DE69231232T2 - Verfahren zur Immunoneutralisierung von nichtkastrierten männlichen Haustieren gegen LMRH und Peptide dafür - Google Patents
Verfahren zur Immunoneutralisierung von nichtkastrierten männlichen Haustieren gegen LMRH und Peptide dafürInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Schweine-, Rind-, Schaffleisch mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften, insbesondere Geruch, Geschmack und Zartheit, ausgehend von männlichen nichtkastrierten Haustieren.
- Die Erfindung betrifft auch ein dieses betreffendes Kit zur Impfung.
- Die Vorteile der Verwendung des unversehrten männlichen Tiers gegenüber dem kastrierten männlichen Tier bei der Mästung von zur Herstellung von Fleisch bestimmten Haustieren sind seit mehreren Jahrzehnten von wissenschaftlichen Tierzüchtern betont worden. Sie betreffen eine erhöhte Wachstumsrate, besonders bei Rindern und Schafen, eine bessere Nutzung der Futterration und einen magereren, aber stärker mit Muskelmasse ausgestatteten Körper bei allen Haustierarten (S. C. Seideman et al., J. of Animal Science, 1982, 55(4) 826-840, und M. Bonneau, INRA Prod. Anim., 1988, 1(2) 133-140).
- Die in den oben genannten Übersichten berichteten Hauptnachteile dieser Verwendung des unversehrten männlichen Tiers betreffen den unangenehmen Geruch und Geschmack bei männlichen Schweinen und Schafen, die geringe Zartheit des Fleisches unversehrter männlicher Rinder und Schafe und rechtfertigen die gegenwärtigen Praktiken der chirurgischen Kastration.
- In der Tat sind zwar die androgenen Steroide, darunter Androstendiol, Androstendion und Testosteron, die Bestandteile, welche die bei allen Haustierarten erwarteten Vorteile des schnelleren Wachstums und der besseren Nutzung der Futterration bestimmen, sie aber erweisen sich auch als verantwortlich für eine geringere Zartheit des Fleisches von unversehrten männlichen Rindern und Schafen. Die nicht androgenen Steroide oder die Derivate von 16-Androstenen, wie 5α- Androstenon (5α-Androsten-16-on-3) sind beim männlichen Schwein zum Teil für den unangenehmen Geruch und Geschmack des Fleisches einer bestimmten Anzahl unversehrter männlicher Schweine von der Pubertät an verantwortlich, wobei sie das Fleisch verschlechtern und seine Vermarktung im frischen Zustand verhindern.
- Skatol, ein von Tryptophan herrührendes Produkt und ein Produkt der Mikrobenflora im Darm, ist eine Verbindung, die zum Teil für den unangenehmen Geruch und Geschmack des Fleisches unversehrter männlicher Schweine verantwortlich ist. Seine Produktion hängt von Umweltfaktoren, der Ernährung und der Rasse ab. Seine Akkumulation im Fettgewebe ist beim Eber ganz entscheidend und hängt mit der Sekretion von Geschlechtssteroiden in den Gonaden zusammen.
- Es ist bereits experimentell versucht worden, die Entwicklung des männlichen Charakters beim jungen Tier oder die Sekretion testikulärer Hormone, insbesondere testikulärer Steroide, mittels aktiver oder passiver Immunoneutralisierung gegen diese oder gegen Hormone, die an ihrer Sekretion beteiligt sind, insbesondere Luteinisierendes Hormon oder LH (Luteinizing Hormone) und Gonadoliberin-Hormon (GnRH), das auch als Luteinizing Hormone Releasing Hormone (LHRH) bezeichnet wird, zu vermindern oder zu unterdrücken. Es sind Versuche am Schwein unternommen worden, den Anteil an 5α-Androstenon aus der Gruppe der 16-Androstene im Gewebe durch aktive gegen diese Verbindung gerichtete Immunisierung (E. D. Williamson et al., Liverstock Production Science, 1985, 12, 251-264) oder durch passive Immunisierung gegen dieselbe Verbindung (R. Claus, Immunization with Hormones in Reproduction Research, Hrsgb. Nieschlag, 1975) zu senken. Die Unterdrückung oder Verringerung der Sekretion von testikulären Steroiden lässt sich durch Immunoneutralisierung des für die entsprechende Art spezifischen gonadotropen Hormons LH (R. E. Falvo et al., J. Anim. Science, 1986, 63, 986-994) oder durch anti-LHRH- Immunoneutralisierung des endogenen LHRH angehen. Nur die aktive anti-LHRH-Immunisierung ist von verschiedenen Autoren vorgeschlagen worden. Beim Schwein wurde die Verringerung von α-Androstenon durch dieses Verfahren erzielt (A. Caraty und M. Bonneau, C. R. Acad. Sci. Paris 1986, 303, Folge III (16) 673-676; R. E. Falvo et al., J. Anim. Sci., 1986, 63, 986- 994).
- Beim Schaf schlägt B. D. Schanbacher (Am. J. Physiol., 1982, 242, E201-E205) die anti-LHRH-Immunisierung zur Verzögerung der Hodenentwicklung und zur Erzeugung einer Kastrationswirkung bei den männlichen Lämmern vor. Bei Rindern beschreibt P. S. Robertson (Vet. Rec., 1979, 105, 516-517) eine immunologische anti-LHRH-Kastration.
- Die bei Labortieren (Arimura et al., Endocrinology, 1973, 93, 1092-1103; Fraser, H. M., et al., J. Endocr. 1974, 63, 399-406; Makino, T., et al., Contraception, 1973, 8(2) 133-145; Carelli, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1982, 79, 5392-5395) und bei mehreren Haustierarten (Jeffcoate et al., Theriogenology, 1978, 10(4) 323-335); Robertson, I. S., et al., Veterinary Record., 1979, 105, 556; Schanbacher, B. D., Am. J. Physiol., 1982, 242, E201-E205) beschriebenen Versuche zur anti-LHRH-Immunoneutralisierung haben gezeigt, dass es möglich ist, einen Stillstand der Testosteronsekretion, eine Gewichtsrückbildung der Hoden und ihrer Anhangsdrüsen, einen Stillstand der Spermatogenese und, auf der Verhaltensebene, das Verschwinden der Libido zu erreichen.
- Diese Arbeiten haben zu dem Vorschlag geführt, auf eine frühzeitige Immunoneutralisierung, insbesondere anti-LHRH- Immunoneutralisierung, anstelle der herkömmlichen chirurgischen Kastration am Ende der Aufzucht zurückzugreifen.
- Im US-Patent Nr. 4,556,555 ist ein Verfahren zur passiven Immunisierung von Tieren vor ihrer Pubertät mit einem An tiserum, das gegen Gonadotropin gerichtete Antikörper enthält, beschrieben.
- Die Internationale Patentanmeldung WO 90/11298 beschreibt ein Verfahren zur anti-LHRH-Immunisierung bei der Geburt mittels 2 in Tandem an ein Trägerprotein gekuppelten LHRH-Sequenzen zur Verbesserung der Fleischqualität beim Schwein.
- Die Internationale Patentanmeldung WO 88/00056 beschreibt ein Verfahren zur immunologischen anti-LHRH- Kastration zur Verbesserung des sozialen und sexuellen Verhalten der männlichen Tiere als Ersatz für die chirurgische Kastration, welche die Wachstumsrate beeinflusst. Die Stiere werden im Alter von 8 bis 40 Wochen geimpft und erhalten anschließend mehrere Wiederholungen.
- Ein unter dem Handelsnamen VAXSTRATE von der australischen Firma WEBSTERS vertriebener anti-LHRH-Impfstoff wird bei der Kuh eingesetzt.
- R. E. Falvo et al. (J. Anim. Sci. 1986, 63: 986-994) haben mehrere Gruppen von Ebern mit LHRH-menschliches Serumglobulin-Konjugaten und komplettem Freund'schen Adjuvans oder mit Muramylpeptid als Adjuvans immunisiert. Die Autoren haben nach Impfung und mehreren Wiederholungen erhöhte anti-LHRH- Antikörpertiter beobachtet, wobei aber mehrere Wiederholungen durchgeführt werden mussten, um den Antikörpertiter erhöht zu halten.
- I. S. Robertson beschreibt ein Verfahren zur Immunisierung mit LHRH, das an Tetanus-Anatoxin oder Thyreoglobulin konjugiert ist, und legt nahe, dass der immunologische Ansatz auf einer verzögerten Kastration beruht mit dem Vorteil, dass man hinsichtlich der Gewichtszunahme damit warten kann. Er schließt jedoch, dass entweder hinsichtlich des Verfahrens selbst oder, da Freund'sches Adjuvans in der Praxis verboten ist, hinsichtlich des Adjuvans' noch Anstrengungen unternom men werden müssen, damit ein in der Praxis anwendbares Kastrationsverfahren erhalten wird.
- Schließlich haben A. Caraty und M. Bonneau (C. R. Acad. Sci. Paris, S. 303, Folge III, Nr. 16, 1986) eine anti-LHRH- Immunisierung beim männlichen Schwein durchgeführt. Die Autoren legen nahe, dass man durch Blockade der Steroidproduktion 2 bis 3 Wochen vor der Schlachtung die größeren Möglichkeiten dieses Tiertyps zur Fleischproduktion ausnutzen und die Probleme aufgrund der Akkumulation von Androsteron im Fettgewebe vermeiden kann. Sie schließen jedoch, dass bedeutende Fortschritte in den Immunisierungstechniken gemacht werden müssen, bevor die aktive anti-LHRH-Immunisierung als geeignete Technik bei der Schweineaufzucht vorgeschlagen werden kann.
- Überdies verursacht die verzögerte Immunoneutralisation in der Praxis das bedeutende Problem der Unschädlichkeit der Behandlung und insbesondere von lokalen Reaktionen, die von den Impfstoffen, insbesondere ölhaltigen Impfstoffen, verursacht werden, mit den daraus resultierenden Risiken des Zurückweisens oder der Herabstufung des Fleisches.
- Die Verbesserung der organoleptischen Eigenschaften bei Rindern und Schafen wird nicht vorgeschlagen.
- Die Anmelderin hat gerade ein industriell anwendbares Verfahren gefunden, mit dem die organoleptischen Eigenschaften des Fleisches von Tieren verbessert werden können.
- So ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Schweine-, Rind-, Schaffleisch mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften, insbesondere Geruch, Geschmack und Zartheit, wobei männliche nichtkastrierte Haustiere gemästet werden, eine aktive Immunoneutralisierung mit einem anti-LHRH-Impfstoff bei den Tieren vorgenommen wird, dadurch gekennzeichnet, dass man die mit dem männlichen Charakter der Tiere einhergehenden Vorteile praktisch bis zu ihrer Schlachtung dadurch erhält, dass ihnen vor oder während des Mästzeitraums der Tiere einmal ein anti- LHRH-Impfstoff verabreicht wird, der so konzipiert ist, dass er eine erste Immunantwort mit schwacher Intensität ohne merkliche oder messbare Wirkung auf die Sekretion von Gonadensteroiden hervorruft, und dass man ihnen nur kurz vor der Schlachtung einen anti-LHRH-Impfstoff verabreicht, um eine anti-LHRH-Immunoneutralisation zu induzieren, welche die Unterdrückung oder signifikante Senkung der Sekretion von Steroiden hervorruft.
- Der zuerst verabreichte Impfstoff und der kurz vor der Schlachtung verabreichte Impfstoff werden unter den Emulsionsimpfstoffen und den Impfstoffen mit wässrigem Adjuvans ausgewählt.
- Nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird dem Tier ein anti-LHRH-Impfstoff, vorzugsweise in Emulsion, vorzugsweise während oder vor dem Mästzeitraum des Tiers verabreicht, dann wird kurz vor der Schlachtung des Tiers erneut ein anti-LHRH-Impfstoff verabreicht. Man kann mit zwei getrennten Verabreichungen oder auf ansteigende Weise durch ein Verfahren zur kontrollierten Freisetzung vorgehen.
- Beim Schwein ist es besonders vorteilhaft, den anti- LHRH-Impfstoff vor der Schlachtung mit einem Adjuvans des wässrigen Typs, insbesondere mit Aluminiumhydroxidgel und/oder Saponin, zu verabreichen.
- Diese Verabreichung erfolgt vorzugsweise 15 bis 21 Tage vor der Schlachtung.
- Im Gegensatz dazu erfolgt beim Rind und gegebenenfalls beim Schaf die der Schlachtung vorausgehende Verabreichung vorzugsweise mit einem Emulsionsadjuvans und vorzugsweise 1 bis 2 Monate vor der Schlachtung. Diese Verabreichung wird vorzugsweise mindestens 4 Wochen und vorzugsweise mehrere Monate nach der ersten Verabreichung durchgeführt.
- In allen Fällen ist für den Emulsionsimpfstoff, der zur ersten Verabreichung und, beim Rind, zur zweiten Verabreichung bestimmt ist, bevorzugt, dass der Impfstoff in Form einer Wasser-in-Öl-Emulsion vorliegt. Dennoch werden andere Emulsionsformen in Betracht gezogen.
- Dieser Impfstoff, der vorzugsweise eine Emulsion ist, ist erfindungsgemäß für die Induktion einer ersten Immunantwort mit schwacher Intensität ohne merkliche oder messbare Wirkung auf die Sekretion von Gonadensteroiden konzipiert. Die Formulierung in einer Emulsion ist bevorzugt, aber andere Formulierungen sind geeignet, wenn sie die gleiche Wirkung hervorrufen.
- Die der Schlachtung vorausgehende Verabreichung wird mit einem Impfstoff durchgeführt, der so formuliert ist, dass er in diesem Moment die Unterdrückung oder signifikante Verringerung der Sekretion von Steroiden ohne lokale oder allgemeine nachteilige Reaktion, die dem Aussehen oder der Qualität des Fleisches schaden könnte, erzeugt.
- Vorzugsweise wird insbesondere beim Schwein das Konjugat in wässriger Lösung den beiden folgenden Formulierungen unterworfen: die erste in stabiler Wasser-in-Öl-Emulsion, hergestellt aus einem Gemisch tierischer oder pflanzlicher hochgereinigter Mineralöle und nichtionischer Tenside, zur Induktion einer Immunantwort mit schwacher Intensität ohne messbare Wirkung auf die Sekretion von Gonadensteroiden, die zweite, nicht emulgierte, mit Aluminiumhydroxidgel und Saponin, zur Auslösung einer schnellen und intensiven Immunreaktion, welche sich durch die Produktion von neutralisierenden anti- LHRH-Antikörpern auszeichnet, die zur Erzielung der Verringerung oder Unterdrückung von Gonadensteroiden und zur Verringerung des mit Skatol aus dem Darm einhergehenden Transports ausreichen.
- Im Gegensatz zu der mittels komplettem oder inkomplettem Freund'schen Adjuvans erhaltenen Emulsion ist die verwendete eine stabile Emulsion, welche die Herstellung eines gebrauchsfertigen Impfstoffs ermöglicht. Die entzündliche Hautreaktion bleibt sehr schwach und auf die Verabreichungsstellen der beiden Impfformulierungen beschränkt. Sie äußert sich bei äußerer Untersuchung in Form gut abgegrenzter Pocken. Ihre interne Entwicklung bleibt auf die oberflächliche Dermis beschränkt. Sie verschwindet, ohne ein bei der Schlachtung der Tiere sichtbares Granulom zurückzulassen.
- Gemäß einer anderen Ausführungsform des Verfahrens werden dem Tier einige Tage vor der Schlachtung, insbesondere 5 bis 15 Tage vorher, hyperimmunes anti-LHRH-Serum oder -Plasma oder monoklonale anti-LHRH-Antikörper verabreicht.
- Die passive anti-LHRH-Immunisierung, welche die Verringerung und sogar die Unterdrückung der Sekretion von androgenen und nicht androgenen Steroiden bewirkt, ist durch intramuskuläre Verabreichung von hyperimmunem Pferdeplasma erzielt worden. Wenn sie in einer ausreichenden Menge durchgeführt wird, wie durch den LHRH-Antikörpertiter im Serum des geimpften Tieres gemessen wird, bewirkt sie die Verringerung von Testosteron im Plasma vom 3. Tag an; dieses wird in den folgenden 12 Tagen auf diesem Niveau gehalten und reicht zur Senkung von Androsteron im Gewebe auf unter 0,50 Mikrogramm/g aus, einen Wert, bei dem der unangenehme Geruch und der besondere Geschmack von Fleisch des männlichen Schweins vom Konsumenten nicht mehr wahrgenommen wird. Dieses passive Immunisierungsverfahren hat gezeigt, dass die Aufrechterhaltung der signifikanten Verringerung von Testosteron während 12 Tagen ausreicht, um die Konzentration von Androsteron im Gewebe unter die festgelegte Grenze zu senken. Diese passive Immunisierung kann unter Einsatz monoklonaler, von Schweine- Hybridomas oder -Heterohybridomas sezernierter anti-LHRH- Antikörper durchgeführt werden.
- Die Verabreichungsweise dieser Formulierungen ist vorzugsweise transkutan, insbesondere mittels einer nadellosen Druckstrahl-Injektionsvorrichtung, insbesondere gemäß der Patentanmeldung FR-A-2, 652,257.
- Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den entscheidenden Vorteil, dass es völlige Unschädlichkeit bereitstellt und insbesondere keine lokalen Reaktionen hervorruft, welche eine Herabstufung des Fleisches nach sich ziehen würden.
- Die entzündliche Hautreaktion bleibt auf die Verabreichungsstellen der beiden Impfformulierungen beschränkt. Sie äußert sich bei äußerer Untersuchung in Form gut abgegrenzter Pocken. Ihre interne Entwicklung bleibt auf die oberflächliche Dermis beschränkt. Sie verschwindet, ohne ein bei der Schlachtung der Tiere sichtbares Granulom zurückzulassen. Die auf die Zeit und die Stellen der Verabreichung beschränkte Entzündungsreaktion demonstriert die Toleranz der beiden Impfformulierungen und wird durch deren transkutane Verabreichung mittels eines nadellosen Injektors erhalten.
- Die anti-LHRH-Immunisierung erfordert die Konjugation des LHRH-Peptids oder eines Fragments des LHRH-Peptids, die unter ihren wirtschaftlichen Einsatzbedingungen nicht immunogen sind, an ein als Träger bezeichnetes immunogenes Protein mittels einer kovalenten Bindung.
- Natürliches oder synthetisches LHRH oder GnRH besteht aus 10 Aminosäuren, die vom Aminoterminus zum Carboxyterminus gemäß der folgenden Formel von 1 bis 10 numeriert werden:
- Übereinkunftsgemäß stellen diese Symbole dar: pGlu, Pyroglutaminsäure; His, Histidin; Trp, Tryptophan; Ser, Serin; Tyr, Tyrosin; Gly, Glycin; Leu, Leucin; Arg, Arginin; Pro, Prolin.
- Die von verschiedenen Autoren beschriebenen immunogenen anti-LHRH-Konjugate lassen sich bezüglich des Haptens herstellen mit:
- a) gesamtem oder in einem oder mehreren seiner Abschnitte modifiziertem LHRH zur Gewinnung der gewünschten aminoterminalen, carboxyterminalen oder dazwischen liegenden Konjugation,
- b) mit einem seiner aus 5 bis 7 Aminosäuren bestehenden, modifizierten oder nicht modifizierten Peptidfragmente zur Gewinnung der gewünschten aminoterminalen, carboxyterminalen oder dazwischen liegenden Konjugation,
- c) mit einem Agonisten, welcher eine substituierte Aminosäure, meist 6, beinhaltet, zur Gewinnung einer Konjugation im mittleren Abschnitt.
- Bezüglich des Trägerproteins sind Rinderserumalbumin, menschliches Serumalbumin, Thyreoglobulin, Ovalbumin, menschliche oder Pferde-Globuline verwendet worden.
- So beschreibt die Europäische Patentanmeldung EP-A-181 236 immunogene Konjugate, umfassend ein Nonapeptid oder Decapeptid, welches eine den letzten 8 Aminosäuren des LHRH- Moleküls entsprechende Sequenz beinhaltet, an die auf aminoterminaler Seite ein Lysin oder eine Cystein-Lysin-Sequenz angefügt ist.
- Andererseits offenbart die Patentanmeldung WO 88/05308 Konjugate, die mittels Fragmenten von 5, 6 oder 7 aufeinanderfolgenden Aminosäuren des natürlichen Moleküls hergestellt sind, wobei jedes Fragment N-terminal Pyroglutaminsäure oder carboxyterminal Glycinamid beinhaltet und an die eine zusätzliche Aminosäure oder Aminosäuresequenz an dem zum immunogenen Protein gelegenen Ende angefügt werden kann.
- Die verwendeten Konjugationsmittel lassen sich in drei große Kategorien einteilen: Aktivierungsmittel, homobifunktionelle Mittel, heterobifunktionelle Mittel. Während bei den Aktivierungsmitteln die Bindung zwischen den beiden Molekülen zwischen zwei bereits vorhandenen Funktionen erfolgt, wird die Bindung bei den anderen mittels eines als Ligand bezeichneten Kohlenwasserstoffrestes durchgeführt.
- Unter den Aktivierungsmitteln lässt sich Periodsäure nennen, die zur Oxidation von Oligosaccharidresten von Glycoproteinen in Aldehyde, mit denen schließlich die Aminogruppen des anderen an der Konjugation teilnehmenden Moleküls reagieren, eingesetzt wird.
- Carbodiimide sind Aktivierungsmittel, die weitverbreitet zur Kupplung von Antigenen an Proteine eingesetzt werden. Unter ihnen wird zweifellos am häufigsten N-Ethyl-N'- (dimethylamino-3-propyl)carbodiimidchlorhydrat (EDC) verwendet, welches die Durchführung der Reaktion im wässrigen Medium ermöglicht. Ihre Wirkung führt zur Bildung einer Amidbindung zwischen einer Carboxylgruppe eines in Form eines O- Alkylisoharnstoffs aktivierten Protein-Zwischenproduktes und einer Aminogruppe auf einem anderen Molekül. Ihr Vorteil liegt in der Einfachheit ihrer Verwendung.
- Homobifunktionelle Mittel sind Moleküle, die zwei durch eine Kohlenwasserstoffkette voneinander getrennte identische reaktive Gruppen besitzen. Unter ihnen wird Glutaraldehyd genannt, das mit zwei primären Aminogruppen reagiert, Alkyl- oder Arylbisisothiocyanate, welche mit primären Aminen und Thiolen reagieren, Bisdiazobenzidin, welches an die aromatischen Tyrosinreste gekuppelt wird. Zur Erinnerung werden Bismaleinimide und Bisamidinate genannt. Der Hauptnachteil der homobifunktionellen Mittel ist, dass sich die Natur der gebildeten Konjugate schlecht einstellen lässt, weil diese Mit tel mit zwei gleichartigen Molekülen reagieren und zur Bildung von Oligomeren oder Polymeren führen können.
- Um dies zu beheben, haben Chemiker die heterobifunktionellen Mittel eingeführt, die zwei Gruppen mit unterschiedlichen Spezifitäten aufweisen. Allgemein ist eine dieser Gruppen ein N-Hydroxysuccinimidester, der unter milden Bedingungen mit freien Amingruppen von Proteinen reagiert und einerseits das N-Hydroxysuccinimid und andererseits das Protein ergibt, das über eine kovalente Amidbindung das Kupplungsmittel trägt, an dem sich die zweite Funktion befindet. Gewöhnlich kann diese mit Thiolen auf dem zu kuppelnden Molekül reagieren, wobei diese Thiole entweder in Form von Cysteinresten (die Bestandteile oder, bei Peptiden, absichtlich während der Synthese eingebracht sein können) von vornherein auf dem Molekül vorliegen oder durch Mittel, wie Imino-2-thiolan oder N-((Pyridyl-2)-dithio-3-propanoyloxy)-succinimid (SPDP) nach Reduktion beigesteuert werden.
- Unter den vorstehend dargelegten Möglichkeiten wird die Verwendung von gesamtem LHRH bevorzugt. In diesem Fall ist das natürliche LHRH aufgrund des Vergleichs der immunogenen Aktivität von mit den beiden Peptiden hergestellten Konjugaten gegenüber Agonisten, wie (D-Lys&sup6;)-LHRH, bevorzugt.
- Carbodiimid ist gegenüber Glutaraldehyd als Mittel zur Konjugation von LHRH in natürlicher Form an Alphaglobulin bevorzugt.
- Menschliches oder Pferde-Globulin, Fraktion IV-1 oder IV-4, ist gegenüber menschlichem oder Rinder-Serumalbumin bevorzugt.
- Vorzugsweise umfassen die Impfstoffe den gleichen Wirkstoff, der vorzugsweise ein LHRH-Alphaglobulin-Konjugat umfasst; LHRH liegt vorzugsweise in natürlicher Form vor, und das Alphaglobulin stammt von Mensch oder Pferd, insbesondere aus den Fraktionen IV-1 und/oder IV-4. Das Konjugat wird vor zugsweise durch Zugabe von 0,5 bis 2 Volumina einer 2,5%igen N-Ethyl-N'-(dimethylamino-3-propyl)-carbodiimidchlorhydrat- (EDC-) Lösung in 0,9% NaCl zu einem Volumen eines Gemischs aus 2 bis 20 mg/ml Alphaglobulin und LHRH in Lösung in 0,9% NaCl erhalten. Nach Rühren wird das Gemisch über Nacht stehen gelassen, dann durch Gelpermeationschromatographie gereinigt.
- Bezüglich des Trägerproteins können Serumalbumine, insbesondere menschliches oder Rinder-Serumalbumin, Thyreoglobulin, Ovalbumin, menschliche oder Pferde-Globuline, Anatoxine, insbesondere Tetanus-Anatoxin, verwendet werden.
- Das bei männlichen Schweinen beobachtete Überwiegen der Immunantwort auf den carboxyterminalen Abschnitt des LHRH- Peptids, konjugiert mittels Carbodiimid, oder seines Agonisten [D-Lys&sup6;]-LHRH, konjugiert mittels SPDP an Alphaglobulin, führte zur Definition eines immunogenen anti-LHRH- Konjugates unter Verwendung eines vorteilhaften, den Carboxyterminus von LHRH aufweisenden Peptids.
- Die Anmelderin hat gefunden, dass es sehr vorteilhaft war, ein Konjugat mit einem die 8 letzten Aminosäuren von LHRH umfassenden Peptid zu verwenden, zum Beispiel ein Decapeptid der Formel:
- das eine hohe immunogene Aktivität ohne die hormonelle Aktivität des natürlichen LHRH aufweist.
- So sieht die Erfindung die Verwendung von Konjugaten vor, umfassend das Peptid (3-10), gekuppelt an ein immunogenes Trägerprotein aus den vorstehend genannten, wobei Ovalbumin und Pferde-Alphaglobulin, insbesondere die Fraktionen IV- 1 und/oder IV-4, bevorzugt sind.
- Bei der Erfindung ist Carbodiimid gegenüber Glutaraldehyd und heterobifunktionellen Mitteln als Mittel zur Konjuga tion des Peptids LHRH (3-10), insbesondere an Pferde-Alphaglobulin oder Ovalbumin, bevorzugt.
- Bei der bevorzugten Herstellung des Konjugates werden LHRH (3-10) und das Trägerprotein, Ovalbumin oder Alphaglobulin, jeweils zu 2 bis 40 mg pro ml in einem Puffer aus 0,1 M NaCl-0,1 M (N-Morpholino)-2-ethansulfonsäure gelöst. Dann werden 0,5 bis 2 Volumina einer Lösung von 2,5% N-Ethyl-N'- (dimethylamino-3-propyl)-carbodiimid im gleichen Puffer zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 1 N Natronlauge eingestellt. Nach Rühren wird das Gemisch über Nacht stehen gelassen, dann mittels Gelpermeationschromatographie gereinigt, wobei das nicht gekuppelte LHRH (3-10), restliches Carbodiimid und seine Hydrolyseprodukte entfernt werden.
- Auch die passive anti-LHRH (3-10)-Immunisierung gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ist eine Aufgabe der Erfindung.
- Eine Aufgabe der Erfindung ist auch ein Kit zur anti- LHRH-Impfung, das sich zur Produktion von Fleisch mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften, ausgehend von männlichen, nicht-kastrierten Schweinen, Rindern oder Schafen verwenden lässt, wobei das Impfkit umfasst:
- - einen anti-LHRH-Impfstoff zur ersten Verabreichung vor oder während der Mästphase der Tiere, der so konzipiert ist, dass er eine erste Immunantwort mit schwacher Intensität, ohne merkliche oder messbare Wirkung auf die Sekretion von Gonadensteroiden hervorruft, so dass die Entwicklung des männlichen Charakters der Tiere ermöglicht wird, und
- - einen anti-LHRH-Impfstoff zur Verabreichung nach dem ersten Impfstoff und nur kurz vor der Schlachtung, wobei dieser Impfstoff so konzipiert ist, dass er eine anti-LHRH- Immunoneutralisation induziert, welche die Unterdrückung oder signifikante Senkung der Sekretion von Steroiden hervorruft.
- Ein Merkmal der Erfindung sind somit Kits, die zusammen in einer Verpackung eine gleiche Anzahl an Dosen des vor der Schlachtung zu verabreichenden Impfstoffs und des Impfstoffs für die erste Injektion beinhalten. Vorzugsweise sind diese Impfstoffe in verringertem Volumen und mit erhöhter Konzentration an die Verabreichung mittels Transkutanstrahl, beispielsweise nach der vorstehend genannten französischen Patentanmeldung, angepasst.
- Die Erfindung wird nun einerseits mittels Experimenten, die mehrere erfindungsgemäße Produkte und Impfverfahren vergleichen, und andererseits mittels Experimenten, welche das Überwiegen der Immunantwort von männlichen Schweinen auf den carboxyterminalen Abschnitt des LHRH-Peptids gezeigt haben, sowie eines Experiments zur erfindungsgemäßen anti-LHRH- Impfung männlicher Schweine eingehender beschrieben.
- A. Das Konjugat, bei dem der längste carboxyterminale Abschnitt des LHRH-Peptids intakt bleibt, hat die höchste immunogene Aktivität, und das Konjugat auf der Basis von LHRH mit der natürlichen Formel wird gegenüber dem mit dem Agonisten (D-Lys&sup6;)-LHRH erhaltenen bevorzugt ausgewählt
- Der Vergleich der Aktivität der beiden anti-LHRH- Impfstoffe aus Konjugaten zwischen LHRH in natürlicher Form (B1 und B2) oder (D-Lys&sup6;)-LHRH (A1 und A2) und menschlichem Albumin, wobei die Konjugate durch Carbodiimid in wässriger Phase bzw. SPDP erhalten wurden, zu einer Öl-in-Wasser- Emulsion verarbeitet und auf intramuskulärem Weg an Schweine sowie auf subkutanem Weg an Ratten verabreicht wurden, führt zu den nachstehenden Schlussfolgerungen:
- - Höchste Aktivität des Impfstoffs auf der Basis von LHRH in natürlicher Form: Eine kleinere Menge an LHRH-Peptid- Konjugat als die des (D-Lys&sup6;)-LHRH-Peptid-Konjugats zur Rekrutierung einer höheren Anzahl an Tieren mit Immunantwort (Tabellen 1 und 3).
- - Die Dosiswirkung zeigt die sich anhand der Rekrutierung einer höheren Anzahl an Tieren mit Immunantwort aufgrund des gleichen Konjugats (Tabelle 3).
- Die Herstellung von (D-Lys&sup6;)-LHRH-Albumin-Konjugaten erfolgt in drei Schritten: Herstellung von (N-(Pyridyl-2)- dithio-3-propanoyl-D-Lys&sup6;)-LHRH, Herstellung von N-(Mercapto- 3-propanoyl)-Albumin, dann Kupplung.
- (Nε-(Pyridyl-2)-dithio-3-propanoyl-D-Lys&sup6;)-LHRH wird hergestellt, indem man einen Überschuss SPDP mit LHRH in wässriger Lösung (6 mol SPDP pro mol LHRH) reagieren lässt und dann, nach einer Nacht bei 4ºC, das erhaltene Produkt abzentrifugiert. Dieses wird in 8 M Harnstoff gelöst, und die vorhandenen (Pyridyl-2)-dithio-Gruppen werden bestimmt.
- N-(Mercapto-3-propanoyl)-Albumin wird durch Einwirkung von 0,2 mmol SPDP auf 1 g in 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer gelöstes menschliches Albumin und dann, nach einer Nacht Kontakt bei 4ºC und Ansäuerung auf pH-Wert 6, durch Reduktion mittels Dithiothreitol erhalten. Dann wird es durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Die Menge an Thiolen und an Proteinen ergibt das durchschnittliche Ausmaß der Substitution.
- Die Kupplung erfolgt, indem eine (Pyridyl-2)-dithio- Gruppe pro 1,25 Thiolgruppen eingesetzt wird. Der pH-Wert wird auf 7-7,5 gebracht, nach einer Stunde wird dann die Ausbeute durch Messung des freigesetzten Pyridin-2-thions bestimmt.
- Daraus wird das durchschnittliche Ausmaß der Substitution ermittelt. Schließlich wird das Konjugat mittels Chromatographie gereinigt und durch Ultrafiltration aufkonzentriert.
- Zu 300 mg LHRH und 300 mg menschlichem Albumin, gelöst in 30 ml 0,9% NaCl, werden 1000 mg N-Ethyl-N'-(dimethylamin- 3-propyl)-carbodiimidchlorhydrat, frisch gelöst in 40 ml 0,9% NaCl, gegeben. Nach Rühren wird das Gemisch über Nacht vor Licht geschützt bei Umgebungstemperatur belassen. Dann wird es einer Chromatographie auf Sephadex-G-50-Gel unterworfen; die dem Konjugat entsprechenden Fraktionen werden aufbewahrt, gegebenenfalls eingeengt und eingefroren.
- Ausgehend von Fraktionen, welche nicht gekuppeltes LHRH enthalten, wird die Menge an nicht gekuppeltem LHRH und daraus das mittlere Ausmaß an Konjugation bestimmt. Dieses ist reproduzierbar und variiert von 8 bis 10 mg LHRH, die pro 100 mg Albumin gekuppelt werden.
- Ausgehend von UV-Spektren des Konjugats vor und nach der Chromatographie werden die Ausbeuten an Konjugat nach der Chromatographie und daraus die Menge (oder Konzentration) des LHRH-Konjugats bestimmt.
- Der Antikörpertiter wird gemäß der von Jeffcoate et al., Acta Endocr., Kopenh., 1974, 75: 625-635 beschriebenen Technik bestimmt.
- Testosteron wird direkt in Plasma mittels einer RIA- Technik unter Verwendung des Radioliganden Testosteron-C19- carboxymethylether-(¹²&sup5;I)-histamin gemessen.
- Die Bindung an markiertes Peptid wird nach Markierung verschiedener Peptide mit Iod-125 gemäß Copeland et al., Endocr., 1979, 104: 1504-1506 und Titration gemäß der von Jeffcoate et al., Acta Endocr., Kopenh., 1974, 75, 625-635 beschriebenen Technik bestimmt.
- Tabelle Nr. 1: anti-LHRH-Antikörperreaktion, gemessen durch den Anteil der Bindung von ¹²&sup5;Iod-markiertem LHRH.
- Tabelle Nr. 2: Wirkung der anti-LHRH-Immunisierung auf die Testosteronkonzentration im Plasma.
- Posologie
- Impfstoffe A1: 50 ug (D-Lys&sup6;)-LHRH-Konjugat
- B1: 12 ug LHRH-Konjugat
- Tabelle Nr. 3: anti-LHRH-Antikörperreaktion, gemessen durch den Anteil der Bindung von ¹²&sup5;Iod-markiertem LHRH.
- Posologie
- Impfstoffe A1: 0,5 mg (D-Lys&sup6;)-LHRH-Konjugat
- A2: 6 mg (D-Lys&sup6;)-LHRH-Konjugat
- B1: 0,15 mg LHRH-Konjugat
- B2: 1,20 mg LHRH-Konjugat Tabelle 1 anti-LHRH-Antikörperreaktion, gemessen über den Anteil der Bindung von ¹²&sup5;Iod-markiertem LHRH Untersuchung von Antikörpern (%B&sub0;/T) im Serum (1/100) bei der Ratte Tabelle 2 Wirkung der anti-LHRH-Immunisierung auf die Testosteronkonzentration im Plasma Bestimmung von Testosteron im Plasma (ng/ml) bei der Ratte Tabelle 3 anti-LHRH-Antikörperreaktion, gemessen über den Anteil der Bindung von ¹²&sup5;Iod-markiertem LHRH Untersuchung von anti-LHRH-Antikörpern im Serum (1/50 verd.)
- A2. - Vergleichstest von zwei anti-LHRH-Impfstoffen, bestehend aus einem LHRH-α-Globulin-Konjugat mittels Carbodiimid bzw. einem (D-Lys&sup6;)-LHRH-α-Globulin-Konjugat mittels SPDP, die zu einer Öl-in-Wasser-Emulsion verarbeitet und auf intramuskulärem (IM) oder transkutanem (ID) Weg an Schweine verabreicht worden sind
- Das im Beispiel A1 beschriebene Verfahren wird genau auf die gleiche Weise eingesetzt, wobei aber 10 mg/ml Albumin durch 6 mg/ml α-Globulin ersetzt werden.
- Die Gesamtausbeute an gekuppeltem (D-Lys&sup6;)-LHRH ist etwa 45 bis 50%.
- Der Grad der Substitution von α-Globulin, d. h. das Ausmaß der Konjugation, lässt sich außerdem nach Wunsch modifizieren, indem die Konzentrationen von SPDP und/oder α- Globulin bei der Präparation von MP-α-Globulin eingestellt werden.
- Das im Beispiel A1 beschriebene Verfahren wird genau auf die gleiche Weise eingesetzt, wobei aber menschliches Albumin durch menschliches α-Globulin ersetzt wird. Das Ausmaß der Konjugation beträgt 24 bis 28 mg LHRH, gebunden pro 100 mg menschliches α-Globulin.
- A2.3 - Die Wirksamkeit des Impfstoffs auf der Basis des LHRH- α-Globulin-Konjugats mittels Carbodiimid ist höher als die des anderen. Die Wirksamkeit wird ausgedrückt durch die Anzahl Tiere, die vollständiges Verschwinden des Testosterons im Plasma aufweisen (Tabelle 4). Tabelle 4
- Dies wird durch Vergleich der prozentualen Bindung von anti-LHRH- und anti-(D-Lys&sup6;)-LHRH-Seren durch zwei markierte LHRH-Fragmente bestimmt, LHRH (3-10), dessen aminoterminaler Abschnitt deletiert ist, bzw. LHRH (1-10) in Form der freien Säure, wobei der Amidanteil des natürlichen carboxyterminalen Abschnitts deletiert ist. Diese beiden Fraktionen erkennen insbesondere einerseits die gegen den carboxyterminalen bzw. andererseits die gegen den aminoterminalen Abschnitt gerichteten Antikörper.
- Das Überwiegen der Reaktion auf den carboxyterminalen Abschnitt des Peptids zeigt sich durch eine Anzahl von Tieren mit Antikörpern, die unter Ausschluss der Bindung der freien LHRH-Säure nur das LHRH-Peptid (3-10) binden (10/58 für das anti-LHRH-Serum und 3/10 für das anti-(D-Lys&sup6;)-LHRH-Serum).
- Kein Serum zeigte 100% Bindung der Fraktion der freien LHRH-Säure, was einer ausschließliche Erkennung des aminoterminalen Abschnitts entsprechen würde.
- Die am häufigsten auftretenden gemischten Reaktionen zeigen, dass der aminoterminale Abschnitt durch die anti-(D- Lys&sup6;)-LHRH-Seren besser als durch die anti-LHRH-Seren. Bei letzteren erkennen nur 3 Seren von 58 den aminoterminalen Ab schnitt zu mehr als 40%, im Gegensatz zu 4 von 10 beim anti- (D-Lys&sup6;)-LHRH-Serum.
- B - Das mittels Carbodiimid hergestellte LHRH-α-Globulin- Konjugats hat eine höhere immunogene Aktivität als das mit Glutaraldehyd hergestellte Konjugat
- Zu 10 mg LHRH und 50 mg menschlichem α-Globulin (Serva), gelöst in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, werden tropfenweise während eines Zeitraums von 30 min 2,5 ml einer 10 mg/ml Glutaraldehydlösung gegeben, wobei nach jeder Zugabe leicht gerührt wird. Nachdem das Gemisch 2,5 Std. bei Umgebungstemperatur stehengelassen worden ist, wird die Reaktion durch Zugabe von 25 mg Natriumbisulfit, gelöst in 0,5 ml Wasser, abgestoppt. Das Konjugat wird bei 4ºC gegen einen Puffer aus 150 mM NaCl-10 mM Phosphat, pH-Wert 7,5, dialysiert, dann durch Ultrafiltration eingeengt.
- B.2 - Vergleichstest von mittels gleicher Mengen LHRH- Konjugat formulierten anti-LHRH-Impfstoffen am Schwein. Die Wirksamkeit ist ausgedrückt durch die Anzahl Tiere, die vollständiges Verschwinden des Testosterons im Plasma aufweisen (Tabelle 7). Tabelle 7
- C - Das Konjugat unter Verwendung von menschlichem α-Globulin hat eine höhere immunogene Aktivität als das Konjugat unter Verwendung von menschlichem Serumalbumin
- Die Wirksamkeit ist ausgedrückt durch die Anzahl Tiere, die vollständiges Verschwinden des Testosterons im Plasma aufweisen (Tabelle 8). Tabelle 8 Experimente an Schweinen - Intramuskuläre Injektion
- D - Die immunogene Aktivität des Konjugats unter Verwendung von Pferde-α-Globulin, Fraktion IV-1, ist gleich der des Konjugats unter Verwendung von menschlichem α-Globulin
- Das im Beispiel A1 beschriebene Verfahren wird genau auf die gleiche Weise eingesetzt, wobei aber menschliches Albumin durch Pferde-α-Globulin (Fraktion IV-1) ersetzt wird.
- D.2 - Verabreichung eines Impfstoffs in einer Dosis von 12 ug LHRH, konjugiert an menschliches oder Pferde-α-Globulin, in 2 Wiederholungen im Abstand von 4 Wochen an Ratten auf subkutanem Weg Tabelle 9 Experimente an Ratten
- E - Höhere Adjuvansaktivität der erfindungsgemäßen Wasser-in- Öl-Emulsion gegenüber anderen Emulsionen (Tabelle 10)
- Experimente an Schweinen unter Verwendung des gleichen Konjugats aus LHRH und menschlichem α-Globulin mittels Carbodiimid, verabreicht in gleicher Dosis im gleichen Volumen auf transkutanem Weg an 5 Stellen
- Die untersuchten Emulsionen sind: eine flüssige Öl-in- Wasser-Emulsion (B), die erfindungsgemäße Emulsion (Formel C der Tabelle), eine kommerzielle Emulsion zur Verdünnung mit dem Antigen (E), eine Ölphase zur Emulgation mit dem Konjugat (F).
- Bei allen diesen Formulierungen ist die endgültige Menge an Antigen pro Dosis die gleiche.
- Die Emulsionen werden unter Bedingungen hergestellt, die für den Fachmann für diesen Typ der Formulierung üblich sind. Tabelle 10
- F - Wirksamkeit der passiven anti-LHRH-Immunisierung auf die Verbesserung der organoleptischen Eigenschaften von Fleisch, gemessen durch Senkung des Gewebe-Androstenons
- Androstenongehalt im Fettgewebe bei Bezugstieren und bei Tieren, die einer passiven anti-LHRH-Immunoneutralisation durch hyperimmunes anti-(D-Lys&sup6;)-LHRH-Pferdeplasma unterworfen wurden sind, verabreicht in einem Volumen von 300 ml an den Tagen 16, 13, 9 und 5 vor der Schlachtung
- (signifikanter Fehler α = 0,2)
- G - Wirksamkeit und Toleranz von Formulierungen mit LHRH, konjugiert an α-Globulin mittels Carbodiimid, in Wasser-in- Öl-Emulsion (1. Impfstoff) und in Aluminiumhydroxidgel und Saponin (2. Impfstoff), die in gleicher Dosis des konjugierten LHRH zu Beginn der Mästung bzw. 18 bis 21 Tage vor der Schlachtung auf transkutanem Weg mit einem als Pigjet bezeichneten nadellosen Injektor verabreicht werden Es wurden zwei Experimente an zwei Zeitpunkten durchgeführt, die Gruppen 1, 3 und 5 am ersten bzw. die Gruppen 2 und 4 am zweiten (Tabellen 12 und 13).
- G.1 - Die Wirksamkeit der anti-LHRH-Immunoneutralisierung wird bei gleichem Volumen an Impfstoff durch Vermehrung der Stellen der transkutanen Verabreichung verstärkt Tabelle 12
- ND: Nicht bestimmt
- G.2 - Die Toleranz der verwendeten Impfstoffe wird anhand der Entwicklung einer entzündlichen Hautreaktion bewertet, die bei einem Tier in Abhängigkeit von der Schwere der nach Verabreichung erscheinenden Pocken von 0 bis 4 benotet wird; pro Verabreichungsstelle erscheint eine Pocke. Die Summe der Noten in jeder Gruppe wird folgendermaßen zusammengefasst: durchschnittliche Benotung am Ende der ersten, auf die Verab reichung folgenden Woche (Ad. 1) und durchschnittliche Benotung zum Zeitpunkt der Schlachtung für jeden Impfstoff (Ab) (Tabelle 13). Die beste Toleranz wird bei Einsatz von Impfstoffen in der Gruppe 4 beobachtet.
- Toleranz der Verabreichung auf transkutanem Weg, beobachtet bei 2 durchgeführten Experimenten (Experiment 1: Gruppen 1, 3 und 5; Experiment 2: Gruppen 2 und 4)
- Die Messung der anti-LHRH-Immunantwort erfolgt durch den Antikörpertiter, der gemäß der von Jeffcoate et al., Acta Endocr. (Kopenh.) 1974, 75, 625-635 beschriebenen Technik bestimmt wird.
- Die Bindung an markierte Peptide wird nach Markierung verschiedener Peptide mit Iod-125 gemäß Copeland et al., Endocr., 1979, 104, 1504-1506 bestimmt. Die Titration von Seren bezüglich dieser Peptide erfolgt gemäß der oben zitierten Technik von Jeffcoate et al.
- Die biologische Wirksamkeit wird durch die Senkung oder das Verschwinden von Testosteron im Plasma und von Androste non im Gewebe gemessen. Die Bestimmung von Plasma-Testosteron erfolgt direkt an Plasma mittels einer RIA-Technik unter Verwendung des Radioliganden Testosteron-C19-carboxymethylether- (¹²&sup5;I)-histamin (Furuyama, S., et al., Steroids, 1972, 16, 415). Die Bestimmung von Gewebe-Androstenon erfolgt an einer Probe von Fettgewebe mittels einer RIA-Technik unter Verwendung des Radioliganden 5α-³H-Androstenon, beschrieben von Claus, C. R. Acad. Sci., Paris, 1974, 278, 299-302.
- Das Konjugat wird vorzugsweise durch Zugabe von 0,5 bis 2 Volumina einer 2,5%igen N-Ethyl-N'-(dimethylamino-3- propyl)-carbodiimidchlorhydrat (EDC)-Lösung in 0,9% NaCl zu einem Volumen eines Gemischs aus 2 bis 20 mg/ml α-Globulin und LHRH in Lösung in 0,9% NaCl erhalten. Nach Rühren wird das Gemisch über Nacht stehen gelassen, dann durch Gelpermeationschromatographie gereinigt.
- Die Herstellung von ([D-Lys&sup6;])-LHRH-menschliches α- Globulin-Konjugaten erfolgt in drei Schritten: Herstellung von [N-(Pyridyl-2)-dithio-3-propanoyl-D-Lys&sup6;]-LHRH, Herstellung von N-(Mercapto-3-propanoyl)-menschliches α-Globulin; dann Kupplung.
- [Nε-(Pyridyl-2)-dithio-3-propanoyl-D-Lys&sup6;]-LHRH wird hergestellt, indem man einen Überschuss SPDP mit LHRH in wässriger Lösung (6 mol SPDP pro mol [D-Lys&sup6;]-LHRH) reagieren lässt und dann, nach einer Nacht bei 4ºC, das erhaltene Produkt abzentrifugiert. Dieses wird in 8 M Harnstoff gelöst, und die vorhandenen (Pyridyl-2)-dithio-Gruppen werden bestimmt.
- N-(Mercapto-3-propanoyl)-α-Globulin wird durch Einwirkung von 0,2 mmol SPDP auf 0,6 g menschliches α-Globulin, gelöst in 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer, und dann, nach einer Nacht Kontakt bei 4ºC und Ansäuerung auf pH-Wert 6, durch Reduktion mittels Dithiothreitol erhalten. Dann wird es durch Gelfiltrationschromatographie gereinigt. Die Menge an Thiolen und an Proteinen ergibt das durchschnittliche Ausmaß der Substitution.
- Die Kupplung erfolgt, indem eine (Pyridyl-2)-dithio- Gruppe pro 1,25 Thiolgruppen eingesetzt wird. Der pH-Wert wird auf 7-7,5 gebracht, nach einer Stunde wird dann die Ausbeute durch Messung des freigesetzten Pyridin-2-thions bestimmt.
- Daraus ergibt sich das durchschnittliche Ausmaß der Substitution. Schließlich wird das Konjugat mittels Chromatographie gereinigt und durch Ultrafiltration aufkonzentriert. Die Gesamtausbeute an gekuppeltem [D-Lys&sup6;]-LHRH beträgt etwa 45 bis 50%.
- B3. Das Überwiegen der Immunantwort von männlichen Schweinen auf den carboxyterminalen Abschnitt des LHRH-Peptids, das unter den in A1 und A2 beschriebenen Bedingungen konjugiert wird, wird durch Vergleich der Bindung von zwei markierten LHRH-Fragmenten, LHRH (3-10) (LHRH, bei dem der aminoterminale Abschnitt deletiert ist) bzw. LHRH (1-10) in Form der freien Säure (LHRH, dessen Amidanteil des carboxyterminalen Abschnitts deletiert ist) durch anti-LHRH- und anti-[D-Lys&sup6;]- LHRH-Seren bestimmt. Diese beiden Fragmente erkennen insbesondere einerseits die gegen den carboxyterminalen bzw. andererseits die gegen den aminoterminalen Abschnitt gerichteten Antikörper.
- Die Reaktion auf den carboxyterminalen Abschnitt des Peptids ist allen mit dem einem oder dem anderen der Konjugate immunisierten Tieren gemeinsam (68/68). Die Seren von 3 unter 10 aus 10 mit dem [D-Lys&sup6;]-LHRH-Konjugat immunisierten Tieren und von 10 unter 68 mit dem LHRH-Konjugat geimpften Tieren zeigten ausschließlich die Bindung des carboxyterminalen Abschnitts. Die übrigen Tiere zeigen eine gemischte Reaktion, die bevorzugt gegen den carboxyterminalen Abschnitt gerichtet ist.
- Die Reaktion auf den aminoterminalen Abschnitt ist nicht allgemein (55/68). Kein Serum zeigte eine ausschließliche Bindung der Fraktion der freien LHRH-Säure.
- 85 mg LHRH (3-10) und 170 mg Pferde-α-Globulin IV-4 werden in 12,8 ml eines Puffers aus 0,1 M NaCl-0,1 M (N- Morpholino)-2-ethansulfonsäure gelöst. Dann werden 212 mg N- Ethyl-N'-(dimethylamino-3-propyl)-carbodiimidchlorhydrat, gelöst in 17 ml der vorstehenden Lösung, zugegeben. Der pH-Wert wird sofort durch Zugabe von 1,3 ml 1 N Natronlauge auf 6,0 eingestellt.
- Nach Rühren wird das Gemisch 16 Std. bei Umgebungstemperatur stehen gelassen, dann wird das Konjugat durch Gelper meationschromatographie gereinigt, um das Konjugat von nicht konjugiertem LHRH zu trennen. Durch Messung der Menge des letzteren lässt sich anhand der Differenz die Menge an gekuppeltem LHRH erhalten. Es ist möglich, die Kupplungsausbeute zu bestimmen.
- Sechzig mg LHRH (3-10) und 120 mg Ovalbumin werden in 9 ml eines Puffers aus 0,1 M NaCl-0,1 M (N-Morpholino)-2- ethansulfonsäure gelöst. Dann werden 150 mg N-Ethyl-N'- (dimethylamino-3-propyl)-carbodiimidchlorhydrat, gelöst in 12 ml des gleichen Puffers, zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 1 N Natronlauge (etwa 1,9 ml) auf 7,0 eingestellt. Das Gemisch wird über Nacht bei Umgebungstemperatur stehen gelassen, dann durch Zentrifugation geklärt. Der Überstand wird einer Chromatographie auf Sephadex-Gel unterworfen, um das Konjugat von nicht umgesetztem LHRH und von Produkten, die von dem ursprünglichen Carbodiimid herrühren, abzutrennen. Durch Messung der Menge an ungebundenem LHRH (3-10) lässt sich die Ausbeute der LHRH (3-10)-Kupplung bestimmen.
- C3. Immunantwort, biologische Wirksamkeit und Toleranz eines anti-LHRH-Impfstoffs, der aus dem zwischen den Fragmenten LHRH (3-10) und Pferde-α-Globulin IV-4 mittels Carbodiimid erhaltenen Konjugat formuliert worden ist
- Die Formulierungen aus konjugiertem LHRH (3-10) in Wasser-in-Öl-Emulsion (1. Impfstoff) und in Aluminiumhydroxidgel und Saponin (2. Impfstoff) wurden in einem Volumen von 0,4 ml pro Dosis jeweils zu Beginn der Mästung und 17 Tage vor der Schlachtung auf transkutanem Weg mit einem als Pigjet bezeichneten nadellosen Injektor an 6 männliche Schweine verabreicht, wobei das Volumen der Dosis in 2 Anwendungen von 0,2 ml, die jeweils auf 5 Stellen verteilt werden, verabreicht wird.
- Die Immunantwort war 10 Tage nach Verabreichung des 2. Impfstoffs maximal. Die einzelnen Antikörpertiter (Umkehrwert der Verdünnung, die Iod-125 zu 50% bindet) waren jeweils:
- Die biologische Wirksamkeit dieser Immunantwort zeigt sich im Verschwinden von Testosteron aus dem Plasma ab dem 10. Tag nach Verabreichung des 2. Impfstoffs bei allen 6 Tieren. Das Verschwinden von Testosteron geht mit dem Verschwinden des Androstenons im Gewebe unter den gleichen Bedingungen einher.
- Die Toleranz des Impfstoffs wird durch Entwicklung der entzündlichen Hautreaktion bewertet und in Abhängigkeit von der Schwere der an jeder Verabreichungstelle des Impfstoffs nach der Verabreichung erscheinenden Pocken benotet. Diese lokale Entzündung ist ab dem 10. Tag nach Verabreichung des 2. Impfstoffs völlig verschwunden.
Claims (35)
1. Verfahren zur Herstellung von Schweine-, Rind-,
Schaffleisch mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften,
insbesondere Geruch, Geschmack und Zartheit, wobei
männliche nicht-kastrierte Haustiere gemästet werden, eine
aktive Immunoneutralisierung mit einem anti-LHRH-
Impfstoff bei den Tieren vorgenommen wird, dadurch
gekennzeichnet, dass man die mit dem männlichen Charakter
der Tiere einhergehenden Vorteile praktisch bis zu ihrer
Schlachtung dadurch erhält, dass ihnen vor oder während
des Mästzeitraums der Tiere einmal ein anti-LHRH-
Impfstoff verabreicht wird, der so konzipiert ist, dass
er eine erste Immunantwort mit schwacher Intensität,
ohne merkliche oder messbare Wirkung auf die Sekretion von
Gonadensteroiden hervorruft, und dass man ihnen nur kurz
vor der Schlachtung einen anti-LHRH-Impfstoff
verabreicht, um eine anti-LHRH-Immunoneutralisation zu
induzieren, welche die Unterdrückung oder signifikante
Senkung der Sekretion von Steroiden hervorruft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
der zuerst verabreichte Impfstoff und der kurz vor der
Schlachtung verabreichte Impfstoff ausgewählt sind aus
den Emulsionsimpfstoffen und den Impfstoffen mit
wässrigem Adjuvans.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch
gekennzeichnet, dass der zuerst verabreichte anti-LHRH-
Impfstoff ein Emulsionsimpfstoff ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, dass man beim Schwein kurz vor der
Schlachtung den anti-LHRH-Impfstoff mit wässrigem
Adjuvans verabreicht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass
als wässriges Adjuvans Aluminiumhydroxidgel und/oder
Saponin verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, dass der Impfstoff mit wässrigem Adjuvans 15 bis 21
Tage vor der Schlachtung verabreicht wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, dass für Rinder und Schafe vor der
Schlachtung ein anti-LHRH-Impfstoff mit einem
Emulsionsadjuvans verabreicht wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass
der Emulsionsimpfstoff ein bis zwei Monate vor der
Schlachtung verabreicht wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch
gekennzeichnet, dass der Emulsionsimpfstoff vier Wochen bis mehrere
Monate nach der zuerst durchgeführten Verabreichung
verabreicht wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3 und 7 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, dass der Emulsionsimpfstoff ein
Wasser-in-Öl-Emulsionsimpfstoff ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass
die Wasser-in-Öl-Emulsion aus einem Gemisch
hochgereinigter Mineralöle und nichtionischer Tenside hergestellt
wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, dass ein anti-LHRH-Immunogen-Konjugat
verabreicht wird, umfassend:
- das gesamte oder modifizierte LHRH,
- ein modifiziertes oder unmodifiziertes LHRH-
Peptidfragment oder
- einen LHRH-Agonisten,
gekoppelt an ein immunogenes Trägerprotein, ausgewählt
aus:
- Rinder- oder Menschen-Serumalbumin,
- Thyreoglobulin,
- Ovalbumin,
- den Anatoxinen, insbesondere dem Tetanus-Anatoxin,
- menschlichen oder Pferde-Globulinen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass
das Konjugat LHRH, gekoppelt an Pferde-Alphaglobulin,
insbesondere die Fraktionen IV-1 und/oder IV-4, umfasst.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass
das Konjugat LHRH (3-10), gekoppelt an Pferde-
Alphaglobulin, insbesondere die Fraktionen IV-1 und/oder
IV-4, oder an Ovalbumin, umfasst.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch
gekennzeichnet, dass LHRH/LHRH (3-10) und das immunogene
Trägerprotein durch ein Carbodiimid gekuppelt sind.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
man dem Tier mehrere Tage vor der Schlachtung
hyperimmunes anti-LHRH-Serum oder -Plasma verabreicht.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
man dem Tier mehrere Tage vor der Schlachtung
monoklonale anti-LHRH-Antikörper verabreicht.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch
gekennzeichnet, dass die Verabreichung fünf bis fünfzehn Tage vor
der Schlachtung auf subkutanem oder intramuskulärem Weg
erfolgt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch
gekennzeichnet, dass man die Verabreichung auf
transkutanem Weg, vorzugsweise an mehreren Stellen, mittels einer
Injektionsvorrichtung ohne Nadel durch Druckstrahl
durchführt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch
gekennzeichnet, dass der zuerst verabreichte anti-LHRH-
Impfstoff vor der Mästperiode des Tiers verabreicht
wird.
21. Kit zur anti-LHRH-Impfung, das sich zur Herstellung von
Fleisch mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften
ausgehend von männlichen, nicht-kastrierten Schweinen,
Rindern oder Schafen eignet, wobei das Kit umfasst:
- einen anti-LHRH-Impfstoff zur ersten Verabreichung vor
oder während der Mästphase der Tiere, der so konzipiert
ist, dass er eine erste Immunantwort mit schwacher
Intensität, ohne merkliche oder messbare Wirkung auf die
Sekretion von Gonadensteroiden hervorruft, so dass die
Entwicklung des männlichen Charakters der Tiere
ermöglicht wird, und
- einen anti-LHRH-Impfstoff zur Verabreichung nach dem
ersten Impfstoff und nur kurz vor der Schlachtung, wobei
dieser Impfstoff so konzipiert ist, dass er eine anti-
LHRH-Immunoneutralisation induziert, welche die
Unterdrückung oder signifikante Senkung der Sekretion von
Steroiden hervorruft.
22. Kit zur Impfung nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, dass die Impfstoffe einen Wirkstoff umfassen, der
ein Konjugat zwischen einem immunogenen Trägerprotein
und einem LHRH-Peptid ist.
23. Kit zur Impfung nach Anspruch 22, dadurch
gekennzeichnet, dass das LHRH-Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe,
bestehend aus:
- gesamtem oder modifiziertem LHRH,
- einem modifizierten oder unmodifizierten LHRH-
Peptidfragment,
- einem LHRH-Agonisten.
24. Kit zur Impfung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch
gekennzeichnet, dass das immunogene Trägerprotein
ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
- Serumalbumin,
- Thyreoglobulin,
- Ovalbumin,
- Anatoxinen,
- Tetanus-Anatoxin,
- Pferde-Globulinen,
- menschlichen Globulinen,
- Alpha-Globulinen.
25. Kit zur Impfung nach einem der Ansprüche 21 bis 24,
dadurch gekennzeichnet, dass der bei der ersten Injektion
zu injizierende anti-LHRH-Impfstoff ein Impfstoff in
Emulsionsform ist.
26. Kit zur Impfung nach einem der Ansprüche 21 bis 25,
dadurch gekennzeichnet, dass der kurz vor der Schlachtung
zu verabreichende anti-LHRH-Impfstoff ein Impfstoff in
Emulsionsform ist.
27. Kit zur Impfung nach Anspruch 25 oder 26, dadurch
gekennzeichnet, dass der Impfstoff in Emulsionsform ein
Impfstoff in Form einer Wasser-in-Öl-Emulsion ist.
28. Kit zur Impfung nach einem der Ansprüche 25 bis 27,
dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff in
Emulsionsform aus einem Gemisch von Mineralölen und
nichtionischen Tensiden hergestellt ist.
29. Kit zur Impfung nach einem der Ansprüche 21 bis 25,
dadurch gekennzeichnet, dass der für die Verabreichung
kurz vor der Schlachtung bestimmte anti-LHRH-Impfstoff
ein Impfstoff mit einem wässrigen Adjuvans ist.
30. Kit zur Impfung nach Anspruch 29, dadurch
gekennzeichnet, dass das wässrige Adjuvans ausgewählt ist aus der
Gruppe, bestehend aus Aluminiumhydroxidgel, Saponin und
einem Gemisch davon.
31. Kit zur Impfung nach einem der Ansprüche 21 bis 25 und
29, 30, das für Schweine bestimmt ist, dadurch
gekennzeichnet, dass der kurz vor der Schlachtung zu
verabreichende anti-LHRH-Impfstoff ein Impfstoff mit einem
wässrigen Adjuvans ist.
32. Kit zur Impfung nach einem der Ansprüche 21 bis 28, das
für Rinder und Schafe anwendbar ist, dadurch
gekennzeichnet, dass der kurz vor der Schlachtung zu
verabreichende anti-LHRH-Impfstoff ein Impfstoff in
Emulsionsform ist.
33. Kit zur Impfung nach einem der Ansprüche 21 bis 32,
dadurch gekennzeichnet, dass das Impf-Kit aus einer
identischen Anzahl an Dosen von jedem Impfstoff in einer
einzelnen Verpackung besteht.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, dass ein Impfstoff verabreicht wird,
umfassend einen immunogenen Wirkstoff, der das LHRH-Peptid
umfasst.
35. Kit zur Impfung nach Anspruch 21 oder nach einem der
Ansprüche 25 bis 33 zusammen mit Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, dass die anti-LHRH-Impfstoffe einen
immunogenen Wirkstoff umfassen, der das LHRH-Peptid umfasst.
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