DE69332365T2

DE69332365T2 - Vorrichtung zur Messung von Fluoreszenz

Info

Publication number: DE69332365T2
Application number: DE69332365T
Authority: DE
Inventors: Yasutami Mitoma
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1992-07-17
Filing date: 1993-07-15
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2013-07-16
Also published as: US6144448A; DE69332365D1; JPH0634546A; EP0580362B1; EP0580362A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung von Fluoreszenz, und insbesondere betrifft sie eine Vorrichtung zur Messung von Fluoreszenz, um Veränderungen in den Fluoreszenzeigenschaften von Substanzen oder deren Wechselwirkungskomplexen in Reaktionen zu messen, welche wenigstens zwischen zwei Arten von Substanzen auftreten, welche zu Wechselwirkungen untereinander fähig sind, wie beispielsweise Reaktionen, welche Nukleinsäuren und Interkalatfluoreszenzpigmente, Lipiddoppelschichten und hydrophobe fluoreszente Sonden, Proteine und fluoreszente Pigmente, organische Polymere und fluoreszente Pigmente usw. umfassen.
In Reaktionen, welche wenigstens zwischen zwei Arten von Substanzen auftreten, welche zu Wechselwirkungen untereinander fähig sind, wie beispielsweise Reaktionen, welche Nukleinsäuren und Interkalatfluoreszenzpigmente, Lipiddoppelschichten und hydrophobe fluoreszente Sonden, Proteine und fluoreszente Pigmente, organische Polymere und fluoreszente Pigmente usw. umfassen, variieren die fluoreszenten Eigenschaften dieser Substanzen oder deren Wechselwirkungskomplexe abhängig von deren Zustand. Somit ist es, wenn die Veränderung von deren fluoreszenten Eigenschaften gemessen wird, möglich, den Wechselwirkungszustand der vorgenannten Substanzen, der Menge des erzeugten Komplexes usw. zu kennen
In Polymerase-Kettenreaktionen (PCRs - polymerase chain reaction), welche bei gleichzeitigem Vorhandensein eines Interkalatfluoreszenzpigments (siehe beispielsweise die Japanische Patentanmeldung Hei 3-313616) usw. durchgeführt wird, ist es möglich, den Zustand der Nukleinsäure-Amplifikation (Erfolg der PCR) zu erkennen, indem die fluoreszenten Eigenschaften an einem gewünschten Punkt in jedem Zyklus der PCR gemessen werden und üblicherweise an einem Punkt während der Wiederholung oder Trennung der Doppelstrangnukleinsäure in Einzelstränge und Hybridisierung zwischen Einzelsträngen, indem die Temperatur verändert wird, gemessen wird. Bei dieser Prozedur wird eine Vorrichtung benötigt, welche die Temperatur gemäß einem voreingestellten Programm variieren und die Veränderung in den Fluoreszenzeigenschaften einer Probe in einem Probenbehälter messen kann. Eine derzeitig in Gebrauch befindliche Vorrichtung ist ein Spektrophotometer, welches eine Zellenhalterung mit Temperatursteuerung enthält.
Die Messung der Fluoreszenzeigenschaften gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung eines Spektrophotometers verwendet ein System, in welchem Anregungslicht auf eine Zelle unter Verwendung eines optischen Systems von Linsen, Spiegeln usw. geleitet wird, und Fluoreszenz in gleicher Weise zu einer Fluoreszenzdetektionsvorrichtung geleitet wird, und es deshalb schwierig war, eine Mehrkanalmessung (gleichzeitige Messung mehrerer Proben) durchzuführen. Ferner wird die Empfindlichkeit der Probentemperatur gegenüber Temperaturschwankungen durch die Menge der Flüssigkeit in der Probe verringert, und es ist schwierig, die raschen Wechselwirkungen zwischen den Verbindungen zu messen, welche Phasenübergänge begleiten.
Es wurden bereits verschiedene Versuche unternommen, die Temperaturempfindlichkeit zu verbessern, wobei jedoch in Verfahren, in welchem das Volumen des Probenbehälters verringert wird. usw., es erforderlich wird, beispielsweise durch Verwendung einer Blende den Strahl des Anregungslichtes auf die Probe zu selektieren, d. h. zu verkleinern, womit neue Probleme bewirkt werden, wie z. B. eine Reduzierung der Lichtmenge und eine sich daraus ergebende Verringerung der Meßgenauigkeit. Ein Verbesserungsversuch wurde unter Verwendung eine intensiven Lichtquelle zur Kompensierung der Verringerung der Lichtmenge durchgeführt, wobei aber in diesem Falle das Problem der Wärmeabfuhr aus der Vorrichtung und der Einfluß von Wärme auf die Fluoreszenz- Detektionsvorrichtung erheblich sind, und es somit schwierig wird, hoch genaue und wiederholbare Meßergebnisse zu erzielen.
In letzter Zeit sind Vorrichtungen, welche optische Fasern in einem optischen System verwenden (Biotechnology Vol. 10, p. 413, 1992) bekannt geworden, aber in diesen Vorrichtungen wird die Probe von der Oberseite des Probenbehälters aus angeregt und die Fluoreszenz aus der Probe ebenfalls von der Oberseite empfangen und daher tritt, wenn die Menge der Probe klein ist, ein Verlust im anregenden Licht und der Fluoreszenz aus der Probe in der Luftschicht zwischen der Probe und der Spitze der optischen Fasern auf. Das Verfahren wird damit durch die Notwendigkeit einer Ersetzung des Probenbehälters von Zeit zu Zeit, abhängig von dem Volumen der Probe, um dieses Problem zu überwinden, verkompliziert, weshalb eine diesbezügliche Verbesserung angebracht ist.
EP-A-0516274 offenbart ein mehrkanaliges optisches Meßsystem, in welchem Licht von nur einer Lichtquelle über eine Kondensatorlinse und eine Mehrfachfaseranordnung und Mehrfachbündel großer optischer Fasern entnommen wird, um Licht auf eine biologische Zellenproben enthaltende Glasmeßküvetten zu projizieren. Demzufolge wird eine Vielzahl von Küvetten von nur einer einzigen Lichtquelle bestrahlt.
Photodioden sind um die Seiten der Küvette in rechten Winkeln zu der optischen Achse der Bündel der optischen Fasern angeordnet. Diese Photodioden 8 sind so angeordnet, daß sie das fluoreszente und übertragene Licht detektieren.
EP-A-0127286 offenbart ein temperaturgesteuertes Bad, durch welches Küvetten 10 hindurchgeführt werden, aber die Inhalte der Küvette nicht direkt bestrahlt oder gemessen werden. Optische Fasern 36 und 42 werden verwendet, um Licht dem System zuzuführen und um aus dem System austretendes Licht zu detektieren, wobei die faseroptischen Kabel nicht auf die Böden der Küvetten gerichtet sind.
Fig. 1 ist eine Zeichnung, welche den Aufbau einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
Fig. 2 ist eine Zeichnung, welche die Umgebung des Behälterhalters der Vorrichtung in Fig. 1 darstellt;
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, welches die Ergebnisse von Beispiel 1 darstellt, wobei die Fluoreszenzintensität während des PCR-Zyklusses für verschiedene Konzentrationen von λ-DNA über der vertikalen Achse aufgetragen ist, und die Anzahl von PCR-Zyklen über der horizontalen Achse aufgetragen ist. In der Figur stellt "a" einen Fall dar, in welchem die Menge an DNA 2,5 ng ist, "b" ein Fall, in welchem sie 0,25 ng ist, und "c" einen Fall, in welchem sie 0,025 ng ist.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Ergebnisse von Beispiel 2 darstellt, wobei die Fluoreszenzintensität einer bei Vorhandensein eines Interkalatfluoreszenzpigments durchgeführten PCR über der vertikalen Achse aufgetragen ist, welche die Temperaturen der Probe zum Zeitpunkt der Messung der Fluoreszenzintensität auf der rechten Seite angezeigt, und die Zeit über der horizontalen Achse aufgetragen ist.
Wir, die vorliegenden Erfinder, haben als Ergebnis intensiver Forschung welche zur Überwindung der vorgenannten Probleme durchgeführt wurde, erfolgreich die vorliegende Erfindung vollbracht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Messung der Fluoreszenz aus einer Probe einer Nukleinsäure mit einem Interkalatfluoreszenzpigment in einer PCR- Reaktion dadurch gekennzeichnet, daß sich die Detektion des PCR-Zyklusses mittels einer Veränderung der Temperatur der Probe und einer Bestrahlung der Probe synchron zu der Veränderung in dem PCR-Zyklus und Messung der Fluoreszenz der Probe während der Bestrahlung umfaßt, wobei die Synchronisation durch die Verwendung einer Berechnungseinrichtung erzielt wird, welches das Öffnen und Schließen eines lichtunterbrechenden Verschlusses (4) so steuert, daß die Probe mit Anregungslicht nur zu dem Zeitpunkt der Messung der Fluoreszenz bestrahlt wird.
Bevorzugt erfolgt die Messung der Fluoreszenz zum selben Zeitpunkt in jedem PCR- Zyklus, in welchem eine Messung durchgeführt wird. Bevorzugter wird die Messung während der letzten Sekunde der Anreicherungsreaktion in dem PCR-Zyklus durchgeführt.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf eine Fluoreszenzdetektionsvorrichtung, welche einen Probenbehälter, welcher eine Probe enthält, einen Behälterhalter, welcher den Probenbehälter hält und in der Lage ist, die Temperatur der Probe in dem Probenbehälter, welcher er enthält zu verändern, einen Fluoreszenzdetektor zum Messen der Fluoreszenz aus der Probe und eine Lichtquelle umfaßt, welche ein Anregungslicht aussendet, um die Probe zur Fluoreszenz anzuregen, wobei die Lichtquelle und der Behälterhalter, und der Behälterhalter und der Fluoreszenzdetektor jeweils optisch über optische Fasern verbunden sind; und
die optischen Fasern in dem Behälter in einer solchen Weise angeordnet sind, daß die Probe in dem Behälter zur Fluoreszenz von unterhalb des von dem Behälterhalter gehaltenen Probenbehälters aus angeregt wird, und daß die optischen Fasern das fluoreszente Licht, welches von der Probe emittiert wird, von unten aus dem Probenbehälter empfängt, dadurch gekennzeichnet, daß:
wenigstens ein Licht-Unterbrechungsverschluß in dem optischen Pfad des zur Anregung der Probe zur Fluoreszenz verwendeten Anregungslichtes angeordnet ist, welcher von der Lichtquelle zu dem Behälterhalter verläuft,
und daß die Probe eine Probe eines Interkalatfluoreszenzpigments in einer Nukleinsäure in einer PCR-Reaktion ist,
und daß der Verschluß von einer Berechnungseinrichtung gesteuert wird, welche die Veränderung in der Temperatur des Behälterhalters und somit des PCR-Zyklusses detektiert,
wobei die Berechnungseinrichtung das Öffnen und Schließen des Licht- Unterbrechungsverschlusses synchron zu der Veränderung in der Temperatur des Behälterhalters steuert, und
die Berechnungseinrichtung eine Messung der Fluoreszenz bewirkt, wenn der Verschluß offen ist,
wodurch die Probe mit Anregungslicht nur zu dem Zeitpunkt der Messung der Fluoreszenz bestrahlt wird.
Der Probenbehälter zum Halten der Probe kann jede beliebige Form aufweisen, um aber die Probe vom Boden des Behälters aus zu bestrahlen und um die Fluoreszenz der Probe vom Boden des Behälters aus zu empfangen, wird ein Behälter verwendet, bei dem wenigstens der Boden lichtdurchlässig ist. In Reaktionssystemen, wie z. B. der PCR, in welcher die Gefahr einer Infektion vom viralen Nukleinsäuen usw. besteht, und die leichteste Kontamination zwischen zwei oder mehr Proben zu einem großen experimentellen Fehler führt, ist es zu bevorzugen, einen verschließbaren Reaktionsbehälter zu verwenden und die Proben dem Detektor unter verschlossenen Bedingungen zuzuführen. Ein Beispiel eines verschließbaren Probenbehälters ist einen im Handel erhältliches Zentrifugenröhrchen (z. B. ein Eppendorf Mikrozentrifugenröhrchen, usw.). Ferner gibt es keine spezifische Einschränkung bezüglich des Materials, unter der Voraussetzung, daß es die vorstehend beschriebenen Bedingungen erfüllt.
Der zum Halten des Probenbehälters verwendete Behälterhalter hat eine Funktion der Veränderung der Temperatur der Probe, und dient auch zum Haften des Behälters. Er kann beispielsweise in der Form eines Behälterhalters vorliegen, der so geformt ist, daß er den verwendeten Behälter angepaßt ist oder beispielsweise in der Form eines großen Kastens aufgebaut ist, wobei der Behälter einfach darin plaziert werden kann.
Wenn der Behälterhalter in der Form eines Behälterhalters aufgebaut ist, welcher zur Aufnahme des Behälters geformt ist, kann er so aufgebaut sein, daß eine Veränderung in der Temperatur der Proben beispielsweise erreicht werden kann, indem die Temperatur des Behälterhalters selbst verändert wird, um die Temperatur des Probenbehälters zu verändern, und somit die Temperatur der Probe in dem Probenbehälter. In diesem Falle sind der Behälterhalter und der Probenbehälter bevorzugt aus einem sehr gut wärmeleitenden Material aufgebaut. Ein Beispiel, welches erwähnt werden kann, ist eine Heizvorrichtung usw., die an der Kontaktoberfläche des Behälterhalters mit dem Behälter in einer Position angeordnet ist, welche nicht die Anregung oder den Empfang des fluoreszenten Lichtes stört. Wenn der Behälterhalter in der Form einer großen Kastens aufgebaut ist, kann dann die Temperatur der Probe darin durch den Einbau einer Heizung darin, die Erzeugung eines Kühlmittelkreislaufs oder durch eine Luft-Konditionierung oder ein Flüssigkeitsbad usw. variiert werden. Zusätzlich zu diesen kann eine Vielzahl anderer Verfahren angewendet werden, um die Temperatur der Probe gemäß der vorliegenden Erfindung zu verändern. Da kein Bedarf für die Erwärmung besteht, wenn die Temperatur der Probe innerhalb eines Temperaturbereichs von beispielsweise der Raumtemperatur oder darunter verwendet wird, kann in derartigen Fällen nur eine Kühlvorrichtung vorgesehen werden. Somit wird der Behälterhalter bevorzugt unter Berücksichtigung des gewünschten Variierungsbereiches der Probentemperatur aufgebaut.
Der Fluoreszenzdetektor kann einer sein, welcher in der Lage ist, die Fluoreszenz aus einer Probe zu messen. Hier umfaßt "Fluoreszenz" die Fluoreszenzintensität, das Fluoreszenzspektrum usw., und diese können mittels eines Photovervielfachers oder einer Photodiode gemessen werden.
Die zu verwendende Lichtquelle kann eine Xenonlampe, eine D2-Lampe, eine Quecksilberlampe, eine Halogenlampe, eine Entladungsröhre, Laserlicht oder dergleichen sein. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden optische Fasern sowohl zur Zuführung des Anregungslichtes aus der Lichtquelle zu der Probe, als auch zur Führung des fluoreszenten Lichtes von der Probe zu der Detektionsvorrichtung verwendet. Dieses schließt jedoch keinen Aufbau aus, in welcher beispielsweise gemeinsame optische Teile, wie z. B. Linsen oder Spiegel in der Nähe der Lichtquelle zusätzlich zu den optischen Fasern verwendet werden und das dadurch fokussierte Lieht zu den optischen Fasern geleitet wird.
Zwei Systeme optischer Fasern werden verwendet, eines zum Zuführen des Anregungslichtes zu der Probe und das andere zum Führen des fluoreszenten Lichtes von der Probe zu dem Fluoreszenzdetektor. Durch die Verwendung beispielsweise eines dichroitischen Spiegels oder dergleichen, können die vorstehend erwähnten zwei Systeme auch durch nur eine optische Faser (eine Leitung) bereit gestellt werden. Die Enden der optischen Fasern jedes Systems sind direkt mit der Lichtquelle, bzw. dem Fluoreszenzdetektor über die vorstehend erwähnten optischen Teile, oder falls notwendig über einen Lichtverstärker usw. verbunden. Wenn die zwei Systeme durch nur eine einzige optische Faserleitung bereit gestellt werden, wird dann ein optisches Hilfssystem daran befestigt, um an dem dichroitischen Spiegel, welcher an einem Ende zu der Lichtquelle oder dem Detektor angeordnet ist, verzweigtes Licht zu führen. Das andere Ende der optischen Faserleitung ist mit dem Behälterhalter so verbunden, daß das Anregungslicht auf die Probe von der Unterseite des von dem Behälterhalter gehaltenen Probenbehälters aus aufgestrahlt wird und so, daß die Fluoreszenz aus der Probe von unterhalb des Probenbehälters aus empfangen wird. Beispielsweise können, wenn der Behälterhalter in der Form eines Halters vorliegt, welcher zur Aufnahme des Behälters zur Aufnahme geformt ist, die Fasern so verbunden sein, daß sie eine Durchtrittsöffnung an ihrem konkaven Abschnitt bereit stellen, aber um eine hoch genaue und wiederholbare Messung von kleinen Probenmengen zu ermöglichen, sind sie bevorzugt mit dem tiefsten Bereich des konkaven Abschnittes verbunden.
Das Ende der optischen Faserleitung zur Führung des Anregungslichtes und das eine für den Empfang des fluoreszenten Lichtes können getrennt mit dem Behälterhalter verbunden sein. Beispielsweise können die Achsen der Enden der Anregungslichtstrahlungsfasern und der Fluoreszenzlichtempfangsfasern parallel zueinander oder konvergierend zueinander angeordnet sein. Für eine genauere und wiederholbare Messung der Fluoreszenz gemäß der vorliegenden Erfindung ist es zu bevorzugen, die Enden der zwei Systeme nahe beieinander aufzubauen, und es ist insbesondere zu bevorzugen, die Enden unter Verwendung von Fasern mit zwei koaxialen Systemen aufzubauen. Wenn die Enden unter Verwendung von Fasern von zwei koaxialen Systemen aufgebaut werden, ist es zu bevorzugen, die Enden der Fasern für den Empfang des fluoreszenten Lichtes aus der Probe auf der Außenseite und die Enden der optischen Fasern für die Zuführung des Anregungslichtes in der Mitte zu positionieren, da dieses den Empfang einer schwächeren Fluoreszenz erlaubt. Wie vorstehend erwähnt, kann, wenn die zwei Systeme durch nur eine einzige optische Faserleitung bereit gestellt werden, dann das Ende der Faserleitung einfach mit dem Behälterhalter verbunden werden.
Der Licht-Unterbrechungsverschluß ist in dem optischen Pfad, welcher von der Lichtquelle zu dem Behälterhalter verläuft, vorgesehen, aber die einfachste Konstruktion ist eine, in welcher ein beweglicher Verschluß zwischen den Enden der optischen Fasern und der Lichtquelle aufgebaut ist, und der Verschluß mechanisch oder elektrisch zum Öffnen und Schließen synchron zu dem Zeitpunkt der Messung der Fluoreszenz bewegt wird. Dieser Zeitpunkt kann beispielsweise die Zeit sein, an welcher die Temperatur des Behälterhalters in einen gewünschten Bereich fällt (d. h. die Zeit, bei welcher die Probe in der Behälterhalter als in dem gewünschten Bereich liegend betrachtet wird).
Eine derartige Prozedur ist besonders effektiv, wenn eine kontinuierliche (intermittierende) Detektion der Fluoreszenz aus zwei identischen Proben durchgeführt wird, in der Fluoreszenzmessung in PCRs, wie sie in der japanischen Patentanmeldung Hei 3- 313616 beschrieben ist.
Die Variation der Temperatur des Behälterhalters zum Variieren der Probentemperatur kann innerhalb eines bestimmten Bereichs bewirkt ausgeführt, und dieser kann in einem Programm gespeichert sein, und eine Steuerung, für die Steuerung der Temperatur des Behälterhalters kann in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingebaut sein. Die Steuerung kann einen Sensor zum Erfassen der Temperatur des Behälterhalters und eine Einrichtung zum Speichern des vorstehend erwähnten Programms enthalten, und kann das Signal aus dem vorstehend erwähnten Sensor und die Inhalte des Programms vergleichen, eine Anzeige zum Heizen oder Kühlen des Behälterhalters ausgeben und diese Aufgabe kann unter Verwendung eines Mikrocomputers oder dergleichen gelöst werden. In der vorliegenden Erfindung hat die Steuerung die Funktion, den Detektor, die Lichtquelle und den Verschluß der vorliegenden Erfindung zu steuern, und dieses ergibt eine automatische Fluoreszenzdetektionsvorrichtung, welche die Temperatur der Probe variiert, wenn der Probenbehälter in dem Behälterhalter plaziert ist, und welcher die Fluoreszenz durch Öffnen und Schließen des Verschlusses abhängig vom Zeitablauf messen kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird in PCRs verwendet. Es wird insbesondere bevorzugt, daß der vorstehend erwähnte Probenbehälter verschlossen ist. Die PCR ist eine Reaktion, welche die Nukleinsäure in einer Probe amplifiziert und für den Zweck der Verhinderung einer sekundären Kontamination, ist eine Fluoreszenzdetektionsvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, welche einen verschlossenen Probenbehälter verwendet, am effektivsten. Dieses beruht darauf, da es bei Verwendung eines verschlossenen Behälters möglich ist, ein Minimum an Kontamination von Nukleinsäuren durch andere Proben zu erreichen, welche Grund für eine falsch positive Anzeige in PCRs ist.
In der meisten PCRs ist der Abschluß nicht nach nur einer Prozedur erreicht. Dieses beruht darauf, weil die Trennung von Doppelstrangnukleinsäuren in Einzelstrangnukleinsäuren durch Variieren der Temperatur der Probe, Anbindung eines Primers an jede von den Einzeltrangnukleinsäuren, und die Anreicherungsreaktion der Nukleinsäuren, ausgehend von dem Primer, was zu dem Auftreten von Doppelstrangnukleinsäuren führt) als ein Zyklus durchgeführt werden, und der Zyklus üblicherweise wiederholt wird. Daher ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung, welche für PCRs geeignet ist, mit dem vorstehend erwähnten Verschluß ausgestattet.
Da der vorstehend erwähnte Zyklus wiederholt wird, ist die Temperaturvariation des Behälterhalters tatsächlich die Variation zwischen der Temperatur, bei welcher die Nukleinsäuren in Doppelstrangform existieren können (wenn die untersuchte Nukleinsäure doppelsträngig ist, wird dieser Temperaturbereich zu Beginn des vorstehend erwähnten Zyklus angelegt, zu dem Zeitpunkt der Anreicherung des Primers, und bei dem Auftreten der Doppelstrang-Nukleinsäure, welches sich aus der vorstehend erwähnten Anreicherung ergibt) und der Temperatur, bei welcher sie nur in Einstrangform existieren können (dieser Temperaturbereich wird für die Aufteilung der Doppelstrangnukleinsäure in Einzelstränge angelegt).
Bei Nukleinsäuren und Interkalatfluoreszenzpigmente beinhaltenden Reaktionen variieren die Eigenschaften der Fluoreszenzpigmente selbst in einer temperaturabhängigen Art und somit ist der Zeitpunkt der Variation der Temperatur einer Probe in einer PCR und das Öffnen und Schließen des vorstehend erwähnten Verschlusses bevorzugt so, daß die Messung in einem Stadium durchgeführt wird, in welchem eine feste Temperatur nach Abschluß einer Reihe von Temperaturvariationen erreicht wurde, statt während der Variation der Temperatur. Ferner kann in dieser Reaktion, da ein Fluoreszenzpigment in der Nukleinsäure-Anreicherungsreaktion, welche mit einem Primer entsteht, aufgenommen wird, und deren Fluoreszenzeigenschaften variieren, die Reaktion überwacht werden, um zu ermitteln, ob die PCR erfolgreich ist (Japanische Patentanmeldung Hei 3-313616); hier kann jedoch der Temperaturbereich ebensogut einer sein, in welchem die Nukleinsäuren in Doppelstrangform existieren können, und es ist ein Zeitpunkt, welcher eine feste Temperatur im Inneren des Probenbehälters aufrecht erhält, zu bevorzugen. Konkret gesagt, ist dies der Moment des Abschlusses des vorstehend erwähnten Zyklusses.
Eine Erläuterung der vorliegenden Erfindung erfolgt nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen. Fig. 1 ist eine Zeichnung, welche den gesamten Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung darstellt. 1 repräsentiert einen Behälterhalter für das Halten eines Probenbehälters, welcher mit einer Vielzahl konkaver Abschnitte zum Halten der Behälter, um eine Messung einer Vielzahl von Proben zu ermöglichen und mit optischen Fasern 5 an jedem konkaven Abschnitt versehen ist. 2 repräsentiert einen Fluoreszenzdetektor, 3 eine Lichtquelle, 4 einen Verschluß, 5 optische Fasern und 6 eine Steuerung. Fig. 1 stellt einen Fall dar, in welchem die Endoberflächen der optischen Fasern zur Ausstrahlung von Anregungslicht und Endoberflächen der optischen Fasern für den Empfang von fluoreszentem Licht koaxial angeordnet sind. Ferner ist in dieser Ausführungsform die verwendete Steuerung ein Mikrocomputer und dieser steuert den Behälterhalter, den Fluoreszenzdetektor, die Lichtquelle und den Verschluß.
Die Temperatur des Behälterhalters wird gemäß dem in der Steuerung gespeicherten Temperaturvariationsprogramm variiert, um die Temperatur der Probe in dem (nicht dargestellten) Probenbehälter zu variieren. Die Lichtquelle wird synchron zu dem Zeitablauf der Messung der Fluoreszenz gesteuert. Die Steuerung öffnet und schließt den Verschluß gemäß einem vorgeschriebenen Zeitablauf, welcher dem Signal aus einem (nicht dargestellten) Temperatursensor folgt und regt somit die Probe an und ermöglicht die Messung der Fluoreszenz durch den Fluoreszenzdetektor. In dieser Vorrichtung können die Meßergebnisse des Fluoreszenzdetektors von der Steuerung eingelesen und später dargestellt werden.
Fig. 2 ist eine Zeichnung, welche die Umgebung des Behälterhalters der in Fig. 1 erläuterten Vorrichtung darstellt. 7 repräsentiert einen versiegelten Probenbehälter, 8 eine Probe in dem Behälter, 9 einen Behälterhalter aus Aluminium, welcher den Probenbehälter hält (nur einer von der Vielzahl der konkaven Abschnitte ist dargestellt), 10 einen O-Ring und 11 eine Schraube, welche die optischen Fasern mit dem Behälterhalter verbindet. In dieser Ausführungsform sind 48 Fasern miteinander gebündelt und um den Umfang herum angeordnet, wobei 12 für die Ausstrahlung des Anregungslichtes in der Mitte des Bündels und die restlichen 36 für den Empfang des fluoreszenten Lichtes an der Außenseite des Bündels angeordnet sind.

Beispiele

Es werden nun Beispiele gegeben, um die erfindungsgemäße Vorrichtung und Messung der Fluoreszenz unter Verwendung dieser darzustellen, ohne jedoch die vorliegende Erfindung darauf einzuschränken.

Beispiel 1

Unter Verwendung eines im Handel erhältlichen DNA-Synthesebaukastens (GeneAmp, Handelsbezeichnung, Produkt von Takara Brewing Co.) und der in Fig. 1 und 2 dargestellten Vorrichtung wurde eine Amplifikation von Nukleinsäuren unter Verwendung der PCR (1 Zyklus = Denaturation bei 94ºC für eine Minute, Anlagerung bei 55ºC für eine Minute, Anreicherung bei 72ºC für eine Minute (unter Verwendung einer Taq- Polymerase) durchgeführt, und 30 Zyklen wurden bei Vorhandensein eines Interkalatfluoreszenzpigments (Pigment 23258, Produkt der Hoechst AG) wiederholt. Die Reaktionslösung für die PCR wurde unter Verwendung einer Kalibrierungs-λ-DNA und eines Satzes eines in dem Baukasten enthaltenen Primers und unter Beachtung der Anweisungen für den Baukasten hergestellt. Das Fluoreszenzpigment wurde in einer Konzentration von 1 ug/ml zugesetzt. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung ist nachstehend aufgelistet:
-λ-DNA (1 ug, 0,1 ug oder 0,01 ug/ml) 10 ul
10 · Reaktionspufferlösung 10 ul
(Natriumchlorid 0,5 M)
(Tris-HCl-Pufferlösung) (pH 8,0) 0,1 M)
Magnesiumchlorid 15 mM)
(Gelatine (Gewicht/Volumen) 0,01%)
Interkalatfluoreszenzpigment (Endkonzentration) 1 ug/ml
Primer 1 und Primer 2 (20 uM) 1 ul
(Primer 1: λ-DNA entsprechend 7131-7155, Antisense-Strang GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG) Primer 2: λ-DNA entsprechend 7607-7630, Sense-Strang GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC) dNTP-Gemisch (2,5 mM ea) 8 ul
Wasser 59,5 ul
Taq-Polymerase (5 Einheiten/ul) 0,5 ul
In der in Fig. 1 und 2 dargestellten Vorrichtung werden optische Fasern (Superseca, Produkt von Mitsubishi Rayon), eine Steuerung (DCP 200, Produkt von Yamatake Honeywell) und eine Lichtquelle (50 Watt Xenonlampe; Lichtversorgungsquelle: Modell C2576, beide Produkte von Hamamatsu Photonics) verwendet, und der Verschluß und der Fluoreszenzdetektor wurden im Hause hergestellt.
Für die in der vorstehenden Weise hergestellten drei unterschiedlichen Proben mit unterschiedlichen Anfangs λ-DNA-Konzentrationen wurden jeweils 25 ui jeder Reaktionslösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen (Produkt von Biobic) abgefüllt, Mineralöl über deren Oberfläche aufgebracht, um eine Verdampfung der Probe zu vermeiden, welche in einem Aluminiumblock gelagert wurden, und die PCR wurde unter Anhebung und Absenkung der Temperatur durchgeführt. Das Anregungslicht aus der Xenonlampen- Lichtquelle wurde nach dem Passieren ein U350 Farbglasfilter mit einer Linse fokussiert, auf die optischen Fasern gerichtet, und von Boden des Probenbehälters auf die Probe gestrahlt. Die Fluoreszenz aus der Probe wurde durch die optischen Fasern am Boden des Reaktionsbehälters erfaßt und das Licht, welches ein 400-450 nm Interferenzfilter passierte, wurde mit dem im Hause hergestellten Fluoreszenzdetektor gemessen, welcher eine Photodiode enthielt. Die Messung der Fluoreszenz wurde während der letzten Sekunde der Anreicherungsreaktion des vorstehend erwähnten Reaktionszyklusses vorgenommen.
Das sich ergebende Meßergebnis der Variation der Fluoreszenz während der PCR war wie in Fig. 3 dargestellt. In Fig. 3 ist die Fluoreszenzintensität während des PCR- Zyklusses für jede Konzentration der λ-DNA über der vertikalen Achse aufgetragen und die Anzahl von Zyklen ist über der horizontalen Achse aufgetragen, und aus dieser graphischen Darstellung ist klar, daß die Anzahl für eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität von der Konzentration der Probe abhängt; d. h., es wurden drei Kurven mit unterschiedlichen Zunahmepunkten abhängig von der Anfangsmenge der DNA in der Probe erhalten.

Beispiel 2

Von einer λ-DNA, welche mit EcoT14l ausgelaugt worden war, wurde 1 ug in 25 ul in einer Pufferlösung (50 mM NaCl, 1 ug/ml eines Interkalatfluoreszenzpigments (33258 Produkt der Hoechst AG), 10 mM Tris-HCl, pH 8,5) suspendiert, die Suspension in einem 25 ul Mikrozentrifugenröhrchen (Produkt von Biobic) plaziert, und die Fluoreszenzintensität unter Verwendung einer Vorrichtung ähnlich der in Beispiel 1 gemessen, mit der Ausnahme, daß koaxiale Fasern (E32-CC200, Produkt von Omron) verwendet wurden. Zum Vergleich wurden die vorstehend erwähnten optischen Fasern an der oberen Öffnung des Mikrozentrifugenröhrchens zur Messung in derselben Weise befestigt. Zu diesem Zweck waren die Enden der an der Flüssigkeitsoberfläche der Probe in dem Zentrifugenröhrchen und an der vorstehend erwähnten Öffnung positionierten optischen Fasern in einem Abstand von 23 mm getrennt.
Die vorstehend erwähnten optischen Fasern bestanden aus einer Faser von 1 mm Durchmesser in der Mitte und 16 Leitungen aus 0,25 mm Fasern um den Umfang, wobei die Mittenfaser für zum Aufstrahlen des Anregungslichtes verwendet wurde und die Umfangsfasern zum Empfangen dies fluoreszenten Lichtes. In dieser Ausführungsform wurde eine 50 Watt Xenonlampe als Lichtquelle verwendet und die Messung wurde mit dem Anregungslicht durchgeführt, welches durch ein U-350 Filter geleitet wurde, und mit dem fluoreszenten Licht, welches durch ein Interferenzfilter (400-450 nm) geleitet wurde.
Demzufolge wurde eine Fluoreszenzintensität von 265 mV mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhalten, während die Fluoreszenzintensität von derselben Probe mit nur 20 mV, oder nur etwa 1/13 im Vergleich gemessen wurde, wenn die optischen Fasern an der oberen Öffnung des Zentrifugenrohres befestigt waren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es, da die Lichtquelle, der Behälterhalter (d. h. die Probe) und der Fluoreszenzdetektor alle über die optischen Fasern verbunden sind, möglich, all diese getrennt so anzuordnen, daß die wärmeemittierende Lichtquelle und der Behälterhalter nicht den Fluoreszenzdetektor beeinträchtigen. Ferner ist eine Multikanalmessung, oder die Zuführung von Anregungslicht aus einer einzigen Lichtquelle an mehrere Proben und die Führung von Fluoreszenz aus einer Vielzahl von Proben zu einem Detektor leicht zu realisieren. Wenn gut photoleitende Fasern verwendet werden, kann der Verlust an Anregungslicht und Fluoreszenzlicht verändert werden und der Lichtstrahl kann selektiv angepaßt werden und somit ist es möglich hochgenaue Messungen, selbst in dem Falle von beispielsweise winzigen Probenmengen usw. durchzuführen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Anregungslicht auf den Probenbehälter bevorzugt am Boden des Probenbehälters aufgestrahlt, und fluoreszentes Licht wird aus dem Probenbehälter bevorzugt am Boden der Probe empfangen, und daher kann die Luftschicht zwischen der Probe und dem Detektor auf einem Minimum gehalten werden. Demzufolge sind hoch genaue Messungen, insbesondere in Fällen möglich, in welchem die Fluoreszenz von winzigen Probenmengen gemessen wird.
Wenn eine erfindungsgemäße Vorrichtung in einer PCR verwendet wird, in welcher ein Interkalatfluoreszenzpigment hinzugefügt wird, und die Fluoreszenzintensität abhängig von einem gewünschten Zeitablauf während jedes Zyklusses gemessen wird, ist es dann möglich, den Fortschritt der Nukleinsäure-Amplifikation, d. h., den Erfolg der PCR aus anhand dieser Messungen zu erkennen. Demzufolge ist es gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls leicht möglich, den Erfolg von PCS zu erkennen, welcher bisher mittels Elektrophorese usw. ermittelt wurde. Dieses bedeutet, daß Abfall in Fällen reduziert werden kann, in welchen die Anfangskonzentration der untersuchten Nukleinsäure hoch ist, und die PCR unbemerkt sogar nach der Sättigung der Amplifikationsreaktion weiterläuft, was zu der Amplifikation nicht-spezifischer Nukleinsäuren führt, und ferner bedeutet, daß der nachfolgende Prozeß der Identifikation der Nukleinsäuren erleichtert werden kann. Wenn die Fluoreszenzeigenschaft bei einer geeigneten Wellenlänge für die PCR gemessen wird, und ein versiegelter Probenbehälter verwendet wird, besteht dann kein Bedarf die Probe aus dem Behälter für die Messung zu entnehmen, und dieses ist sehr effektiv zur Vermeidung einer falschen Positivanzeige, insbesondere in dem Falle von Proben mit einer hohen Wahrscheinlichkeit einer sekundären Kontamination, usw.
Es ist insbesondere vorteilhalft, die Anregung und die Fluoreszenzstrahlung vom Boden des Behälters aus zuzuführen, bzw. zu sammeln, wenn der Behälter einen sich verengenden oder zugespitzten Boden aufweist, da die Probe an dem Boden eines solchen Behälters gesammelt wird, aber sich ein gegebenes Volumen nach oben in dem Röhrchen ausbreitet, und somit die Entfernung der Proben leichter macht.
Es wurde vorstehend erwähnt, daß die Achsen der Enden der Fasern der Anregungslichtstrahlung und Empfangsfasern des Fluoreszenzlichts aufeinander zu laufen können. Dieses Aufeinanderzulaufen kann so sein, daß sich die Achsen innerhalb des Probenbehälters und bevorzugt indem Bereich davon schneiden, wo die Probe bei der Anwendung angeordnet ist, z. B. in der Nähe des Bodens, und wobei die Behälter sich verschmälernde oder zugespitzte Enden bevorzugt innerhalb eines solchen sich verschmälernden oder zuspitzenden Bereichs aufweisen.

Claims

1. Verfahren zum Messen der Fluoreszenz aus einer Probe eines Interkalatfluoreszenzpigments in einer Nukleinsäure in einer PCR-Reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß es die Detektion des PCR-Zyklusses mittels der Veränderung in der Temperatur der Probe und Bestrahlung der Probe synchron zu der Veränderung in dem PCR-Zyklus und eine Messung der Fluoreszenz der Probe während der Bestrahlung umfaßt, wobei die Synchronisation durch die Verwendung einer Berechnungseinrichtung erzielt wird, welcher das Öffnen und Schließen eines Lichtunterbrechenden Verschlusses (4) so steuert, daß die Probe mit dem Anregungslicht nur zu dem Zeitpunkt der Messung der Fluoreszenz bestrahlt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Fluoreszenz zur selben Zeit in jedem PCR-Zyklus durchgeführt wird, in welchem eine Messung durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung während der letzten Sekunde der Anreicherungsreaktion in dem PCR-Zyklus durchgeführt wird.

4. Fluoreszenzdetektionsvorrichtung, welche einen Probenbehälter (7), welcher eine Probe (8) enthält, einen Behälterhalter (9), welcher den Probenbehälter (7) hält und in der Lage ist, die Temperatur der Probe in dem Probenbehälter, welcher er enthält zu verändern, einen Fluoreszenzdetektor(2) zum Messen der Fluoreszenz aus der Probe und eine Lichtquelle (3) umfaßt, welche ein Anregungslicht aussendet, um die Probe zur Fluoreszenz anzuregen, wobei die Lichtquelle (3) und der Behälterhalter (9), und der Behälterhalter (9) und der Fluoreszenzdetektor (2) jeweils optisch über optische Fasern (5) verbunden sind; und

die optischen Fasern (5) in dem Behälter in einer solchen Weise angeordnet sind, daß die Probe (8) in dem Behälter (7) zur Fluoreszenz von unterhalb des von dem Behälterhalter (9) gehaltenen Probenbehälters aus angeregt wird, und daß die optischen Fasern (5) das fluoreszente Licht, welches von der Probe (8) emittiert wird, von unten aus dem Probenbehälter (7) empfängt,

dadurch gekennzeichnet, daß:

wenigstens ein Licht-Unterbrechungsverschluß (4) in dem optischen Pfad des zur Anregung der Probe zur Fluoreszenz verwendeten Anregungslichtes angeordnet ist, welcher von der Lichtquelle (3) zu dem Behälterhalter (9) verläuft,

und daß die Probe eine Probe eines Interkalatfluoreszenzpigments in einer Nukleinsäure in einer PCR-Reaktion ist,

und daß der Verschluß von einer Berechnungseinrichtung gesteuert wird, welche die Veränderung in der Temperatur des Behälterhalters und somit des PCR- Zyklusses detektiert,

wobei die Berechnungseinrichtung das Öffnen und Schließen des Licht- Unterbrechungsverschlusses (4) synchron zu der Veränderung in der Temperatur des Behälterhalters (9) steuert,

und die Berechnungseinrichtung eine Messung der Fluoreszenz bewirkt, wenn der Verschluß offen ist,

wodurch die Probe mit Anregungslicht nur zu dem Zeitpunkt der Messung der Fluoreszenz bestrahlt wird.

5. Fluoreszenzdetektionsvorrichtung nach Anspruch 4, wobei der Probenbehälter (7) ein verschlossener Behälter ist.