DE69320457T2

DE69320457T2 - Verfahren und anordnung für bioaffinitätsassays

Info

Publication number: DE69320457T2
Application number: DE69320457T
Authority: DE
Inventors: Erkki Kirjala Soini
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-11-09
Filing date: 1993-10-28
Publication date: 1998-12-24
Anticipated expiration: 2013-10-29
Also published as: EP0626069B1; FI925064A0; FI925064A; EP0626069A1; WO1994011735A1; JPH07503325A; DE69320457D1; AU5339394A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren für ein automatisiertes Multiparameter-Bioaffinitäts-Assay unter Verwendung von vorgefertigten Mikropartikeln, die in unterschiedliche Kategorien aufgeteilt sind und unterschiedliche Analyte repräsentieren,
- in welchem Verfahren die Mikropartikel, die zu unterschiedlichen Kategorien gehören, unterschiedliche Mengen eines fluoreszenten Farbstoffs enthalten,
- in welchem Verfahren die Mikropartikel von unterschiedlichen Kategorien mit biospezifischen Reaktanten beschichtet sind, die unterschiedliche Analyte binden,
- in welchem Verfahren die Mikropartikel von unterschiedlichen Kategorien zu einer Suspension gemischt werden, zu welcher Suspension die Probe hinzugefügt wird, wobei zu der Suspension eine Mischung von biospezifischen sekundären Reaktanten hinzugefügt wird, die mit einem Molekül, das Lumineszenz erzeugt oder katalysiert oder einem fluoreszenten oder einem phosphoreszenten Molekül markiert sind,
- in welchem Verfahren der fluoreszente Farbstoff aktiviert und die Stärke der fluoreszenten Emission separat für jedes Partikel zur Identifikation der Mikropartikelkategone gemessen wird,
- und in welchem Verfahren die Markierung des biospezifischen sekundären Reaktanten aktiviert und die biospezifische Bindungsreaktion mittels des Signals von dem Molekül, das Lumineszenz erzeugt oder katalysiert, oder von dem fluoreszenten oder phosphoreszenten Molekül gemessen wird.
Das genannte Verfahren wird speziell dazu verwendet, Multiparameter-Assays, basierend auf der Verwendung von Mikropartikeln, auszuführen und zu automatisieren, besonders in solchen, wie es jene sind, die in US-A-5 028 545 und dergleichen beschrieben sind.
Immunassay ist ein auf Bioaffinität basierendes und ümfassend für biologisch aktive Moleküle in der klinischen Diagnostik und in Forschungslaboratorien verwendetes Assayverfahren. Ein anderes wichtiges auf Bioaffinität basierendes Assayverfahren ist das DNA-Hybridisierungsassay. Der entscheidende Reaktant in Bioaffinitäts-Assays ist z.B. ein Antikörper oder eine DNA-Sonde, der bzw. die sehr häufig an einen festen Träger, wie die Wand eines Testrohrs, gekoppelt wird. Der genannte Reaktant bindet das zu untersuchende Molekül (den Analyt), und die Spezifität des Assays wird vor allem durch die Charakteristika des genannten Reaktanten bestimmt. Bioaffinitäts-Assays, die später auch als biospezifische Assays bezeichnet werden, beinhalten oft einen zweiten Antikörper oder eine DNA-Sonde, der bzw. die mit z.B. einem fluoreszenten Molekül markiert ist. Der in der biospezifischen Reaktion erzeugte Komplex, welcher an die feste Phase gebunden ist und beide biospezifischen Reaktanten umfaßt, das Analytmolekül und die Markierung, wird von dem freien markierten Reaktanten oder der freien Fraktion, beispielsweise durch Wegwaschen der freien Fraktion, getrennt, wonach die Stärke des durch die Markierung erzeugten Signals mittels eines geeigneten mikrophotometrischen Verfahrens gemessen wird, welches in dem Falle von fluoreszenten Markierungen ein Fluorometer ist, und im Falle von Markierungen, die Chemilumineszenz emittieren, ein Luminometer.
In der Diagnostik kann die Bestimmung einer Mehrzahl von Analyten in der gleichen Probe gleichzeitig erforderlich sein, was mit dem Ausdruck "Multiparameter-Assay" bezeichnet wird. Die insoweit in der Literatur beschriebenen Multiparameter- Assays sind auf die gleichzeitige Untersuchung von zwei bis vier Analyten unter Verwendung von jeweils zwei bis vier unterschiedlichen Markierungen, deren Signale eine genügende spektrometrische Auflösung ermöglichen, beschränkt.
In US-A-5 028 545 ist ein neuartiges Multiparameter-Assay- Verfahren für die gleichzeitige Bestimmung von mehr als vier Analyten beschrieben. Dieses Verfahren macht von Mikropartikein (z.B. Latexpartikeln von 10 bis 200 Mikrometern) als dem festen Träger Gebrauch, wobei jedes separate Partikel eine separate stöchiometrische Meßbasis in der jeweiligen Reaktant lösung bildet.
Für jeden spezifizierten Analyt werden Mikropartikel in separaten Chargen derart hergestellt, das unterschiedliche Mengen an Farbstoff zu den unterschiedlichen Chargen (Kategorien) der genannten Partikel für den Zweck der Identifizierung der Mikropartikelkategorien hinzugefügt werden. Der genannte Farbstoff kann auch ein fluoreszenter Farbstoff sein. Der Farbstoff kann gleichmäßig in dem inneren Volumen des Mikropartikels oder auf ihrer Oberfläche verteilt sein. Der in einem Multiparameter-Assay-Verfahren verwendete Reaktant ist eine Mischung von Mikropartikeln unterschiedlicher Kategorien. Die Mikropartikel sind zusätzlich mit dem Bioaffinitätsreaktanten für den spezifizierten Analyt beschichtet.
Wie in US-A-5 028 545 beschrieben, kann die biospezifische Bindungsreaktion mittels einer fluoreszenten Markierung gemessen werden. Die fluoreszente Markierung kann ein Lanthanidchelat mit fluoreszenten Erregungszuständen von langer Lebendauer (länger als 1 Mikrosekunde), verglichen mit der Lebensdauer der Hintergrundfluoreszenz oder der Lebensdauer der fluoreszenten Erregungszustände von konventionellen organischen Farbstoffen, die zur Identifizierung von Mikropartikeln verwendet werden, sein. Die durch Lanthanidchelate erzeugte Fluoreszenz wird mit einem zeitaufgelösten Fluorometer gemessen, welches die effiziente Trennung der durch die Lanthanidchelate emittierten Fluoreszenz von der Hintergrundfluoreszenz und von der Fluoreszenz aufgrund anderer organischer Farbstoffe ermöglicht.
Für die Messung von Analytkonzentrationen mittels eines fluoreszenten Lanthanidchelats kann das zeitaufgelöste Fluorometer verwendet werden, worin die Probe mit einem kurzen Lichtimpuls erregt wird. Für die Messung der langlebigen Fiuoreszenz des Lanthanidchelats und seine Trennung von der Hintergrundfluoreszenz der Mikroteuchen von der Streuung und dem Signal, das durch den Farbstoff emittiert wird, der jeder Kategorie zugeordnet ist, wird der Lichtdetektor nur nach einer spezif ierten Verzögerungszeit, die auf den Erregungslichtimpuls folgt, aktiviert, und die kurzlebige Fluoreszenz erreicht nicht den Lichtdetektor. Die Identifizierung des Mikroteilchens findet andererseits unmittelbar während des Erregungslichtimpulses statt, oder das System enthält einen separaten photometrischen Detektor, der die Lichtabsorption oder kurzlebige Fluoreszenz mißt.
Der Vorteil der zeitaufgelösten Fluorometrie besteht in der Tatsache, daß das Signal von dem für die Identifizierung verwendeten Farbstoff in keiner Weise mit der Messung des Signals von dem Lanthanidchelat interferiert, weil die Messungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt werden. Dieses ist der Grund, warum das System die Messung einer Mehrzahl von Analyten unter Verwendung von Mikropartikeln in der gleichen Suspension ermöglicht.
Eine alternative Markierung für die Detektion der Bioaffinitätsreaktion ist die Verwendung von phosphoreszenten Molekülen. Es wurde kürzlich gefunden, daß gewisse Metallporphyrine, einschließlich Platin-Coproporphyrin und Palladium-Coproporphyrin, Phosphoreszenz in Wasserlösung emittieren und wurden für die Verwendung zum Markieren von Biomolekülen eingeführt (A. P. Savitsky u.a., Dokl. Acad. Nauk. UdSSR, 304, 1005, 1989). Das zeitaufgelöste Meßprinzip und die für die Detektion der Phosphoreszenz benotigte Einrichtung sind im wesentlichen ähnlich bzw. gleichartig der Einrichtung, die normalerweise für die Detektion von Fluoreszenz langer Abklingzeit von Lanthanidchelaten benutzt wird.
Alternativ kann eine biospezifische Bindungsreaktion auch mittels einer lumineszenten Markierung gemessen werden, wobei das genannte Lanthanidchelat durch eine lumineszente Markierung ersetzt wird. Die lumineszente Markierung kann die Form einer Mehrzahl von bereits bekannten chemilumineszenten oder biolumineszenten Molekülen haben. Beispiele von diesen sind u.a. Luciferase-Enzym, Derivate von Luminol oder dergleichen. In diesem Fall werden Mikropartikel durch einen separaten Detektor, der Lichtabsorption oder Fluoreszenz mißt, vor der Aktivierung der lumineszenten Reaktion identifiziert. Der für die Identifikation verwendete Farbstoff wirkt in keiner Weise störend auf die Lumineszenzmessung ein, weil die Erregungsund Emissionsmechanismen total unterschiedlich sind und zu unterschiedlichen Zeitpunkten in den beiden Fällen auftreten.
Da jedes Mikropartikel stöchiometrisch selbständig bzw. unabhängig reagiert, ist es wichtig, daß die Partikel exakt gleiche Größe haben. Es ist heute möglich, Mikropartikel mit präzise der gleichen Größe für diesen Zweck herzustellen. Wenn jedoch die Größenverteilung zu breit ist, kann ein Abbildungslichtdetektor (z.B. ein CCD-Element) dazu verwendet werden, die Mikropartikel durch separate Messung des Durchmessers von jedem Mikropartikel zu identifizieren. Das Ergebnis wird dann dazu benutzt, die angemessene Korrektur der Meßdaten auszuführen.
Die vorerwähnte US-A-5 028 545 beschreibt nicht die aktuelle Art und Weise zum Ausführen und Automatisieren dieses auf Bioaffinität basierenden Multiparameter-Assays. Im allgemeinen basiert eine Fluidhandhabung in den klinischen und anderen Analysiereinrichtungen ("Autoanalysiereinrichtunge"), die heute in Gebrauch sind, auf der Verwendung von Testrohren oder Mikrotiterpiatten, oder es werden Fluide in Rohrleitungen gehandhabt, die durch peristaltische Pumpen und Kolbenpumpen und verschiedene mechanische Ventile gesteuert bzw. geregelt werden, in welchen Rohrleitungen unterschiedliche Proben mittels Luftblasen während des Verteilens bzw. Ausgebens und Transports der Fluide voneinander getrennt werden. Diese Einrichtungen sind durch das Fehlen von Vorsorge für die Handhabung und das Transportieren von Fluidvolumina von weniger als 10 Mikroliter oder Transportieren von Mikropartikeln eines auf einmal mit einer spezifizierten Geschwindigkeit gekennzeichnet. Wenn in diesen Einrichtungen der innere Durchmesser der Rohrleitung so reduziert wird, daß er fast gleich dem äußeren Durchmesser der Mikropartikel ist, können diese Mikropartikel den zuverlässigen Betrieb der mechanischen Ventile gefährden. Die in diesen Einrichtungen gehandhabten Fluidvolumina sind generell wenigstens einige zehn Mikroliter, und die Querkontamination ist in der Größenordnung von 0,1 bis 1%. Die Konzentrationsdynamiken, die in Assays, welche auf Bioaffinität basieren, erforderlich sind, sind wenigstens das Tausendfache oder sehr häufig das Zehntausendfache, und die Verwendung von konventionellen Fluidhandhabungselementen und Rohrleitungen auf dem Gebiet der Anwendung dieser Erfindung wird durch solche Querkontaminationsniveaus inakzeptabel gemacht.
Ein Teil der Fluidhandhabung in konventionellen Analysiereinrichtungen geschieht außerdem in einem offenen System. Ein offenes System in diesem Zusammenhang bezeichnet ein System, in welchem die Proben oder die Reaktanten an einer gewissen Stelle des Assays in offenen Behältern sind, aus denen sie verteilt bzw. ausgegeben oder verdünnt werden können, oder in denen sie inkubiert oder gemessen werden können Beispiele von offenen Analysesystemen in allgemeiner Verwendung sind jene, in denen Proben in Testrohren oder Mikrotiterpiatten gehandhabt werden. Ein geschlossenes Analysesystem in diesem Zusammenhang bezeichnet ein System, in dem die Proben und Reaktanten während des Assays nicht in offenen Behältern enthalten sind, noch sind sie in Kontakt mit Luft außerhalb des Systems oder mit einer gasförmigen Phase, die im Gleichgewicht mit Luft ist. Das Problem bei einem offenen System ist es, daß die Proben und Reaktanten den chemischen Umgebungsfaktoren und der Verdampfung ausgesetzt sind, wie auch, daß das Personal möglichen pathogenen Stoffen bzw. Keimen in den Proben ausgesetzt ist. Außerdem beschränkt die Oberflächenspannung der Fluide die Möglichkeit, Mikrovolumina von 1 Mikröliter oder weniger zu verteilen bzw. auszugeben, und in der Praxis sind die Probenvolumina in allen offenen Systemen während des Prozesses mehr als 10 Mikroliter oder sogar mehr als 100 Mikroliter.
Das auf Bioaffinität und der Verwendung von Mikropartikeln basierende Multiparameter-Assayverfahren, das in US-A-5 028 545 beschrieben ist, kann nicht durch Anwenden der vorstehend erwähnten konventionellen Prinzipien automatisiert werden, weil offene Fluidhandhabungssysteme keine prazise übertragung oder kein präzises Verteilen bzw. Ausgeben von einzelnen oder einer kleinen Anzahl von Mikropartikeln ermöglichen, die in Volumina enthalten sind, welche kleiner als 1 Mikroliter sind. Aufgabe dieser Erfindung ist es, die Art und Weise zu beschreiben, in welcher ein automatisiertes Multiparameter- Bioaffinitäts-Mikroassaysystem aufzubauen ist, das Mikropartikel als einen festen Reaktionsträger und ein System von Mikrokanälen für die Fluidhandhabung umfaßt. Ein System von Mikrokanälen in diesem Zusammenhang bezeichnet Kanäle, die breiter als die für diesen Zweck benutzten Mikropartikel sind, z.B. um das Zweifache der äußeren Dimensionen der für diesen Zweck benutzten Mikropartikel, wobei die genannten Kanäle entweder die Form von dünnen Rohren oder dünnen Kanälen haben, welche innerhalb eines festen Trägers durch Ätzen oder Eingravieren oder durch irgendein anderes geeignetes Verfahren hergestellt sind, wobei die genannten Kanäle separate Fluidhandhabungsoperationen verbinden, und längs welcher Kanäle Suspensionen von Mikropartikeln von einem Punkt zu einem anderen übertragen bzw. transportiert werden. Die Mikrokanäle haben eine derartige geometrische Ausbildung, welche die übertragung bzw. den Transport und die Handhabung von Mikropartikeln in der Form einer Fluidsuspension ermöglicht, während sie eine Verstopfung bzw. Behinderung des Systems der Kanäle durch die Partikel oder ihr Verbleiben in Taschen des Systems von Kanälen vermeiden. Die inneren Dimensionen des Systems der Mikrokanäle sind derart gewählt, daß sie eine Be wegung der Mikropartikel in dem genannten System von Mikrokanälen, zentriert durch Laminarströmung, in dem Zentrum der Mikrokanäle, einzeln in einer Reihe ermöglichen. Jene Teile des Systems der Mikrokanäle, welche zum Speichern von Proben oder die Inkubation bestimmt sind, z.B. das Probenregister, können jedoch weitere interne Dimensionen haben. Wenn ziemlich große Mikropartikel, z.B. größer als 100 Mikrometer, verwendet werden, ist ein geeigneter Innendurchmesser 250 Mikrometer für einen Mikrokanal, der für die übertragung bzw. den Transport einer Suspension von Mikropartikeln gedacht ist. Wenn kleinere Mikropartikel, z.B. von der Größe von 10 Mikrometer, verwendet werden, ist ein geeigneter Innendurchmesser z.B. 50 Mikrometer für einen Mikrokanal, der für die übertragung bzw. den Transport einer Suspension von Mikropartikeln gedacht ist.
Der Zweck der Verwendung eines Systems von Mikrokanälen ist es, Mikrovolumina zu verwenden und gleichzeitig Einsparungen in dem Aufwand für Reagentien zu machen. Kosteneinsparungen werden durch Verminderung der Mengen an spezifischen Reaktanten auf einen Bruchteil, z.B. ein Hundertstel der in modernen offenen Systemen benutzten Volumina, realisiert. In einem auf einem System von Mikrokanälen basierenden geschlossenen Analysesystem, das gemäß dieser Erfindung ausgebildet ist, können Proben von einem Volumen von weniger als 1 Mikroliter oder sogar weniger als 100 Nanoliter quantitativ mit guter Präzision gehandhabt werden. Außerdem erlaubt diese Erfindung eine Mehrzahl von gleichzeitigen unterschiedlichen Bioaffinitätsbestimmungen, d.h., ein spezifiziertes Diagnostikfeld, oder die Kombination von allen Analyten, die z.B. für spezifizierte diagnostische Symptome relevant sind, welche in dem genannten Volumen auszuführen sind. In der Praxis ist eine Kapazität von zehn Analyten wahrscheinlich ausreichend, obwohl es das genannte System glaubhaft ermöglicht, eine sogar größere Anzahl von Analyten gleichzeitig zu messen. Die Übernahme des genannten Mikro-Assaysystems ermöglicht es wahrscheinlich, die Routinediagnostik zu vereinfachen und das Ausmaß der manuellen Handhabung und die Mengen der Reaktanten und des Verpackungsmaterials zu vermindern. In der Reagenzherstellung ermöglicht das genannte System außerdem große Wirtschaftlichkeit. Die Herstellung von Diagnostiktestkits für offene Systeme beinhaltet massige Fluide, beschichtete Testrohre und ihre Verpackung und erfordert außerdem einen hohen Standard an Hygiene. Das Herstellungssystem für Reaktanten für ein geschlossenes Mikro-Assaysystem, derart, wie es hier beschrieben, kann als ein geschlossener Prozeß aufgebaut sein.
Die Aufgabe dieser Erfindung ist es, die Art und Weise zu beschreiben, in welcher ein Assayverfahren der vorstehend erwähnten Charakteristika durch Anwenden des Konzepts eines Systems von Mikrokanälen vollständig automatisiert werden kann.
Diese Aufgabe wird mittels eines Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, welches gekennzeichnet ist durch die Verwendung eines Systems von Mikrokanälen in dem Assay für die Identifikation der Mikropartikelkategorien und die Messung der biospezifischen Bindungsreaktionen und vielleicht auch für das Verteilen bzw. Ausgeben, das Mischen, die Inkubation oder die Trennung der freien Fraktion.
Es ist beobachtet worden, daß sich Mikropartikel in den Mikrokanälen zentriert durch Laminarströmung auf der Mittelachse des Kanals eines nach dem anderen in einer kontrollierten bzw. gesteuerten Art und Weise bewegen. Alle Stadien der Handhabung von Mikropartikeln werden in einem System von Mikrokanälen gemäß dieser Erfindung ausgeführt, das wenigstens die Identifikation der Kategorien und Messung umfaßt, und gemäß der Kapazität der Einrichtung möglicherweise aüch das Verteilen bzw. Ausgeben, das Mischen, die Inkubation und die Trennung der freien Fraktion. Ein Probenregister wird durch die Mikrokanäle und Ventile gebildet, um die gleichzeitige Inkubation einer Mehrzahl von Proben zu ermöglichen.
Das Mischen von Proben und Reaktanten in Verbindung mit dem Verteilen bzw. Ausgeben und während der Inkubation wird durch turbulente Strömung bewirkt, die mittels Hydraulikdruckimpulsen in dem Mikrokanal erzeugt wird, welcher zusätzlich zu den vorerwähnten Fluiden eine Gasphase enthält, die ein elastisches Kissen zum Aufnehmen der Druckimpulse vorsieht. Das Mischen wird in einer solchen Art und Weise bewirkt, daß die Fluide nicht in Kontakt mit sich bewegenden, gegen Abnutzung empfindlichen Teilen sind. Der freie und der gebundene markierte Reaktant werden durch Austauschen der flüssigen Phase in dem Mikrokanal, der die Mikropartikel enthält, getrennt.
Ein System von Mikrokanälen, das die vorstehend erwähnten Erfordernisse erfüllt, ist das System von "Mikrofluidistiken", dessen Betriebsprinzipien und Komponenten u.a. in den folgenden finnischen Patenten beschrieben worden sind: Nrn. 56591, 57849, 57850, 64012, 67490, 70331, 71102, 72660 und 86229. Nach der Publikation der vorstehend erwähnten Patente sind mehr Probenhandhabungsverfahren, Komponenten und ihre Herstellungsverfahren, basierend auf Mikrofluidistiken, entwikkelt worden, wie eine Verteil- bzw. Ausgabenadel für die sterile Wiedergewinnung der Probe aus dem primären Probenrohr, und ein Verfahren für die Herstellung der genannten Nadel, ein Verfahren für das Mischen eines Fluidvolumens in einem Behälter während des Verteilens bzw. Ausgebens mittels der Verteilungs- bzw. Ausgabenadel, und eine nichtlineare Verteilungs- bzw. Ausgabeeinrichtung, die auf einem Metallbaig basiert, wobei die Genauigkeit der Verteiler- bzw. Ausgabeeinrichtung bei allen Volumina konstant ist.
Das Mikrofluidistiken-System, das in den vorerwähnten Patenten beschrieben ist, ermöglicht eine präzise Handhabung und einen präzisen Transport von kleinen Reaktantenvolumina (weniger als 1 Mikroliter) sowie kleine Anzahlen von Mikropartikein oder sogar von einzelnen Partikeln in einem geschlossenen System von Mikrokanälen. Das genannte System ist ein hermetisch abgeschlossenes, steriles System, sofern der Bedarf besteht, ein quantitatives System für die Fluidhandhabung, das aus dünnwandigen Mikrokanälen aus inertem Metall zusammengesetzt ist. Die Fluidhandhabung wird durch elektrisch gesteuerte bzw. geregelte Eisventile geleitet, in welchen Ventilen das Fluid (Probe, Reaktant oder Hilfsfluid) gefroren oder entfrostet bzw. aufgetraut wird, um die Teile zu öffnen oder zu schließen, welche als Tore für die Mikrokanäle funktionieren. Das Volumen der Ventile ist z.B. nur 50 Nanoliter, was bedeutet, daß sie eine verminderte Wärmekapazität haben und infolgedessen ihre Betätigung schnell ist. Ein wichtiger Vorteil der genannten Eisventile in einem System, das gemäß dieser Erfindung ausgebildet ist, wird durch die Tatsache zur Verfügung gestellt, daß die Mikropartikel mechanisch nicht störend auf das Funktionieren der Eisventile einwirken, obgleich ihre äußeren Dimensionen fast gleich den inneren Dimensionen des Mikrokanais sind.
Eine alternative Technologie des Herstellens von Mikrofluidistiken ist die Verwendung von kristallinem Silicium als festes Substrat. Die Mikrokanäle und andere notwendige Strukturen können in dieses Silicium unter Verwendung einer planaren photolithographischen Mikrobearbeitungstechnik geätzt werden, die durch die Mikroelektronikindustrie entwickelt worden ist (M. Salonen und T. Ropponen, Mikromekaniikka, Technische Universität Helsinki, Veröffentlichung Nr. C234, 1991). Es können Standardsiliciumwafer mit einer geeigneten Kristallorientierung und einem Durchmesser von z.B. 100 mm oder größer verwendet werden. Die Verbindungen konnen in die Siliciumwafer auf jeder Seite geätzt werden, und die Flüssigkeit wird durch vertikale Bohrungen zu dem Mikrokanalsystem zugeführt oder aus dem Mikrokanalsystem entfernt.
Die obere Seite der Siliciumwafer besteht aus dünnem Quarzglas, welches unter Verwendung von Standarderhitzungstechnik hermetisch an dem Silicium angebracht ist. Die Quarzabdeckung gestattet eine direkte Strömungsbeobachtung und Detektion der Photonenemission von den lumineszenten, fluoreszenten oder phosphoreszenten Markierungen der Reaktanten auf den Mikropartikeln. Siliciumwafer, wie sie durch die Halbleiterindustrie verwendet werden, sind chemisch extrem rein und enthalten gemäß unseren Testergebnissen keinerlei Verunreinigungen, z.B. Schwermetalle, welche störend auf die Fluoreszenzdetektion der Lanthanidchelate einwirken könnten. Gewisse Arten von Quarz erfüllen auch die Reinheitserfordernisse.
Mikrokanäle für die Flüssigkeitshandhabung können mit einer Präzision von 0,1 Mikrometer (J. Phaler u.a., Liquid transport in micron and submicron channels, Sensors and Actuators, A21 A23 (1990) 431-434) in Silicium geätzt werden. Diese Präzision gestattet Konstruktionen von Reaktionskammern&sub1; in denen die Mikropartikel innerhalb eines geometrisch genau definierten Teils eines Mikrokanais gehalten werden, dessen Wand ein Filter ist. Der prinzipielle Aufbau einer solchen Reaktionskammer ist in Figur 1 gezeigt. Dieser Aufbau ermöglicht ein Waschen der freien Fraktion der markierten Reaktanten ohne Bewegen der Mikropartikel. Die Mikropartikel werden durch den Einlaß 1 zugeführt und durch den Auslaß 2 herausgeführt. Das Waschen wird einfach durch eine Strömung von Waschlösung durch das Filter von dem Einlaß 3 und dem Auslaß 4 ausgeführt. Das Filter 5 verhindert es, daß sich die Mikropartikel 6 in der Richtung der Waschströmung bewegen. Das Filter besteht aus Teilen des Siliciums, das irgendeine optimale Form und irgendwelche optimalen Dimensionen hat. Es ist offensichtlich, daß der Abstand zwischen den Teilen kleiner als der Durchmesser der Mikropartikel sein soll.
Die meisten Microfluidistiken-Funktionen, die in den Patenten beschrieben sind, auf die oben Bezug genommen wurde, können auch durch die Konstruktionen in Silicium ausgeführt werden, einschließlich z.B. von Eisventilen. Die Siliciumtechnologie ermöglicht es, Silicium mit Metallkonstruktionen zu integrieren, und es können Metalle mit hoher Wärmeleitfähigkeit als "kalte Finger" für die Betätigung der Eisventile verwendet werden. Es kann eine hohe Wärmeisolation zwischen den kalten Fingern und anderen Konstruktion mit eingebauten Vakuum- bzw. Unterdruckhohlräumen erreicht werden.
Die Siliciumtechnologie ermöglicht es, Mikropumpenmembranen, Heizelemente, Temperaturaustauscher, Temperatursensoren, Drucksensoren, optische Sensoren, andere optische Elemente und Elektronik in der gleichen Silicumwafer mit den Mikrofluidistiken zu integrieren.
Die prinzipiellen Charakteristika der oben beschriebenen Fluidistiken sind die folgenden:
- Die Fluidhandhabungsräume sind von einer solchen geometrischen Ausbildung, daß die Mikropartikel jederzeit durch einen hydraulischen Mechanismus bewegt werden können, und das System enthält keine Taschen mit einer Größe von den oder größer als die Partikeldimensionen,
- der Aufbau des Systems ist hermetisch und steril, die Eingänge und die Ausgänge sind einer Biosicherheitskontrolle unterworfen,
- das Volumen des flüssigen Abfalls, der intern sterilisierbar ist, ist weniger als 10 - 100 Mikroliter pro Analyse,
- das Fluid ist nicht in Kontakt mit irgendwelchen separaten, sich bewegenden, gegen Abnutzung empfindlichen Komponenten,
- das Verteil- bzw. Ausgabesystem der Fluide ist vollständig hydraulisch (keine Flüssigkeits-Gas-Zwischenphase),
- die Fluide werden innerhalb eines Volumenbereichs von 1 Nanoliter - 100 Mikroliter verteilt bzw. ausgegeben,
- die Genauigkeit der Handhabung der Fluide ist 0,1% in dem Mikroliterbereich und 1 - 5% in dem Nanoliterbereich,
- die Dekontaminationskapazität des Flüssigkeitshandhabungssystems (Querkontamination) ist 0,0001 %,
- für die Reaktanten ist ein hydraulisches Mischen während des Verteilens bzw. Ausgebens und der Inkubation vorgesehen, und die zu mischenden Fluide sind nicht in Kontakt mit sich bewegenden, gegen Abnutzung empfindlichen Teilen.
Die hier beschriebene vollständige Automation umfaßt eine Einrichtung, in welche Fluidproben, z.B. Blutserum, durch ein dünnes Rohr eingespeist werden. Die notwendigen Reaktanten, z.B. die Suspension von Mikropartikeln und die notwendigen Puffer und Waschflüssigkeiten sind in zweckentsprechenden und sterilen (wenn benotigt) Behältern enthalten, die hermetisch mit der Einrichtung verbunden sind.
Proben und Reaktanten werden in dem genannten System in einem geschlossenen Raum und in Mikrovolumina gehandhabt. Die wesentlichen Reaktanten des genannten Systems sind die folgenden:
1. Die Mikropartikelsuspension ist eine Mischung von Mikropartikeln, die mit unterschiedlichen Bioaffinitätsreaktanten beschichtet sind, wobei der Durchmesser der genannten Partikel 1 - 200 Mikrometer ist. Ein Beispiel von kommerziellen Mikropartikeln ist die Auswahl von Duke Scientific Inc. (USA). Es können auch magnetische Mikropartikel verwendet werden.
2. Ein Puffer ist ein Fluid, das zum Optimieren der chemischen Umgebung während der Inkubation verwendet wird. Ein Puffer kann auch benutzt werden, um das System zu waschen.
3. Ein Meßfluid ist ein Fluid, das zum Optimieren der chemischen Umgebung während der Messung der Fluoreszenz des Lanthanidchelats oder während der Messung der Phosphoreszenz oder Lumineszenz verwendet wird. Ein Meßf luid kann einen Verstärker der Fluoreszenz des Lanthanidchelats (z.B. Cofluoreszenz) und ein Reagens zum Eliminieren einer Agglutination der Mikropartikel enthalten.
Ein funktionelles Blockschaltbild des Systems ist in Figur 2 gezeigt, welches die folgenden Teile umfaßt:
1. Einen Multiplatzinkubator 10, in den die Probe, Mikropartikelsuspension und Puffer eingespeist werden. Der Multiplatzinkubator enthält Mikrokanäle, Eisventile und Temperaturregulatoren und ermöglicht eine statistische Eingabe von Proben und eine gleichzeitige Inkubation. In dem Inkubator wird die Probe mit der Mikropartikelsuspension gemischt. Die Inkubationszeit von jeder Probe wird genau gesteuert bzw. geregelt, und die Bioaffinitätsreaktion wird nicht notwendigerweise zum Gleichgewicht gebracht. Die Anzahl der Mikropartikel, die in dem Inkubator zu jedem gegebenen Zeitpunkt ist, hat keine signifikante Wirkung auf die Reaktionskinetik und Präzision, sondern das System ermöglicht eine präzise Zählung der zu nehmenden Mikropartikel, sollte sich dieses als brauchbar für den Zweck der Prazision erweisen. Unterschiedliche Proben können während unterschiedlicher Zeitdauern inkubiert werden.
Gebundener Reaktant wird von freiem Reaktanten getrennt, z.B. durch das gut bekannte Nebenschluß-Wasch-Filter-Verfahren. Ein alternatives Verfahren ist es, die Mikropartikel in dem Inkubator mittels magnetischen Felds zu fixieren und den freien Reaktanten wegzuwaschen, wobei gleichzeitig der freie Reaktant durch das Meßf luid ersetzt wird. Die in dem FI-Patent Nr. 72660 beschriebene geschlossene Durchflußzentrifuge oder das in dem FI-Patent Nr. 67490 beschriebene Filterverfahren können auch für die genannte Trennung verwendet werden.
2. Eine Pumpe 20 für die Übertragung bzw. den Transport von Fluiden in den Mikrokanälen und der Mikropartikelsuspension in den Detektor. Das Pumpen geht weiter, bis die gewünschte Anzahl von Mikropartikeln, die jeder Kategorie entspricht, gemessen worden ist. Die Mikropumpe stellt den Transport der Suspension in die Detektoren mit präzise gesteuerter bzw. geregelter Geschwindigkeit sicher, und das Mikropartikel kann sich bewegen oder stationär sein, während die Messung stattfindet. Die Mikropartikelsuspension ist in diesem Stadium so verdünnt, daß der mittlere Zwischenpartikelabstand in der Strämungskapillare ausreicht, um die optische Auf lösung der Signale, die sie emittieren, zu ermöglichen. Die Mikropumpe -bewegt die Mikropartikelsuspension in dem mikrophotometrischen Meßkanal mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit längs der Mittelachse des Kanals, wobei die Mikropartikel durch Laminarströmung zentriert sind, und der Ort des Partikeis kann in der Richtung der Strömung, wenn das notwendig ist, mit der Präzision von Mikrometern an dem Brennpunkt des photometrischen Detektors bestimmt werden. Die Flüssigkeitsströmung zentriert das Teilchen in der Querrichtung der Strömung mit der gleichen Präzision. Wenn sich die spezifische Masse des Partikels von jener des Meßfluids unterscheidet, wird das Partikel, nachdem es lokalisiert worden ist, d.h. nachdem die Flüssigkeitströmung gestoppt ist, entweder sich absetzen oder gegen die Wand des horizontalen Meßkanals in einem Bruchteil einer Sekunde ansteigen. An dieser Stelle kann eine photometrische, fluorometrische oder luminometrische Messung des Teilchens mit der Genauigkeit und der Empfindlichkeit erfolgen, die für die spezielle Anwendung erforderlich ist.
Die oben beschriebene Mikropumpe kann z.B. eine Balgpumpe sein, welche durch einen computergesteuerten bzw. -geregelten Schrittmotor und einen exzentrischen Antrieb gesteuert bzw. geregelt ist, wobei das Volumen des durch die Pumpe verteilten bzw. ausgegebenen Fluids eine nichtlineare Relation zu dem Drehwinkel des Schrittmotors hat, was einen Transport von sich in weitem Umfang unterscheidenden Fluidvolumina mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit und mit konstanter Präzision erlaubt.
3. Das Element 30, das zum Identifizieren der Mikropartikel verwendet wird, ist eine photometrische oder fluorometrische Einrichtung, die eine Lichtquelle und einen Photodetektor für die Messung des in dem Mikropartikel enthaltenden Farbstoffs und möglicherweise für die Messung des Durchmessers des Mikropartikels enthält. Die Kategorie von jedem Mikropartikel wird durch das System entsprechend der Stärke des Signals von dem Detektor identifiziert. Die aus dem Identifikationsprozeß und aus der Messung erhaltene Information wird als Berechnungsparameter in dem Standardisierungsprogramm für den speziellen Analyt in einem Computer verwendet, welcher die Konzentration des Analyts in der Probe, basierend auf der von dem Detektor (40) für die Markierung erhaltenen Signalstärke berechnet. Das identifizierende Element kann außerdem agglutinierte Mikropartikel detektieren, welche nicht gemessen, aber weg abgeleitet werden.
4. Der Detektor 40 für eine Markierung ist entweder ein zeitaufgelöstes Fluorometer oder Phosphorometer oder ein Luminometer. Die Meßzelle kann eine kommerzielle Durchflußzelle sein, welche z.B. in einem Querschnitt von 0,25 x 0,25 mm und mit einem effektiven Volumen von weniger als 20 Nanoliter mißt, in welchem Volumen das Signal von gerade einem Mikropartikel auf einmal gemessen wird. Alternativ ist die Meßkammer mit anderen funktionellen Teilen in das gleiche Siliciumsubst rat integriert.
Das System enthält weiter für die Steuerung bzw. Regelung der funktionellen Elemente für die Fluidhandhabung und für die Steuerung bzw. Regelung der elektrischen Funktionen, andere erforderliche Funktionen, wie konventionelle Pumpen, Ventile, Fluidbehälter und Temperaturregulatoren wie auch die erforderliche Anzahl von elektronischen Steuer- bzw. Regelelementen und einen Computer für die Systemsteuerung bzw. -regelung und für die Standardisierung sowie die Berechnung der Ergebnisse.
Die beschriebenen Ausführungsformen sind erläuternd und sollten nicht als beschränkend aufgefaßt werden.

Claims

1. Verfahren fur ein automatisiertes Multiparameter-Bioaffinitäts-Assay unter Verwendung von vorgefertigten Mikropartikeln (6), die in unterschiedliche Kategorien aufgeteilt sind und unterschiedliche Analyte repräsentieren,

- in welchem Verfahren die Mikropartikel (6), die zu unterschiedlichen Kategorien gehören, unterschiedliche Mengen eines fluoreszenten Farbstoffs enthalten,

- in welchem Verfahren die Mikropartikel (6) von unterschiedlichen Kategorien mit biospezifischen Reaktanten beschichtet sind, die unterschiedliche Analyte binden,

- in welchem Verfahren die Mikropartikel (6) von unterschiedlichen Kategorien zu einer Suspension gemischt werden, zu welcher Suspension die Probe hinzugefügt wird, wobei zu der Suspension eine Mischung von biospezifischen sekundären Reaktanten hinzugefügt wird, die mit einem Molekül, das Lumineszenz erzeugt oder katalysiert oder einem fluoreszenten oder einem phosphoreszenten Molekül markiert sind,

- in welchem Verfahren der fluoreszente Farbstoff aktiviert und die Stärke der fluoreszenten Emission separat für jedes Partikel (6) zur Identifikation der Mikropartikelkategone gemessen wird,

- und in welchem Verfahren die Markierung des biospezifischen sekundären Reaktanten aktiviert und die biospezifische Bindungsreaktion mittels des Signals von dem Molekül, das Lumineszenz erzeugt oder katalysiert, oder von dem fluoreszenten oder phosphoreszenten Molekül gemessen wird, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Systems von Mikrokanälen in dem Assay für die Identifikation der Mikropartikelkategorien und die Messung der biospezifischen Bindungsreaktionen und vielleicht auch für das Verteilen bzw. Ausgeben, das Mischen, die Inkubation oder die Trennung der freien Fraktion.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Fluidtransport in dünnwandigen Mikrokanälen, die aus inertem Metall durch Elektro- bzw. Galvanoformung hergestellt sind, oder durch Fluidtransport in Mikrokanälen, die zu einem Substrat gemacht sind, hergestellt mit Lithographie und Ätzen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung einer geschlossenen Ausführung des Fluidhandhabungssystems, das von Mikrokanälen gebildet ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung von Eisventilen für die Steuerung bzw. Regelung des Betriebs des Systems der Mikrokanäle und/oder das Verteilen bzw. Ausgeben von Fluiden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung des hydraulischen Verteilens bzw. Ausgebens von Fluiden so, daß im wesentlichen keine Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche während des Verteilens bzw. Ausgebens in den Mikrokanälen vorhanden ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Steuerung bzw. Regelung der Strömung der Mikropartikel in dem System von Mikrokanälen bei bzw. mit varuerender Geschwindigkeit, bestimmt durch eine Mikropumpe (20), die präzise mittels eines Computers gesteuert bzw. geregelt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet durch die Identifikation und Messung der Bewegung der Mikropartikel (6) mittels mikrophotometrischer Detektoren und Zuführen der resultierenden Daten in den Computer, welcher die Pumpe (20) steuert bzw. regelt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Mikropumpe (20), die eine nichtlineare Balgpumpe ist, mit konstanter Präzision über einen weiten Bereich von Volumina.

9. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch die Verwendung eines von Mikrokanälen und Ventilen gebildeten Probenregisters für die gleichzeitige Inkubation der Proben.

10. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch die Trennung von freien und gebundenen markierten Reaktanten mittels extensiver Verdünnung oder durch Austauschen der Fluidphase, welche die Mikropartikel (6) enthält.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, gekennzeichnet durch die Optimierung der neuen Fluidphase, die aus dem Austausch oder der Verdünnung resultiert, um eine maximale Assay-Empfindlichkeit der Markierung vorzusehen.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10, gekennzeichnet durch die Trennung des freien Reaktanten von den Mikropartikeln (6) mittels Verdünnung oder Umleitungs- bzw. Nebenschlußströmungsfilterung in einen Mikrokanal, der eine Ebene oder eine Einrichtung zum Zurückhalten der Mikropartikel (6) enthält.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Einrichtung, die eine geschlossene Durchflußzentrifuge ist.

14. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch Mischen von Proben und Reaktanten während des Verteilens bzw. Ausgebens und der Inkubation mittels turbulenter Strömung, die durch Hydraulikdruckimpulse in einem Mikrokanal erzeugt wird, der zusätzlich zu den vorerwähnten Fluiden eine Gasphase für die elastische Aufnahme der Druckimpulse enthält.

15. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, gekennzeichnet durch die Dekontamination des Systems von Mikrokanälen nach einer vorhergehenden Probe durch Pumpen einer Mischung von Fluid und Gas durch das System der Mikrokanäle.