DE69316572T2

DE69316572T2 - Messung von blutplättchenaktivitäten

Info

Publication number: DE69316572T2
Application number: DE69316572T
Authority: DE
Inventors: Hendrik Hemker; Robert Wagenvoord
Original assignee: Dade Producktions AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Switzerland
Priority date: 1992-06-03
Filing date: 1993-06-03
Publication date: 1998-09-10
Anticipated expiration: 2013-06-04
Also published as: US5266462A; CA2114719A1; EP0605674B1; EP0605674A1; ATE162632T1; AU4409093A; DE69316572D1; ES2114053T3; AU658073B2; CA2114719C; JP3143694B2; WO1993024840A1; JPH06509479A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Messen von Blutplättchenaktivität bei Blutkoagulation. Noch genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein chromogenes Nachweisverfahren zum Bestimmen der Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen in Voliblut, Verfahren zum Bestimmen der Ruheaktivität und/oder Anregbarkeit von Blutplättchen, was wiederum den Schwellenwert bestimmt, bei dem eine Aktivierung der Blutgerinnungsfaktoren gefährlich ist, und Verfahren zur Untersuchung von Arzneimitteln auf ihre potentielle inhibierende Wirkung auf die Aktivierung von Blutplättchen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es kann gezeigt werden, daß Haemostase oder die Blockierung des Blutflusses eine Störung eines Systems ist, das ein empfindliches Gleichgewicht von zwei Prozessen ist - Koagulation und Fibrinolyse. Unter normalen Bedingungen bleibt Blut flüssig, wenn jedoch eine Gefäßschädigung erfolgt oder wenn sich bestimmte abnormale physiologische Zustände entwickeln, ist das dynamische Gleichgewicht in einem oder in beiden dieser Prozesse gestört, und es ergibt sich eine Haemostase.
An der Blutkoagulation sind mehr als 50 wichtige Substanzen beteiligt, die in Blut oder im Gewebe gefunden werden, wobei einige ("Prokoagulanzien") die Koabulation begünstigen und andere ("Antikoagulanzien") die Koabulation inhibieren. Ob Blut koaguliert oder nicht, hängt von dem Gleichgewichtszustand zwischen diesen zwei Substanzgruppen ab. Bei einer gesunden Person überwiegen normalerweise die Antikoagulanzien, und das Blut bleibt flüssig. Bei belasteten Personen, das sind solche Personen mit endogen geschädigten Gefäßen und insbesondere solche mit bestimmten abnormalen physiologischen Zuständen, werden in den betroffenen Bereichen Prokoagulanzien "aktiviert" und überwinden die Antikoagulanzien, was zur Bildung von Thrombin führt, das wiederum zur Entwicklung eines Blutgerinnsels oder Thrombus führt. Ein Thrombus ist ein Aggregat von Blutfraktionen, vor allem Blutplättchen und Fibrin unter Einschluß von Zellelementen, die häufig eine Verstopfung am Ort ihrer Bildung bewirken.
Es herrscht allgemeine Übereinstimmung, daß eine Blutkoagulation oder -gerinnung in drei Hauptschritten erfolgt. Zuerst wird ein Substanzkomplex gebildet, der Prothrombinaktivator genannt wird, z.B. als Reaktion auf die Ruptur der Blutgefäße oder eine Schädigung des Blutes selbst. Zweitens katalysiert der Prothrombinaktivator die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin. Drittens wirkt das Thrombin als Enzym, um die Blutplättchen zu aktivieren und um Fibrinogen in Fibrinfasern umzuwandeln, die die Blutplättchen, Blutzellen und Plasma mit einem Netzwerk umgeben, um das Gerinnsel selbst zu bilden.
Blutplättchen spielen bei der Blutkoagulation eine sehr wichtige Rolle. Sie spielen eine Doppelrolle, denn sie bilden Aggregate und sie stellen Prokoagulationsphospholipide zur Verfügung, das heißt negativ geladene Phospholipide. Die Aggregate haben anfänglich als Pfropf zwei Funktionen, die eine ist, daß sie für eine kurze Zeit eine Blutung verhindern, und die andere ist, daß sie als Schwamm oder Nische aus nichtfließendem Plasma wirken, wo sich Thrombin ansammeln kann. Dieses angesammelte Thrombin wiederum aktiviert den Mechanismus der Gerinnungsbildung auf verschiedene Arten, aber wichtig ist, daß er auch die Blutplättchen aktiviert.
Thrombin wird durch Aktivierung von Prothrombin mit Faktor Xa gebildet. Faktor Xa wird durch Aktivierung von Faktor X mit Faktor IXa gebildet. Beide Aktivierungsreaktionen sind in Abwesenheit von Prokoagulationsphospholipiden langsam. Eine Phospholipid-Membran wirkt nur prokoagulierend, wenn eine ausreichende Menge an negativ geladenen Phospholipiden (meistens Phosphatidylserin) vorhanden ist (siehe z.B. Bevers et al., Eur. J. Biochem. 122 (1982), 429-436). Die äußere Schicht eines ruhenden Blutplättchens enthält kaum Phosphatidylserin. Die Membran ist somit kaum oder nicht prokoagulierend. Bei der Aktivierung des Blutplättchens wird das in der inneren Membranschicht vorhandene Phosphatidylserin in der äußeren Schicht exponiert.
Dies ist die sogenannte Flip-Flop-Reaktion, und durch diesen Prozeß wird das Blutplättchen prokoagulierend.
Blutplättchen können nicht nur durch die natürlichen Aktivatoren Thrombin und Kollagen aktiviert werden, sondern auch durch Calcium-Ionophor A23187 (Bevers et al., vorstehend), Diamid (Van Rijn et al., Eur. J. Biochem. 133 (1983), 1-10) und mehrere andere Verbindungen, wie Serotonin (Zucker und Nachtmias, Arteriosclerosis 5 (1985), 2-18), Epinephrin, Blutplättchenaktivierungsfaktor, Adenosindiphosphat etc. (siehe Rapaport, Introduction to haematology 440-448). Da Blutplättchen durch Thrombin aktiviert werden, erleichtert diese Verbindung seine eigene Bildung. Neben prokoagulierenden Phospholipiden werden die Cofaktoren, Faktor Va und VIIIa, für eine optimale Aktivierung von Prothrombin bzw. Faktor X benötigt. Diese Cofaktoren werden durch Aktivierung der Faktoren V und VIII mit Spuren von Thrombin gebildet. Auf diese Art begünstigt auch Thrombin seine eigene Bildung. Wie die ersten wenigen Moleküle von Faktor V und VIII aktiviert werden, unterliegt immer noch der Spekulation.
Wie vorstehend erwähnt, ist der Gehalt an aktivierten Gerinnungsfaktoren in Vollblut normalerweise gering, da alle möglichen Arten von Plasmainhibitoren diese Gerinnungsfaktoren inhibieren. Unterhalb von einen bestimmten Schwellenwert sind diese aktivierten Faktoren nicht schädlich. Auch die Menge an Prokoagulationsphospholipiden in Vollblut ist gering, da ruhende Blutplättchen einen Mechanismus haben, Phosphatidylserin von der äußeren Schicht in die innere Schicht der Membran zu transportieren. Eine sehr geringe Menge von Phosphatidylserin ist wahrscheinlich noch in der äußeren Schicht vorhanden und bewirkt eine restliche Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen. Diese restliche oder "ruhende Aktivität" erzeugt den Schwellenwert, bei dem aktivierte Gerinnungsfaktoren eine Thrombusbildung ergeben können. Die Anfälligkeit einer Person, eine Thrombose zu bekommen, kann somit gut mit dem Pegel der Prokoagulationsaktivität dieser Blutplättchen korreliert werden.
Die bisherigen Verfahren zum Nachweis der Thromben in Menschen haben immer eine klinische Voraussetzung und sind somit eine Art einer Krankheitsdiagnose und -behandlung (siehe Rapaport, Indroduction to Haematology 558-576).
Die bisherigen Verfahren zum Nachweis der Thrombenbildung sind in den überwiegenden Fällen eine Abschätzung der Gerinnungszeiten, wie z.B. der Prothrombinzeit in ihren vielfältigen Variationen. Diese geben keine Information über die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen, weil externe Phospholipide zugegeben werden. Die Gesamtblutgerinnungszeit hat einen sehr großen experimentellen Fehler und hängt von hämatokriten Gerinnungsfaktoren, Blutplättchen und Fibrinolyse ab, alle zur gleichen Zeit. Spezialisierte Labortests, wie der Thrombin-Erzeugungstest in Blutplättchen-reichem Plasma, sind genauer, nehmen aber wenigstens eine halbe Stunde einer Laborfachkraft in Anspruch und sind nicht zur Untersuchung einer Population oder für die Krankenhaus routine geeignet.
Es wäre somit wünschenswert, ein Verfahren zur Bestimmung der Prokoagulationsaktivität ruhender Blutplättchen auf der Basis der Verfügbarkeit von negativ geladenen Phospholipiden in der äußeren Membran von Blutplättchen zu erstellen. Dies würde die Festsetzung eines Schwellenwertes erleichtern, oberhalb von dem vorhergesagt werden könnte, daß ein Risiko einer Thrombusbildung eintreten könnte. Außerdem wäre ein solcher Test nützlich bei der Ermittlung der Anfälligkeit von Blutplättchen gegenüber der aktivierenden Wirkung von Thrombin. Es wurde zum Beispiel gefunden, daß einige Blutplättchen anfälliger gegenüber der aktivierenden Wirkung von Thrombin sind als andere. Dies kann mit der Membranzusammensetzung der Blutplättchen, der Membran-Fluidität oder der Anwesenheit von Blutplättchen-Inhibioren zusammenhängen. Einfach zu triggernde Blutplättchen können ein höheres Thrombusbildungsrisiko zur Folge haben, und sie rechtfertigen deshalb vorbeugende therapeutische Maßnahmen. Es wäre auch wünschenswert, ein Verfahren zur Untersuchung von Arzneimitteln zu haben, die zum Beispiel die Flip-Flop-Wirkung negativ geladener Phospholipide in der Membran des Blutplättchens inhibieren. Solch ein Test könnte verwendet werden, Arzneimittel zur Verringerung der Anregbarkeit von Blutplättchen zu entwickeln, so daß das Risiko einer Thrombusbildung bei dem Patienten verringert würde. Schließlich wäre es für den praktischen/klinischen Arzt wünschenswert, ein Verfahren zum Messen der Prokoagulationsphospholipide in Vollblut zu haben, da die Isolierung von Blutplättchen zeitaufwendig und in der klinischen Anwendung nicht einfach anwendbar ist. Außerdem ist durch die Isolierung von Blutplättchen ein ernsthaftes Risiko für die Blutplättchenaktivierung vorhanden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein schnelles und einfaches Verfahren zum Bestimmen von einem der drei hauptsächlichen auf Thrombin basierenden Feedback-Mechanismen der Blutkoagulation zur Verfügung gestellt, nämlich die Erzeugung von Blutplättchen-Prokoagulationsaktivität.
Eine Variation des Verfahrens kann verwendet werden, die Ruheaktivität und/oder Anregbarkeit von Blutplättchen zu ermitteln. Die Ruheaktivität und/oder die Anregbarkeit von Blutplättchen kann verwendet werden, um solche zu bestimmen, die Thrombusbildungsrisiken sind. Entsprechend kann durch eine Modifikation des vorstehenden Verfahrens ein Nachweisverfahren verwendet werden, Arzneimittel zu suchen, die die Anregbarkeit von Blutplättchen verringern und/oder die Anwesenheit von Prokoagulationsphospholipiden auf einen Pegel unter den Schwellenwert verringern, bei dem eine solche Aktivität eine Reihe von Ereignissen zur Folge hat, die zu Thrombusbildung führen.
Die Merkmale der vorliegenden Erfindung sind in den Patentansprüchen 1, 2 und 12 angegeben.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt die Geschwindigkeit von Thrombinbildung als Funktion der Konzentration von Prokoagulationsphospholipiden.
Figur 2A und 2B zeigen die Auswirkung einer erhöhten Konzentration von Faktor Xa und Va auf die Thrombinbildung bei einer Konzentration von 1,0 uM bzw. 0,1 uM Prokoagulationsphospholipid.
Figur 3 zeigt die Auswirkung der Blutplättchenkonzentration auf die Thrombinbildung in einem Reaktionsgemisch mit Faktor Xa, Faktor Va, CaCl&sub2; und Prothrombin. Siehe Text für diese Verfahren. Die Blutplättchen (3,55 x 10&sup8; Zellen/ml) wurden 10mal (-O-), 5mal (-_-), 2mal (- -) und nicht verdünnt (- -). Die Kurven wurden mit der Formel y = ax³ + bx² + cx + d simuliert, wobei y das gebildete Thrombin und x die Reaktionszeit ist. Die abgeleiteten Funktionen der Gleichungen sind in Figur 3B aufgetragen.
Figur 4 zeigt die Auswirkung von Sonifikation auf die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen. Die Blutplättchen (3,44 x 10&sup7; Zellen/ml) wurden während 5 Minuten mit 6 u von Peak zu Peak ultraschallbehandelt. 300 ul der nicht behandelten (-O-) Blutplättchen (3,44 x 10&sup7; Zellen/ml) oder die ultraschallbehandelten Blutplättchen wurden wie in Figur 3 untersucht. Figur 4B ist die abgeleitete Funktion von Figur 4A.
Figur 5 zeigt die Auswirkung von Thrombin und Thrombin plus CaCl&sub2; auf die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen. Die Blutplättchen (1,72 x 10&sup8; Zellen/ml) wurden nicht behandelt (-O-), mit 3,3 nM Thrombin (-_-), oder mit 3,3 nM Thrombin und 2 mM CaCl&sub2; (- -)inkubiert. Das weitere Verfahren wird bei Figur 1 beschrieben. Figur 5B ist die abgeleitete Funktion von Figur 5A.
Figur 6 zeigt die Auswirkung von Thrombin, Kollagen und Thrombin plus Kollagen auf die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen. Die Blutplättchen (1,62 x 10&sup8; Zellen/ml) waren nicht behandelt (-O-), mit 4,0 nM Thrombin (-_-), mit 1 ug/ml Kollagen (- -), oder mit 4,0 nM Thrombin plus 1 ug/ml Kollagen (- -)inkubiert. Das weitere Verfahren ist vorstehend beschrieben. Die abgeleiteten Funktionen der Kurven in Figur 6A sind in Figur 6B angegeben.
Figur 7 zeigt die Auswirkung von Thrombin-Inkubation als Funktion der Zeit auf die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen. Die Blutplättchen (1 x 10&sup8; Zellen/ml) wurden nicht behandelt (-O-), oder mit 4 nM Thrombin während 15 (-_-), 60 (- -) und 180 Minuten (- -) inkubiert.
Figur 8 zeigt die Auswirkungen von Sonifikation bzw. Ultraschallbehandlung oder die Behandlung mit Calcium-Ionophor A23187 auf die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen. Die Blutplättchen (1,5 x 10&sup8; Zellen/ml) waren nicht behandelt (-O-), oder die Blutplättchen (3 x 10&sup6;) wurden während 5 Minuten mit 6 u von Peak zu Peak (-_-) ultraschallbehandelt, oder mit 1 uM Calcium-Ionophor A23187 während 5 Min. (- -) inkubiert. Die gefundenen Geschwindigkeiten der Thrombinbildung in den Fällen der Sonifikation bzw. Ultraschallbehandlung und der Ionophor-Behandlung wurden mit 50 multipliziert. Figur 8B gibt die abgeleitete Funktion von Figur 8A wieder.
Die Figuren 9 bis 16 zeigen Messungen der Prokoagulationsaktivität von Vollblut vor und nach physischen Anstrengungen von gesunden Freiwilligen.
Die Figuren 17 und 18 zeigen Messungen der Prokoagulationsaktivität von Vollblut von Thrombosepatienten.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Messung geringer Konzentrationen von Prokoagulationsphospholipiden.

Der erste Schritt bei der Entwicklung des Nachweisverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Test zu schaffen, der geringe Mengen negativ geladener Phospholipide mißt. Um die Aktivität solcher Prokoagulationsphospholipide genau zu messen, ist es vorteilhaft, ein Nachweisverfahren zu haben, das von der Konzentration der Prokoagulationsphospholipide linear abhängt und in der Lage ist, geringe Mengen von Phospholipiden zu ermitteln. Um die Menge an negativ geladenen Phospholipiden zu messen, ist eine enzymatische Reaktion erforderlich, die von solchen Phospholipiden abhängt. Beispiele solcher Reaktionen sind der vollständige Faktor X Aktivierungskomplex und die vollständige Prothrombinase. Zu anderen Reaktionssystemen, die auch verwendet werden können, gehören die unvollständigen Faktor X und Prothrombin-Aktivierungsgemische (ohne Faktor VIIIa bzw. Va). Für eine optimale Wirkung des Faktor X Aktivierungskomplexes werden Faktor IXa und Faktor VIIa benötigt, wohingegen für die vollständigen Prothrombinase Faktor Xa und Faktor Va benötigt werden. Da beobachtet wurde, daß Faktor VIIIa in Plasma instabil ist, aus Gründen, die noch unbekannt sind, wird es bevorzugt, die Komponenten der vollständigen Prothrombinase zu verwenden.
Das Nachweisverfahren zum Messen geringer Mengen von Prokoagulationsphospholipiden kann wie folgt durchgeführt werden:
Es werden zwei Gemische hergestellt, Reagens A und Reagens B. Reagens A enthält zum Beispiel Faktor Va, Faktor Xa und CaCl&sub2;, während Reagens B Prothrombin enthält. Eine bevorzugte Methode, das Nachweisverfahren durchzuführen, ist es, Phospholipide zu Reagens A zu geben und somit alle Komponenten der vollständigen Prothrombinase zur Verfügung zu stellen, und dann die Prothrombinaseaktivität durch Zugabe von Prothrombin und einem geeigneten chromogenen Substrat zu messen. Die Menge an Faktor Va, die verwendet werden kann, liegt im allgemeinen zwischen 0,2 und 8 nM, stärker bevorzugt zwischen 0,6 und 3 nM. Für Faktor Xa sind diese Zahlen etwa gleich, das Verhältnis zwischen Faktor Va und Xa sollte jedoch zwischen 1 und 2 liegen. Die Menge an CaCl&sub2;, die verwendet werden kann, liegt im allgemeinen zwischen 2 und 40 mM, stärker bevorzugt zwischen 4 und 8 mM. Die Menge an Prothrombin, die verwendet werden kann, liegt im allgemeinen zwischen 0,6 und 24 uM, stärker bevorzugt zwischen 2 und 12 uM.
Tabelle I veranschaulicht die Ergebnisse von einer Methode, bei der:
i) Reagens A mit 240 pM Faktor Xa und 15 mM CaCl&sub2; hergestellt ist;
ii) Reagens B 6 uM Prothrombin enthält;
iii) die Phospholipid-Stammkonzentration 3 mM (75 Mol% Phosphatiylcholin und 25 Mol% Phosphatidylserin), verdünnt auf die in Tabelle I gezeigten Konzentrationen ist; und
iv) das Pipettierschema 100 ul Reagens A vermischt mit 100 ul Phospholipiden mit anschließender Inkubation bei 37 ºC für 5 Minuten ist, wonach 100 ul Reagens B zugegeben wird. Proben von 100 ul werden nach 2 und 4 Minuten Reaktionszeit genommen, um das gebildete Thrombin zu messen, unter Verwendung eines Unterbrechungspuffers (880 ul einer 10 mM EDTA-lösung), eines chromogenen Substrats und eines optischen Analysegerätes, wie einem Spektrophotometer, das in der Lage ist bei genau 405 oder 396 nm zu messen.
Figur 1 zeigt, daß die Geschwindigkeit der Thrombinbildung linear mit der Phospholipidkonzentration bis zu etwa 0,4 uM in dem Reaktionsgemisch ist, was bedeutet, daß Phospholipide bis zu 1,2 uM in der Probe genau gemessen werden können. Um höhere Phospholipidkonzentrationen zu messen, sollte die Probe entweder verdünnt werden, oder es sollte eine kleinere Probe, zum Beispiel 20 ul, zugegeben werden, so daß die Menge an Phospholipiden verringert wird.
Die Menge an gebildetem Thrombin ist proportional zu der Hydrolysegeschwindigkeit (mΔA/Min.) des chromogenen Substrats, in diesem Fall S2238. Die Proportionalitätszahl hängt von dem Substrat, der Konzentration des Substrats und dem pH-Wert und der Salzstärke des verwendeten Puffers ab. Wenn mit einer konstanten Salzstärke und bei einem konstanten pH-Wert und unter Verwendung einer fixierten Substratkonzentration gearbeitet wird, dann ist diese Zahl eine Konstante. In diesem besonderen Fall ist die Zahl 0,0114. Tabelle I
Die Aktivität des vollständigen Prothrombinase-Komplexes als Funktion der Phospholipidkonzentration. Um die Geschwindigkeit der Thrombinbildung zu berechnen, wurden nur die 2 Mini-Proben verwendet.
Es wurde auch gezeigt, daß ein Erhöhen der Konzentration von Faktor Va und/oder Faktor Xa die Menge des gebildeten Thrombin erhöht (siehe Tabelle II). Genauer gesagt wurde Reagens A mit 2,24 nM, 0,48 nM, 0,72 nM, 0,96 nM und 1,2 nM Faktor Xa und Va hergestellt; dann wurden die Phospholipide von 1 uM (Figur 2A) und die Phospholipide von 0,1 uM (Figur 2B) gemessen.
Tabelle II zeigt, daß unter den beschriebenen Bedingungen die Geschwindigkeit der Thrombinbildung abhängig ist von der Enzymkomplex Konzentration und daß diese Konzentration vorzugsweise konstant gehalten werden sollte, um ein Reaktionssystem zu haben, in dem die Prothrombinaktivierung nur von der zugegebenen Menge an Prokoagulationsphospholipiden abhängt. Es sollte eine Enzymkomplex-Konzentration von 0,2 bis 4,0 nM, vorzugsweise von etwa 1,2 nM, verwendet werden, um ein möglichst großes Signal zu erhalten. Dies ist wichtig, insbesondere wenn es erwünscht ist, die Prokoagulationsphospholipid-Konzentration in Vollblut genau zu messen, die normalerweise niedrig ist. Tabelle II
Phospholipidbestimmung mit Prothrombinasen, die verschiedene
Menge Faktor Xa und Va enthielten. A: die
Phospholipidkonzentration ist 1 uM; B: die
Phospholipidkonzentration ist 0,1 uM.
Die Ergebnisse von Tabelle II sind in Figur 2 graphisch dargestellt. Man kann schließen, daß sich durch Erhöhen der Konzentration der Faktoren Xa und Va von 0,24 auf 1,2 mM (siehe Figur 2) die Geschwindigkeit de Thrombinbildung etwa zehnfach erhöht, wie zu erwarten ist, da bei niedrigen Enzym (-Komplex) Konzentrationen die Reaktionsgeschwindigkeit linear von der Enzym (-Komplex) Konzentration abhängt. Figur 2 zeigt, daß bei Kohzentrationen oberhalb von 1 nM die Geschwindigkeit der Thrombinbildung abflacht. Dieser Effekt zeigt sich sowohl bei den Phospholipid-Konzentrationen von 1 uM (Figur 2A) wie auch bei 0,1 uM (Figur 2B) Phospholipiden, was wahrscheinlich bedeutet, daß bei diesen Konzentrationen alle Phospholipide in dem Prothrombinase-Komplex gebunden sind, oder daß andere Prozesse geschwindigkeitsbegrenzend werden (Diffusion). Figur 2 zeigt, daß Phospholipidkonzentrationen bis zu 0,01 uM gemessen werden können.

Messen von Prokoagulationsphospholipiden in Blutplättchen.

Um ein Nachweisverfahren zum Bestimmen der Ruheaktivität und/oder Anregbarkeit von Blutplättchen zu entwickeln, kann gezeigt werden, daß das Verfahren mit isolierten Blutplättchen funktioniert. Die Prokoagulationsaktivität von isolierten Blutplättchen kann als die äquivalente molare Menge an Prokoagulationsphospholipiden ausgedrückt werden, da diese negativ geladenen Phospholipide für die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen verantwortlich sind.
Blutplättchen können aus dem Blut von Personen/Patienten durch Gel-Filtration (siehe Lages et al., J. Lab. Clin. Med. 5 (1976), 811-825), oder Zentrifugation (siehe Bevers et al., Biochim. Biophys. Acta 736 (1983), 57-66) isoliert werden. Die Konzentration (Zellen/ml) wird durch Messen ihrer Absorption bei 405 nm bestimmt. Sobald die Plättchen isoliert sind, kann die Prokoagulationsaktivität gemäß dem Verfahren, das vorstehend zum Messen geringer Konzentrationen von Phospholipiden beschrieben wurde, gemessen werden.

a) Die Auswirkung der Blutplättchen-Konzentration.

Die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen als Funktion ihrer Konzentration kann wie folgt gemessen werden: Es werden zwei Reagenzien hergestellt: A und B. Reagens A enthält 240 pM Faktor Va, 240 pM Faktor Xa und 15 mM CaCl&sub2;. Reagens B enthält 6 uM Prothrombin. Bei diesem Experiment ist die Blutplättchen-Konzentration 3,44 x 10&sup8; Zellen/ml.
Das Pipettierschema ist wie folgt: 300 ul Reagens B werden mit 300 ul verdünnten Blutplättchen vermischt. Nach 5 Minuten Präinkubation bei 37 ºC werden 300 ul Reagens A zugegeben. Proben von 100 ul werden nach 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 und 4 Minuten Reaktionszeit genommen, um das gebildete Thrombin zu messen. In die Küvetten werden 800 ul Unterbrechungspuffer (10 mM EDTA), die 100 ul Probe, und um das gebildete Thrombin zu messen, 20 ul S2238 (ein chromogenes Substrat von AB Kabi Diagnostica, Stockholm, Schweden) pipettiert. In Tabelle III wird die Auswirkung der Blutplättchen-Konzentration auf die Thrombinbildung gezeigt.
Zum Vergleich wird die Aktivität mit 1 uM Phospholipiden (25 Mol% Phosphatidylserin, 75 Mol% Phosphatidylcholin) in der zugegebenen Probe angegeben, die gefundenen Hydrolysegeschwindigkeiten sind 375,63 bzw. 705,67 mΔA/Min. nach 1 bzw. 2 Minuten Reaktionszeit.
Fig. 3 zeigt die Auswirkung der Blutplättchen- Konzentration auf die Geschwindigkeit der Thrombinbildung. Fig. 3A zeigt die gefundenen Daten. Die Kurve wurde unter der Annahme gezeichnet, daß die Menge des gebildeten Thrombin eine Gleichung dritten Grades ist. Die abgeleitete Funktion (die Geschwindigkeit der Thrombinbildung zu jedem Zeitpunkt) ist graphisch in Fig. 3A dargestellt. Man beobachtet, daß sich die Geschwindigkeit der Thrombinbildung mit der Zeit erhöht, und daß die Kurvenform für jede Verdünnung gleich ist. Die Geschwindigkeit der Thrombinbildung, die ein Maßstab für die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen ist, ist proportional der Blutplättchen-Konzentration. Dies zeigt an, daß man bei konstanten Blutplättchen-Konzentrationen arbeiten muß (oder darauf korrigieren muß), um die Prokoagulationsaktivität pro Blutplättchen zu messen. Tabelle III
Es werden die Auswirkung der Blutplättchenkonzentration auf die Geschwindigkeit der Thrombinbildung, die ein Maßstab für die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen ist, und die Auswirkung der Sonifikation der Blutplättchen auf die Geschwindigkeit der Thrombinbildung gezeigt.

Aus diesem Grund sollte die gemessene

Prokoagulationsaktivität für die Thrombozytenzahl (Menge an Blutplättchen) korrigiert werden, die auf verschiedene Arten gemessen werden kann.
i) Es wird die optische Dichte bei 405 nm von isolierten Blutplättchen gemessen, die proportional der Blutplättchen-Konzentration ist.
ii) Die Blutplättchen werden in einem Thrombozytenzähler gezählt. Es können sowohl isolierte Blutplättchen wie auch Blutplättchen in Vollblut gezählt werden.
iii) Die Blutplättchen können vollständig durch Behandlung mit Calcium-Ionophor A23187 aktiviert werden, das eine vollständige Randomisierung der Phospholipide (somit auch von Phosphatidyserin) über beide Membrane bewirkt. Da die Phospholipidzusammensetzung praktisch eine Konstante ist, hängt die erreichte Prokoagulationsaktivität nur von der Menge der Blutplättchen ab.

b) Sonifikation der Blutplättchen

In Tabelle III und Figur 4 wird die Auswirkung von Sonifikation der Blutplättchen auf die Prokoagulationsaktivität gezeigt. Wie zu sehen ist, wird eine gewaltige Erhöhung der Aktivität gefunden, die anzeigt, daß das Testsystem ein sehr gutes Werkzeug ist, sogar sehr hohe Prokoagulationsaktivitäten zu messen, und die früher gefundene Daten bestätigt.

c) Wirkung von Thrombin auf Blutplättchen

Die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen wird gemessen wie zuvor, und zwar mit den gleichen Reagenzien wie vorstehend. In diesem Fall werden die Blutplättchen jedoch mit Thrombin präinkubiert. In Tabelle IV wird die Wirkung der Vorbehandlung der Blutplättchen mit Thrombin ünd Thrombin plus CaCl&sub2; gezeigt.
Figur 5 zeigt, daß die Vorbehandlung der Blutplättchen mit 3,3 nM Thrombin eine stimulierende Wirkung auf die Thrombinbildung hat. Wenn Thrombin (3,3 nM) plus CaCl&sub2; (1 mM) vorhanden ist, dann ist diese stimulierende Wirkung etwas größer. Tabelle IV
Die Wirkung von Thrombin und Thrombin plus CaCl&sub2; auf die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen. Die Blutplättchen wurden behandelt, wie in Figur 5 angegeben.
Dies Ergebnis bestätigt früher gefundene Daten, somit ist das entwickelte Nachweisverfahren ein gutes Werkzeug die Anfälligkeit von Blutplättchen gegen Thrombin-induzierte Aktivierung zu messen.

d) Die Wirkung von Thrombin plus Kollagen auf Blutplättchen.

In diesem Experiment wird die Wirkung von Thrombin plus Kollagen auf die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen untersucht. Diese Aktivität wird in der gleichen Art, wie vorstehend beschrieben, gemessen. Als Vergleichsprobe werden 1 uM Phospholipide in dem Nachweisverfahren untersucht. Die gefundenen Hydrolysegeschwindigkeiten waren 390,96 und 741,71 mA/Min. nach 1 bzw. 2 Minuten Reaktionszeit. Die Blutplättchen Konzentration ist 1,62 x 10&sup8; Zellen/ml.
In Tabelle V wurde der Prokoagulationsaktivität für Blutplättchen während des Prothrombinase-Nachweisverfahrens durch regelmäßige Unterprobennahme und der Geschwindigkeit der Thrombinbildung gefolgt. In Tabelle V werden zwei Experimente gezeigt: I) die Auswirkung von Sonifikation der Blutplättchen auf die Thrombinbildung; und II) die Auswirkung von Vorbehandlung von Blutplättchen mit Thrombin, Kollagen und Thrombin plus Kollagen. Tabelle V
Die Wirkung von Sonifikation (die Blutplättchen sind 10fach verdünnt), Thrombin, Kollagen und Thrombin plus Kollagen auf die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen. Eine Vergleichsprobe wird ebenfalls gezeigt.
Diese Experimente bestätigen frühere Ergebnisse und zeigen somit, daß das entwickelte Nachweisverfahren ein gutes Werkzeug ist, die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen zu messen.

e) Inkubation von Blutplättchen mit Thrombin über bestimmte Zeitabschnitte

In diesem Experiment wird die Auswirkung der Behandlung von Blutplättchen mit Thrombin über bestimmte Zeitabschnitte untersucht. Das Testsystem wurde bereits früher beschrieben. Als Vergleichsprobe wurden 1 M Phospholipide untersucht, die eine Hydrolysegeschwindigkeit von 281,86 und 547,38 mA/Min. nach 1 bzw. 2 Minuten ergaben. Die Blutplättchen- Stammkonzentration war 1 x 10&sup8; Zellen/ml.
In diesem Experiment wurden die Blutplättchen mit 4 nM Thrombin über einen bestimmten Zeitabschnitt inkubiert, und ihre Prokoagulationsaktivität wurde nach einer Inkubation von 15, 60 und 180 Minuten gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle VI gezeigt.
Die Ergebnisse sind in Figur 7 graphisch dargestellt. Man kann sehen, daß Blutplättchen, die mit 4 nM Thrombin 15 Minuten inkubiert wurden, mehr Prokoagulationsphospholipide zeigen als die Blutplättchen einer Vergleichsprobe. Die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen steigt langsam nach den ersten 15 Minuten Inkubationszeit an. Dieser Anstieg der Prokoagulationsaktivität nach den ersten 15 Minuten ist nicht auf die Wirkung von Thrombin zurückzuführen, sondern auf eine Alterung der Blutplättchen.
Dies zeigt, daß der Test vorzugsweise an einer frischen Probe durchgeführt werden sollte, wenn eine maximale Unterscheidung erhalten werden soll. Tabelle VI
Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen nach Behandlung mit 4 nM Thrombin über 15, 60 und 180 Minuten.

f) Wirkung des Calcium-Ionophor A23187 auf Blutplättchen

Bei diesem Experiment wurden Blutplättchen mit 1 uM A23187 behandelt (siehe Pressman, Ann Rev. Biochem. 45 (1976), 501-530, für eine Übersicht über Ionophore und der Strukturformel von A23187; das Reagens wurde von CalBiochem- Hoechst, USA, erhalten), und anschließend wurde die Prokoagulationsaktivität gemessen. Es wurde ein Vergleich mit einer Probe sonifizierter, also ultraschallbehandelter und einer Vergleichsprobe von Blutplättchen gemacht. Es wurde das vorstehend beschriebene Verfahren verwendet, die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen zu untersuchen. Die Blutplättchen-Konzentration ist 1,5 x 10&sup8; Zellen/ml.
In Tabelle VII und Figur 8 werden die Auswirkung der Sonifikatiom der Blutplättchen, die Auswirkung der Vorbehandlung der Blutplättchen mit Calcium-Ionophor A23187 (1 uM) und eine Vergleichsprobe gezeigt. Beide Behandlungen bewirken einen gewaltigen Anstieg der Prokoagulationsaktivität. Tabelle VII
Die Prokoagulationsaktivität einer Vergleichsprobe von Blutplättchen, sonifizierter Blutplättchen und Blutplättchen behandelt mit Calcium-Ionophor A23187 (1uM). Die Proben mit den sonifizierten Blutplättchen oder den mit Calcium-Ionophor A23187 behandelten Blutplättchen wurden 50mal verdünnt, bevor sie gemessen wurden.
Aus dem Vorstehenden geht hervor, daß Blutplättchen eine geringe Blutkoagulationsaktivität besitzen, die durch Behandlung mit Thrombin ein wenig erhöht werden kann. Eine Behandlung mit Thrombin plus Kollagen erhöht diese Aktivität stärker. Durch Inkubation der Blutplättchen mit dem Calcium-Ionophor A23187 wird eine gewaltige Prokoagulationsaktivität freigesetzt, die vergleichbar der Aktivität ist, die durch die Sonifikation der Blutplättchen freigesetzt wird.
Wie nachstehend genauer besprochen wird, stellt dies die Basis für die Entwicklung von Nachweisverfahren zur Bestimmung der Ruheaktivität und/oder Anregbarkeit von Blutplättchen zur Verfügung, und es ermöglicht auch die Untersuchung von Arzneimitteln, die zum Beispiel die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen beeinträchtigen oder sie verhindern, indem sie den Flip-Flop-Mechanismus in der Blutplättchen-Membran inhibieren.

Verfahren zum Bestimmen der Ruheaktivität von Blutplättchen

Es wird angenommen, daß die Ruheaktivität von Blutplättchen ein Indikator für die Tendenz zur Thrombusbildung ist. Je höher die Prokoagulationsaktivität von ruhenden Blutplättchen ist, desto geringer ist der Schwellenwert, bei dem ein aktivierter Blutgerinnungsfaktor eine Blutgerinnung bewirkt.
Im allgemeinen kann das Nachweisverfahren durch sorgfältiges Sammeln von Blut durchgeführt werden, um eine Blutplättchenaktivierung über Citrat, oder Citrat plus zusätzlichen Verbindungen, zu vermeiden und um die Blutplättchen in einem nicht aktivierten Zustand zu halten. Das Blut wird ausreichend in Salzlösung verdünnt, um eine Störung des Nachweisverfahrens durch die Anwesenheit von Erythrozyten zu verhindern. Das verdünnte Blut wird mit einer Verbindung (Substrat) vermischt, die durch ein Prokoagulationsphospholipid abhängiges Enzym oder einen derartigen Enzymkomplex umgewandelt werden kann. Beispiele für das Substrat sind Prothrombin und Faktor X, die in Konzentrationen von 0,1 - 6 M bzw. 0,05 - 3 M verwendet werden können. Beispiele für von Phospholipid abhängigen Enzym-Komplexen sind der Faktor X- Aktivierungskomplex und Prothrombinase. Die Komponenten des Faktor x-Aktivierungskomplexes sind Faktor IXa (1 - 200 nM) und Faktor VIIIa (0,1 - 10 nM), und die Faktoren der Prothrombinase sind Faktor Xa (0,1 - 5 nM) und Faktor Va (0,1 - 10 nM). Dann wird der Enzym-Komplex zugegeben und nach einer Reaktionszeit von 0,5 - 4 Minuten wird die weitere Aktivierung des Substrats durch Zugabe eines Inhibitors für das Enzym gestoppt, zum Beispiel EDTA, Citrat oder eine andere Verbindung, die das zweiwertige Kation komplexiert, von dem das Enzym abhängt. Um eine Störung der Messung zu vermeiden, sollten die Erythrozyten entfernt werden. Dies kann durch Zentrifugation oder Lysis der Zellen erreicht werden, indem das Reaktionsgemisch mit Ammoniumbicarbonat vermischt wird.
Das gebildete aktivierte Substrat ist ein Maßstab für die Prokoagulationsaktivität des Blutes (der Blutplättchen) gemessen. Das aktivierte Substrat kann aufgrund seiner Fähigkeit gemessen werden, ein chromogenes Substrat zu hydrolysieren. Zum Beispiel kann aktiviertes Prothrombin (Thrombin) aufgrund seiner Fähigkeit gemessen werden, S2238 zu hydrolysieren, und der aktivierte Faktor X (Faktor Xa) aufgrund seiner Fähigkeit, S2337, S2222 oder CH3OCO-D-CHG-Gly-Arg-pNA- Acetat zu hydrolysieren.
Ein bevorzugtes Schema zum Messen der Prokoagulationsaktivität von ruhenden Blutplättchen ist wie folgt: Es werden drei Reagenzien benötigt. Reagens 1 enthält 6 M Prothrombin; Reagens 2 enthält 1,2 nM Faktor Xa, 1,2 nM Faktor Va, 15 mM CaCl&sub2;; und Reagens 3 enthält 10 mM EDTA (pH-Wert 8,0).
- Das Blut wird sorgfältig auf ACD (183 mM Glucose, 80 mM Trinatriumcitrat, 52 mM Citronensäure) gesammelt, um eine Blutplättchenaktivierung zu verhindern; d.h. fünf Teile Blut werden mit einem Teil ACD vermischt. Glucose ist vorhanden, um die Blutplättchen in nativer, nicht aktivierter Form zu halten.
- Die Blutplättchen werden durch Gel-Filtration (siehe Lages et al., J. Lab. Clin. Med. 85 (1975), 811-825), oder Zentrifugation (siehe Bevers et al., Biochim. Biophys. Acta 736 (1983), 57-66) isoliert.
- Das weitere Verfahren wird bei konstanter Temperatur durchgeführt, zum Beispiel bei 37 ºC. Zu 150 l Blutplättchen werden 150 l Reagens 1 gegeben, und das Gemisch wird über 5 Minuten inkubiert.
- Dann werden 150 l Reagens 2 zugegeben, um die Prothrombinase einzuleiten.
- Nach 1, 2, 3 und 4 Minuten werden Proben von 100 l genommen und mit 500 l Reagens 3 in einer Küvette vermischt, um die Prothrombinaktivierung sofort abzubrechen.
- Die Küvette wird in ein thermostabiles Spektrophotometer (zum Beispiel bei 37 ºC) gegeben, und Thrombin wird durch Zugabe von 20 l S2238 gemessen, und der Absorptionsanstieg wird bei 405 nm verfolgt.
Durch Messen von Blutplättchen, die aus dem Blut einer Gruppe gesunder Personen isoliert wurden, wird ein Satz von Werten erhalten. Durch Berechnung der mittleren und der Standardabweichung dieser Werte können die Grenzen bestimmt werden, in die die nörmale Blutplättchen-Ruheaktivität fällt. Verfahren zum Bestimmen der Anregbarkeit von Blutplättchen.
Es wird auch angenommen, daß die Anregbarkeit von Blutplättchen ein Indikator für die Tendenz zur Thrombusbildung ist. Wenn aus dem einen oder anderen Grund die Thrombinkonzentration im Blut ansteigt, könnte eine gefährliche Situation vorhanden sein, insbesondere wenn die Blutplättchen eine erhöhte Anregbarkeit haben. In diesem Fall aktiviert eine niedrige Konzentration an Thrombin die Blutplättchen, wohingegen normale Blutplättchen im allgemeinen nicht aktiviert worden wären.
Im allgemeinen ist das Nachweisverfahren ähnlich dem vorstehend beschriebenen für das Verfahren zum Bestimmen der Ruheaktivität von Blutplättchen. Es wird jedoch ein zusätzlicher Schritt benötigt. Die Blutplättchen werden mit Thrombin, oder Thrombin plus Kollagen, die natürliche Aktivatoren für Blutplättchen sind, inkubiert. Durch die Zugabe von Thrombin, oder Thrombin plus Kollagen, zu dem Substrat und Inkubieren der Blutplättchen mit dieser Lösung kann das gleiche erreicht werden, es wird jedoch eine Verringerung des Pipettierschrittes erreicht.
Ein bevorzugtes Verfahren, die Anregbarkeit von Blutplättchen zu bestimmen, sieht folgendermaßen aus:
- Die Blutplättchen werden wie vorstehend beschrieben isoliert.
- Die Blutplättchen werden 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 4 nM Thrombin, oder 4 nM Thrombin plus Kollagen (1 g/ml) inkubiert.
- Dann wird das vorstehend beschriebene Verfahren weitergeführt.
Um die normale Anregbarkeit von Blutplättchen zu bestimmen, wird Blut von einer Gruppe gesunder Personen gesammelt, die Blutplättchen werden isoliert, und die Anregbarkeit der Blutplättchen wird bestimmt. Dann wird ein Satz von Werten erhalten, die als Normalwerte betrachtet werden können. Aus den Werten kann die Normalstatistik berechnet werden, die verwendet werden kann, um zu entscheiden, ob die Blutplättchen einer Einzelperson eine höhere Anregbarkeit haben als normale Blutplättchen.

Verfahren zum Untersuchen von Arzneimitteln, die den Flip-Flop-Mechanismus inhibieren.

Um Arzneimittel auf ihre Fähigkeit zu untersuchen,die Blutplättchenaktivierung (Flip-Flop) zu inhibieren, kann dieser Test verwendet werden. Solch ein Arzneimittel kann ein nützliches Medikament sein, Patienten mit Thrombusbildung zu behandeln, oder eine gute Prophylaxe für Personen mit der Tendenz zu Thrombusbildung.
Das allgemeine Verfahren, Arzneimittel nachzuweisen, sieht folgendermaßen aus. Die Blutplättchen werden wie vorstehend angegeben isoliert. Es wird ein Gemisch des Arzneimittels und Thrombin, oder Thrombin plus Kollagen, hergestellt. Die Blutplättchen werden mit diesem Gemisch unter standardisierten Bedingungen inkubiert, und dann wird die Anregbarkeit der Blutplättchen gemessen wie vorstehend beschrieben. Die notwendigen Vergleichsproben sind eine Inkubierung der Blutplättchen in Anwesenheit des Arzneimittels und ein Experiment mit Phospholipid-Vesikeln bekannter Zusammensetzung bei Anwesenheit und Abwesenheit des Arzneimittels. Der letzere Vergleich ist notwendig, um den Effekt des Arzneimittels auf den Nachweis selbst zu berücksichtigen.
Ein bevorzugtes Schema, Arzneimittel zu untersuchen, die den Flip-Flop inhibieren, basiert auf dem Verfahren, die Anregbarkeit von Blutplättchen zu bestimmen.
- Es wird dem bevorzugten Verfahren gefolgt, das bei dem Verfahren zum Bestimmen der Anregbarkeit von Blutplättchen beschrieben wurde.
- Ein zusätzlicher Schritt wird eingeschlossen. Das Arzneimittel wird mit dem Thrombin, oder Thrombin plus Kollagen, vermischt. Dann wird das Verfahren fortgesetzt wie beschrieben.
- Notwendige Vergleiche sind:
i) Ein Experiment in Abwesenheit des Arzneimittels.
ii) Eine Untersuchung des Arzneimittels mit dem Nachweis selbst. Es werden Vesikel mit einer hohen Prokoagulationsaktivität hergestellt, und die Prothrombinaktivierung wird bei einigen Phospholipidkonzentrationen (0 bis 0,4 M) in Abwesenheit und bei Anwesenheit des Arzneimittels gemessen. Wenn das Arzneimittel eine Auswirkung auf den Nachweis hat, kann eine Korrektur durchgeführt werden, um diesen Effekt zu berücksichtigen.

Verfahren zum Bestimmen der Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen in Vollblut.

Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen der Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen in Vollblut zur Verfügung gestellt. Wie vorstehend besprochen, obwohl die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen durch ein einfaches Nachweisverfahren gemessen werden kann, erfordert die Isolierung der Blutplättchen 1 bis 2 Stunden und ist somit nicht ideal für eine klinische Anwendung. Aus diesem Grund wird das Bestimmen der Prokoagulationsaktivität von Vollblut bevorzugt. Dadurch, daß ein einfaches Nachweisverfahren zum Messen der Blutplättchenaktivität in Vollblut direkt verfügbar ist, kann in der Klinik ein Routineverfahren verwendet werden, um schnell eine große Anzahl von Proben zu untersuchen.
Im allgemeinen wird Blut von einem Freiwilligen/einer Person genommen und mit Prothrombin vermischt. Nach Inkubation bei einer geeigneten Temperatur (z.B. 37 ºC) wird die Reaktion durch Vermischen von Vollblut und Prothrombin mit, zum Beispiel Faktor Va, Faktor Xa und CaCl&sub2;, eingeleitet. Proben werden bei vorbestimmten Inkrementen genommen und in ein Röhrchen mit Unterbrechungspuffer gegeben. Die roten Zellen werden danach zentrifugiert und entfernt, da rote Blutzellen nicht zur gemessenen Aktivität beitragen, sie die Thrombinbestimmung stören. Der Flüssigkeitsüberstand wird dann entfernt und in Küvetten gegeben. Das gebildete Thrombin wird nach der Zugabe eines chromogenen Substrats gemessen.
In einer anderen Ausführungsform, anstelle die roten Blutzellen vor der Thrombinbestimmung zu entfernen, können sie lysiert werden, wie in den nachstehenden Beispielen genauer beschrieben wird. Wenn jedoch die Zellen-Lysis-Methode verwendet wird, ist es notwendig, das Vollblut zu verdünnen, um sicherzustellen, daß die Lysis vollständig ist. Die Verdünnungsmenge hängt von der Größe der Probe ab, die zu dem Unterbrechungspuffer gegeben wird. Im allgemeinen sollte Vollblut wenigstens 16mal verdünnt werden, und am stärksten bevorzugt wenigstens 20mal. In Fällen, in denen die Flip-Flop- Reaktion vollständig ist (zum Beispiel bei Behandlung mit dem Calcium-Ionophor A23187), kann eine höhere Verdünnung (bis zu 200mal) notwendig sein.
Das Nachfolgende ist ein bevorzugtes Schema, das verwendet werden kann, um die Prokoagulationsaktivität von Vollblut zu messen. Es werden drei Reagenzien benötigt. Reagens 1 enthält 6 M Prothrombin; Reagens 2 enthält 1,2 nM Faktor Xa, 1,2 nM Faktor Va, 15 mM CaCl&sub2;; und Reagens 3, das entweder 10 mM EDTA (pH-Wert 8,0) (3A) oder 10 mM EDTA (pH-Wert 8,0) plus 100 mM Ammoniumbicarbonat (3B) enthält.
- Das Blut wird über ACD (183 mM Glucose, 80 mM Trinatriumcitrat, 52 mM Citronensäure) gesammelt; d.h. fünf Teile Blut werden mit einem Teil ACD vermischt. Glucose ist vorhanden, um eine Blutplättchenaktivierung zu verhindern.
- Das Blut wird 20mal in isotonischer Salzlösung verdünnt.
- Das verdünnte Blut wird, zum Beispiel, mit Thrombin plus Kollagen oder einem Arzneimittel inkubiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Das weitere Verfahren wird bei konstanter Temperatur durchgeführt, zum Beispiel bei 37 ºC. Zu 150 l, verdünnt mit Blut, werden 150 l gegeben, und das Gemisch wird 5 Minuten inkubiert.
- Dann werden 150 l Reagens 2 zugegeben, um die Prothrombinase einzuleiten.
Nach 1, 2, 3 und 4 Minuten werden Proben von 100 l genommen und mit 500 l Reagens 3 vermischt, um die Prothrombinaktivierung sofort abzubrechen.
- Wenn Reagens 3A verwendet wird, werden die Erythrozyten durch Zentrifugation entfernt; aber bei Verwendung von Reagens 3B ist nur eine 2minütige Inkubationszeit notwendig, um eine vollständige Lysis der Erythrozyten zu erhalten.
- Das Gemisch wird in eine Küvette überführt, in ein thermostabiles Spektrophotometer gegeben (zum Beispiel bei 37 ºC), und Thrombin wird durch Zugabe von 20 l S2238 gemessen, und der Absorptionsanstieg bei 405 nm wird verfolgt.
Wie vorstehend beschrieben kann die Prokoagulationsaktivität ruhender Blutplättchen und die Anregbarkeit von Blutplättchen in Blutproben bestimmt werden, die von einer Gruppe gesunder Personen erhalten wurden. Der Satz von Werten, der mit diesen Tests erhalten wird, kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Einzelperson eine Prokoagulationsaktivität ruhender Blutplättchen, oder eine Anregbarkeit von Blutplättchen hat, die von den Normwerten abweicht. Korrekturen für die Blutplättchenzahl können gemacht werden, entweder indem die Blutplättchen in einem Zähler gezählt werden, oder indem die Prokoagulationsaktivität nach der Behandlung mit Calcium-Ionophor A23187 gemessen wird, das ein Maß für die Blutplättchenzahl ist.
Es ist auch möglich, Arzneimittel auf ihre inhibierende Wirkung auf den Flip-Flop-Mechanismus zu untersuchen. In dem Fall sollten Blutproben von einer Gruppe gesunder Freiwilliger erhalten werden, und die Wirkung des Arzneimittels auf die Anregbarkeit der Blutplättchen wird bestimmt.
Die Erfindung wird genauer in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.

BEISPIEL I

Bestimmung der Ruheaktivität von Blutplättchen.

Fünf Teile Blut werden mit 1 Teil 183 mM Glucose, 80 mM Trinatriumcitrat und 52 mM Citronensäure vermischt. Es werden drei Reagenzien hergestellt: Regens B enthält 6 M Prothrombin; Regens A enthält 1,2 nM Faktor Xa, 1,2 nM Faktor Va und 15 mM CaCl&sub2;; und Reagens 3 enthält 10 uM EDTA (pH-Wert 8,0) plus 100 uM Ammoniumbicarbonat. Das Blut wird 20mal in isotonischer Salzlösung verdünnt. Dann werden 100 l verdünntes Blut mit 100 l Reagens B vermischt und 5 Minuten bei 37 ºC inkubiert. Zu diesem Gemisch werden 100 l Reagens A gegeben, die Lösung wird gut gemischt und nach 0,75 oder 1,5 Min. wird eine Probe von 250 l in eine Küvette mit 500 l Reagens 3 gegeben. Nach 2 Minuten, um eine vollständige Lysis der Erythrozyten zu ermöglichen, werden schließlich 50 l S2238 zugegeben, um das gebildete Thrombin zu messen, das die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen wiedergibt.
Bei klinischen Anwendungen ist es wichtig, daß nur wenige Pipettierschritte notwendig sind und daß somit große Gruppen von Personen in einem einfachen Test untersucht werden können.
Durch Bestimmen der Prokoagulationsaktivität einer Gruppe von Vergleichspersonen und einer Gruppe von Patienten mit nachgewiesener Tendenz zur Thrombusbildung, kann man einen Schwellenwert der Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen bestimmen, der eine erhöhte Tendenz zur Thrombusbildung zu erkennen gibt. Wenn zum Beispiel eine Gruppe von Vergleichspersonen eine durchschnittliche Blutplättchen- Prokoagulationsaktivität von 5,52 mA/Min. hatte, dann hatte eine Gruppe von Patienten, die einer Bypass-Operation unterzogen worden waren, eine durchschnittliche Blutplättchen- Prokoagulationsaktivität von 9,38 mA/Min..

BEISPIEL II

Bestimmung der Anregbarkeit von Blutplättchen.

Es wurde dem gleichen Verfahren wie in Beispiel I gefolgt. Zu Reagens B wurden jedoch, zum Beispiel, 4 nM Thrombin und 1 g/ml Kollagen gegeben.
Durch die Anwesenheit dieser natürlichen Blutplättchen- Aktivatoren, Thrombin plus Kollagen, erfolgt eine begrenzte Erhöhung der Prokoagulationsaktivität (Anregbarkeit). Diese Teilaktivierung der Blutplättchen ist von einer Personengruppe zur anderen unterschiedlich. Es wird angenommen, daß, im Hinblick auf eine Vergleichsgruppe, eine hohe Anregbarkeit der Blutplättchen das Risiko einer Thrombusbildung erhöht.

BEISPIEL III

Verfahren zur Untersuchung von Arzneimitteln, die die Flip-Flop-Reaktion inhibieren.

Es kann wieder dem gleichen Verfahren wie in Beispiel I gefolgt werden, um die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen zu messen. Die Wirkung von Arzneimitteln auf Blutplättchen-Prokoagulationsaktivität kann durch Zugabe des Arzneimittels zu Vollblut, zu verdünntem Blut oder zu Reagens 1, unter Befolgung des gleichen Inkubationsschemas für jedes Arzneimittel untersucht werden.
Das Blut wird zum Beispiel 20mal in isotonischer Salzlösung verdünnt, zu der 1 g/ml Aspirin gegeben wird. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 37 ºC inkubiert. Dann wird dem Verfahren von Beispiel II gefolgt. Auf diese Art ist es möglich die Wirkung von Aspirin auf die Anregbarkeit von Blutplättchen durch Thrombin plus Kollagen zu untersuchen. Wenn die Anregbarkeit der Blutplättchen zum Beispiel um mehr als 50% verringert wird, dann kann man schließen, daß das Versuchsarzneimittel die Flip-Flop-Reaktion inhibiert oder anderweitig beeinträchtigt.

BEISPIEL IV

Messung der Blutplättchenaktivität in Vollblut.

In einem ersten Versuch wurden die Reagenzien A und B wie folgt hergestellt: Reagens A enthielt 240 uM Faktor Va, 240 pM Faktor Xa und 15 mM CaCl&sub2;. Reagens B enthielt 6 M Prothrombin. Die Versuchsanordnung war folgendermaßen: das Vollblut wurde mit Reagens B vermischt, und die Reaktion wurde mit Reagens A eingeleitet, und dann wurde die Prothrombinaseaktivität gemessen. Das Blut wurde verdünnt, wie in Tabelle VIII angegeben. Das Pipettierschema war folgendermaßen: 300 l Reagens B wurden mit 300 l verdünntem Vollblut vermischt. Nach 5 Minuten Präinkubation bei 37 ºC wurden 300 l Reagens A zugegeben. Es wurden Proben von 100 l nach 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 und 4 Min. Reaktionszeit genommen und dann in Reagenzgläser mit 900 l Unterbrechungspuffer (10 mM EDTA) gegeben. Die roten Zellen wurden zentrifugiert (Eppendorf), und es wurden 900 l des Flüssigkeitsüberstandes in die Küvetten gegeben. Das gebildete Thrombin wurde durch Zugabe von 18 l S2238 gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle VIII gezeigt.
Da sich in den Fällen mit der geringsten Verdünnung ein Gerinnsel gebildet hatte, wurden 0,5 mM Gly-Pro-Arg-Pro zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und das Blut wurde wie vorstehend untersucht. Tabelle VIII
Tabelle VIII zeigt, daß das Signal nicht linear mit der Menge an zugegebenem Blut ist. Es war nicht möglich, den Zentrifugationsschritt zu vermeiden, um die roten Zellen zu entfernen, da diese Zellen die Messung störten.
Weitere Tests wurden folgendermaßen durchgeführt. Zu 270 l Vollblut wurden 30 l Gly-Pro-Arg-Pro (10 mM) gegeben, und die Prokoagulationsaktivität wurde wie vorstehend gemessen (Vergleich). Es wurde auch die Wirkung der Zugabe von Calcium- Ionophor A23187 zu dem Blut untersucht. Es wurde das nachfolgende Gemisch hergestellt: 30 l Vollblut, 267 l Standardpuffer, 3 l A23187 (100 uM), und diese Lösung wurde nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wie vorstehend beschrieben untersucht (siehe Tabelle IX). Tabelle IX
Wie aus dem Vorstehenden zu sehen ist, erhöht Calcium-Ionophor A23187 die Aktivität gewaltig. Diese Aktivität wird durch die Gesamtmenge der Blutplättchen bestimmt, da durch das Ionophor ein vollständiger Flip-Flop aller vorhandenen Phospholipide induziert wird und die Aktivität durch die Gesamtmenge an Phospholipiden und der Prozentanteil Phosphatidylserin in der Phospholipidmembran bestimmt wird. Phosphatidylserin ist in den Zellen in konstanter Menge vorhanden, so daß die maximale Prokoagulationsaktivität nur von der Gesamtmenge an Phospholipiden abhängt. Somit kann die durch A23187 induzierte Aktivität als Blutplättchenzahl verwendet werden, und es können Korrekturen gemacht werden, um Änderungen in der Blutplättchenkonzentration zu berücksichtigen.

BEISPIEL V

Um eine einfachere Methode zu entwickeln, die Prokoagulationsaktivität von Vollblut zu bestimmen, wurde ein Unterbrechungspuffer aus Ammoniumbicarbonat plus EDTA verwendet. Rote Blutzellen lysieren in Ammoniumbicarbonat, da dies Salz in Wasser nicht vollständig ionisiert ist. In der wässrigen Lösung sind die kleinen, ungeladenen Moleküle NH&sub3; und CO&sub2; vorhanden, die durch die Membran der Erythrozyten hindurchtreten. In der Zelle reagieren diese Moleküle mit Wasser, und es werden wieder Ionen gebildet, und so erhöht sich die Ionenstärke in der Zelle. Um die erhöhte Ionenstärke auszugleichen, diffundiert Wasser in die Zelle, und schließlich lysiert die Zelle. Dadurch, daß sie in eine Unterprobe von Ammoniumbicarbonat gegeben werden, lysieren die Erythrozyten und stören nicht die chromogenen Messungen.
Zuerst wurde bestimmt, wie sich eine Veränderung des Puffers auf die Hydrolysegeschwindigkeit von S2238 durch Thrombin auswirkt. Tabelle X zeigt, daß dies der Fall ist. Tabelle X
Die Hydrolysegeschwindigkeit von S2238 durch Thrombin in entweder 175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH-Wert 7,9) (= Standard-Unterbrechungspuffer), oder 100 mM Ammoniumbicarbonat, 10 mM EDTA (pH-Wert 8,0) (= Lysis- Unterbrechungspuffer). In die Küvette wurden 100 l Thrombin (8 nM), S2238 wie angegeben und die Puffer auf ein Endvolumen von 1 ml pipettiert.
Die in Tabelle XI gezeigten Experimente wurden auf zwei Arten durchgeführt, d.h. Beendigung der Reaktion entweder durch Eingeben einer Unterprobe in Standard-Unterbrechungspuffer oder durch Eingeben einer Unterprobe in Ammoniumbicarbonat plus EDTA. Im Falle des Eingebens einer Unterprobe in den Standard- Unterbrechungspuffer wurden die Erythrozyten zentrifugiert, und es wurde die Thrombinbildung im Flüssigkeitsüberstand gemessen. Im Falle des Ammoniumbicarbonat-Puffers wurde der Zentrifugierschritt weggelassen. Tabelle XI
Messen von Prokoagulationsphospholipiden in Vollblut. Das Blut wurde in 3,8% Natriumcitrat (1 Teil Citrat, neun Teile Blut) gesammelt. Das Blut wurde entweder in 175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH-Wert 7,9), oder 100 mM Ammoniumbicarbonat, 10 mM EDTA (pH-Wert 8,0) gegeben. Im Falle des Eingebens in Standard-Unterbrechungspuffer wurden die roten Zellen zentrifugiert, und Thrombin wurde im Flüssigkeitsüberstand gemessen. Im zweiten Fall wurde der Zentrifugierschritt weggelassen.
Um die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens zu erhöhen, wurden Reagenzien mit größeren Mengen Faktor Xa und Faktor Va hergestellt (siehe Abschnitt "Messung geringer Konzentrationen von Phospholipiden") . Aus dem Grund wurden die Reagenzien A mit 1,2 nM Faktor Xa, 1,2 nM Faktor Va und 15 mM CaCl&sub2; hergestellt. Reagens B wurde mit 6 M Prothrombin verwendet. Diese Reagenzien wurden in den nachfolgenden Experimenten, Beispiele VI bis IX, verwendet.

BEISPIEL VI

Untersuchung von Blutplättchen in Vollblut nach dem vereinfachten Verfahren.

Das nachstehend beschriebene Experiment zeigt, daß die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen in Vollblut auf eine einfache Art gemessen werden kann, die für die klinische Anwendung besser geeignet ist, da nur zwei zeitabhängige Pipettierschritte erforderlich sind. Durch die Verwendung von Vollblut vermeidet man das Isolierverfahren der Blutplättchen, das zeitaufwendig ist und darüber hinaus das Risiko der Blutplättchenaktivierung erhöht. Es sollte darauf geachtet werden, daß eine Aktivierung des Blutes vermieden wird. Dann wird ein Teil des mit Salzlösung verdünnten Blutes mit einem Teil Prothrombin (Reagens B) vermischt. Nach einer Inkubation von einigen Minuten bei, zum Beispiel 37 ºC, wird ein Teil Reagens A zugegeben, und nach einer vorgegebenen Reaktionszeit werden die Proben mit Lysis-Unterbrechungspuffer vermischt. Das gebildete Thrombin wird durch Zugabe eines chromogenen Thrombin-Substrats, nachdem eine ausreichenden Zeit zur vollständigen Lysis der Erythrozyten zugelassen worden war, gemessen.
Ein bevorzugtes Schema zur Bestimmung von Prokoagulationsaktivität von Vollblut ist das nachfolgende Beispiel. Blut wird 20mal in Salzlösung verdünnt. Alle Reagenzien werden 5 Minuten bei 37 ºC präinkubiert, um sicher zu sein, daß die Reaktionstemperatur genau 37 ºC ist. Zu 150 l verdünntem Blut werden 150 l Reagens B gegeben, dann werden 150 l Reagens A zugegeben, um die Reaktion einzuleiten. Es werden Proben von 100 l nach 1, 2, 3 und 4 Min. Reaktionszeit genommen und mit 500 l 100 mM Ammoniumbicarbonat, 10 mM EDTA (pH-Wert 8,0) vermischt. Das gebildete Thrombin wird nach 2 Minuten durch Zugabe von 20 l 82238 gemessen.
In einem Experiment wurde Blut von gesunden Personen vor und nach physischer Belastung genommen. Bei den Personen 1 bis 5 wurde das Blut über Citrat gesammelt, während in den Fällen 6 bis 8 das Blut über ACD (Citrat, Citronensäure, Glucose) gesammelt wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle XII gezeigt.
In Fig. 1 bis 8 sind die Ergebnisse der Blutproben (Personen 1 bis 8, entsprechend), die vor und nach physischer Belastung genommen wurden, graphisch dargestellt.
Es ist zu erkennen, daß die Auswirkung der physischen Belastung in fast allen Fällen gleich ist. In allen Fällen außer einem (Person 4) war die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen nach der Belastung höher. Der Grund, warum die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen nach der Belastung höher ist, ist nicht klar.
Es ist auch zu bemerken, daß die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen in Blut, das auf ACD gesammelt wurde, etwas niedriger ist als in den anderen Fällen. Dieser Effekt ist jedoch nicht sehr ausgeprägt. Die Wirkung von ACD ist nach ein paar Stunden (nicht gezeigt) sehr gut zu bemerken. Wenn in der Blutprobe keine Glucose vorhanden ist, aktivieren die Blutplättchen sich in ein paar Stunden (siehe Tabelle XI), bei Anwesenheit von Glucose dagegen behalten die Blutplättchen ihre niedrige Prokoagulationsaktivität währen dieser Zeit. Aus dem Grund ist es notwendig, Blut zu messen, das keine Glucose enthält, die innerhalb etwa einer Stunde zugegeben wurde, da nach einer langen Inkubationszeit die Blutplättchen mehr oder weniger aktiviert sind, und somit Aktivitäten gemessen werden, die oberhalb des "wirklichen" Wertes des(der) Patienten/Person liegen. Eine falsche positive Indikation für das Risiko einer Thrombusbildung wäre das Ergebnis. Tabelle XII
Messung von Prokoagulationsphospholipiden in Vollblut. Es wurde ein vereinfachtes Verfahren verwendet (siehe Text).

BEISPIEL VII

Untersuchung von Blutplättchen von "Thrombose"-Patienten

Der vereinfachte Blutplättchen-Test, der den Ammoniumbicarbonat-Unterbrechungspuffer verwendet, wurde verwendet, um die Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen in Vollblut von Patienten zu messen, die mit Sintromitis behandelt worden waren, um teilweise die Synthese von Vitamin K abhängigen Blutgerinnungsfaktoren zu inhibieren. Durch Verringerung von Vitamin K abhängigen Blutgerinnungsfaktoren in Blut wird teilweise die Blutkoagulation inhibiert und somit, zum Beispiel, das Risiko einer Thrombusbildung verringert. Der Gehalt der Vitamin K abhängigen Blutgerinnungsfaktoren wurde regelmäßig vom Thrombosis Service des Academic Hospital von Maastricht gemessen. Das Blut wurde auf ACD gesammelt, um die Blutplättchen so nativ wie möglich zu halten. In Tabelle XIII werden die Ergebnisse gezeigt.
In den Figuren 17 bis 18 sind die Ergebnisse graphisch aufgetragen (Patienten 1 und 2 bis 9, entsprechend) . In einem Fall (Fig. 17) wurde die Messung nach 4 Stunden wiederholt, um die Stabilität der Blutplättchen zu testen. Es ist zu erkennen, daß die Prokoagulationsaktivität nach 4 Stunden etwas erhöht war, trotz der Anwesenheit von Glucose in der Probe. Dies wird in Fig. 17 gezeigt:
In Fig. 18 haben wir die Ergebnisse der Patienten 2 bis 8 graphisch aufgetragen. Es ist zu bemerken, daß die Form der Kurve etwas anders ist als in den Fällen früherer Ergebnisse. Die Geschwindigkeit der Thrombinbildung ist bis zu 2 Minuten linear und steigt dann stark an. Ob dies auf die Behandlung, das Alter oder die Krankheit der Patienten zurückzuführen ist, ist nicht klar. Es ist auch zu bemerken, daß die Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen in fast allen Fällen höher war als die der Blutplättchen von gesunden Freiwilligen (Vergleich).
Tabelle XIII zeigt, daß in allen Fällen die Blutplättchen der "Patienten" eine höhere Prokoagulationsaktivität hatten als die Vergleichs- Blutplättchen. Es wird angenommen, daß diese Ergebnisse ein starker Hinweis darauf sind, daß die Prokoagulations- Ruheaktivität von Patienten-Blutplättchen höher ist als die Prokoagulations-Ruheaktivität von Vergleichs-Blutplättchen. Um nachzuweisen, daß eine erhöhte Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen ein Hinweis für das Risiko einer Thrombusbildung ist, ist es vorzuziehen, diese Aktivität in einer wohl definierten großen Gruppe zu bestimmen.
Um statistisch signifikante Unterschiede zwischen Patientengruppen zu haben, wird es auch bevorzugt, daß sich die Konfidenzintervalle nicht überlappen. Dies wird eher der Fall sein, wenn die Differenzen größer sind. Je kleiner die Differenz, desto größer sollte die Gruppe sein, um statistisch signifikante Unterschiede nachzuweisen.
Tabelle XIII zeigt, sofern Rückschlüsse aus solch einer kleinen Gruppe von Versuchspersonen gezogen werden können, daß Patienten mit einem nachgewiesenen Risiko einer Thrombusbildung eine höhere Prokoagulationsaktivität ruhender Blutplättchen haben als Vergleichs-Versuchspersonen. Tabelle XIII
Messen von Prokoagulationsphospholipiden in Vollblut von Patienten des Thrombosis Service.

BEISPIEL VIII

Blut wird 20mal in Salzlösung verdünnt. Dann werden 50 l verdünntes Blut mit 50 l Prothrombin (6 M) vermischt. Nach einer kurzen Präinkubationszeit, um das Gemisch aufzuwärmen, werden 50 l Aktivierungsgemisch zugegeben (t = 0). Das Aktivierungsgemisch enthält 1,2 mM Faktor Va, 1,2 mM Faktor Xa und 15 bis 30 mM CaCl&sub2; Nach 1 bis 4 Minuten werden 500 l Unterbrechungspuffer zugegeben (100 mM Ammoniumbicarbonat, 10 mM EDTA). Dann wird nach etwa 1 bis 2 Minuten ein chromogenes Substrat zugegeben, um das gebildete Thrombin zu messen.
Mögliche Anpassungen sind: Zugabe von Protamin, das das Nachweisverfahren unempfindlich gegen Heparin macht.
Der Unterbrechungspuffer enthält Ammoniumbicarbonat, das notwendig ist, um die Erythrozyten zu lysieren. Es ist möglich, das chromogene Substrat zu dem Unterbrechungspuffer zu geben und den Schritt des Entnehmens einer Unterprobe zu vermeiden. Es dauert jedoch eine kurze Zeit, die Erythrozyten zu lysieren, und da diese Zellen die Messung stören, kann die Thrombinbildung nicht vor 1 bis 2 Minuten nach der Unterbrechung der Reaktion gemessen werden. Deshalb sollte ein großer Überschuß des chromogenen Substrats vorhanden sein, da andererseits das Substrat erschöpft ist, bevor man das gebildete Thrombin messen kann. Man kann dies Problem vermeiden, indem man Blutplättchen-reiches Plasma verwendet.
Eine mögliche Art, die Menge an Blutplättchen zu standardisieren, ist es, mit dem Calcium-Ionophor A23187 zu präinkubieren, das eine vollständige Randomisierung des Phosphatidylserin über beide Membranschichten bewirkt, und es wird die maximale Menge an Prokoagulationsphospholipiden freigelegt. Um in diesem Fall die Aktivität zu messen, sollte die Probe wenigstens etwa 100mal verdünnt sein.
Es werden die Prokoagulationsaktivitäten von Vollblut von gesunden Versuchspersonen, von Personen, die physischen Belastungen unterworfen waren und von Patienten, die mit Sintromitis behandelt wurden, gezeigt. Die Ergebnisse werden in Tabelle XIV zusammengefaßt. Es ist wichtig, daß das Blut sorgfältig gesammelt wird, um eine Aktivierung der Blutplättchen zu vermeiden. Es ist auch notwendig, die Aktivität innerhalb einer Stunde zu messen, da anderenfalls die Blutplättchen aktiviert werden. Nur wenn man das Blut in ACD (Natriumcitrat, Citronensäure, Glucose) sammelt, sind die Blutplättchen stabiler und können ein paar Stunden nicht aktiviert gehalten werden. In Tabelle XIV werden auch einige statistische Vergleiche gezeigt. Die wichtigsten Ergebnisse sind: physische Anstrengung bewirkt einen 2 bis 4fachen Anstieg der Prokoagulationsaktivität, und die Prokoagulationsaktivität der "Sintromitis"-Patienten ist 2 bis 1,5fach höher als die der Vergleichsgruppe.
Neben den Schlußfolgerungen, die schon in den Beispielen VI bis VIII gezogen wurden, ist ein weiterer wichtiger Punkt folgender: die Unterschiede zwischen den Gruppen ist am deutlichsten ausgeprägt, wenn die Reaktionszeit kurz ist. Es wird angenommen, daß dies auf die Aktivierung der Blutplättchen in dem Reaktionsgemisch durch gebildetes Thrombin zurückzuführen ist. Aus diesem Grund ist es besser, kurze Reaktionszeiten zu verwenden, um die anfängliche Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen zu messen, und nicht die Aktivität, die in dem Reaktionsgefäß hervorgerufen wurde. Tabelle XIV Prokoagulationsaktivität von Vollblut. Blut wurde 20mal in Salzlösung verdünnt. Fünfzig 1 verdünntes Blut wurden mit 50 1 Prothrombin vermischt. Nach ein paar Minuten Äquilibrierung bei 37 ºC wurden 50 l Aktivierungsgemisch zugegeben. Die Prothrombinase wurde nach 1, 2, 3 und 4 Minuten Reaktionszeit durch Zugabe von 500 l Unterbrechungspuffer abgebrochen. Das gebildete Thrombin wurde durch Zugabe von 20 l S2238 nach 1 bis 2 Minuten gemessen, um die Erythrozyten zu lysieren.

BEISPIEL IX

Prokoagulationsaktivität von Blutplättchen verschiedener Patientengruppen

Es wurden vier unterschiedliche Patientengruppen und eine Vergleichsgruppe getestet. Die Patientengruppen waren: solche, die sich einer Bypass-Operation unterzogen hatten, solche, die einen Koronarinfarkt hatten, solche mit Atriumfibrillation und solche mit tiefer Venenthrombose. Es wurden lyophilisierte Reagenzien mit der Zusammensetzung, die in Beispiel VIII beschrieben wurde, verwendet. Das Protokoll war folgendermaßen: bei t = 0 wurden 100 l Prothrombin, oder Prothrombin + IIa (10 mM) + Kollagen (10 g/ml), oder Prothrombin + Calcium-Ionophor A23187 (5 M)mit 100 l verdünntem Blut (20mal in Salzlösung, aber im Falle des Ionophor 200mal) vermischt; bei t = 5 Min. wurden 100 l FXA.FVA.Ca zugegeben; bei t = 5,45 Min. und 6,30 Min. wurden 100 l mit 500 l EDTA- Ammoniumbicarbonat vermischt, und nach 2 Min. wurde das gebildete Thrombin durch Zugabe von 20 l S2238 gemessen.
In Tabelle XV werden die Durchschnittswerte für alle Gruppen und des weiteren einige statistische Werte gegeben. Außer den Hydrolysegeschwindigkeiten werden die Verhältnisse zwischen den Geschwindigkeiten ohne Zugabe und den Ionophor- Geschwindigkeiten, und zwischen den IIa/Kollagen- Geschwindigkeiten und Ionophor-Geschwindigkeiten angegeben.
Diese Werte sind ein Hinweis auf die prozentuale Aktivierung der Blutplättchen.
Die Ergebnisse von Tabelle XV zeigen, daß die Prokoagulationsaktivität (keine Zugabe; 45 Sek.) aller Patientengruppen höher ist als die Aktivität der Vergleichsgruppe. Wenn man sich die Verhältnisse anschaut, ist zu bemerken, daß die Werte im Fall der Patientengruppen etwa dreimal höher sind als die Werte der Vergleichsgruppe. Diese bemerkten Differenzen sind geringer oder fast nicht vorhanden, wenn wir uns die 90 Sek.-Werte anschauen. Dies zeigt an, daß die 45 Sek.-Werte aussagekräftiger sind als die 90 Sek.-Werte. Die durch Thrombin plus Kollagen hervorgerufene Prokoagulationsaktivität ist mehr oder weniger in allen Gruppen die gleiche und zeigt an&sub1; daß die Blutplättchen von Patienten weniger anregbar sind als die Vergleichs-Blutplättchen, sehr wahrscheinlich, weil die Patienten-Blutplättchen schon zu einem gewissen Ausmaß aktiviert sind.
Es ist somit zu sehen, daß ein Blutplättchen- Nachweisverfahren entwickelt wurde, das nur zwei zeitabhängige Pipettierschritte erforderlich macht, mit der Maßgabe, daß Blutplättchen-reiches Plasma verwendet wird. Die Herstellung von Blutplättchen-reichem Plasma kann in einem klinischen Labor durch Zentrifugation für eine festgelegte Zeit und Gravitation (bestimmt durch Umdrehungen pro Minute und Radius) standardisiert werden. Wenn dennoch Vollblut bevorzugt wird, ist es notwendig, einen Unterbrechungspuffer mit einem großen Überschuß an chromogenem Substrat zu verwenden, oder es ist der zusätzliche Schritt des Nehmens einer Unterprobe erforderlich.
Es ist auch möglich, die Volumina der Reagenzien zu ändern, um das Nachweisverfahren für ein automatisches Analysegerät zu adaptieren, indem, zum Beispiel, 100 l verdünntes Blut und 100 l Prothrombin genommen, vermischt und 3 Minuten inkubiert, 100 l Aktivierungsgemisch zugegeben und 600 l Unterbrechungspuffer bei 3,75 oder 4,5 Minuten zugegeben werden. Schließlich werden 50 l chromogenes Substrat 1,5 Minuten nach der Zugabe des Unterbrechungspuffers zugegeben. Dieser letzte Schritt ist notwendig, um die vollständige Lysis der Erythrozyten zu berücksichtigen.
Für die praktische klinische Anwendung wird bevorzugt lyophilisierte Reagenzien zu verwenden. Tabelle XV Durchschnittliche Prokoagulationsaktivität der Blutplättchen von 4 Patientengruppen und einer Vergleichsgruppe. Neben den absoluten Hydrolysegeschwindigkeiten sind statistische Werte und Verhältnisse angegeben (siehe Text für weitere Erklärungen).

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen des Risikos einer Thrombusbildung bei einer Zielperson durch Bestimmen der Prokoagulationsaktivität ruhender Blutplättchen, das folgendes aufweist:

(a) Vermischen einer Probe, die Blutplättchen von einer Zielperson enthält, mit einem Substrat, das durch ein von einem Prokoagulationsphospholipid abhängiges Enzym oder einen derartigen Enzymkomplex umgewandelt werden kann;

(b) in Kontakt Bringen und Umsetzen des Gemisches aus Schritt (a) mit einem Enzym oder Enzymkomplex, um ein aktiviertes Substrat zu bilden;

(c) Bestimmen der Menge des gebildeten aktivierten Substrats in der Probe; und

(d) Vergleichen der Menge des gebildeten aktivierten Substrats von der Zielperson mit der Menge an gebildetem aktiviertem Substrats von einer oder mehreren Kontrollpersonen.

2. Verfahren zum Bestimmen des Risikos einer Thrombusbildung bei einer Zielperson durch Bestimmen der Anregbarkeit von Blutplättchen, das folgendes aufweist:

(a) Inkubieren einer Probe, die Blutplättchen von einer Zielperson enthält, mit Thrombin oder Thrombin plus Kollagen;

(b) Vermischen des so erhaltenen Produktes aus Schritt (a) mit einem Substrat, das durch ein von einem Prokoagulationsphospholipid abhängiges Enzym oder einen derartigen Enzymkomplex umgewandelt werden kann;

(c) in Kontakt Bringen und Umsetzen des Gemisches aus Schritt (a) mit dem Enzym oder Enzymkomplex, um ein aktiviertes Substrat zu bilden;

(d) Bestimmen der Menge des gebildeten aktivierten Substrats in der Probe; und

(e) Vergleichen der Anregbarkeit der Blutplättchen aus dem Gemisch mit der Anregbarkeit von Blutplättchen, die von einer oder mehreren Kontrollpersonen bestimmt worden sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Blutplättchen der Zielperson in einer Art isoliert werden, die die Blutplättchen vor dem Schritt (a) in einem nichtaktivierten Zustand hält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Substrat aus der Gruppe von Prothrombin und Faktor X ausgewählt ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das oder der von dem Prokoagulationsphospholipid abhängige Enzym bzw. Enzymkomplex aus der Gruppe von Faktor X-aktivierenden Komplexen und Prothrombinase ausgewählt ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge des in der Probe gebildeten aktivierten Substrats durch seine Fähigkeit bestimmt wird, ein chromogenes Substrat zu hydrolysieren.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die die Blutplättchen enthaltende Probe Vollblut aufweist, das von der Zielperson entnommen worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, das weiterhin den Schritt des Entfernens von roten Blutkörperchen aus dem Vollblut vor dem Bestimmen der Menge des gebildeten aktivierten Substrats in der Probe aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Vollblut verdünnt wird und die roten Blutkörperchen vor dem Bestimmen der Menge des gebildeten aktivierten Substrats in der Probe lysiert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Vollblut wenigstens etwa 16mal verdünnt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Vollblut wenigstens etwa 20mal verdünnt wird.

12. Verfahren zur Untersuchung auf ein Agens, das die Blutplättchenaktivierung inhibiert, das folgendes aufweist:

(a) Inkubieren einer Probe, die Blutplättchen enthält, mit

(i) Thrombin oder Thrombin plus Kollagen; und (ii) einem Testagens;

(c) in Kontakt Bringen und Umsetzen des Gemisches aus Schritt (b) mit dem Enzym oder Enzymkomplex, um ein aktiviertes Substrat zu bilden;

(d) Bestimmen der Menge des gebildeten aktivierten Substrats in der Probe; und

(e) Vergleichen der Menge des gebildeten aktivierten Substrats aus einer Probe, die das Testagens enthält&sub1; mit der Menge an gebildetem aktiviertem Substrat aus einer Agensfreien Probe und Korrigieren der Menge des gebildeten aktivierten Substrats aus der Probe, die das Testagens enthält, mit einer Menge, die auf das Testagens selbst zurückzuführen ist.