DE69309293T2

DE69309293T2 - 2-substituierte adenosine mit a-2 rezeptor affinität

Info

Publication number: DE69309293T2
Application number: DE69309293T
Authority: DE
Inventors: David R. Loveland Oh 45140 Borcherding; Nelsen L. West Chester Oh 45069 Lentz; Norton P. Cincinnati Oh 45241 Peet; Philip M. Cincinnati Oh 45215 Weintraub
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-02
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2013-09-03
Also published as: IL107101A; FI951500A0; AU672226B2; FI109129B; NO951213L; NO951213D0; ZA937108B; HU9500918D0; MX9306032A; KR100316354B1; WO1994007905A1; JPH08502069A; ES2102679T3; HUT72611A; NZ256195A; DK0662975T3; FI951500A; GR3023761T3; CA2145682C; AU4844693A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Gruppe von Verbindungen, die Adenosin-Analoge sind und selektiv auf Adenosin-Rezeptoren wirken.

TECHNISCHER HINTERGRUND

Die am 12. juli 1989 veröffentlichte Europäische Patentanmeldung 0 323 807 offenbart verschiedene 2-substituierte Adenosin-Derivate, die therapeutisch wirksame Adenosin-A-2-Agonisten sind.
Die stark blutdrucksenkenden, schmerzstillenden, krampflösenden und gefäßerweiternden Wirkungen von Adenosin wurden vor über 50 Jahren erstmals erkannt. Von da an hat die Anzahl der für Adenosin vorgeschlagenen biologischen Funktionen erheblich zugenommen. Es scheint, daß in vielen Zellen die Adenosin-Rezeptoren mit Adenylatcyclase verbunden sind. Zur Untersuchung dieser Rezeptorfunktionen sind in den letzten Jahren verschiedene Adenosin-Analoge eingeführt worden. Alkylxanthine, wie Coffein und Theophyllin, sind die am besten bekannten Antagonisten von Adenosin-Rezeptoren.
Adenosin ist möglicherweise ein allgemeiner Regulator, da kein bestimmter Zelltyp oder kein bestimmtes Gewebe allein für seine Bildung verantwortlich zu sein scheint. Diesbezüglich ist Adenosin anders als verschiedene andere endokrine Hormone. Außerdem gibt es keinerlei Beweise für die Speicherung von Adenosin in Nervenzellen oder anderen Zellen und seine Freisetzung daraus. Adenosin ist daher anders als andere Neurotransmitter-Stoffe.
Als physiologischer Regulator ist Adenosin mit Prostaglandinen vergleichbar. In beiden Fällen sind die an ihrer Bildung während des Stoffwechsels beteiligten Enzyme weit verbreitet und scheinen auf Veränderungen des physiologischen Zustands der Zellen zu reagieren. Es hat sich herausgestellt, daß Adenosin-Rezeptoren ebenso wie Prostaglandin- Rezeptoren weit verbreitet sind. Schließlich scheinen sowohl Prostaglandine als auch Adenosin an der Regulierung von Funktionen beteiligt zu sein, an denen auch Calcium-Ionen beteiligt sind. Prostaglandine stammen natürlich von in Membranen befindlichen Vorläufern, während Adenosin von Vorläufern aus dem Cytosol stammt.
Obwohl Adenosin verschiedene physiologische Funktionen beeinflussen kann, hat man im Laufe der Jahre besondere Aufmerksamkeit auf die Wirkungen gerichtet, die zu klinischen Anwendungen führen können. Überragende Bedeutung haben dabei die Wirkungen von Adenosin auf das Herz-Kreislaufsystem, die zu Gefäßerweiterung und Blutdrucksenkung führen, aber auch zu einer Herabsetzung der Herzfunktionen. Auch den Wirkungen von Adenosin ist Beachtung geschenkt worden, die Fettspaltung verhindern, Thrombose verhindern und krampflösend sind. Adenosin stimuliert die Steroidbildung in Nebennierenzellen, wahrscheinlich wiederum über eine Aktivierung der Adenylatcyclase. Adenosin wirkt auf die Übertragung von Nervenimpulsen und auf die Spontanaktivität zentraler Neuronen hemmend. Schließlich sind die bronchokonstriktorische Wirkung von Adenosin und die antagonistische Wirkung von Xanthin gegenüber Adenosin wichtige Forschungsgebiete.
Man hat jetzt erkannt, daß es nicht nur eine Klasse extrazellulärer Rezeptoren gibt, die an der Wirkung von Adenosin beteiligt ist, sondern mindestens zwei. Eine davon besitzt eine hohe Affinität zu Adenosin und bindet zumindest in einigen Zellen an Adenylatcyclase, wobei diese gehemmt wird. Von einigen Wissenschaftlern werden diese Rezeptoren als A-1-Rezeptoren bezeichnet. Die andere Klasse von Rezeptoren weist eine geringere Affinität zu Adenosin auf und bindet in vielen Zelltypen an Adenylatcyclase, wobei diese stimuliert wird. Diese Rezeptoren sind als A-2-Rezeptoren bezeichnet worden.
Verschiedene Struktur-Analoge haben jetzt die Charakterisierung von Adenosinrezeptoren ermöglicht. Es sind Adenosin-Analoge verfügbar geworden, die gegenüber Stoffwechsel- oder Aufnahme-Mechanismen resistent sind. Diese sind besonders wertvoll, da ihre offensichtliche Wirksamkeit durch die Entfernung aus dem Effektor-System während des Stoffwechsels weniger beeinträchtigt wird. Die Adenosin-Analoge bilden bezüglich ihrer Wirksamkeit an den A-1- und A-2-Adenosinrezeptoren unterschiedliche Rangordnungen und liefern so ein einfaches Verfahren, mit dem sich eine physiologische Reaktion der Art des Adenosin-Rezeptors zuordnen läßt. Ein anderes Verfahren, mit dem sich eine Reaktion daran beteiligten Adenosin-Rezeptoren zuordnen läßt, basiert auf der Blockade von Adenosin-Rezeptoren (Antagonismus). Es sollte erwähnt werden, daß die Entwicklung wirksamer Antagonisten, die spezifisch für A-1- oder A-2- Adenosin-Rezeptoren sind, einen großen Durchbruch auf diesem Forschungsgebiet und bei der Herstellung von Arzneimitteln darstellt, die selektiv auf Adenosin-Rezeptoren wirken und bei Tieren spezifische physiologische Wirkungen ausüben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I: FORMEL I
wobei R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ein Wasserstoff-Atom oder eine C&sub1;- C&sub4;-Alkylgruppe darstellen, R&sub3; eine C&sub1;-C&sub4;-Alkyl- bzw. C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-Gruppe oder ein Halogen-Atom bedeutet und n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "C&sub1;-C&sub4;-Alkyl- Gruppe" bedeutet gesättigte geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoff- Radikale mit ein bis vier Kohlenstoff-Atomen. Dieser Begriff umfaßt Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl- und Isobutyl-Gruppen sowie ähnliche Gruppen. Der Begriff "C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-Gruppe" bedeutet ein Alkyloxy-Radikal, das aus einem Sauerstoff-Radikal besteht, das ein gesättigtes geradkettiges oder verzweigtes Kohlenwasserstoff-Radikal mit ein bis vier Kohlenstoff-Atomen enthält, und umfaßt insbesondere Methoxy-, Ethoxy-, Propyloxy-, Isopropyloxy-, n-Butyloxy-, Isobutyloxy-, sek-Butyloxy- und tert-Butyloxy- Gruppen sowie ähnliche Gruppen. Der Begriff "Halogen-Atom" bedeutet Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jod-Atome.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen ist Stereoisomerie möglich. Die vorstehend gezeigte chemische Struktur umfaßt alle möglichen Stereoisomere und Razemate solcher Stereoisomere. Wenn R&sub1; und R&sub2; wie in Formel I definiert und verschieden sind, ist insbesondere das entsprechende Kohlenstoff-Atom chiral und damit optische Isomerie möglich.
Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen sind wie folgt:
1. (R)-2-[(phenylisopropyl)-amino] adenosin
2. (S)-2-[(phenylisopropyl)-amino] adenosin
3. (R)-2-[(1-phenylisopropyl)-amino] adenosin
4. (S)-2-[(1-phenylisopropyl)-amino] adenosin.
Das allgemeine Syntheseverfahren für Verbindungen der Formel I ist in Schema A dargelegt. Soweit nicht anders angegeben, sind alle Substituenten wie vorstehend definiert. Die bei diesem Verfahren verwendeten Reagenzien und Ausgangsmaterialien sind für den Fachmann ohne weiteres erhältlich.

Schema A

Bei Schema A, Schritt a, werden 2'- und 3'-Hydroxyl-Gruppen von 2- Chloradenosin (1) als Acetonid, das durch Struktur (2) definiert ist, geschützt. Wenn man nach dem allgemeinen Verfahren von Hampton [J. Am. Chem. Soc. 83 (1961), 3 640] vorgeht, wird ein Äquivalent von 2-Chloradenosin mit etwa 10 Äquivalenten 2,2-Dimethoxypropan und etwa 5 Äquivalenten p- Toluolsulfonsäure in einem geeigneten Lösungsmittel, wie N,N- Dimethylformamid, vereinigt. Nach etwa 20-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Produkt mit Hilfe von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, isoliert und aufgereinigt. Beispielsweise wird eine geeignete wäßrige Base, wie z.B. eine gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung, im Überschuß zugegeben und das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wird mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform, extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert. Das Rohprodukt kann mittels Flash-Chromatographie- oder Umkristallisierungs-Verfahren aufgereinigt werden, wobei das Acetonid (2) erhalten wird. Schritt a Schritt b Schritt c
Bei Schema A, Schritt b, wird das Acetonid (2) danach mit einem in geeigneter Weise substituierten primären Amin behandelt, wobei das sekundäre Amin der Struktur (3) erhalten wird. Das Acetonid (2) wird insbesondere mit einem im großen Überschuß vorliegenden, in geeigneter Weise substituierten primären Amin, wie L-(-)-Amphetamin, D-(+)- Amphetamin, (R)-1-phenylpropylamin oder (S)-1-phenylpropylamin, unter einer Atmosphäre eines Inertgases, wie z.B. Stickstoff, vereinigt. Das Gemisch wird dann etwa 3 bis 6 Stunden unter Rühren auf 130ºC erhitzt. Nach Abkühlung kann das Produkt mit Hilfe von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, isoliert und aufgereinigt werden. Das Roh-Gemisch kann beispielsweise mittels Flash-Chromatographie und anschließend mittels Radial- Chromatographie unter Verwendung eines geeigneten Elutionsmittels, wie z.B. 3% bis 6% Methanol/Chloroform, direkt aufgereinigt werden, wobei das sekundäre Amin (3) erhalten wird.
Bei Schema A, Schritt c, wird das sekundäre Amin (3) danach unter sauren Bedingungen von den Schutzgruppen befreit, wobei die Verbindung der Formel I erhalten wird. Insbesondere wird das sekundäre Amin (3) mit einer im Überschuß vorliegenden geeigneten Säure, wie z.B. 1 M Salzsäure, behandelt und etwa 30 Minuten auf etwa 40ºC bis 50ºC erhitzt. Nach Abkühlung kann das Produkt mittels Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, isoliert und aufgereinigt werden. Beispielsweise kann das Reaktionsgemisch mit einer im Überschuß vorliegenden geeigneten schwachen Base, wie z.B. einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung, behandelt und danach mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, extrahiert werden. Die organischen Extrakte werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert. Der Roh-Rückstand kann dann mittels Chromatographie-Verfahren, wie z.B. Radial-Chromatographie, aufgereinigt und danach mit Chlorwasserstoff in Ether behandelt werden, wobei das Hydrochlorid-Salz der Verbindung von Formel I erhalten wird.

Therapeutischer Nutzen von Mitteln, die selektiv an Adenosin-Rezeptoren wirken

Die nachstehende Tabelle zeigt den potentiellen therapeutischen Nutzen erfindungsgemäßer Mittel, die selektiv an Adenosin-Rezeptoren wirken:
In den Herz-Kreislauf-, Lungen- und Nieren-Zielsystemen können neu entwickelte, mittels Rezeptor-Bindungsuntersuchungen identifizierte Verbindungen in in vivo-Funktionstests beurteilt werden, die direkt auf menschliche physiologische Reaktionen schließen lassen. Die pharmakologische und funktionelle Bedeutung von Purin-Rezeptoren ist von M. Williams in Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 27 (1987), 31, gut beschrieben. In einem Abschnitt mit dem Titel "Therapeutic Targeting of Adenosin Receptor Modulators" wird festgestellt, daß "Adenosin-Agonisten als blutdrucksenkende Mittel, bei der Behandlung von Opiat-Entzugserscheinungen, als Modulatoren von Immunkompetenz und Renin-Freisetzung, als gegen Psychosen gerichtete Mittel und als Schlafmittel wirksam sind. Umgekehrt lassen sich Antagonisten als zentralwirkende Stimulantien, Muskelkontraktion beeinflussende Mittel, Kardiotonika, gegen Stress gerichtete Mittel, Antiasthmatika und bei der Behandlung von Atembeschwerden verwenden." Die Palette der von Adenosin- Rezeptor-Mitteln gezeigten Aktivitäten unterstreicht ihren großen potentiellen therapeutischen Nutzen und den Bedarf an zentralwirkenden Mitteln.
Adenosin übt seine verschiedenen biologischen Effekte über seine Wirkung auf Rezeptoren an der Zelloberfläche aus. Es gibt zwei Typen von Adenosin-Rezeptoren, nämlich A-1 und A-2. Die A-1-Rezeptoren werden ihrer Funktion nach als diejenigen Rezeptoren definiert, an denen verschiedene &sup6;C- N-substituierte Adenosin-Analoge, wie R-phenylisopropyladenosin (R-PIA) und Cycloadenosin (CHA) wirksamer sind als 2-Chloradenosin und N-5'- Ethylcarboxamido-adenosin (NECA). Dagegen ist die Rangfolge der Wirksamkeit beim A-2-Rezeptor NECA > 2-Chloradenosin > R-PIA > CHA.
Wie in der vorstehenden Tabelle veranschaulicht ist, regulieren Adenosin- Rezeptoren verschiedene physiologische Funktionen. Die zwei Hauptklassen von Adenosin-Rezeptoren sind bereits definiert worden. Das sind zum einen die A-1-Adenosin-Rezeptoren, die Adenylatcyclase hemmen, und zum anderen die A-2-Adenosin-Rezeptoren, die Adenylatcyclase stimulieren. Die A-1-Rezeptoren besitzen zu Adenosin und Adenosin-Analogen eine höhere Affinität als die A-2- Rezeptoren. Die physiologischen Wirkungen von Adenosin und Adenosin- Analogen werden durch die Tatsache erschwert, daß Mittel, die an Adenosin- Rezeptoren nicht selektiv wirken, zuerst an die ziemlich weit verbreiteten A-2- Rezeptoren niedriger Affinität binden, danach mit zunehmender Dosis an die A-2-Rezeptoren hoher Affinität binden und schließlich bei viel höheren Dosen an A-1-Adenosin-Rezeptoren sehr hoher Affinität binden (vgl. J. W. Daly et al., Subclasses of Adenosine Receptors in the Central Nervous System: Interaction with Caffeine and Related Methylxanthins, Cellular and Molecular Neurobiology 3 (1) (1983), 69-80).
Im allgemeinen werden die physiologischen Wirkungen von Adenosin entweder durch Stimulierung oder Hemmung von Adenylatcyclase herbeigeführt. Die Aktivierung der Adenylatcyclase erhöht die intrazelluläre Konzentration von cyclischem AMP, das allgemein als zweiter intrazellulärer Messenger (Bote) angesehen wird. Die Wirkungen von Adenosin-Analogen lassen sich deshalb dadurch bestimmen, daß in gezüchteten Zellinien entweder die Fähigkeit zur Erhöhung der Konzentration von cyclischem AMP oder die Fähigkeit zur Neutralisierung der Konzentrations-Erhöhung ermittelt wird. Zwei wichtige Zellinien diesbezüglich sind VA 13 (WI-38 VA 13 2RA), eine mit SV-40 transformierte menschliche fötale Lungen-Fibroblasten-Zellinie, von der bekannt ist, daß sie den A-2-Subtyp von Adenosin-Rezeptoren enthält, sowie Fettzellen, von denen bekannt ist, daß sie den A-1-Subtyp von Adenosin- Rezeptoren enthalten (vgl. R. F. Bruns, Adenosine Antagonism by Purines, Pteridines and Benzopteridines in Human Fibroblasts, Chemical Pharmacology 30 (1981), 325-333).
Aus in vitro-Untersuchungen ist wohlbekannt, daß die Carbonsäure von 8- Phenyl-1,3-dipropylxanthin (XCC) an Adenosin-Rezeptoren nicht selektiv wirkt, wobei der Ki-Wert am A-1-Rezeptor von Rattenhirn-Membranen bei 58 ± 3 nM und der Ki-Wert am A-2-Rezeptor im Test mit Rattenhirn-Schnitten bei 34 ± 13 nM liegt. Andererseits weist die Aminosäure von 8-Phenyl-1,3- dipropylxanthin (XAC) für den A-1-Adenosin-Rezeptor mit einem Ki-Wert von 1,2 ± 0,5 nM im Vergleich zum A-2-Rezeptor mit einem Ki-Wert von 49 ± 17 nM eine 40-fach höhere Affinität auf. XAC kann außerdem die Wirkung von Adenosin-Analogen auf die Herzrate viel wirksamer neutralisieren als deren Wirkung auf den Blutdruck. Seitdem allgemein bekannt ist, daß die von Adenosin-Analogen induzierten Wirkungen auf das Herz anscheinend über A- 1-Rezeptoren vermittelt werden und ihre Wirkungen auf den Blutdruck über A-2-Rezeptoren, deutet die selektive Wirkung von XAC unter in vivo- Bedingungen darauf hin, daß die Aktivität von Adenosin-Rezeptoren in vitro mit deren Aktivität in vivo im Einklang steht und daß sich spezifische physiologische Wirkungen aufgrund dieser selektiven Wirkung an Rezeptoren unterscheiden lassen (vgl. B. B. Fredholm, K. A. Jacobsen, B. Jonzon, K. L. Kirk, Y. O. Li und J. W. Daly, Evidence That a Novel 8-Phenyl-Substituted Xanthine Derivative is a Cardioselective Adenosine Receptor Antagonist In Vivo, Journal of Cardiovascular Pharmacology 9 (1987), 396-400, sowie K. A. Jacobsen, K. L. Kirk, J. W. Daly, B. Jonzon, Y. O. Li und B. B. Fredholm, Novel 8-Phenyl- Substituted Xanthine Derivative Is Selective Antagonist At Adenosine Receptors In Vivo, Acta Physiol. Scand. (1985), 341-342).
Bekanntlich bewirkt Adenosin auch eine deutliche Blutdrucksenkung. Diese Blutdrucksenkung hängt wahrscheinlich von der Verminderung des peripheren Widerstandes ab, der von A-2-Rezeptoren vermittelt wird. Adenosin-Analoge können auch die Herzrate senken. Diese Wirkung wird wahrscheinlich über Adenosin-Rezeptoren vom A-1-Subtyp vermittelt.
Daher ist leicht ersichtlich, daß die pharmakologische Verabreichung von in der vorliegenden Erfindung offenbarten Adenosin-Analogen, die eine selektive Wirkung auf Adenosin-Rezeptoren ausüben, entweder zur selektiven Bindung an A-2-Rezeptoren oder zur Bindung an A-1-Rezeptoren führt, was wiederum z.B. entweder zur Blutdrucksenkung oder zur Verminderung der Herzrate führt, wodurch es zu einer Entkopplung dieser physiologischen Wirkungen in vivo kommt. Mit Hilfe von nachstehend genauer beschriebenen Verfahren können solche Mittel, die an Adenosin-Rezeptoren selektiv wirken, ausgewählt werden.

Test auf Affinität zu A-2-Adenosin-Rezeptoren im Gehirn

Der nachstehend beschriebene Test wurde zur Bestimmung verwendet, wie wirksam Testverbindungen mit dem Liganden [³H]-5'-N- Ethylcarboxamidoadenosin (NECA) um die Bindung an A-2-Adenosin- Rezeptoren konkurrieren, die aus tierischen Hirnmembranen hergestellt worden waren (vgl. auch R. R. Bruns, G. H. Lu und T. A. Pugsley, Characterization of the A-2 Adenosine Receptor Labeled by [³H]NECA in Rat Striatal Membranes, Mol. Pharmacol. 29 (1986), 331-346). Von Charles River bezogene junge männliche Ratten (Stamm C-D) wurden durch Enthauptung getötet und die Gehirne wurden entfernt. Aus dem Rattenhirn-Striatum wurden Membranen zur Ligandenbindung isoliert. Das Gewebe wurde in 20 Volumina eiskaltem 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,7) unter Verwendung einer Polytron-Vorrichtung (über eine Zeitspanne von 6 bis 20 Sekunden) homogenisiert. Das Homogenisat wurde 10 Minuten bei 4ºC bei 50 000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in einer Polytron-Vorrichtung in 20 Volumina Puffer homogenisiert und wie vorstehend beschrieben zentrifugiert. Schließlich wurde das Pellet in 40 Volumina 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,7) pro Gramm ursprüngliches Gewebe-Feuchtgewicht resuspendiert.
In drei Inkubationsröhrchen wurden 100 µl [³H]NECA (im Testsystem 94 nM), 100 µl 1 µM Cyclohexyladenosin (CHA), 100 µl 100 mM MgCl&sub2;, 100 µl Adenosindeaminase in einer Konzentration von 1 IE/ml, 100 µl mit Testpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,7) verdünnte Testverbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 10&supmin;¹&sup0; M bis 10&supmin;&sup4; M und 0,2 µl Membran- Suspension (5 mg Feuchtgewicht) gegeben, wobei das Endvolumen 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,7, betrug. Inkubationen wurden 60 Minuten bei 25ºC durchgeführt. Der Inhalt jedes Röhrchens wurde unter Anwendung von Vakuum durch GF/B-Glasfaserfilter filtriert. Die Filter wurden zweimal mit 5 ml eiskaltem Puffer gewaschen. Die Membranen auf den Filtern wurden in Szintillationsgefäße überführt, in die 8 ml Omnifluor mit 5% Protosol gegeben worden waren. Die Anzahl der radioaktiven Impulse auf den Filtern wurden mittels Flüssig-Szintillations-Spektrometrie bestimmt.
Die spezifische Bindung von [³H]] NECA wurde als der Überschußwert bestimmt, der den entsprechenden Wert von Blindproben überstieg, die in Gegenwart von 100 µM 2-Chloradenosin untersucht worden waren. Die gesamte an die Membranen gebundene Radioaktivität betrug etwa 2,5% der Radioaktivität, die in die Röhrchen gegeben worden war. Da unter diesen Bedingungen die Gesamtbindung auf weniger als 10% der Radioaktivität beschränkt blieb, veränderte sich während des Bindungstestes die Konzentration freier Liganden nicht nennenswert. Die spezifische Bindung an Membranen betrug etwa 50% der Gesamtbindung. Der Proteingehalt der Membran-Suspension wurde mit Hilfe des von O.H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L Farr und R. J. Randall in Protein Measurements With Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem. 193 (1951), 265-275, beschriebenen Verfahrens bestimmt.
Die Verdrängung der [³H] NECA-Bindung durch eine Testverbindung um 15% oder mehr weist auf die Affinität zur A-2-Adenosin-Rezeptorstelle hin. Die molare Konzentration einer Verbindung, die eine 50%-ige Hemmung der Ligandenbindung verursacht, wird als IC&sub5;&sub0;-Wert bezeichnet. Ein Wert im Bereich von 100 nM - 1000 nM weist auf eine sehr wirksame Verbindung hin.

Test auf Affinität zu A-1-Adenosin-Rezeptorbindungsstellen im Gehirn

Der nachstehend beschriebene Test wurde zur Bestimmung verwendet, wie wirksam Testverbindungen mit dem Liganden [³H]-Cycloadenosin um Bindung an A-1-Adenosin-Rezeptoren konkurrieren, die aus Rattenhirn-Membranen hergestellt worden waren. Männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden durch Enthauptung getötet. Aus den vollständigen Gehirnen der Tiere wurden Membranen isoliert (vgl. R. Goodman, M. Cooper, M. Gavish und S. Synder, Guanine Nucleotide and Cation Regulation of the Binding of [³H] Diethylphenylxanthine to Adenosine A-1 Receptors in Brain Membrane, Molecular Pharmacology 21 (1982), 329-335).
Die Membranen wurden in 25 Volumina eiskaltem 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,7, homogenisiert (unter Verwendung des Polytron-Systems 7 bis 10 Sekunden). Das Homogenisat wurde 10 Minuten bei 4ºC bei 19 000 Upm zentrifugiert. Das Pellet wurde durch Resuspendieren in 25 Volumina Puffer, der Adenosindeaminase in einer Konzentration von 2 IE pro ml enthielt, gewaschen und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann wurde das Homogenisat erneut zentrifugiert. Das zum Schluß erhaltene Pellet wurde in 25 Volumina eiskaltem Puffer resuspendiert.
In drei Inkubationsröhrchen wurden 100 µl [³H]-Cyclohexyladenosin, (Endkonzentration im Testsystem 0,8 nM), 200 µl mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,7) verdünnte Testverbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 10&supmin;¹&sup0; M bis 10&supmin;&sup6; M sowie 0,2 ml Membran-Suspension (8 mg Feuchtgewicht) gegeben, wobei das Endvolumen 2 ml Tris-Puffer betrug. Inkubationen wurden 2 Stunden bei 25ºC durchgeführt. Jede Inkubation wurde durch Filtration durch ein GF/B-Glasfaserfilter unter Anwendung von Vakuum innerhalb von 10 Sekunden beendet. Die auf den Filtern befindlichen Membranen wurden in Szintillationsgefäße überführt. Die radioaktiven Impulse auf den Filtern wurden mittels Flüssig-Szintillations-Spektrometrie in 8 ml 5% Protosol enthaltendem Omniflour bestimmt.
Die spezifische Bindung von [³H]-Cyclohexyladenosin wurde als Überschußwert bestimmt, der den entsprechenden Wert von Blindproben überstieg, die in Gegenwart von 10&supmin;&sup5; M 2-Chloradenosin untersucht worden waren. Die gesamte an die Membranen gebundene Radioaktivität betrug etwa 5% der den Teströhrchen zugegebenen Radioaktivität. Die spezifische Bindung an Membranen betrug etwa 90% der Gesamtbindung. Der Proteingehalt der Membran-Suspension wurde mittels des Verfahrens von Lowry et al., ibid, 265, bestimmt.
Die Verdrängung der [³H]-Cyclohexyladenosin-Bindung durch eine Testverbindung um 15% oder mehr wies auf Affinität zu den Adenosin- Bindungsstellen hin.

Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Testverfahren erhaltene Bindungsaffinitätswerte von Adenosin-Rezeptoren

Im folgenden ist eine Tabelle gezeigt, die die Bindungsaffinitäten von Adenosin-Rezeptoren für verschiedene Verbindungen zeigt (vgl. die auf Seite 5 beschriebenen Beispiele von Verbindungen hinsichtlich Verbindungs- Bezeichnungen ), die zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung gehören:
Es hat sich gezeigt, daß das Nucleotid Guanosintriphosphat (GTP) die Bindung von Agonisten und Antagonisten an verschiedene Neurotransmitter- Rezeptoren unterschiedlich beeinflußt. Im allgemeinen verringern Guanin- Nucleotide die Affinität von Agonisten zu Rezeptoren, ohne daß es gleichzeitig zu einer Abnahme der Affinität von Antagonisten kommt. Dementsprechend hat es sich gezeigt, daß GTP die Wirksamkeit von Agonisten zur Hemmung der Bindung des Adenosin-Antagonisten [³H]-3-Diethyl-8-phenylxanthin verringert, nicht jedoch die von Antagonisten. Im allgemeinen verringert GTP die Wirksamkeit von Purin-Agonisten zur Hemmung der [³H]Phenylisopropyladenosin-Bindung stark, nicht jedoch die von Antagonisten. Deshalb ist GTP ein wirksames Mittel zur Unterscheidung zwischen Agonisten und Antagonisten (vgl. L. P. Davies, S. C. Chow, J. H. Skerritt, D. J. Brown und G. A. R. Johnston, Pyrazolo [3,4-d]Pyrimidines as Adenosine Antagonists, Life Sciences 34 (1984), 2117-2128). Natürlich wirken Adenosin-Aanaloge im allgemeinen als Agonisten, wenn β-D-Ribofuranosyl im Molekül an der R&sub1;-Position vorhanden ist, und als Antagonisten, wenn R&sub1; ein Wasserstoff-Atom oder eine Phenyl-Gruppe ist.

Pharmazeutische Präparate aus Adenosin-Analogen, die selektiv an Adenosin-Rezeptoren wirken

Die genaue Menge der einzusetzenden Verbindung oder Verbindungen, d.h. die Menge der verabreichten Verbindung oder Verbindungen, die zur Erzielung der gewünschten Wirkung ausreicht, hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z.B. der eingesetzten Verbindung, Verabreichungstyp, Größe, Alter und Geschlecht eines Tieres, Form, Zeitpunkt und Häufigkeit der Verabreichung sowie der gewünschten physiologischen Wirkung. In bestimmten Fällen kann die zu verabreichende Menge mittels üblicher Verfahren zum Feststellen des Konzentrationsbereiches ermittelt werden.
Die Verbindungen werden vorzugsweise in Form eines Mittels verabreicht, das die Verbindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, d.h. einem Träger, der gegenüber dem Wirkstoff chemisch inaktiv ist und der unter den Anwendungsbedingungen keine schädlichen Nebenwirkungen aufweist oder toxisch wirkt. Solche Mittel können etwa 0,1 µg oder weniger bis 500 mg Wirkstoff pro ml Träger bis zu etwa 99-Gew.-% Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten.
Die Mittel können sowohl in fester Form, z.B. als Tabletten, Kapseln, Granulate, Futtergemische, Futterzusätze und -konzentrate, Pulver, Körnchen oder dergleichen, als auch in flüssiger Form vorliegen, z.B. als sterile injizierbare Suspensionen, oral verabreichte Suspensionen oder Lösungen. Pharmazeutisch verträgliche Träger können Excipienten umfassen, wie z.B. oberflächenaktive Dispersionsmittel, Suspendiermittel, Tabletten-Bindemittel, Gleitmittel, Geschmacksstoffe und Farbstoffe. Geeignete Excipienten sind beispielsweise in Veröffentlichungen wie Remington's Pharmaceutical Manufacturing, 13. Ausgabe (1965), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, offenbart.
Die folgenden Beispiele zeigen die im Schema A beschriebenen typischen Syntheseverfahren. Diese Beispiele dienen natürlich nur zur Veranschaulichung und sollen den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung in keinster Weise beschränken. Die in den folgenden Beispielen verwendeten Begriffe haben die folgende Bedeutung: "[α]D²&sup0;" bedeutet die optische Drehung einer Verbindung bei 20ºC unter Verwendung von Natrium-D-Licht, "g" bedeutet Gramm, "mmol" Millimol, "ml" Milliliter, "ºC" Grad Celsius, "TLC" Dünnschicht-Chromatographie, "mg" Milligramm, "µl" Mikroliter und "δ" die Tieffeldverschiebung bezüglich Tetramethylsilan in ppm (Teile pro Million).

BEISPIEL 1

(R)-2-[(PHENYLISOPROPYL)AMINO]ADENOSIN

Schema A, Schritt a

2-Chloradenosin-halbhydrat (0,96 g, 3,09 mmol), 2,2-Dimethoxypropan (3,2 g, 30,9 mmol) und p-Toluolsulfonsäure (2,93 g, 15,5 mmol) wurden in N,N- Dimethylformamid (40 ml) vereinigt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden gerührt und danach wurde eine gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung (70 ml) zugegeben. Unter Vakuum wurde das Reaktionsgemisch konzentriert. Der Rückstand wurde mit Chloroform extrahiert (3 x 300 ml). Die organischen Extrakte wurden vereinigt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Radial- Chromatographie (5% Methanol/Chloroform, 4 mm-Platte) aufgereinigt, wobei 1,14 g Acetonid (2) erhalten wurden.

Schema A, Schritt b

Das Acetonid (2) (444 mg, 0,13 mmol) wurde mit L-(-)-Amphetamin (3,4g) vereinigt und unter Rühren 3,5 Stunden unter Stickstoff auf 130ºC erhitzt. Nach Abkühlung erfolgte eine Aufreinigung mittels Flash-Chromatographie (3% Methanol/Chloroform, dann 4% Methanol/Chloroform, dann 5% Methanol/Chloroform) und anschließend mittels Radial-Chromatographie (3% Methanol/Chloroform, dann 4% Methanol/Chloroform, dann 5% Methanol/Chloroform, 4 mm-Platte), wobei das sekundäre Amin (3) erhalten wurde (262 mg).

Schema A, Schritt c

Das sekundäre Amin (3) (249 mg, 0,57 mmol) wurde mit 1 M Salzsäure (20 ml) behandelt. Dann wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten auf 50ºC erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und in eine gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung (200 ml) gegossen. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Chloroform extrahiert (3 x 150 ml). Die organischen Extrakte wurden vereinigt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Radial- Chromatographie (2% Methanol/Chloroform, dann 4% Methanol/Chloroform, dann 8% Methanol/Chloroform, dann 15% Methanol/Chloroform, 4 mm-Platte) viermal aufgereinigt, wobei die Titel-Verbindung (105 mg) als freie Base erhalten wurde. Diese wurde mit Chlorwasserstoff in Ether behandelt und filtriert. Der Feststoff wurde unter hohem Vakuum über Phosphor(III)- pentoxid getrocknet, wobei das Hydrochlorid-Salz der Verbindung von Formel I (48 mg) erhalten wurde. Schmp. (Zersetzung) 153ºC; [α]D²&sup0; = -30º (c = 1,04, H&sub2;O). BEISPIEL 2

(S)-2-[(PHENYLISOPROPYL)AMINO]ADENOSIN

Schema A, Schritt a

Schema A, Schritt b

Das Acetonid (2) (638 mg, 1,87 mmol) und D-(+)-Amphetamin (4,5 g) wurden vereinigt und unter Stickstoff 5 Stunden auf 130ºC unter Rühren erhitzt. Nach Abkühlung erfolgte eine Aufreinigung mittels Flash-Chromatographie (3% Methanol/Chloroform, dann 5% Methanol/Chloroform, dann 10 % Methanol/Chloroform). Anschließend wurde viermal eine Radial- Chromatographie durchgeführt (2% Methanol/Chloroform, dann 4% Methanol/Chloroform, dann 8% Methanol/Chloroform, dann 10 % Methanol/Chloroform, 4 mm-Platte), wobei das sekundäre Amin (3) erhalten wurde (0,56 g).

Schema A, Schritt c

Das sekundäre Amin (3) (0,46 g, 1,05 mmol) wurde mit 1 M Salzsäure (40 ml) behandelt. Dann wurde das Reaktionsgemisch 15 Minuten auf 45ºC erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und in eine gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung (300 ml) gegossen. Das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform (3 x 150 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert, wobei die Titel-Verbindung (0,40 g) als freie Base erhalten wurde. Diese wurde mit Chlorwasserstoff in Ether behandelt und filtriert. Der Feststoff wurde unter hohem Vakuum über Phosphor (III)- pentoxid getrocknet. Danach erfolgte eine Umkristallisierung aus 10% Methanol/Diethylether, wobei nach Trocknen über Phosphor (III)-pentoxid unter hohem Vakuum das Hydrochlorid-Salz der Verbindung von Formel I (184 mg) erhalten wurde.
Schmp. (Zersetzung) 155ºC; [α]D²&sup0; = + 9,75º (c = 1,01, H&sub2;O). BEISPIEL 3

(R)-2 [(1-PHENYLPROPYL)AMINO]ADENOSIN

Schema A, Schritt a

Das Acetonid (2) (3,4 g, 9,95 mmol) wurde mit (R)-1-Phenylpropylamin (8,62 g) vereinigt und 18 Stunden bei Siedetemperatur erhitzt. Ein Teil des überschüssigen Amins wurde mittels Destillation entfernt. Nach Abkühlung erfolgte eine Aufreinigung mittels Flash-Chromatographie (3% Methanol in Dichlormethan). Das Produkt wurde mit Diethylether zermahlen, wobei das sekundäre Amin (3) erhalten wurde (1,38 g).
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,41 (1 H, s), 7,21 - 7,34 (4H, m), 7,14 - 7,22 (1H, m), 5,69 (1H, d), 5,50 (2H, s), 5,25 (1H, d), 5,10 (1H, t), 5,01 (1H, q), 4,90 (1H, q), 4,41 (1H, s), 3,93 (1H, d), 3,80 (1H, d), 1,82 (2H, pent), 1,60 (3H, s), 1,32 (3H, s), 0,94 (3H, t);
IR(KBr) 3450 - 3100, 1633, 1599 cm&supmin;¹.
Analytische Berechnung für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub8;N&sub6;O&sub4;: C, 59,99; H, 6,41; N, 19,08.
Festgestellt: C, 59,99; H, 6,38; N, 18,71.

Schema A, Schritt c

Das vorstehend erhaltene sekundäre Amin (3) wurde in Trifluoressigsäure (20 ml) gelöst und mit Wasser (2 ml) behandelt. Nach 15 Minuten wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Wasser/Dichlormethan behandelt und die wäßrige Phase wurde mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung auf einen basischen pH-Wert eingestellt. Die Phasen wurden getrennt. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum konzentriert. Der erhaltene Feststoff wurde mittels Flash-Chromatographie (5% Methanol/Dichlormethan, dann 10% Methanol/Dichlormethan, dann 15% Methanol/Dichlormethan) aufgereinigt und danach aus Aceton umkristallisiert, wobei die Titel-Verbindung erhalten wurde (62 mg).
¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 7,87 (1H, s), 7,38 (1H, d), 7,27 (2H, t), 7,16 (1H, t), 6,60 - 6,73 (3H, m, austauschbar), 5,69 (1H, d), 5,31 (1H, d), 5,02 + 5,12 (2H, brs + d), 4,83 (1H, q), 4,52 (1H, dd), 4,17 (1H, dd), 3,88 (1H, dd), 3,64 - 3,73 (1H, m), 3,47 - 3,59 (1H, m), 2,08 (3H, s, ME&sub2;SO), 1,63 - 1,89 (2H, m), 0,96 (3H, t);
IR (KBr) 3423 - 3290 cm&supmin;¹.
Analytische Berechnung für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub4;N&sub6;O&sub4; 1/2 C&sub3;H&sub6;O: C, 57,33; H, 6,34; N, 19,57.
Festgestellt: C, 59,96; H, 6,73; N, 19,92.

Claims

1. Verbindung, die (R)-2-[(phenylisopropyl)amino]adenosin ist.

2. Verbindung, die (R)-2-[(phenylisopropyl)amino]adenosinhydrochlorid ist.

3. Arzneimittel, umfassend die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, gegebenenfalls im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung als eine pharmazeutisch aktive Verbindung.

5. Arzneimittel nach Anspruch 3, zur Verwendung bei der Blutdrucksenkung.

6. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Blutdrucksenkung.

7. Verfahren zur Herstellung von (R)-2-[(phenylisopropyl)amino]adenosin und seines Hydrochloridsalzes, umfassend die Umsetzung einer Verbindung der Formel mit einer geeigneten Säure.