DE69326539T2 - Zytotoxische arzneimittel therapie - Google Patents

Zytotoxische arzneimittel therapie

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf potentiell zytotoxische Mittel, die gegen ausgewählte Zellen gerichtet werden können, und befaßt sich insbesondere mit der Wirkung der Mittel in der Verwendung bei der Behandlung von Krebs.
  • Die meisten Formen von Krebs neigen dazu, sich in einem frühen Stadium im Körper auszubreiten, und das ultimative Ziel einer Krebstherapie ist es, die Elimination des Krebses zu erreichen, vorzugsweise ohne schwerwiegende toxische Auswirkungen auf den Wirtsorganismus hervorzurufen. Kombinationen von zytotoxischen Mitteln haben sich zwar als heilend in einem kleinen Bereich von relativ unüblichen Krebsformen erwiesen, aber einzelne Mittel und Kombinationen derselben haben darin versagt, größere therapeutische Erfolge bei den meisten Patienten mit gewöhnlichem Lungen-, Brust-, Dickdarm-, Rektum-, Prostatakrebs und dgl. zu erzielen.
  • Zytotoxische Mittel können wegen ihrer Effekte auf normale Gewebe, in denen eine Zellteilung aktiv ist, so wie beispielsweise blutbildende Gewebe und die Epithele des Verdauungstrakts, nur nach intermittierenden Dosisplänen verabreicht werden. Der verbleibende Zeitraum zwischen den Behandlungen, der notwendig ist, um eine Erholung dieser normalen Gewebe von den Effekten der zytotoxischen Substanzen zu erlauben, ist tendenziell von viel größerer Dauer als der Zeitraum der Verabreichung der zytotoxischen Mittel.
  • Substanzen, die in Zellteilung befindlich sind, sind die üblichsten Ziele für zytotoxische Mittel und darunter sind Substanzen, die in die Synthese von Nukleotiden, den Basiskom ponenten von DNA und RNA, verwickelt sind. Die Enzyme Ribunukleotidreduktase, Dihydrofolatreduktase und Thymidinsynthase sind typische Ziele. Das Enzym Dihydrofolatreduktase wirkt auf einen Nahrungsmittelfaktor, Folsäure, um das aktive Co-Enzym 5,10-Methenyltetrahydrofolat zu erzeugen. Das Co-Enzym ist erforderlich für einen Kohlenstofftransfer bei den verschiedenen Synthesen, einschließlich derjenigen von Pyrimidin, das für die DNA-Synthese benötigt wird. Das weit verwendete Arzneimittel Methotrexat (2,4-Diamin-N¹&sup0;-methylpteroylglutaminsäure) wirkt durch starkes Anbinden an die Hydrofolatreduktase, was die Neuerzeugung von aktivem Tetrahydrofolat verhindert und so die DNA-Synthese unterbricht und zum Tod der Zellen führt, die die S-Phase des Zellzyklus erreichen, in welcher die DNA-dubliziert wird. Methotrexat ist allgemein verfügbar, beispielsweise von Cyanamid Inc.
  • Das Arzneimittel Trimetrexat (NSC 352122; 2,4-Diamin-5-methyl-6- [3,4,5-trimethoxyanilinmethyl]quinazolin) wirkt ebenfalls durch Bindung an Dihydrofolatreduktase, aber währen Methotrexat in die Zellen über die Folatrezeptoren eindringt, dringt Trimetrexat über alternative Mechanismen ein. Die Synthese von Trimetrexat ist offenbart durch Baker (1967) in Design of site-directed irreversible enzyme inhibitors, Wiley, New York, und durch Elslager et al (1974) Lectures in heterocyclic chemistry, Vol. 2, Seiten 97/5-133 (Castle & Townsend, Herausgeber), Hetero Corp, Oren, Utah. Trimetrexat ist allgemein erhältlich von US Biosciences, One Tower Bridge, 100 Front Street, Suite 400, West Conshohocken, PA 19428, USA.
  • Methotrexat ähnelt natürlichen Folaten, indem es einen endseitigen Glutaminsäureanteil aufweist, der durch Carboxypeptidase G2 gespalten werden kann, während Trimetrexat von der Wirkung dieses Enzyms unbeeinflußt bleibt (Bagshawe (1985) Clinical Radiol. 36, 545-551). Wir haben kürzlich berichtet, daß die Wirkung von Trimetrexat auf Dickdarmkrebszellen in vitro durch die Zugabe eines Folat abbauenden Enzyms Carboxypeptidase G2 gesteigert werden kann (Searle et al (1990) Biochemical Pharmacol. 39, 1787-1791). Wir haben auch gezeigt, daß dieses Enzym seine Aktivität beibehält, wenn es an Antikörper oder Antikörperfragmente konjugiert wird (Searle et al (1988) Bact. J. Cancer 53, 377-384).
  • Der biologische Effekt sowohl von Methotrexat als auch von Trimetrexat kann durch Verabreichen eines Endprodukts der von Ihnen blockierten Reaktion oder durch ein einfacher verfügbares Anologon, das als Folinsäure [5-Formyltetrahydrofolinsäure] bekannt ist, umgekehrt werden. Folinsäure ist breit verfügbar, zum Beispiel als Leucovorin von Cyanamid Inc., aber auch von Wellcome Inc. und Farmitalia. Falls Folinsäure in ausreichender Dosierung gleichzeitig mit Methotrexat oder Trimetrexat verabreicht wird, sind deren Wirkungen blockiert. Es ist als nützlich bei der Behandlung von einigen Krebsarten herausgefunden worden, Folinsäure in Verbindung mit Methotrexat in sorgfältig zeitlich abgestimmten und Dosis-kontrollierten Abfolgen zu verwenden. Die Methotrexat-Folinsäure-Kombination kann das therapeutische Verhältnis im Vergleich mit nur Methotrexat für bestimmte Krebsarten verbessern und ist gemeinhin als "Rettungs"-Therapie bekannt. Es scheint von der Fähigkeit von Folinsäure abhängig zu sein, normale clonogene Zellen schneller zu retten als einige Krebszellen. Ein Beispiel ist die erfolgreiche Verwendung von Methotrexat und Folinsäure bei der Behandlung einiger trophoblastischer Tumore (Bagshawe et al (1989) Brit. J. Ob. & Gynaecol.). Dieser Ansatz hat sich jedoch nur bei einem begrenzten Bereich von Krebsarten als sinnvoll erwiesen, und es scheint naheliegend zu sein, daß die Zeit x Konzentration von Folinsäure, die notwendig ist, um normale Zellen zu schützen, auch einige Krebszellen vor der Wirkung des anti-Folats schützt.
  • Darüberhinaus erfordert die Verwendung von Folinsäure in dieser Weise immer noch die intermittierende Verabreichung von Methotrexat (MTX), während es vorteilhaft wäre, das MTX gleichmäßiger über einen ausgedehnten Zeitraum zu geben, da es sich gezeigt hat, daß die Dauer der Wirkung der anti-Folate den Grad der erreichten Zytotoxizität bestimmt. Ähnliche Überlegungen treffen auf andere zytotoxische Arzneimittel zu.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Verbindung, bereit, die einen Targetzellen-spezifischen Bereich und einen inaktivierenden Bereich aufweist, der fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist, wobei (a) die Substanz Thymidin oder ein Analogon davon ist, das fähig ist, die Wirkung eines zytotoxische Mittels, welches auf die Enzym-Thymidylat-Synthetase einwirkt, zu beeinflussen, oder (b) die Substanz Uridin ist, oder (c) der inaktivierende Bereich (1) einen Targetzellen-spezifischen Promotor und (2) ein DNA-Segment aufweist, welches ein Polypeptid codiert, das fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein therapeutisches System bereit, das eine Verbindung mit einem Targetzellen- spezifischen Bereich und einem inaktivierenden Bereich aufweist, der fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist, und eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung des zytotoxischen Mittels zu inhibieren, und welche von dem inaktivierbaren Bereich in eine Substanz umwandelbar ist, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist.
  • Der inaktivierende Bereich kann direkt oder indirekt inaktivierend sein.
  • Mit "direkt inaktivierend" meinen wir, daß der Bereich selbst in der Lage ist, die Substanz zu inaktivieren, beispielsweise durch Anbinden an sie oder sie Umwandeln in eine inaktive Form.
  • Mit "indirekt inaktivierend" meinen wir, daß das Heranbringen des Bereichs an die Targetzelle in eine Inaktivierung des zytotoxischen Mittels resultiert. Zum Beispiel kann der Bereich eine Nukleinsäure, entweder DNA oder RNA, sein, die ein Polypeptid codiert, welches in der Lage ist, die Substanz zu inaktivieren, beispielsweise durch Anbinden an sie oder durch ihr Umwandeln in eine inaktive Form.
  • Das Polypeptid kann intrazellulär ausgebildet werden, es kann auf der Zelloberfläche ausgebildet werden, oder es kann von der Zelle sekretiert werden. Mit dem Begriff "Polypeptid" schließen wir Proteine und Glycoproteine ein.
  • Vorzugsweise ist der inaktivierende Bereich ein enzymatisch aktiver Bereich.
  • Substanzen, die den Effekt eines zytotoxischen Mittels "inhibieren", sind solche, die in einem sinnvollen Umfang die Fähigkeit des zytotoxischen Mittels beseitigen, Targetzellen zu zerstören. Vorzugsweise wird diese Fähigkeit im wesentlichen zu null reduziert. Dementsprechend wird der inaktivierende Bereich eine solche Inhibierung in einem sinnvollen Umfang reduzieren und wird sie vorzugsweise zu im wesentlichen null reduzieren.
  • Die Einheit, die von dem Targetzellen-spezifischen Bereich erkannt wird, kann jede geeignete Einheit sein, die durch Tumorzellen, viralinfizierte Zellen, pathogene Mikroorganismen, Zellen, die als Teil einer Gentherapie eingeführt wurden, oder normale Zellen des Körpers, die man aus einem bestimmten Grund zu zerstören wünscht, ausgebildet wird. Vorzugsweise sollte die Einheit sollte für den zielgerichteten Bereich in signifikant größeren Konzentrationen in oder an Zellen, die zu zerstören sind, präsent oder zugänglich sein als in jedem normalen Gewebe des Wirts, das nicht funktionell durch andere therapeutische Mittel ersetzt werden kann. Die Verwendung eines Targets, das durch eine Krebszelle ausgebildet wird, würde beispielsweise nicht durch seine gleiche oder größere Ausbildung an einem endokrinen Gewebe oder Organ ausgeschlossen. In lebensrettenden Situationen könnte das Organ geopfert werden, vorausgesetzt, daß seine Funktion entweder nicht lebensnotwendig war, beispielsweise im Fall der Hoden, oder seine Funktion durch eine Hormonersatztherapie geleistet werden könnte. Solche Überlegungen würden zum Beispiel zutreffen auf die Schilddrüse, die Nebenschilddrüse, die Nebennierenrinde und die Eierstöcke.
  • Die Einheit, die erkannt wird, wird oft ein Antigen sein. Tumorassoziierte Antigene verleihen sich selbst die Rolle von Targets für Antikörper, wenn sie an einer Zellmembran ausgedrückt werden oder in eine extratumorzelluläre Flüssigkeit sekretiert werden.
  • Der Begriff "Tumor" ist so zu verstehen, als daß er sich auf alle Formen von neoplastischem Zellwachstum bezieht, einschließlich Tumoren der Lunge, der Leber, der Blutzellen (Leukämien), der Haut, der Pankreas, des Dickdarms, der Prostata, der Gebärmutter oder der Brust.
  • Der Antigen-spezifische Bereich kann ein vollständiger Antikörper (üblicherweise wegen der Bequemlichkeit und Spezifizität ein monoklonaler Antikörper), ein oder mehrere Teile davon (z. B. ein Fab-Fragment oder F(ab')&sub2;) oder ein synthetischer Antikörper oder ein Teil davon sein. Ein Konjugat, das nur einen Teil eines Antikörpers aufweist, kann vorteilhaft sein, weil es die Rate der Entfernung aus dem Blut erhöht und weil es weniger leicht eine nicht-spezifische Bindung aufgrund des Fc-Bereichs erfährt. Geeignete monoklonale Antikörper für ausgewählte Antigene können durch bekannte Techniken präpariert werden, z. B. jene, die offenbart sind in "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) und in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J. G. R. Hurrell (CRC Press, 1982). Bispezifische Antikörper können präpariert werden durch Zellfusion, durch Reassoziation von monovalenten Fragmenten oder durch chemisches Crosslinking zu ganzen Antikörpern, wobei ein Teil des resultierenden bispezifischen Antikörpers gegen das zellspezifische Antigen und der andere gegen das Enzym gerichtet ist. Der bispezifische Antikörper kann gebunden an das Enzym verabreicht werden oder er kann zuerst verabreicht werden gefolgt von dem Enzym. Es ist bevorzugt, daß die bispezifischen Antikörper zuerst verabreicht werden, und daß nach ihrer Anordnung an den Tumorzellen das Enzym verabreicht wird, um von dem an dem Tumor angeordneten Antikörper eingefangen zu werden. Verfahren zur Präparation bispezifischer Antikörper sind offenbart in Corvalan et al (1987) Cancer Immunol. Immunother. 24, 127-132 und 133-137 und 138-143, und Gillsland et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7719-7723.
  • Die variable schwere (VH) und die variable leichte (VL) Domäne des Antikörpers sind in die Antigen-Erkennung verwickelt, ein Faktum, das zuerst durch frühe Proteaseaufschlußexperimente erkannt wurde. Weitere Bestätigung wurde gefunden durch "Humanisation" von Nagetierantikörpern. Variable Domänen von Nagetierursprung können an konstante Domänen humanen Ursprungs angesetzt werden, so daß der resultierende Antikörper die antigenische Spezifizität des vom Nagetier stammenden Antikörpers beibehält (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851- 6855).
  • Daß die antigenische Spezifizität durch variable Domänen bewirkt wird und unabhängig von den konstanten Domänen ist, ist aus Experimenten bekannt, die die bakteriologische Ausbildung von Antikörpern einbeziehen, die alle eine oder mehrere variable Domänen umfassen. Diese Moleküle schließen Fab-artige Moleküle (Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv-Moleküle (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); Einzelketten-Fv-(ScFv)-Moleküle, wobei die VH und VL-Partnerdomänen über ein flexibles Oligopeptid verknüpft sind (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) und Eindomänenantikörper (dAbs), die isolierte V-Domänen aufweisen (Ward et al (1989) Nature 341, 544), ein. Ein genereller Überblick über die Techniken, die an der Synthese von Antikörperfragmenten, die ihre spezifischen Bindungsplätze behalten, beteiligt sind, ist bei Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299 zu finden.
  • Mit "ScFv-Molekülen" meinen wir Moleküle, bei denen die VH- und, die VL-Partnerdomänen über ein flexibles Oligopeptid verknüpft sind.
  • Die Vorteile der Verwendung von Antikörperfragmenten anstelle von ganzen Antikörpern sind unterschiedlicher Art. Die geringere Größe der Fragmente kann zu verbesserten pharmakologischen Eigenschaften führen, so wie beispielsweise der besseren Penetration von festem Gewebe. Effektor-Funktionen von ganzen Antikörpern, so wie beispielsweise das komplementäre Binden, werden entfernt. Fab-, Fv-, ScFv- und dAb-Antikörperfragmente können alle in E. coli ausgebildet und von E. coli sekretiert werden, was die einfache Produktion von großen Mengen dieser Fragmente erlaubt.
  • Ganze Antikörper und F(ab')&sub2;-Fragmente sind "bivalent". Mit "bivalent" meinen wir, daß diese Antikörper und F(ab')&sub2;-Fragmente zwei antigenkombinierende Plätze aufweisen. Im Gegensatz dazu sind Fab-, Fv-, Sc-, Fv- und dAb-Fragmente monovalent, wobei sie nur einen mit einem Antigen kombinierbaren Platz aufweisen. Die Fragmentation von intakten Immunglobulinen, um F(ab')&sub2;-Fragmente herzustellen, ist von Harwood et al (1985) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21, 1515-1522 beschrieben worden.
  • Antikörper der Klasse IgG sind bevorzugt.
  • Alternativ kann die erkannte Einheit antigenisch sein oder sie kann nicht-antigenisch sein, aber in irgendeiner anderen Weise erkannt und selektiv gebunden werden. Zum Beispiel kann sie ein charakteristischer Zelloberflächenrezeptor, so wie beispielsweise der Rezeptor für das Melanozyt-stimmulierende Hormon (MSH), das in großer Anzahl in Melanom-Zellen ausgebildet wird, sein. Der zellspezifische Bereich kann dann eine Verbindung oder ein Teil davon sein, der in einem nicht-Immunsinne spezifisch an die Einheit anbindet, zum Beispiel als ein Substrat oder ein Analogon davon für ein Zelloberflächenenzym oder als ein Messenger.
  • Der viral ausgerichtete Enzym-Prodrug-Therapie-(VDEPT)-Ansatz ist für das selektive Töten von neoplastischen Zellen offenbart worden, indem transkriptionale Unterschiede zwischen normalen und neoplastischen Zellen ausgenutzt werden, um selektiv das Ausbilden von Enzymen anzutreiben, die in der Lage sind, ein Prodrug in ein zytotoxisches Arzneimittel umzuwandeln (Huber et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8039-8043).
  • So mögen analog transkriptionale Unterschiede zwischen normalen und neoplastischen Zellen genutzt werden, um selektiv die Ausbildung eines Enzyms anzutreiben, das in der Lage ist, die hier beschriebenen Inhibitor-Substanzen zu inaktivieren. Es ist bevorzugt, daß das Enzym von der Tumorzelle sekretiert wird, so daß ein freier Zugang zu der zu inaktivierenden Inhibitor- Substanz möglich ist.
  • Ein Unterschied in der Transkription zwischen Zellen kann mit Gewebe-spezifischen Promotoren assoziiert sein oder kann auf Änderungen bei Aktivator- oder Repressor-Molekülen im neoplastischen Stadium beruhen. So können in einem Beispiel transkriptionale Regelsequenzen von Leberassoziiertem Albumin nützlich sein, um die Ausbildung von Inhibitor-inaktivierenden Proteinen anzutreiben, einschließlich von Enzymen bei der Behandlung von Patienten mit hepatozellulären Karzinomen. Größere transkriptionale Unterschiede zwischen normalen und neoplastischen Zellen werden ständig entdeckt, und es ist anzunehmen, daß viele dieser Unterschiede bei den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ausgenutzt werden können.
  • Rekombinante, Replikations-defektive Retroviren, die geeignet sind, die genetischen Konstrukte (d. h., den Promotor puls Gene, die das Inhibitor-inaktivierende Protein codieren) an Targetzellen heranzubringen, sind beschrieben worden (Huber et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8039-8043).
  • So mag ein Virus oder ein anderer Kernproteinpartikel oder ein Liposom einen Targetzellen-spezifischen Bereich bereitstellen, der geeignet ist, den indirekt inaktivierenden Bereich an diese Zelle heranzubringen.
  • Das Inhibitor-inaktivierende Protein kann ein Enzym sein, das in der Lage ist, den Inhibitor in eine inaktive Form umzusetzen, oder es kann ein Protein sein, das in der Lage ist, den Inhibitor zu binden und ihn so zu inaktivieren.
  • Erhebliche Arbeit ist bereits durchgeführt worden bezüglich Antikörpern und Fragmenten davon zu Tumor assoziierten Antigenen und bezüglich Antikörpern und Antikörper-Fragmenten, die gegen karzinoembryonisches Antigen (CEA) gerichtet sind; und Antikörper und deren Fragmente, die gegen menschliches Choriongonadrotropin (hCG) gerichtet sind, können mit Carboxypeptidase G2 konjugiert werden und das resultierende Konjugat behält sowohl Antigen-bindende als auch katalytische Funktionen bei. Im Anschluß an die intravenöse Injektion dieser Konjugate ordnen sie sich selektiv in Tumoren an, die CEA bzw. hCG ausbilden. Von anderen Antikörpern ist bekannt, daß sie sich in Tumoren anordnen, die das entsprechende Antigen ausbilden. Solche Tumore können primärer und metastatischer Kolorektalkrebs (CEA) und Choriokarzinome (hCG) bei humanen Patienten oder andere Formen von Krebs sein. Obwohl sich solche Antikörper- Enzym-Konjugate auch in einigen normalen Geweben anordnen können, die die jeweiligen Antigene ausbilden, ist die Antigenausbildung in normalen Geweben diffuser. Solche Antikörper- Enzym-Konjugate können an Zellmembranen über ihre jeweiligen Antigene gebunden werden oder von Antigenen gefangen werden, die in die Zwischenräume zwischen den Zellen hineinsekretiert wurden.
  • Beispiele von Tumor assoziierten, Immunzellen-assoziierten und auf infektiöse Mittel bezogene Antigene sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 1. Tumor-assoziierte Antigene
  • 1 Hellstöm et al (1986) Cancer Res. 46, 3917-3923
  • 2 Clarke et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 1766-1770
  • Andere Antigene umfassen Alphafötoprotein, Ca-125 und Prostata- spezifisches Antigen. 2. Immunzellenantigene 3. Antigene, die auf infektiöse Mittel bezogen sind
  • Vor der Verabreichung eines Konjugats mit einem Antikörper, der gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichtet ist, kann es vorteilhaft sein, die Ausbildung des Antigens an den Tumorplätzen zu verstärken, da dies die Menge des an den Tumorplätzen festgehaltenen Konjugats vergrößert. Verschiedene Mittel sind dahingehend identifiziert worden, daß sie die Antikörperaufnahme vergrößern, einschl. Tumornekrosefaktor (TNF) (Forsyth et al (1988) Cancer Res. 48, 3607-3612) und Interferone (Borden (1988) J. Nat. Cancer Inst. 80, 148-149).
  • So ist es bevorzugt, daß die Ausbildung des Tumorzellenantigens unter Verwendung irgendeines oder mehrerer Reagenzien vor oder während der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erhöht wird.
  • Die Aufnahme eines Antikörpers, eines Antikörperfragments oder irgendeines Teils davon kann auch mit gefäßbeeinflussenden Mitteln durch Änderungen der Tumordurchblutung oder durch Verändern der kapillaren Permeabilität modifiziert werden. Solche Mittel umfassen Histamin und Interleukin-2 (Hennigan et al (1991) Brit. J. Cancer 64, 872-874), Flavonessigsäure (Bibby et al (1989) J. Natl. Cancer Institute 81, 216-219), aber auch andere Mittel können verwendet werden, um die Tumordurchblutung oder die Kapillarpermeabilität zu ändern, um so eine erhöhte Retention des Enzyms an Tumorplätzen zu favorisieren oder um so die Penetration der Tumorplätze durch das schützende Metabolit zu verhindern.
  • So ist es weiter bevorzugt, daß die Tumordurchblutung unter Verwendung eines oder mehrerer der Reagenzien vor oder während der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung geändert wird.
  • Die Substanz, die in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, kann jede ausreichend nicht-toxische Substanz sein, die in eine Substanz umgewandelt werden kann, die weniger Wirkung auf das zytotoxische Mittel hat. Eine geeignete Verbindung ist Folinsäure. Folinsäure kehrt beispielsweise die biologische Wirkung des zytotoxischen Mittels Trimetrexat um, das auf das Enzym Dihydrofolatreduktase wirkt. Folinsäure wird durch das Enzym Carboxypeptidase G2 und andere deglutamatisierende Enzyme deglutamatisiert und gegen Trimetrexat inaktiv gemacht.
  • Dasselbe Prinzip kann bei anderen anti-zytotoxischen Substanzen angewendet werden. Zum Beispiel blockiert Thymidin den Effekt eines zytotoxischen Mittels, wie beispielsweise CB3717 und ICT D1694 (Jodrell et al 1991, BJC 64, 833-8; Jones et al (1986), J. Med. Chem. 29, 468-472), die auf das Enzym Thymidylatsynthetase wirken. So kann ein thymidinabbauendes Enzym (so wie beispielsweise Dihydrothymindehydrogenase, Shiotani & Weber 1981 J. Biol. Chem. 256, 219-224) oder Thymidinkinase (Shiotani et all (1989) Cancer Res. 49, 1090-1094) als der inaktivierende Bereich der erfindungsgemäßen Verbindung verwendet werden, um das Thymidin gegen das zytotoxische Mittel unwirksam zu machen.
  • Ähnliche Überlegungen beziehen sich auf andere Mittel, die in den normalen Prozesse des Einbaus von Nukleotiden in die DNA oder RNA eingreifen, da diese durch das normale Stoffwechselprodukt, das seinerseits durch ein geeignetes, auf die Tumorplätze gerichtetes Enzym abgebaut werden kann, potentiell umkehrbar sind.
  • Zum Beispiel ist gezeigt worden, daß die zytotoxischen Effekte des weit verwendeten zytotoxischen Fluoruracils (erhältlich von Roche Products Inc.) zumindest teilweise durch Uridin geschwächt werden können (Groeningen et al (1989) J. Natl. Cancer Inst. 81, 157-162). Es folgt daraus, daß die Konjugation eines anti-Tumorantikörpers mit einem Uridin-abbauenden Enzym oder mit Uridinkinase in Verbindung mit 5-Fluorurazil und Uridin verwendet werden kann. Solch eine Kombination wäre insbesondere relevant bei Kolorektal- und Brustkarzinomen, für die 5-Fluorurazil eines der am stärksten wirksamen zytotoxischen Mittel ist. Solch eine Kombination von Mitteln kann weiterhin kombiniert werden mit Folinsäure, die die Zytotoxizität von 5-Fluorurazil verstärkt oder zusätzlich mit Thymidin und einem Thymidin-inaktivierenden Enzym.
  • Der inaktivierende Bereich der Verbindung wird ausgewählt in Bezug auf die anti-zytotoxische Substanz.
  • Andere Enzyme als Carboxypeptidase G2 und ihre Äquivalente können verwendet werden. Sie sollten spezifische für das anvisierte Stoffwechselprodukt sein, sie können aber sowohl von humanem oder nicht humanem Ursprung sein.
  • Es muß nicht notwendigerweise ein konventionelles Enzym verwendet werden. Antikörper mit katalytischer Kapazität sind entwickelt worden (Tramontano et al Science 234, 1566-1570) und sind als "Abzyme" bekannt. Diese haben den potentiellen Vorteil, daß sie in der Lage sind, humanisiert zu werden, um ihre Immunogenität zu reduzieren.
  • Enzyme, die von humanen Lymphozyten erhalten werden und in der Lage sind, Thymidin zu zersetzen, sind offenbart worden (Schiotani et al (1989) Cancer Res. 49, 1090-1094). Eine Dihydrothymindehydrogenase und eine Thymidinkinase können bei dem System des hier offenbarten Typs zur Verwendung in Zusammenhang mit Inhibitoren von Thymidinsynthetase verwendet werden.
  • Thymidinabbauende und phosphorylierende Enzyme können als zusätzliches Element in einer anti-Folattherapie, wie sie hier offenbart wird, verwendet werden durch Blockieren des Thymidinrückgewinnungswegs. Sie können auch in Verbindung mit Uridin-katalysierenden Enzymen verwendet werden, die mit dem zytotoxischen Arzneimittel 5-Fluorurazil verwendet werden.
  • Die bakteriellen Enzyme Carboxypeptidase G1 und G2 (CPG1 und CPG2) bauen Folate, einschließlich Methotrexat, durch Abspaltung der terminalen Glutaminsäure ab. Die Wirkungen dieser beiden Enzyme werden als gleich angesehen. Die folgende Beschreibung der bevorzugten Aspekte dieser Erfindung bezieht sich auf CPG2, ist aber gleicherweise auf CPG1 anwendbar und auf alle anderen Enzyme, die auf dieselben Substrate wirken, und auf Abzyme, die auf dieselben Substrate wirken.
  • Die Isolation, Reinigung und einige Eigenschaften von Carboxypeptidase G2 aus Pseudomonas sp. Stamm RS-16 sind von Sherwood et al (1984) Eur. J. Biochem. 148, 447-453 offenbart worden. Das Klonen des Gens, das die Carboxypeptidase G2 codiert, seine Nukleotidsequenz und seine Expression in E. coli sind von Minton et al (1984) Gene 31, 31-38 und von Minton et al (1983) J. Bacteriol. 156, 1222-1227 offenbart worden. CPG2 ist erhältlich von der Division of Biotechnology, Centre for Applied Microbiological Research, Porton Down, Salisbury, UK. Carboxypeptidase G1 (CPG1) ist von Chabner et a3 (1972) Cancer Res. 32, 2114-2119 beschrieben worden.
  • Wenn der inaktivierende Bereich der Verbindung ein enzymatisch aktiver Bereich ist, ist es wahrscheinlich, daß er isoliert von dem zellspezifischen Bereich enzymatisch sein wird, aber es ist nur nötig, daß er enzymatisch aktiv ist, wenn (a) er in Kombination mit dem zellspezifischen Bereich vorliegt und (b) die Verbindung an der Targetzelle oder in ihrer Nähe anhaftet.
  • Die zwei Bereiche der Verbindung der Erfindung können auf alle üblichen Weisen des Cross-Linkings von Polypeptiden miteinander verknüpft werden, so wie beispielsweise jene, die im allgemeinen in O'Sullivan et al (1979) Anal. Biochem. 100, 100-108 beschrieben sind. Zum Beispiel kann der Antikörperbereich mit Thiol- Gruppen angereichert und der Enzymbereich mit einem bifunktionalen Mittel reagiert werden, das in der Lage ist, mit solchen Thiol-Gruppen zu reagieren, z. B. der N-Hydroxysuccinimidester von Jodessigsäure (NHIA) oder N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyl dithio)propionat (SPDP). Amid- und Thioetherbindungen, beispielsweise erzielt durch m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester, sind im allgemeinen in vivo stabiler als, Disulfidbindungen.
  • Es muß nicht notwendig sein, daß das gesamte Enzym in der erfindungsgemäßen Verbindung vorliegt, aber natürlich muß sein katalytischer Bereich vorhanden sein.
  • Alternativ kann die Verbindung als eine Fusionsverbindung durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, wobei ein DNA- Abschnitt entsprechende Regionen aufweist, die die zwei Bereiche der erfindungsgemäßen Verbindung entweder einander benachbart oder getrennt durch eine Region codieren, die ein Verbindungspeptid, das die gewünschten Eigenschaften der Verbindung nicht zerstört, codiert. Die zwei Bereiche der Verbindung können durchaus ganz oder teilweise überlappen. Die Antikörperkomponente der Fusion muß durch mindestens einen Bindungsplatz wiedergegeben werden. Beispiele für die Konstruktion von Antikörper-(oder Antikörperfragment)-Enzym-Fusionen werden durch Neuberger et al (1984) Nature 312, 604 beschrieben.
  • Die DNA wird dann wird dann in einem geeigneten Wirt expressiert, um ein Polypeptid herzustellen, das die erfindungsgemäße Verbindung aufweist. So kann die DNA, die das die erfindungsgemäße Verbindung ausbildende Polypeptid codiert, gemäß bekannten Techniken verwendet werden, die in geeigneter Weise in Hinsicht auf die hier enthaltenen Lehren modifiziert wurden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle für die Expression und die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids zu transformieren. Solche Techniken umfassen diejenigen, die in dem US-Patenten 4 440 859 herausgegeben am 3. April 1984 für Rutter et al, 4 530 901 herausgegeben am 23. Juli 1985 für Weissmann, 4 582 800 herausgegeben am 15. April 1986 für Crowl, 4 677 063 herausgegeben am 30. Juni 1987 für Mark et al. 4 678 751 herausgegeben am 7. Juli 1987 für Goeddel, 4 704 362 herausgegeben am 3. November 1987 für Itakura et al, 4 710 463 herausgegeben am 1. Dezember 1987 für Murray, 4 757 006 herausgegeben am 12. Juli 1988 für Toole, Jr. et al, 4 766 075 herausgegeben am 23.08.1988 für Goeddel et al und 4 810 648 herausgegeben am 7. März 1989 für Stalker offenbart sind.
  • Die DNA, die das Polypeptid codiert, welches die erfindungsgemäße Verbindung ausbildet, kann mit einer breiten Vielfalt von anderen DNA-Sequenzen für das Einbringen in einen geeigneten Wirt gebunden werden. Die Begleit-DNA wird von der Art des Wirts, der Weise des Einführens der DNA in den Wirt und davon abhängen, ob eine episomale Erhaltung oder -integration gewünscht ist.
  • Im allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie beispielsweise ein Plasmid, in richtiger Orientierung und im richtigen Leserahmen für die Expression eingesetzt. Falls notwendig kann die DNA mit der geeigneten transkriptional und translational regelnden Steuernukleotidsequenz verknüpft werden, die von dem gewünschten Wirt erkannt wird, obwohl solche Steuerungen im allgemeinen in dem Expressionsvektor verfügbar sind. Der Vektor wird dann über Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert werden. Deshalb wird es notwendig sein, die transformierten Wirtszellen zu selektieren. Eine Selektionstechnik schließt das Inkorporieren einer DNA-Sequenz zusammen mit allen notwendigen Steuerelementen, die eine selektierbare Eigenschaft bei der transformierten Zelle codieren, wie beispielsweise eine antibiotische Resistivität, in den Expressionsvektor ein. Alternativ können die Gene für eine solche selektierbare Eigenschaft auf einem anderen Vektor angeordnet sein, der verwendet wird, um die gewünschten Wirtszellen zu cotransformieren.
  • Wirtszellen, die durch die erfindungsgemäße rekombinante DNA transformiert worden sind, werden dann für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, die den Fachleuten in Hinblick auf die hier offenbarten Lehren bekannt sind, kultiviert, um die Expression des Polypeptids zu erlauben, welches dann gewonnen werden kann.
  • Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich Bakterien (z. B. E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (z. B. Saccharomyces cerevisiae), filamentöse Pilze (z. B. Aspergillus), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen.
  • Die Vektoren umfassen ein procaryotisches Replikon, so wie das ColE1 ori, zur Propagation in einem Procaryot, selbst wenn der Vektor für die Expression in anderen, nicht-procaryotischen Zelltypen verwendet wird. Die Vektoren können auch einen geeigneten Promotor aufweisen, wie beispielsweise einen procaryotischen Promotor, der in der Lage ist, die Expression (Transkription und Translation) der Gene in einer bakteriellen Wirtszelle, wie beispielsweise E. coli, welche mit jenen transformiert wurde, einleitet.
  • Ein Promotor ist ein Expressionssteuerelement, das von einer DNA-Sequenz ausgebildet wird und das es ermöglicht, daß das Anbinden von RNA-Polymerase und die Transkription erfolgen. Promotorsequenzen, die mit exemplarischen bakteriellen Wirten kompatibel sind, werden typischerweise in Plasmidvektoren bereitgestellt, die günstig gelegene Restriktionsplätze für das Einsetzen eines DNA-Segments gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten.
  • Typische procaryotische Vektorplasmide sind pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, erhältlich von Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA) und pTrc99A und pKK223-3, erhältlich von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.
  • Ein typisches Säugetierzellenvektorplasmid ist pSVL, erhältlich von Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Dieser Vektor verwendet den SV40 Spätpromotor, um die Expression von geklonten Genen anzutreiben, wobei das höchste Niveau der Expression in T- Antigen produzierenden Zellen gefunden wird, wie beispielsweise in COS-1-Zellen.
  • Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetierexpressionsvektor ist pMSG, ebenfalls erhältlich von Pharmacia. Dieser Vektor verwendet den glucocorticoidisch-induzierbaren Promotor der langen endseitigen Wiederholung des Mausbrustdrüsentumorvirus, um die Expression der geklonten Gene anzutreiben.
  • Verwendbare Hefeplasmidvektoren sind pRS403-406 und pRS 413-416 und sind allgemein erhältlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Yeast Integrating plasmids (YIps) und inkorporieren die hefeselektierbaren Marker his3, trp1, leu2 und ura3. Die Plasmide pRS413-416 sind Yeast Centromere plasmids (YCps).
  • Eine Vielzahl von Verfahren ist entwickelt worden, um DNA über komplementär anhaftende Endbereiche effektiv an Vektoren anzulinken. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymertrakte zu dem DNA-Segment, welches in die Vektor-DNA einzufügen ist, hinzugefügt werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann über Wasserstoffbindungen zwischen den komplementären homopolymerischen Enden verbunden, um rekombinante DNA-Moleküle auszubilden.
  • Synthetische Linker enthalten einen oder mehrere Restriktionsplätze, die eine alternative Methode des Verbindens des DNA- Segments mit Vektoren bereitstellen. Das DNA Segment, das durch Endonucleaserestriktionsdigestion wie zuvor beschrieben erzeugt wurde, wird mit Bakteriophage-T4-DNA-Polymerase oder E. coli- DNA-Polymerase I, Enzymen, die vorstehende 3'-Einzelstrangendbereiche mit ihren 3'-5'-exonukleolytischen Aktivitäten entfernen und die zurückgesetzten 3'-Enden mit ihren polymerisierenden Aktivitäten auffüllen, behandelt.
  • Die Kombination dieser Aktivitäten erzeugt deshalb stumpf endende DNA-Segmente. Die stumpf endenden Segmente werden dann mit einem großen molaren Überschuß von Linker-Molekülen in der Anwesenheit eines Enzyms inkubiert, das in der Lage ist, die Ligation der stumpf endenden DNA-Moleküle zu katalysieren, wie beispielsweise Bakteriophage-T4-DNA-Ligase. So sind die Produkte der Reaktion DNA-Segmente, die eine polymerische Linker-Sequenz an ihren Enden aufweisen. Diese DNA Segmente werden dann mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und an einen Expressionsvektor angebunden, der mit einem Enzym gespalten worden ist, das Endbereiche erzeugt, welche kompatibel mit denjenigen des DNA- Segments sind.
  • Synthetische Linker, die eine Bandbreite von Restriktionsendonucleaseplätzen umfassen, sind kommerziell erhältlich aus einer Anzahl von Quellen, einschließlich International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, USA.
  • Ein wünschenswerter Weg, um die DNA, welche das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, zu modifizieren, ist die Verwendung der Polymerasekettenreaktion, wie sie von Saiki et al (1988) Science 239, 487-491 offenbart wird.
  • Bei diesem Verfahren wird die enzymatisch zu verstärkende DNA durch zwei spezifische Oligonucleotidprimer flankiert, welche ihrerseits in die verstärkte DNA inkorporiert werden. Diese spezifischen Primer können Restriktionsendonucleaseerkennungsplätze enthalten, die zum Klonen in Expressionsvektoren unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren verwendet werden können.
  • Beispielhafte Hefe-Genera, die als nützlich in der Praxis der vorliegenden Erfindung angesehen werden, sind Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Hansenula, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis und dergleichen. Bevorzugte Genera sind jene, die aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia und Hansenula besteht. Beispiele für Saccharomyces sind Sccharomyces cerevisiae, Saccharomyces italicus und Saccharomyces rouxii. Beispiele für Kluyveromyces sind Kluyveromyces fragilis und Kluyveromyces lactis. Beispiele für Hansenula sind Hansenula polymorpha, Hansenula anomala und Hansenula capsulata. Yarrowia lipolytica ist ein Beispiel für eine geeignete Yarrowia-Art.
  • Verfahren für die Transformation von S. cerevisiae werden im allgemeinen in EP 251 744, EP 258 067 und WO 90/01063 gelehrt.
  • Geeignete Promotor für S. cerevisiae umfassen solche, die mit dem PGK1-Gen, den GAL1- oder GAL10-Genen, CYC1, PHO5, TRP1, ADH1, ADH2, den Genen für Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Triosephosphatisomerase, Phosphorglucoseisomerase, Glucokinase, α- Matingfaktor-Pheromon, a-Matingfaktor-Pheromon, dem PRB2- Promotor, dem GUT2-Promotor und Hybrid-Promotoren assoziiert sind, die Hybride von Teilen der 5'-Regulatorregionen mit Teilen der 5'-Regulatorregionen von anderen Promotoren oder mit stromauf gelegenen Aktivierungsplätzen einbeziehen (beispielsweise den Promotor gemäß EP-A-258 067).
  • Das Transkriptionsbeendungssignal ist vorzugsweise die 3'- flankierende Sequenz eines eukaryotischen Gens, das ein geeignetes Signal für die Transkriptionsbeendung und die Polyadenylation enthält. Geeignete 3'-flankierende Sequenzen können beispielsweise jene der Gene sein, die natürlich an die verwendete Expressionssteuersequenz angelinkt sind, d. h. sie können dem Promotor entsprechen. Alternativ können sie unterschiedlich sein, wobei in diesem Fall das Beendungssignal des S. cerevisiae AUD1-Gens bevorzugt ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt die Verwendung einer Verbindung mit einem Targetzellen-spezifischen Bereich und einem inaktivierenden Bereich, der fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Patienten, wobei dem Patienten ein zytotoxisches Mittel verabreicht wird; und einer Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung des zytotoxischen Mittels zu inhibieren, und welche von dem inaktivierbaren Bereich in eine Substanz umwandelbar ist, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist.
  • Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Verbindung verabreicht, und sobald sich eine optimale Balance zwischen dem Verhältnis von Tumorzellen zu normalen Zellen der Verbindung und dem absoluten Niveau der mit dem Tumor assoziierten Verbindung eingestellt hat, wird das zytotoxische Mittel zusammen mit der Substanz verabreicht, die in der Lage ist, die Wirkung des zytotoxischen Mittels zu blockieren. Es wäre jedoch auch eine alternative Methode der Verabreichung möglich. Die Menge der erfindungsgemäßen Verbindung, die in dem Blut zirkuliert, kann durch Messen der Aktivität des enzymatischen Bereichs bestimmt werden.
  • Vorzugsweise stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers bereit, das einen Tumor beherbergt. Sinnvollerweise wird das Säugetier zuerst für die Tumortherapie durch Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung und durch Abwarten, bis das Verhältnis der Verbindung, die an Targetzellen angebunden ist, zu der Verbindung, die nicht an Targetzellen angebunden ist, einen gewünschten Wert erreicht hat, vorbereitet. Die Verwendung weist dann weiterhin das Verabreichen eines zytotoxischen Mittels und einer Substanz an das Säugetier auf, die in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, den Effekt des zytotoxischen Mittels zu inhibieren, und von der durch den inaktivierenden Bereich der Verbindung eine Substanz erzeugt werden kann, die weniger Effekt auf das zytotoxische Mittel hat.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden auf jedem geeigneten Weg verabreicht, üblicherweise parenteral, z. B. intravenös, intraperitoneal oder intra-vesical, in standard-sterilen, nicht- pyrogenen Formulierungen von Verdünnern und Trägerstoffen, z. B. isotonischen Salzlösungen (wenn sie intravenös verabreicht werden). Die vorliegende Erfindung stellt damit ein Mittel bereit, das die kontinuierliche Einwirkung eines zytotoxischen Mittels an Tumorplätzen ermöglicht, während normale Gewebe vor den Wirkungen des zytotoxischen Mittels geschützt werden, die dieses gegenüber dem Targetkrebs entwickelt. Die Substanz, die in ihrem nativen Zustand fähig ist, die Effekte des zytotoxischen Mittels zu inhibieren, wird in einer Dosis verabreicht, die ausreichend ist, um normale Gewebe zu schützen. Beim Erreichen von Tumorplätzen wird die Substanz jedoch inaktiviert, bevor sie in die Zellen eintreten und sie vor dem zytotoxischen Mittel schützen kann. Auf diese Weise werden normale Gewebe vor den Wirkungen des zytotoxischen Mittels geschützt, während das schützende Molekül an den Tumorplätzen schnell abgebaut wird.
  • Das zytotoxische Mittel und der Inhibitor werden auf jedem der Wege verabreicht, wie sie für die erfindungsgemäße Verbindung beschrieben wurden, und sie könnten auch oral verabreicht werden.
  • Es ist auch gezeigt worden, daß Antikörper-Enzym-Konjugate ihre Spitzenkonzentration in Tumoren im allgemeinen innerhalb von 24 Stunden erreichen und daß die Enzymaktivität an den Tumorplätzen für 7 bis 8 Tage anhält. Die Antikörper-Enzym-Konjugate bestehen auch im Blut und in nicht-Tumorgeweben für mehrere Tage fort. Enzyme in nicht-Tumorgeweben werden die Inhibitorsubstanz abbauen und verringern so deren Schutzwirkung bzw. erhöhen den Bedarf an ihr. Durch verschiedene Techniken kann die Entfernung des Enzyms aus dem Blut beschleunigt oder das Enzym inaktiviert werden, ohne die Enzymniveaus an den Tumorplätzen signifikant zu ändern. Diese Techniken können sinnvoll und zusätzlich zu den anderen Komponenten eingesetzt werden.
  • Obwohl die Antikörper bzw. Antikörperfragmente, die bei dem Antikörper-Enzym-Konjugat verwendet werden, "humanisiert" werden können, um ihre Immunogenität zu reduzieren (wie offenbart von Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 und Riechmann et al (1988) Nature 332, 323-327), haben die bakteriellen Enzyme CPG1 und CPG2 kein humanes Analogon und für die wiederholte Verwendung beim Menschen mag es wünschenswert sein, sie zu modifizieren, um so ihre Immunogenität zu reduzieren, oder Mittel zu verwenden, die eine Immunsupression oder Immuntoleranz induzieren.
  • Techniken zum Reduzieren der Immunogenität von Fremdproteinen, die auf Antikörper-Enzym-Konjugate anwendbar sind, umfassen solche der Konjugation zu Formen von Polyethylenglycol (Wilkinson et al (1987) J. Immunol. 139, 326-331).
  • Alternativ oder zusätzlich kann das Problem der Immunogenität überwunden werden durch Verabreichung von Immunsupressoren oder immuntoleranzinduzierenden Mitteln. Cyclosporin und FK506 sind weit verbreitete Arzneimittel, um Immunsuppression bei Gewebetransplantationen zu erreichen. Es ist gezeigt worden, daß Cyclosporin die Wirtsantikörperreaktion auf Fremdproteine verzögert (Lederman et al (1988) Br. J. Cancer 58, 562-566 und 654-657). Die Toleranz gegenüber Fremdproteinen, wenn der Wirt dem Fremdproblem zum ersten Mal nach der Aufnahme eines Antikörpers ausgesetzt ist, der auf das CD4-Epitop an Lymphozyten gerichtet ist, ist beschrieben worden (Waldman et al (1988) Seiten 16-30 in Progress in Allergy (Shizata & Woksman, Herausgeber, New York). Weitere Mittel, um dies zu erreichen, sind woanders beschrieben worden und mögen sich mit ergebenden Fortschritten bei der Steuerung von Wirtsantikörperreaktionen auf Fremdantigene ändern. Katalytische Antikörper (Abzyme) können "humanisiert" werden, um ihre Immunogenität zu reduzieren oder zu beseitigen.
  • Wenn ein Antikörper, der gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichtet ist, oder ein Antikörper-Enzym-Konjugat in einen geeigneten, einen Tumor tragenden Wirt injiziert wird, ordnet sich nur eine kleine Fraktion des Antikörpers bzw. Konjugats an dem Tumorplatz an, und das meiste davon verbleibt für einige Tage im Blut und anderen normalen Geweben. So ist, obwohl die Tumorkonzentration des Enzyms höher als in normalen Geweben sein wird, das Volumen des normalen Gewebes viel größer. So kann es zum Minimieren der Menge des Enzyms, das in normalen Geweben und dem Blut zurückbleibt, wünschenswert sein, die Methoden der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den Methoden zu verwenden, die in WO 98/10140, Bagshawe (1989) Brit. J. Cancer 60, 275-281, und Sharma et al (1990) Brit. J. Cancer 61, 659-662 für das Inaktivieren und Entfernen überschüssiger Antikörper-Enzym- Konjugate aus dem Blut offenbart sind.
  • Beim Versuchen, eine Ausrottung von Krebs zu erreichen, kann es unmöglich sein, eine Unterdrückung von blutbildenden Funktionen zu vermeiden, obwohl sie bei einer gegebenen Wirkung auf ein Tumortarget (Myelosupression) bei dem hier beschriebenen System deutlich geringer zu erwarten ist. Entsprechend wird für ein gegebenes Maß an Myelosupression eine viel größere Tumorwirkung erwartet. Wachstumsfaktoren, die auf blutbildende Gewebe wirken, können daher sinnvoll in Verbindung mit dem hier beschriebenen System eingesetzt werden.
  • Das hier beschriebene System kann in Verbindung mit konventionellen zytotoxischen Mitteln und der Verwendung von Mehrfachenzymzufuhr verwendet werden und mehr als einen Metaboliten inaktivieren.
  • In entsprechender Weise kann ein Enzym, das von einem Antikörper an einen Tumorplatz angeliefert wird, sowohl wirken, indem es ein Prodrug aktiviert, als auch, indem es einen Metaboliten inaktiviert, der normale Gewebe schützt. Wie hier offenbart ist, inaktiviert Carboxypeptidase G2 Folinsäure an Tumorplätzen, um die Tumorzellen ungeschützt gegen Trimetrexat zu lassen. Dasselbe Tumor-lokalisierte Enzym kann ein Benzoesäureprodrug aktivieren, um einen zytotoxischen Mustard auszubilden (wie offenbart von Bagshawe (1989) Brit. J. Cancer 60, 275-281).
  • Selbstverständlich können ein oder mehrere Enzyme auf die Tumorplätze entweder durch denselben oder einen anderen Antikörper gerichtet werden und derart, daß ein oder mehrere Prodruge in ein aktives Arzneimittel umgewandelt werden, und derart, daß ein oder mehrere schützende Mittel an den Tumorplätzen abgebaut werden. So können zwei oder mehr Enzyme mit demselben Antikörper verbunden werden.
  • Da Antikörper-Enzym-Konjugate im allgemeinen ihre Maximalkonzentration an Tumorplätzen binnen 12 bis 24 Stunden erreichen, und da sie einige Tage benötigen, um sich aus dem Plasma und anderen Körperflüssigkeiten zu entfernen, ist es auch gezeigt worden, daß es vorteilhaft ist, die Entfernung der Antikörper-Enzym- Konjugate zu beschleunigen und die speziell im Blut vorliegenden Enzyme zu inaktivieren. Verschiedene Mittel, mit denen dies erreicht werden kann, sind beschrieben worden (WO 89/10140).
  • Die Antikörper, die zum Entfernen oder Inaktivieren der Antikörper-Enzym-Konjugate verwendet werden, können auf den Antigenbindungsplatz an dem anti-Tumorantikörper gerichtet werden oder gegen den aktiven Platz des Enzyms oder gegen jeden anderen Platz an dem Antikörper-Enzym-Konjugat. Solche Antikörper können zusätzlich Galactosereste oder andere hinzugefügte Zucker aufweisen, um die Entfernung zu beschleunigen oder sie können dialysiert werden. Galactosylation des Antikörpers resultiert in seine schnelle Entfernung aus dem Blut durch Aufnahme durch Galactoserezeptoren an Hepatozyten. Alternativ oder zusätzlich wird das Antikörper-Enzym-Konjugat galactosyliert, und es wird verabreicht, nachdem die Lebergalactoserezeptoren durch asialo-bovines Unterkieferdrüsenspeichelprotein oder durch gegen Lebergalactoserezeptoren gerichtete Antikörper oder durch andere Moleküle mit hoher Affinität für Galactoserezeptoren blockiert wurden. Die blockierende Substanz wird für einen Zeitraum von bis zu 24 Stunden im Plasma belassen, so daß der Antikörper-Enzym-Komplex sich an den Tumorplätzen lokalisiert, aber nach dem Ende der Galactoserezeptorblockade wird das galactolysierte Antikörper-Enzym schnell über die verfügbaren Galactoserezeptoren entfernt.
  • Die vorliegende Erfindung wird jetzt anhand der nachfolgenden Beispiele und Figuren unter spezieller Bezugnahme auf zytotoxische Therapie mit Trimetrexat und Folinsäurerettung erläutert.
  • Fig. 1 zeigt die Strukturen von Trimetrexat, Methotrexat, Folinsäure, CB3717 und ICI D1694.
  • Fig. 2 ist eine zeichnerische Darstellung der Erfindung, wobei der Targetzellen-spezifische Bereich ein Antikörper und an Carboxypeptidase G2 gekoppelt ist; Folinsäure der Inhibitor eines zytotoxischen Mittels ist; und Trimetrexat das zytotoxische Mittel ist.
    • Beispiel 1: Zytotoxische Therapie mit Trimetrexat und Folinsäurerettung
  • Die vorliegende Erfindung kann ein Mittel bereitstellen, das eine kontinuierlichere anti-Folatwirkung an Tumorplätzen erlaubt, während normale Gewebe vor anti-Folateffekten geschützt werden. Der erste Schritt ist es, immunsupressive oder immuntoleranzinduzierende Mittel aufzunehmen, und dies wird normalerweise für nicht weniger als zwei Tage erfolgen, bevor die Verbindung der vorliegenden Erfindung verabreicht wird. Falls das Antikörper-Enzym-Konjugat nicht immunogen ist, wird dieser Schritt weggelassen. Ein Antikörper-CPG2-Konjugat oder ein Antikörperfragment, das chemisch oder durch rekombinante DNA-Technologie zu CPG2 oder ein ähnliches Enzym konjugiert ist, wird auf intravenösem oder einem anderen geeigneten Weg verabreicht; der Antikörper ist gegen ein Tumorantigen gerichtet, das von dem Targetkrebs ausgebildet wird. Nachdem es für einige Stunden dem Konjugat ermöglicht wurde, sich an den Tumorplätzen zu lokalisieren, wird ein zweiter Antikörper verabreicht. Dieser kann auf die aktiven Plätze an dem Enzym gerichtet sein, wobei in diesem Fall zusätzliche Glactosereste an dem zweiten Antikörper befestigt sind, um eine schnelle Entfernung über hepatozytische Galactoserezeptoren sicherzustellen. Alternative Mechanismen für die schnelle Entfernung von Konjugaten aus nicht-Tumorplätzen sind beschrieben worden. Wenn die Enzymniveaus auf sehr niedrige oder nicht detektierbare Niveaus im Plasma gefallen sind, wird Trimetrexat als Bolus oder als kontinuierliche Infusion mit dem Ziel des Einhaltens einer konstanten Plasmakonzentration verabreicht. Gleichzeitig mit dem Trimetrexat wird Folinsäure durch intravenöse Infusion auf einem Niveau verabreicht, das ausreichend ist, um normale Gewebe von der Trimetrexattoxizität zu schützen. Folinsäure, die Tumorplätze erreicht, an denen CPG2 lokalisiert ist, wird ebenso wie Folsäure deglutamatisiert und inaktiv gemacht, bevor sie in die Zellen eintreten und diese vor Trimetrexat schützen kann. Auf diese Weise können normale Gewebe durch Folinsäure vor der Einwirkung von Trimetrexat geschützt werden, während das schützende Molekül an Tumorplätzen schnell abgebaut wird. Andere anti-Folatarzneimittel, die wie Trimetrexat nicht durch CPG2 abgebaut werden, können für Trimetrexat substituiert werden.
  • Da die Trimetrexatblockade der Dihydrofolatreduktase zumindest teilweise durch endogene Quellen von Thymidin umgangen werden kann, mag ein Thymidin abbauendes Enzym ebenfalls durch einen Antikörper oder einen anderen Liganden auf die Tumorplätze gerichtet werden.
  • Es wird erkannt, daß die Verteilung der Antikörper-Enzym- Konjugate in dem Tumor nicht gleichmäßig sein wird, da es eine Heterogenizität in der Ausbildung von Tumor-assoziierten Antigenen an den Zellmembranen gibt. Die Sekretion eines Antigens in den extrazellulären Raum resultiert in eine gleichmäßigere Verteilung des Targetantigens, und sekretierte Antigene bilden Komplexe mit den hierauf gerichteten Antikörper- Enzym-Konjugaten. Eine Verinnerlichung der Antikörper-Enzym- Konjugate durch Tumorzellen ist nicht notwendig und kann unerwünscht sein.
  • Es ist evident, daß das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sich von konventioneller zytotoxischer Chemotherapie mit Methotrexat und Folinsäurerettung durch die Einführung eines Mittels zum Abbauen des normalen Metabolits (Folsäure) und des Rettungsmittels (Folinsäure) aber nicht des Folinsäureantagonisten an den Tumorplätzen unterscheidet.
  • Der Verlust von Enzymen von den Tumorplätzen durch Dissoziation der Antikörper von dem anvisierten Antigen und durch biologischen Abbau führen wahrscheinlich nach einigen Tagen zu reduzierten Niveaus der Enzyme an jenen Plätzen. Die Rate des Abfalls der Enzymaktivität wird mit dem Tumor- und Enzymtyp variieren; Carboxipeptidaseaktivität ist in Nacktmäuse xenotransplantierten humanen Kolonkarzinomtumoren sieben Tage nach der Verabreichung in einer zu einem gegen CEA gerichteten Antikörper konjugierten Form nachgewiesen worden. Es sollte deshalb möglich sein, die Trimetrexattherapie für etwa 5 Tage mit einer Unterbrechung von 24 bis 48 Stunden vorzusetzen, während derer weitere Antikörper-Enzym-Konjugate verabreicht und von nicht-Tumorplätzen entfernt werden könnten wobei sich weitere Zyklen anschließen, vorausgesetzt es gibt eine wirksame immunologische Kontrolle oder die Vermeidung von Wirtsantikörperreaktionen.
  • Obwohl der Vorschlag nicht zu einer ununterbrochenen Therapie führen würde, würde so das Verhältnis der Behandlungszeit zur behandlungsfreien Zeit bei einer konventionellen Therapie von etwa 1 : 7 auf etwa 2-3 : 1 verbessert.
    • Beispiel 2: Zytotoxische Therapie mit Thymidylatsynthetaseinhibitoren und Thymidinrettung
  • Dasselbe Prinzip kann auf andere anti-Metabolittherapien angewandt werden. Zum Beispiel sind erhebliche Anstrengungen in den vergangenen Jahren für die Entwicklung von Mitteln unternommen worden, die das Schlüsselenzym Thymidylatsyntetase blockieren, wie beispielsweise CB3717 und ICI D1694 (Jodrell et al 1991, BJC 64, 833-8). Solche Mittel neigen dazu, unter denselben Beschränkungen zu leiden wie konventionelle zytotoxische Mittel, indem sie auch die Thymidylatsynthetase in normalen Zellen blockieren. Ihre Wirkung ist durch Thymidin umkehrbar. Thymidinverabreichung kann deshalb verwendet werden, um normale Gewebe vor Thymidylatsynthetaseinhibitoren zu schützen, während schützende Effekte des Thymidins und von endogenem Thymidin an Tumorplätzen durch thymidinabbauende Enzyme begrenzt werden können, wie beispielsweise durch Dihydrothymindehydrogenase oder Thymidinkinase, die den Eintritt von Thymidin in die Tumorzellen hemmen würden. Das Thymidininhibitorenzym oder -mittel wird durch einen Antikörper oder einen anderen geeigneten Vektor angeliefert.
  • Dihydrothymindehydrogenase kann von normalen menschlichen Lymphozyten erhalten werden (Shiotani & Weber 1989 Cancer Res. 49, 1090-1094), und hat deshalb den Vorteil, daß ein Antikörper- Enzym-Konjugat von geringer Immunogenität durch Konjugation zu einem humanen oder "humanisierten" Antikörper hergestellt werden kann.
  • Man stellt sich auch vor, daß sowohl ein anti-Folatmittel als auch ein anti-Thymidinmittel zusammen verwendet werden könnten mit geeigneten Inhibitoren und inhibitorabbauenden Enzymen, was zu einer effektiven zytotoxischen Kombination führen würde.
    • Beispiel 3: Kombinantionstherapie mit ADEPT
  • Das ADEPT-Konzept verwendet ein Antikörper-Enzym-Konjugat, um aus einem inaktiven Vorboten an Tumorplätzen ein zytotoxisches Arzneimittel zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung kann in Verbindung mit ADEPT verwendet werden, was zu einer Art von Kombinationschemotherapie führt, wobei beide aktiven Arzneimittel im wesentlichen auf die Tumorplätze beschränkt bleiben, aber dasselbe oder unterschiedliche Enzyme verwenden, um das aktive Mittel in einem Fall zu erzeugen und ein schützendes Mittel in dem anderen Fall zu zerstören.
  • In dem Fall der ADEPT-Behandlung empfingen Nacktmäuse, die menschliche Choriokarzinom-(CC3)-Tumore hatten, 29 Einheiten von CPG2 konjugiert zu Anti-HCG (W14 Fab&sub2;, wie offenbart in WO 88/07378), und nach 24 oder 48 Stunden empfingen sie das Prodrug (41 uM/kg). Die Menge des schützenden Mittels wird eingestellt, um einen optimalen Schutzeffekt in der Abwesenheit des inhibitorischen Mittels zu ergeben.
    • Beispiel 4: Behandlung eines Patienten mit Lebermetastasen und abdominalem Drüsenkarzinom
  • Beginnend am Tag minus-2 wurde einem Patienten mit großen Lebermetastasen und wiederkehrendem abdominalem Drüsenkarzinom des Dickdarms das immunsupressive Mittel Cyclosporin durch kontinuierliche intravenöse Infusionen verabreicht. Am Tag 0 empfing er eine Verbindung, die den F(ab')&sub2;-Bereich eines monoklonalen Antikörpers enthielt, der als A&sub5;B&sub7; bekannt ist, der das Karzinoembryonische Antigen (CEA) bindet und der chemisch zu Carboxypeptidase G2 als ein bakterielles Enzym konjugiert war. Die Menge des verabreichten Enzyms betrug 20.000 Enzymeinheiten (10.000 U/m²) durch intravenöse Infusion über zwei Stunden. 24 Stunden später (Tag 1) war das Enzym immer noch in seinem Blutplasma mit 1,0 Einheiten/ml verfügbar, und er erhielt dann 80 mg (40 mg/m²) des monoklonalen Antikörpers SB43, der galactosyliert worden war, um seine Entfernung zu beschleunigen. Dieser wurde über 24 Stunden durch kontinuierliche intravenöse Infusion verabreicht, und während der letzten Stunde der Infusion wurden 10 mg nicht galactosyliertes SB43 zu der Infusionslösung hinzugegeben. Nach dem Abschluß der SB43-Infusion (Tag 2), als die CPG2-Aktivität im Plasma nicht länger nachweisbar war, wurde Trimetrexat in 5% Dextrose durch intravenösen Bolus verabreicht. Die Infusion von 100 mg Folinsäure begann zu diesem Zeitpunkt für eine kontinuierliche 24-Stunden-Infusion. Trimetrexat wurde täglich für vier Tage fortgesetzt (Tag 2, 3, 4, 5).
  • Der mit dem Antikörper-Enzym-Konjugat beginnende Zyklus wurde am Tag 7 und 14 erneut gestartet. Die Toxizität blieb auf einen vorübergehenden Anstieg beim Serumkreatin beschränkt, eine wohlbekannte Komplikation der Therapie mit Cyclosporin. Die Wirtsantikörperreaktion auf die Tumorantikörper und die bakteriellen Enzyme war bis zum Abschluß der drei Behandlungszyklen nicht detektierbar.
  • Die Zählungen peripherer weißer und roter Blutkörperchen blieben während und nach dieser Behandlung auf normalen oder supranormalen Niveaus. Nachfolgende Patienten erhalten ansteigende Dosen von Trimetrexat und reduzierte Dosen von Folinsäure.
  • Der in Mäusen gegen karzinoembryonisches Antigen (CEA) gezogene monoklonale Antikörper A&sub5;B&sub7; ist erhältlich von Cancer Research Campaign Technology, Cambridge House, 5-10 Cambridge Terrace, Regent's Part, London NE1 4JL, und wurde nach dem Verfahren präpariert, welches bei Harwood et al (1986) Brit. J. Cancer 54, 75-82 und in Beispiel 5 beschrieben ist. Der murine monoklonale Antikörper SB43 ist erhältlich von Cancer Research Campaign Technology und wurde durch das Verfahren präpariert, welches bei Sharma et al (1990) Brit. J. Cancer 61, 659-662 und in Beispiel 8 beschrieben ist.
    • Beispiel 5: Präparation eines monoklonalen Antikörpers, welcher gegen karzinoembryonisches Antigen reaktiv ist
  • Gereinigtes CEA wurde von Metastasen von Dickdarmtumoren präpariert. Eine Radioiiodierung auf eine spezifische Aktivität von 6 uCiug&supmin;¹ wurde mittels eines Iodogen-Verfahrens durchgeführt. Als Lösungspuffer wurde ein 0,15 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, präpariert, der 0,1% bovines Serumeiweiß enthielt. Die Studien bei geringer ionischer Stärke wurden in 0,02 M Tris-HCl-Puffer bei pH 7,4 durchgeführt.
  • Immunisierungsplan: Monoklonaler Antikörper A&sub5;B&sub7; wurde gegen gereinigtes, hitzebehandeltes CEA unter Anwendung der folgenden Prozedur gezogen. Ein Milligramm gereinigtes CEA wurde in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7) bei einer Konzentration von 1 mgml&supmin;¹ für 35 min. auf 85ºC erhitzt. Nach dem Mischen mit 1 ml wässrigem Natriumaluminiumsulphat (Alum) wurde der pH-Wert unter konstantem Rühren durch tropfenweises Hinzufügen von NaOH-Lösung auf, 6,5 bis 7 eingestellt. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für 30 min. wurde das resultierende Prezipitat dreimal in Salzlösung gewaschen. Es wurde dann mit 10¹&sup0; formalisierter Bordetella pertussis (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Wellcome Research Laboratories) vermischt. Drei unterschiedliche Immunisierungspläne wurden angewendet.
  • Milzzellen von immunisierten Mäusen wurden dann entweder mit SP2/0-Ag 14 oder P3-NS/1-Ag 4-1 Myelomzellen verschmolzen, und die anti-CEA erzeugenden Hybridome wurden durch einen einzigen Zelltransfer geklont.
    • Beispiel 6: Präparation von F(ab')&sub2;-Fragmenten von A&sub5;B&sub7;
  • Der in dieser Studie verwendete monoklonale Anti-CEA (A&sub5;B&sub7;) ist zuvor beschrieben worden und ausgewählt worden wegen seiner geringen Kreuzreaktivität mit NCA und seiner Stabilität bei einer Immunaufreinigung und Radiomarkierung. F(ab')&sub2;-Fragmente wurden durch das Verfahren Lamoyi und Nisonoff (1983) J. Immunol. Methods 56, 235-243 präpariert. Nach der Trennung der Aufschlußmischung auf Sephacryl 5-200, wurden die Fraktionen durch SDS-PAGE unter Verwendung eines 7,5% Gels analysiert. Die Fraktion, die das F(ab')&sub2; enthielt wurde konzentriert und gegen 0,15 molaren Phosphatpuffer, pH 7, dialysiert. Durch Elektroblotten des SDS-Gels auf Nitrozellulosepapier und Überlagern mit ¹²&sup5;I-markiertem CEA wurde gezeigt, daß sowohl das intakte A&sub5;B&sub7; als auch das Fragment immunologisch aktiv und relativ homogen war. Intaktes A&sub5;B&sub7; und sein F(ab')&sub2;-Fragment wurden durch das Chloramin-T-Verfahren auf spezifische Aktivitäten von 5, 6 bzw. 5,2 uCi/ug radiomarkiert. Durch einen Festphasenradioimmungssay unter Verwendung von an Aminozellulose gekoppeltem CEA (Rogers et al (1983) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 19, 629-639) wurde für beide markierten Präparationen gezeigt, daß sie ihre immunologische Aktivität beibehielten. Ein Überschuß von 60% Aktivität wurde in jedem Fall beibehalten.
    • Beispiel 7: Konjugation von A&sub5;B&sub7;-F(ab')&sub2; zu DPG2
  • Zu einer Lösung von CPG2 (2,15 mg) in Phosphatpuffer (2,5 ml, pH = 7,6, 1 mM EDTA enhaltend) wurde 4-(p-Maleimidophenyl)-buttersäure-N-hydroxysuccinimidester (138 ug) in DMF (13,5 ul) entsprechen einem 15 molaren Überschuß von Ester zu Carboxypeptidase hinzugegeben. Die Lösung wurde für zwei Stunden stehengelassen, nach welcher Zeit überschüssiger Ester durch Gelfiltration entfernt wurde (PD 10-Säule, verdünnt mit 3,2 cm Phosphat- /EDTA-Puffer) - Lösung 1.
  • F(ab')&sub2;-A&sub5;B&sub7; (2,6 mg) in Phosphat-/EDTA-Puffer (1,2 ml) wurde mit S-Acetylthioglycolsäure-N-hydroxysuccinimidester (SATA) (90 ug) in DMF (10 ul) behandelt, und die Mischung wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Überschüssiger SATA wurde durch Gelfiltration (PD 10-Säule, verdünnt mit 3,2 cm Phosphatpuffer) entfernt.
  • Dreißig Minuten vor der Verwendung wurde eine Lösung von NH&sub4;OH (3,47 g neutralisiert mit Na&sub3;PO&sub4;H- und NaOH-Lösung und auf 100 ml mit 930 mg EDTA enthaltendem H&sub2;O aufgefüllt) (320 ul) hinzugefügt - Lösung 2.
  • Die Lösungen 1 und 2 wurden dann gemischt und über Nacht bei 4 ºC stehengelassen. Nach Konzentration (zehnfach) (Minicon) wurde das Konjugat durch Gelfiltration (S-12-Säule) auf FPLC (Pharmacia) isoliert. Das Konjugat wurde durch einen Millipore 0,22 um Filter gefiltert. Die Proteinkonzentration wurde gemessen, und die Enzymkonzentration wurde vor der Verwendung auf einem spektrophotometrischen Assay gemessen.
    • Beispiel 8: Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, welcher gegen CPG2 reaktiv ist
  • Ein monoklonaler Antikörper (SB43), der gegen CPG2 gezogen wurde, wird zur Herstellung eines bispezifischen Antikörpers (siehe das nächste Beispiel) und für die Entfernung und die Inaktivierung von Restenzymaktivität an nicht-Tumorplätzen verwendet.
  • Der monoklonale Antikörper wurde auf folgende Weise hergestellt. Balb/C-Mäuse (6-8 Wochen alt) wurden mit 50 ug CPG2 i.p. in unvollständigem Freund'schen Adjuvants (jeweils 50 ug CPG2, i.p.) in monatlichen Intervallen und mit zwei täglichen Injektionen (50 ug und 100 ug in PBS, i.v.) zwei Tage vor der Fusion immunisiert. Immune Milzzellen wurden mit nicht immunglobulin- sekretierenden SP2/0-Myelomzellen gemäß den Hybridom-Prozeduren von Köhler und Milstein (1975) Nature 256, 495 fusioniert.
  • Die Anwesenheit von anti-CPG2-Antikörpern wurde durch einen indirekten Festkörperradioimmungssay nachgewiesen. Eine 1 ugml&supmin;¹- Lösung von CPG2 in 0,05 M Phosphatpuffer wurde in Polyvinylmikrotitrierplatten (100 ng pro Vertiefung) gegeben, trocknen gelassen, mit Methanol fixiert und mit PBS-Puffer gewaschen, der 0,05% Tween und 0,1% bovines Serumeinweiß enthielt. Der Überstand bzw. die gereinigten Antikörperproben wurden in PBS verdünnt und in den CPG2-beschichteten Mikrotritierplatten (100 ul pro Vertiefung) bei 37ºC für vier Stunden und dann für eine Stunde mit ¹²&sup5;I-markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG inkubiert. Die Vertiefungen wurden zwischen jeder Stufe dreimal mit PBS-Tween- Puffer gewaschen, und nach dem letzten Waschen wurden die einzelnen Vertiefungen auseinander geschnitten und in einem Gammazähler gezählt.
    • Beispiel 9: Bispezifischer Antikörper, der gegen CPG2 und CEA reaktiv ist
  • Das Hybridom, welches A&sub5;B&sub7;, einen monoklonalen Antikörper, der gegen CEA reaktiv ist, produziert, ist durch Harwood et al (1986) Brit. J. Cancer 54, 75-82 beschrieben worden, und ein Verfahren zur Erzeugung eines Hybridoms, das SB43, einen monoklonalen Antikörper, welcher gegen CPG2 reaktiv ist, ist in den Beispielen beschrieben worden.
  • Das Fusionsprotokoll erlaubt es, jegliche zwei Antikörper produzierende Hybridomen zu fusionieren, und ist kürzlich offenbart worden (Clark & Waldmann (1987) J. Natl. Cancer Inst. 79, 1393-1401). Kurz gesagt wurden 5 · 10&sup6; bis 3,5 · 10&sup7; Zellen eines Elternteilhybridoms, das zuvor durch Auswahl einer Hypoxanthimphosphoribosyltransferase-negativen Variante Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin-(HAT)-empfindlich gemacht worden war, in einem Verhältnis 11 : 1 oder 10 : 1 unter Verwendung von 1 ml einer 50%igen (Gewichts/Volumen)-Lösung von Polyethylenglycol mit den Zellen des zweiten Elternteilhybridoms fusioniert, die mit einer tödlichen Dosis von 10 mM Jodacetamid vorbehandelt worden waren. Überschüssiges Polyethylenglycol wurde ausgewaschen, und die Zellen wurden bei Konzentrationen von 8 · 105 pro ml bis 2 · 105 pro ml in 24-Loch-Platten in Bicarbonat-gepufferten Iscove's modifiziertem Dulbecco's-Medium (IMDM) ergänzt um 5% (Volumen/Volumen) fötales Kälberserum aufgebracht. Nach 24 Stunden in der Kultur wurden Hybrydhybridome in einem HAT enthaltenden Medium selektiert.
    • Beispiel 10: Reduktion der Restenzymaktivität an nicht- Tumorplätzen
  • Es ist wünschenswert, die enzymatischen Bereiche des Enzym- Antikörper-Konjugats an nicht-Tumorplätzen aber nicht am Tumor zu inaktivieren. Ein Verfahren, um diesen Effekt zu erreichen, ist es, dem Patienten, der unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung behandelt wird, Antikörper zu verabreichen, welche gegen den Enzymbereich gezogen sind, der mit den Galactosereste konjugiert worden ist.
  • Ein monoklonaler Antikörper (SB43), der gegen CPG2 gerichtet ist, inaktiviert das Enzym. Um den Antikörper daran zu hindern, die Enzyme an den Tumorplätzen zu inaktivieren, werden zusätzliche Galactosereste zu ihm konjugiert, so daß er weiterhin Enzyme im Plasma inaktivieren kann, wenn er über den intravenö sen Weg verabreicht wird, wobei der inaktivierende Antikörper aber schnell aus dem Plasma und den Galactoserezeptoren an den Hepatozyten entfernt wird.
  • Das galactosylierte SB43 wird verabreicht, um die enzymatische Aktivität im Plasma zu eliminieren, und um dann eine Menge von nicht-galactolysiertem SB43 zu verabreichen, um inaktivierte Restenzymaktivität in anderen nicht-Tumorgeweben zu inaktivieren.
  • Der monoklonale Antikörper SB43 wird unter Verwendung des folgenden Protokolls galactosyliert: Eine Stammlösung des aktivierten Derivats wurde wie folgt hergestellt: Cyanomethyl-2,3,4,6- tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (Sigma C-4141) in wasserfreiem Methanol (10 ml) wurden mit 5,4 mg Natriummethoxid in einem 1 ml wasserfreiem Methanol bei Raumtemperatur für 48 Stunden behandelt. Die Mischung wurde in einem konischen 25 ml- Kolben, Quickfit (Handelsname), aufbewahrt, der mit einem leicht gefetteten Stopfen versehen war.
  • Eine Stammlösung von SB43 (1,3 mg/ml) wurde in 0,25 M Natriumboratpuffer, PH 8,5, zubereitet. Aliquots der erforderlichen Menge des aktivierten Galactosylderivats (80, 40. 20. 190 ul) wurden in 3 ml-Glasampullen hineingegeben und in einem Stickstoffstrom zu einem glasigen Rest eingedampft. Eine Lösung des Antikörpers (200 ug) wurde hinzugegeben und vermischt, bis sich der Rest aufgelöst hatte. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung gegen dreimal gewechseltes PBS dialysiert.
  • Die Präparationen wurden aufskaliert durch Verwenden von Vielfachen der oben erwähnten Volumina.

Claims (17)

1. Verbindung mit einem Targetzellen-spezifischen Bereich und einem inaktivierenden Bereich, der fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist, wobei (a) die Substanz Thymidin oder ein Analogon davon ist, das fähig ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels, welches auf die Enzymthymidylatsynthetase einwirkt, zu beeinflussen, oder (b) die Substanz Uridin ist, oder (c) der inaktivierende Bereich (1) einen Targetzellen-spezifischen Promotor und (2) ein DNA-Segment aufweist, welches ein Polypeptid codiert, das fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der inaktivierende Bereich ein enzymatisch aktiver Bereich ist.
3. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2, wobei der Targetzellen-spezifische Bereich einen Antikörper oder einen Teil davon aufweist.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Targetzellen-spezifische Bereich fähig ist, selektiv an eine Zellenoberflächeneinheit anzubinden.
5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei die Zellenoberflächeneinheit eine Tumor-assoziiertes Antigen ist.
6. Verbindung nach Anspruch 4, wobei die Zellenoberflächeneinheit ein Zellenoberflächenrezeptor ist.
7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei, wenn die Substanz wie bei (a) ist, der inaktivierende Bereich mindestens den katalytischen Bereich eines Thymidin-abbauenden Enzyms oder von Thymidinkinase aufweist.
8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei, wenn die Substanz wie bei (b) ist, der inaktivierende Bereich mindestens den katalytischen Bereich eines Uridin-abbauenden Enzyms oder von Uridinkinase aufweist.
9. Verbindung nach Anspruch 1, wobei, wenn die Substanz wie bei (c) ist, das DNA-Segment mindestens den katalytischen Bereich von Carboxypeptidase G2 codiert.
10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei, wenn die Substanz wie bei (c) ist, das DNA-Segment mindestens den katalytischen Bereich eines Thymidin-abbauenden Enzyms oder von Thymidinkinase codiert.
11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei, wenn die Substanz wie bei (c) ist, das DNA-Segment mindestens den katalytischen Bereich eines Uridin-abbauenden Enzyms oder von Uridinkinase codiert.
12. Verbindung nach Anspruch 1, wobei, wenn die Substanz wie bei (c) ist, der Targetzellen-spezifische Bereich einen Retrovirus aufweist.
13. Bispezifischer Antikörper, der fähig ist, an ein Targetzellen-spezifisches Antigen und an ein inaktivierendes Molekül anzubinden, das fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur parenteralen Verabreichung.
15. Therapeutisches System mit einer Verbindung mit einem Targetzellen-spezifischen Bereich und einem inaktivierenden Bereich, der fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist, und mit einer Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung des zytotoxischen Mittels zu inhibieren, und welche von dem inaktivierbaren Bereich in eine Substanz umwandelbar ist, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist.
16. Therapeutisches System nach Anspruch 15, wobei entweder das zytotoxische Mittel ein Folsäure-Gegenspieler und die Substanz, die fähig ist, die Wirkung des Mittels zu inhibieren, Folinsäure ist oder das zytotoxische Mittel ein Thymidin-Gegenspieler und die Substanz, die fähig ist, die Wirkung des Mittels zu inhibieren, Thymidin ist oder es eine Kombination beider Gegenspieler ist.
17. Verwendung einer Verbindung mit einem Targetzellen-spezifischen Bereich und einem inaktivierenden Bereich, der fähig ist, eine Substanz, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung eines zytotoxischen Mittels zu inhibieren, in eine Substanz umzuwandeln, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krankheiten eines Patienten, der sich einer Behandlung mit einem zytotoxischen Mittel und mit einer Substanz unterzieht, welche in ihrem nativen Zustand in der Lage ist, die Wirkung des zytotoxischen Mittels zu inhibieren, und welche von dem inaktivierbaren Bereich in eine Substanz umwandelbar ist, die weniger Wirkung gegen das zytotoxische Mittel aufweist.
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