DE69320437T2

DE69320437T2 - Analysenkassette und system zum aufspüren von analyten

Info

Publication number: DE69320437T2
Application number: DE69320437T
Authority: DE
Inventors: Marina Redwood City Ca 94062 Saltman; Bernhard Boe Danville Ca 94526 Sterling; Kumar Alameda Ca 94501 Subramanian; Jeffrey Sunnyvale Ca 94087 Sugarman; Fred Pleasanton Ca 94566 Voss
Original assignee: Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1992-04-10
Filing date: 1993-04-07
Publication date: 1999-02-11
Anticipated expiration: 2013-04-08
Also published as: WO1993020939A1; ES2123050T3; AU3976793A; JP2944216B2; DE69320437D1; JPH06509279A; CA2109704A1; EP0593714A4; US5223219A; CA2109704C; EP0593714A1; EP0593714B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Analysensysteme und insbesondere kleine, vom Patienten zu bedienende Analysensysteme, mit denen eine chemische oder biochemische Analyse an einer Probe einer Körperflüssigkeit, wie z. B. Blut, durchgeführt werden kann.
Es ist eine große Vielzahl von Assays entwickelt worden, die die Reaktion einer Probe mit Reagenzien umfassen, die in einem porösen Substrat vorhanden sind. Bei einigen dieser Arbeiten wird Probe auf einen porösen Streifen an derselben Stelle aufgetragen, wo Reagens vorhanden ist. Die Reaktion findet an dieser Stelle statt, und die Assayergebnisse werden entweder visuell oder durch Reflexionsspektroskopie ermittelt, nachdem der Teststreifen in eine geeignete Ablesevorrichtung eingeschoben wurde. In anderen Fällen wandert flüssige Probe durch ein poröses Medium, um an einer zweiten Stelle zu reagieren, wobei die Ergebnisse wie oben erhalten werden. Bei derartigen Assays gibt es jedoch eine Reihe von Schwierigkeiten, wenn sie von jemandem ohne entsprechender Ausbildung oder am Krankenbett eines Patienten an einem Ort fern von einem Testlabor verwendet werden. Die quantitative Bestimmung der Ergebnisse ist schwierig, wenn die Teststreifen visuell untersucht werden. Bei einem Reflexionsspektrometer können zwar präzise Ablesungen vorgenommen werden, der Teststreifen muß jedoch in ein Spektrometer eingeschoben werden, und der Betrieb des Spektrometers muß richtig durchgeführt werden, was für ungeschulte Benutzer schwierig ist. Ähnliche Probleme gibt es mit Streifen, bei denen Probe durch Aufgesaugtwerden in einen porösen Streifen transportiert wird, aber solche Streifen erfordern auch größere Probenmengen, um die gesamte Länge eines porösen Streifens zu benetzen.
Jedes Analysensystem, das von Patienten angewandt werden soll, muß so einfach wie möglich funktionieren. Beispielsweise sollte es nicht notwendig sein, daß ein Benutzer nach der Zugabe der Probe Schalter betätigt, lichtdichte Türen schließt oder öffnet oder die Probe oder den Reagensstreifen oder ein anderes Material, dem die Probe zugesetzt wurde, manipuliert. Derartige Manipulationen verringern die Genauigkeit der Assayergebnisse, wenn sie von einem ungeschulten Benutzer durchgeführt werden sollen.
Außerdem sollte bei jedem Assaysystem, bei dem Blut als Probe verwendet wird, aufgrund der Schwierigkeiten beim Erhält von Blutproben von Patienten, insbesondere, wenn die Probe vom Patienten selbst gezogen wird, das geringstmögliche Volumen verwendet werden. Wenn sich Patienten selbst Blut abnehmen, wird wegen der einfachen Durchführung von einem Fingerstich erhaltenes Kapillarblut bevorzugt, aber für die Assays sind nur geringe Volumina (weniger als 50 ul) verfügbar.
Einige dieser Einschränkungen widersprechen einander. Das Aufbringen eines kleinen Bluttropfens oder einer anderen Probe auf einen Teststreifen und die Analyse an der gleichen Stelle erfordert im allgemeinen irgendeine Manipulation von Teststreifen oder Monitor, wie durch Schließen einer lichtdichten Tür, um zu verhindern, daß Umgebungslicht die Reflexionsablesungen stört. Probentransportsysteme erfordern im allgemeinen größere Probenmengen und werden daher für kleine Proben einzelner Tropfen nicht eingesetzt.
Die US-A-4.756.844 der Anmelderin beschreibt Verfahren und Vorrichtungen, bei denen einheitliche Kapillarflußspuren verwendet werden, um Proben, die auf eine Einweg-Kassette aufgebracht werden, unter Einsatz von Kapillarwirkung in das Innere eines Monitors zu ziehen. Beispiele für solche Analysensysteme sind das Biotrack PT- und PTT-System, mit denen Blutgerinnungsraten gemessen werden. Die Weiterentwicklung solcher Systeme, um die gleichzeitige Bestimmung mehrere Analyten zu ermöglichen und die Meßkapazität auf andere Analytenarten auszudehnen, sind natürlich wünschenswert.
Es gibt eine Reihe von Vorrichtungen zum Bestimmen von Analyten in geringen Probenvolumina unter Verwendung von Einwegkassetten und Tisch-Analyseninstrumenten. Die US-A-4.756.884 beschreibt Verfahren und Vorrichtungen, bei denen Kapillarflußspuren verwendet werden, um Proben auf die Gegenwart von Analyten und Eigenschaften der Probe, wie z. B. Gerinnungsraten von Blutproben, zu analysieren. Analysenkassetten, mit denen mehr als eine Art der Analyse in einer einzigen Einwegkassette durchgeführt werden können, werden in der EP-A-397 424 beschrieben. Die US-A-4.233.029 beschreibt eine Flüssigkeitstransportvorrichtung, die aus gegenüberliegenden Oberflächen gebildet ist, die in einem Abstand voneinander angeordnet sind, mit dem wirksam Kapillarfluß von Flüssigkeit bewirkt werden kann, ohne daß ein Mittel zur Steuerung der Kapillarflußrate bereitgestellt wird. Die US-A-4.618.476 und 4.233.029 beschreiben eine ähnliche Kapillartransportvorrichtung, die Geschwindigkeits- und Meniskussteuermittel aufweist. Die US-A-4.426.451 beschreibt eine weitere ähnliche Kapillartransportvorrichtung, die Mittel zum Unterbrechen des Flusses zwischen zwei Zonen umfaßt, wobei der Fluß durch Anwendung eines äußerlich ausgeübten Drucks wiederaufgenommen wird. Die US-A-3.799.742 beschreibt eine Vorrichtung, bei der eine Änderung der Oberflächenbeschaffenheit von hydrophil zu hydrophob eingesetzt wird, um den Fluß einer kleinen Probe zu unterbrechen, wodurch die vorhandene Probe gemessen wird. Die US A-4.946.795 und 5.077.017 beschreiben eine Reihe von Verdünnungs- und Mischkassetten, bei denen das Vermischen in kleinen Kapillar- und Nichtkapillarräumen stattfindet. Die US-A-5.004.923 beschreibt eine Kapillarflußvorrichtung, worin die Volumsverhältnisse zwischen den verschiedenen Teilen erörtert werden, wobei eine Aufnahmekammer ein Volumen aufweist, daß gleich groß wie oder größer als jenes der Reaktionskammer ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Analysenkassette bereitzustellen, die unabhängig vom auf die Kassette gemäß vorliegender Erfindung aufgebrachten Probenvolumen für fehlerfreien Betrieb sorgt.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine Kassette bereitzustellen, die für jeden der zur Zeit bestehenden oder in Zukunft entwickelten Festsubstratassays verwendet werden kann, die auf Reflexionsablesungen von einer reflektierenden Matrix beruhen, während die hierin beschriebenen Vorteile der Erfindung beibehalten werden.
Diese und andere Ziele der Erfindung sind erreicht worden, indem eine Analysenkassette nach Anspruch 1 als Diagnosesystem bereitgestellt wurde, das einen Monitor und eine in den Monitor einsetzbare Analysenkassette gemäß vorliegender Erfindung umfaßt. Der Monitor enthält mehrere Lichtquellen und -detektoren zum Vornehmen von Reflexionsablesungen in einer Anordnung einzelner Positionen in der Kassette, wenn sie sich im Inneren des Monitors befindet. Die Kassette wird fest in einer fixen Position gehalten, so daß Reflexions-Ablesestellen in der Kassette in bezug auf die Reflexionsablesungsvorrichtungen richtig ausgerichtet sind. Die Zahl der Reflexions-Ablesevorrichtungen im Monitor ist zwar fixiert, aber die Anzahl an Reflexions-Ablesestellen in der Analysenkassette kann je nach Anforderungen der einzelnen Kassette variieren. Wenn die Analysenkassette in den Monitor eingesetzt ist, erstreckt sich ein Abschnitt der Analysenkassette aus dem Gehäuse des Monitors heraus, so daß Probe auf die Analysenkassette aufgebracht werden kann. Eine (oder mehr als eine) Kapillarspur verbinden die Aufbringstelle mit jeder der Reflexions-Ablesestellen. Die Analysenkassette kann ein Element einer Sammlung von Kassetten sein, die sich jeweils in irgendeinem Aspekt der Chemie unterscheiden, die auf den reflektierenden Matrizen vorhanden ist, die an den Reflexions-Ablesestellen vorliegen, und die weiters jeweils unterschiedliche Reflexions-Ablesestellen aufweisen können, solange sich die Ablesestellen in der richtigen Ausrichtung in bezug auf die Anordnung von Reflexions-Ablesevorrichtungen befinden, die im Monitor vorhanden sind. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfassen auch funktionelle Merkmale, die dazu bestimmt sind, die Präzision der Messung zu optimieren, etwa indem sie steuern, wann und ob Probe Reflexionsablesestellen erreicht, oder indem überschüssige Probe von unerwünschten Stellen in der Kassette abgezogen wird, und dazu gehört das Ermitteln der relativen Flüssigkeitshaltekapazitäten der Aufbringstelle, des probentransportierenden Kapillarkanals, der zur Reflexions- Ablesestelle führt, und der porösen Matrizen, von denen die Reflexionsablesung erfolgt, und durch Gewährleistung eines Kapillargleichgewichts, wie in Anspruch 1 angeführt, kann überschüssige Probe darin daran gehindert werden, in die Kassette einzutreten, während Probenvolumina, die unter dem zum präzisen Betrieb erforderlichen Minimum liegen, die Matrix nicht erreichen, wodurch falsche Ablesungen vermieden werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie zum besseren Verständnis unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung in Kombination mit den Zeichnungen betrachtet, die einen Teil der Beschreibung bilden und worin:
Fig. 1 eine Draufsicht auf vier Kassetten gemäß vorliegender Erfindung ist, bei denen eine Aufbringstelle und eine Reihe von Verzweigungskapillaren Probe zu einer von fünf potentiellen einzelnen Reflexions-Ablesestellen lenken;
Fig. 2 eine Draufsicht auf eine fünfte Ausführungsform der Erfindung ist;
Fig. 3 eine Reihe von Querschnittsansichten der in Fig. 2 gezeigten dritten Ausführungsform entlang der Linien A-A, B-B und C-C ist, die die Kapillarspur und Reagensstapel zeigt;
Fig. 4 eine Draufsicht auf eine sechste Ausführungsform einer Kassette gemäß vorliegender Erfindung ist;
Fig. 5 eine Querschnittsansicht auf eine siebente Ausführungsform einer Kassette ist, die Kräfte zeigt, die zum kontinuierlichen Fluß von Probe in einen Assaystapel führen;
Fig. 6 eine perspektivische Ansicht einer Aufbringstelle mit einem Überlaufregelschlitz ist;
Fig. 7 eine Querschnittsansicht einer anderen Ausführungsform des Aufbringstellen- Überlaufreglers ist;
Fig. 8 eine auseinandergezogene Querschnittsansicht eines optischen Fensters an einer Assaystapelstelle ist, die die Verwendung von Leisten zeigt, um gekrümmte Flüssigkeitsoberflächen zu vermeiden;
Fig. 9 eine Draufsicht auf eine vierte Ausführungsform der Erfindung ist, die Kapillarkanäle zeigt, die verwendet werden, um den Flüssigkeitsstrom zu regulieren und Fehlbetrieb der Kassette zu verhindern;
die Fig. 10 bis 13 Ansichten von drei Ausführungsformen zum Regulieren des Eintritts von Probe in einen Assaystapel sind;
Fig. 14 eine Querschnittsansicht einer neunten Ausführungsform einer Kassette gemäß vorliegender Erfindung ist.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung umfaßt ein System, das Analyten-Sets (oder in manchen Fällen einzelne Analyten) in kleinen Blutproben oder anderen Probenflüssigkeiten einem Assay unterzieht. Das System umfaßt (1) Einwegkassetten, die mechanische und chemische Mittel zum (a) Bearbeiten (Bewegen, Aliquotieren, Mischen, Entfernen roter Blutkörperchen usw.) und (b) Umsetzen mit spezifischen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, üblicherweise Vollblut, enthält und (2) einen Monitor, der eine kleine elektromagnetische Vorrichtung ist, in die die Einwegkassette eingepaßt werden kann, die deren Temperatur reguliert, die Reflexion eines Satzes von Assaypositionen bestimmt und die Assayergebnisse berechnet und noch andere Funktionen erfüllt.
Kassetten/Monitor-Systeme für verschiedene Sätze von Analyten sind möglich (z. B. Glucose, Cholesterin, Hämoglobin; Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin, Triglycerid). Jedes System hat eine andere Kassette, und die physische Beschaffenheit und Konstruktion jeder Kassette kann anders sein. Alle Kassetten in einem Satz haben jedoch identische Außendimensionen und weisen Reflexionsmatrizen auf, die sich an einer oder mehreren Positionen eines Satzes fixer Positionen befinden. Der Monitor ist allen Assays in einem Satz gemeinsam.
Typischerweise wandelt die Chemie bei einem bestimmten Assay den Analyten in ein gefärbtes Produkt (Chromophor) um. Dieses Produkt ändert die Reflexion einer diffus reflexiven Membran, die von einem Monitor bei einer Wellenlänge gemessen wird, die einem geeigneten, üblicherweise dem maximalen, Absorptionsvermögen des Chromophors entspricht.
Der Monitor ist mit Lichtquellen ausgestattet, üblicherweise einer oder mehreren lichtemittierenden Dioden (LEDs). Beispielsweise können vier Dioden mit Emissionen verwendet werden, die den sichtbaren und den nahen Infrarot-(IR-)Bereich des elektromagnetischen Spektrums abdecken. Die sichtbares und IR-LEDs decken einen großen Bereich von Wellenlängen ab, was die Messung einer großen Vielzahl von farbgebenden Chemikalien ermöglicht, insbesondere jener, die durch Oxidation eines Leukofarbstoffs mit Wasserstoffperoxid, katalysiert durch Peroxidase, ein gefärbtes Produkt erzeugen.
Bei einer bevorzugten Version des Monitors wird das Licht von den LEDs gemischt und unter Verwendung einer Faseroptik von den Quellen zu den Stapeln gelenkt. Auf diese Weise können alle Stapel von allen Lichtquellen beleuchtet werden. Durch Betreiben der Quellen in zeitlich abgestimmter Abfolge und Multiplexen der Reaktion von den Reflexionsdetektoren ist es möglich, die Reflexion bei allen Beleuchtungswellenlängen an allen Stapeln über den zeitlichen Assayverlauf zu messen.
Die Einweg-Analysenkassetten umfassen ein flüssigkeitsundurchlässiges Gehäuse, eine Probenaufbringstelle, eine Reflexions-Ablesestelle, die sich im Monitor befindet, wenn die Kassette in den Monitor eingesetzt ist, einen Probentransportkapillarkanal, der die Aufbringstelle mit der Reflexions-Ablesestelle verbindet, und eine poröse Matrix, die sich in der Reflexions-Ablesestelle befindet. Die Flüssigkeitshaltekapazitäten der Probenaufbringstelle, des Probentransport-Kapillarkanals und der porösen Matrix werden so gewählt, daß die Probentransportkapazität größer ist als die Kapazität der porösen Matrix und die Aufbringstellenkapazität geringer ist als die Summe aus der Probentransportkapazität und der Kapazität der porösen Matrix. Durch Bereitstellen dieser relativen Kapazitäten und dadurch, daß die Kapillartransporteigenschaften der verschiedenen Kanäle und Komponenten so gewählt werden, daß Probe selektiv zur porösen Matrixprobe gezogen wird, wobei die nachstehend im Detail erörterten Konstruktionsanforderungen gelten, können sehr kleine Proben vollständig in die poröse Matrix gezogen werden, so daß weder an der Aufbringstelle, noch im Probentransport-Kapillarkanal Probe verschwendet wird. Andererseits ermöglicht die richtige Konstruktion der Aufbringstelle und die Verwendung zusätzlicher Kapillarkanäle, um überschüssige Probe zu regulieren, den richtigen Betrieb der Kassette in den Händen eines ungeschulten Benutzers.

Überblick über das System und seinen Betrieb

Diese einleitende Beschreibung ist die einer typischen Version einer Kassette und soll einen Überblick bieten. Die wesentlichen Komponenten der Erfindung werden später im Detail mit ihrer Funktion erklärt.
Jede Kassette umfaßt ein Gehäuse, das aus Spritzgußkunststoff (beispielsweise Acrylnitril/Butadien/Styrol oder "ABS") besteht, der später zu beschreibende andere physikalische und chemische Komponenten enthält. Die Herstellung ähnlicher Kassetten für andere Zwecke wird in den zuvor beschriebenen Patenten und Patentanmeldungen beschrieben. Um ein Assay durchzuführen, setzt ein Benutzer die Kassette in den Monitor ein, der durch das Einsetzen aktiviert wird. Die Kassette weist üblicherweise Hinweise, Eingreiflöcher und Schlitze auf, so daß das Einsetzen nur in der richtigen Ausrichtung durchgeführt werden kann. Die Kassette ist im wesentlichen flach (mit einigen Vorsprüngen, die nachstehend ebenfalls angeführt werden) und wird typischerweise in horizontaler Ausrichtung verwendet, obwohl auch andere Ausrichtungen zulässig sind. Ein Strichcode (oder ein anderes Signal) an der Kassette identifiziert die Kassette und ihr Ablaufdatum und kann vom Monitor abgelesen werden, der eine Erkennungsoptik oder andere Sensorvorrichtungen aufweist. Wenn der Monitor die Kassette erkennt und das Ablaufdatum nicht überschritten ist, zeigt der Monitor dem Benutzer einen Satz von Instruktionen an; falls nicht, wird eine Fehlermeldung angezeigt. Bevor der Benutzer dazu aufgefordert wird, eine Probe aufzubringen, wird die Kassette auf eine bestimmte Temperatur erhitzt, wenn das für ein Assay auf der Kassette erforderlich ist. Nach Aufforderung bringt der Benutzer einen Tropfen Blut auf eine Aufbringöffnung auf, die sich an der Oberseite des Teils der Kassette befindet, der aus dem Monitor herausragt. Diese Öffnung ist üblicherweise von einem Steg umgeben, der wiederum an seiner Kante von einer kleinen Lippe umgeben ist (siehe Fig. 3 und deren Erörterung). Der Steg und die Lippe dienen dazu zu verhindern, daß jegliche Probe, die über die Aufbringöffnung hinausfließt, den Monitor oder seine Umgebung erreicht. Probe fließt von der Aufbringöffnung in einen Kapillarkanal, der in der Kassette eingeschlossen ist, wobei die Antriebskraft weitgehend Kapillarwirkung ist. Während früher Stadien der Probenbewegung ist üblicherweise auch unausgeglichene Schwerkraft vorhanden, diese ist aber typischerweise nicht vorhanden oder relativ klein, nachdem Probe vollständig in die horizontale Probentransportkapillare eingetreten ist. Die Innenflächen des Kunststoffs, aus dem die Kassette besteht, werden (falls notwendig) nach einem Ätzverfahren modifiziert, um die inneren Kapillarkanäle hydrophil zu machen, so daß sich das Blut durch Kapillarkraft spontan über die Oberflächen der Spur verbreitet. Probe bewegt sich durch die Kapillare, bis sie eine oder mehrere Verbindungsstellen zu anderen Verzweigungskanälen erreicht, die zu einem Satz von Assaystapeln führen, von denen jeder eine poröse Matrix oder eine Serie poröser Matrizen in engem Kontakt miteinander darstellt. Verschiedene Schichten des Assaystapels können verschiedene Funktionen erfüllen, wie z. B. Herausfiltern von roten Blutkörperchen aus dem Blut, Trennen von Reagenzien voneinander, oder Funktion als Reflexionsmatrix, an der eine optische Ablesung vorgenommen wird. Dabei handelt es sich um herkömmliche Assaystapel, wie nachstehend erörtert. Die Stapel werden in einer (üblicherweise kreisförmigen) Innenkammer oder einem äußeren Hohlraum in der Kassette gehalten. Bei bevorzugten Ausführungsformen sind Kanäle in die Basis des Stapelhohlraums geformt, wo der Kapillarkanal in den Hohlraum mündet, um dazu beizutragen, daß die Probe gleichmäßig in den Stapel fließt. Der Stapel selbst besteht aus einer Reihe (allgemein) scheibenförmiger, poröser Komponenten, die koaxial mit der Hohlraumachse angeordnet und in bevorzugten Ausführungsformen durch eine Leiste in der Außenfläche der Kassette im Hohlraum gehalten werden, die aus der Hohlraumwand zur Mitte ragt. Bei solchen Ausführungsformen ist ein Loch in der Kassette vorhanden, das eine diffusiv reflektierende Matrix sowohl gegenüber der Atmosphäre als auch gegenüber der Optik des Monitors freilegt. Bei anderen Ausführungsform sind die Stapel vollständig in einer Innenkammer eingeschlossen, und Reflexionsablesungen werden durch das Gehäusematerial hindurch vorgenommen, das zumindest an der Position der Kammer, durch die die Ablesung erfolgt, für die Wellenlänge der verwendeten Strahlung durchlässig ist. Die Stapelkomponenten sind nahe beieinander angeordnet, um eine Struktur zu bilden, die kontinuierliche Kapillargestalt aufweist, so daß die Probe in den Stapel gezogen wird, bis die Poren schließlich gesättigt sind. In Kassetten mit mehr als einem Stapel füllen sich alle Stapel mit Probe, vorausgesetzt, daß ausreichend Probe aufgebracht worden ist. Die Reihenfolge und Rate des Füllens wird durch die Abmessungen der Kapillarkanäle und die Struktur der Stapel bestimmt, wie nachstehend erörtert. Im allgemeinen jedoch können die Stapel leicht so konstruiert werden, daß sie sich in weniger als drei Minuten füllen.
Bei Tests, bei denen Plasma die gewünschte Probe ist und Vollblut die Probe ist, wirken die Stapel als Filter für rote Blutkörperchen. Die Filterstapel umfassen eine Faser-Schicht (typischerweise Polypropylen), die ein Agglutinierungsmittel für rote Blutkörperchen enthält, das auf das Fasermaterial aufgetrocknet wurde. Wenn sich die Probe durch den Filter bewegt, geht das Mittel in das Plasma in Lösung und bewirkt, daß die roten Blutkörperchen zusammenklumpen und dadurch im Faser-Filter eingeschlossen werden. Plasma, das nun weitgehend von roten Blutkörperchen frei ist, geht weiter durch den Stapel hindurch. Eine dünne Membranschicht kann an die Faserschicht angrenzend angeordnet sein, um jegliche verbleibenden roten Blutkörperchen zu entfernen, wenn eine genauere Trennung erforderlich ist, als durch die Verwendung des Filters allein möglich ist. Plasma bewegt sich dann in eine Schicht, die mit einer Assaychemikalie getränkt ist, die das Plasma löst und mit dem Analyten reagiert, um ein gefärbtes Produkt zu bilden. Zu den Assaychemikalien gehören typischerweise Salze, Puffer, Detergenzien, Enzyme, Chromogene, Stabilisatoren und Bakterizide oder Bakteriostate. Üblicherweise ist die Schicht, die die Assaychemikalie trägt, die äußerste Schicht des Stapels. Die äußere Schicht, die als reflektierende Matrix fungiert, und das Chromogen werden sorgfältig so ausgewählt, daß im Bereich von klinischem Interesse die Schicht optisch dick ist und die Reflexion der Schicht nach der Assayreaktion K/S-Werten im Bereich von 0,2 bis 2 entspricht. Eine Schicht ist optisch dick, wenn Steigerungen der Dicke der Schicht unabhängig vom Material, das auf der Seite der Schicht, die vom einfallenden Licht abgewandt ist, keine Wirkung auf die Reflexionsablesungen haben. Ein Beispiel für eine solche Wahl ist nachstehend im Detail erörtert. Gegebenenfalls kann die Faserschicht Assaychemikalien, Puffer, Salze, oberflächenaktive Mittel oder Stabilisierungsreagenzien enthalten. Auch andere poröse Schichten können vorhanden sein, um Zusatzmittel zu tragen, Flüssigkeitsbewegungen zu regulieren, Licht zu reflektieren oder zu absorbieren, oder für andere Zwecke. Der Monitor zeichnet die Reflexion der Trägerschicht während der Assayreaktion auf, typischerweise bei drei Wellenlängen. Durch Vergleichen der Änderung in der Reflexion mit jenen für bekannte Kalibriermaterialien kann der Monitor die Analytkonzentration berechnen. Die zweite und die dritte Wellenlänge kann für Qualitätskontrollvorgänge und für andere Zwecke eingesetzt werden. Der Monitor kann auch bestimmen, ob der Betrieb der Vorrichtung beeinträchtigt oder die Probe beschädigt (beispielsweise hämolysiert) wurde, da diese Zustände charakteristische Reflexionswerte erzeugen.
Bei einigen Assays, beispielsweise dem auf Hämoglobin, wo die erforderliche Probe Vollblut ist, wird der Filter für die roten Blutkörperchen durch eine poröse, reagenshältige Scheibe ersetzt. Durch entsprechende Wahl von Porosität und Reagensformulierung bildet sich in der Scheibe ein gleichmäßiges Gemisch aus Blut und Reagens und kann dann einer optischen Analyse unterzogen werden.
Bei Durchführung eines Assays auf mehrere Analyten gehen bestehende Systeme unerwünschte Kompromisse ein. Entweder ist die Assayleistung (Präzision, Genauigkeit) für die optimale Patientenbetreuung nicht geeignet, oder die Systemkonfiguration und die Assaydurchführung sind umständlich und umfangreich und nur für eine Laborsituation geeignet. Die Erfindung ermöglicht es, qualitativ hochwertige Assayleistung mit Zweckmäßigkeit für den Benutzer und Zuverlässigkeit des Systems zu kombinieren. Nachstehend folgt eine Liste der funktionellen Attribute der Erfindung und deren logischen Auswirkungen auf die Struktur.
1. Es kann ein sehr geringes Probenvolumen eingesetzt werden. Das ist auf die geringe Größe des Stapels und die Fähigkeit des Systems zurückzuführen, die gesamte Probe zu verwenden, um die Stapel zu füllen. Die Porosität der Stapel kann so gewählt werden, daß Probe von den Zufuhrkapillaren vollständig in die Stapel gezogen wird. Mit anderen Worten, die Probenaufbringstelle und die Transportkapillaren können entleert werden, ohne daß die Ergebnisse beeinträchtigt werden. Die Verwendung eines geformten Gehäuses (das starr ist) ermöglicht das präzise Ausrichten der Stapel mit der Optik im Monitor und genau definierte, gut reproduzierbare Mikrohohlräume, um die Stapel aufzunehmen.
2. Mehrere Ergebnisse können von einem einzelnen, nicht abgemessenen Probentropfen erhalten werden. Das wird durch die Kapillarkanäle erreicht, die eine einzelne Aufbringstelle mit mehreren Stapeln verbinden. Um Ergebnisse von einem einzelnen Tropfen (von typischerweise etwa 35 ul) zu erhalten, ist das geringe Volumen der Stapel und der Kapillarkanäle, die zu ihnen führen, wichtig. Dieses Merkmal stellt eine entscheidende Verbesserung gegenüber zur Zeit verfügbaren Systemen dar.
3. Assays mit sehr unterschiedlichen chemischen Einschränkungen (z. B. klinischer Bereich, Art des Analyten) können in derselben Vorrichtung gleichzeitig bestimmt werden. Beispielsweise können unterschiedliche Assays sehr unterschiedliche Analytmengen zu messen haben. Glucose ist in Konzentrationen von 1 bis 25 mM in menschlichem Blut plasma vorhanden, während für die Messung des Enzyms Alanin-Aminotransferase in einem vernünftigen Zeitrahmen die Messung von 0 bis 0,2 mM Enzymprodukt erforderlich ist. Um die Messung von Analyten in so unterschiedlichen Mengen unter Verwendung von Chemie zu ermöglichen, die den Analyten stöchiometrisch in lichtabsorbierende Produkte umwandelt, ist es vorteilhaft, optimale Chromophore und reflektierende Membranen so auszuwählen, daß eine optimale Selektion für eine große Vielzahl von Analyten erfolgen kann. Eine Liste von Beispielen für Analyten und entsprechende bevorzugte Chromophore und reflektierende Membranen ist in nachstehender Tabelle 1 vorgesehen und veranschaulicht Techniken zum Modifizieren der K/S-Werte, um die unterschiedlichen Analytkonzentration unterzubringen. Tabelle 1 Die Paarung von Chromogenen und Trägern mit Kubelka-Munk-(K/S-)Anforderungen und Analytenbereich im Blut
*Der Analytenbereich basiert auf dem Peroxid/Peroxidase-System. Die endgültige Träger/Chromogen-Selektion erfordert die Berücksichtigung anderer Faktoren, wie z. B. der chemischen Ausbeute
*Die Akronyme sind im Anhang angeführt (Tabelle 1, Anhang)
¹HDL = Lipoprotein hoher Dichte
²Trig. = Triglycerid
³Chol. = Cholesterin
&sup4;Glu. = Glucose
&sup5;Chromogen ist die angegebene Verbindung plus Aminoantipyrin (AAP)

Anhang zu Tabelle 1

Chromogen Chemischer Name
DAOS N-Ethyl-N-(2-hyd roxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilinnatriumsalz
MAOS N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin-natriumsalz
MAPS N-Ethyl-N-sulfopropyl-3,5-dimethyanilin-natriumsalz
TOOS N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropy)-m-toluidin-natriumsalz
TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
MBTH 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-hydrochlorid
HT-TuffrynTM-Reihe Polysulfonpolymer
SuporTM-Reihe Polyethersulfonpolymer
DuraporTM (GVWP) Polyvinylidendifluorid (Fluorpolymer)
5. Es sind verschiedene Konfigurationen von Tests möglich. In der Grundversion des Systems, die im Detail nachstehend beschrieben ist, können 1 bis 5 Assays durchgeführt werden; Probe kann auf eine, zwei oder mehr Aufbringstellen aufgebracht werden, und eine, zwei oder mehr Spuren können in unterschiedlichen Kassetten vorhanden sein.
Ein komplexeres Assay kann durchgeführt werden, indem die Anzahl der Assaystellen in der Kassette und/oder Zugabe-, Misch- oder Vorbehandlungskammern erhöht wird.
6. Die Hämatokritschwankung in der Blutprobe hat keinen Einfluß auf die Ergebnisse für Analyten (wie Glucose), bei denen die Plasmakonzentration der relevante analytische Parameter ist. Der Assaystapel absorbiert eine entsprechende Plasmaprobe ausgehend von seiner Kapazität, wobei Blut in den Blutfilter gezogen wird, bis Sättigung erreicht ist. So können Proben, die von 0 bis 60% Hämatokrit (Volumsanteil an roten Blutkörperchen) variieren, ohne Eingriff durch den Menschen oder Beeinträchtigung der Assayergebnisse untersucht werden.
7. Bei Assays auf Plasmaanalyten kann die fehlerfreie Durchführung der Erfindung im Hinblick auf den Austritt roter Blutkörperchen und Hämolyse der Probe durch Bereitstellen eines versagenssicheren Stapels, der keine Chemie aufweist, oder durch Spektralanalyse der Farbe der Assaystapel überwacht werden. Der Monitor kann jegliches Rotpigment (Hämoglobin) messen, das die Reflexionsmembran erreicht. Der versagenssichere Stapel entspricht, was die Abmessungen und die Konstruktion des Filters für rote Blutkörperchen betrifft, physikalisch den Assaystapeln.
8. Das Timing von Assays kann durch die Anordnung der Stapel und die Abmessungen der zuführenden Kapillaren sowie durch die Struktur der Stapel gesteuert werden. 9. Vorbehandlung kann beispielsweise durch die Verwendung einer Mischkammer erfolgen, die ein Reagens enthält: siehe US-A-5.222.808 mit dem Titel "Capillary Mixing Device", die am gleichen Tag wie die vorliegende Erfindung eingereicht und auf den gleichen Zessionar übertragen wurde.

Zusätzliche Beschreibung von Komponenten, die bei Vorrichtungen nach dem Stand der Technik ebenfalls verwendet werden

In den Labors des Zessionars der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstands ist eine Anzahl einzelner Komponenten entwickelt worden, die beim System gemäß vorliegender Erfindung einsetzt werden, wie z. B. Kapillarspuren zum Transportieren und Analysieren flüssiger Proben, und sie sind Gegenstand erteilter Patente und anderer, noch anhängiger Patentanmeldungen. Diese Komponenten des Systems, die bereits bekannt waren, werden nachstehend ausreichend detailliert beschrieben, um es einem Fachmann zu ermöglichen, die vorliegende Erfindung praktisch umzusetzen. Hintergrundinformationen und eine Reihe zusätzlicher Details sind in Patenten und Patentanmeldungen dargelegt, in denen diese einzelnen Aspekte des Systems ursprünglich beschrieben wurden und die durch Verweis hierin aufgenommen sind.
Die Analysenkassette, die gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt wird, ist, was ihr Gesamterscheinungsbild und Herstellungsverfahren betrifft, den zuvor beschriebenen Einweg-Analysenkassetten zur einmaligen Verwendung ähnlich, die in den Labors der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes entwickelt wurden und zumeist hergestellt werden, indem zwei oder mehr (üblicherweise durch Spritzguß hergestellte) Kunststoffteile, die verschiedene Kanäle und Kammern enthalten, miteinander verschweißt werden. Die Probenbewegung wird typischerweise, aber nicht notwendigerweise, durch Kapillarwirkung herbeigeführt; üblicherweise sind gewisse Gravitationskräfte vorhanden, diese sind jedoch im allgemeinen gering (es sei jedoch auf die detaillierte Erörterung der Vermeidung unnötiger Gravitationskräfte verwiesen, wie nachstehend für bevorzugte Ausführungsformen beschrieben). Die Kassette kann mehrere Kammern enthalten, die fähig sind, Probe in mehreren Kapillarspuren, mehreren Kammern in einer einzelnen Spur oder nur eine einzelne Kammer in einer einzelnen Kapillarspur zu vermischen. Die Kapillarspuren umfassen üblicherweise eine Eingangsöffnung zum Eintritt von Probe in die Spur, einen Kapillarabschnitt, der für das Strömen und Beinhalten der Probe vorgesehen ist, und ein Luftloch, welches das Entweichen eingeschlossener Luft ermöglicht, so daß Kapillarfluß erfolgen kann. In einigen Fällen wird für mehrere Kapillarspuren eine gemeinsame Probeneingangsöffnung verwendet; in anderen Fällen sind vollständig getrennte Spuren mit getrennten Eingangsöffnungen vorgesehen.
Die Kapillarabschnitte sind im allgemeinen in mehrere Unterabschnitte unterteilt, die unterschiedliche Funktionen haben, wie Probenfluß, Auflösung des Regens, Analysenergebnisse, Verifizierung des richtigen Betriebs oder Belüftung. Die Geometrie dieser Abschnitte variiert je nach ihrem Zweck. Beispielsweise findet das Auflösen und/oder Mischen von Reagenzien normalerweise in weiten Kapillarkammern statt, die eine große Oberfläche aufweisen, auf die Reagenzien aufgebracht werden können und von der sie beim Kontakt mit der Probe rasch resuspendiert werden oder in Lösung gehen können. Der Probenfluß wird normalerweise durch die Abmessungen der Kapillarkanäle und die physikalischen Eigenschaften der Probe gesteuert, die zur Verwendung in einer bestimmten Kassette bestimmt ist. Analysen- und Verifizierungsunterabschnitte der Kapillarkanäle und verschiedenen Kammern weisen eine Geometrie auf, die so geformt ist, daß sie mit dem verwendeten Detektionssystem kooperiert, wie z. B. flache oder gekrümmte Oberflächen, die mit Licht kooperieren, das durch die Wände der Kapillarspur hindurchgeht, so daß das Licht je nach dem gewünschten Ergebnis gestreut, konzentriert oder unbeeinflußt gelassen wird. Eine weitere Beschreibung von Kapillarflußvorrichtungen mit diesen Elementen ist der US-A-4.756.884 und US-A-5.039.617 zu entnehmen.
Flüssigkeiten, die in die Kassette eintreten, können in den Kapillarspuren oder vor dem Eintreten von Probe in die Kapillarspur in einer Eingangsöffnung modifiziert werden, um eine Probe bereitzustellen, die für eine bestimmte Analyse besser geeignet ist. Beispielsweise kann Blut filtriert werden, um Plasma bereitzustellen, oder lysiert werden, um ein einheitliches lysiertes Medium bereitzustellen. Die Filtration roter Blutkörperchen in Kapillarspuren ist in der US-A-4.753.776 beschrieben. Die Probe kann auch mittels Durchtritt durch eine poröse Scheibe lysiert werden, die ein Mittel enthält, das rote Blutkörperchen lysiert (nachstehend im Detail beschrieben). Das "Lysat" kann dann für die einzelnen Assays auf eine oder mehrere Kapillarspuren verteilt werden.
Das Assaysystem umfaßt auch einen Monitor (Analyseinstrument), der fähig ist, zumindest ein und üblicherweise mehrere Assays gleichzeitig abzulesen. Der Monitor umfaßt daher Detektionssysteme und kann auch Verifizierungssysteme umfassen (von denen jedes ein Detektionssystem, das mit unterschiedlicher Software oder Hardware im Detektor eingesetzt wird, oder ein getrenntes System an unterschiedlichen Positionen im Monitor sein kann), um jegliche Fehler im System zu detektieren. Monitore zur Durchführung einzelner Analysen werden in der US-A-4.756.884 und US-A-5.039.617 beschrieben. Siehe auch US-A-4.829.011 für ein Detektorsystem, das bei einem Monitor verwendet werden kann, um Agglutination von Teilchen in einer Kapillarspur zu detektieren. Diese Monitore können leicht an den Einsatz gemäß vorliegender Erfindung angepaßt werden, indem einfach die entsprechenden Reflexionsdetektoren eingebaut werden, die von bekannten Quellen übernommen werden können.
Wenn er zum Detektieren des Vorhandenseins, Fehlens oder der Menge eines bestimmten Analyten in einer gemischten Probe verwendet wird, ist der Monitor mit geeigneten Analysen- und Verifizierungssystemen versehen. Eine Anzahl von Systemen, die eingesetzt werden können, um zu bestimmen, ob die Analyse in einer in ein Instrument eingesetzten (und daher für den Anwender nicht sichtbaren) Kassette korrekt stattgefunden hat, ist der US-A-5.104.813 zu entnehmen.
Andere Monitorsysteme und eine Anzahl von Typen von Einweg-Kassetten, die für eine oder mehrere Analysen verwendet werden könnten, sind in der auf den Zessionar der vorliegenden Anmeldung übertragenen US-A-4.756.884 geoffenbart. Andere Vorrichtungen und Techniken sind in den US-A-4.946.795, 5.077.017 und 4.820.647 beschrieben.
Eine Reihe von Betriebsweisen der Kassetten bezieht sich auf eine Stop-Flow-Verbindung. Die Bezeichnung "Stop-Flow-Verbindung" bezieht sich auf einen Kontrollbereich in einem Kapillarkanal, der bei einer Anzahl früherer Erfindungen eingesetzt worden ist, die aus den Labors der Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes und ande ren Labors stammen (siehe Beispielsweise US-A-3.799.742 und 4.946.795). Eine Stop- Flow-Verbindung ist ein Bereich in einer Flüssigkeitsspur, der die Verbindung zwischen einem frühen Teil der Spur, in der Probe durch Kapillarwirkung (und gegebenenfalls Schwerkraft) fließt, und einem späteren Teil der Flüssigkeitsspur bezeichnet, in den normalerweise erst dann Probe fließt, bis der Fluß durch eine äußere Kraft in Gang gesetzt wird, wie z. B. eine Handlung des Anwenders. Beispielsweise kann die Stop-Flow- Verbindung eingesetzt werden, um den Fluß anzuhalten, während ein Mischvorgang erfolgt. Eine Anzahl von Stop-Flow-Verbindungen wird in den US-A-4.868.129, 5.077.017, 5.104.813 und 5.230.866 beschrieben.

Beschreibung spezifischer Ausführungsformen unter Bezugnahme auf Figuren

Der allgemeine Betrieb des erfindungsgemäßen Systems kann unter Bezugnahme auf die Figuren verstanden werden, in denen gleiche Bezugszahlen, die bei verschiedenen Ausführungsformen verwendet werden, Merkmale bezeichnen, die die gleiche Funktion erfüllen. Die physische Position gewisser gemeinsamer Merkmale, wie z. B. Kapillarspuren und Aufbringstellen, kann jedoch von Ausführungsform zu Ausführungsform verschieden sein.
Fig. 1 zeigt vier verschiedene Kassetten gemäß vorliegender Erfindung und wie solche Kassetten eingesetzt werden können, um Probe zu verschiedenen Elementen einer Anordnung von Positionen zu lenken, an denen Reflexionsablesungen vorgenommen werden. Die in Fig. 1 (und den anderen Figuren) gezeigten Kassetten sind allgemein transparent oder lichtdurchlässig. Daher sind die inneren Kapillaren und Kammern durch die äußere Kassettenoberfläche hindurch zu sehen, wie in den Draufsichten aus Fig. 1 gezeigt.
Kassette 101 umfaßt eine einzige Aufbringstelle 11 und zwei Assaystapel 51 und 52. Die Aufbringstelle befindet sich außerhalb des Monitors, wenn eine Kassette in den Monitor eingesetzt ist, während sich die Assaystapel innerhalb des Monitors befinden. Die Trennlinie 15 zeigt das Ausmaß, in dem die Kassette in den Monitor eingesetzt ist.
Aufbringstelle 11 ist in dieser Ausführungsform im wesentlichen eine einfache Hohlraumöffnung in einer Oberfläche von Kassette 101. Die Assaystapel 51 und 52 sind zur Atmosphäre hin belüftet, um das Austreten von Gasen (oder den Zugang zu Sauerstoff in der Atmosphäre) zu ermöglichen. Der Belüftungsvorgang ist in dieser Figur nicht gezeigt, aber in anderen Ausführungsformen und Figuren im Detail dargestellt.
Der Kapillarkanal 21 führt von der Aufbringstelle 11 zum Verzweigungspunkt 31, an dem sich der Kapillarkanal in zwei Kanäle (22 und 23) teilt, die jeweils zu einem der einzelnen Assaystapel führen. Wie durch die Erörterung der verbleibenden in Fig. 1 gezeigten Kassetten deutlich werden wird, ist diese Kassette ein Element eines Systems, bei dem fünf mögliche Stellen vorhanden sind, an denen Assaystapel für eine Reflexionsablesung vorliegen können. Die drei ungenutzten Stellen sind durch strichlierte Kreise mit den Bezugszahlen 53, 54 und 55 angegeben. Es gibt jedoch keine spezifischen Merkmale in der diesen Bezugszahlen zugeordneten Kassette 101, bei denen es sich lediglich um physische Positionen handelt, an denen in anderen Kassetten des selben Systems Assaystapel angeordnet sein können.
Das wird in Kassette 102 gezeigt, die die gleiche Größe und das gleiche äußere Erscheinungsbild hat wie Kassette 101 und die gleiche anfängliche Aufbringstelle 11 und den gleichen anfänglichen Kanal 21 aufweist. Verzweigungspunkt 31 liegt jedoch an anderer Stelle, und die Verzweigungskapillarenkanäle 22, 23 und 24 führen zu Assaystapeln an den Positionen 53, 54 und 55. Bei dieser Ausführungsform sind an den Positionen 51 und 52 keine Assaystapel vorhanden, und kein Merkmal von Kassette 102 ist mit diesen Positionen verbunden.
Kassette 103 ist Kassette 101 und 102 insofern ähnlich, als sie eine einzelne Aufbringstelle 11 und einen einzelnen anfänglichen Kapillarkanal 21 umfaßt. Hier führt der Verzweigungspunkt 31 zu drei Kapillarkanälen 22, 23 und 24. Die ersten beiden davon führen zu den Assaystapeln 54 und 55, während der dritte zum zweiten Verzweigungspunkt 32 führt, wobei die Kapillaren 25 und 26 zu den Assaystapeln 51 bzw. 52 führen.
In dieser Kassette ist an Position 55 kein Assaystapel vorhanden. Bei der abschließenden Kassette in der Figur, Kassette 104, werden alle fünf der Assaystapelpositionen verwendet. Sie unterscheidet sich von den anderen Kassetten der gleichen Gruppe auch dadurch, daß sie zwei Aufbringstellen aufweist. Die äußeren physischen Abmessungen dieser Kassette sind jedoch gleich, die Position der Assaystapel ist gleich, und die Kassette kann im gleichen Monitor verwendet werden.
In Kassette 104 wird eine der Aufbringstelle 11 zugeführte Probe über Kapillarkanal 21 zu Verzweigungspunkt 31 geleitet, an dem sich die Probe teilt und durch die Kapillarkanäle 22 und 23 in die Assaystapel 51 und 54 gelangt. Eine zweite Probe, die der Aufbringstelle 12 zugeführt wird, geht durch den Kapillarkanal 24 zum Verzweigungspunkt 32, wo sich die Probe teilt und von den Kapillaren 25, 26 und 27 zu den Assaystapeln 52, 53 und 55 befördert wird.
Fig. 1 zeigt zwar vier verschiedene Kassetten, bei denen eine spezifische Anordnung aus fünf Assaystellenpositionen eingesetzt wird, aber weder die Anzahl an Assaystellenpositionen noch die spezifische Ausrichtung der Positionen in der Anordnung muß wie in dieser Figur gezeigt sein. Es können andere Muster und eine andere Anzahl von Assaystapelpositionen eingesetzt werden, solange der Monitor in Übereinstimmung mit der Kassette so konstruiert ist, daß ein Reflexionsableser an jeder Position vorhanden ist, an der potentiell ein Assaystapel angeordnet werden kann.
Fig. 2 ist eine Draufsicht auf eine Kassette, die Kassette 103 aus Fig. 1 ähnlich ist, die aber mehr Details der physischen Merkmale der Kassette zeigt, die mit den Flußregelungsaspekten der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang stehen. Hier weist die Kassette 105 eine Aufbringstelle 11, einen anfänglichen Kapillarkanal 21 und eine Anordnung aus Verzweigungskapillaren und Assaystapeln im gleichen Muster und mit den gleichen Bezugszahlen auf, wie bei Kassette 103 aus Fig. 1 gezeigt. Von den zusätzlichen Merkmalen, die in dieser Figur sichtbar sind, ist zu erkennen, daß die Verzweigungskapillarkanäle, die allgemein als Kapillarbaum bezeichnet werden, Kapillarkanäle mit unterschiedlichen Größen enthalten. Der anfängliche Kapillarkanal 21 ist der breiteste der Kapillarkanäle. (Im allgemeinen haben alle Kapillarkanäle zwecks einfacher Konstruktion die gleiche Höhe, obwohl diese auch, wie nachstehend erörtert, variieren kann). Bei Verzweigungspunkt 31 sind die beiden Kapillarkanäle 22 und 23, die zu den Assaystapeln 54 und 55 führen, kleiner als Kanal 24, der zu Verzweigungspunkt 32 führt. Bei Verzweigungspunkt 32 führen zwei kleine Kapillaren 25 und 26 zu den Assaystapeln 51 und 52. Indem die Kapillarkanäle kleiner werden, wenn sie sich von der Aufbringstelle weiter weg bewegen, bewirken die Kapillaren, daß sie Flüssigkeit die Kapillarspur entlang vorwärts ziehen. Kleinere Kapillarkanäle üben eine größere Kraft auf die Flüssigkeit aus, so daß Probe mit größerer Kraft solche Kanäle entlang gezogen wird. Daher hat die immer kleinere Verzweigung der Kapillarkanäle in Kombination mit den kleinen Kapillarkanälen, die im porösen Material in den Assaystapeln vorhanden sind (nachstehend im Detail erörtert), die Funktion, flüssige Probe, die an Aufbringstelle 11 aufgebracht wird, vollständig in die Reaktionsstapel zu ziehen. Das ermöglicht, daß die Reaktionen abgeschlossen werden, auch wenn kaum genügend Probe aufgebracht wird, um alle Reaktionsstapel zu füllen. Daher können die Assays anhand von kleineren Probenvolumina durchgeführt werden, als für kontinuierliche poröse Materialien erforderlich sind, wie z. B. Papierstreifen, die in bezug auf die Flüssigkeit, die die Reaktionsposition tatsächlich erreicht, größere Flüssigkeitsmengen an unerwünschten Positionen absorbieren.
Die Kassette ist so konstruiert, daß sie genau in einen Reflexionsablesungsmonitor paßt, und ist daher mit Löchern 61 und 62 versehen, die über entsprechende Zapfen im Monitor passen, um die Monitoroptik und die Reflexions-Ablesestellen in der Kassette richtig in Eingriff zu bringen. Es können auch andere Arten von Eingreifvorrichtungen verwendet werden.
Fig. 3 zeigt eine Serie von Querschnittsansichten durch Kassette 105 aus Fig. 2 an den Positionen A-A (Schaubild A von Fig. 3) und B-B (Schaubild B), sowie C-C (Schaubild C).
Schaubild A zeigt eine Querschnittsansicht von Kassette 105 an Aufbringstelle 11. Es ist zu sehen, daß Aufbringstelle 11 ein Hohlraum ist, der in einer erhabenen Oberfläche von Kassette 105 ausgebildet ist, die von geneigten Oberflächen und einer Lippe 63 umgeben ist, welche gewährleistet, daß Probe an der Aufbringstelle in den Hohlraum und somit zu Kapillarkanal 21 gelenkt wird. Die gesamte Aufbringstelle 11 umgebende Fläche ist von einem weiteren hochgezogenen Rand 64 umgeben, der bewirkt, daß Probe nahe der Aufbringstelle gehalten wird, wenn die Probe falsch aufgebracht wird oder wenn Probe über Lippe 62 läuft, wie nachstehend erörtert.
Schaubild B zeigt eine Querschnittsansicht, wieder entlang Kapillarkanal 21 und zeigt, daß Kapillarkanal 21 im Inneren des Gehäuses ausgebildet ist, das Kassette 105 bildet.
Schaubild C zeigt eine Querschnittsansicht entlang Linie C-C an der Position zweier der vier Assaystapel. Die Assaystapel 54 und 55 sind in dieser Ansicht gemeinsam mit Zwischenkapillarkanal 24 sichtbar, der in der Mitte von Kassette 105 zu sehen ist, wie er in Richtung der Assaystapel 51 und 52 führt (die in dieser Ansicht nicht zu sehen sind). An der Position von Reaktionsstapel 54 befindet sich eine Öffnung 64, die es ermöglicht, die Reflexionsablesung von der Oberfläche des Assaystapels vorzunehmen. Eine ähnliche Öffnung 65 ist für Assaystapel 55 vorhanden. Details dieser Öffnung, des Assaystapels und der Kapillarkanäle, die zum Assaystapel führen, sind in anderen Figuren dargelegt.
Fig. 4 ist eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die ein Vertreter desselben Satzes von Kassetten wäre, zu dem auch Kassette 105 aus Fig. 3 zählt. Kassette 106 aus Fig. 4 und Kassette 105 aus Fig. 2 stehen miteinander auf die anhand der Kassetten 103 und 104 von Fig. 1 gezeigte Weise in Verbindung. Mit anderen Worten, sie haben Assaystapelpositionen gemeinsam und die gleichen Außenabmessungen, so daß sie austauschbar in einem einzigen Monitor verwendet werden können.
Kassette 106 weist viele der gleichen Merkmale auf wie Kassette 105, die die Aufbringstelle 11 umgebende Lippe 63 und die umgebende Lippe 64, die vor Überlaufen in den gesamten Probenaufbringbereich schützt. Außerdem sind Löcher 61 und 62 für Positionierungszapfen vorgesehen, um das richtige Einschieben der Kassette in den Monitor zu gewährleisten. Diese Kassette unterscheidet sich dadurch, daß sie eine zweite Aufbringstelle 12 mit einer sie umgebenden Lippe 65 aufweist. Außerdem ist nach dem anfänglichen Kapillarkanal 21 eine Mischkammer 35 vorhanden, um für jegliche Betriebsweisen vorzusorgen, die in einer Kapillarkassette wünschenswert wäre, wie für frühere Kassetten beschrieben. Die Funktionsweise der verschiedenen Kapillarkanäle 22 bis 28, Verzweigungspunkte 31 und 32 und Assaystapel 51 bis 55 geht aus den in den vorherigen Ausführungsformen beschriebenen, ähnlichen Merkmalen hervor.
Alle hier beschriebenen Kassetten sind zur Verwendung für eine nicht abgemessene Probe bestimmt. Vorausgesetzt, daß ausreichend Probe aufgebracht wird, liefert der Monitor unabhängig vom Probenvolumen das gleiche Assayergebnis, mit der Maßgabe, daß mehrere Kontrollmerkmale in der Kassette enthalten sind.
Wenn beispielsweise ein großes Probenvolumen auf die Vorrichtung aufgebracht wird (d. h. mehr als das zum Füllen der Assaystapel erforderliche Minimum), neigt die Probenflüssigkeit dazu, weiter in die Assaystapel zu fließen, wie durch die strichlierte Linie 72 in Fig. 5 dargestellt, die die potentielle Position von überschüssiger Probe zeigt. Schwerkraft wirkt auf die Probenflüssigkeitssäule in Kapillare 21, wenn die Oberfläche 71 der verbleibenden Probe oberhalb der Oberfläche von Probenflüssigkeit liegt, die die Oberseite des Assaystapels 53 erreicht hat (die Differenz der potentiellen Energie resultiert daraus, daß Schwerkraft über die Höhe "h" in Fig. 5 wirkt). Es wirken auch Osmosekräfte (der Assaystapel enthält osmotisch aktive Materialien), so daß die Tendenz besteht, daß sich Flüssigkeits als Reaktion auf osmotischen Druck in den Stapel bewegt. Oberflächenspannungskräfte, wenn sich die Probe über die Oberseite der Probenaufbringstelle wölbt, wie bei 71 in Fig. 5 gezeigt, drängen die Flüssigkeit ebenfalls in die Assaystapel. Die Folge dieser Kräfte ist durch die strichlierte Linie 72 über dem Assaystapel angegeben. Die Flüssigkeit der Probe hat die Tendenz, sich auf der Oberseite des Stapels anzusammeln, wenn keine geeigneten Flüssigkeitsregelungsmerkmale vorhanden sind, wodurch Reflexionsmessungen beeinträchtigt werden, die an der optischen Oberfläche auf der Oberseite des Stapels vorgenommen werden, die idealerweise eben ist, und der Monitor möglicherweise mit einer biologisch bedenklichen Probe verunreinigt wird. Diesem potentiellen Problem wird mit einem Satz Flußreglerelementen entgegengesteuert, die bei jeder Kassette angewandt werden können, bei der ein anfänglicher Kapillarkanal gefolgt von einem Kapillarreaktionsstapel eingesetzt wird.
Eine erste Vorsichtsmaßnahme besteht darin, die Probenaufbringstelle so zu konstruieren, daß sie überfließt, wenn mehr als das maximale Probenvolumen aufgebracht worden ist. Das wird einfach durch das Bereitstellen eines ausgeschnittenen Schlitzes 75 im oberen Bereich der Aufbringstellenlippe 63 erreicht, wie in Fig. 6 gezeigt (in der strichlierte Linien Kanten darstellen, die durch den durchscheinenden Kunststoffaufbringbereich hindurch sichtbar sind). Dieser ausgeschnittene Schlitz, der jede beliebige Form haben kann, verhindert auch die Bildung eines ruhenden Tropfens (d. h. Tropfen 71 in Fig. 5). Dieses Merkmal begrenzt das maximale Ausmaß des Volumens an überschüssiger Probe auf einen Bereich, der von anderen Regelelementen bewältigt werden kann. Selbstverständlich können auch andere Techniken eingesetzt werden, um die Ansammlung von überschüssiger Probe an der Aufbringstelle zu vermeiden. Die einfachste Technik ist in Fig. 7 angegeben, in der die Aufbringstelle nicht von einer nach unten abfallenden Ebene in der Nähe umgeben ist, die dazu bestimmt ist, das Aufbringen von Probe auf die Aufbringstelle zu unterstützen, sondern von einer scharfen Kante. In diesem Fall ist das maximale Volumen der Aufbringstelle das maximale Volumen einschließlich des ruhenden Tropfens, wie durch Linie 71 gezeigt. Das stellt zwar eine einfache Lösung für überschüssige Probe dar, aber unglücklicherweise wird das Aufbringen von Probe auf die Stelle schwieriger, weil eine leicht fehlgelenkte Probe die Aufbringstelle 11 gänzlich verfehlen kann.
Eine weitere Regulierung des Probenvolumens wird dadurch erreicht, daß die Flüssigkeitshaltekapazitäten verschiedener Teile der Kassette sorgfältig ausgeglichen werden. Die Kapazität der Spur, die das Probenaufbringvolumen und die Stapel verbindet, kann so gewählt werden, daß sie gerade gleich groß wie oder vorzugsweise nur ein wenig (um etwa 5 bis 25%, vorzugsweise etwa 15%) Größe als das Mindestvolumen ist, das zum Füllen des oder der Assaystapel erforderlich ist. Auf diese Weise ist ein Großteil des Probenvolumens in de Kassette unterhalb der Höhe der Oberseite des Stapels enthalten, so daß der Druck durch die Schwerkraft minimiert wird. Bei Proben, deren Volumen von der minimalen Probengröße bis zum Volumen der Stapel plus dem Volumen der Probentransportkapillaren reicht, wird nicht nur die Schwerkraft aufgehoben, sondern die Kapillarkraft wird negativ, wenn die Probe in die Spur gezogen wird. Die Stapel haben sehr hohe Kapillarkräfte, durch die die negative Kapillarkraft und Schwerkraft überwunden werden kann; die Vorrichtung arbeitet daher auch dann richtig, wenn verbleibende Probe in die Spur gezogen wird, wodurch die Aufbringstelle entleert wird.
Dem Stapelhohlraum kann auch eine "Leiste" hinzugefügt werden (Fig. 8), um das Volumen an Flüssigkeit zu minimieren, das sich auf der Oberseite des Stapels ansammeln kann. Die Kante der Leiste wirkt als "Stop-Flow-Verbindung", die zuvor für andere Vorgänge in Kapillarkassetten beschrieben worden ist. Zwei solcher Leisten mit entsprechenden Kanten 80 und 81 sind in Fig. 8 zu sehen. Diese Kanten sind scharf ausgebildet und weisen im allgemeinen Innenwinkel von 90º oder weniger auf. Indem die Leistendicke in vertikaler Richtung gering gehalten wird, kann ein Zusammenrinnen beträchtlich verringert werden. Das Volumen zwischen der Oberseite des Stapels und der Deckfläche der Kassette ist notwendigerweise ziemlich groß, um das Risiko der Verunreinigung des Monitors mit Probe zu verringern. Die Leiste verringert dieses Volumen, das sich ansonsten vollständig mit Flüssigkeit füllen könnte, wirksam. Die Leiste trägt auch dazu bei zu verhindern, daß die potentiell gefährliche Probe den Monitor verunreinigt. Wie aus der nachstehenden Beschreibung zu entnehmen, ermöglicht diese Leiste in Kombination mit anderen Regulierungsmerkmalen, daß auch die kleine Flüssigkeitsmenge auf der Stapeloberfläche schließlich in den Stapel zurückgezogen wird.
Überström-/Ablauf-Kapillaren könnender Kassette ebenfalls hinzugefügt werden, um die Ansammlung von Flüssigkeit oberhalb des Stapels aktiv zu verhindern. In Fig. 9 werden zwei solche Kapillaren gezeigt. Die Abläufe sind so angeordnet und dimensioniert, daß die Probe vorzugsweise in die Kapillaren, die den Stapel versorgen, und in die Stapel fließt, bis alle Stapel voll sind. Die Kapillarkraft in den Ablaufkapillaren ist größer als die Kräfte, die das Zusammenrinnen fördern. Diese zweifache Anforderung wird durch die Wahl entsprechender Abmessungen, wie nachstehend erörtert, leicht erfüllt. Das Volumen der Ablaufkapillaren wird so gewählt, daß das größtmögliche Probenvolumen auf genommen wird (d. h. gerade genug, um ein Überfließen der Aufbringstelle zu verursachen). Die Ablaufkapillaren sind besser zu verstehen, wenn sie zusammen mit den anderen Teilen von Kassette 108 betrachtet werden.
Die Probentransportkapillarkanäle 21 bis 25 und porösen Matrizen für jedes Assay 52, 54 und 55 umfassen zusammen ein Volumen, das größer als das im Aufbringnapf 11 durch ein einziges Aufbringen von Probe gehaltene, mögliche Volumen. Auf diese Weise befindet sich keine überschüssige Probe im Aufbringnapf, wenn das Assay abgelesen wird, eine Bedingung, von der gezeigt wurde, daß sie Schwankungen bei der Sättigung der optischen Assaystapel mit Flüssigkeit verursacht. Kapillarkanal 21 selbst, der von der Aufbringstelle zu den Assaystellen führt, hat ein Volumen, das etwas größer als jenes Volumen ist, das zum Füllen der Assaystellen 52, 54 und 55 erforderlich ist. Die Tiefen und Breiten der Kapillarkanäle werden so gewählt, daß die gesamte in Kanal 21 aufgebrachte Probe über Verzweigungspunkt 31 hinaus in die kleineren Kapillarkanäle und Assaystellen gezogen werden kann. Während Probe zu den Stellen fließt, verdrängt an der Aufbringstelle angezogene Luft die Probe in Kanal 21, so daß die gesamte Probe ausgenutzt werden kann, wodurch das Assay vom Standpunkt des aufgebrachten Volumens aus effizient wird. Das ist möglich, weil der bewegende Kapillardruck, der vom Meniskus am vorderen Rand der Probe in die Verzweigungsspuren nach Verzweigungspunkt 31 ausgeübt wird, den entgegengesetzten verzögernden Kapillardruck der anfänglichen Spur 21, der vom Meniskus des hinteren Rands ausgeübt wird, übersteigt.
Der Kapillardruck P ist eine Funktion der beiden Hauptkrümmungsradien des Kapillarkanals R1 und R2 (unter der Annahme eines rechteckigen Kanals):
P = s · cosj · (1 /R1 + 1/R2),
worin s die Oberflächenspannung der Probe ist und j der Kontaktwinkel der Probe mit der Kassettenoberfläche ist. Daher erzeugt, auch wenn die Tiefen der Kanäle vor und nach Verzweigungspunkt 31 gleich groß sind, die relativ geringe Breite der Kanäle nach Verzweigungspunkt 31 in bezug auf den verzögernden Druck in Kapillare 21 einen höheren bewegenden Kapillardruck. Beispielsweise können die Abmessungen von Kanal 21 0,0381 cm (0,015") Tiefe · 0,127 cm bis 0,508 cm (0,05 bis 0,2") Breite sein, während jenseits von Verzweigungspunkt 31 die Kanäle 0,038 cm (0,015") tief · 0,051 cm (0,02") breit sind.
Wenn überschüssige Probe auf die Aufbringstelle 11 aufgebracht wird, fließt ein Teil davon in die Überlaufspur 26/27. Die Kapazität dieser Spur ist so, daß jede bei einem Aufbringen auf Aufbringstelle 11 aufgebrachte Probenmenge im großen Überströmkanal 26/27 aufgenommen werden könnte. Umgekehrt wird in dem Fall, wo die Mindest- Probenmenge auf die Aufbringstelle 11 aufgebracht wird und ein Teil davon in den Überlaufkanal über Verzweigungspunkt 32 hinaus eintritt, Probe schließlich durch Kapillarkräfte in den Hauptkanal zurück gezogen, da der Kapillardruck des Überlaufs weniger stark als jener in den Verzweigungsspuren ist, die zu den Assaystellen oder den Stapeln führen. Um beispielsweise dieses Gleichgewicht zu erreichen, kann der Kanal jenseits von 32 von 0,038 cm (0,015") auf 0,046 cm (0,018") Tiefe zunehmen, wodurch der Kapillardruck wirksam verringert wird.
In der Spur, die von Aufbringstelle 12 auf der Kassette weg führt, wird für optimale Ergebnisse eine andere Strategie verfolgt. Bei diesem Assay ist nur ein kleines mit Reagens aus Mischkammer 35 vermischtes Probenvolumen verfügbar, um zu Assaystapel 51 zu fließen. Durch Vorsehen einer Überlaufspur nach der Mischkammer 35 wird riskiert, daß ein Teil dieser eingeschränkten Probe abgelenkt wird. Bei dieser speziellen Situation mit geringem Volumen zweigt ein Überlaufkanal 29 am Verzweigungspunkt 33 vom Hauptkanal ab. Wie oben beschrieben, soll der Kapillardruck des Überlaufs 28 schwächer als der Kapillardruck von Kanal 28 und Mischkammer 35 sein. Auf diese Weise wird, wenn eine Mindest-Probenmenge auf 12 aufgebracht wird, jegliche zum Überlauf 29 abgelenkte Probe schließlich durch höhere Kapillardrücke in den Hauptkanal zurückgezogen. Wenn jedoch überschüssige Probe auf 12 aufgebracht worden ist, hat der Kanal 29 die Kapazität, das höchste in einem Aufbringvorgang aufbringbare Volumen zu halten, wodurch die mögliche Übersättigung von Assaystelle 51 durch Zurückhalten von überschüssiger Probe an der Aufbringstelle und den resultierenden Gravitationsdruck vermieden wird.
Die oben beschriebenen Systeme zur Regulierung des Probenvolumens können unter Bezugnahme auf die Flüssigkeitsaufnahmekapazität verschiedener Teile der Kassette leicht zusammengefaßt und verstanden werden. Die Kassette ist zum Aufbringen eines einzigen Probentropfens durch einen einmaligen Vorgang bestimmt, und das so unmittelbar wie physikalisch möglich, wie etwa durch das Berühren eines von einem Finger hängenden Bluttropfens (durch einen Kapillar-Fingerstich) durch die Aufbringöffnung. Dieser Aufbringöffnung, die typischerweise ein Hohlraum ist, der sich in einer Außenfläche des Gehäuses befindet, das die Kassette bildet, ist eine Flüssigkeitsaufnahmekapazität zu eigen, die aus der Größe des Hohlraums resultiert. Der Hohlraum befindet sich typischerweise in jenem Abschnitt des Gehäuses, der sich über den ihn umgebenden Bereich erstreckt, so daß auf den Hohlraum aufgebrachte überschüssige Probe lediglich von den Seiten dieses hochgezogenen Abschnitts auf die Oberfläche der Kassette fließt, wo sie von einer sie umgebenden Lippe zurückgehalten werden kann, wie in den oben beschriebenen Figuren gezeigt. Die Kapazität der Aufbringungsstelle bezieht sich daher auf die Proben menge, die in die Einbringstelle eintritt, wenn sie als einzelner Bolus zugegeben wird, wie oben beschrieben. Diese ist typischerweise beinahe gleich groß wie das physische Volumen der Aufbringöffnung selbst, da der Fluß in Kapillare 21 relativ zur Probenaufbringgeschwindigkeit langsam ist.
Eine zweite Kapazität, die reguliert werden muß, ist die Kapazität des/der Probentransport-Kapillarkanals oder -kanäle, der/die im Gehäuse vorhanden ist/sind und die Probenaufbringstelle mit der Reflexions-Ablesestelle und ihrer porösen Matrix verbindet/verbinden. Die Kapazität dieses Kapillarkanals (hier wird der Singular verwendet, um alle derartigen Kanäle zu bezeichnen) ist einfach das Volumen des Kanals. Wenn Überlauf kapillaren vorhanden sind, sind ihre Kapazitäten zum Vergleich mit dem Volumen der Aufbringstelle innerhalb der Kapazität des Probentransportsystems enthalten, sie werden aber beim Vergleich mit der Matrixkapazität nicht berücksichtigt, weil sich, wie oben erörtert, die direkt transportierenden Kapillaren gegenüber den Überlaufkapillaren bevorzugt füllen. Nähere Details zu geeigneten Kapillaren zur Aufnahme in die Kapazitätsvergleiche sind nachstehend angeführt.
Es sollte angemerkt werden, daß nicht alle Spuren einer bestimmten Kassette alle bevorzugten Faktoren der Erfindung aufweisen. Beispielsweise umfassen die beiden Spuren in Kassette 108 aus Fig. 9 verschiedene Merkmale der Erfindung.
Schließlich weist die poröse Matrix selbst, bei der eine Reflexionsablesung durchgeführt wird, eine eigene Innenkapazität in ihren Poren auf.
Diese verschiedenen Kapazitäten sind so reguliert, daß die Probentransportkapazität größer ist als die Kapazität der porösen Matrix. Weiters füllt, wenn eine Probe kleiner ist als jene, die zur Sättigung der Matrix erforderlich ist (eine Bedingung, die, falls sie unberücksichtigt bleibt, zu falschen Assayergebnissen führen würde) die Probe die Probentransportkapazität vollständig, bevor sie die poröse Matrix erreicht. Ein solches System liegt bei der rechten Spur von Kassette 108 aus Fig. 9 vor. Daher können durch Vorsehen entsprechender Größen und Hydrophobie/Hydrophilie der Kapillarkanalwände Kapillarkräfte an den vorderen und hinteren Rändern der Probe ausgeglichen werden, wodurch verhindert wird, daß Probe in die Matrix fließt. Diese ausgeglichenen Kräfte werden unter Einsatz von Standardtechniken zur Kapillartransportregulierung erreicht, die typischerweise die Regulierung des Krümmungsradius für den vorderen und den hinteren Probenmeniskus und der Höhe der Probe an ihren beiden Enden relativ zueinander umfassen. Meniskuskrümmung wird problemlos erreicht, indem identische Kapillarquerschnittsabmessungen an den Positionen bereitgestellt werden, wo sich der vordere und der, hintere Rand der Probe befindet, und indem dafür gesorgt wird, daß die Eigenschaften der Wände an beiden Positionen gleich sind. Es ist jedoch auch möglich, verschiedene Querschnittsabmessungen vorzusehen, während unterschiedliche Oberflächenenergien an den beiden Positionen oder unterschiedliche Höhen vorliegen, so daß die Kapillarkräfte im Gleichgewicht bleiben. Es sollte daran erinnert werden, daß Kapillarkräfte durch Oberflächenspannungswirkungen an den vorderen und hinteren Rändern verursacht werden und daß eine Kammer oder ein Kanal, die/der vollständig mit Flüssigkeit gefüllt ist, keine Kapillarkräfte erzeugt. Daher hört der Probenfluß auf, wenn eine Probe die Aufbringöffnung verläßt (wo sie von der Schwerkraft beeinflußt werden kann, wobei ein Teil der Flüssigkeit höher liegt als andere Teile) und in ein horizontales Probentransportsystem eintritt, falls der hintere Rand der Probe eine Verzögerungskraft ausübt, die mit der Kapillarkraft in Vorwärtsrichtung am vorderen Rand der Probe - unabhängig von der intervenierenden Struktur des Kapillarkanals - identisch ist.
Eine weitere Volumsbeziehung, die bei einer anderen (oder der gleichen) bevorzugten Ausführungsform eingehalten wird, ist die Beziehung zwischen der Aufbringstellen- Kapazität und der Summe aus der Probentransportkapazität (sowohl direkt als auch Überlauf) und der Kapazität der porösen Matrix. Die Aufbringstellen-Kapazität muß geringer sein als die Summe, so daß, wenn überschüssige Probe auf die Aufbringstelle aufgebracht wird, diese wie zuvor beschrieben abfließt und daher nicht in der physisch höheren Aufbringstelle verbleibt, wodurch Gravitationsdruck auf die Probe in der Matrix ausgeübt wird.
Als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme für die Assays und um die inneren optischen Komponente des Monitors vor Verunreinigung durch die Probe zu bewahren, umfaßt die Konstruktion des optischen Fensters Merkmale, um ein Ansteigen der Probe in den optischen Fenstern zur Optik hin zu begrenzen, das auftreten kann, wenn die Trägermembran voll Plasma ist und immer noch überschüssige Probe von der Aufbringstelle in die Überlaufbereiche abfließt (wie das der Fall sein kann, wenn ein Benutzer irrtümlich wieder Probe aufbringt, nachdem das Assay begonnen hat). Die horizontalen Abschnitte im Fenster brechen die aufwärtsgerichteten Kräfte, die normalerweise Flüssigkeit in eine Kapillare hinaufziehen. Auf diese Weise wird, wenn überschlüssige Flüssigkeit an den Rändern der Trägermembran während des Fließens von Probe durch die Kassette Gerinnsel bildet, dieses Zusammenrinnen auf ein geringes Volumen begrenzt, das später rasch abläuft, wenn die gesamte überschüssige Probe von der Aufbringstelle abgelassen worden ist. Diese "Stop-Flow-Verbindungen" werden oben detaillierter erörtert.
Bei allen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Anzahl anderer Flüssigkeitsregulierungskapillaren vorteilhaft eingesetzt werden. Beispielsweise weisen die Ausführungsformen der zuvor gezeigten Figuren eine Kapillare im Inneren des Gehäuses auf, die in den Raum eintritt, der den Assaystapel am Rand des Assaystapels hält. So tritt Probe an einem Rand in den Assaystapel ein und verbreitet sich durch den Assaystapel horizontal sowie zu seiner Deckfläche hin, wo die Reflexion gemessen wird. Ein solches seitliches Eintreten kann zu ungleichmäßiger Farbbildung auf einigen Reaktionsstapeln führen, und ein gleichmäßigeres Eintreten von Probe in den Reaktionsstapel wird bevorzugt. Das kann auf mehrere Arten erreicht werden. Beispielsweise kann eine horizontale, vierwandige Kapillarspur unter dem Assaystapel zur Mitte des Stapels führen und durch eine kleine vertikale Kapillare damit verbunden sein. Eine solche Ausführungsform wird in Fig. 10 gezeigt. Probe tritt dann in die Mitte des Assaystapels ein und verbreitet sich gleichmäßig über den gesamten Assaystapel.
Der Einsatz des in Fig. 10 gezeigten Flüssigkeitsverteilungsschemas macht jedoch die Herstellung des Gehäuses, das die Kassette bildet, kompliziert. Das Gehäuse wird im allgemeinen aus zwei oder mehr, vorzugsweise zwei Kunststoffteilen, hergestellt, wobei die Innenräume gebildet werden, wenn die Teile aneinandergefügt werden. Wegen der bei der in Fig. 10 gezeigten Ausführungsform erforderlichen Geometrie sind zumindest drei Teile erforderlich.
Es kann jedoch eine aus nur zwei Kunststoffkassettenteilen gebildete Kassette hergestellt werden, die für die zufriedenstellende und im wesentlichen gleichmäßige Verteilung von Flüssigkeit im Assaystapel sorgt. Eine solche Ausführungsform wird in Fig. 11 gezeigt, in der eine vierwandige Kapillarspur in den Raum eintritt, in dem sich der Assaystapel weitgehend wie zuvor an der Seite befindet. Die vierwandige Kapillarspur befindet sich jedoch gleich unter der Oberfläche des Raums, der den Stapel enthält, und dreiwandige Kapillarspuren (d. h. Kapillarräume, die im wesentlichen Rillen in der Bodenfläche des Bereichs sind, der den Assaystapel hält) setzen sich in den Bereich unter dem Assaystapel fort. Die Bodenfläche des Assaystapels bildet die Deckfläche (vierte Wand) dieser Kapillarspuren. Obwohl in Fig. 11 eine spezielle Geometrie gezeigt wird, können zahlreiche andere Geometrien dieser Rillen eingesetzt werden, um das gleiche Ziel zu erreichen, d. h. die Verteilung von Flüssigkeit in Kapillarkanälen unter dem Kapillarstapel, so daß Flüssigkeit von allen Bereichen unter dem Stapel in den Stapel eintritt.
Eine alternative Geometrie, die Flüssigkeit zur Mitte des Kapillarstapels leitet, wird in den Fig. 12 und 13 gezeigt. In Fig. 12 nähert sich eine typische Probentransportkapillare 21 dem Raum unter Assaystapel 53 und Öffnung 65. Kapillare 21 tritt in einen keilartigen offenen Raum 41 unter Assaystapel 53 ein. An der Unterseite von Raum 41 befindet sich eine kleine Rille 42, die als dreiwandiger Kapillarkanal in Raum 41 dient. Rille 42 beginnt an der Unterseite von Kapillarkanal 21, bevor Kanal 21 in Raum 42 eintritt. Die Schaubilder A-E von Fig. 13, die Querschnittsansichten entlang der Linien A-A bis E-E von Fig. 12 sind, zeigen die Entwicklung von Kapillarrille 42, wenn der Blick von Schaubild A zu Schaubild E wandert. Zusätzlich ist die ansteigende Beschaffenheit des Bodenraums 21 in den Schaubildern C-E dargestellt. Kapillarrille 42 bewirkt, daß eine Probe, die in Raum 41 eintritt, die Oberfläche von Raum 41 mit geneigtem Boden entlang hochgezogen wird, so daß die Probe mit Assaystapel 53 in seiner Mitte in Kontakt kommt, wodurch für die gewünschte Gleichmäßigkeit beim Aufbringen gesorgt ist. Die Kapillarrille liefert aufgrund ihrer geringen Breite eine starke Kraft, um Probe zur Mitte der Matrix zu ziehen. Der Raum hat eine typische Breite von 0,051 cm (0,020"), und die Rille hat typischerweise 0,013 (0,005").
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung wird in Fig. 14 gezeigt. Die zuvor beschriebenen Kassetten weisen alle gezeigten Assaystapel auf der gleichen Oberfläche wie die Aufbringstelle auf. Das ist zwar allgemein der Fall, aber es ist auch möglich, einen Assaystapel an der der Aufbringstelle gegenüberliegenden Seite der Kassette bereitzustellen. Eine solche Ausführungsform wird in Kassette 109 aus Fig. 14 gezeigt. Hier befindet sich Aufbringstelle 11 an einer Deckfläche der Kassette, während Kapillarkanal 21 zu Assaystapel 54 führt, der für eine Reflexionsablesung durch den Hohlraum 65 an der Bodenfläche von Kassette 109 hindurch offen ist. Durch Vorsehen einiger Assaypositionen an der Deckfläche des Kassette und anderer Assaypositionen an der Bodenfläche der Kassette können die optischen Systeme, die im Monitor vorhanden sind, der zum Messen der Reflexionsablesungen verwendet wird, voneinander leichter getrennt werden, so daß mehr optische Ablesungen im gleichen begrenzten Raum vorgenommen werden können.
Die in einer Kassette gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Assaystapel können je nach dem Assay, das durchgeführt wird, stark variieren. In einigen Fällen kann eine einfache, poröse, reflektierende Matrix verwendet werden, wenn vorherige Kammern im Kapillarkanal, der zum Assaystapel führt, alle Vorgänge erfüllen, die zur Bestimmung eines anderen Ergebnisses als der Reflexionsablesung selbst notwendig sind. In den meisten Fällen umfaßt der Assaystapel jedoch eine Reflexionsmatrix zusammen mit anderen Elementen, die zur Handhabung von Flüssigkeit bestimmt sind. Ein typischer Assaystapel umfaßt als erstes Element in der Reihenfolge des Kontakts mit einer Probe, die durch den Kapillarkanal zugeführt wird, ein poröses Flüssigkeitshandhabungs- und Transferelement, das ein oder mehrere Reagenzien enthält oder auf andere Weise auf die Probe einwirkt, beispielsweise durch das Filtrieren roter Blutkörperchen aus Plasma. Die Probe gelangt dann von diesem anfänglichen porösen Element zu einer Matrix, an der die Reflexionsablesung durchgeführt wird. Reagenzien, die für eine bestimmte Analyse notwendig sind, können irgendwo in der Kapillarspur angeordnet sein, die von der Aufbringstelle zur Reflexionsmatrix führt, bis zu und einschließlich der Matrix selbst. Eine Anzahl verschiedener Beispiele für Assaystapel ist in den nachstehenden Beispielen angeführt.
Außerdem sollte angemerkt werden, daß sich die vorliegende Erfindung auf das Flüssigkeits-Handhabungssystem richtet, das Probe zu den sehr kleinen Assaystapeln lenkt, die gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden. Daher kann jedes poröse System, das zum Beinhalten von Reagenzien und/oder zur Verwendung zur Bereitstellung einer Reflexionsablesung bestimmt ist, als Assaystapel gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden. Zahlreiche poröse Elemente, die auf andere Weise für die Handhabung von Flüssigkeit sorgen, sind in der wissenschaftlichen und in der Patent-Literatur beschrieben. Kleine Teile solcher Materialien (wie sie unter Verwendung einer kreisförmigen Stanze hergestellt werden könnten) können aus zahlreichen handelsüblichen Präparaten ausgeschnitten und in eine Kassette gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden, um die Flüssigkeitshandhabungseigenschaften der Kassette auszunutzen. Daher ist die vorliegende Erfindung nicht auf irgendwelche speziellen Reaktionsstapel oder irgendeine spezielle Chemie beschränkt.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, wird sie unter Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beispiele besser verstanden werden, die nur der Veranschaulichung dienen und den Schutzumfang der Erfindung, falls nicht anders angegeben, nicht einschränken sollen.

BEISPIELE

Assaykassetten (Abmessungen nicht gemäß Anspruch 1)

Eine Assaykassette wurde aus ABS-Kunststoff im wesentlichen in der Form hergestellt, wie in den Fig. 2 und 3 beschrieben. Die Kassette hatte eine Breite von 4,45 cm (1,750") und eine Länge von 15,88 cm (2,500"). Aufbringstelle 11 hatte eine Kapazität von 45 ul. Kapillare 21 hatte ein Volumen von 6,6 ul mit Spurabmessungen von 0,102 cm (0,040") · 0,025 cm (0,010") im Querschnitt. Die Verzweigungskapillaren 22, 23, 25 und 26 hatten jeweils ein Volumen von 0,3 ml und eine Querschnittsfläche von 0,025 cm (0,010") · 0,025 cm (0,010"). Die Zwischenkapillare 24 hatte ein Volumen von 0,9 ul und eine Querschnittsfläche von 0,051 cm (0,020) · 0,025 cm (0,010"). Die Gesamt-Matrixkapazität betrug etwa 32 bis 36 ul. In manchen Fällen wurde die Chemie unter Verwendung einer Kapillarspur mit einer einzelnen Aufbringstelle, Kapillarspur und Assaystapel optimiert.

Beispiel 1: Assaystapel

Assaystapel sind für eine Reihe chemischer Vorgänge, einschließlich von Hämoglobin- Assays, optimiert worden. Der Assaystapel für Hämoglobin umfaßt 4 Schichten, die in Reihenfolge des Blutkontakts mit 1-4 numeriert sind. Schicht 1 ist eine Lysescheibe aus UHMW-PE mit einer Dicke von 0,0784 cm (0,031 Zoll) und einer Porosität von 54% bei einer durchschnittlichen Porengröße von 25,5 um. Das Material wird von Porex Technologies im Handel angeboten. Schicht 2 ist eine Ausbreitungsschicht aus Nylongitter 3-2F/186 mit einer Dicke von 22,86 cm (9 mil) (Tetko). Schicht 3 ist dazu bestimmt, Fragmente roter Blutkörperchen einzufangen, die durch die Lyse in der Lysescheibe erzeugt werden. Dabei handelt es sich um eine asymmetrische Polyethersulfon- Membran, die von Sartorius erhältlich ist. Die vierte Schicht, die die Reflexionsablesematrix darstellt, besteht aus HT-Tuffryn-HT200TM, einem von Gelman Sciences hergestellten Polysulfon material. Die Lysescheibe enthält die einzigen Reagenzien in diesem System, nämlich ein Detergens, das die roten Blutkörperchen (Natriumdesoxycholat und Theist) lysiert, zusammen mit herkömmlichen Reagenzien für die Hämoglobin-Messung. Diese Reagenzien und ihre Mengen werden in Beispiel 3 gezeigt.

Beispiel 2: Im Assaystapel verwendete Hämogloblin-Assaychemie

Theist und Natriumdesoxycholat, die oberflächenaktive Stoffe sind, können in einen porösen Porex-Filter eines mehrschichtigen Assaystapels aufgenommen werden, um die Membran roter Blutkörperchen in der Probe aufzubrechen, um Hämoglobin freizusetzen. Hämoglobin wird dann zu Met-Hämoglobin (FeIII) oxidiert und bildet gemeinsam mit Azid stabiles Azidomethämoglobin. Die Hämoglobinkonzentration ist direkt proportional zur Farbintensität. Diese Reaktionen werden nachstehend gezeigt.
Tabelle I zeigt die Reagenskonzentrationen und Komponenten, die verwendet werden, um einen Hämoglobin-Assaystapel zur Verwendung bei einer Kassette gemäß vorliegender Erfindung herzustellen. Tabelle 1 Hämoglobin-Testzusammensetzung, Reagens, Regenskonzentration pro Test, Anbieter
* auf Basis einer Mehrschicht-Filmtechnik unter Verwendung von Porex als Lyse-Kissen (Kissengröße 81,28 cm (32 mil) und 345,44 cm (136 mil) im Durchmesser)
Die angegebenen Reagenzien wurden in entgastem entionisiertem Wasser gelöst und über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Ein Stapel aus einer Porexbahn wurde in die entgaste Reagens-Ausgangslösung gesenkt, so daß der Porex-Träger vollständig und gleichmäßig imprägniert wurde. Überschüssiges Reagens wurde vom Stückgitter abgetupft, bevor dieses in einen Trockentunnel übergeführt wurde. Vorbereitendes Trocknen wurde in einem Trockentunnel mit einem regulierten Luftstrom bei 40ºC über 4 h erreicht. Die Reagensträger wurden dann 12 h lang unter Hochvakuum gehalten. Der resultierende Hämoglobin-Reagensträger wurde in einem dunklen Trockenbehälter bei 4ºC gelagert.
Die Reagensträgerscheibe wurde als Schicht 1 verwendet, um durch Übereinanderlegen mit den zuvor beschriebenen Stapelschichten 2-4 (siehe Beispiel 1) einen Reagensstapel für Hämoglobin herzustellen. Der resultierende Reagensstapel wurde in eine wie oben beschrieben hergestellte Kassette eingesetzt. Dosis/Response- und klinische Bewertungen wurden am Assay gemäß vorliegender Erfindung (BiotrackTM-Assay) durchgeführt und mit dem im Handel erhältlichen HemocueTM-Assay für Hämoglobin verglichen, wobei Vollblutproben verwendet wurden. Die Ergebnisse, die in den Tabellen 2 und 3 angeführt werden, zeigen, daß die Kassette gemäß vorliegender Erfindung nützliche klinische Informationen liefern kann, während sie die zuvor beschriebenen Vorteile der Erfindung liefert. Tabelle 2 Hämoglobin-Testdosis/Response Tabelle 3 Klinische Korrelation für Hämoglobin-Test im Vergleich mit Bezugsverfahren

Beispiel 3: Demonstration der Filtration roter Blutkörperchen

Bei einem Versuch, bei dem die Wirksamkeit des Filters festgestellt wurde, kamen Prototyp 4-Fenster-Kassetten und Monitore zum Einsatz. Die Kassetten enthielten Stapel, die aus mit Antikörper getränkten Polypropylenfiltern, Gelman TR-3000TM-Membran und zwei Schichten aus ST-69 (Schleicher und Schuell) bestanden. In den Stapeln war keine Assaychemie vorhanden. Blut (45% HämatokritTM), das entsprechende Plasma und Serumproben mit bekannten Hämolyseniveaus wurden in der herkömmlichen Weise auf die Kassetten aufgebracht und die K/S-Werte nach 3 min bei 585 nm aufgezeichnet um die Auswirkungen auf rote Blutkörperchen, die nicht durch den Filter entfernt wurden, zu bestimmen, wurden Blut-Proben mit bekanntem, niedrigem Hämatokrit direkt auf die optische Oberfläche des Stapels aufgebracht.
Die nachstehend in Tabelle 4 angeführten Ergebnisse zeigen, daß > 99% der roten Blutkörperchen entfernt waren und < 1% Hämolyse auftrat. Tabelle 4
¹ Als Hämatokrit-Äquivalent angegeben
Beispiel 4: Mehranalyten-Assaysystem: Glucose-, Cholesterin- und Hämoglobin-Bestimmungen
Die Anordnung der Kapillarspuren und Stapel im Mehranalyten-Assaykassetten ist im wesentlichen gleich jener der in den Fig. 2 und 3 gezeigten Kassette. Alle vier Stapelhohlräume waren mit Stapeln gefüllt, die zu bis zu drei verschiedenen Typen gehörten. Eine Draufsicht auf die Prototyp-Kassette ist in Fig. 2 gezeigt. Eine Schnittansicht des Assaystapels wird in Fig. 3 gezeigt. Der Filter im Glucose- und im Cholesterin-Stapel war ein Polypropylen-Faservlies (ErgonTM) (193,26 g/m² (5,7 oz/yard²), das mit Antikörper gegen rote Blutkörperchen (Orgenon-Teknika, im g/ml) imprägniert und dann getrocknet wurde. Die Filterstapel enthalten auch eine Membran und ein Gitter zur Regulierung der Flüssigkeitsbewegung. In allen Fällen befindet sich an der Oberseite des Stapels eine poröse Membran, die als Reflexionselement dient. Im Fall der Glucose- und Cholesterinstapel ist das Assayreagens in dieser Membran enthalten. Beim Hämoglobinstapel ist Detergens in eine poröse Kunststoffscheibe imprägniert. Die Stapelkonfigurationen sind in Tabelle 5 angeführt. TABELLE 5
Vor dem Zusammenbauen wurden die Kunststoffteile der Kassette Plasmaätzen unterzogen, was den Kontaktwinkel zwischen Blut und Kunststoff verringert und so den Kapillarfluß in der Kassette fördert. Die Kassetten wurden nach dem Ausstechen von Scheiben aus einem jeden Element, die in den oberen Teil des Kassette eingesetzt werden, zusammengebaut. Der untere Teil der Kassette wird dann mit dem oberen verschweißt, um die Stapel in den Stapelhohlräumen festzuhalten und die Kapillarkanäle abzudichten. Die Kassette wurden mit einer Trockenmittelpackung einzeln in Aluminium/Kunststoffolie verpackt.
Die Zusammensetzungen der Assaychemie sind nachstehend als Menge pro Test angegeben:
Glucose: Glucose-Oxidase (Aspergillus niger) (1,4 IE), Meerrettich-Peroxidase (0,28 IE), 4-Aminoantipyren (22 ug), N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (44 ug).
Cholesterin: Cholesterin-Esterase (Pseudomonas) (2,8 IE), Cholesterin-Oxidase (Streptomyces cinnamoneus) (0,36 IE), Meerrettich-Sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin (0,44 mg).
Hämoglobin: ThesitTM ~ (1,8 mg), Natriumdesoxycholat (0,37 mg), Natriumnitrit (0,18 mg) und Natriumazid (31 ug).
Wäßrige Zusammensetzungen der obigen Substanzen, formuliert mit Puffern, Stabilisierungsreagenzien und Detergenzien wurden in das entsprechende Stapelmaterial imprägniert und getrocknet.
In den Glucose- und Cholesterinstapeln werden rote Blutkörperchen mittels Hindurchleiten durch einen Filter entfernt, bevor sie in eine Trägermembran gelangten, die Assaychemie enthielt. Da einige der chemischen Substanzen (Glucose und Cholesterin) Sauerstoff erfordern, sorgt die Kassette an der Deckfläche des Assaystapels für Zugang zur Atmosphäre.
Kalibratoren waren Blutproben, die - falls erforderlich - mit Analyt oder verdünntem analytfreiem Plasma ergänzt waren.
Assayvorschriften: nach dem Einsetzen der Kassette in den Monitor wurden Blutproben (typischerweise 35 ul) auf die Probenaufbringstelle aufgebracht. Die Reaktionen erfolgten im allgemeinen für 3 min. und die Reflexionswerte wurden nach drei Minuten oder, wenn keine Änderung der Reflexion im Zeitverlauf auftrat, aufgezeichnet. Üblicherweise wurde die Reflexion in allen Assays bei einer einzigen Wellenlänge (585 nm) gemessen. Die Analytenkonzentrationen in klinischen Proben und Vergleichsmaterialien wurden unter Verwendung des Kodak DT-60TM für Glucose und Cholesterin und des HemocueTM ~ für Hämoglobin bestimmt.
Berechnung der Ergebnisse: Das relative Reflexionsvermögen, R, wurde üblicherweise als Verhältnis zwischen dem Signal nach Beendigung der Reaktion und dem, das vor dem Benetzen des Stapels aufgezeichnet wurde, definiert. Eine vereinfachte Version der Kubelka-Munk-Beziehungen K/S = (1-R^2/2R) wurde verwendet, um K/S zu berechnen, worin K der Absorptionskoeffzient des Chromophor/Membran-Paares ist, der eine Funktion des Absorptionsvermögens und der Konzentration des Chromophors ist, und S der Streuungskoeffzient der Membran ist. Bei optisch dicken Membranen ist K/S direkt proportional zur Konzentration an gefärbtem Produkt. Die K/S-Werte wurden mit einer Kali brierungsfunktion (üblicherweise eines Polynoms mit vier Termen, die von Daten von zumindest fünf Kalibrierungsmaterialien abgeleitet worden war, die den Assaybereich umspannten, in Analytenkonzentrationen umgerechnet.

Ergebnisse Kassettenleistung

Die Kassette dient dazu, den Assaystapeln Blut zuzuführen, um rote Blutkörperchen in den Cholesterin- und Glucosestapeln abzufiltrieren und Probe und Reagenzien zu vermischen. Es wurde gute Reproduzierbarkeit der Flußdauer von der Probenaufbringstelle zum Stapel und die Zeit zur Sättigung des Assaystapels festgestellt. Die Zeit vom Aufbringen der Probe bis zum Abschließen des Benetzens der optischen Oberfläche lag im Bereich von 45 bis 90 s für Blut mit jeweils 20 bis 60% HämatokritTM.
Die Effizienz des Filters für rote Blutkörperchen wurde in Glucose-Assaystapeln bewertet, wobei Assayreagens weggelassen und die Färbung der optischen Membran bei 585 nm gemessen wurde, was dem Haupt-Absorptionsvermögen von Hämoglobin entspricht. Jeglicher Austritt von roten Blutkörperchen oder Hämolyse kann auf diese Weise detektiert werden. Es wurde weniger als 1% Austritt oder Hämolyse festgestellt. Der Filter arbeitet durch Agglutinierung der roten Blutkörperchen und Tiefenfiltration der agglutinierten Blutkörperchen im Faser-Gitter des Filters. Der Filter ist für Blut mit bis zu 60% Hämatokrit wirksam.
Das Lösen und Vermischen von Reagenzien und Probe tritt spontan auf, wenn sich die Probenflüssigkeit in die mit Reagens imprägnierten porösen Medien bewegt. Die Reproduzierbarkeit dies Verfahren ist gut, wie die Assaygenauigkeit zeigt (siehe weiter unten). Bei jedem Assay wurde die Farbausbeute, die dem Assay-Quantifizierungsbereich entsprach, sowohl theoretisch als auch durch direkten Versuch bestimmt. Die Ausbeuten lagen bei etwa 80 % für die Glucose- und Cholesterinassays und 100% für Hämoglobin. Bei Test-Membranen wurden S-Werte gemessen. Durch Untersuchung der Ergebnis se war es dann möglich, ein Membran/Chromophor-Paar zu wählen, das einen Bereich von K/S-Werten nahe dem optimalen Bereich von 0,2 bis 2,0 ergibt. Diese optimale Bereich wurde berechnet, indem eine Fehleranalyse durchgeführt wurde. Die Fehlerfunktionen weisen flache Minima im K/S-Bereich 0,2 bis 2 auf.
Bei den gewählten Assay-Chemien wurden hohe Konzentrationen an Enzymen und Enzymsubstratüberschüsse eingesetzt, um den Analyten rasch und vollständig in das gemessene Reaktionsprodukt umzuwandeln. Ein typischer zeitlicher Assayverlauf zeigt, daß die Reflexion etwa 20 s nach der Probenaufbringung zu sinken beginnt. Vor diesem Sinken ermittelt der Monitor die Stapelreflexion und vergleicht sie mit den vorher festgelegten Normen, um zu verifizieren, daß die Kassette nicht fehlerhaft ist. Es findet ein rasches Sinken der Reflexion statt, wenn die optische Membran benetzt wird. Das ist auf die Zunahme des Brechungsindex des Mediums zurückzuführen, mit dem die Membranporen imprägniert sind, wobei Luft durch Plasma ersetzt wird. Diese Änderung verursacht eine Reduktion der spezifischen Reflexion (S) der Membran. Die Reagenzien lösen sich rasch im Plasma auf und reagieren mit dem Analyten. Typischerweise innerhalb von zwei bis drei Minuten ist die Reaktion abgeschlossen, wie durch das Nicht- Vorliegen von Reflexionsänderung gezeigt. Unabhängige Messungen der chemischen Ausbeute des Produkts von Analyten zeigen, daß bei allen Assays über den gesamten Analytenbereich zumindest 80% Umsatz erfolgt. Assays, bei denen vollständiger Umsatz in gefärbtes Produkt erfolgt und wo die Reflexionsmatrix optisch dick ist, sollten eine lineare Reaktion von K/S auf Analyten aufweisen. Das ist tatsächlich bei allen drei Assays (Glucose, Cholesterin und Hämoglobin) der Fall. Die Reaktion ist bis zu den höchsten Analyten mengen im wesentlichen linear. Bei hohen Analytenmengen nimmt die Reaktion aufgrund unvollständigen Umsatzes etwas ab. Eine derartige Nicht-Linearität läßt sich durch entsprechende Kalibrierung natürlich leicht bewältigen.
Nach der Kalibrierung ergaben alle Assays (Glucose, Cholesterin und Hämoglobin) Ergebnisse, die eine gute Korrelation mit etablierten Verfahren für Patientenproben aufweisen. Das Glucoseassay korreliert hervorragend mit einem im Handel erhältlichen Verfahren und erzeugt Ergebnisse, die insgesamt vollständig übereinstimmen (Anstieg der Regressionsgeraden ist 1,0 und der Achsenabschnitt ist vernachlässigbar gering). Die Korrelationsstatisik für alle Assays ergab einen Korrelationskoeffizienten von 0,99. Für diese Korrelationsuntersuchungen war es zweckmäßig, heparinisierte venöse Blutproben zu verwenden. Um Fingerstich- und venöse Probenergebnisse im System zu vergleichen wurden gepaarte Tests durchgeführt. Die Ergebnisse wurden durch "Wilcoxon signed rank paired"-Statistiken analysiert. Bei allen Assays (Glucose, Cholesterin und Hämoglobin), bei denen 20 gepaarte Proben verwendet wurden, betrug der p-Wert für 95%-igen Vertrauensbereich etwa 0,9, was darauf hinweist, daß die Fingerstich- und venösen Ergebnisse äquivalent waren.
Die Präzision der Assays in diesem Entwicklungsstadium unter Verwendung von Kassetten, die durch ein halbautomatisiertes Verfahren zusammengebaut wurden, liegt im Bereich von 3 bis 6% CV in der Mitte des quantifizierten Bereichs für alle Analyten.
Die Interferenz bei Assays aufgrund üblicher problematischer Faktoren ist bewertet worden. Bilirubin bis zu 600 mg/dl. Lipemia bis zu 12 g Triglyceride/I und Hämolyse bis zu 10 g/l haben keine wesentlichen Auswirkungen auf die Assayergebnisse.
Hämolyse kann aufgrund unangemessener Handhabung der Probe auftreten. Ein einfacher Algorithmus, der aus den bekannten Spektraleigenschaften des Reaktionsprodukts und von Hämoglobin konstruiert ist, ermöglicht die Berechnung sowohl der Chromogen- als auch der Hämoglobinkonzentrationen von Daten, die bei 585 nm (wo sowohl das Reaktionsprodukt als auch Hämoglobin stark absorbieren) und 637 nm (wo das Reaktionsprodukt absorbiert und Hämoglobin geringe Absorption aufweist) ermittelt wurden. Geringere Hämoglobinkonzentrationen als jene, bei denen eine Interferenz in den Glucose- und Cholesterinassays vorliegt, lassen sich leicht messen. Hämolysierte Proben, die inkorrekte Assayergebnisse ergeben, können auf diese Weise identifiziert werden.

Claims

1. Analysenkassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109), umfassend:

(a) ein flüssigkeitsundurchlässiges Gehäuse,

(b) eine Probenaufbringstelle (11), die einen Hohlraum (71) umfaßt, der sich in einer Außenfläche des Gehäuses befindet und eine Aufbringstellen-Flüssigkeits-Haltekapazität aufweist,

(c) eine Reflexions-Ablesestelle (51, 52, 53, 54, 55), die eine Kammer im Gehäuse umfaßt,

(d) Mittel (61, 62) zum Belüften der Kammer zur Atmosphäre,

(e) einen Probentransport-Kapillarkanal (21) im Gehäuse, der die Probenaufbringstelle (11) mit der Reflexions-Ablesestelle verbindet und eine Probentransport-Flüssigkeitshaltekapazität aufweist, sowie

(f) eine poröse Matrix, die sich in der Reflexions-Ablesestelle befindet und eine poröse Matrix-Flüssigkeitshaltekapazität aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß

(g) die Probentransportkapazität gleich groß wie oder größer als die Kapazität der porösen Matrix ist,

(h) die Aufbringstellenkapazität geringer als die Summe der Probentransportkapazität und der Kapazität der porösen Matrix ist, und

(i) der Kapillarkanal so beschaffen ist, daß Kapillarkräfte am vorderen und am hinteren Ende einer Probe in diesem Kanal ausgeglichen sind, wenn eine Probe mit einem Volumen, das gleich jenem der Kapazität der porösen Matrix oder geringer als dieses ist, von der Probenaufbringstelle (11) her in den Kapillarkanal (21) eintritt.

2. Analysenkassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109) nach Anspruch 1, worin der Probentransport-Kapillarkanal (21) Wandmittel umfaßt, um die Probe an den Positionen des vorderen und des hinteren Meniskus den ausgeglichenen Kräften auszusetzen, wenn eine Probe mit einem Volumen, das gleich dem der Kapazität der porösen Matrix oder geringer als dieses ist, von der Aufbringstelle (11) her in den Kapillarkanal (21) eintritt, wobei die Positionen des vorderen und des hinteren Meniskus für das dem der Matrixkapazität gleichende Probenvolumen als vordere Position des gleichen Volumens bzw. als hintere Position des gleichen Volumens identifiziert werden.

3. Analysenkassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109) nach Anspruch 2, worin der Kapillarkanal (21) und die Aufbringstelle (11) an einer Aufbringstellen-Verbindung verbunden sind und der Kapillarkanal (21) Wandmittel umfaßt, um an der Verbindungsstelle einen Krümmungsradius für einen an der Verbindungsstelle befindlichen hinteren Probenmeniskus zu schaffen, der einem Krümmungsradius für einen vorderen Probenmeniskus gleicht, der sich an der vorderen Position des gleichen Volumens befindet.

4. Analysenkassette (101, 102, 103, 104) nach Anspruch 2, worin der Kapillarkanal (21) an den Positionen des gleichen Volumens gleiche Querschnittsabmessungen aufweist.

5. Analysenkassette (105, 106, 107, 108) nach Anspruch 2, worin der Kapillarkanal (21) an den Positionen des gleichen Volumens unterschiedliche Querschnittsabmessungen aufweist, aber Wände der Kapillare mit unterschiedlichen Oberflächenenergien oder Gravitationspotentialen an den Positionen des gleichen Volumens die gleichen Kräfte ausüben.

6. Analysenkassette (105) nach Anspruch 1, worin die Kassette Lenkmittel (63) umfaßt, um zu bewirken, daß eine Probe, die nahe der Aufbringstelle (11) aufgebracht wird, in die Aufbringstelle fließt.

7. Analysenkassette (105) nach Anspruch 6, worin das Lenkmittel (63) eine Oberfläche umfaßt, die die Aufbringstelle im wesentlichen umgibt und zur Aufbringstelle (11) hin abfällt.

8. Analysenkassette (105) nach Anspruch 6, worin das Lenkmittel (63) weiters Mittel (64) umfaßt, um über die Aufbringstellenkapazität hinausgehende Probe von der Aufbringstelle auszuschließen.

9. Analysenkassette (105) nach Anspruch 8, worin das Lenkmittel (63) eine Oberfläche umfaßt, die die Aufbringstelle im wesentlichen umgibt und zur Aufbringstelle (11) hin abfällt, und das Mittel zum Ausschließen von Probe einen Schlitz in einem oberen Bereich der Oberfläche umfaßt.

10. Analysenkassette (108) nach Anspruch 2, worin die Kassette weiters einen Überlaufkapillarkanal (26/27, 29) umfaßt, der an einer Überlaufverbindung (32, 33) mit dem Probentransport-Kapillarkanal (21, 28) verbunden ist.

11. Analysenkassette (108) nach Anspruch 10, worin die Überlaufverbindung (32) im Probentransport-Kapillarkanal (21) nach der vorderen Position des gleichen Volumens angeordnet ist.

12. Analysenkassette (108) nach Anspruch 11, worin der Überlaufkapillarkanal (26/27) Wandmittel umfaßt, um einen Meniskus zu bilden, der eine Kapillarkraft ausübt, die geringer als jene ist, die im Probentransport-Kapillarkanal (21) oder der porösen Matrix herrscht, wenn eine Probe im Überlaufkapillarkanal (26/27) und im Probentransport-Kapillarkanal (21) oder der porösen Matrix vorhanden ist.

13. Analysenkassette nach Anspruch 10, worin die Überlaufverbindung (33) im Probentransport-Kapillarkanal vor der vorderen Position des gleichen Volumens angeordnet ist.

14. Analysenkassette nach Anspruch 13, worin der Überlaufkapillarkanal (29) Wandmittel umfaßt, um einen Meniskus auszubilden, der eine Kapillarkraft ausübt, die gerin ger als jene ist, die im Probentransport-Kapillarkanal (28) herrscht, wenn eine Probe im Überlaufkapillarkanal (29) und im Probentransport-Kapillarkanal (28) vorhanden ist.

15. Analysenkassette nach Anspruch 1, worin (1) die Kassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108) mehrere Reflexions-Ablesestellen (51, 52, 53, 54, 55) umfaßt, die mehrere Reflexions-Ablesematrizen enthalten, wobei die mehreren Matrizen gemeinsam die Kapazität der porösen Matrix aufweisen, und (2) der Probentransport-Kapillarkanal (21) (a) Verzweigungskapillaren (22, 23, 24, 25, 26) umfaßt, die von einer oder mehreren Verzweigungstellen (31, 32) im Probentransport-Kapillarkanal (21) weg zu jeder der Stellen führen, sowie (b) eine anfängliche Hauptkapillare, welche die Probenaufbringstelle (11) mit einer ersten Verzweigungsstelle (31) der Verzweigungsstellen (31, 32) im Probentransport-Kapillarkanal (21) verbindet.

16. Analysenkassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108) nach Anspruch 15, worin die Hauptkapillare eine Hauptflüssigkeitshaltekapazität aufweist, die größer als die Kapazität der porösen Matrix ist.

17. Analysenkassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108) nach Anspruch 16, worin die Verzweigungskapillaren (22, 23, 24, 25, 26) jeweils Wandmittel aufweisen, um eine bewegende Kapillarkraft auszuüben, die größer als die verzögernde Kapillarkraft in der Hauptkapillare (21) ist, wenn in der Probentransportkapillare (21) eine Probe vorhanden ist, und die Probe einen vorderen Meniskus in einer der Verzweigungskapillaren (22, 23, 24, 25, 26) und einen hinteren Meniskus in der Hauptkapillare (21) aufweist.

18. Analysenkassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108) nach Anspruch 17, worin die Hauptkapillare (21) Wandmittel umfaßt, um die Probe an den Positionen des vorderen und des hinteren Meniskus gleich großen bewegenden und verzögernden Kräften auszusetzen, wenn eine Probe mit einem Volumen, das gleich der Kapazität der porösen Matrix ist, von der Aufbringstelle (11) weg in die Hauptkapillare (21) eintritt, wodurch verhindert wird, daß die Probe in die Verzweigungskapillaren (22, 23, 24, 25, 26) fließt, wobei die Positionen des vorderen und des hinteren Meniskus für das der Matrixkapazität gleichende Probenvolumen als vordere Position des gleichen Volumens bzw. hintere Position des gleichen Volumens identifiziert werden.

19. Analysenkassette (105, 106, 107, 108) nach Anspruch 1, worin das Mittel zum Belüften eine Öffnung (61, 62) in einer Deckfläche des Gehäuses in der Kammer umfaßt, wodurch eine Oberfläche der Reflexionsmatrix durch die Öffnung (61, 62) hindurch äußerer Einstrahlung und Reflexion ausgesetzt ist.

20. Analysenkassette (105, 106, 107, 108) nach Anspruch 19, worin die Öffnung (61, 62) eine Stop-Flow-Verbindung unterhalb der Deckfläche umfaßt.

21. Analysenkassette (105, 106, 107, 108) nach Anspruch 20, worin die Öffnung (61, 62) kreisförmig ist und die Stop-Flow-Verbindung eine Leiste mit einer Kante mit einem Innenwinkel von 90º oder weniger umfaßt, die in die Öffnung hineinragt.

22. Diagnosesystem, umfassend:

(a) einen Monitor, umfassend:

(i) Mittel zum Detektieren Mehrfachreflexionsablesungen in einer Anordnung einzelner Positionen,

(ii) Mittel zum Registrieren einer Analysenkassette an einer feststehenden Position und Ausrichtung relativ zur Anordnung in einem Innenraum des Monitors, und

(iii) Mittel zum Bestimmen und Anzeigen von Analysenergebnissen durch Reflexionsablesungen, die an einzelnen Positionen in der Anordnung erhalten werden; und

(b) eine erste Analysenkassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108) nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin sich die Probenaufbringstelle (11) im flüssigkeitsundurchlässigen Gehäuse an einer Position befindet, die außerhalb des Monitors liegt, wenn die Kassette durch Paßmittel im Monitor eingepaßt ist, und die eine oder mehrere Reflexionsablesestelle(n) (51, 52) umfaßt, die im Gehäuse angeordnet ist/sind, um mit einer oder mehreren der Positionen in der Anordnung übereinzustimmen, wenn die Kassette im Monitor eingepaßt ist.

23. System nach Anspruch 22, worin mehrere Reflexions-Ablesestellen (51, 52) in der Kassette vorhanden sind.

24. System nach Anspruch 23, worin das System weiters eine zweite Analysenkassette umfaßt, die fähig ist, zumindest einen Analyten unabhängig von den von der ersten Kassette gemessenen Analyten zu messen.

25. System nach Anspruch 24, worin die zweite Analysenkassette zumindest eine Reflexions-Ablesestelle (53, 54, 55) an einer Position in der Anordnung umfaßt, die sich von den Reflexions-Ablesestellen (51, 52), die von der ersten Analysenkassette verwendet werden, unterscheidet.

26. System nach Anspruch 22, worin der Monitor weiters Mittel umfaßt, um die Analysenkassette (101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109) zu detektieren und zu identifizieren, wenn sie in den Monitor eingeschoben ist, und die Kassette weiters Informationen umfaßt, die auf der Kassette kodiert sind, wodurch das Mittel zum Detektieren und Identifizieren der Analysenkassette die Kassette als zu einem vorbestimmten Kassettentyp gehörig identifiziert, der vom Monitor erkannt wird, wenn die Kassette in den Monitor eingeschoben ist.

27. System nach Anspruch 26, worin die zweite Analysenkassette zumindest einen Kapillarkanal umfaßt, der sich von den Kapillarkanälen unterscheidet, die von der ersten Analysenkassette verwendet werden.

28. System nach Anspruch 22, worin das Gehäuse einen Kapillarbaum umfaßt, der eine einzelne Aufbringstelle mit einer Vielzahl von Assaystapeln verbindet, worin der Kapillarbaum einen Anfangskapillarkanal (21) mit einer ersten Querschnittsfläche und einer Vielzahl von Verzweigungskapillarkanälen (22, 23, 24, 25) umfaßt, der den Anfangskapillarkanal (21) mit den Assaystapeln (51, 52, 53, 54) entweder direkt oder über weitere Verzweigungskapillarkanäle verbindet, worin jede der Verzweigungskapillaren in einem Kanal, der die Hauptkapillare mit einem der Assaystapel verbindet, enger als die Hauptkapillare und jegliche vorhergehende Verzweigungskapillare in der Verbindung ist.

29. System nach Anspruch 22, worin die Reflexions-Ablesestellen (51, 52, 53, 54, 55) in einer Anordnung vorliegen, die auf einer ebenen Oberfläche des Gehäuses zugänglich ist.

30. Sammlung von Analysenkassetten zum Detektieren mehrerer Analyten, umfassend eine erste und eine zweite Analysenkassette nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die erste Analysenkassette umfaßt:

ein Mittel, um die Kassette als zu einem vorbestimmten ersten Kassettentyp zugehörig zu identifizieren, und einen Assaystapel (51), der sich in der Reflexions-Ablesestelle befindet;

wobei die zweite Analysenkassette zum Bestimmen zumindest eines Analyten unabhängig von den von der ersten Kassette bestimmten Analyten umfaßt:

Mittel, um die Kassette als zu einem vorbestimmten zweiten Kassettentyp gehörig zu identifizieren, und

einen Assaystapel (52), der sich der Reflexions-Ablesestelle befindet; und

worin die erste und die zweite Analysenkassette so ausgebildet sind, daß sie in eine einzelne Ableseposition eines Monitors eingesetzt werden können, und die Reflexions- Ablesestellen in der ersten und der zweiten Kassette so angeordnet sind, daß sie von einer einzelnen Anordnung von im Monitor befindlichen Reflexionsablesevorrichtungen abgelesen werden können.

31. Analysenkassette nach einem der Ansprüche 1 bis 21, weiters umfassend eine Öffnung (61, 62) im Gehäuse in der Kammer, wodurch eine Oberfläche der Reflexions matrix durch die Öffnung hindurch potentieller äußerer Bestrahlung und Reflexion ausgesetzt ist, die eine Stop-Flow-Verbindung umfaßt.

32. Analysenkassette (105, 106, 107, 108) nach Anspruch 31, worin die Öffnung kreisförmig ist und die Stop-Flow-Verbindung eine Leiste mit einer Kante mit einem Innenwinkel von 90º oder weniger umfaßt.

33. Analysenkassette (105, 106, 107, 108) nach Anspruch 32, worin die Öffnung (61, 62) kreisförmig ist und die Stop-Flow-Verbindung an einer Verbindungsstelle in der Öffnung vorliegt, wo die Öffnung von einem proximalen geringeren Durchmesser zu einem distalen größeren Durchmesser übergeht, wobei die proximale und die distale Position in der Öffnung auf die Oberfläche der Reflexionsmatrix bezogen sind.