DE69233652T2

DE69233652T2 - Nukleotidsequenzen, die für die veränderlichen bereiche der alpha-ketten menschlicher t-zell-rezeptoren kodieren sowie ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69233652T2
Application number: DE69233652T
Authority: DE
Inventors: Thierry Hercend; Frederic Triebel; Sergio Roman-Roman; Laurent Ferradini
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1991-02-08
Filing date: 1992-02-07
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2012-02-08
Also published as: DE69233652D1; WO1992013949A1; DK0529033T3; KR100242278B1; US5817511A; ATE504650T1; CA2079879C; ATE338134T1; AU660660B2; AU1360392A; DE69233804D1; EP1721978B1; CA2079879A1; EP0529033B1; US6114516A; EP0529033A1; IE920413A1; EP1721978A1; US5798231A; JPH05509234A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Nukleotidsequenz, die für eine variable Region der α-Kette menschlicher T-Zellen-Rezeptoren kodiert, die entsprechenden Peptidsegmente und die Anwendungen in Diagnose und Therapie.
Es ist bekannt, daß die Rezeptoren, die die Antigene an der Oberfläche der reifen T-Lymphozyten erkennen (im folgenden T-Zellen-Rezeptoren genannt) eine Struktur aufweisen, die eine gewisse Analogie mit der Struktur von Immunglobulinen aufweisen. So enthalten sie heterodimere Strukturen, die α- und β-Glykoproteinketten oder γ- und δ-Glycoproteinketten umfassen (siehe Meuer et al. (1), Moingeon et al. (2), Brenner et al. (3), Bank et al.(4)).
Die Reihe der T-Zellen-Rezeptoren muß der enormen Vielfältigkeit der antigenen Determinanten begegnen können. Dies geschieht durch genetische Rekombination der unterschiedlichen diskreten Abschnitte von Genen, die für die verschiedenen Strukturregionen der T-Zellen-Rezeptoren kodieren. So enthalten die Gene V-Abschnitte (Variable Abschnitte), gegebenenfalls D-Abschnitte (Diversity-Abschnitte), J-Regionen (Joining-Abschnitte) und C-Abschnitte (Konstante Abschnitte). Während der Differenzierung der T-Zellen werden spezifische Gene durch Rekombination der V-, D- und J-Abschnitte für die β- und δ-Loci und V-Abschnitte und J-Abschnitte für die α- und γ-Loci erzeugt. Diese spezifischen Kombinationen sowie die Paarung der beiden Ketten führen zu der Kombinationsvielfalt. Diese Vielfalt wird noch stark durch zwei Nebenmechanismen erweitert, nämlich der ungenauen Zusammenfügung der V-D-J-Abschnitte bzw. der V-J-Abschnitte und der Hinzufügung von Nukleotiden, die dem N-Abschnitt entsprechen (Davis et al. (5)).
Es ist bereits eine gewisse Anzahl von V-Gen-Abschnitten bekannt. Diese Abschnitte werden entsprechend der Ähnlichkeit der Sequenzen in Unterfamilien eingeteilt. Definitionsgemäß werden diejenigen Abschnitte, die mehr als 75% Ähnlichkeit in der Nukleotidsequenz aufweisen, als Mitglieder derselben Unterfamilie betrachtet (Crews et al. 6)). Die bekannten Vα-Gen-Abschnitte wurden dementsprechend in 22 Unterfamilien eingeteilt, von denen 14 nur ein einziges Mitglied aufwiesen (siehe Concannon et al. (7), Kimura et al. (8), Wilson et al. (9)).
Außerdem wurden ungefähr 60 Jα-Gen-Abschnitte beschrieben (9).
Außerdem wurden in jüngster Zeit in WO 90/06758 monoklonale Antikörper gegen spezifische Abschnitte der variablen Teile der T-Zellen-Rezeptoren, insbesondere die β- und δ-Ketten, beschrieben. Diese monoklonalen Antikörper eignen sich nicht nur als Werkzeuge für die Diagnose, sondern auch als Werkzeuge für die Therapie, zum Beispiel gegen rheumatoide Arthritis.
Die Verwendung von synthetischen Peptiden, die variablen Regionen der α- oder β-Ketten entsprechen, bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten ist ebenfalls beschrieben worden (23 und 24).
Außerdem ist bekannt, daß zwischen verschiedenen Individuen Variationen bezüglich der Expression von unterschiedlichen variablen Abschnitten des T-Rezeptors beim Menschen existieren (27 und 28).
Mit der vorliegenden Erfindung soll die Reihe der Genabschnitte, die für variable Regionen der α-Ketten der T-Zellen-Rezeptoren kodieren, erweitert werden, und zwar dadurch, daß man einen neuen Vα-Genabschnitt bereitstellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft also eine Nukleotidsequenz, die für eine variable Region der α-Kette menschlicher T-Zellen-Rezeptoren kodiert und die einer cDNA entspricht, die die Nukleotidsequenz des Vα-Abschnitts gemäß SEQ ID Nr. 1 umfaßt sowie die Sequenzen, die sich davon durch ein oder mehrere Nukleotid(e) unterscheiden.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere:

– eine Nukleotidsequenz, die für eine variable Region der α-Kette von menschlichen T-Lymphozyten-Rezeptoren kodiert und die der cDNA zu der gesamten Nukleotidsequenz des Abschnitts Vα oder einem Teil davon entspricht und die der Sequenz 1 bis 200 der SEQ ID Nr. 1 entspricht, sowie die Sequenzen, die sich davon durch ein oder zwei Nukleotide unterscheiden.

Unter "Nukleotidsequenzen, die cDNAs entsprechen, die den gesamten Nukleotidsequenzen oder einem Teil davon entsprechen" versteht man sowohl die vollständigen Sequenzen als auch Fragmente dieser Sequenzen, darunter auch kurze Fragmente (Oligonukleotide), die als Sonden verwendet werden (und die im allgemeinen mindestens zehn Nukleotide aufweisen) oder die als Primer verwendet werden (und die im allgemeinen mindestens 15 Nukleotide aufweisen). Allgemein umfaßt die Erfindung die Gesamtheit der neuen Oligonukleotide, die erfindungsgemäß Fragmente der Sequenz Vα sind.
Die Sequenzen, die sich durch ein oder zwei Nukleotid(e) unterscheiden, entsprechen Variationen, die man bei einem Versuch bei der Bestimmung der Nukleotidsequenz von mehreren cDNAs beobachtet.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Peptide, die von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen sowie deren Allelen und Derivaten codiert werden und die dieselbe Funktion aufweisen.
Allgemein umfaßt die vorliegende Erfindung die Peptide, die aus einer Peptidsequenz, die von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen kodiert werden bzw. diese Nukleotidsequenz umfassen, bestehen sowie die Fragmente dieser Peptide. Außerdem umfaßt sie die Peptide, die sie von diesen durch eine oder mehrere Aminosäure(n) unterscheiden und die dieselbe Funktion aufweisen. Diese Peptide können Modifikationen entsprechen, wie sie bei den Muteinen oder bei Allelvariationen bekannt sind. Es wurde nämlich insbesondere gezeigt, daß bei gewissen Genabschnitten, die für variable Regionen der Ketten des T-Zellen-Rezeptors beim Menschen ein Phänomen eines genetischen Polymorphismus auftritt, der Allelvariation genannt wird (25). Die vorliegende Erfindung umfaßt die Peptide, die aufgrund dieses Phänomens auftreten.
Die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz wurde mit den folgenden Schritten erhalten:

– Isolation von RNAs von peripheren Lymphozyten eines Einzelorganismus;
– Gewinnen der komplementären DNA mit Hilfe der reversen Transkriptase und einem für die Cα-Region spezifischen Primer A (SEQ ID Nr. 21);
– Genamplifikation (mittels Anchored Polymerase Chain Reaction bzw. A-PCR) mit Hilfe einer DNA-Polymerase, eines poly-C-Primers (SEQ ID Nr. 22) und einem für die Cα-Region spezifischen Primer B (SEQ ID Nr. 23);
– erneute Amplifikation mittels A-PCR mittels DNA-Polymerase und einem für die Cα-Region spezifischen Primer C (SEQ ID Nr. 24);
– Insertion in einen Plasmidvektor;
– Transformation eines bakteriellen Wirts mit dem rekombinanten Vektor;
– Durchmustern der rekombinanten Bakterienkolonien mit einem markierten für Cα spezifischen Oligonukleotid D (SEQ ID Nr. 25);
– Isolation von Plasmiden von positiven Kolonien;
– sowie Sequenzierung der DNA-Fragmente, die die Cα-Region enthalten.

Die vorliegende Erfindung kann insbesondere mittels bispezifischer Genamplifikation (Polymerase-Kettenreaktion bzw. PCR) nachgearbeitet werden, und zwar dadurch, daß man von den peripheren Lymphozyten, die die m-RNA mit dem variablen Abschnitt, der der Sequenz ID Nr. 1 der Erfindung entspricht, ausgeht oder auch daß man diese PCR-Technik auf genomische DNA von einer beliebigen somatischen Zelle eines zufällig gewählten Einzelorganismus anwendet. Die Erfindung kann auch dadurch nachgearbeitet werden, daß man die obige Gensequenz mittels chemischer Oligonukleotidsynthese herstellt.
Die erfindungsgemäßen Peptide können mittels der traditionellen Peptidsynthese erhalten werden. Sie können auch durch Anwendung von Techniken, die als Gentechnik bekannt sind, erhalten werden, wobei eine DNA-Sequenz, die für ein erfindungsgemäßes Peptid kodiert, in einen Expressionsvektor wie ein Plasmid insertiert wird und Zellen mit diesem Expressionsvektor transformiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Plasmide und Expressionsvektoren mit einer DNA-Sequenz, die für ein erfindungsgemäßes Peptid kodiert, sowie mit diesem Vektor transformierte Werte.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, gegen eine antige Determinante, die zu einem erfindungsgemäßen Peptid gehört oder ein erfindungsgemäßes Peptid enthält.
Die monoklonalen Antikörper können auf jedem Weg erhalten werden, der es ermöglicht, ausgehend von Zellkulturlinien Antikörpermoleküle zu produzieren. Dazu zählen die unterschiedlichen Techniken, bei denen Hybridome verwendet werden.
Antikörper können beim Tier dadurch erzeugt werden, daß man Tiere dadurch immunisiert, daß man ihnen erfindungsgemäße Peptide oder Fragmente injiziert, egal ob diese natürlich, rekombinant oder synthetisch sind, gegebenenfalls nach Kopplung mit einem immunogenen Agens wie dem Tetanus-Anatoxin, oder dadurch, daß man ihnen humane T-Lymphozyten injiziert, die an ihrer Oberfläche die entsprechenden Sequenzen exprimieren, darunter auch rekombinante Zellen, die mit den entsprechenden Kodiersequenzen transfiziert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide produzieren.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Fragmente und Derivate von erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern, die mit den von den T-Zellen-Rezeptoren definierten variablen Regionen reagieren. Bei diesen Fragmenten handelt es sich insbesondere um die F(ab')2-Fragmente, die durch enzymatische Spaltung von Antikörpermolekülen mit Pepsin erhalten werden können, die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken von F(ab')2-Fragmenten erhalten werden können, sowie die Fab'-Fragmente, die durch enzymatische Spaltung von Antikörpermolekülen mit Papain in Gegenwart eines Reduktionsmittels erhalten werden können. Diese Fragmente können auch gentechnisch erhalten werden.
Bei den Derivaten von monoklonalen Antikörpern handelt es sich zum Beispiel um Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper, an die Marker wie ein Radioisotop gebunden sind. Die Derivate von monoklonalen Antikörpern sind auch Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper, an die therapeutisch aktive Moleküle gebunden sind, insbesondere zytotoxische Verbindungen.
Die Produkte der Erfindung sind vielseitig auf dem Gebiet der Diagnose und auf dem Gebiet der Therapie einsetzbar.
1 – Einsatz auf dem Gebiet der Diagnose
Die in den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthaltenen Oligonukleotide können für die Konstruktion von Nachweissonden (im allgemeinen mindestens 10 Nukleotide), die mit einer variablen Region der α-Kette hybridisieren können, oder die Konstruktion von Primern für die Amplifikation von DNA (die im allgemeinen mindestens 15 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 17 Nukleotide enthalten), die sich an eine zu amplifizierende Sequenz anlagern können, verwendet werden.
Die Oligonukleotide lassen sich daher in der Diagnose vn Immunstörungen einsetzen, und zwar dadurch, daß das Vorhandensein von Nukleinsäuresequenzen, die mit einem Gen, das für variable Regionen von α-Ketten des T-Zellen-Rezeptors in der mRNA einer Probe eines Patienten kodieren, homolog sind, nachgewiesen werden. Um einen Zusammenhang zwischen der Expression von Genen von T-Zellen und einer Krankheit herzustellen, können unterschiedliche Verfahren verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen:

a – Herstellung und Analyse von cDNA-Expressionsbibliotheken, die von T-Zellen, die mit der Krankheit in Zusammenhang stehen, erhalten wurden, um die Frequenz der dominanten Gene zu bestimmen;
b – Analyse von Proben genomischer DNA mittels Southern-Blot, um festzustellen, ob genetische Polymorphismen oder Umordnungen von Genen, die für die Rezeptoren der T-Zellen kodieren, vorliegen;
c – Analyse von Proben dadurch, daß man cDNA gewinnt, diese mittels PCR amplifiziert und mit den markierten Sonden hybridisiert;
d – In-situ-Hybridisierung von T-Zellen ohne zuvorige Kultur der T-Zellen.

Die Primer lassen sich in PCR-Reaktionen in einem Verfahren, wie es unter c oben definiert ist, einsetzen.
Die monoklonalen Antikörper, die Fragmente oder die Derivate dieser erfindungsgemäßen Antikörper, insbesondere die Anti-Vα-Antikörper, können dazu verwendet werden, um Immunreaktionen des T-Typs zu untersuchen, zum Beispiel bei Autoimmunerkrankungen, bei Krebserkrankungen, bei Allergie, bei Transplantation und bei Infektionskrankheiten. Insbesondere kann die Gesamtheit der verschiedenen variablen α-Abschnitte des T-Rezeptors untersucht werden, egal, ob es sich um T-Zellen des Fluids oder der Bewegung handelt. Allgemein kann es sich bei dem verwendeten Verfahren um In-vitro- oder In-vivo-Verfahren handeln.
Bei den In-vitro-Verfahren kann es sich bei den verwendeten Proben um Proben von Körperflüssigkeiten oder um Gewebeproben handeln. Zu dem verwendeten Verfahren können insbesondere die Durchflußzytofluorimetrie für die Analyse der T-Lymphozyten des Bluts oder um Markierungen eines anatomisch-pathologischen Schnittpräparats mittels Immunperoxidase für die Untersuchung der Lymphozyten, die in die Gewebe eindringen, gehören.
Bei den In-vivo-Verfahren werden die Antikörper, ihre Fragmente oder ihre Derivate auf den üblichen Wegen, zum Beispiel intravenös, verabreicht, und man weist die immunspezifischen Bindungen nach. Dies kann zum Beispiel dann erhalten werden, wenn man einen mit einem Radioisotop markierten Antikörper verwendet.
2 – Einsatz auf dem Gebiet der Therapie
Die in den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthaltenen Oligonukleotide können als antisense-Oligonukleotide in der Therapie verwendet werden. Man weiß nämlich, daß die Expression eines in Human-Lymphozyten transkribierten Gens in vitro inhibiert werden kann, und zwar dadurch, daß man diese Lymphozyten mit einem für das jeweilige Gen spezifischen antisense-Oligonukleotid inkubiert (26). Diese antisense-Oligonukleotide enthalten im allgemeinen mindestens zehn, vorzugsweise mindestens 16, Nukleotide. Bei diesen antisense-Oligonukleotiden kann es sich insbesondere um die invertierten und komplementierten Sequenzen handeln, die den 20 Nukleotiden stromaufwärts der Translationsinitiationsstelle (ATG) entsprechen. Das Ziel einer In-vitro-Verwendung von für einen Vα-Genabschnitt spezifischen antisense-Oligonukleotiden besteht darin, die Expression eines T-Rezeptors, der diesen Vα-Abschnitt enthält, zu stoppen (oder stark zu verringern) und so zu einer klonmäßigen Deletionserscheinung bezüglich der spezifischen Reaktivität der T-Lymphozyten zu gelangen. Die antisense-Oligonukleotide können nicht nur in vitro bei Human-T-Lymphozyten, die anschließend erneut injiziert werden, angewendet werden, sondern auch in vivo durch lokale oder systemische Injektion, vorzugsweise nach Modifikationen, um die In-vivo-Stabilität und das Eindringen dieser Oligonukleotide in das Innere der T-Lymphozyten zu erhöhen.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, insbesondere die Anti-Vα-Antikörper, können zur Modulation des Immunsystems verwendet werden. Die Antikörper können zum Beispiel zur Blockierung der Wechselwirkung der Effektor-T-Zellen mit ihrem spezifischen Antigen verabreicht werden. Man kann auch Anti-T-Rezeptor-Antikörper, die zum Beispiel an ein zytotoxisches Molekül oder an ein Radioisotop gebunden sind, dazu verabreichen, um zu einer klonmäßigen Deletion zu gelangen, und zwar dadurch, daß eine spezifische Fixierung auf einer α-Kette eines T-Zellen-Rezeptors erfolgt. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können in schwach nitrogenen Konzentrationen in der Therapie verwendet werden, um spezifisch gewisse Untereinheiten der T-Zellen zu aktivieren, oder sie können in wesentlich höheren Konzentrationen verwendet werden, um sich an die ent sprechenden Rezeptoren fix anzulagern und so diese Untereinheiten so zu markieren, daß sie vom Retikulo-endothelial-System eliminiert werden können. Ein wichtiges Kriterium für die Behandlung einer Krankheit ist die Fähigkeit, Untereinheiten der T-Zellen, die mit einer Krankheit in Zusammenhang stehen, zu modulieren. Details solch einer therapeutischen Modulation, nämlich eine Blockierung oder Unterdrückung einer bestimmten Untereinheit der T-Zellen oder umgekehrt die Stimulation und Aktivierung einer bestimmten Untereinheit, wird von der betreffenden Krankheit und von der jeweiligen Untereinheit der entsprechenden T-Zellen abhängen.
Im Vergleich zu derzeit vorgenommenen Behandlungen, bei denen Antikörper verwendet werden, wie die Behandlung von Patienten mit Nierentransplantation, bei denen ein Abstoßungsproblem auftritt, mit Anti-CD3-Antikörpern weist die oben beschriebene Art der Behandlung einen Vorteil auf, da aufgrund der Erfindung keine Modulation der Gesamtheit der T-Zellen-Population, sondern nur von der Untereinheit der T-Zellen, die die jeweilige α-Unterfamilie der T-Zellen-Rezeptoren, exprimieren, erfolgt.
Da die Reaktion der T-Zellen häufig oligoklonal ist, werden im allgemeinen zweckmäßig Cocktails aus mehreren Antikörpern in der Therapie verwendet.
Außerdem kann man die Anti-Vα-Antikörper dazu verwenden, um eine In-vitro-Selektion der T-Lymphozyten vorzunehmen, zum Beispiel dadurch, daß man sie auf eine Säule, die Kügelchen mit Antikörpern enthält, aufträgt. Diese Trennung von gewissen T-Lymphozyten kann im Hinblick auf eine Kultivierung dieser Lymphozyten vor ihrer Rückinjektion in den Patienten verwendet werden.
Außerdem kann man die erfindungsgemäßen Peptidsequenzen ganz oder teilweise in der Therapie verwenden, zum Bei spiel die von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen kodierten Peptidsequenzen oder die Fragmente dieser Sequenzen, die im allgemeinen wenigsten acht bis zehn Aminosäuren enthalten). Diese Sequenzen bzw. Fragmente, die dem Menschen oder dem Tier verabreicht werden, können als Köder wirken, das heißt sie werden sich an das von dem schädlichen Antigen getragene Epitop anlagern und die Reaktion der normalen T-Zellen mit dem Antigen verhindern, wodurch sie die Entwicklung einer aggressiven Krankheit gegen die Determinanten desselben verhindern. Sie können auch als Immunogene bei der Herstellung von Impfstoffen verwendet werden (gegebenenfalls nach Kopplung mit Trägerproteinen).
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der beigelegten Abbildungen genauer beschrieben. Die Abbildungen zeigen folgendes:
1A bis E zeigen ein Alignment einer bekannten Vα-Sequenz und einer Partialsequenz einer erfindungsgemäßen Extension für die Sequenz SEQ ID Nr. 6 bis 10, mit der Bezeichnung IGRa 08 bis IGRa 12. In diesen Abbildungen beginnt die Numerierung der Nukleotide beim ATG-Initiationscodon (das unterstrichen ist). Die Punkte geben die identischen Nukleotide an. Die Sequenzen, bei denen es sich um Leitsequenzen handeln soll, sind oberhalb mit einem Strich versehen.
2 zeigt ein Alignment der neuen Jα-Sequenzen (SEQ ID Nr. 12, 13 und 15 bis 20) mit der Bezeichnung IGRJa 01, 02 und 04 bis 09. In diesen Sequenzen sind die Rekombinationssignale der Keimlinie unterstrichen. Die den stark konservierten Codons entsprechenden Aminosäuren sind oberhalb der Sequenzen gekennzeichnet. Die Codons, die einer Substitution in einer Position einer konservierten Aminosäure entsprechen, sind doppelt unterstrichen.
3 zeigt die Southern-Blot-Analysen der mit einem Restriktionsenzym behandelten genomischen DNA, wobei man für die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 5 spezifische Sonden verwendete. Bei den verwendeten Restriktionsenzymen handelt es sich um EcoRI (Bahn R), HindIII (Bahn H) sowie BamIII (Bahn B). In dieser Abbildung zeigen die Dreiecke die Lage der DNA-Fragmente, die spezifisch mit Cα hybridisieren.
4 ist eine Darstellung des autoradiographischen Nachweises der amplifizierten Transkripte der α-Ketten des von den peripheren Lymphozyten eines gesunden Probanden exprimierten PCR sowie der gemeinsam amplifizierten β-Akti-Kontrolle.
I – Herstellung von cDNA und Amplifikation mittels PCR
Als RNA-Ausgangsmaterial wurden periphere Lymphozyten eines Probanden verwendet. Die Gesamt-RNA wurde nach der Guanidiniumisothiocyanat-Cäsiumchlorid-Methode (Chirgwin (10)) oder nach der Ein-Schritt-Methode durch Extraktion mit Guanidiniumisothiocyanat, Phenol und Chloroform (Chomczynski(11)) erzeugt.
Der cDNA-Erststrang wird in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern bei einer Temperatur von 42°C während einer Stunde synthetisiert, wobei 5 Mikrogramm Gesamt-RNA, die reverse Transkriptase sowie ein für die Cα-Region spezifischer Primer A, der aus der Sequenz 5'-GTTGCTCCAGGCCACAGCACTG (SEQ ID Nr. 21) besteht. Dieses Material wurde anschließend durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und Fällung mit Ammoniumacetat aufgereinigt. Nach Auswahl einer 0,45/1-kB-Fraktion auf Agarosegel wird 30 Minuten lang bei 37°C an den RNA/cDNA-Heteroduplex in einem CoCl₂-Zugabepuffer mit 14 Einheiten terminaler Desoxynukleotidyltransferase (Tdt) ein dG-Ende angefügt. Die Reaktion wurde durch zehnminütiges Halten bei 70°C gestoppt. Es wird mit 1 N NaOH (1/3 Volumen) versetzt und der Ansatz wurde eine Stunde lang bei 50°C inkubiert, um die RNA zu hydrolysieren, und anschließend mit 2 M Tris-HCl pH 8 und 1 N HCl neutralisiert. Nach Extraktion mit einer Phenol-Chloroform-Mischung wurde der cDNA-Erststrang mit G-Ende mittels Ethanol gefällt und damit eine Amplifikation durchgeführt, wobei man die PCR-Technik (Polymerase-Kettenreaktion gemäß Saiki et al. (12)) in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern mit 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% (Gew./Vol.) Gelatine, 200 Mikromol dNTP, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase und 100 Pikomol der beiden Primer durchgeführt. Bei den zwei verwendeten Primern handelt es sich einerseits um einen poly-C-Primer (5'-GCATGCGCGCGG CCGCGGAGG-14C) (SEQ ID Nr. 22) gemäß Loh et al. (13) sowie zweitens um einen für die Cα-Region spezifischen Primer B (5'-GTCCATAGACCTC ATGTCCAGCACAG) (SEQ ID Nr. 23).
Es werden 25 Amplifikationszyklen und anschließend eine 15minütige abschließende Elongation bei 72°C durchgeführt. Jeder Zyklus umfaßt eine einminütige Denaturierung bei 92°C, eine zweiminütige Hybridisierung bei 55°C und eine vierminütige Elongationsdauer bei 72°C. Die Amplifikationsprodukte werden anschließend mit Ethanol gefällt, in 30 mM Natriumacetat pH 5, 50 mM NaCl, 1 mM ZnCl₂, 5 Vol.-% Glycerin suspendiert, und 1/10 dieses Materials wird größenmäßig auf einem einprozentigen Low-Melting-Agarosegel aufgereinigt.
Anschließend wird eine zweite Amplifikationsphase durchgeführt, und zwar direkt mit ungefähr 10% der Bande, die die Agarose enthält, wobei unter denselben Bedingungen wie zuvor vorgegangen wird, nur daß man als für den für die Cα-Region spezifischen Primer C den Primer 5'-ATACACATCAGAATTC TTACTTTG (SEQ ID Nr. 24) verwendet. Der Reaktionsansatz wird anschließend mit Ethanol gefällt und das Fällungsprodukt wird in 60 μl H₂O suspendiert.
II – Klonierung und Sequenzierung der cDNAs
1/3 des Produkts der zweiten Amplifikation wird mit SacII verdaut, auf einprozentigem Agarosegel getrennt und durch Adsorption an Glaskügelchen auf gereinigt. Das Material wird in den Vektor Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, USA) insertiert und mit den erhaltenen Rekombinanten werden XL1-Blau-Stämme von E. coli (Stratagene) transformiert. Nach Auftragen in Gegenwart von X-gal und IPTG wird mit den weißen Kolonien ein Test durchgeführt, wobei man eine "Dot-Blot"-Technik verwendet und als Sonde ein mit 32 P markiertes, für die Cα-Region (5'-GTCACTGG ATTTAGAGTCT) (SEQ ID Nr. 25) spezifisches drittes Oligonukleotid einsetzt. Von positiven Kolonien wird die Plasmid-DNA extrahiert und man sequenziert die beiden Stränge mit dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren (Sanger et al. (14)) mit Sequenaee 2,0 (United States Biochemicals, Cleveland, USA), wobei nach den Empfehlungen des Zulieferers vorgegangen wird. Außer bei der Sequenz SEQ ID Nr. 5 wurden alle Nukleotidsequenzen an den beiden Strängen bestimmt, und zwar mit mindestens zwei unterschiedlichen cDNA-Klonen.
Die erhaltenen Sequenzen werden mit dem von Lipman und Pearson (15) entwickelten Verfahren mit den veröffentlichen Vα- und Jα-Sequenzen verglichen. Die mutmaßlichen Ausgangscodons wurden dadurch identifiziert, daß man nach dem Vorhandensein der Kosak-Konsensussequenz für die Translationsinitiationsstellen in eukaryontischen Zellen suchte (Kozak (16)). Das Vorhandensein von hydrophoben Leitsequenzen des N-terminalen Endes wurde mittels Hydrophobizitätsanalyse gemäß dem von Kyte (17) beschriebenen Verfahren nachgewiesen.
III – Southern-Blot-Analyse
Die DNA der Human-Erythroleukämie-Zellinie K562 wurde extrahiert und mit einem der folgenden Restriktionsenzyme verdaut: EcoR I, BamH I bzw. Hind III. Mit der DNA (15 Mikrogramm) wurde eine Elektrophorese auf 0,7%iger Agarose durchgeführt und die DNA wurde wie von Triebel et al. (18) beschrieben auf Nylonmembranen übertragen. Die Hybridisierungen wurden 16 Stunden lang bei 65°C mit 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardt's und 100 Mikrogramm denaturierter Lachssperma-DNA durchgeführt. Die Membranen wurden bei 65°C mit 2 × SSC, 0,2% SDS gewaschen.
Als Vα-spezifische Sonden wurden Sonden verwendet, die durch Amplifikation von V-J-C-cDNA (500 Bp) mit Vα-Fragmenten, die den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 5 entsprechen, erhalten wurden, wobei als Primer der poly-C-Primer und der Primer C verwendet wurden. Die Sonden wurden auf einprozentigem Agarosegel gereinigt. Ausgehend von Fragmenten, die nach der Methode von Feinberg (19) auf Agarose aufgereinigt worden waren, wurden 32P-markierte DNA-Sonden hergestellt.
IV – Ergebnisse
Mit der A-PCR-Methode wurden 308 cDNAs, die mit der Cα-Sonde hybridisieren, kloniert und anschließend sequenziert. Darunter entsprechen 172 cDNAs einmalig auftretenden variablen V-J-Cα-Regionen.
Die beschriebenen Sequenzen Vα und Jα sind in der Aufzählung der Sequenzen angegeben, und zwar jeweils unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 11 sowie SEQ ID Nr. 12, 13 und 15 bis 20. Die Sequenzen SEQ ID Nr. 2-5 entsprechen neuen Unterfamilien (mit der Bezeichnung Vα25, Vα26, Vα27 bzw. Vα29, während die Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und 6 bis 11 Verlängerungen von bekannten Vα-Abschnitten entsprechen.
1. Vα-Sequenzen, die neuen Unterfamilien entsprechen
Zur Identifikation der Anzahl der Vα-Gensegmente, die zu jeder Familie gehören, und zur Charakterisierung von DNA-Restriktionsfragmenten mit diesen Vα-Genabschnitten wurden Southern-Blot-Analysen von DNA der Keimbahn, die mit einer Endonuklease verdaut worden war, unter Verwendung der V-J-Cα-Sonden, die Vα-Fragmente enthal ten, die den Sequenzen SEQ ID Nr. 2 bis 5 entsprechen, unter Hybridisierungsbedingungen mit niedriger Stringenz durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Diese Analysen zeigen, daß die Unterfamilie, die der SEQ ID Nr. 3 entspricht, mindestens zwei Genabschnitte umfaßt, während die anderen Sequenzen (SEQ ID Nr. 2, Nr. 4 und Nr. 5) vermutlich einmalig auftretenden Mitgliedern entsprechen.
Die Restriktionsfragmente der Keimbahn-DNA weisen die folgende Größe auf:
SEQ ID Nr. 2 : EcoR I 2,2 kB, Hind III 4,8 und 5,7 kB, BamH I 25 kB
SEQ ID Nr. 3 : EcoR I 4,6 und 7,5 kB, Hind III 4,2 und 6,4 kB, BamH I 23 und 4,5 kB
SEQ ID Nr. 4 : EcoR I 7, 6 kB, Hind III 18 kB, BamH I 9 und 0, 9 kB
SEQ ID Nr. 5 : EcoR I 5,9 und 4,8 kB, Hind III 6,6 kB, BamH I 6,5 kB.
2. Sequenzen, die Verlängerungen von bekannten Vα-Sequenzen entsprechen
SEQ ID Nr. 1 (IGR a 02) entspricht einer Verlängerung des 5'-Endes der Sequenz LINV (171 Bp)(Mengle-Gaw (20)): diese Sequenz definiert die Unterfamilie mit der provisorischen Bezeichnung Vα w24.
SEQ ID Nr. 6 (IGR a 08): diese Sequenz entspricht einer Verlängerung des 5'-Endes der Sequenz des Klons Vα1 AE11 (Klein et al. (21)). Die beiden Sequenzen mit Alignment sind in 1A dargestellt.
SEQ ID Nr. 7 (IGR a 09): diese Sequenz entspricht einer Verlängerung, die für das NH₂-terminale Ende der Sequenz Vα2 AF110 (Klein, Zitat oben) kodiert. Die beiden Sequenzen mit Alignment sind in 1B dargestellt. Die Sequenz ID Nr. 7 entspricht einer Konsensussequenz. Man beobachtet, daß in Position 206 T statt C steht.
SEQ ID Nr. 8 (IGA a 010): diese Sequenz entspricht einer Verlängerung der 5'-Region des Klons Vα HAP35 (Yoshikai (22)). Die beiden Sequenzen mit Alignment sind in 1C dargestellt. Die Sequenz ID Nr. 8 entspricht einer Konsensussequenz. Man beobachtet, daß in Position 307 G statt A steht und daß in Position 360 T statt C steht.
SEQ ID Nr. 9 (IGA a 11): diese Sequenz entspricht einer Verlängerung des 3'-Endes der Sequenz Vα7 HAP12 (Yoshikai, Zitat oben). Das Alignment der Sequenzen ist in 1D dargestellt. Die Sequenz ID Nr. 9 entspricht einer Konsensussequenz. Man beobachtet, daß in Position 68 C statt T steht.
SEQ ID Nr. 10 (IGA a 12): diese Sequenz umfaßt die vollständige Kodieregion eines Gens der Unterfamilie Vα22, die bereits aufgrund der Partialsequenz (113 Bp) AC9 (Klein, Zitat oben) identifiziert worden ist. Die beiden Sequenzen mit Alignment sind in 1E dargestellt.
SEQ ID Nr. 11 (IGA a 13): diese Sequenz entspricht teilweise den Klonen HAVT 32 und HAVT 35 (die zur Unterfamilie Vα16 (8) gehören und die als Pseudogene beschrieben worden sind. Aufgrund der Hinzufügung eines Nukleotids in Position 108 kodiert die SEQ ID Nr. 11 nämlich für eine ursprüngliche variable Region eines T-Lymphozyten-Rezeptors. Außerdem ist diese Sequenz bezüglich des kodierenden Abschnitts mit einer Sequenz HSTCAYM (Klein et al. (21)) homolog. Die Sequenz SEQ ID Nr. 11 ist jedenfalls die einzige Sequenz, die vollständig und kodierend ist.
3. Jα-Sequenzen
In 2 sind alle neuen Sequenzen Jα dargestellt. Der Großteil der acht Jα-Abschnitte weist eine stark konservierte Aminosäuresequenz FGXGT der Jα-Abschnitte auf, wie dies bei Yoshikai (Zitat oben) beschrieben ist. Bei dem Abschnitt IGRJa 07 ist jedoch der Threoninrest durch einen Isoleucinrest ersetzt.
Außerdem findet sich in IGRJa 02G statt dem Phenylalaninrest ein Cysteinrest.
Oligonukleotide, die für verschiedene Vα-Unterfamilien spezifisch sind, lassen sich als Primer für die Amplifikation von DNA, die diesen verschiedenen Vα-Unterfamilien entspricht, verwenden, zum Beispiel für eine Expressionsstufe von gewissen Vα-Unterfamilien bei einem Patienten und schließlich für ein Diagnostikum von Immunstörungen, wie dies weiter oben beschrieben ist.
Die vorherrschende Expression von gewissen Unterfamilien von Vα wurde bereits mit Hilfe eines unvollständigen Oligonukleotidsatzes untersucht. So haben Nitta et al. (29) die vorherrschende Expression der Vα-7-Gene in den Lymphozyten, die in Tumore eindringen, beschrieben. Außerdem haben Sottini et al. (30) die Untersuchung der Vα-Reihe bei Patienten mit rheumatoider Arthritis beschrieben.
Es wird ein vollständiger Satz von Oligonukleotiden beschrieben, die ganz spezifisch für jede Unterfamilie sind und mit denen gleichzeitig bekannte Vα-Unterfamilien und neue Vα-Unterfamilien untersucht werden können. Es wurden also zu diesem Zweck Oligonukleotide gewählt und synthetisiert und gegebenenfalls wurden Modifikationen von einem oder zwei Nukleotiden im Vergleich zu den natürlichen Sequenzen eingeführt, um Kreuzreaktivitäten zwischen den Unterfamilien zu verringern.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung eines Oligonukleotids der Sequenz SEQ ID Nr. 49 als Primer für die Amplifikation von DNA, die einer variablen Region der α-Kette von T-Zellen-Rezeptoren entspricht. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Oligonukleotids der Sequenz SEQ ID Nr. 49 als Primer für die Amplifikation von DNA, die einer variablen Region der α-Kette von T-Zellen-Rezeptoren entspricht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von Nukleotidsequenzen, die für Vα-Abschnitte von T-Rezeptoren kodieren, oder von cDNA, die deren Transkriptionsprodukten entsprechen, in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

a) Amplifikation der DNA mit mindestens einem Primer-Paar, das von dem Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID Nr. 49 und einem Oligonukleotid, das zu dem Cα-Abschnitt gehört, gebildet wird, sowie
b) Nachweisen der amplifizierten Sequenzen mit einer Cα-Sonde.

Das Oligonukleotid, das zu dem Cα-Abschnitt gehört, der für die Amplifikation verwendet wird, kann insbesondere unter den Sequenzen SEQ ID Nr. 55 und 56 gewählt sein.
Um die Amplifikationseffizienz zu überprüfen, arbeitet man vorzugsweise in Gegenwart eines Kontroll-Primer-Paars und weist die amplifizierte entsprechende Kontrollsequenz mit Hilfe einer entsprechenden Kontrollsonde nach.
Dieses Kontroll-Primer-Paar kann zwei Cβ-Abschnitten entsprechen, zum Beispiel entsprechen die Primer CβF und CβK den Sequenzen SEQ ID Nr. 61 und 62. Man verwendet also eine Cβ-Nachweissonde (die zum Beispiel der Sequenz SEQ ID Nr. 63 entspricht). Das Primer-Paar kann jedoch auch aus zwei Primern, die zum β-Actin gehören, gebildet werden, insbesondere den Primern, die den Sequenzen SEQ ID Nr. 58 und 59 entsprechen. Man verwendet in diesem Fall eine Nachweissonde, die einer β-Actin-Sequenz entspricht, wie die Sequenz SEQ ID Nr. 60.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Diagnose-Kit zur Durchführung des oben genannten Verfahrens, das

a) mindestens ein Oligonukleotid der Sequenz SEQ ID Nr. 49,
b) einen Cα-Primer,
c) eine Cα-Sonde

Solch ein Kit enthält vorzugsweise weiterhin

d) ein Kontroll-Primer-Paar,
e) eine Kontrollsonde.

In der Information, die in der Sequenzbeschreibung für die Sequenzen 26 bis 60 angegeben ist, entsprechen die Sequenzen SEQ ID Nr. 26 bis 47 Sequenzen, die zu Klonen der bekannten Unterfamilien Vα1 bis Vα22 gehören (und die von der EMBL-Datei abgerufen werden können) oder Sequenzen, die sich davon durch ein oder zwei Nukleotide unterscheiden.
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 49, 50, 51, 52 und 54 entsprechen Sequenzen, die Klonen von neuen erfindungsgemäßen Unterfamilien gehören und die Unterfamilien mit der provisorischen Bezeichnung Vα w24, Vα w25, Vα w26, Vα w27 und Vα w29 entsprechen (wobei w bedeutet, daß noch keine definitive Bezeichnung erfolgt ist).
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 48 und 53 entsprechen Sequenzen, die zu den Klonen IGRa01 bzw. IGRa06 von bekannten Unterfamilien gehören, bei denen jedoch noch keine definitive Bezeichnung erfolgt ist (Vα w23 bzw. Vα w28) und von denen ein Mitgliedselement bereits beschrieben worden ist (Hinkkanen A. et al. (31) bzw. Bernard O. et al. (32)). Die vollständige Sequenz von IGRa06 ist noch nicht veröffentlicht worden.
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 55 und 56 sind zwei Beispiele für Oligonukleotide, die als Cα-Primer für die Amplifikation verwendet werden können.
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 57 ist Sequenz einer Cα-Sonde, die für den Nachweis von amplifizierter DNA verwendet werden kann.
Die Sequenzen SEQ ID Nr. 58, 59 und 60 sind jeweils Sequenzen eines Paars von Oligonukleotiden, die zur β-Actin-Sequenz gehören und die für die Überprüfung der Amplifikation verwendet werden können bzw. die Sequenz einer Sonde zum Nachweisen der entsprechenden amplifizierten DNAs.
In der Sequenzbeschreibung ist die angegebene Position die Position des 5'-Endes, die von der vorhersagbaren ATG-Translationsinitiationsstelle zu zählen ist. Bei unvollständigen Sequenzen (unbekannte 5'-Region) wird die Position (die mit einem Sternchen bezeichnet ist) in Bezug auf das erste Nukleotid der Sequenz angegeben. Die unterstrichenen Nukleotide entsprechen Fehlpaarungen, die in Bezug auf die natürliche Sequenz eingeführt wurden.
Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesegerät von Applied Biosystems, Typ 381 A, unter Verwendung der β-Cyanoethylphosphoramidit-Methode (Sinha et al. (33)) synthetisiert, wobei man gemäß der empfohlenen Vorschrift des Herstellers vorging. Die Oligonukleotide wurden in dem Gerät enttrityliert, vom Träger abgespalten und mit Ammoniak entschützt (60°C, fünf Stunden lang). Die Rohprodukte wurden mittels Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie auf einer μ-Bondapak C-18-Säule gereinigt, wobei man einen Gradienten von Acetonitril (9 bis 15%) in 0,01 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 5,5 verwendete.
Bei der mit den erfindungsgemäßen Primern durchgeführten Amplifikation kann es sich insbesondere um die PCR-Technik (PCR = Polymerase Chain Reaction, Polymerasekettenreaktion) handeln, wie sie von Saiki et al. (12) und in den Patenten US-A-4 683 195, 4 683 202, 4 889 818 beschrieben wurde.
Für die PCR kann man eine denaturierte Doppelstrang-DNA oder eine cDNA, die aus einer RNA mit Hilfe der reversen Transkriptase erhalten worden ist, verwenden, wie dies oben erwähnt ist.
Bei dem Polymerisationsmittel handelt es sich um eine DNA-Polymerase, insbesondere um die Taq-Polymerase.
Im allgemeinen wird der Amplifikationszyklus 25 bis 40 mal wiederholt.
Die Sonden, die man für den Nachweis von amplifizierten Sequenzen verwendet, können durch Markierung von Oligonuklotiden mit einem Radioisotop erhalten werden, was zu einem Nachweis mittels Autoradiographie führt, oder durch Kopplung mit einem Enzym wie Peroxidase (ECL-Amersham-System), alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase (Tropix-Ozyme-System), was zu einem Chemolumineszenznachweis führt.
In dem folgenden Beispiel wird die Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens veranschaulicht.
Periphere Lymphozyten eines gesunden Probanden wurden durch Zentrifugation mit einem Dichtegradienten erzeugt. Die Gesamt-RNA wurde nach dem Ein-Stufen-Ver fahren durch Extraktion mit Guanidiniumisothiocyanat, Phenol und Chloroform (Chomczynski, 11) extrahiert. Die Komplementär-DNA wurde in einem Endvolumen von 20 μl bei 42°C im Verlauf von einer Stunde synthetisiert, und zwar mit 1 bis 5 μg Gesamt-RNA, reverser Transkriptase und dem Cα-Primer B (1,25 μM).
Das erhaltene Material wurde anschließend drei Minuten auf 95°C erhitzt und anschließend wurde damit eine Amplifikation gemäß der PCR-Technik durchgeführt, wobei man parallel jeden der spezifischen Vα-Primer, der den Sequenzen SEQ ID Nr. 26 bis 54 entsprach, und den für die Cα-Region spezifischen Cα-Primer B (SEQ ID Nr. 56) verwendete. Dies Amplifikation wurde in einem Endvolumen von 10 μl pro Röhrchen durchgeführt, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% (Gewicht/Volumen) Gelatine, 200 μM dNTP, 0,25 Einheiten Taq-Polymerase und 0,25 μM jedes Primers enthielt. In jedem Röhrchen wurde eine Kontrollamplifikation durchgeführt, und zwar ausgehend von 25 mM eines mittels PCR hergestellten 877 Basenpaaren großen β-Actin-DNA-Fragments und von den actinspezifischen Primern Act1 und Act2 (SEQ ID Nr. 58 und 59). Es wurden 30 Amplifikationszyklen durchgeführt, woran sich ein abschließender Elongationsschritt von fünf Minuten bei 72°C anschloß. Jeder Zyklus umfaßte einen einminütigen Denaturierungsschritt bei 94°C, einen einminütigen Hybridisierungsschritt bei 65°C und eine einminütige Elongationsdauer bei 72°C.
Die erhaltenen Produkte wurden mittels Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel getrennt, auf Nylonmembranen in einen alkalischen Puffer übertragen und gleichzeitig mit den Cα-C-(SEQ ID Nr. 57) und Act 3-(SEQ ID Nr. 60) Oligonukleotidsonden, die mit dem Enzym Polynukleotidyl-T4-Kinase mit 32P markiert worden waren, hybridisiert. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden lang bei 42°C durchgeführt, und zwar in einem Puffer, der 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhart's, 0,05 PO₄H₂Na und 100 μg denaturiertes Lachssperma-DNA pro ml enthielt. Die Membranen wurden anschließend zweimal bei Raumtemperatur fünf Minuten lang und einmal bei 50°C 30 Minuten lang mit 6 × SSC, 20 mM PO₄H₂Na gewaschen und anschließend wurde damit eine Autoradiographie angefertigt.
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Mit Hilfe der Actinkontrolle (Bande mit 877 Basenpaaren), kann man die Amplifikation in allen Näpfchen verifizieren. Unterhalb dieser Bande erscheint ein spezifisches Signal, dessen Größe der Größe der entsprechenden amplifizierten Fragmente entspricht, wobei jedes Fragment eine Länge aufweist, die dem Abstand zwischen der Plazierung des spezifischen Vα-Oligonukleotids und dem Cα-Primer entspricht.
Bei dem geprüften Probanden wird in 4 die bevorzugte Expression von gewissen Genabschnitten, die im Vergleich zu anderen definiert sind, nachgewiesen. So sind zum Beispiel die Unterfamilien Vα 27, 28 und 29 weniger stark vertreten als die Unterfamilien Vα 2, 3 und 6.
LITERATURANGABEN:

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SEQUENZBESCHREIBUNG

Claims

Nukleotidsequenz, die für eine variable Region der alpha-Kette menschlicher T-Zellen-Rezeptoren kodiert und die einer cDNA entspricht, die eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 umfaßt.
Nukleotidsequenz, die für eine variable Region der alpha-Kette menschlicher T-Zellen-Rezeptoren kodiert und die der Sequenz 1 bis 200 der SEQ ID Nr. 1 entspricht.
Peptide, die von den Nukleotidsequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 2 kodiert werden.
Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz, die für eines der Peptide nach Anspruch 3 kodiert, enthalten.
Nichtmenschliche Wirte, die mit einem Vektor nach Anspruch 4 transformiert sind.
Antikörper gegen die eine antigene Determinante von einem der Peptide nach Anspruch 3.
Antikörper nach Anspruch 6, wobei es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Fab-, Fab'- oder F(ab')2-Fragment eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 7.
Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 7 oder 8, an die ein nachweisbarer Marker und/oder mindestens ein therapeutisches Molekül gebunden sind.
Hybridome, die einen Antikörper nach Anspruch 7 produzieren.
Diagnostische Zusammensetzung, die einen oder mehrere monoklonale Antikörper oder deren Fragmente nach einem der Ansprüche 7 bis 9 umfassen.
Diagnostische Zusammensetzung, die einen oder mehrere monoklonale Antikörper oder deren Fragmente nach einem der Ansprüche 7 bis 9 umfassen.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, die Derivate umfaßt, die ein cytotoxisches Molekül oder ein Radioisotop enthalten.
Therapeutische Zusammensetzung, die mindestens eines der Peptide nach Anspruch 3 umfaßt.
Therapeutische Zusammensetzung, die Antisense-Oligonukleotide umfaßt, die der Sequenz eines Vα-Abschnitts nach Anspruch 2 entsprechen.
Verwendung von Nukleotidsequenzen mit ungefähr mindestens 17 Nukleotiden, die von der Sequenz eines Vα-Abschnitts gemäß Anspruch 2 umfaßt werden, als Primer für die Amplifikation von DNA.
Verwendung von Nukleotidsequenzen mit ungefähr mindestens 10 Nukleotiden, die von der Sequenz eines Vα-Abschnitts gemäß Anspruch 2 umfaßt werden, als Nachweissonde.
Oligonukleotid, das als Primer für die Amplifikation von DNA, die einer variablen Region der alpha-Kette von T-Zellen-Rezeptoren entspricht, verwendet werden kann, und das der Sequenz SEQ ID Nr. 49 entspricht.
Verwendung des Oligonukleotids nach Anspruch 18 als Primer für die Amplifikation von DNA, die einer variablen Region der alpha-Ketten des T-Zellen-Rezeptors entspricht.
Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz, die für einen Vα-Abschnitt des T-Rezeptors kodiert, oder von cDNA, die dessen Transkriptionsprodukt entspricht, in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt a) Amplifikation der DNA mit mindestens einem Primer-Paar, das von dem Oligonukleotid nach Anspruch 18 und einem Oligonukleotid, das zu dem Cα-Abschnitt gehört, gebildet wird, sowie b) Nachweisen der amplifizierten Sequenzen mit einer Cα-Sonde.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Amplifikation in Gegenwart eines Kontroll-Primer-Paars und den Nachweis mit Hilfe einer Kontrollsonde durchführt.
Diagnose-Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es a) mindestens ein Oligonukleotid nach Anspruch 18, b) einen Cα-Primer, c) eine Cα-Sonde umfaßt.
Diagnose-Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es a) mindestens ein Oligonukleotid nach Anspruch 18, b) einen Cα-Primer, c) ein Kontroll-Primer-Paar, d) eine Cα-Sonde e) eine Kontrollsonde umfaßt.