DE69432645T2

DE69432645T2 - Monoklonale antikörper gegen isozyme der thymidinkinase

Info

Publication number: DE69432645T2
Application number: DE69432645T
Authority: DE
Inventors: L. Kim O'NEILL
Original assignee: Brigham Young University
Current assignee: Brigham Young University
Priority date: 1993-08-06
Filing date: 1994-08-05
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2014-08-06
Also published as: EP1142991A3; AU7559694A; AU675872B2; DE69432645D1; ATE239784T1; US5698409A; EP0785993B1; EP1142991A2; EP0785993A4; WO1995004758A1; EP0785993A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet: Die Erfindung betrifft im allgemeinen einen monoklonalen Antikörper, der zur Beurteilung der Diagnose, Prognose und Behandlung von Krebs und bestimmten Blutkrankheiten und zur Vorhersage eines Rückfalls bei Krebspatienten nützlich ist.
Stand der Technik: Sobald Krebs nachgewiesen ist, ist das Entwicklungsstadium der Krankheit ein wichtiger Faktor zur Bestimmung, welche Behandlungen) verwendet werden sollen. Krebs wird im allgemeinen von Stadium I, der frühesten und am besten zu behandelnden Phase, bis Stadium IV eingestuft, der ein sehr fortgeschrittener, häufig metastatischer Tumor mit Todesprognose ist.
Es ist ebenfalls erwünscht, das Wachstum oder fehlendes Wachstum des Krebses während und im Anschluß an eine Behandlung zu überwachen. Falls Tumorrückfälle sehr früh entdeckt werden, können sie in manchen Fällen erfolgreich behandelt werden, so dass letztlich eine Heilung bewirkt wird oder dass das Leben des Patienten signifikant verlängert wird. Oder, falls ein Tumor nicht auf ein anspricht, können andere spezielle Arzneimittel oder Behandlungen versucht werden.
Nimmt man Brustkrebs als Beispiel, so könnten dann, wenn es möglich wäre für diese Patienten genau vorherzusagen, dass sie für das Zeigen eines Tumorrückfalls anfällig sind, geeignete Behandlungsabläufe in Abhängigkeit von der Aggressivität des Tumors verabreicht werden. In den Fällen, in denen angenommen wird, dass der Tumor sehr aggressiv ist, wird dann eine dicht darauf folgenden Nachbehandlung mit zusätzlicher Operation, Strahlentherapie und möglicherweise Chemotherapie nötig. Zeigt es sich, dass der Tumor nicht aggressiv ist, dann kann ein milder Behandlungsablauf geeignet sein. Eine genaue Vorhersage des Brusttumorverhaltens würde einen besseren Umgang mit dem Tumor deutlich vereinfachen und trägt signifikant zum Wohlergehen des Patienten bei.
Ebenfalls würde eine frühe Entdeckung eines Rückfalls den Arzt befähigen, schnell Maßnahmen zur Behandlung des Rückfalls zu ergreifen und möglicherweise die Überlebenswahrscheinlichkeit des Patienten zu erhöhen.
Für Brustkrebs wird derzeit angenommen, dass eines der besten Mittel zur Vorhersage der Rückfallwahrscheinlichkeit, der Östrogenrezeptorstatus ist. Von denjenigen Patienten, die Östrogenrezeptor-positiv sind (hohe Zahlen von Östrogenrezeptoren auf den Tumorzellen), wird angenommen, dass sie eine bessere Prognose aufweisen, während bei denjenigen, die Östrogenrezeptor-negativ sind, geglaubt wird, dass sie eine schlechte Prognose aufweisen. Es gibt jedoch viele Fälle, in denen diejenigen, die Östrogenrezeptor-negativ sind, keinen Rückfall zeigen und diejenigen, die Östrogenrezeptor-positiv sind, einen Rückfall zeigen. Da der Östrogenrezeptortest als ein Prognoseindikator nicht ausreichend zuverlässig ist, werden Patienten häufig sowohl mit Strahlentherapie als auch Chemotherapie ohne Rücksicht auf den Östrogenrezeptorstatus behandelt.
Thymidinkinase (ATP: Thymidin-5'Phosphotransferase; EC 2.7.1.21 im Klassifizierungssystem der International Union of Biochemistry) ist ein Enzym, das Thymidin zu Thymidinmonophosphat (TMP) phosphoryliert. Hier wird die allgemein verwendete Abkürzung TK verwendet, um Thymidinkinase in einem allgemeinen Sinne zu bezeichnen, einschließlich verschiedener Isozyme und multimerer Formen, von denen derzeit angenommen wird, dass sie in vivo vorkommen.
Das Thymidinkinaseprotein wurde aus vielen verschiedenen Quellen isoliert und auf unterschiedliche Reinheitsgrade aufgereinigt. Es wurde von einer Vielfalt von Thymidinkinasen mit unterschiedlichem Molekulargewicht aus menschlichen Proben, in Abhängigkeit von der speziellen Zelle und von dem Isolations- und Analyseverfahren, berichtet (zum Beispiel unter denaturierenden Bedingungen gegenüber nicht-denaturierenden Bedingungen). Die Befunde deuten im allgemeinen darauf hin, dass Thymidinkinase in mindestens einer monomeren Form mit einem MW von 24–28 KD und in einer Vielfalt multimerer Formen vorkommt.
Es ist ebenfalls bekannt, dass es in Menschen mindestens zwei Hauptisozyme der Thymidinkinase gibt (ähnlich, jedoch mit verschiedenen Formen), die hierin als TK1 und TK2 bezeichnet werden. Diese Isozyme werden von verschiedenen Genen produziert, werden in verschiedenen Zellkompartimenten gefunden und unterschieden sich in ihren Gehalten und dem Zeitpunkt der Expression während des Zellzyklus und entsprechend dem Zelldifferenzierungszustand. In Menschen befindet sich das TK1-Gen auf dem Chromosom 17 im Band q21–22 (Elsevier 1974), während das TK2-Gen sich auf dem Chromosom 16 (Willecke 1977) befindet. Kürzlich wurde ein Gen für TK1 geklont und sequenziert (Lin 1983, Flemington 1987).
Es gibt Berichte, dass die TK-Aktivität im Serum oder in den Tumorgeweben von Patienten mit manchen Krebsarten, einschließlich akuter und chronischer Leukämie, Hodgkins und Nicht-Hodgkins Lymphomen, solider Brust-, Prostata-, Gehirn- und Enddarmtumore, erhöht ist. Es wurde vorgeschlagen, dass eine anhaltende Erhöhung von Thymidinkinase im Serum ein Indikator einer bösartigen Krankheit ist. Die Messung der Thymidinkinaseaktivität mit herkömmlichen Mitteln ist jedoch langwierig und nicht immer reproduzierbar.
Weiterhin ist es aus vorhergehenden Berichten nicht immer klar, welche der Isozyme oder Formen der Thymidinkinase in ihrer Aktivität in Krebspatienten erhöht ist. Das Verfahren, das im allgemeinen zur Messung des TK1-Gehalts verwendet wird, beruht auf der Enzymaktivität durch Vergleich der Inkorporation von radioaktivem Thymidin in parallelen Proben, die mit verschiedenen sekundären Substraten (Adenosintriphosphat order ATP und Cytosintriphosphat oder CTP) untersucht werden. Sowohl TK1 als auch TK2 verwenden sehr wirksam ATP als Substrat. Jedoch weist das TK1-Isozym mit CTP als Substrat nur 7–15% der Aktivität mit ATP als Substrat auf. TK2 ist jedoch mit CTP nahezu so wirksam wie mit ATP. Die Gehalte der gesamten TK-Aktivität werden aus dem Assay mit ATP bestimmt, während die Gehalte der TK2 Aktivität aus dem Assay mit CTP bestimmt werden. Der Unterschied zwischen dem mit CTP gemessenen und dem mit ATP gemessenen Aktivitätsgehalt wird auf das TK1-Isozym zurückgeführt.
Dieses Verfahren ist langwierig und die Ergebnisse sind stark abhängig von der genauen Durchführung der parallelen Assays und sind manchmal schwer reproduzierbar. Da weiterhin TK1 eine gewisse Inkorporation in das CTP-Substrat zeigt, kann die Interpretation mehrdeutig sein. Ebenfalls scheint die aktive Form des TK1-Proteins ziemlich instabil zu sein, so dass die Menge der nachgewiesenen Aktivität in Anhängigkeit von der Handhabung der Probe variieren kann.
Es wäre daher wünschenswert, wenn man in der Lage wäre die Mengen des TK-Proteins und/oder der einzelnen TK-Isozyme zu messen. Für solche Zwecke wäre ein TK-Isozymspezifischer Antikörper, besonders ein monoklonaler Antikörper, nützlich.
Das am 30. Dezember 1981 veröffentlichte europäische Patent Nr. 0 042 482 von Balis et al. offenbart ein Verfahren zum Nachweis von bösartigen und noch nicht bösartigen Zellen in Menschen, die ein Antiserum verwenden, das gegen ein als „oncofötales" TK bezeichnete Isozym der Thymidinkinase erzeugt wurde. Das zum Erhalten des Antiserums verwendete TK-Isozym wurde aus menschlichem Plazentamaterial isoliert. Der Balis-Antikörper reagierte jedoch nicht mit den leukämischen Leukozyten oder mit normalen oder Mitogen-stimulierten peripheralen Lymphozyten, obwohl von diesen bekannt ist, dass die die TK-Gehalte erhöht haben (Balis et al., Spalte 2, Zeilen 21–23).
Ein weiteres am 23. Oktober 1991 veröffentlichtes europäisches Patent Nr. 0 255 431 von Jouan offenbart die Reinigung von „TK-F", das heißt von fötaler TK aus menschlichem Plazentamaterial für Zwecke, die die Verwendung des reinen TK-F zur Herstellung von Anti-TK-F-Antikörper umfassen. Sie offenbaren jedoch nicht, wie ein solcher Antikörper tatsächlich erhalten wird.
Dementsprechend besteht weiterhin ein Bedarf für Antikörper, die zum Nachweis der gesamten Mengen an Thymidinkinaseenzymen in Serum und Geweben brauchbar sind. Es besteht ebenfalls ein Bedarf für eine Liste von Antikörper, die zur Unterscheidung von verschiedenen TK-Isozymen und aktiven gegenüber inaktiven TK-Formen brauchbar sind. Weiterhin besteht ein Bedarf für verbesserte Verfahren zur Bewertung der Behandlungseffizienz und der Wahrscheinlichkeit eines Tumorrückfalls bei Brustkrebspatienten und Patienten mit anderen Tumorarten.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt umfaßt die Erfindung eine gereinigte Säuger-Thymidinkinase 1 (TK1) von Raji-Zellen, die ein Molekulargewicht von näherungsweise 100 kD aufweist und eine enzymatische Aktivität wie eine natürliche tetramere Spezies jedoch nicht wie eine monomere Untereinheit zeigt.
In einem zweiten Aspekt umfaßt die Erfindung monoklonale Antikörper, die mit Spezifität an die „aktive TK1" des ersten Aspekts der Erfindung binden (sie werden fortan "Anti-AcTK1"-Antikörper genannt).
In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung zeigen die monoklonalen Antikörper eine enzymatische TK1-Aktivität in einer einem Tier entnommenen biologischen Probe. Beispiele solcher biologischen Proben umfassen das Serum, das Gewebe und das Tumorgewebe.
In einer weiteren Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung bindet der monoklonale Antikörper spezifisch an die aktive tetramere Form einer TK1 mit einem Molekulargewicht von 100 kD und hemmt die enzymatische Aktivität des gebundenen Thymidinkinase 1-Polypeptids.
Die monoklonalen Antikörper dieses Aspekts der Erfindung können durch das American Type Culture Collection Hybridom HB 11432 oder andere geeignete Hybridomzelllinien hergestellt werden. Zuverlässige Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher geeigneten Hybridomzelllinien sind dem Fachmann bekannt. Kurzum, ein Verfahren zur Herstellung einer Hybridomzelllinie, die einen für die tetramere Thymidinkinase 1 spezifischen Antikörper erzeugt, umfaßt die Schritte des Bereitstellens eines Thymidinkinasepräparats des ersten Aspekts der Erfindung; des Injizierens eines Wirtstiers mit dem Thymidinkinasepräparat und des Abwartens einer Zeitdauer, die für das Anwachsen einer Immunreaktion gegen das Antigenpräparat ausreicht; des Entfernens von aktivierten B Lymphozyten aus dem injizierten Tier, des Verschmelzens der aktivierten B Lymphozyten mit Myelomazellen unter Bildung einer Vielzahl von Hybridomzellen und des einzelnen Kultivierens der Hybridomzellen zur Herstellung einer Vielzahl von Hybridomklonen und des Screenings der Hybridomkulturen zur Auswahl eine Hybridomklons, der einen Antikörper absondert, der mit Spezifität an das tetramere Thymidinkinase 1-Enzym bindet.
Ein Screeningverfahren zur Auswahl der monoklonalen Antikörper mit den gewünschten Spezifitäten verwendet die aktive TK1 des ersten Aspekts der Erfindung, die zu einer Form gereinigt wurde, die, bei einem Aussetzen gegenüber nicht-denaturierender Elektrophorese, als eine homogene Spezies wandert. Das Screeningverfahren kann ebenfalls das Screening zur Bestimmung der Fähigkeit der Antikörper zur Hemmung der Thymidinkinase 1-Aktivität in Zellextracten und/oder das Western-Blotting der elektrophoresierten Präparate der Thymidinkianse 1 umfassen.
In einem dritten Aspekt umfaßt die Erfindung einen zur Bestimmung des Thymidinkinase 1 (TK1)-Gehalts in biologischen Säugerproben verwendbaren Kit, umfassend:
einen monoklonalen Antikörper entsprechend dem zweiten Aspekt der Erfindung und
ein Reagenz, das zum Nachweis des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper und der TK1 in der biologischen Säugerprobe verwendbar ist.
In einem vierten Aspekt umfaßt die Erfindung ein Kit, der zur Bestimmung des Thymidinkinase 1 (TK1)-Gehalts und des Thymidinkinase 2 (TK2)-Gehalts in einer biologischen Säugerprobe verwendbar ist, umfassend:
einen monoklonalen Antikörper entsprechend dem zweiten Aspekt der Erfindung;
ein erstes Reagenz, das zum Nachweis des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper und der TK1 in der biologischen Säugerprobe verwendbar ist;
einen monoklonaler Antikörper, der mit Spezifität an eine gereinigte TK2 bindet; und
ein zweites Reagenz, das zum Nachweis des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper gegen eine gereinigte TK2 und die TK2 in der biologischen Säugerprobe verwendbar ist.
In einem fünften Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des aktiven TK1-Gehalts in einer Tumor- oder Serumprobe, das die Schritte umfaßt:
das Inkontaktbringens der Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch die TK1 des ersten Aspekts der Erfindung 1 bindet und
das Bestimmen der Menge des Antikörpers, der an die TK1 gebundenen hat.
Die in diesen Verfahren verwendeten Tumorproben können eine feste Tumorprobe, zum Beispiel eine frische oder gefrorene Gewebeprobe oder ein histologisches Objektträgerpräparat sein.
In einer Ausführungsform ist der monoklonale Antikörper an ein Enzym, das in einem ELISA Assay verwendbar ist, oder an einen anderen nachweisbaren Marker, wie zum Beispiel an einen Fluoreszenzfarbstoff, an ein radioaktives Isotop oder dergleichen konjugiert. Weiterhin kann der Kit wahlweise einen Anti-Maus-Antikörper, der zum Nachweis durch ELISA an ein Enzym konjugiert ist oder sonst irgendwie markiert ist, enthalten.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können ebenfalls zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit eines Tumorrückfalls in einem Patienten nützlich sein. Solche Verwendungen der monoklonalen Antikörper der Erfindung können auch die Schritte des Errichtens eines normalen Bereichs für die TK-Gewebeaktivität, des Erhaltens einer primären Tumorprobe von einem Patienten, des Bestimmens der TK-Enzymmenge in der Patientenprobe zur Herstellung eines TK-Patientenwerts und des Vergleichens des TK-Patientenwerts mit dem normalen Wert und falls er den normalen Bereich durch eine signifikante Menge überschreitet, des Vorhersagens, dass der Tumor voraussichtlich wieder auftritt und falls er den normalen Bereich nicht signifikant überschreitet, des Vorhersagens dass ein Rückfall unwahrscheinlich ist, umfassen.
Der Schritt des Errichtens eines normalen Bereichs kann auf mehrere Arten durchgeführt werden. In einer Ausführungsform können eine oder mehrere Proben des eigenen normalen Gewebes des Patienten zum Vergleich verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein normaler Bereich von einer Untersuchung des normalen Gewebes in gesunden (nicht krankhaften) Personen oder von Personen mit bekannter vorübergehender Besserung errichtet werden.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können auch in verbesserten Verfahren und Zusammensetzungen für das Stellen einer Diagnose und für das Einstufen von soliden und leukämischen und lymphoiden Tumoren und für die Überwachung der Behandlungswirksamkeit und für den Nachweis eines Wiederauftretens solcher Tumore von Nutzen sein. Solche Verwendungen der monoklonalen Antikörper der Erfindung zur Bestimmung, ob die Krankheit in einem Patienten, der gegen Leukämie oder Lymphkrebs behandelt worden ist, können die Schritte des Nehmens einer Reihe von Serumproben eines Krebspatienten in regelmäßigen Abständen, des Messens der TK-Menge in den Proben, des Vergleichens der TK-Menge unter den Proben und des Bestimmens, dass die Krankheit Wiederauftritt, falls die TK-Menge in den späteren Proben die Menge der früheren Proben um eine signifikante Höhe überschreitet, umfassen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Diagamm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen die Elutionszeit von einer DEAE-Zellulosesäule eines TK1-Rohextrakts, das von Raji-Zellen erfindungsgemäß hergestellt wurde, darstellt;
2 ist ein Diagamm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen die Elutionszeit eines TK1-Rohpräparats von einer Mono Q Säule darstellt, das wie nach der Beschreibung in Beispiel N durchlief;
3 ist ein Diagamm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen die Elutionszeit eines teilweise gereinigten TK1-Präparats von einer Mono Q Säule darstellt, das näherungsweise den Fraktionen 201–204 von 2 entspricht, die einem zweiten Durchlauf auf einer Mono Q Säule, so wie in Beispiel N beschrieben ist, unterzogen wurden;
4 ist ein Diagramm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen die Elutionszeit eines weiteren gereinigten TK1-Präparats von einer Mono Q Säule darstellt, das näherungsweise den Fraktionen 308, 310 von 3 entspricht und die einem dritten Durchlauf auf einer Mono Q Säule, so wie in Beispiel N beschrieben ist, unterzogen wurden;
5 ist ein Diagamm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen die Elutionszeit eines TK-Rohextrakts von einer Mono Q Säule darstellt, das von HeLa-Zellen hergestellt wurde und wie nach der Beschreibung in Beispiel IX durchlief
6 ist ein Diagramm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen die Elutionszeit eines teilweise gereinigten TK2-Präparats von einer Mono Q Säule darstellt, das näherungsweise den Fraktionen 501–504 von 5 entspricht, die einem zweiten Durchlauf auf einer Mono Q Säule, so wie sie in Beispiel IX beschrieben ist, unterzogen wurden;
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
In der Entwicklung eines gegen TK1 spezifischen Antikörpers und hauptsächlich für einen anti-aktiven TK1-Antikörper traf man auf mehrere Schwierigkeiten. Die aktive TK1-Form ist ziemlich labil, so dass es schwierig ist, sie in ausreichender Reinheit und Menge zur Verwendung als ein Antigen herzustellen. Aufgrund deren Labilität kann die aktive TK1- Multimerform in Monomere oder inaktive Formen nach der Injektion in die Maus und bevor B-Zellen gebildet werden, die Antikörper herstellen, die gegen die aktive TK1 oder TK1 mit hohem Molekulargewicht spezifisch sind, abgebaut werden, so dass die Wahrscheinlichkeit, ein solche Antikörper herstellendes Hybridom zu erhalten, stark verringert ist. Weiterhin weisen Mäuse ein TK1-Enzym auf, so dass es schwierig ist, eine Antikörperbildungsreaktion auf das TK1-Protein hervorzurufen.
Als ein Teil der Erfindung wurde entdeckt, dass Raji-Zellen anscheinend nur ein einziges TK-Isozym erzeugen, von dem man glaubt, dass es das TK-Isozym ist. Raji-Zellen ist eine immortalisierte menschliche Lymphomzelllinie, die von ATCC als #CCL-86 Zellinie erhältlich ist. Die Entdeckung dieser reinen Antigenherstellung war wichtig für die Überwindung der Hindernisse, die frühere Versuche zur Herstellung von Anti-TK1-Antikörpern behinderten.
BEISPIEL I
Assay von Raji-Zellen für die TK1- und TK2-Aktivität. Von Raji-Zellen wurde ein Rohzellextrakt folgendermaßen hergestellt. Es wurden näherungsweise 10¹¹ bis 10¹² exponentiell wachsende Raji-Zellen durch Zentrifugieren aus dem Wachstumsmedium geerntet. Die pelletisierten Zellen wurden von der überstehenden Flüssigkeit getrennt und in 1–2 ml eines Extraktionspuffer, der 0,02 M Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 0,05 MgCl₂ und 0,2 mM KCl enthielt, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde drei Gefrier-Tau-Zyklen in flüssigem Stickstoff und in einem Wasserbad mit 37°C unterzogen. Dann wurde die zerrissene Zellsuspension bei 30000 × g während 30 Minuten zum Pelletisieren der Zelltrümmer zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit, die einschließlich TK und anderen löslichen Enzymen- ungefähr 50 mg/ml Protein enthielt, wurde von dem Pellet dekantiert und bei –20 °C gefroren gelagert.
Zur Durchführung der TK-Assays wurde 0,2 Milliliter (abgekürzt ml) des Rohextrakts mit einer gleichen Menge (0,2 ml) einer Assaymischung gemischt, die 0,02 M Tris-HCL (pH-Wert 7,8), 2 × 10^–6 M [³H]-Thymidin (85 Curie pro Millimol), 0,002 M MgCl₂, 0,2 M KCl, 0,1 M NH4Cl, 0,005 M Mercaptoethanol und 0,004 M ATP (Adenosintriphosphat) enthielt.
Die Assayreaktionen wurden bei 37°C in einem Wasserbad inkubiert. Nach Inkubationszeitdauern von 30 Minuten und 60 Minuten wurden Proben mit 0,025 ml entnommen und auf Whatman DE-81 Scheiben getüpfelt. Man ließ die Filterscheiben trocknen und wusch sie 3 mal während jeweils 5 Minuten mit 0,01 M Formiat. Dann wurden die Scheiben während 5 Minuten mit destilliertem Wasser gespült, anschließend mit Methanol gespült und in Szintillationsampullen übertragen, die 4 ml eines Szintillationszählfluids zur Messung der ³H-Radioaktivität enthielten. Auf dieselbe Weise wurde ein genau gleicher zweiter Assay durchgeführt, jedoch unter Substitution von ATP durch CTP (Cytosintriphosphat).
Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass das Rohextrakt der Raji-Zellen 7000–8000 cpm von CTP in 60 Minuten inkorporierte, im Vergleich zu ungefähr 259000 cpm, die bei der Verwendung von ATP als Vorläufer inkorporiert wurden. Man meinte, dass diese Ergebnisse darauf hinwiesen, dass es in Raji-Zellen keine nachweisbare Höhe der TK2-Aktivität gab. Die spezifische Aktivität des Raji-Extrakts betrug ungefähr 559 cpm/mg Protein/min.
BEISPIEL II
Teilweise Reinigung von TK1. Das TK1-Enzym wurde teilweise von dem Rohextrakt der Raji-Zellen aus Beispiel I durch DEAE-Zellulose-Anionenaustauscherchromatographie gereinigt. Damit die höchsten Ausbeuten an TK-Protein erhalten werden, ist es wünschenswert, dass sich die Zellen bei der Ernte in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Der Proteingehalt des Rohextrakts wurde unter Verwendung des gut bekannten Bradford Assays bestimmt. Insgesamt wurden ungefähr 1,0–2,0 Gramm Protein aus dem Rohextrakt auf eine DEAE-Zellulosesäule gegeben und mit 10 Hohlraumvolumen von 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0) unter Verwendung des gravimetrischen Durchflusses gewaschen. Die Säule wurde mit 0,5 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0) eluiert und Fraktionen mit 1,0 ml wurden gesammelt.
1 stellt die bei 280 nm gemessene Extinktion als Funktion der Elutionszeit dar. Das Auffangen der Ein-Milliliter Fraktionen 102, 103, 104 ist angezeigt. Von den gesammelten Fraktionen wurden Teile auf die TK1-Aktivität hin allgemein wie in Beispiel I beschrieben ist, untersucht. Fraktion 104 erstreckt sich näherungsweise über einen ersten Peak 110 in dem Chromatograph, von dem festgestellt wurde, dass er die meiste von der aus der Säule eluierten TK-Aktivität enthielt. Durch Zusammenfassen und Konzentrieren der Fraktion 104 von ungefähr einhundert Durchläufen, die wie in Beispiel II durchgeführt wurden, wurden näherungsweise 40 ml Eluierungsmittel, das ungefähr 1,6 mg/ml TK1-Protein enthielt rückgewonnen. Die ungefähre spezifische Aktivität des zusammengefassten DEAE-Zellulosepräparats betrug 17430 cpm pro mg Protein pro Minute.
Die zusammengefassten DEAE-Zellulosefraktionen wurden unter Verwendung eines Amicon Proteinkonzentrationsapparats eingeengt und eine Probe wurde unter nicht-denaturierenden Bedingungen auf einem 10% Polyacrylamidtrennungsgel mit einer 4,0% Polyacrylamidgelschicht elektrophoresiert. In dem Gel waren näherungsweise 7 Banden in einem Molekulargewichts (MW)-Bereich von ungefähr 24000 bis ungefähr 180000 Dalton sichtbar. Diese Banden wurden ausgeschnitten, das Protein aus dem Gel euiert und auf die TK1-Aktivität hin auf eine Weise untersucht, die ähnlich zu derjenigen ist, die in Beispiel I beschriebenen ist. Nur eine Bande von ungefähr 100000 Dalton enthielt eine signifikante TK1-Aktivität. In keiner der anderen Banden gab es eine signifikante TK1-Aktivität. Die Bande mit einem MW von 100000 umfaßte ein halbreines Präparat von aktiver TK1 und wurde als das Antigen zur Herstellung der Anti-TK1 monoklonalen Antikörper verwendet. Von dem zusammengefassten DEAE-Zellulosepräparat wurden ungefähr 50 μg (Mikrogramm) dieses halbreinen TK1 rückgewonnen.
Beispiel III
Reinigung von TK1 durch ROTIFER. Alternativ wurde TK1 durch isoelektisches Fokussieren des Rohextrakts unter Verwendung einer ROTIFER-Vorrichtung, die von Bio-Rad bezogen wurde, teilweise gereinigt. Es wurde das Verfahren verwendet, das in dem ROTIFER-Handbuch von Bio-Rad (1990) erläutert ist. In den isoelektrischen Gelen wurden sechs bis sieben Proteinabanden beobachtet, von denen eine ein Molekulargewicht von ungefähr 100000 Dalton aufwies und bei der Untersuchung, wie sie in den vorangehenden Abschnitten beschrieben ist, etwas TK1-Aktivität zeigte. Die Rückgewinnung der Aktivität war ziemlich schwach im Vergleich zu den Verfahren der Beispiele II und IV.
Beispiel IV
Reinigung durch FPLC. Ein drittes und derzeit bevorzugtes Verfahren der TK1-Reinigung wendet die FPLC (Feine Protein-Flüssigkeitschromatographie) an mit drei aufeinanderfolgenden Reinigungen auf einer Mono Q 5/5 Anionenaustauschersäule unter Verwendung verschiedener Elutionsgradienten für jeden Durchlauf. Die Mono Q 5/5 ist eine von Pharmacia kommerziell erhältliche Ionenaustauscherpackung, die im wesentlichen eine monodisperse Kügelchengröße und starke Anionenaustauschereigenschaften, aufgrund gebundener quartärer Amingruppen aufweist, die über den Bereich von pH-Wert 2 bis pH-Wert 12 geladen bleiben. Die Vorrichtung für das Verfahren kann ebenfalls von Pharmacia bezogen werden. Die Säule wurde mit 0,1 ml des halbreinen Präparats aus dem Verfahren von Beispiel II, das ungefähr 1 mg Protein enthielt, beladen und mit 10 Volumen des Puffers A (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) ausgewaschen. Das Hohlraumvolumen dieser Säule betrug 1,0 ml. Ein programmierter Gradient wurde angelegt, um die Konzentration von Puffer B (1,0 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) allmählich von 0–100%, während eines Durchlaufs von 20 Minuten mit einer konstanten Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/min, zu erhöhen.
Das Protein wurde, sowie es aus der Säule eluierte, durch die Extinktion bei 280 nm nachgewiesen (2). Die Fraktionen, die die Extinktionspeaks bei 280 nm enthielten, wurden gesammelt und auf die TK1-Aktivität untersucht, so wie hierin vorstehend beschrieben ist. Es wurde festgestellt, dass die TK1-Aktivität vor allem in Peak 200 war (der erste von der Säule eluierte Peak), wobei bei dem Punkt der Gradient ungefähr 15–20% Puffer B enthielt.
Das Protein aus dem Peak 200 wurde durch eine nicht-denaturierende PAGE, wie vorher zur Bestimmung der Reinheit, analysiert. Es waren 5 Proteinbanden vorhanden. Diese Banden wurden ausgeschnitten und von jeder wurde das Protein auf die TK1-Aktivität hin untersucht. Eine nachweisbare TK1-Aktivität wurde in der Bande mit hohem Molekulargewicht (100000 MW), jedoch nicht in den anderen Banden festgestellt.
Für einen zweiten Reinigungsschritt wurden die TK1-Aktivität-positiven Fraktionen von mehreren Durchläufen gesammelt, zusammengefasst und eingeengt. Diese teilweise gereinigte, zusammengefasste Probe durchlief dann wiederum die Mono Q Säule mit einem niedrigeren Gradienten. Wie vorher wurde von der zusammengefassten Probe eine Portion mit einzehntel ml, die ungefähr 1 mg Protein enthielt auf die Mono Q Säule gegeben. Für diesen zweiten Durchlauf startete der Gradient bei 5% Puffer B und lief bis 40% Puffer B über eine Zeit von 35 Minuten bei 1,0 ml/min.
3 stellt ein Chromatogramm der Extinktion gegen das Elutionsvolumen für den zweiten nachfolgenden Mono Q-Durchlauf dar. Es wurden wiederum Fraktionen mit 1,0 ml Elutionsmittel gesammelt. Ein Hauptpeak 300 eluierte von der Säule bei ungefähr 15% Puffer B und zwei kleinere Peaks 302, 304 eluierten bei ungefähr 18% beziehungsweise 20 % Puffer B. Die Peaks wurden auf TK1-Aktivität untersucht und von der Fraktion 310 von dem Hauptpeak 300 wurde festgestellt, dass sie TK1-Isozymaktivität enthält.
Das Protein von dem Peak 300 (Fraktionen 308, 310) wurde ebenfalls durch SDS-PAGE analysiert und es wurde festgestellt, dass es 3 Proteine mit Molekulargewichten von ungefähr 100000, 75000 beziehungsweise 24000 enthielt. Bei dem Assay für die TK1-Aktivität des Proteins von jeder der Banden zeigte nur das Protein mit 100000 Dalton eine signifikante TK1-Aktivität.
Ein dritter aufeinanderfolgender Mono Q Durchlauf wurde mit Protein durchgeführt, das von den Fraktionen 308, 310 die den Peak 300 enthielten, ausgefällt und zusammengefasst wurde. Die Durchlaufbedingungen wurden weiter verändert, indem die Durchflussgeschwindigkeit verlangsamt und der Gradient weiter erniedrigt wurde. Ein Gradient von 5% Puffer B bis 30 % Puffer B lief mit 0,5 ml/min während 50 Minuten durch. Für diesen Durchlauf wurden Fraktionen mit 0,5 ml gesammelt. Es gab drei Peaks 400, 402, 404, die nahe bei 15% von Puffer B eluierten. Von jedem der Peaks 400, 402, 404 wurde das Protein auf TK1-Aktivität wie vorher untersucht. Der erste eluierte Peak 400 enthielt TK1-Aktivität und bei der Analyse durch nicht-denaturierende PAGE wurde festgestellt, dass er eine einzige Bande bei einem Molekulargewicht von ungefähr 100000 enthielt. Dieses Präparat wird hierin als „gereinigtes" TK1-Isozym bezeichnet. In Peak 400 wurden ungefähr 5 Nanogramm des Proteins mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 2412800 cpm/mg Protein/mg rückgewonnen.
Das Protein von Peak 400 wurde von mehreren Säulendurchläufen zusammengefasst und durch Elektrophorese unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Auf dem nicht-reduzierenden Gel wurde nur eine Bande bei 100000 MW beobachtet, während auf dem reduzierenden Gel eine schwache Bande bei 100000 MW und eine dunklere Bande bei 24000 MW beobachtet wurden. Aus diesem Ergebnis scheint es, dass die aktive TK1-Form ein Multimer mit Untereinheiten mit niedrigeren Molekulargewichten sein kann. Derzeit scheint es ebenfalls, dass die Untereinheiten von identischen Molekulargewichten sind.
Derzeit ist das Verfahren von Beispiel IV unter Verwendung der FPLC mit Mono Q Säule das bevorzugte Verfahren zur Isolierung von reiner TK1. In Beispiel N war das Ausgangsmaterial das Rohextrakt von Beispiel I. Alternativ kann jedoch die DEAE-Zellulosepräparation von Beispiel II als Ausgangsmaterial verwendet werden. Jedoch kann zur Herstellung von halbreiner TK1 für die Antigeninjektion in Mäuse das Verfahren von Beispiel II verwendet werden oder es ist auch das Produkt geeignet, das durch den zweiten Durchlauf auf der Mono Q Säule, wie in Beispiel N, erhalten wird.
BEISPIEL V
Herstellung von monoklonalen an TK1 bindenden Antikörpern. Hybridomzelllinien, die Antikörper zu TK1 erzeugen, wurden durch Verfahren hergestellt, die aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind, jedoch bestimmte Modifikationen aufweisen.
Die Immunisierungstechnik ist von derjenigen, die in der Literatur gefunden wird, verschieden. Halbreine TK1 wurde so wie in Beispiel II hergestellt. Eine Dosis von 100 μg halbreiner TK1, die in 50 μl PBS + 50 μl vollständigem freundsches Adjuvans suspendiert war, wurde intraperitoneal (I. P.) jeder Maus aus einer Gruppe weiblicher 5–6 Wochen alter BALB/c Mäusen gegeben. Zwei Wochen später wurde eine zweite Immunisierung gegeben, die identisch mit der ersten war.
Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung mit halbreiner TK1 wurde eine Injektion innerhalb der Milz gegeben, die 10 μg der reinen aktiven TK1 (hergestellt wie in Beispiel N), suspendiert in 100 μl PBS, enthielt. Die Mäuse wurden mit Natriumpentabarbitol (65 mg/ml), das durch Zugabe von 6,7 ml bis 93,3 ml PBS verdünnt war, betäubt. Jeder Maus wurden 10 μg/Gramm Körpergewicht intraperitoneal gegeben. Ein chirurgischer Eingriff wurde unter Verwendung eines Skalpells und einer Pinzette durchgeführt und die Milz wurde sanft zur Verabreichung des Antigens aufgerauht. Mehrere Berieche der Milz wurde injiziert, um eine einheitliche Verteilung des Antigens sicherzustellen. Die Wunde wurde mit Metallnähten geschlossen und die Mäuse wurden unter eine Wärmelampe während 1–2 Stunden gesetzt.
Zweiundsiebzig Stunden nach der Injektion innerhalb der Milz wurden die Mäuse unter Verwendung von Ether geopfert und die Milz wurde entfernt. Bevor die Mäuse getötet wurden, wurde Blut entfernt das das Serum getestet, um sicherzustellen, dass die Mäuse eine Immunreaktion auf das TK1-Protein aufbauten. Die B-Zellen wurden aus der Milz zur Verschmelzung mit einer unsterblichen Myelomazelllinie isoliert.
Die für den Verschmelzungspartner verwendete Zelllinie war eine selbst-verschmolzene Sp2/ Linie, die als FO bezeichnet war, die von ATCC bezogen wurde. Es ist ein Derivat von P3-X63-Ag8. Diese Linie ist eine unsterbliche Myeloma-Mäusezelllinie, die schnell wächst und ein Nicht-Sekretor ist (schwer- oder leichtkettige Immunglobuline). Die Verschmelzung von FO- und den aktivierten Milzzellen wurden so durchgeführt, wie allgemein aus dem Stand der Technik bekannt ist. Eine Milz, die ungefähr 1 × 10⁸ Zellen enthielt, wurde pro Verschmelzung verwendet. Die erfolgreichsten Verschmelzungen ergaben sich dann, wenn das Verhältnis von B-Zellen zu FO-Zellen ungefähr 10 : 1 betrug. Nach der Beendigung der Verschmelzung wurde die Verschmelzungszellsuspension in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen geimpft, die einen Tag vorher mit 3000 bis 6000 Mäusemakrophagen pro Vertiefung als Futterzellen geimpft worden waren.
Das HAT Selektionsmedium wurde verwendet, damit nur Verschmelzungsprodukte ausgewählt wurden. Die Vertiefungen wurden für das Wachstum markiert und allmählich dem HAT entwöhnt und in normale Medien gebracht. Zu dieser Zeit waren die einzigen überlebenden Zellen Hybridomzellen, die durch Verschmelzung von B-Zellen und FO-Zellen erhalten wurden. Aus jeder Verschmelzung resultierten insgesamt ungefähr 500 Kolonien, die die Verschmelzungsprodukte darstellten.
BEISPIEL VI
Vorläufiges Screening der Hybridomkolonien von der Verschmelzung. Aus einer Verschmelzung wurden 500 Kolonien einem vorläufigen Screening durch ELISA gegenüber teilweise gereinigter TK1 unterzogen, die wie in Beispiel II hergestellt wurde. Die überstehenden Flüssigkeiten von den Hybridomkulturen wurden anfänglich mit halbreiner TK1 gescreent, die durch Durchlaufen des Rohextrakts von Raji-Zellen auf DEAE-Zellulose zur teilweisen Reinigung der TK1 hergestellt wurde. Somit weist dieser vorläufige Screen Antikörper gegen multiple TK1-Formen nach, einschließlich monomeren, multimeren einschließlich tetrameren, aktiven und inaktiven Formen, usw. nach.
Mikrotiterplatten wurden mit 1,0 μg (Mikrogramm) pro Vertiefung der ausgewählten TK-Proteinpräparate, die in 50 μl PBS suspendiert waren, beschichtet und man ließ sie über Nacht trocknen. Dann wurden die Platten während 30 Minuten pro Vertiefung mit 200 μl PBS-Tween 20-EDTA-1% Milchfett behandelt, um nicht spezifisches Binden zu blockieren. Die Platten wurden 3 mal mit 200 μl PBS-Tween 20-EDTA (PBST2E) gewaschen. Tween 20 ist ein anionisches Detergens, das von Bio-Rad Laboratories, Richmon, CA kommerziell erhältlich ist und zur Verringerung der nicht-spezifischen Antikörper-Antigenbindung verwendbar ist, während es die Bindung primärer Antikörper an Antigene oder von Antigenen an Nitrozellulose nicht zerbricht.
Das Wachstumsmedium auf den Hybridomzellkulturen wurde zur Sättigung der Medien mit Antikörpern drei Tage lang nicht ausgetauscht, bevor die überstehenden Flüssigkeiten der Hybridomkulturen gesammelt wurden. Für jedes Hybridom wurden 80 μl Überstand pro Vertiefung zugegeben, um die Vertiefungen zu verdoppeln. Dann wurden die Mikrotiterplatten bei 37°C während 1–1/2 Stunden inkubiert. Die überstehenden Lösungen wurden dekantiert und die Vertiefungen 6 mal mit PBST2E gewaschen.
Als nächstes wurde mit Peroxidase (erhältlich von Bio-Rad) konjugiertes Ziegen-Anti-Mäuse-IgG (schwere und leichte Ketten-spezifisch), in PBST2E 1 : 3000 verdünnt zugegeben. Zu jeder Vertiefung wurde einzehntel ml zugegeben und die Platten wie vorstehend inkubiert. Die Vertiefungen wurden wiederum in PBST2E gewaschen und 200 μl Substrat, Tetramethylbenzidin wurde zugegeben und während 1 Stunde wurde inkubiert. Die Substratreaktion wurde durch Zugabe von 50 μl 2 M Schwefelsäure zu jeder Vertiefung beendet, wodurch eine Farbverschiebung von blau nach gelb verursacht wurde. Die Platten wurden für die O. D. Messung bei 450 nm auf einem Plattenleser gescannt. O. D. Messdaten, die mindestens das zweifache des O. D. Hintergrunds betrugen wurden als positiv betrachtet. Von ungefähr 25000 aus fünfzig Verschmelzungen erhaltenen Klonen wurden fünfunddreißig in einem vorläufigen Screening für positiv getestet. Die positiven Klone wurden unter Verwendung eines Kits von Hyclone, Logan, UT (Kat. # EK-5051) isotypisiert und von den positiven Kolonien wurde festgestellt, dass sie Antikörper der IgG1-, IgG2a-, IgG3- und IgM-Klassen produzieren.
BEISPIEL VII
Die 35 Klone, die in den anfänglichen Screenings für positiv getestet wurden, wurden gründlicheren Screenings unterzogen. Eine Platte wurde mit fünf Paaren replizierter Vertiefungen folgendermaßen beschichtet: die Vertiefungen A, B wurden mit einem TK1-Rohextrakt von Raji-Zellen beschichtet; die Vertiefungen C, D wurden mit halbgereinigter, von der DEAE-Zellulosesäule hergestellter TK1 beschichtet; die Vertiefungen E, F wurden mit gereinigter TK1 des Peaks 400 beschichtet, wie sie in Beispiel IV durch FPLC hergestellt wurde (siehe 4); die Vertiefungen G, H wurden mit dem TK1-Protein aus den Fraktionen 308, 310 des zweiten FPLC-Durchlaufs beschichtet (siehe 3); und die Vertiefungen J, K wurden mit einem E. co1i-Zeltextrakt beschichtet, das ein TK1-Gen in einem PET-Vektor exprimierte. Für die gereinigten Proben wurde pro Vertiefung 1,0 μg Protein verwendet.
Der ELISA wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie für das vorläufige Screening beschrieben wurde. Von den 35 getesteten Klonen stellte sich heraus, dass einer davon nur an die aktive TK1-Form bindet. Die Extinktionsmeßdaten (EXT) wurden bei 405 nm für 120 Vertiefungen auf einer Platte erzeugt, auf der zehn Klone gescreent wurden, sie sind in TABELLE I gezeigt. Die Klone, die zumeist durch das vorläufige Screening auf hochgradig positiv getestet wurden, wurden absichtlich auf dieser Platte gruppiert. Die Hintergrund EXT wurde von vier Vertiefungen gemittelt und es wurde festgestellt, dass sie ungefähr 0,058 betrug (Vertiefungen J11, J12 und K11, K12).
Es ist offensichtlich, dass eine positive Bindung (Extinktion ist signifikant größer, als das Hintergrundniveau) in allen Vertiefungen der Spalten 2 und 5 beobachtet wurde; in allen Vertiefungen, außer in den Zeilen C, D von Spalte 1; in den Zeilen J, K der Spalten 3, 4 und 7; und in den Zeilen A, B der Spalten 4 und 7. Das heißt, dass die Klone in den Spalten 1–5 und 7 alle für die Bindung an TK1 positiv getestet wurden. Von diesen wurden die Klone mit den Nummern 2 und 5 für die Bindung an alle der TK1-Präparate positiv getestet, während das Klon Nr. 1 an alle der TK1-Präparate band mit Ausnahme des halbreinen DEAF-Zellulose-Präparats. Die Klone Nr. 4 und 7 banden an das Raji-Zellen TK1-Rohextrakt und an die durch genetisches Design in E. co1i hergestellte TK1. Klon Nr. 3 band nur an die von E. coli hergestellt TK1. Die übrigen 25 Klone wurden für Antikörper gegen TK1 negativ getestet.
Tabelle I Screening der Hybridomklone auf Anti-TK1-Antikörper
Eine weitere Charakterisierung wurde durch Western-Blotting durchgeführt. Die Western-Blots wurde durch Verfahren hergestellt, die zu denjenigen, die in CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, Verlag Wiley-Interscience, New York (1991) beschrieben sind, ähnlich sind. Antikörper wurden aus dem Überstand von jedem Hybridom geerntet und an eine von einem nicht-denaturierenden Gel der TK-Proteine geblottete Nitrozellulosemembran hybridisiert. Dann wurde Ziegen-Anti-Mäuse IgG zum Nachweis der gebundenen Antikörper verwendet.
In einem Blot, der durch Elektrophorese einer Raji-Extraktprobe erhalten wurde, wurde beobachtet, dass der Klon #1-Antikörper nur an die 100000 Dalton Bande band, von der bekannt war, dass sie eine Aktivität aufweist. Der Klon 5-Antikörper band ebenfalls an diese Bande, jedoch weniger stark. Der Klon 2-Antikörper band an vier Banden mit den Molekulargewichten von ungefähr 24000, 48000, 72000 und 100000. Von diesen wird angenommen, dass sie die Monomer-, Dimer-, Trimer- und Multimerformen von TK1 darstellen. Somit bindet der Klon 2-Antikörper an alle der gewöhnlich beobachteten TK1-Formen, oder an die „gesamte" TK1.
Ein weiterer Western Blot wurde von einem Gel hergestellt, in dem die gereinigte Multimer-TK1 aus dem dritten Durchlauf des FPLC-Verfahrens (Peak 400 in 4). Dieses gereinigte Multimer wandert als eine homogene Spezies mit einem Molekulargewicht von 100000, jedoch weist sie eine beträchtlich geringere Aktivität als erwartet auf. Folglich ist dieses Präparat eine Multimer- oder Tetramerform, jedoch kann sie sich nicht in der aktiven Konfiguration befinden. In diesem Blot bindet der Klon 5-Antikörper stark an die eine Bande bei 100000, während der Klon 1-Antikörper weniger stark and die Bande bindet – in dem Blot des Raji-Zellextrakts wurde das gegenteilige Ergebnis erhalten.
Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass Klon 1 und Klon 5 an verschiedene Epitope binden. Der Klon 1-Antikörper bindet selektiv an die aktive TK1-Multimerform und wird nachfolgend hierin als ein „Anti-AcTK1"-Antikörper bezeichnet. Der Klon 5-Antikörper bindet an die Multimerform, jedoch offensichtlich vorzugsweise an eine inaktive Multimerform.
Die Klone Nr. 1–5 sind alle Hybridome vom IgM-Typ. Der Klon 7 ist ein Hybridom vom IgG-Typ.
BEISPIEL VIII
Hemmung der TK1-Aktivität durch ausgewählte monoklonale Antikörper. Zum Testen der Hemmung der TK1-Aktivität wurde der TK-Assay unter Verwendung von ATP durchgeführt, wobei das vorstehend beschriebene Rohextrakt der Raji-Zellen mit Rücksicht auf die TK1-Isolierung verwendet wurde.
Es wurden gleiche Assayreaktionen hergestellt. Zu einigen Reaktionen wurde ein 20 μl Aliquot der überstehenden Flüssigkeit aus einer der Hybridomkulturen zugegeben, wobei sie ungefähr zwischen 0,02 bis 0,1 μg Antikörper enthielt.
Die Inkorporierung der Radioaktivität wurde mit einer Kontrolle (kein Antikörper) und einer Testreaktion verglichen, zu der der Hybridomüberstand aus ausgewählten Hybridomkulturen zugegeben wurde. Die für die ausgewählten Hybridome erhaltenen Daten sind in Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle II TK1-Hemmung durch Anti-TKl-Antikörper
In den Reaktionsröhrchen, zu denen Überstandproben von den Klonen Nr. 1–5 und 7 zugegeben wurden, betrug die Menge der inkorporierten Radioaktivität nicht mehr als 20% der Radioaktivitätsmenge in den Kontrollen. Im Gegensatz dazu hemmte in dem Reaktionsröhren, zu dem der Überstand von Klon Nr. 19 zugegeben wurde, eines der Verschmelzungsprodukte, das durch ELISA negativ auf die TK1-Bindung getestet wurde, nicht die Aktivität von TK1 in dem Raji-Zeltextrakt. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die Fähigkeit zur TK1-Hemmung in diesem Assay mit den höchsten O. D. Messdaten positiv korrelierte, wie durch das ELISA-Verfahren festgestellt wurde.
Die Antikörper von den Klonen Nr. 3, 4, 6 und 7 waren in der Hemmung der TK1-Aktivität in dem Raji-Extraktassay weniger wirkungsvoll (nicht gezeigt). Sie wurden daher keinem weiteren Screening unterzogen.
Die Klone 1,2 und 5 wurden wiederum bis zu einer Grenze verdünnt und die Kolonien, die von diesem Reklonierungsverfahren stammten, wurden nochmals getestet. Das Reklonierungsverfahren wurde verwendet, um dafür zu sorgen, dass eine Hybridomzelllinie von einer einzigen Verschmelzungszelle abstammt, und somit in dem Isotyp und der Spezifität einheitliche Antikörper erzeugt, zum Beispiel monoklonale Antikörper. Die Klone Nr. 1,2 und 5 wurden gemäß dem Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland U.S.A am 11. August, 1993 hinterlegt und ihnen wurden die ATCC Nummern HB 11432, HB 11433 beziehungsweise HB 11434 zuwiesen.
Zusätzliches Screening stellte fest, dass keiner der Klone Nr. 1, 2 oder 5 Antikörper produzierte, die an TK2 banden (das TK2-Antigen wurde so, wie im nachstehenden Beispiel IX beschrieben ist, hergestellt). In einem nachfolgenden Satz von Hybridomklonen, die nach dem Verfahren von Beispiel V hergestellt worden waren, offenbarte das Screening gegen das TK1-Antigen, wie in Beispiel VII, und gegen das TK2-Antigen, wie in Beispiel IX, dass mindestens zwei Klone Antikörper erzeugten, die sowohl auf die TK1- als auch auf die TK2-Bindung positiv waren. Von den letzteren Klonen wird angenommen, dass sie Antikörper erzeugen, die mit Spezifität an natürlich vorkommende Proteine binden werden, die eine Sequenzhomologie von 90% mit einer menschlichen Thymidinkinase aufweisen (einschließlich entweder TK1 oder TK2).
BEISPIEL IX
Isolierung von TK2. Die Isolierung von TK2 wurde durch FPLC mit einer Mono Q-Säule durchgeführt. Das Ausgangsmaterial war ein dem Raji-Extrakt ähnliches Rohzellextrakt, mit der Ausnahme, dass es von HeLa-Zellen hergestellt wurde. HeLa ist eine immortalisierte menschliche zervikale Karzinomzelllinie, die von ATCC unter #CCl-2 erhältlich ist, und von der angenommen wird, dass sie hohe TK2-Gehalte und sehr geringe TK1-Gehalte aufweist. Bei der Analyse durch nicht-denaturierende PAGE, scheint TK2 ebenfalls eine Monomerform und eine oder mehrere Multimerformen aufzuweisen.
Als ein vorbereitender Schritt lässt man ein Rohextrakt der HeLa-Zellen auf DEAE-Zellulose laufen. Unter Verwendung des CTP-Assays wurde festgestellt, dass die TK2-Aktivität sich weitestgehend in den Peaks 18–20 befand, was ziemlich von dem Bereich getrennt liegt, in dem TK1 eluiert.
Eine weitere Reinigung wurde durch FPLC auf einer Mono Q Säule durchgeführt. 5 zeigt die Ergebnisse eines ersten Durchlaufs auf einer Mono Q-Säule des zusammengefassten Materials aus den Peaks 18–20. Puffer A war 0,05 molare Tris-HCl und Puffer B war 0,5 molare Tris-HCl und die Säule wurde mit einem Gradienten von 5% bis 45% Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min durchlaufen. Die TK2-Aktivität wurde in den gesammelten Fraktionen untersucht und es wurde festgestellt, dass sie größtenteils in Fraktion 7 (Peak 500) vorhanden war. Das Material von Peak 500 wurde aus mehreren Säulendurchläufen zusammengefasst, eingeengt und lief ein zweites Mal mit demselben Puffergradienten und derselben Durchflussrate durch. 6 zeigt die Ergebnisse des zweiten Durchlaufs. Es wurde festgestellt, dass die TK2-Aktivität in Fraktion 6 (Peak 600) vorhanden war. Das gesammelte Material der Fraktion 6 ist ein halbreines Präparat des aktiven TK2-Isozyms.
Gegen TK2 spezifische monoklonale Antikörper
Ein TK2-Präparat, das die Fraktion 6 aus dem zweiten Durchlauf des Mono Q-FPLC-Verfahrens in Beispiel IX umfasste, wurde als das Antigen verwendet. Das Immunisierungsverfahren, Ernten der Milzzellen und Verschmelzen mit FO-Zellen, war ähnlich zu denjenigen in den Beispielen V-VI. Das Screening wurde durch ELISA auf Vertiefungen, die mit dem halbreinen TK2-Präparat aus Beispiel IX beschichtet waren, durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Antikörper von den Klonen 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-12, 2-17 und 2-19 zu den positivsten Ergebnissen für die Bindung an die halbreine TK2 führten. In Tabelle III stellen die mit „2-1A", „2-5A", usw. bezeichneten Proben getrennte replizierte Antikörperaliquoten von den Klonen 2-1, 2-5, usw. dar. Die Klone 2-7, 2-8, 2-9, 2-10 und 2-12 ergaben schließlich Hybridomzelllinien, die akzeptable Gehalte von Anti-TK2-Antikörpern erzeugten.
Tabelle III Screening der Hybridomkone auf Anti-TK2-Antikörper
Zur Verwendung in Tests mit Patientenproben wurden die ausgewählten Antikörpererzeugenden Zelllinien passagiert und der Überstand wurde über eine Zeitdauer von 3 Monaten aseptisch gesammelt. Die Antikörper wurden durch Ausfällen der Überstände mit Ammoniumsulfat und anschließend entweder durch Gelfiltrationschromatographie oder durch DEAE-Zellulosechromatographie (Diethylaminoethylzellulose; bezogen von Whatman International, Maidstone, Kent, UK unter der Handelsbezeichnung SEPHADEX) gereinigt. Die Antikörper wurden durch Standardverfahren gereinigt und entweder mit HRP-Peroxidase oder alkalischer Phosphatase (Bio-Rad) konjugiert. Solche Verfahren sind in ANTIBODIES: A Laboratory Manual von Harlowe und Lane, 1988 beschrieben.
Für die Bestimmung der Serum-TK-Gehalte in Versuchspersonen, wurden von den Versuchspersonen frische Proben von peripheralem Venenblut gesammelt. Von jeder Probe wurden durch herkömmliche Verfahren das Serum und die mononuklearen Leukozyten voneinander getrennt und die getrennten Proben wurden bis zu Analyse gefroren gelagert. Die TK-Gehalte in Tumorgeweben können durch Herstellung eines TK-Extrakts aus Proben von frischem Tumorgewebe, ähnlich zu dem Rohextrakt der Raji-Zellen von Beispiel I, bestimmt werden. Der Proteingehalt der Probe wird vorzugsweise so bestimmt, dass die TK-Menge mit der Menge an gesamtem Protein in dem Tumor korreliert werden kann. Dann kann ein Immunfällungsassay unter Verwendung des gewünschten Anti-TK-Antikörpers an dem Extrakt durchgeführt werden.
BEISPIEL X
Der konjugierte Antikörper von Klon 1 wurde zur Immunfärbung der Tumorzellen verwendet, die histologisch an Objektträgern fixiert waren. In diesem Verfahren wurde Diaminobenzidin (DAB) als Enzymsubstrat verwendet.
BEISPIEL IX
Nachweis von aktiver TK1 in Serumproben von Krebspatienten unter Verwendung des Antik-acTKl-Antikörpers. Die Serumproben wurden von Krebspatienten erhalten. Jede Probe wurde auf TK-Aktivität durch ein Verfahren, wie dasjenige von Beispiel I, untersucht. Dieselben Proben wurden dann mit einem ELISA-Test mit dem Klon #1-Antikörper unter Verwendung verschiedener Serumverdünnungsgehalte blind quantitativ bestimmt. Es wurde festgestellt, dass eine Verdünnung von 1 : 16000 die besten Ergebnisse ergab. Die Ergebnisse der zwei Assays sind in Tabelle N gezeigt. Die Daten wurden durch Western-Blot-Analyse bestätigt.
In Tabelle N werden die Sera von den höchsten zu den niedrigsten Mengen an gebundener Anti-TK1 durch den O. D. Messwert in dem ELISA-Assay eingestuft. Aus den TK1-Aktivitätsmessungen ist ersichtlich, dass die Korrelation zwischen Antikörperbindungsdaten und dem Standard TK1-Aktivitätsassay ausgezeichnet ist. Die Daten zeigen, dass der Anti-AcTK1-Antikörper zur Bewertung des Serumgehalts der TK1-Aktivität in Versuchspersonen verwendet werden kann. Weiterhin band das Serum von einer gesunden (keine Krebs tragenden) Person viel weniger Anti-AcTK1-Antikörper als im Vergleich zu dem am niedrigsten eingestuften Serum eines Krebspatienten. Folglich ist der Anti-Ac-TK1-Antikörper nützlich zur Unterscheidung zwischen dem Serum von Krebs-tragenden Personen und dem Serum von gesunden nicht-kanzerogenen Personen.
Tabelle IV Vergleich der durch ³H-Thymidin-Inkorporation und Anti-AcTK1-Bindung gemessenen TK1-Aktivität
Es wurde weiterhin festgestellt, dass die Gehalte der TK-Aktivität und besonders der TK1-Aktivität zu einer verlässlichen Vorhersage der Tumorrückfallwahrscheinlichkeit bei Brustkrebspatienten verwendet werden können. Tabelle V fasst die Ergebnisse einer Untersuchung der TK-Aktivität in Proben von nicht-behandelten primären Tumoren zusammen, die aus 86 Patienten operativ entfernt wurden, von denen 13 später einen Krankheitsrückfall erlitten.
In dieser Untersuchung wurde ebenfalls durch Vergleich der TK-Gehalte mit dem Östrogenrezeptorstatus festgestellt, dass der TK-Gehalt genau vorhersagt, welche der Patienten in der Östrogenrezeptor-positiven Gruppe später einen Rückfall zeigten und welche der Patienten in der Östrogenrezeptor-negativen Gruppe keinen Rückfall zeigten. Von 57 Östrogenrezeptor-positiven Patienten (Patienten, deren Tumore hohe Zahlen von Östrogenrezeptoren aufwiesen) hatten 4 einen Rückfall der Krankheit. Der durchschnittliche TK-Aktivitätsgehalt, der in den Tumoren von diesen vier Patienten gemessen wurde betrug 289717 cpm/min, im Vergleich zu 161674 cpm/min für Tumore von Patienten ohne Rückfall. Ebenfalls betrug der Prozentsatz der Aktivität, die auf TK2 zurückführbar ist, ungefähr 76% in der Gruppe ohne Rückfall, gegenüber 41% in der Gruppe mit Rückfall.
Umgekehrt wiesen von 29 Östrogenrezeptor-negativen Patienten (diejenigen, deren Tumore wenige oder keine Östrogenrezeptoren aufwiesen), die 20, die keinen Rückfall aufwiesen, einen durchschnittlichen TK-Aktivitätsgehalt von 100675 cpm/min auf, wovon ungefähr 71% die TK2-Aktivität ist, im Vergleich zu 379238 cpm/min, wovon ungefähr 42% die TK2- Aktivität ist, für die Gruppe ohne Rückfall. Folglich lieferten der TK-Aktivitätsgehalt und die relativen Proportionen der TK2- zur TK1-Aktivität bessere Vorhersagen eines Rückfalls, als der Östrogenrezeptorzustatus.
TABELLE V Tumor-TK-Gehalte und -rückfall
In Bezug auf Leukämiepatienten wurde festgestellt, dass der TK1-Aktivitätsgehalt im Serum zum Nachweis eines Rückfalls verwendet werden kann, häufig bevor irgendein anderes Symptom augenscheinlich ist.
Der Anti-AcTK1-Antikörper kann somit zum Screenen des Serums und des Gewebes von Krebspatienten nützlich sein, um sowohl die Ziele als auch die Verwendung in der Diagnose und Behandlung von Tumorpatienten zu untersuchen. Der Anti-Ac-TK1-Antikörper kann ebenfalls zum Screening des Serums bei gewissen anderen Blutkrankheiten, wie zum Beispiel perniziöse Anämie nützlich sein, wobei die TK-Aktivität mit dem Krankheitszustand verbunden worden ist. Weiterhin können die Antikörper zum Testen von Patienten mit bestimmten Viruskrankheiten, einschließlich Masern, Röteln und Herpes nützlich sein, wobei festgestellt wurde, dass die Thymidinkinasegehalte während der akuten Krankheitsphase erhöht sind.
Da der Anti-AcTK1-Antikörper nur die aktive TK1-Form nachweist, kann er anstelle des radioaktiven Thymidininkorporierungssassay zur Bewertung der Aktivität verwendet werden. Die Verwendung des Antikörpers zur Bewertung der TK1-Aktivität in Tumoren und in dem Serum von Krebspazieten macht diesen Test in großem Umfang praktisch, wohingegen der Aktivitätsassay im allgemeinen schwieriger durchzuführen ist.
Der Antikörper kann ebenfalls zur gezielten Tumortherapie nützlich sein. Das heißt, dass ein Anti-Tumormittel an den Antikörper gekoppelt werden kann, der an die Tumorzellen binden wird, die große Menge an TK1 exprimieren. Auf diese Weise ist das Anti-Tumormittel auf Tumorzellen gerichtet und das Abtöten der Tumorzellen ist gegenüber dem Abtöten der normalen Zellen erhöht.
Weitere Verfahren zur Bestimmung, ob die Krankheit in einem Patienten aufgetreten ist, der auf eine Krebs- oder Blutkrankheit, einschließlich Brustkrebs, Leukämie und Lymphkrebs behandelt wird, kann die Schritte des Nehmens einer Reihe von Proben des Serums eines Krebspatienten in regelmäßigen Zeitabschnitten, des Messens der TK-Menge in den Proben, des Vergleichens der TK-Menge unter den Proben und, falls die TK-Menge in den späteren Proben die Menge in den früheren Proben in signifikanter Höhe überschreitet, des Bestimmens, dass die Krankheit Wiederauftritt, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Messungen der TK1-Aktivität in der Probe unter Verwendung eines anti-aktiven TK1 monoklonalen Antikörpers bestimmt worden.
Zusammenfassend enthält die vorliegende Erfindung zumindest die folgenden Lehren: dass nur TK1-Tetramere oder -Multimere eine signifikante Aktivität aufweisen; aus einfach zugänglichen Quellen stammen (Raji-Zellen, HeLa-Zellen) und Verfahren zur Isolierung großer Mengen von TK1, aktivem TK1 und TK2 zur Verwendung als Antigen und beim Screening zur Auswahl der gewünschten Hybridome; und Screening-Verfahren zur Identifizierung von Antikörpern die verschiedene Spezifitäten aufweisen. Es ist offensichtlich, dass mit diesen und anderen angegebenen Lehren dieser Anmeldung, ein Fachmann die beschriebenen und vorliegend beanspruchten Hybridome und Antikörper, sowie auch monoklonale Antikörper, die eine Spezifität für jede gewünschte Kategorie der Thymidinkinaseisozyme aufweisen, erhalten kann.

Claims

Gereinigte Säuger-Thymidinkinase-1 (TK1) aus Raji-Zellen, wobei die TK1 ein Molekulargewicht von ungefähr 100 kD aufweist und Enzymaktivität als eine native tetramere Spezies, nicht aber als eine monomere Untereinheit aufzeigt.
Monoklonaler Antikörper, welcher mit Spezifität an die gereinigte TK1 von Anspruch 1 bindet.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei der monoklonale Antikörper TK1-Enzymaktivität in einer biologischen Probe eines Lebewesens inhibiert.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei der monoklonale Antikörper TK1-Enzymaktivität in Serum, Gewebe und Tumorgewebe inhibiert.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei der monoklonale Antikörper spezifisch an die aktive tetramere Form einer TK1 mit 100 kD Molekulargewicht bindet und wobei der monoklonale Antikörper die Thymidinkinase-1-Aktivität inhibiert.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 5, wobei der monoklonale Antikörper durch das American Type Culture Collection Hybridom HB 11432 erzeugt wird.
Hybridom, welches den monoklonalen Antikörper von Anspruch 2 erzeugt.
American Type Culture Collection Hybridom HB 11432.
Kit, welcher zur Bestimmung des Thymidinkinase-1 (TK1)-Gehälts in einer biologischen Säugerprobe verwendbar ist, umfassend einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 und ein Reagenz, welches zum Nachweis des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper und der TK1 in der biologischen Säugerprobe verwendbar ist.
Kit, welcher zur Bestimmung des Thymidinkinase-1 (TK1)-Gehalts und des Thymidinkinase-2 (TK2)-Gehalts in einer biologischen Säugerprobe verwendbar ist, umfassend einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2, ein erstes Reagenz, welches zum Nachweis des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper und der TK1 in der biologischen Säugerprobe verwendbar ist, einen monoklonalen Antikörper, welcher mit Spezifität an eine gereinigte TK2 bindet, und ein zweites Reagenz, welches zum Nachweis des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper gegen eine gereinigte TK2 und der TK2 in der biologischen Säugerprobe verwendbar ist.
Verfahren zum Bestimmen des aktiven TK1-Gehalts in einer Tumorprobe oder einer Serumprobe, welches die Schritte umfasst: das Inkontaktbringen der Probe mit einem monoklonalen Antikörper, welcher spezifisch die TK1 von Anspruch 1 bindet, und das Bestimmen der Menge des Antikörpers, welcher an die TK1 gebunden hat.