist von Reynolds und Weiss, Science 255: 1707 (1992) beschrieben worden. Der Begriff "Stammzelle" bezieht sich auf eine nicht differenzierte Zelle, welche unbeschränkt proliferieren kann und mehrere Stammzellen ergeben kann mit der Fähigkeit, eine große Anzahl von Vorläuferzellen zu erzeugen, welche wiederum differenzierte oder differenzierbare Tochterzellen ergeben können. Der Begriff "neurale Stammzelle" (NSC) bezieht sich auf die Stammzellen der vorliegenden Erfindung, deren Nachkommen unter geeigneten Kulturbedingungen sowohl Glia- als auch neuronale Vorläuferzellen umfassen. Es wurde gezeigt, dass NSCs Neuroblasten ergeben können (Reynolds und Weiss, Restorative Neurology & Neuroscience 4: 208 (1992). Es ist auch bekannt, dass NSCs wichtige Macrogliazelltypen (Astrozyten und Oligodendrozyten) ergeben.
  • Neurale Stammzellen können aus einer Vielzahl von Spendergeweben erzeugt werden, einschließlich adultem oder fötalem neuralem Gewebe vom Mensch oder anderen tierischen Quellen, und durch das Verfahren von Reynolds und Weiss (siehe oben) kultiviert werden können. Der Begriff "Spender" bezieht sich auf den Mensch oder das andere Tier, welches die Quelle der neuralen Stammzellen ist, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einigen Situationen ist der Spender ein transgenes Tier. Der Begriff "transgenes Tier" bezieht sich auf nicht humane Tiere, in welchen ein DNA-Segment physikalisch in das Genom aller Zellen, einschließlich der Keimzellen integriert wurde, sodass die DNA auf die Nachkommen übertragen werden kann.
  • Die neuralen Stammzellen der vorliegenden Erfindung sprechen auf Wachstumsfaktoren an. Wenn sie in einem definiertem serumfreien Medium angezogen werden und in Gegenwart eines Wachstumsfaktors oder Mitogens wie etwa dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder dergleichen, werden die Zellen zur Teilung induziert, wobei sich Cluster von undifferenzierten Zellen ergeben. Der Begriff "Neurosphäre" wird verwendet, um den Zellcluster zu beschreiben. Zumindest einige der Zellen besitzen den Nestin (+)-Phänotyp. Der Cluster ist aus Stammzellen und/oder Vorläuferzellen zusammengesetzt und kann differenzierte Zellen enthalten oder nicht. Der Begriff "Vorläuferzellen" bezieht sich auf undifferenzierte Zellen, welche von neuralen Stammzellen abstammen, deren Nachkommen unter geeigneten Bedingungen Glia- und/oder neuronale Vorläuferzellen umfassen.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff " Präkursorzellen" auf die lebenden Zellen der vorliegenden Erfindung, welche von den neuralen Stammzellen abstammen, die in einem Kulturmedium mit einem Wachstumsfaktor oder einer Kombination von Wachstumsfaktoren proliferiert werden und sowohl Vorläufer- als auch Stammzellen umfassen. Die Zellen der Neurosphäre werden hierin nachfolgend als Präkursorzellen bezeichnet. Präkursorzellen wachsen normalerweise in der Form von Neurosphären, können aber in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen unterschiedliche Wachstumsmuster aufweisen. Der Begriff "Wachstumsfaktor" wie hierin verwendet bezieht sich auf Protein, Peptid, Mitogen oder ein anderes Molekül mit einem Wachstumseffekt, proliferativen Effekt, Differenzierungseffekt oder trophischem Effekt. Der Begriff Wachstumsfaktor umfasst auch eine beliebige Kombination von Wachstumsfaktoren. Solche Wachstumsfaktoren umfassen den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den sauren und basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF, bFGF), den Plättchenwachstumsfaktor (PDGF, "platelet-derived growth factor"), das Thyrotropin-freisetzende Hormon (TRH), EGF, einen EGF-ähnlichen Liganden, Amphiregulin, den trans formierenden Wachstumsfaktor Alpha und Beta (TGFα, TGFβ, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) und dergleichen.
  • Obwohl die Präkursorzellen nicht transformierte primäre Zellen sind, besitzen sie Merkmale einer kontinuierlichen Zelllinie. Im undifferenzierten Zustand in Gegenwart eines Wachstumsfaktors wie etwa EGF teilen sich die Zellen kontinuierlich und sind deswegen ausgezeichnete Ziele für eine genetische Veränderung. Der Begriff "genetische Veränderung" wie hierin verwendet, bezeichnet die stabile oder transiente Veränderung des Genotyps einer Präkursorzelle durch Einbringen von exogener DNA. Die DNA kann synthetisch oder natürlich erhalten sein und kann Gene, Teile von Genen oder andere nützliche DNA-Sequenzen enthalten. Der Begriff "genetische Veränderung" wie hierin verwendet soll nicht bedeuten, dass natürlich vorkommende Veränderungen enthalten sind, wie etwa Veränderungen, die durch natürliche virale Aktivität, natürliche genetische Rekombination oder dergleichen auftreten. Die exogene DNA kann in eine Präkursorzelle durch virale Vektoren (Retrovirus, modifiziertes Herpes-Virus, Herpes-Virus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und dergleichen) oder durch direkte DNA-Transfektion (Lipofektion, Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation und dergleichen) eingebracht werden. Die genetisch veränderten Zellen der vorliegenden Erfindung besitzen den zusätzlichen Vorteil, dass sie die Kapazität zur vollen Differenzierung besitzen, um Neuronen oder Macrogliazellen in reproduzierbarer Art und Weise unter Verwendung einer Vielzahl von Differenzierungsprotokollen zu erzeugen.
  • Präkursorzellen können von nicht humanen transgenen Tieren stammen, und sind somit auf eine Art bereits genetisch modifiziert. Es gibt mehrere Verfahren, welche momentan zur Erzeugung von transgenen Tieren verwendet werden. Die am meisten verwendete Technik ist die direkte Mikroinjektion von DNA in einzellige befruchtete Eier. Andere Verfahren umfassen einen retroviral vermittelten Transfer oder einen Gentransfer in embryonale Stammzellen. Diese Verfahren und andere werden ausführlich von Hogan et al. in "Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Ed., 1986) be schrieben, welches hierin durch Referenz enthalten ist. Die Verwendung dieser transgenen Tiere besitzt bestimmte Vorteile, einschließlich der Tatsache, dass keine gesunden Neurosphären transfiziert werden müssen. Präkursorzellen von transgenen Tieren weisen eine stabile Genexpression auf. Unter Verwendung von transgenen Tieren ist es möglich, neue genetische Kombinationen zu züchten. In das Genom des transgenen Tiers kann ein beliebiges nützliches Gen integriert sein, welches durch neurale Zellen exprimiert wird. Beispiele für nützliche DNA sind unten in der Diskussion der genetisch modifizierten Präkursorzellen angegeben.
  • Eine wesentliche Herausforderung für die zelluläre Transplantation in das ZNS ist die Identifizierung der Donorzellen nach der Implantation in den Wirt. Es sind mehrere Strategien verwendet worden, um Donorzellen zu markieren, einschließlich Markierungen mit Tritium, Fluoreszenzfarbstoffen, Dextranen und viralen Vektoren mit Reportergenen. Aber diese Verfahren leiden unter den inhärenten Problemen der Toxizität, Stabilität oder langfristige Verdünnung. Die Verwendung von neuralen Zellen, die von transgenen Tieren stammen, kann ein verbessertes Mittel bereitstellen, durch welches die Identifikation von transplantierten neuralen Zellen erreicht werden kann. Ein transgenes Markierungssystem stellt ein stabileres und effizienteres Verfahren zur Zellmarkierung bereit. In diesem System können Promotorelemente, beispielsweise für das fibrilläre saure Gliaprotein (GFAP, "glial fibrillary acidic protein") und das basische Myelinprotein (MBP, "myelin basic protein") die Expression des E.coli β-Galactosidasereportergens in transgenen Mäusen steuern. In diesen Systemen tritt eine zellspezifische Expression des Reportergens in Astrozyten (GFAP-lacZ) und in Oligodendrozyten (MBP-lacZ) in einer durch die Entwicklung regulierten Art und Weise auf.
  • Wenn sie einmal propagiert sind, werden die Neurosphärenzellen mechanisch in eine Einzelzellsuspension aufgetrennt und auf Petrischalen in einem Medium ausplattiert, wo sie sich über Nacht anheften können. Die Präkursorzellen werden dann genetisch modifiziert. Wenn die Präkursorzellen von transgenen Tieren stammen, können sie einer weiteren genetischen Veränderung unterzogen werden oder nicht, in Abhängigkeit von den gewünschten Eigenschaften der Zellen. Eine beliebige nützliche genetische Modifikation der Zellen liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise können Präkursorzellen verändert werden, um eine biologisch wirksame Substanz zu produzieren oder die Produktion einer biologisch wirksamen Substanz zu steigern, wie etwa einem Neurotransmitter oder Wachstumsfaktor oder dergleichen. Die genetische Veränderung wird entweder durch Infektion mit rekombinanten Retroviren oder durch Transfektion unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt (siehe Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982)). Kurz gesagt, die chimären Genkonstrukte enthalten virale Elemente beispielsweise den „Long Terminal Repeat" (LTR) des Retrovirus, Simian Virus 40 (SV40), Cytomegalievirus (CMV); oder säugetierzellspezifische Promotoren wie etwa Tyrosinhydroxylase (TH), Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), Phenylethanolamin-N-methyltransferase (PNMT), Cholinacetyltransferase (ChAT), fibrilläres saures Gliaprotein (GFAP), Neuronen-spezifische Enolase (NSE), die Neurofilament-(NF)-Proteine (NF-L, NF-M, NF-H und dergleichen), welche die Expression der Strukturgene, welche für das gewünschte Protein codieren, steuern. Außerdem umfassen die Vektoren einen Medikamentselektionsmarker wie etwa das E.coli Aminoglycosidphosphotransferasegen, welches bei Coinfektion mit dem experimentellen Gen eine Resistenz gegenüber Geneticin (G418), einem Proteinsyntheseinhibitor, verleiht.
  • Wenn die genetische Veränderung zur Produktion einer biologisch wirksamen Substanz geschieht, ist die Substanz im Allgemeinen eine Substanz, welche für die Behandlung einer bestimmten ZNS-Erkrankung nützlich ist. Beispielsweise kann es erwünscht sein, die Zellen genetisch zu modifizieren, so dass sie ein bestimmtes Wachstumsfaktorprodukt sekretieren. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Wachstumsfaktorprodukt" ein Protein, Peptid, Mitogen oder ein anderes Molekül mit einem Wachstums-, proliferativen, Differenzierungs- oder trophischem Effekt. Wachstumsfaktorprodukte, welche bei der Behandlung von ZNS-Erkrankungen nützlich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den hirnstämmigen neurotrophen Faktor (BDNF), die Neurotrophine (NT-3, NT-4/NT-5), den zilären neurotrophen Faktor (CNTF), Amphiregulin, bFGF, aFGF, EGF, TGFα, TGFβ, PDGF, IGFs und die Interleukine.
  • Die Zellen können auch so verändert werden, dass sie einen bestimmten Wachstumsfaktorrezeptor (r) exprimieren, einschließlich aber nicht beschränkt auf den p75 NGFr mit geringer Affinität, CNTFr, die trk-Familie der Neurotrophinrezeptoren (trk, trkB, trkC), EGFr, FGFr und die Amphiregulinrezeptoren. Zellen können so verändert werden, dass sie verschiedene Neurotransmitter oder deren Rezeptoren erzeugen, wie etwa Serotonin, L-Dopa, Dopamin, Norephinephrin, Ephinephrin, Tachykinin, die Substanz P, Endorphin, Enkephalin, Histamin, N-Methyl-D-aspartat (NMDA), Glycin, Glutamat, γ-Aminobuttersäure (GABA), Acetylcholin und dergleichen. Nützliche Neurotransmitter-synthetisierende Gene umfassen TH, Dopacarbocylase (DDC), DBH, PNMT, Glutaminsäuredecarboxylase (GAD), Tryptophanhydroxylase, ChAT und Histidindecarboxylase. Gene, welche für verschiedene Neuropeptide codieren, die sich bei der Behandlung von ZNS-Erkrankungen als nützlich erweisen können, umfassen die Substanz P, Neuropeptid-Y (NP-Y), Enkephalin, Vasopressin, vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Glucagon, Bombesin, Cholecystokinin (CCK), Somatostatin, Calcitoningenverwandtes Peptid (CGRP) und dergleichen.
  • Nachdem erfolgreich transfizierte/identifizierte Zellen selektiert sind, werden sie kloniert unter Verwendung einer Grenzverdünnung in 96 Multi-Well-Platten und im Hinblick auf die Gegenwart der gewünschten biologisch aktiven Substanz untersucht. Klone, welche hohe Spiegel der gewünschten Substanz exprimieren, werden angezogen und ihre Anzahl in T-Flaschen expandiert. Die spezielle Zelllinie kann dann cyrokonserviert werden. Die genetisch veränderte Präkursorzelllinie kann zur Zell/Gentherapie verwendet werden und folglich in das ZNS eines Empfängers implantiert werden, welcher das biologisch wirksame Molekül benötigt, das von den genetisch veränderten Zellen erzeugt wird. Es werden mehrere Klone von genetisch veränderten Präkursorzellen erhalten. Einige ergeben bevorzugt neuronale Zellen und manche Gliazellen.
  • Alternativ können die genetisch veränderten Präkursorzellen vor der Implantation verschiedenen Differenzierungsprotokollen in vitro unterzogen werden. Beispielsweise können genetisch veränderte Präkursorzellen aus dem Kulturmedium entfernt werden, welches eine Proliferation ermöglicht, und mit einem Medium behandelt werden, das einen Wachstumsfaktor oder eine Kombination von Wachstumsfaktoren enthält, welche die Differenzierung der Zellen in Neuronen oder Makrogliazellen induzieren. Die Differenzierungsprotokolle sind in der parallel anhängigen Patentanmeldung U.S.S.N. 07/967,622 angeführt, die am 28. Oktober 1992 angeführt wurde und am 11. Mai 1994 als WO 94/10292 veröffentlicht wurde. Das verwendete Protokoll hängt von der Art der gewünschten genetisch veränderten Zelle ab. Die Differenzierung kann auch induziert werden durch Ausplattieren der Präkursorzellen auf einem fixierten Substrat, einschließlich mit Poly-L-Ornithin oder Poly-L-Lysin beschichteten Flaschen oder dergleichen.
  • Es werden verschiedene Macker verwendet, um die differenzierten Zellen zu identifizieren. Oligodendrozytenpräkursorzellen, welche Oligodendrozyten ergeben, können den Phänotyp A2B5 (+), 04(+)/GalC(–), MBP(–) und GFAP(–) aufweisen [sind aber nicht auf diesen Phänotyp beschränkt]. Oligodendrozyten, die Gliazellen sind, welche das die Axone umgebende Myelin im ZNS bilden, besitzen den Phänotyp Galactocerebrosid (+), basisches Myelinprotein (–) und fibrilläres saures Gliaprotein (–) [GalC(–), MBP(+), GFAB(–)].
  • Neuronen können einen oder mehrere der folgenden phänotypischen Marker besitzen: Neuronen-spezifische Enolase (NSE), die Neurofilament (NF)-Proteine, tau-1 und MAP-2. Neuronen können auch identifiziert werden auf Grundlage der Expression eines beliebigen einer Vielzahl von klassischen Neurotransmitterenzymen. Außerdem können Neuronen identifiziert werden auf Grundlage von morphologischen Kriterien oder anderen funktionellen Maßnahmen wie etwa einer elektrophysiologischen Aufzeichnung. Solch eine Identifizierung kann durchgeführt werden in Kombination mit der Identifizierung von einem oder mehreren der oben angeführten phänotypischen Marker.
  • Astrozyten des Typs 1 sind Gliazellen, welche eine flache protoplasmische/Fibroblasten-ähnliche Morphologie besitzen. Diese Zellen besitzen den Phänotyp GFAB(+), A2B5(–), GalC(–) und MBP(–). Astrozyten des Typs II, welche Gliazellen sind, die eine sternförmige, Fortsätze aufweisende Morphologie zeigen, besitzen den Phänotyp GFAP(+), A2B5(+), GalC(–) und MBP(–).
  • Wenn sich die Zellen einmal differenziert haben, werden sie erneut untersucht im Hinblick auf die Expression des gewünschten Proteins. Zellen mit dem gewünschten Phänotyp können isoliert werden und in Empfänger implantiert werden, die das Protein oder das biologisch aktive Molekül benötigen, welches durch die genetisch veränderte Zelle exprimiert wird.
  • Es kann ein beliebiges Verfahren für Implantation von Präkursorzellen in das ZNS verwendet werden, sodass die Zellen angemessen in das ZNS integrieren. Die Injektionsverfahren, beispielhaft dargestellt durch diejenigen, welche von Duncan et al., J. Neurocytology, 17:351–361 (1988) verwendet wurden, und zur Verwendung beim Menschen im Maßstab vergrößert und verändert wurden, sind bevorzugt. Die von Gage et al., U.S. Patent Nr. 5,082,670 gelehrten Verfahren für die Injektion von Zellsuspensionen wie etwa Fibroblasten in das ZNS können auch für die Injektion von Präkursorzellen verwendet werden. Zusätzliche Ansätze und Verfahren können in "Neural Grafting in the Mammalian CNS", Bjorklund und Stenevi, Eds., (1985) gefunden werden. Die Zahl der injizierten genetisch veränderten Zellen wird die sein, welche erforderlich ist, um eine therapeutische Wirkung bereitzustellen und hängt von der zu behandelnden Erkrankung ab. Im Allgemeinen liegen genetisch veränderte neurale Präkursorzellen im Gehirn mit einer Konzentration von größer als 10 Zellen/100 Kubikmikrometer vor.
  • Wenn die Präkursorzellen in den Empfänger injiziert werden sollen und nicht von einem Gewebe des Wirts stammen (d.h. Allotransplantat oder Heterotransplantat), können Immunsuppressionsverfahren erforderlich sein, um die Langlebigkeit des Transplantats sicherzustellen. Eine lokale Immunsuppression wird von Gruber, Transplantation 54:1–11 (1992) offenbart, welche durch Referenz enthalten ist.
  • Rossini, U.S. Patent Nr. 5,026,365 offenbart Verkapselungsverfahren, die für eine lokale Immunsuppression geeignet sind.
  • Als eine Alternative zur Anwendung von Immunsuppressionsverfahren können bei den Präkursorzellen Verfahren des Genaustauschs oder Knockout angewendet werden, unter Verwendung von homologer Rekombination in embryonalen Stammzellen, gelehrt von Smithies et al. (Nature, 317:230–234 (1985) und ausgedehnt auf einen Genaustausch oder Knockout in Zelllinien (N. Zheng et al., PNAS, 88:8067–8071 (1991)), zur Entfernung der Gene des Haupthistokompatibilitätkomplexes (MHC). Präkursorzellen ohne MHC-Expression ermöglichen die Transplantation von angereicherten neuralen Zellpopulationen über allogene und vielleicht sogar heterogene Histokompatibilitätsbarrieren, ohne dass der Empfänger immunsupprimiert werden muss. Allgemeine Übersichten und Zitate für die Verwendung von rekombinanten Verfahren zur Verringerung der Antigenizität von Spenderzellen werden auch von Gruber (siehe oben) offenbart. Beispielhafte Ansätze zur Verringerung der Immunogenizität von Transplantaten durch Oberflächenveränderung werden von Faustman WO 92/04033 (1992) offenbart.
  • Obwohl feste Gewebefragmente und Zellsuspensionen von neuralem Gewebe als ein Ganzes immunogen sind, kann es möglich sein, dass einzelne Zelltypen innerhalb des Transplantats selbst in einem geringeren Ausmaß immunogen sind. Beispielsweise haben Bartlett et al. (Prog. Brain Res. 82: 153–160 (1990)) die neurale Allotransplantatabstoßung aufgehoben durch Vorauswahl einer Subpopulation von embryonalen Neuroepithelzellen für die Transplantation durch die Verwendung einer Immunobeadseparation auf Basis der MHC-Expression. Folglich ist ein anderer Ansatz bereitgestellt zur Verringerung der Möglichkeit der Allotransplantat- und Heterotransplantatabstoßung durch den Empfänger ohne Verwendung von Immunsuppressionverfahren.
  • Ergebnisse von Studien zur humanen Transplantation haben gezeigt, dass das Überleben von fötalem mesencephalischem Allotransplantatgewebe im Parkinson-Gehirn relativ schlecht ist (Freed et al. und Spencer et al siehe oben).
  • Das schlechte Überleben des verpflanzten Materials kann verursacht sein durch die gleichen mit der Erkrankung assoziierten Faktoren, welche die ursprüngliche Neurodegeneration ergaben. Man kann vorhersagen, dass die Umgebung, welche für die eigenen Neuronen des Empfängers toxisch war, auf ähnliche Art und Weise toxisch ist für das verpflanzte Gewebe oder die Zellen. Unterstützung dafür kommt von Berichten einer signifikanten funktionellen Verbesserung, die durch das implantierte fötale Mesencephalongewebe in MPTP-geschädigten Menschen bereitgestellt wird (Widner et al., siehe oben). Anders als bei der Situation im Gehirn der Parkinson-Krankheit ist das MPTP-induzierte Parkinson-Syndrom primär ein funktioneller Verlust der dopaminergischen Neuronen der Substantia nigra ohne die zugrundeliegenden idiopathischen Prozesse, die mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung stehen. Im Gegensatz zum Gehirn der Parkinson-Erkrankung ist das MPTP-geschädigte menschliche Gehirn wahrscheinlich zur Zeit der Implantation frei von neurotoxischen Substanzen.
  • Kürzlich ist von Liu et al. (Cell, 70:539–551 (1992)) die cDNA eines neuen Chromaffingranulatransporters (CGAT, „chromaffin granule amine transporter") beschrieben worden, welche in vitro eine Resistenz gegen das Neurotoxin MPP+ in CHO-Zellen verleiht. Da dopaminergische Neuronen von der Substantia nigra spezifisch durch MPP+ getötet werden, kann die CGAT-Genexpression in Präkursorzellen die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Implantation in das Parkinson-Gehirn verbessern.
  • Damit die hierin beschriebene Erfindung vollständiger verstanden wird, werden die folgenden Beispiele angeführt. Es sollte verstanden werden, dass diese Beispiele nur zu illustrativen Zwecken dienen und nicht den Umfang der Erfindung auf irgendeine Art und Weise beschränken sollen.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Propagation der Vorläuferzellen
  • CD1-Albinomäuse (Charles River) des Embryonaltags 14 (E14) wurden dekapitiert und das Gehirn und Striatum wurden unter Verwendung eines sterilen Verfahrens entfernt. Das Gewebe wurde mechanisch mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette in serumfreies Medium ausgetrennt, zusammengesetzt aus einem 1:1 Gemisch von Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und F-12 Nahrungsgemisch (Gibco). Die Zellen wurden für 5 Minuten bei 800 rpm zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen wurden zum Auszählen in DMEM/F-12 Medium resuspendiert.
  • Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium, hierin nachfolgend als "Komplettmedium" bezeichnet, suspendiert, das aus DMEM/F-12 (1:1) zusammengesetzt war, welches Glucose (0,6%), Glutamin (2 mM), Natriumbicarbonat (3 mM), HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure)-Puffer (5 mM) umfasste, und ein definiertes Hormongemisch und Salzgemisch (um das Serum zu ersetzen), welches Insulin (25 μg/ml), Transferrin (100 μg/ml), Progesteron (20 nM), Putrescin (60 μM) und Selenchlorid (30 nM) (alles außer Glutamin [Gibco] von Sigma) enthielt. Außerdem enthielt das Medium 16–20 ng/ml EGF (gereinigt von der Submandibulardrüse der Maus, Collaborative Research) oder TGF (human, rekombinant, Gibco). Die Zellen wurden mit 0,2 × 106 Zellen/ml in 75 cm2 Gewebekulturflaschen (Corning) ohne Substratvorbehandlung ausplattiert und in einem Inkubator bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit, 95% Luft/5% CO2 untergebracht.
  • Die Zellen proliferierten innerhalb der ersten 48 Stunden und nach 3–4 Tagen in vitro (DIV, "days in vitro") bildeten sich kleine Cluster, bekannt als Neurosphären, welche sich zwischen 4–6 DIV vom Substrat abhoben.
  • Nach 7 DIV wurden die Neurosphären entfernt, bei 400 rpm für 2–5 Minuten zentrifugiert und das Pellet mechanisch mit einer feuerpolierten Glas-Pasteur-Pipette in 2 ml Komplettmedium in einzelne Zellen getrennt.
  • 1 × 106 Zellen wurden in eine 75 cm2 Gewebekulturflasche mit 20 ml des EGF-haltigen Komplettmediums wieder ausplattiert. Die Proliferation der Stammzellen und Bildung neuer Neurosphären wurde wieder eingeleitet. Dieses Verfahren kann alle 6–8 Tage wiederholt werden, um eine unbegrenzte Anzahl von Stammzellen zu erhalten.
  • Beispiel 2
  • Genetische Veränderung von Präkursorzellen mit einem Retrovirus, der das bakterielle β-Galactosidasegen enthält
  • Die Vorläuferzellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben propagiert. Eine große Flasche Neurosphären (4–5 Tage alt) der Passage 1 wurde geschüttelt, um die Sphären von der Flasche zu lösen. Die Flasche wurde bei 400 rpm für 3–5 Minuten rotiert. Etwa die Hälfte des Mediums wurde entfernt ohne die Neurosphären zu stören. Die Sphären und das restliche Medium wurden entfernt, in einem 12 ml Falcon Zentrifugenröhrchen platziert und bei 600 rpm für 3–5 Minuten rotiert. Das restliche Medium wurde entfernt, wobei einige hundert Mikroliter zurückgelassen wurden.
  • Ein Retrovirus, welcher das bakterielle β-Galactosidasegen enthielt, wurde verpackt und sekretiert, in einer Replikations-abhängigen Art und Weise, von der CRE BAG2 Zelllinie, hergestellt von C. Cepko. Einen Tag nachdem die CRE-Zellen Konfluenz erreichten, wurden die Zellen mit PBS gewaschen und das Retrovirus wurde in DMEM/F12/HM/20 ng/ml EGF für vier Tage gesammelt. Das Virus-haltige Medium wurde durch einen 0,45 μm Spritzenfilter filtriert. Die Neurosphären wurden in dem Virus-haltigen Medium resuspendiert, in eine große Flasche übertragen und in einem Inkubator über Nacht bei 37°C belassen. Am nächsten Tag wurden die Inhalte der Flaschen in 12 ml Zentrifugenröhrchen übertragen und bei 800 rpm rotiert. Die Zellen wurden in EGF-haltigem Medium/HM resuspendiert, zu Einzelzellen aufgetrennt und gezählt. Die Zellen wurden wieder ausplattiert in einer großen Flasche mit 50 000 Zellen/ml in insgesamt 20 ml.
  • Vier Tage später wurden die transformierten Zellen mit G418 bei einer Konzentration von 300 μg/ml selektiert. Transformierte Sphären wurden auf einem mit Polyornithin beschichteten Glasdeckgläschen in einer 24-Well-Platte ausplattiert. Nachdem die Neurosphären sich an die Platte anhefteten, wurden die Zellen mit 0,1 % Glutaraldehyd für 5 Minuten bei 4°C fixiert. Nachdem die Zellen fixiert waren, wurden sie zweimal mit PBS für 10 Minuten gewaschen. Dann wurden die Zellen mit 0,1 % TritonR in PBS für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Eine 1 mg/ml X-Gal-Lösung wurde jedem Well zugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten gewaschen und im Hinblick auf irgendwelche Reaktionsprodukte beobachtet. Eine positive Reaktion ergab eine blaue Farbe, was anzeigt, dass die Zellen das übertragene Gen enthalten.
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Präkursorzellen aus transgenen Mäusen
  • Transgene Mäuse wurden erzeugt unter Verwendung einer pronuklearen Standardinjektion des chimären MBP-lacZ-Gens, in welchem der Promotor für MBP die Expression der E.coli β-Galactosidase (lacZ) steuert. Transgene Tiere wurden durch PCR identifiziert, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die spezifisch für lacZ sind.
  • Die Neurosphären wurden aus transgenen E15-Mäusen und DNA-negativen Wurfgenossen unter Verwendung der in Beispiel 1 dargelegten Verfahren hergestellt. Die Neurosphären wurden in dem definierten Kulturmedium in Gegenwart von 20 ng/ml EGF propagiert und wurden wöchentlich für 35 Wochen passagiert. Für die Passage wurden die Neurosphären geerntet, sanft bei 800 rpm zentrifugiert und mechanisch durch Zerstoßen mit einer feuerpolierten Pasteurpipette zerteilt. Bei verschiedenen Passagen wurden die Zellen durch Veränderung der Kulturbedingungen zur Differenzierung in Oligodendrozyten, Astrozyten und Neuronen induziert. Die freifließenden Stammzellcluster wurden sanft zentri fugiert, im gleichen Basis-definierten Medium ohne EGF und mit 1 % fötalem Kälberserum resuspendiert und auf mit Polyornithin behandelten Glasdeckgläschen ausplattiert, um die Anheftung der Zellen zu fördern. Die Cluster heften sich fest an das Glas und die Zellen verlangsamen oder stoppen die Teilung und beginnen, sich zu differenzieren.
  • Die Identifizierung von verschiedenen Zelltypen wurde durchgeführt unter Verwendung der Immunfluoreszenzmikroskopie mit Antikörpern, welche für Neuronen (MAP-2, NF-L und NF-M), Astrozyten (GFAP) und Oligodendrozyten und Oligodendrozytenpräkursoren (A2B5, O1, O4, Gal C und MBP) spezifisch waren. Ein bis 14 Tage nach dem Ausplattieren wurden die Zellen auf den Deckgläschen unfixiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert mit den primären Antikörpern O1, O4, GalC und A2B5 (Überstände), verdünnt in Minimalessentialmedium mit 5% normalem Ziegenserum und 25 mM HEPES-Puffer, pH 7,3 (MEM-HEPES, NGS). Nach den primären Antikörpern wurden die Deckgläschen sanft fünfmal in Rhodamin-konjugierten sekundären Antikörpern (Sigma), die in MEM-HEPES, NGS verdünnt waren, gewaschen. Die Deckgläschen wurden dann fünfmal mit MEM-HEPES gewaschen und mit saurem Alkohol (5% Eisessig/95% Ethanol) bei –20°C fixiert. Dann wurden die Deckgläschen fünfmal mit MEM-HEPES gewaschen und entweder fixiert und unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie untersucht, oder mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen GFAP, Nestin, MBP oder Proteolipidprotein (PLP) gerichtet war, immunreagiert. Wenn sie einer zweiten Runde der Immunmarkierung unterzogen wurden, wurden die Deckgläschen zuerst für 1 Stunde mit 5% normalem Ziegenserum (NGS) in 0,1 M Phosphatpuffer mit 0,9% NaCl bei pH 7,4 (PBS) inkubiert und dann in primären Kaninchen-Antikörpern, verdünnt in NGS, für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Deckgläschen wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann mit den geeigneten sekundären Antikörperkonjugaten, verdünnt in NGS, inkubiert, erneut mit PBS gewaschen und dann schließlich auf Glasmikroskopträger mit Citifluor-Antibleichfixiermittel fixiert und unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops untersucht. In Fällen, bei denen sie nicht zuerst mit den monoklonalen Antikörperüberständen inkubiert wurden, wurden die Deckgläschen für 20 Minuten mit 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) fixiert, mit PBS gewaschen, mit 100% Ethanol permeabilisiert, erneut mit PBS gewaschen und 5% NGS in PBS für 1 Stunde inkubiert. Die primären Antikörper und sekundären Antikörperkonjugate wurden wie oben beschrieben verwendet.
  • Die neuralen Stammzellen, die von den transgenen Tieren stammten, waren nicht von den nicht transgenen Stammzellen unterscheidbar, im Hinblick auf ihr Potenzial zur Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Der MBP-Promotor steuerte die Expression des β-Galactosidasereportergens in einer zellspezifischen und entwicklungsmäßig geeigneten Art und Weise. Die Transgenexpression ist hochstabil, da Oligodendrozyten, die von MBP-lacZ-Neurosphären einer späten Passage (20 Passagen) stammen, das β-Galactosidasegen exprimierten. Folglich sind transgen markierte Neurosphären wahrscheinlich eine ausgezeichnete Quelle für Zellen für eine Gliatransplantation.
  • Beispiel 4
  • Genetische Veränderung von Präkursorzellen unter Verwendung einer Calciumphosphattransfektion
  • Präkursorzellen werden wie in Beispiel 1 beschrieben propagiert. Die Zellen werden dann unter Verwendung eines Calciumphosphattransfektionsverfahren infiziert. Für die Standardcalciumphosphattransfektion werden die Zellen mechanisch in eine Einzelzellsuspension geteilt und auf behandelten Gewebekulturplatten bei 50% Konfluenz (50 000 – 75 000 Zellen/cm2) ausplattiert, und können über Nacht anhaften.
  • Das modifizierte Calciumphosphattransfektionsverfahren wird wie folgt durchgeführt: DNA (15–25 μg) in sterilem TE-Puffer (10 mM Tris, 0,25 mM EDTA, pH 7,5), verdünnt auf 440 μl mit TE, und 60 μl 2 M CaCl2 (pH bis 5,8 mit 1 M HEPES-Puffer) wird zu dem DNA/TE-Puffer zugegeben. Insgesamt 500 μl 2 × HeBS (HEPES-gepufferte Saline; 275 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, 12 mM Dextrose, 40 mM HEPES-Pufferpulver, pH 6,92) wird zu dieser Mischung tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehen gelassen. Die Zellen werden kurz mit 1 × HeBS gewaschen und 1 ml der mit Calciumphosphat präzipitierten DNA-Lösung wird zu jeder Platte zugegeben, und die Zellen werden bei 37°C für 20 Minuten inkubiert. Nach dieser Inkubation werden 10 ml Komplettmedium zu den Zellen zugegeben, und die Platten werden in einem Inkubator (37°C, 9,5% CO2) für weitere 3–6 Stunden platziert. Die DNA und das Medium werden durch Absaugen am Ende der Inkubationszeit entfernt, und die Zellen werden dreimal mit komplettem Wachstumsmedium gewaschen und dann in den Inkubator zurückgestellt.
  • Beispiel 5
  • Genetisch veränderte Präkursorzellen, welche NGF exprimieren
  • Unter Verwendung entweder des rekombinanten Retrovirus oder des direkten DNA-Transfektionsverfahrens wird ein chimäres Gen, zusammengesetzt aus dem Promotor des humanen Cytomegalievirus CMV, welcher die Expression des NGF-Gens der Ratte steuert, in die Neurosphärenzellen eingebracht. Außerdem umfasst der Vektor das E.coli Neomycinresistenzgen, gesteuert von einem viralen Promotor. Nach 2 Wochen G418-Selektion werden die Zellen unter Verwendung einer Grenzverdünnung in 96-Multi-Well-Platten kloniert, und die resultierenden Klone werden im Hinblick auf eine Neurotrophinproteinexpression unter Verwendung eines Neurotrophinrezeptor- (trk-Familie) Autophosphorylierungsbioassays untersucht.
  • Klone, die hohe Spiegel von NGF exprimieren, werden vor der Differenzierung in T-Flaschen expandiert. Die Zellen werden dann aus dem EGF-haltigen Komplettmedium entfernt und mit einer Kombination von Serum und einem Cocktail von Wachstumsfaktoren behandelt, um die Astrozytendifferenzierung zu induzieren. Die Astrozyten werden erneut im Hinblick auf NGF-Expression untersucht, um sicherzustellen, dass die differenzierten Zellen weiterhin die trophischen Faktoren exprimieren. Astrozyten, welche NGF sekretieren, werden dann in Rattengehirne mit Fimbria/Fornix-Läsionen unmittelbar nach der Läsion injiziert, um die cholinergen Neuronen zu schützen. Kontroll-Astrozyten, welche kein NGF sekretieren, werden auf ähnliche Art und Weise in läsionierte Tiere injiziert. Die Schonung der cholinergen Neuronen im Läsionsmodell wird bewertet unter Verwendung einer Immunzytochemie für ChAT, dem Marker dieser cholinergischen Neuronen.
  • Beispiel 6
  • Genetisch veränderte Präkursorzellen, die CGAT exprimieren
  • Die Vorläuferzellen werden wie in Beispiel 1 propagiert. Diese Zellen werden mechanisch zerteilt und auf Plastikpetrischalen ausplattiert und mit einem Retrovirus infiziert, welcher die CGAT-cDNA enthält. Die Expression der CGAT-cDNA (Liu et al., siehe oben) wird durch einen konstitutiven Promotor (CMV oder SV40, oder einem retroviralen LTR) oder einem zellspezifischen Promotor (TH oder andere dopaminerge oder catecholaminerge zellspezifische regulatorische Elemente oder dergleichen) gesteuert. Die Zellen werden im Hinblick auf die Expression des CGAT-Proteins untersucht. Ausgewählte Zellen können dann in vitro differenziert werden unter Verwendung eines Wachstumsfaktors oder einer Kombination aus Wachstumsfaktoren, um dopaminerge oder prädopaminerge Neuronen zu erzeugen.

Claims (20)

  1. Verfahren zur Herstellung von nicht tumorigenen, genetisch veränderten, multipotenten neuralen Stammzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), umfassend die Schritte: (a) Isolieren von multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS aus neuralem Gewebe unter Ausschluss von humanem Embryonalgewebe/Embryonalzellen, wobei die neuralen Stammzellen nicht mit einem Oncogen immortalisiert wurden, wobei die neuralen Stammzellen des ZNS Nachkommen erzeugen können, die sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren können; (b) Proliferieren der multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS in einem serumfreien Kulturmedium, das einen Wachstumsfaktor enthält, welcher eine Induktion der Proliferation der multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS bewirken kann; (c) weiteres Vermehren der proliferierten Zellen, und (d) genetisches Verändern der vermehrten Zellen durch Einbringen eines exogenen Polynukleotids in die proliferierten Zellen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wachstumsfaktor, welcher eine Induktion der Proliferation der multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS im Kulturmedium in Schritt (b) bewirken kann, ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus saurem Fibroblastenwachstumsfaktor, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, Amphiregulin, transformierendem Wachstumsfaktor Alpha und Kombinationen davon.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das neurale Gewebe von einem Foetus erhalten wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das neurale Gewebe von einem erwachsenen Lebewesen erhalten wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, worin das neurale Gewebe von einem Menschen erhalten wird.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die proliferierten Zellen genetisch verändert werden, um ein Wachstumsfaktorprodukt zu erzeugen.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Wachstumsfaktorprodukt ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nervenwachstumsfaktor, hirnstämmigem neurotrophem Faktor („brain-derived neurotrophic factor"), Neurotrophinen, ziliärem neurotrophem Faktor, Amphiregulin, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor, saurem Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, transformierendem Wachstumsfaktor Alpha, transformierendem Wachstumsfaktor Beta, Plättchenwachstumsfaktor, Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren und Interleukinen.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die proliferierten Zellen genetisch verändert werden, um einen Wachstumsfaktor-Rezeptor zu produzieren.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Wachstumsfaktor-Rezeptor ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus dem Rezeptor des p75 Nervenwachstumsfaktors mit geringer Affinität, dem Rezeptor des ziliären neurotrophen Faktors, Neurotrophinrezeptoren, dem Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors, dem Rezeptor des Fibroblastenwachstumsfaktors und dem Amphiregulinrezeptor.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die proliferierten Zellen genetisch verändert werden, um einen Neurotransmitter zu exprimieren.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Neurotransmitter ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Serotonin, L-Dopa, Dopamin, Norepinephrin, Epinephrin, Tachykinin, Endorphin, Histamin, N-Methyl-D-Aspartat, Glycin, Glutamat, γ-Aminobuttersäure und Acetylcholin.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die proliferierten Zellen genetisch verändert werden, um ein Neurotransmitter-bildendes Gen zu enthalten.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Neurotransmitter-bildende Gen ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Tyrosin-Hydroxylase, Dopa-Decarboxylase, Dopamin-β-Hydroxylase, Phenylethanolamin-N-Methyltransferase, Glutaminsäure-Decarboxylase, Tryptophan-Hydroxylase, Cholin-Acetyltransferase und Histidin-Decarboxylase.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die proliferierten Zellen genetisch verändert werden, um ein Neuropeptid zu produzieren.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Neuropeptid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Substanz P, Neuropeptid-γ, Enkephalin, Vasopressin, vasoaktivem intestinalem Peptid, Cholecystokinin, Glucagon, Bombesin, Somatostatin und Calcitoningen-verwandtem Peptid.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die proliferierten Zellen genetisch verändert werden, um den Chromaffin-Granulum-Amintransporter zu exprimieren.
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend: (d) Differenzieren der genetisch veränderten Zelle.
  18. Kultur, umfassend genetisch veränderte, multipotente, neurale Stammzellen des zentralen Nervensystems (ZNS), welche nicht mit einem Onkogen immortalisiert wurden, und welche (a) eine positive Nestin-Färbung aufweisen; (b) Nachkommen erzeugen können, welche sich zu Oligodendrozyten, Astrozyten und Neuronen differenzieren können, und (c) nicht tumorigen sind, worin die Zellkultur erhältlich ist durch die Schritte: (a) Isolieren von multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS aus neuralem Gewebe, worin die neuralen Stammzellen nicht mit einem Oncogen immortalisiert wurden, wobei die neuralen Stammzellen des ZNS Nachkommen erzeugen können, die sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren können; (b) Proliferieren der multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS in einem serumfreien Kulturmedium, das einen Wachstumsfaktor enthält, welcher eine Induktion der Proliferation der multipotenten neuralen Stammzellen des ZNS bewirken kann; (c) weiteres Vermehren der proliferierten Zellen, und (d) genetisches Verändern der vermehrten Zellen durch Einbringen eines exogenen Polynukleotids in die proliferierten Zellen.
  19. Kultur nach Anspruch 18, worin die Zelle eine humane Zelle ist.
  20. Kultur nach Anspruch 18 oder 19, worin die Zellen genetisch verändert werden, um eine biologisch aktive Substanz zu exprimieren, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wachstumsfaktorprodukten, Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Neurotransmittern, Neurtransmitter-Rezeptoren und Neuropeptiden.
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