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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet: Die Erfindung betrifft im
allgemeinen einen monoklonalen Antikörper, der zur Beurteilung der Diagnose,
Prognose und Behandlung von Krebs und bestimmten Blutkrankheiten
und zur Vorhersage eines Rückfalls
bei Krebspatienten nützlich
ist.
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Stand der Technik: Sobald Krebs nachgewiesen
ist, ist das Entwicklungsstadium der Krankheit ein wichtiger Faktor
zur Bestimmung, welche Behandlungen) verwendet werden sollen. Krebs
wird im allgemeinen von Stadium I, der frühesten und am besten zu behandelnden
Phase, bis Stadium IV eingestuft, der ein sehr fortgeschrittener,
häufig
metastatischer Tumor mit Todesprognose ist.
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Es ist ebenfalls erwünscht, das
Wachstum oder fehlendes Wachstum des Krebses während und im Anschluß an eine
Behandlung zu überwachen.
Falls Tumorrückfälle sehr
früh entdeckt
werden, können
sie in manchen Fällen
erfolgreich behandelt werden, so dass letztlich eine Heilung bewirkt
wird oder dass das Leben des Patienten signifikant verlängert wird.
Oder, falls ein Tumor nicht auf ein anspricht, können andere spezielle Arzneimittel
oder Behandlungen versucht werden.
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Nimmt man Brustkrebs als Beispiel,
so könnten
dann, wenn es möglich
wäre für diese
Patienten genau vorherzusagen, dass sie für das Zeigen eines Tumorrückfalls
anfällig
sind, geeignete Behandlungsabläufe
in Abhängigkeit
von der Aggressivität
des Tumors verabreicht werden. In den Fällen, in denen angenommen wird,
dass der Tumor sehr aggressiv ist, wird dann eine dicht darauf folgenden
Nachbehandlung mit zusätzlicher
Operation, Strahlentherapie und möglicherweise Chemotherapie
nötig.
Zeigt es sich, dass der Tumor nicht aggressiv ist, dann kann ein
milder Behandlungsablauf geeignet sein. Eine genaue Vorhersage des Brusttumorverhaltens
würde einen
besseren Umgang mit dem Tumor deutlich vereinfachen und trägt signifikant
zum Wohlergehen des Patienten bei.
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Ebenfalls würde eine frühe Entdeckung eines Rückfalls
den Arzt befähigen,
schnell Maßnahmen
zur Behandlung des Rückfalls
zu ergreifen und möglicherweise
die Überlebenswahrscheinlichkeit
des Patienten zu erhöhen.
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Für
Brustkrebs wird derzeit angenommen, dass eines der besten Mittel
zur Vorhersage der Rückfallwahrscheinlichkeit,
der Östrogenrezeptorstatus
ist. Von denjenigen Patienten, die Östrogenrezeptor-positiv sind
(hohe Zahlen von Östrogenrezeptoren
auf den Tumorzellen), wird angenommen, dass sie eine bessere Prognose
aufweisen, während
bei denjenigen, die Östrogenrezeptor-negativ
sind, geglaubt wird, dass sie eine schlechte Prognose aufweisen.
Es gibt jedoch viele Fälle,
in denen diejenigen, die Östrogenrezeptor-negativ sind,
keinen Rückfall
zeigen und diejenigen, die Östrogenrezeptor-positiv
sind, einen Rückfall
zeigen. Da der Östrogenrezeptortest
als ein Prognoseindikator nicht ausreichend zuverlässig ist,
werden Patienten häufig
sowohl mit Strahlentherapie als auch Chemotherapie ohne Rücksicht
auf den Östrogenrezeptorstatus
behandelt.
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Thymidinkinase (ATP: Thymidin-5'Phosphotransferase;
EC 2.7.1.21 im Klassifizierungssystem der International Union of
Biochemistry) ist ein Enzym, das Thymidin zu Thymidinmonophosphat
(TMP) phosphoryliert. Hier wird die allgemein verwendete Abkürzung TK
verwendet, um Thymidinkinase in einem allgemeinen Sinne zu bezeichnen,
einschließlich
verschiedener Isozyme und multimerer Formen, von denen derzeit angenommen
wird, dass sie in vivo vorkommen.
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Das Thymidinkinaseprotein wurde aus
vielen verschiedenen Quellen isoliert und auf unterschiedliche Reinheitsgrade
aufgereinigt. Es wurde von einer Vielfalt von Thymidinkinasen mit
unterschiedlichem Molekulargewicht aus menschlichen Proben, in Abhängigkeit
von der speziellen Zelle und von dem Isolations- und Analyseverfahren,
berichtet (zum Beispiel unter denaturierenden Bedingungen gegenüber nicht-denaturierenden
Bedingungen). Die Befunde deuten im allgemeinen darauf hin, dass
Thymidinkinase in mindestens einer monomeren Form mit einem MW von
24–28
KD und in einer Vielfalt multimerer Formen vorkommt.
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Es ist ebenfalls bekannt, dass es
in Menschen mindestens zwei Hauptisozyme der Thymidinkinase gibt
(ähnlich,
jedoch mit verschiedenen Formen), die hierin als TK1 und TK2 bezeichnet
werden. Diese Isozyme werden von verschiedenen Genen produziert,
werden in verschiedenen Zellkompartimenten gefunden und unterschieden
sich in ihren Gehalten und dem Zeitpunkt der Expression während des
Zellzyklus und entsprechend dem Zelldifferenzierungszustand. In
Menschen befindet sich das TK1-Gen auf dem Chromosom 17 im Band
q21–22
(Elsevier 1974), während
das TK2-Gen sich auf dem Chromosom 16 (Willecke 1977) befindet. Kürzlich wurde
ein Gen für
TK1 geklont und sequenziert (Lin 1983, Flemington 1987).
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Es gibt Berichte, dass die TK-Aktivität im Serum
oder in den Tumorgeweben von Patienten mit manchen Krebsarten, einschließlich akuter
und chronischer Leukämie,
Hodgkins und Nicht-Hodgkins Lymphomen, solider Brust-, Prostata-,
Gehirn- und Enddarmtumore, erhöht
ist. Es wurde vorgeschlagen, dass eine anhaltende Erhöhung von
Thymidinkinase im Serum ein Indikator einer bösartigen Krankheit ist. Die
Messung der Thymidinkinaseaktivität mit herkömmlichen Mitteln ist jedoch
langwierig und nicht immer reproduzierbar.
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Weiterhin ist es aus vorhergehenden
Berichten nicht immer klar, welche der Isozyme oder Formen der Thymidinkinase
in ihrer Aktivität
in Krebspatienten erhöht
ist. Das Verfahren, das im allgemeinen zur Messung des TK1-Gehalts
verwendet wird, beruht auf der Enzymaktivität durch Vergleich der Inkorporation
von radioaktivem Thymidin in parallelen Proben, die mit verschiedenen
sekundären
Substraten (Adenosintriphosphat order ATP und Cytosintriphosphat
oder CTP) untersucht werden. Sowohl TK1 als auch TK2 verwenden sehr wirksam
ATP als Substrat. Jedoch weist das TK1-Isozym mit CTP als Substrat
nur 7–15%
der Aktivität
mit ATP als Substrat auf. TK2 ist jedoch mit CTP nahezu so wirksam
wie mit ATP. Die Gehalte der gesamten TK-Aktivität werden aus dem Assay mit
ATP bestimmt, während
die Gehalte der TK2 Aktivität
aus dem Assay mit CTP bestimmt werden. Der Unterschied zwischen
dem mit CTP gemessenen und dem mit ATP gemessenen Aktivitätsgehalt
wird auf das TK1-Isozym zurückgeführt.
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Dieses Verfahren ist langwierig und
die Ergebnisse sind stark abhängig
von der genauen Durchführung
der parallelen Assays und sind manchmal schwer reproduzierbar. Da
weiterhin TK1 eine gewisse Inkorporation in das CTP-Substrat zeigt,
kann die Interpretation mehrdeutig sein. Ebenfalls scheint die aktive
Form des TK1-Proteins ziemlich instabil zu sein, so dass die Menge
der nachgewiesenen Aktivität
in Anhängigkeit von
der Handhabung der Probe variieren kann.
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Es wäre daher wünschenswert, wenn man in der
Lage wäre
die Mengen des TK-Proteins und/oder der einzelnen TK-Isozyme zu
messen. Für
solche Zwecke wäre
ein TK-Isozymspezifischer Antikörper,
besonders ein monoklonaler Antikörper,
nützlich.
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Das am 30. Dezember 1981 veröffentlichte
europäische
Patent Nr. 0 042 482 von Balis et al. offenbart ein Verfahren zum
Nachweis von bösartigen
und noch nicht bösartigen
Zellen in Menschen, die ein Antiserum verwenden, das gegen ein als „oncofötales" TK bezeichnete Isozym
der Thymidinkinase erzeugt wurde. Das zum Erhalten des Antiserums
verwendete TK-Isozym wurde aus menschlichem Plazentamaterial isoliert.
Der Balis-Antikörper
reagierte jedoch nicht mit den leukämischen Leukozyten oder mit
normalen oder Mitogen-stimulierten peripheralen Lymphozyten, obwohl
von diesen bekannt ist, dass die die TK-Gehalte erhöht haben (Balis
et al., Spalte 2, Zeilen 21–23).
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Ein weiteres am 23. Oktober 1991
veröffentlichtes
europäisches
Patent Nr. 0 255 431 von Jouan offenbart die Reinigung von „TK-F", das heißt von fötaler TK
aus menschlichem Plazentamaterial für Zwecke, die die Verwendung
des reinen TK-F zur Herstellung von Anti-TK-F-Antikörper umfassen. Sie offenbaren
jedoch nicht, wie ein solcher Antikörper tatsächlich erhalten wird.
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Dementsprechend besteht weiterhin
ein Bedarf für
Antikörper,
die zum Nachweis der gesamten Mengen an Thymidinkinaseenzymen in
Serum und Geweben brauchbar sind. Es besteht ebenfalls ein Bedarf
für eine
Liste von Antikörper,
die zur Unterscheidung von verschiedenen TK-Isozymen und aktiven
gegenüber
inaktiven TK-Formen brauchbar sind. Weiterhin besteht ein Bedarf
für verbesserte
Verfahren zur Bewertung der Behandlungseffizienz und der Wahrscheinlichkeit
eines Tumorrückfalls
bei Brustkrebspatienten und Patienten mit anderen Tumorarten.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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In einem ersten Aspekt umfaßt die Erfindung
eine gereinigte Säuger-Thymidinkinase 1 (TK1)
von Raji-Zellen, die ein Molekulargewicht von näherungsweise 100 kD aufweist
und eine enzymatische Aktivität
wie eine natürliche
tetramere Spezies jedoch nicht wie eine monomere Untereinheit zeigt.
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In einem zweiten Aspekt umfaßt die Erfindung
monoklonale Antikörper,
die mit Spezifität
an die „aktive TK1" des ersten Aspekts
der Erfindung binden (sie werden fortan "Anti-AcTK1"-Antikörper genannt).
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In einer Ausführungsform dieses Aspekts der
Erfindung zeigen die monoklonalen Antikörper eine enzymatische TK1-Aktivität in einer
einem Tier entnommenen biologischen Probe. Beispiele solcher biologischen Proben
umfassen das Serum, das Gewebe und das Tumorgewebe.
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In einer weiteren Ausführungsform
dieses Aspekts der Erfindung bindet der monoklonale Antikörper spezifisch
an die aktive tetramere Form einer TK1 mit einem Molekulargewicht
von 100 kD und hemmt die enzymatische Aktivität des gebundenen Thymidinkinase
1-Polypeptids.
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Die monoklonalen Antikörper dieses
Aspekts der Erfindung können
durch das American Type Culture Collection Hybridom HB 11432 oder
andere geeignete Hybridomzelllinien hergestellt werden. Zuverlässige Verfahren
zur Herstellung und Verwendung solcher geeigneten Hybridomzelllinien
sind dem Fachmann bekannt. Kurzum, ein Verfahren zur Herstellung
einer Hybridomzelllinie, die einen für die tetramere Thymidinkinase 1 spezifischen
Antikörper
erzeugt, umfaßt
die Schritte des Bereitstellens eines Thymidinkinasepräparats des
ersten Aspekts der Erfindung; des Injizierens eines Wirtstiers mit
dem Thymidinkinasepräparat
und des Abwartens einer Zeitdauer, die für das Anwachsen einer Immunreaktion
gegen das Antigenpräparat
ausreicht; des Entfernens von aktivierten B Lymphozyten aus dem
injizierten Tier, des Verschmelzens der aktivierten B Lymphozyten
mit Myelomazellen unter Bildung einer Vielzahl von Hybridomzellen
und des einzelnen Kultivierens der Hybridomzellen zur Herstellung
einer Vielzahl von Hybridomklonen und des Screenings der Hybridomkulturen
zur Auswahl eine Hybridomklons, der einen Antikörper absondert, der mit Spezifität an das
tetramere Thymidinkinase 1-Enzym bindet.
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Ein Screeningverfahren zur Auswahl
der monoklonalen Antikörper
mit den gewünschten
Spezifitäten verwendet
die aktive TK1 des ersten Aspekts der Erfindung, die zu einer Form
gereinigt wurde, die, bei einem Aussetzen gegenüber nicht-denaturierender Elektrophorese,
als eine homogene Spezies wandert. Das Screeningverfahren kann ebenfalls
das Screening zur Bestimmung der Fähigkeit der Antikörper zur
Hemmung der Thymidinkinase 1-Aktivität in Zellextracten und/oder
das Western-Blotting der elektrophoresierten Präparate der Thymidinkianse 1 umfassen.
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In einem dritten Aspekt umfaßt die Erfindung
einen zur Bestimmung des Thymidinkinase 1 (TK1)-Gehalts
in biologischen Säugerproben
verwendbaren Kit, umfassend:
einen monoklonalen Antikörper entsprechend
dem zweiten Aspekt der Erfindung und
ein Reagenz, das zum Nachweis
des Ausmaßes
der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper und
der TK1 in der biologischen Säugerprobe
verwendbar ist.
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In einem vierten Aspekt umfaßt die Erfindung
ein Kit, der zur Bestimmung des Thymidinkinase 1 (TK1)-Gehalts
und des Thymidinkinase 2 (TK2)-Gehalts in einer biologischen
Säugerprobe
verwendbar ist, umfassend:
einen monoklonalen Antikörper entsprechend
dem zweiten Aspekt der Erfindung;
ein erstes Reagenz, das zum
Nachweis des Ausmaßes
der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper und
der TK1 in der biologischen Säugerprobe
verwendbar ist;
einen monoklonaler Antikörper, der mit Spezifität an eine
gereinigte TK2 bindet; und
ein zweites Reagenz, das zum Nachweis
des Ausmaßes
der Wechselwirkung zwischen dem monoklonalen Antikörper gegen
eine gereinigte TK2 und die TK2 in der biologischen Säugerprobe
verwendbar ist.
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In einem fünften Aspekt umfaßt die Erfindung
ein Verfahren zur Bestimmung des aktiven TK1-Gehalts in einer Tumor-
oder Serumprobe, das die Schritte umfaßt:
das Inkontaktbringens
der Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch die TK1
des ersten Aspekts der Erfindung 1 bindet und
das Bestimmen
der Menge des Antikörpers,
der an die TK1 gebundenen hat.
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Die in diesen Verfahren verwendeten
Tumorproben können
eine feste Tumorprobe, zum Beispiel eine frische oder gefrorene
Gewebeprobe oder ein histologisches Objektträgerpräparat sein.
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In einer Ausführungsform ist der monoklonale
Antikörper
an ein Enzym, das in einem ELISA Assay verwendbar ist, oder an einen
anderen nachweisbaren Marker, wie zum Beispiel an einen Fluoreszenzfarbstoff,
an ein radioaktives Isotop oder dergleichen konjugiert. Weiterhin
kann der Kit wahlweise einen Anti-Maus-Antikörper, der zum Nachweis durch
ELISA an ein Enzym konjugiert ist oder sonst irgendwie markiert ist,
enthalten.
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Die monoklonalen Antikörper der
Erfindung können
ebenfalls zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit eines Tumorrückfalls
in einem Patienten nützlich
sein. Solche Verwendungen der monoklonalen Antikörper der Erfindung können auch
die Schritte des Errichtens eines normalen Bereichs für die TK-Gewebeaktivität, des Erhaltens
einer primären
Tumorprobe von einem Patienten, des Bestimmens der TK-Enzymmenge
in der Patientenprobe zur Herstellung eines TK-Patientenwerts und
des Vergleichens des TK-Patientenwerts
mit dem normalen Wert und falls er den normalen Bereich durch eine
signifikante Menge überschreitet,
des Vorhersagens, dass der Tumor voraussichtlich wieder auftritt
und falls er den normalen Bereich nicht signifikant überschreitet,
des Vorhersagens dass ein Rückfall
unwahrscheinlich ist, umfassen.
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Der Schritt des Errichtens eines
normalen Bereichs kann auf mehrere Arten durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform
können
eine oder mehrere Proben des eigenen normalen Gewebes des Patienten
zum Vergleich verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform
kann ein normaler Bereich von einer Untersuchung des normalen Gewebes
in gesunden (nicht krankhaften) Personen oder von Personen mit bekannter vorübergehender
Besserung errichtet werden.
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Die monoklonalen Antikörper der
Erfindung können
auch in verbesserten Verfahren und Zusammensetzungen für das Stellen
einer Diagnose und für
das Einstufen von soliden und leukämischen und lymphoiden Tumoren
und für
die Überwachung
der Behandlungswirksamkeit und für
den Nachweis eines Wiederauftretens solcher Tumore von Nutzen sein.
Solche Verwendungen der monoklonalen Antikörper der Erfindung zur Bestimmung,
ob die Krankheit in einem Patienten, der gegen Leukämie oder
Lymphkrebs behandelt worden ist, können die Schritte des Nehmens
einer Reihe von Serumproben eines Krebspatienten in regelmäßigen Abständen, des
Messens der TK-Menge in den Proben, des Vergleichens der TK-Menge
unter den Proben und des Bestimmens, dass die Krankheit Wiederauftritt,
falls die TK-Menge in den späteren
Proben die Menge der früheren
Proben um eine signifikante Höhe überschreitet,
umfassen.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 ist
ein Diagamm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen
die Elutionszeit von einer DEAE-Zellulosesäule eines TK1-Rohextrakts,
das von Raji-Zellen erfindungsgemäß hergestellt wurde, darstellt;
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2 ist
ein Diagamm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen
die Elutionszeit eines TK1-Rohpräparats
von einer Mono Q Säule
darstellt, das wie nach der Beschreibung in Beispiel N durchlief;
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3 ist
ein Diagamm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen
die Elutionszeit eines teilweise gereinigten TK1-Präparats von
einer Mono Q Säule
darstellt, das näherungsweise
den Fraktionen 201–204 von 2 entspricht, die einem
zweiten Durchlauf auf einer Mono Q Säule, so wie in Beispiel N beschrieben
ist, unterzogen wurden;
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4 ist
ein Diagramm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen
die Elutionszeit eines weiteren gereinigten TK1-Präparats von
einer Mono Q Säule
darstellt, das näherungsweise
den Fraktionen 308, 310 von 3 entspricht und die einem dritten Durchlauf
auf einer Mono Q Säule,
so wie in Beispiel N beschrieben ist, unterzogen wurden;
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5 ist
ein Diagamm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen
die Elutionszeit eines TK-Rohextrakts von einer Mono Q Säule darstellt,
das von HeLa-Zellen hergestellt wurde und wie nach der Beschreibung
in Beispiel IX durchlief
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6 ist
ein Diagramm, das die Auftragung der Extinktion bei 280 nm gegen
die Elutionszeit eines teilweise gereinigten TK2-Präparats von
einer Mono Q Säule
darstellt, das näherungsweise
den Fraktionen 501–504 von 5 entspricht, die einem
zweiten Durchlauf auf einer Mono Q Säule, so wie sie in Beispiel
IX beschrieben ist, unterzogen wurden;
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Genaue Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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In der Entwicklung eines gegen TK1
spezifischen Antikörpers
und hauptsächlich
für einen
anti-aktiven TK1-Antikörper
traf man auf mehrere Schwierigkeiten. Die aktive TK1-Form ist ziemlich
labil, so dass es schwierig ist, sie in ausreichender Reinheit und
Menge zur Verwendung als ein Antigen herzustellen. Aufgrund deren
Labilität
kann die aktive TK1- Multimerform
in Monomere oder inaktive Formen nach der Injektion in die Maus
und bevor B-Zellen gebildet werden, die Antikörper herstellen, die gegen
die aktive TK1 oder TK1 mit hohem Molekulargewicht spezifisch sind,
abgebaut werden, so dass die Wahrscheinlichkeit, ein solche Antikörper herstellendes
Hybridom zu erhalten, stark verringert ist. Weiterhin weisen Mäuse ein
TK1-Enzym auf, so dass es schwierig ist, eine Antikörperbildungsreaktion
auf das TK1-Protein hervorzurufen.
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Als ein Teil der Erfindung wurde
entdeckt, dass Raji-Zellen anscheinend nur ein einziges TK-Isozym erzeugen,
von dem man glaubt, dass es das TK-Isozym ist. Raji-Zellen ist eine
immortalisierte menschliche Lymphomzelllinie, die von ATCC als #CCL-86
Zellinie erhältlich
ist. Die Entdeckung dieser reinen Antigenherstellung war wichtig
für die Überwindung
der Hindernisse, die frühere
Versuche zur Herstellung von Anti-TK1-Antikörpern behinderten.
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BEISPIEL I
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Assay von Raji-Zellen für die TK1-
und TK2-Aktivität.
Von Raji-Zellen wurde ein Rohzellextrakt folgendermaßen hergestellt.
Es wurden näherungsweise
1011 bis 1012 exponentiell
wachsende Raji-Zellen durch Zentrifugieren aus dem Wachstumsmedium
geerntet. Die pelletisierten Zellen wurden von der überstehenden Flüssigkeit
getrennt und in 1–2
ml eines Extraktionspuffer, der 0,02 M Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 0,05
MgCl2 und 0,2 mM KCl enthielt, resuspendiert.
Die Zellsuspension wurde drei Gefrier-Tau-Zyklen in flüssigem Stickstoff und
in einem Wasserbad mit 37°C
unterzogen. Dann wurde die zerrissene Zellsuspension bei 30000 × g während 30
Minuten zum Pelletisieren der Zelltrümmer zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit,
die einschließlich
TK und anderen löslichen
Enzymen- ungefähr
50 mg/ml Protein enthielt, wurde von dem Pellet dekantiert und bei –20 °C gefroren
gelagert.
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Zur Durchführung der TK-Assays wurde 0,2
Milliliter (abgekürzt
ml) des Rohextrakts mit einer gleichen Menge (0,2 ml) einer Assaymischung
gemischt, die 0,02 M Tris-HCL (pH-Wert 7,8), 2 × 10–6 M
[3H]-Thymidin (85 Curie pro Millimol), 0,002
M MgCl2, 0,2 M KCl, 0,1 M NH4Cl, 0,005 M
Mercaptoethanol und 0,004 M ATP (Adenosintriphosphat) enthielt.
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Die Assayreaktionen wurden bei 37°C in einem
Wasserbad inkubiert. Nach Inkubationszeitdauern von 30 Minuten und
60 Minuten wurden Proben mit 0,025 ml entnommen und auf Whatman
DE-81 Scheiben getüpfelt.
Man ließ die
Filterscheiben trocknen und wusch sie 3 mal während jeweils 5 Minuten mit
0,01 M Formiat. Dann wurden die Scheiben während 5 Minuten mit destilliertem
Wasser gespült,
anschließend
mit Methanol gespült
und in Szintillationsampullen übertragen,
die 4 ml eines Szintillationszählfluids
zur Messung der 3H-Radioaktivität enthielten.
Auf dieselbe Weise wurde ein genau gleicher zweiter Assay durchgeführt, jedoch unter
Substitution von ATP durch CTP (Cytosintriphosphat).
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Die Ergebnisse wiesen darauf hin,
dass das Rohextrakt der Raji-Zellen 7000–8000 cpm von CTP in 60 Minuten
inkorporierte, im Vergleich zu ungefähr 259000 cpm, die bei der
Verwendung von ATP als Vorläufer inkorporiert
wurden. Man meinte, dass diese Ergebnisse darauf hinwiesen, dass
es in Raji-Zellen keine nachweisbare Höhe der TK2-Aktivität gab. Die
spezifische Aktivität
des Raji-Extrakts betrug ungefähr
559 cpm/mg Protein/min.
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BEISPIEL II
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Teilweise Reinigung von TK1. Das
TK1-Enzym wurde teilweise von dem Rohextrakt der Raji-Zellen aus
Beispiel I durch DEAE-Zellulose-Anionenaustauscherchromatographie
gereinigt. Damit die höchsten
Ausbeuten an TK-Protein erhalten werden, ist es wünschenswert,
dass sich die Zellen bei der Ernte in der exponentiellen Wachstumsphase
befinden. Der Proteingehalt des Rohextrakts wurde unter Verwendung
des gut bekannten Bradford Assays bestimmt. Insgesamt wurden ungefähr 1,0–2,0 Gramm
Protein aus dem Rohextrakt auf eine DEAE-Zellulosesäule gegeben
und mit 10 Hohlraumvolumen von 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0) unter
Verwendung des gravimetrischen Durchflusses gewaschen. Die Säule wurde
mit 0,5 M Tris-HCl (pH-Wert 8,0) eluiert und Fraktionen mit 1,0
ml wurden gesammelt.
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1 stellt
die bei 280 nm gemessene Extinktion als Funktion der Elutionszeit
dar. Das Auffangen der Ein-Milliliter Fraktionen 102, 103, 104 ist
angezeigt. Von den gesammelten Fraktionen wurden Teile auf die TK1-Aktivität hin allgemein
wie in Beispiel I beschrieben ist, untersucht. Fraktion 104 erstreckt
sich näherungsweise über einen
ersten Peak 110 in dem Chromatograph, von dem festgestellt
wurde, dass er die meiste von der aus der Säule eluierten TK-Aktivität enthielt.
Durch Zusammenfassen und Konzentrieren der Fraktion 104 von
ungefähr
einhundert Durchläufen,
die wie in Beispiel II durchgeführt
wurden, wurden näherungsweise
40 ml Eluierungsmittel, das ungefähr 1,6 mg/ml TK1-Protein enthielt
rückgewonnen.
Die ungefähre
spezifische Aktivität
des zusammengefassten DEAE-Zellulosepräparats betrug
17430 cpm pro mg Protein pro Minute.
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Die zusammengefassten DEAE-Zellulosefraktionen
wurden unter Verwendung eines Amicon Proteinkonzentrationsapparats
eingeengt und eine Probe wurde unter nicht-denaturierenden Bedingungen
auf einem 10% Polyacrylamidtrennungsgel mit einer 4,0% Polyacrylamidgelschicht
elektrophoresiert. In dem Gel waren näherungsweise 7 Banden in einem
Molekulargewichts (MW)-Bereich von ungefähr 24000 bis ungefähr 180000
Dalton sichtbar. Diese Banden wurden ausgeschnitten, das Protein
aus dem Gel euiert und auf die TK1-Aktivität hin auf eine Weise untersucht,
die ähnlich
zu derjenigen ist, die in Beispiel I beschriebenen ist. Nur eine
Bande von ungefähr
100000 Dalton enthielt eine signifikante TK1-Aktivität. In keiner
der anderen Banden gab es eine signifikante TK1-Aktivität. Die Bande
mit einem MW von 100000 umfaßte
ein halbreines Präparat
von aktiver TK1 und wurde als das Antigen zur Herstellung der Anti-TK1
monoklonalen Antikörper
verwendet. Von dem zusammengefassten DEAE-Zellulosepräparat wurden
ungefähr
50 μg (Mikrogramm)
dieses halbreinen TK1 rückgewonnen.
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Beispiel III
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Reinigung von TK1 durch ROTIFER.
Alternativ wurde TK1 durch isoelektisches Fokussieren des Rohextrakts
unter Verwendung einer ROTIFER-Vorrichtung, die von Bio-Rad bezogen wurde,
teilweise gereinigt. Es wurde das Verfahren verwendet, das in dem
ROTIFER-Handbuch von Bio-Rad (1990) erläutert ist. In den isoelektrischen
Gelen wurden sechs bis sieben Proteinabanden beobachtet, von denen
eine ein Molekulargewicht von ungefähr 100000 Dalton aufwies und
bei der Untersuchung, wie sie in den vorangehenden Abschnitten beschrieben
ist, etwas TK1-Aktivität
zeigte. Die Rückgewinnung
der Aktivität
war ziemlich schwach im Vergleich zu den Verfahren der Beispiele
II und IV.
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Beispiel IV
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Reinigung durch FPLC. Ein drittes
und derzeit bevorzugtes Verfahren der TK1-Reinigung wendet die FPLC
(Feine Protein-Flüssigkeitschromatographie)
an mit drei aufeinanderfolgenden Reinigungen auf einer Mono Q 5/5
Anionenaustauschersäule
unter Verwendung verschiedener Elutionsgradienten für jeden
Durchlauf. Die Mono Q 5/5 ist eine von Pharmacia kommerziell erhältliche
Ionenaustauscherpackung, die im wesentlichen eine monodisperse Kügelchengröße und starke
Anionenaustauschereigenschaften, aufgrund gebundener quartärer Amingruppen
aufweist, die über
den Bereich von pH-Wert 2 bis pH-Wert
12 geladen bleiben. Die Vorrichtung für das Verfahren kann ebenfalls
von Pharmacia bezogen werden. Die Säule wurde mit 0,1 ml des halbreinen
Präparats
aus dem Verfahren von Beispiel II, das ungefähr 1 mg Protein enthielt, beladen
und mit 10 Volumen des Puffers A (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) ausgewaschen.
Das Hohlraumvolumen dieser Säule betrug
1,0 ml. Ein programmierter Gradient wurde angelegt, um die Konzentration
von Puffer B (1,0 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) allmählich von
0–100%,
während
eines Durchlaufs von 20 Minuten mit einer konstanten Durchflussgeschwindigkeit
von 1,0 ml/min, zu erhöhen.
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Das Protein wurde, sowie es aus der
Säule eluierte,
durch die Extinktion bei 280 nm nachgewiesen (2). Die Fraktionen, die die Extinktionspeaks
bei 280 nm enthielten, wurden gesammelt und auf die TK1-Aktivität untersucht,
so wie hierin vorstehend beschrieben ist. Es wurde festgestellt,
dass die TK1-Aktivität vor
allem in Peak 200 war (der erste von der Säule eluierte
Peak), wobei bei dem Punkt der Gradient ungefähr 15–20% Puffer B enthielt.
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Das Protein aus dem Peak 200 wurde
durch eine nicht-denaturierende PAGE, wie vorher zur Bestimmung
der Reinheit, analysiert. Es waren 5 Proteinbanden vorhanden. Diese
Banden wurden ausgeschnitten und von jeder wurde das Protein auf
die TK1-Aktivität
hin untersucht. Eine nachweisbare TK1-Aktivität wurde in der Bande mit hohem
Molekulargewicht (100000 MW), jedoch nicht in den anderen Banden
festgestellt.
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Für
einen zweiten Reinigungsschritt wurden die TK1-Aktivität-positiven
Fraktionen von mehreren Durchläufen
gesammelt, zusammengefasst und eingeengt. Diese teilweise gereinigte,
zusammengefasste Probe durchlief dann wiederum die Mono Q Säule mit
einem niedrigeren Gradienten. Wie vorher wurde von der zusammengefassten
Probe eine Portion mit einzehntel ml, die ungefähr 1 mg Protein enthielt auf
die Mono Q Säule
gegeben. Für diesen
zweiten Durchlauf startete der Gradient bei 5% Puffer B und lief
bis 40% Puffer B über
eine Zeit von 35 Minuten bei 1,0 ml/min.
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3 stellt
ein Chromatogramm der Extinktion gegen das Elutionsvolumen für den zweiten
nachfolgenden Mono Q-Durchlauf dar. Es wurden wiederum Fraktionen
mit 1,0 ml Elutionsmittel gesammelt. Ein Hauptpeak 300 eluierte
von der Säule
bei ungefähr
15% Puffer B und zwei kleinere Peaks 302, 304 eluierten bei
ungefähr
18% beziehungsweise 20 % Puffer B. Die Peaks wurden auf TK1-Aktivität untersucht
und von der Fraktion 310 von dem Hauptpeak 300 wurde
festgestellt, dass sie TK1-Isozymaktivität enthält.
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Das Protein von dem Peak 300 (Fraktionen 308, 310)
wurde ebenfalls durch SDS-PAGE analysiert und es wurde festgestellt,
dass es 3 Proteine mit Molekulargewichten von ungefähr 100000,
75000 beziehungsweise 24000 enthielt. Bei dem Assay für die TK1-Aktivität des Proteins
von jeder der Banden zeigte nur das Protein mit 100000 Dalton eine
signifikante TK1-Aktivität.
-
Ein dritter aufeinanderfolgender
Mono Q Durchlauf wurde mit Protein durchgeführt, das von den Fraktionen 308, 310 die
den Peak 300 enthielten, ausgefällt und zusammengefasst wurde.
Die Durchlaufbedingungen wurden weiter verändert, indem die Durchflussgeschwindigkeit
verlangsamt und der Gradient weiter erniedrigt wurde. Ein Gradient
von 5% Puffer B bis 30 % Puffer B lief mit 0,5 ml/min während 50
Minuten durch. Für
diesen Durchlauf wurden Fraktionen mit 0,5 ml gesammelt. Es gab
drei Peaks 400, 402, 404, die nahe bei 15%
von Puffer B eluierten. Von jedem der Peaks 400, 402, 404 wurde
das Protein auf TK1-Aktivität
wie vorher untersucht. Der erste eluierte Peak 400 enthielt
TK1-Aktivität
und bei der Analyse durch nicht-denaturierende PAGE wurde festgestellt,
dass er eine einzige Bande bei einem Molekulargewicht von ungefähr 100000
enthielt. Dieses Präparat
wird hierin als „gereinigtes" TK1-Isozym bezeichnet.
In Peak 400 wurden ungefähr 5 Nanogramm des Proteins
mit einer spezifischen Aktivität
von ungefähr
2412800 cpm/mg Protein/mg rückgewonnen.
-
Das Protein von Peak 400 wurde
von mehreren Säulendurchläufen zusammengefasst
und durch Elektrophorese unter reduzierenden und nicht-reduzierenden
Bedingungen analysiert. Auf dem nicht-reduzierenden Gel wurde nur
eine Bande bei 100000 MW beobachtet, während auf dem reduzierenden
Gel eine schwache Bande bei 100000 MW und eine dunklere Bande bei
24000 MW beobachtet wurden. Aus diesem Ergebnis scheint es, dass
die aktive TK1-Form ein Multimer mit Untereinheiten mit niedrigeren
Molekulargewichten sein kann. Derzeit scheint es ebenfalls, dass
die Untereinheiten von identischen Molekulargewichten sind.
-
Derzeit ist das Verfahren von Beispiel
IV unter Verwendung der FPLC mit Mono Q Säule das bevorzugte Verfahren
zur Isolierung von reiner TK1. In Beispiel N war das Ausgangsmaterial
das Rohextrakt von Beispiel I. Alternativ kann jedoch die DEAE-Zellulosepräparation
von Beispiel II als Ausgangsmaterial verwendet werden. Jedoch kann
zur Herstellung von halbreiner TK1 für die Antigeninjektion in Mäuse das
Verfahren von Beispiel II verwendet werden oder es ist auch das
Produkt geeignet, das durch den zweiten Durchlauf auf der Mono Q
Säule,
wie in Beispiel N, erhalten wird.
-
BEISPIEL V
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Herstellung von monoklonalen an TK1
bindenden Antikörpern.
Hybridomzelllinien, die Antikörper
zu TK1 erzeugen, wurden durch Verfahren hergestellt, die aus dem
Stand der Technik allgemein bekannt sind, jedoch bestimmte Modifikationen
aufweisen.
-
Die Immunisierungstechnik ist von
derjenigen, die in der Literatur gefunden wird, verschieden. Halbreine
TK1 wurde so wie in Beispiel II hergestellt. Eine Dosis von 100 μg halbreiner
TK1, die in 50 μl
PBS + 50 μl
vollständigem
freundsches Adjuvans suspendiert war, wurde intraperitoneal (I.
P.) jeder Maus aus einer Gruppe weiblicher 5–6 Wochen alter BALB/c Mäusen gegeben.
Zwei Wochen später
wurde eine zweite Immunisierung gegeben, die identisch mit der ersten
war.
-
Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung
mit halbreiner TK1 wurde eine Injektion innerhalb der Milz gegeben,
die 10 μg
der reinen aktiven TK1 (hergestellt wie in Beispiel N), suspendiert
in 100 μl
PBS, enthielt. Die Mäuse
wurden mit Natriumpentabarbitol (65 mg/ml), das durch Zugabe von
6,7 ml bis 93,3 ml PBS verdünnt
war, betäubt.
Jeder Maus wurden 10 μg/Gramm
Körpergewicht
intraperitoneal gegeben. Ein chirurgischer Eingriff wurde unter
Verwendung eines Skalpells und einer Pinzette durchgeführt und
die Milz wurde sanft zur Verabreichung des Antigens aufgerauht.
Mehrere Berieche der Milz wurde injiziert, um eine einheitliche
Verteilung des Antigens sicherzustellen. Die Wunde wurde mit Metallnähten geschlossen
und die Mäuse wurden
unter eine Wärmelampe
während
1–2 Stunden
gesetzt.
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Zweiundsiebzig Stunden nach der Injektion
innerhalb der Milz wurden die Mäuse
unter Verwendung von Ether geopfert und die Milz wurde entfernt.
Bevor die Mäuse
getötet
wurden, wurde Blut entfernt das das Serum getestet, um sicherzustellen,
dass die Mäuse
eine Immunreaktion auf das TK1-Protein aufbauten. Die B-Zellen wurden
aus der Milz zur Verschmelzung mit einer unsterblichen Myelomazelllinie
isoliert.
-
Die für den Verschmelzungspartner
verwendete Zelllinie war eine selbst-verschmolzene Sp2/ Linie, die
als FO bezeichnet war, die von ATCC bezogen wurde. Es ist ein Derivat
von P3-X63-Ag8.
Diese Linie ist eine unsterbliche Myeloma-Mäusezelllinie, die schnell wächst und
ein Nicht-Sekretor ist (schwer- oder leichtkettige Immunglobuline).
Die Verschmelzung von FO- und den aktivierten Milzzellen wurden
so durchgeführt, wie
allgemein aus dem Stand der Technik bekannt ist. Eine Milz, die
ungefähr
1 × 108 Zellen enthielt, wurde pro Verschmelzung
verwendet. Die erfolgreichsten Verschmelzungen ergaben sich dann,
wenn das Verhältnis von
B-Zellen zu FO-Zellen ungefähr
10 : 1 betrug. Nach der Beendigung der Verschmelzung wurde die Verschmelzungszellsuspension
in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen geimpft, die einen Tag
vorher mit 3000 bis 6000 Mäusemakrophagen
pro Vertiefung als Futterzellen geimpft worden waren.
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Das HAT Selektionsmedium wurde verwendet,
damit nur Verschmelzungsprodukte ausgewählt wurden. Die Vertiefungen
wurden für
das Wachstum markiert und allmählich
dem HAT entwöhnt
und in normale Medien gebracht. Zu dieser Zeit waren die einzigen überlebenden
Zellen Hybridomzellen, die durch Verschmelzung von B-Zellen und
FO-Zellen erhalten wurden. Aus jeder Verschmelzung resultierten
insgesamt ungefähr
500 Kolonien, die die Verschmelzungsprodukte darstellten.
-
BEISPIEL VI
-
Vorläufiges Screening der Hybridomkolonien
von der Verschmelzung. Aus einer Verschmelzung wurden 500 Kolonien
einem vorläufigen
Screening durch ELISA gegenüber
teilweise gereinigter TK1 unterzogen, die wie in Beispiel II hergestellt
wurde. Die überstehenden
Flüssigkeiten
von den Hybridomkulturen wurden anfänglich mit halbreiner TK1 gescreent,
die durch Durchlaufen des Rohextrakts von Raji-Zellen auf DEAE-Zellulose
zur teilweisen Reinigung der TK1 hergestellt wurde. Somit weist
dieser vorläufige
Screen Antikörper
gegen multiple TK1-Formen nach, einschließlich monomeren, multimeren
einschließlich
tetrameren, aktiven und inaktiven Formen, usw. nach.
-
Mikrotiterplatten wurden mit 1,0 μg (Mikrogramm)
pro Vertiefung der ausgewählten
TK-Proteinpräparate,
die in 50 μl
PBS suspendiert waren, beschichtet und man ließ sie über Nacht trocknen. Dann wurden
die Platten während
30 Minuten pro Vertiefung mit 200 μl PBS-Tween 20-EDTA-1% Milchfett behandelt,
um nicht spezifisches Binden zu blockieren. Die Platten wurden 3
mal mit 200 μl
PBS-Tween 20-EDTA (PBST2E) gewaschen. Tween 20 ist ein
anionisches Detergens, das von Bio-Rad Laboratories, Richmon, CA
kommerziell erhältlich
ist und zur Verringerung der nicht-spezifischen Antikörper-Antigenbindung
verwendbar ist, während es
die Bindung primärer
Antikörper
an Antigene oder von Antigenen an Nitrozellulose nicht zerbricht.
-
Das Wachstumsmedium auf den Hybridomzellkulturen
wurde zur Sättigung
der Medien mit Antikörpern
drei Tage lang nicht ausgetauscht, bevor die überstehenden Flüssigkeiten
der Hybridomkulturen gesammelt wurden. Für jedes Hybridom wurden 80 μl Überstand
pro Vertiefung zugegeben, um die Vertiefungen zu verdoppeln. Dann
wurden die Mikrotiterplatten bei 37°C während 1–1/2 Stunden inkubiert. Die überstehenden Lösungen wurden
dekantiert und die Vertiefungen 6 mal mit PBST2E gewaschen.
-
Als nächstes wurde mit Peroxidase
(erhältlich
von Bio-Rad) konjugiertes Ziegen-Anti-Mäuse-IgG (schwere und leichte Ketten-spezifisch),
in PBST2E 1 : 3000 verdünnt
zugegeben. Zu jeder Vertiefung wurde einzehntel ml zugegeben und
die Platten wie vorstehend inkubiert. Die Vertiefungen wurden wiederum
in PBST2E gewaschen und 200 μl
Substrat, Tetramethylbenzidin wurde zugegeben und während 1
Stunde wurde inkubiert. Die Substratreaktion wurde durch Zugabe
von 50 μl
2 M Schwefelsäure
zu jeder Vertiefung beendet, wodurch eine Farbverschiebung von blau
nach gelb verursacht wurde. Die Platten wurden für die O. D. Messung bei 450
nm auf einem Plattenleser gescannt. O. D. Messdaten, die mindestens
das zweifache des O. D. Hintergrunds betrugen wurden als positiv
betrachtet. Von ungefähr
25000 aus fünfzig
Verschmelzungen erhaltenen Klonen wurden fünfunddreißig in einem vorläufigen Screening
für positiv
getestet. Die positiven Klone wurden unter Verwendung eines Kits
von Hyclone, Logan, UT (Kat. # EK-5051) isotypisiert und von den positiven
Kolonien wurde festgestellt, dass sie Antikörper der IgG1-, IgG2a-, IgG3-
und IgM-Klassen
produzieren.
-
BEISPIEL VII
-
Die 35 Klone, die in den anfänglichen
Screenings für
positiv getestet wurden, wurden gründlicheren Screenings unterzogen.
Eine Platte wurde mit fünf
Paaren replizierter Vertiefungen folgendermaßen beschichtet: die Vertiefungen
A, B wurden mit einem TK1-Rohextrakt
von Raji-Zellen beschichtet; die Vertiefungen C, D wurden mit halbgereinigter,
von der DEAE-Zellulosesäule
hergestellter TK1 beschichtet; die Vertiefungen E, F wurden mit
gereinigter TK1 des Peaks 400 beschichtet, wie sie in Beispiel
IV durch FPLC hergestellt wurde (siehe 4); die Vertiefungen G, H wurden mit
dem TK1-Protein aus den Fraktionen 308, 310 des
zweiten FPLC-Durchlaufs beschichtet (siehe 3); und die Vertiefungen J, K wurden
mit einem E. co1i-Zeltextrakt beschichtet, das ein TK1-Gen in einem
PET-Vektor exprimierte. Für
die gereinigten Proben wurde pro Vertiefung 1,0 μg Protein verwendet.
-
Der ELISA wurde im wesentlichen so
durchgeführt,
wie für
das vorläufige
Screening beschrieben wurde. Von den 35 getesteten Klonen stellte
sich heraus, dass einer davon nur an die aktive TK1-Form bindet.
Die Extinktionsmeßdaten
(EXT) wurden bei 405 nm für
120 Vertiefungen auf einer Platte erzeugt, auf der zehn Klone gescreent
wurden, sie sind in TABELLE I gezeigt. Die Klone, die zumeist durch
das vorläufige
Screening auf hochgradig positiv getestet wurden, wurden absichtlich
auf dieser Platte gruppiert. Die Hintergrund EXT wurde von vier
Vertiefungen gemittelt und es wurde festgestellt, dass sie ungefähr 0,058
betrug (Vertiefungen J11, J12 und K11, K12).
-
Es ist offensichtlich, dass eine
positive Bindung (Extinktion ist signifikant größer, als das Hintergrundniveau)
in allen Vertiefungen der Spalten 2 und 5 beobachtet
wurde; in allen Vertiefungen, außer in den Zeilen C, D von
Spalte 1; in den Zeilen J, K der Spalten 3, 4 und 7;
und in den Zeilen A, B der Spalten 4 und 7. Das heißt, dass
die Klone in den Spalten 1–5 und 7 alle
für die
Bindung an TK1 positiv getestet wurden. Von diesen wurden die Klone
mit den Nummern 2 und 5 für die Bindung an alle der TK1-Präparate positiv
getestet, während
das Klon Nr. 1 an alle der TK1-Präparate band mit Ausnahme des
halbreinen DEAF-Zellulose-Präparats. Die
Klone Nr. 4 und 7 banden an das Raji-Zellen TK1-Rohextrakt und an
die durch genetisches Design in E. co1i hergestellte TK1. Klon Nr.
3 band nur an die von E. coli hergestellt TK1. Die übrigen 25
Klone wurden für Antikörper gegen
TK1 negativ getestet.
-
Tabelle
I
Screening der Hybridomklone auf Anti-TK1-Antikörper
-
Eine weitere Charakterisierung wurde
durch Western-Blotting durchgeführt.
Die Western-Blots
wurde durch Verfahren hergestellt, die zu denjenigen, die in CURRENT
PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, Verlag Wiley-Interscience, New
York (1991) beschrieben sind, ähnlich
sind. Antikörper
wurden aus dem Überstand
von jedem Hybridom geerntet und an eine von einem nicht-denaturierenden
Gel der TK-Proteine geblottete Nitrozellulosemembran hybridisiert.
Dann wurde Ziegen-Anti-Mäuse
IgG zum Nachweis der gebundenen Antikörper verwendet.
-
In einem Blot, der durch Elektrophorese
einer Raji-Extraktprobe erhalten wurde, wurde beobachtet, dass der
Klon #1-Antikörper
nur an die 100000 Dalton Bande band, von der bekannt war, dass sie
eine Aktivität aufweist.
Der Klon 5-Antikörper
band ebenfalls an diese Bande, jedoch weniger stark. Der Klon 2-Antikörper band
an vier Banden mit den Molekulargewichten von ungefähr 24000,
48000, 72000 und 100000. Von diesen wird angenommen, dass sie die
Monomer-, Dimer-, Trimer- und Multimerformen von TK1 darstellen.
Somit bindet der Klon 2-Antikörper
an alle der gewöhnlich
beobachteten TK1-Formen,
oder an die „gesamte" TK1.
-
Ein weiterer Western Blot wurde von
einem Gel hergestellt, in dem die gereinigte Multimer-TK1 aus dem dritten
Durchlauf des FPLC-Verfahrens (Peak 400 in 4). Dieses gereinigte Multimer wandert
als eine homogene Spezies mit einem Molekulargewicht von 100000,
jedoch weist sie eine beträchtlich
geringere Aktivität
als erwartet auf. Folglich ist dieses Präparat eine Multimer- oder Tetramerform,
jedoch kann sie sich nicht in der aktiven Konfiguration befinden.
In diesem Blot bindet der Klon 5-Antikörper stark an die eine Bande
bei 100000, während
der Klon 1-Antikörper
weniger stark and die Bande bindet – in dem Blot des Raji-Zellextrakts wurde
das gegenteilige Ergebnis erhalten.
-
Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich,
dass Klon 1 und Klon 5 an verschiedene Epitope
binden. Der Klon 1-Antikörper
bindet selektiv an die aktive TK1-Multimerform und wird nachfolgend
hierin als ein „Anti-AcTK1"-Antikörper bezeichnet.
Der Klon 5-Antikörper
bindet an die Multimerform, jedoch offensichtlich vorzugsweise an
eine inaktive Multimerform.
-
Die Klone Nr. 1–5 sind alle Hybridome vom
IgM-Typ. Der Klon 7 ist ein Hybridom vom IgG-Typ.
-
BEISPIEL VIII
-
Hemmung der TK1-Aktivität durch
ausgewählte
monoklonale Antikörper.
Zum Testen der Hemmung der TK1-Aktivität wurde der TK-Assay unter
Verwendung von ATP durchgeführt,
wobei das vorstehend beschriebene Rohextrakt der Raji-Zellen mit
Rücksicht
auf die TK1-Isolierung verwendet wurde.
-
Es wurden gleiche Assayreaktionen
hergestellt. Zu einigen Reaktionen wurde ein 20 μl Aliquot der überstehenden
Flüssigkeit
aus einer der Hybridomkulturen zugegeben, wobei sie ungefähr zwischen
0,02 bis 0,1 μg
Antikörper
enthielt.
-
Die Inkorporierung der Radioaktivität wurde
mit einer Kontrolle (kein Antikörper)
und einer Testreaktion verglichen, zu der der Hybridomüberstand
aus ausgewählten
Hybridomkulturen zugegeben wurde. Die für die ausgewählten Hybridome
erhaltenen Daten sind in Tabelle II zusammengefasst.
-
Tabelle
II
TK1-Hemmung durch Anti-TKl-Antikörper
-
In den Reaktionsröhrchen, zu denen Überstandproben
von den Klonen Nr. 1–5
und 7 zugegeben wurden, betrug die Menge der inkorporierten Radioaktivität nicht
mehr als 20% der Radioaktivitätsmenge
in den Kontrollen. Im Gegensatz dazu hemmte in dem Reaktionsröhren, zu
dem der Überstand
von Klon Nr. 19 zugegeben wurde, eines der Verschmelzungsprodukte,
das durch ELISA negativ auf die TK1-Bindung getestet wurde, nicht
die Aktivität
von TK1 in dem Raji-Zeltextrakt. Es wurde ebenfalls festgestellt,
dass die Fähigkeit zur
TK1-Hemmung in diesem Assay mit den höchsten O. D. Messdaten positiv
korrelierte, wie durch das ELISA-Verfahren festgestellt wurde.
-
Die Antikörper von den Klonen Nr. 3,
4, 6 und 7 waren in der Hemmung der TK1-Aktivität in dem Raji-Extraktassay
weniger wirkungsvoll (nicht gezeigt). Sie wurden daher keinem weiteren
Screening unterzogen.
-
Die Klone 1,2 und 5 wurden
wiederum bis zu einer Grenze verdünnt und die Kolonien, die von
diesem Reklonierungsverfahren stammten, wurden nochmals getestet.
Das Reklonierungsverfahren wurde verwendet, um dafür zu sorgen,
dass eine Hybridomzelllinie von einer einzigen Verschmelzungszelle
abstammt, und somit in dem Isotyp und der Spezifität einheitliche
Antikörper
erzeugt, zum Beispiel monoklonale Antikörper. Die Klone Nr. 1,2 und
5 wurden gemäß dem Budapester
Vertrages bei der American Type Culture Collection in Rockville,
Maryland U.S.A am 11. August, 1993 hinterlegt und ihnen wurden die
ATCC Nummern HB 11432, HB 11433 beziehungsweise HB 11434 zuwiesen.
-
Zusätzliches Screening stellte
fest, dass keiner der Klone Nr. 1, 2 oder 5 Antikörper produzierte,
die an TK2 banden (das TK2-Antigen wurde so, wie im nachstehenden
Beispiel IX beschrieben ist, hergestellt). In einem nachfolgenden
Satz von Hybridomklonen, die nach dem Verfahren von Beispiel V hergestellt
worden waren, offenbarte das Screening gegen das TK1-Antigen, wie
in Beispiel VII, und gegen das TK2-Antigen, wie in Beispiel IX,
dass mindestens zwei Klone Antikörper
erzeugten, die sowohl auf die TK1- als auch auf die TK2-Bindung positiv waren.
Von den letzteren Klonen wird angenommen, dass sie Antikörper erzeugen,
die mit Spezifität
an natürlich
vorkommende Proteine binden werden, die eine Sequenzhomologie von
90% mit einer menschlichen Thymidinkinase aufweisen (einschließlich entweder
TK1 oder TK2).
-
BEISPIEL IX
-
Isolierung von TK2. Die Isolierung
von TK2 wurde durch FPLC mit einer Mono Q-Säule durchgeführt. Das
Ausgangsmaterial war ein dem Raji-Extrakt ähnliches Rohzellextrakt, mit
der Ausnahme, dass es von HeLa-Zellen hergestellt wurde. HeLa ist
eine immortalisierte menschliche zervikale Karzinomzelllinie, die
von ATCC unter #CCl-2 erhältlich
ist, und von der angenommen wird, dass sie hohe TK2-Gehalte und
sehr geringe TK1-Gehalte aufweist. Bei der Analyse durch nicht-denaturierende
PAGE, scheint TK2 ebenfalls eine Monomerform und eine oder mehrere
Multimerformen aufzuweisen.
-
Als ein vorbereitender Schritt lässt man
ein Rohextrakt der HeLa-Zellen auf DEAE-Zellulose laufen. Unter
Verwendung des CTP-Assays wurde festgestellt, dass die TK2-Aktivität sich weitestgehend
in den Peaks 18–20 befand,
was ziemlich von dem Bereich getrennt liegt, in dem TK1 eluiert.
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Eine weitere Reinigung wurde durch
FPLC auf einer Mono Q Säule
durchgeführt. 5 zeigt die Ergebnisse eines
ersten Durchlaufs auf einer Mono Q-Säule des zusammengefassten Materials
aus den Peaks 18–20.
Puffer A war 0,05 molare Tris-HCl und Puffer B war 0,5 molare Tris-HCl
und die Säule
wurde mit einem Gradienten von 5% bis 45% Puffer bei einer Durchflussgeschwindigkeit
von 1 ml/min durchlaufen. Die TK2-Aktivität wurde in den gesammelten
Fraktionen untersucht und es wurde festgestellt, dass sie größtenteils
in Fraktion 7 (Peak 500) vorhanden war. Das Material
von Peak 500 wurde aus mehreren Säulendurchläufen zusammengefasst, eingeengt
und lief ein zweites Mal mit demselben Puffergradienten und derselben
Durchflussrate durch. 6 zeigt
die Ergebnisse des zweiten Durchlaufs. Es wurde festgestellt, dass
die TK2-Aktivität
in Fraktion 6 (Peak 600) vorhanden war. Das gesammelte
Material der Fraktion 6 ist ein halbreines Präparat des aktiven
TK2-Isozyms.
-
Gegen TK2 spezifische
monoklonale Antikörper
-
Ein TK2-Präparat, das die Fraktion 6 aus
dem zweiten Durchlauf des Mono Q-FPLC-Verfahrens in Beispiel IX umfasste,
wurde als das Antigen verwendet. Das Immunisierungsverfahren, Ernten
der Milzzellen und Verschmelzen mit FO-Zellen, war ähnlich zu
denjenigen in den Beispielen V-VI. Das Screening wurde durch ELISA
auf Vertiefungen, die mit dem halbreinen TK2-Präparat aus Beispiel IX beschichtet
waren, durchgeführt und
die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben. Die Ergebnisse wiesen
darauf hin, dass die Antikörper
von den Klonen 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-12, 2-17 und 2-19 zu
den positivsten Ergebnissen für
die Bindung an die halbreine TK2 führten. In Tabelle III stellen
die mit „2-1A", „2-5A", usw. bezeichneten
Proben getrennte replizierte Antikörperaliquoten von den Klonen 2-1, 2-5,
usw. dar. Die Klone 2-7, 2-8, 2-9, 2-10 und 2-12 ergaben schließlich Hybridomzelllinien,
die akzeptable Gehalte von Anti-TK2-Antikörpern erzeugten.
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Tabelle
III
Screening der Hybridomkone auf Anti-TK2-Antikörper
-
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Zur Verwendung in Tests mit Patientenproben
wurden die ausgewählten
Antikörpererzeugenden
Zelllinien passagiert und der Überstand
wurde über
eine Zeitdauer von 3 Monaten aseptisch gesammelt. Die Antikörper wurden
durch Ausfällen
der Überstände mit
Ammoniumsulfat und anschließend
entweder durch Gelfiltrationschromatographie oder durch DEAE-Zellulosechromatographie
(Diethylaminoethylzellulose; bezogen von Whatman International,
Maidstone, Kent, UK unter der Handelsbezeichnung SEPHADEX) gereinigt.
Die Antikörper
wurden durch Standardverfahren gereinigt und entweder mit HRP-Peroxidase
oder alkalischer Phosphatase (Bio-Rad) konjugiert. Solche Verfahren
sind in ANTIBODIES: A Laboratory Manual von Harlowe und Lane, 1988
beschrieben.
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Für
die Bestimmung der Serum-TK-Gehalte in Versuchspersonen, wurden
von den Versuchspersonen frische Proben von peripheralem Venenblut
gesammelt. Von jeder Probe wurden durch herkömmliche Verfahren das Serum
und die mononuklearen Leukozyten voneinander getrennt und die getrennten
Proben wurden bis zu Analyse gefroren gelagert. Die TK-Gehalte in
Tumorgeweben können
durch Herstellung eines TK-Extrakts aus Proben von frischem Tumorgewebe, ähnlich zu
dem Rohextrakt der Raji-Zellen von Beispiel I, bestimmt werden.
Der Proteingehalt der Probe wird vorzugsweise so bestimmt, dass
die TK-Menge mit der Menge an gesamtem Protein in dem Tumor korreliert
werden kann. Dann kann ein Immunfällungsassay unter Verwendung
des gewünschten
Anti-TK-Antikörpers
an dem Extrakt durchgeführt
werden.
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BEISPIEL X
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Der konjugierte Antikörper von
Klon 1 wurde zur Immunfärbung
der Tumorzellen verwendet, die histologisch an Objektträgern fixiert
waren. In diesem Verfahren wurde Diaminobenzidin (DAB) als Enzymsubstrat verwendet.
-
BEISPIEL IX
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Nachweis von aktiver TK1 in Serumproben
von Krebspatienten unter Verwendung des Antik-acTKl-Antikörpers. Die
Serumproben wurden von Krebspatienten erhalten. Jede Probe wurde
auf TK-Aktivität durch
ein Verfahren, wie dasjenige von Beispiel I, untersucht. Dieselben
Proben wurden dann mit einem ELISA-Test mit dem Klon #1-Antikörper unter
Verwendung verschiedener Serumverdünnungsgehalte blind quantitativ
bestimmt. Es wurde festgestellt, dass eine Verdünnung von 1 : 16000 die besten
Ergebnisse ergab. Die Ergebnisse der zwei Assays sind in Tabelle
N gezeigt. Die Daten wurden durch Western-Blot-Analyse bestätigt.
-
In Tabelle N werden die Sera von
den höchsten
zu den niedrigsten Mengen an gebundener Anti-TK1 durch den O. D.
Messwert in dem ELISA-Assay eingestuft. Aus den TK1-Aktivitätsmessungen
ist ersichtlich, dass die Korrelation zwischen Antikörperbindungsdaten
und dem Standard TK1-Aktivitätsassay
ausgezeichnet ist. Die Daten zeigen, dass der Anti-AcTK1-Antikörper zur
Bewertung des Serumgehalts der TK1-Aktivität in Versuchspersonen verwendet
werden kann. Weiterhin band das Serum von einer gesunden (keine
Krebs tragenden) Person viel weniger Anti-AcTK1-Antikörper als
im Vergleich zu dem am niedrigsten eingestuften Serum eines Krebspatienten.
Folglich ist der Anti-Ac-TK1-Antikörper nützlich zur
Unterscheidung zwischen dem Serum von Krebs-tragenden Personen und
dem Serum von gesunden nicht-kanzerogenen Personen.
-
Tabelle
IV
Vergleich der durch
3H-Thymidin-Inkorporation
und Anti-AcTK1-Bindung gemessenen TK1-Aktivität
-
-
Es wurde weiterhin festgestellt,
dass die Gehalte der TK-Aktivität
und besonders der TK1-Aktivität zu einer
verlässlichen
Vorhersage der Tumorrückfallwahrscheinlichkeit
bei Brustkrebspatienten verwendet werden können. Tabelle V fasst die Ergebnisse
einer Untersuchung der TK-Aktivität in Proben von nicht-behandelten
primären
Tumoren zusammen, die aus 86 Patienten operativ entfernt wurden,
von denen 13 später
einen Krankheitsrückfall
erlitten.
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In dieser Untersuchung wurde ebenfalls
durch Vergleich der TK-Gehalte mit dem Östrogenrezeptorstatus festgestellt,
dass der TK-Gehalt genau vorhersagt, welche der Patienten in der Östrogenrezeptor-positiven
Gruppe später
einen Rückfall
zeigten und welche der Patienten in der Östrogenrezeptor-negativen Gruppe
keinen Rückfall
zeigten. Von 57 Östrogenrezeptor-positiven
Patienten (Patienten, deren Tumore hohe Zahlen von Östrogenrezeptoren
aufwiesen) hatten 4 einen Rückfall
der Krankheit. Der durchschnittliche TK-Aktivitätsgehalt, der in den Tumoren
von diesen vier Patienten gemessen wurde betrug 289717 cpm/min,
im Vergleich zu 161674 cpm/min für
Tumore von Patienten ohne Rückfall.
Ebenfalls betrug der Prozentsatz der Aktivität, die auf TK2 zurückführbar ist,
ungefähr
76% in der Gruppe ohne Rückfall,
gegenüber
41% in der Gruppe mit Rückfall.
-
Umgekehrt wiesen von 29 Östrogenrezeptor-negativen
Patienten (diejenigen, deren Tumore wenige oder keine Östrogenrezeptoren
aufwiesen), die 20, die keinen Rückfall
aufwiesen, einen durchschnittlichen TK-Aktivitätsgehalt von 100675 cpm/min
auf, wovon ungefähr
71% die TK2-Aktivität
ist, im Vergleich zu 379238 cpm/min, wovon ungefähr 42% die TK2- Aktivität ist, für die Gruppe
ohne Rückfall.
Folglich lieferten der TK-Aktivitätsgehalt und die relativen
Proportionen der TK2- zur TK1-Aktivität bessere Vorhersagen eines Rückfalls,
als der Östrogenrezeptorzustatus.
-
TABELLE
V Tumor-TK-Gehalte und -rückfall
-
In Bezug auf Leukämiepatienten wurde festgestellt,
dass der TK1-Aktivitätsgehalt
im Serum zum Nachweis eines Rückfalls
verwendet werden kann, häufig
bevor irgendein anderes Symptom augenscheinlich ist.
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Der Anti-AcTK1-Antikörper kann
somit zum Screenen des Serums und des Gewebes von Krebspatienten
nützlich
sein, um sowohl die Ziele als auch die Verwendung in der Diagnose
und Behandlung von Tumorpatienten zu untersuchen. Der Anti-Ac-TK1-Antikörper kann
ebenfalls zum Screening des Serums bei gewissen anderen Blutkrankheiten,
wie zum Beispiel perniziöse
Anämie
nützlich
sein, wobei die TK-Aktivität
mit dem Krankheitszustand verbunden worden ist. Weiterhin können die
Antikörper
zum Testen von Patienten mit bestimmten Viruskrankheiten, einschließlich Masern,
Röteln
und Herpes nützlich
sein, wobei festgestellt wurde, dass die Thymidinkinasegehalte während der
akuten Krankheitsphase erhöht
sind.
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Da der Anti-AcTK1-Antikörper nur
die aktive TK1-Form nachweist, kann er anstelle des radioaktiven Thymidininkorporierungssassay
zur Bewertung der Aktivität
verwendet werden. Die Verwendung des Antikörpers zur Bewertung der TK1-Aktivität in Tumoren
und in dem Serum von Krebspazieten macht diesen Test in großem Umfang
praktisch, wohingegen der Aktivitätsassay im allgemeinen schwieriger
durchzuführen
ist.
-
Der Antikörper kann ebenfalls zur gezielten
Tumortherapie nützlich
sein. Das heißt,
dass ein Anti-Tumormittel an den Antikörper gekoppelt werden kann,
der an die Tumorzellen binden wird, die große Menge an TK1 exprimieren.
Auf diese Weise ist das Anti-Tumormittel auf Tumorzellen gerichtet
und das Abtöten
der Tumorzellen ist gegenüber
dem Abtöten
der normalen Zellen erhöht.
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Weitere Verfahren zur Bestimmung,
ob die Krankheit in einem Patienten aufgetreten ist, der auf eine Krebs-
oder Blutkrankheit, einschließlich
Brustkrebs, Leukämie
und Lymphkrebs behandelt wird, kann die Schritte des Nehmens einer
Reihe von Proben des Serums eines Krebspatienten in regelmäßigen Zeitabschnitten,
des Messens der TK-Menge in den Proben, des Vergleichens der TK-Menge
unter den Proben und, falls die TK-Menge in den späteren Proben
die Menge in den früheren
Proben in signifikanter Höhe überschreitet,
des Bestimmens, dass die Krankheit Wiederauftritt, umfassen. In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Messungen der TK1-Aktivität in der Probe unter Verwendung
eines anti-aktiven TK1 monoklonalen Antikörpers bestimmt worden.
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Zusammenfassend enthält die vorliegende
Erfindung zumindest die folgenden Lehren: dass nur TK1-Tetramere
oder -Multimere eine signifikante Aktivität aufweisen; aus einfach zugänglichen
Quellen stammen (Raji-Zellen, HeLa-Zellen) und Verfahren zur Isolierung
großer
Mengen von TK1, aktivem TK1 und TK2 zur Verwendung als Antigen und
beim Screening zur Auswahl der gewünschten Hybridome; und Screening-Verfahren
zur Identifizierung von Antikörpern
die verschiedene Spezifitäten
aufweisen. Es ist offensichtlich, dass mit diesen und anderen angegebenen
Lehren dieser Anmeldung, ein Fachmann die beschriebenen und vorliegend
beanspruchten Hybridome und Antikörper, sowie auch monoklonale
Antikörper,
die eine Spezifität
für jede
gewünschte
Kategorie der Thymidinkinaseisozyme aufweisen, erhalten kann.