DE69228055T2

DE69228055T2 - Ein gewebekulturverfahren für haut im natürlichen zustand

Info

Publication number: DE69228055T2
Application number: DE69228055T
Authority: DE
Inventors: Lingna La Jolla Ca 92037 Li
Original assignee: Anticancer Inc
Current assignee: Anticancer Inc
Priority date: 1991-02-28
Filing date: 1992-02-28
Publication date: 1999-05-20
Anticipated expiration: 2012-02-29
Also published as: ATE175242T1; EP0573606A4; JPH06505636A; DE69228055D1; WO1992015700A1; EP0573606B1; JP2950519B2; EP0573606A1; US5849579A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Histokultivierung von Haut unter Erhalt des natürlichen Zustands sowie einen auf diesem Verfahren beruhenden Assay.

Hintergrund der Erfindung

Alle kommerziellen Produkte, die mit der Haut in Berührung kommen (z. B. Kosmetika, Haushaltsprodukte und Pharmazeutika) müssen ausführliche Tests durchlaufen, um sicherzustellen, daß diese Produkte für den Menschen nicht toxisch sind. Die gegenwärtig zur Verfügung stehenden Mittel zur Prüfung der Toxizität derartiger Produkte sind teuer, zeitaufwendig und erfordern oft, daß eine große Anzahl lebender Tiere toxischen Substanzen ausgesetzt werden. Die Verwendung lebender Tiere für derartige Toxizitätsprüfungen steht zunehmend unter dem kritischen Blick der Öffentlichkeit, der Wissenschaft und der Behörden. Es besteht daher ein dringendes Bedürfnis, Assays für den Test von Hauttoxizität zu entwickeln, bei denen vermieden wird, daß lebende Tiere toxischen Substanzen ausgesetzt werden.
Obwohl in jüngster Zeit über eine Reihe von Versuchen berichtet wurde, in-vitro Assays für die Prüfung der Hauttoxizität zu entwickeln, haben sich diese Systeme als ungeeignet für eine genaue und zuverlässige Prüfung der toxischen Wirkung von Substanzen auf die natürliche Haut erwiesen. Viele dieser in-vitro Tests umfassen die Kultivierung von individuellen Zellen, die aus der Haut von Versuchstieren isoliert wurden. Siehe z. B. Van Brunt, J., Biotechnology, 9: 136-137 (1991) sowie Naughton et al., Alternative Methods In Toxicology, A. M. Goldberg (Hrsg.), 7: 183-189 (1989). Derartige, auf einer Zellkultur basierende Assays sind zu stark vereinfacht und unzureichend, speziell wenn die Wirkung mutmaßlicher Toxine auf einer Änderung der Zell-Zell-Wechselwirkung beruht.
Das Modell von Naughton et al. umfaßt die Isolierung von Hautfibroplasten aus dermalem Gewebe, die Züchtung der isolierten Fibroplasten in einem geeigneten Medium, das Anlegen einer Fibroplastenkultur auf einem Nylonnetz, die Isolierung von Melanocyten aus einer weiteren Hautprobe, die Kultivierung der Melanocyten, das Übertragen der kultivierten Melanocyten auf das mit Fibroplasten bedeckten Nylonnetz, die Isolierung von Keratinocyten und das Übertragen der isolierten Keratinocyten auf das mit Fibrinoplasten und Melanocyten bedeckte Nylonnetz. Einem derartigen System fehlt nicht nur die Vergleichbarkeit mit natürlicher Haut, die Anwendung einer derartigen Technik umfaßt die zeitraubenden Schritte der Isolierung von zumindest drei verschiedenen Zelltypen, die individuelle Kultivierung der jeweiligen Zelltypen und schließlich die gemeinsame Kultivierung der einzelnen Zelltypen auf einem Nylonnetz. Nach Aussage der Autoren beträgt die minimale Zeit, die für den Aufbau dieses Systems benötigt wird, zumindest zwischen ungefähr 8 bis ungefähr 14 Tage.
In vergleichbarer Art und Weise werden bei anderen gegenwärtig verfügbaren oder in der Entwicklung befindlichen in vitro Systemen individuell kultivierte Zellen an Stelle von intakter Haut verwendet. In einigen Fällen werden Zellen verschiedener Organismen zu einem einzelnen Hautäquivalent kombiniert. Van Brunt, a.a.O..
In einem Laboratorium wurde versucht, ein Kultursystem für intakte Haut zu etablieren, die Lebensfähigkeit der Haut konnte jedoch nicht länger als 24 Stunden erhalten werden. Kao et al. Toxicology and Applied Pharmacology, 81: 502-516 (1985).
Frater und Whitmore, Journal of Investigative Dermatology, 61: 72-81 (1973), beschreiben ein Kultivierungsverfahren für Haut, bei dem Gewebestücke auf einem festen Kollagengel kultiviert werden, das wiederum in einer zentralen Öffnung in einer Plastikschale enthalten ist. Die Schale wird dann in ein Kulturmedium gestellt.
Trotz des großen Aufwands an Zeit und Energie, der von der Wissenschaft an Universitäten und in der Industrie investiert wurde, ist gegenwärtig kein Histokultivierungssystem für Haut verfügbar, das es ermöglicht, kultivierte Haut funktions- und wachstumsfähig zu erhalten, während gleichzeitig über längere Zeit der natürliche Zustand und der dreidimensionalen Aufbau erhalten bleibt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein derartiges über lange Zeit stabiles und den natürlichen Zustand bewahrendes Histokultivierungssystem für Haut zur Verfügung und liefert damit eine Lösung für das dringende und seit langer Zeit bestehende Bedürfnis nach einem derartiges System.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur den natürlichen Zustand erhaltenden Histokultivierung einer Hautprobe mit einer inneren und einer äußeren Fläche zur Verfügung, umfassend die Schritte, Übertragen einer Hautprobe auf eine extrazelluläre Matrix, wobei die Matrix in einem Kulturmedium eingetaucht ist und auf diesem schwimmt, wobei die innere Fläche benachbart zur Matrix ist und die äußere Fläche oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt ist, und die Matrix mit der darauf befindlichen Haut bei Bedingungen zur Kultivierung von Haut gehalten wird. Die Matrix weist eine trabekuläre Struktur auf, mit Zwischenräumen, die eine Kapillarwirkung entfalten können, um wie im natürlichen Zustand Nährstoffe aus dem Medium zur inneren Oberfläche der Haut zu transportieren.
Die extrazelluläre Stützmatrix ist vorzugsweise ein kollagenhaltiges Gel, ein Schwamm aus einem Homopolysaccharid oder eine Kombinationsmatrix aus einer oberen Schicht eines kollagenhaltigen Gels und einer unteren Schicht aus einem Schwamm aus einem Homopolysaccharid. Das kollagenhaltige Gel ist vorzugsweise gelatinierte Schweinehaut und das Homopolysaccharid vorzugsweise Zellulose.
Die erfindungsgemäß verwendete Hautprobe stammt vorzugsweise von einem Säugetier und ist besonders bevorzugt menschlichen Ursprungs.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine extrazelluläre Stützmatrix zur Histokultivierung von Haut unter Erhalt des natürlichen Zustands zur Verfügung, mit einer oberen Schicht aus einem kollagenhaltigen Gel und einer unteren Schicht aus einem Schwamm aus einem Homopolysaccharid, wobei die Matrix die oben beschriebene trabekuläre Struktur aufweist.
Weiter stellt die vorliegende Erfindung einen Hauttoxizitäts- Assay zur Verfügung, welcher die Schritte umfaßt, (a) Kultivierung einer Hautprobe mit einer inneren und einer äußeren Fläche auf einer extrazellulären Stützmatrix, welche bei Kultivierungsbedingungen für Haut in einem Medium eingetaucht ist, wobei die innere Fläche der Matrix benachbart ist und die äußere Fläche oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt ist, (b) Kontaktierung der Hautprobe mit einem mutmaßlichen Toxin, (c) Halten der Hautprobe in Gegenwart des Toxins für eine vorbestimmte Zeitdauer, und (d) Bewertung der Lebensfähigkeit der Hautprobe und damit der Hauttoxizität des Toxins.
Die Lebensfähigkeit wird bewertet, indem der Einbau eines Indikators in die Zellen der Hautprobe gemessen wird, der spezifisch für lebende oder tote Zellen ist. Als Indikatoren werden vorzugsweise Farbstoffe verwendet, die optisch detektiert werden können, besonders bevorzugt fluoreszierende Farbstoffe. Alternativ kann die Lebensfähigkeit gemessen werden, indem dem Medium ein erster Farbstoff zugegeben wird, der spezifisch für die Lebensfähigkeit der Zellen ist, und ein zweiter Farbstoff, der spezifisch für tote Zellen ist, das farbstoffhaltige Medium für eine vorbestimmte Zeit beibehalten wird, und die Hautprobe zur Quantifizierung der Verteilung des ersten und des zweiten Farbstoffes in der Hautprobe optisch gescannt wird, wodurch die Toxizität bewertet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Hauttoxizitäts- Assay die Bewertung der Lebensfähigkeit der Hautprobe, bevor die Hautprobe mit dem mutmaßlichen Toxin in Kontakt gebracht wird und den Vergleich der bewerteten Lebensfähigkeit vor und nach dem Kontakt mit dem mutmaßlichen Toxin, wodurch die Toxizität des Toxins erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter einen Assay zur Bewertung des Haarwuchses zur Verfügung, der die Schritte umfaßt, (a) Kultivierung einer Hautprobe, auf der Haare wachsen können, mit einer inneren und einer äußeren Fläche, auf einer in einem Medium eingetauchten Stützmatrix, wobei die innere Fläche der Matrix benachbart ist und die äußere Fläche oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt ist, (b) eine erste Bewertung des Zustandes des Haarwuchses durchgeführt wird, (c) die Hautprobe und die Matrix für eine vorbestimmte Zeitdauer im Medium behalten werden, (d) eine zweite Bewertung des Zustandes des Haarwuchses durchgeführt wird, und (e) die erste und die zweite Bewertung des Zustandes des Haarwuchses verglichen werden und dadurch der Haarwuchs bewertet wird.
Als Zustand des Haarwuchses wird vorzugsweise eine physikalische Meßgröße des Haares herangezogen, wie beispielsweise die Haarlänge.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß ein Histokultivierungssystem für Haut zur Verfügung gestellt wird, wobei der natürliche Zustand und der dreidimensionale Aufbau der Haut während der Kultivierung erhalten bleibt.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß ein einfacher, kostengünstiger und zuverlässiger Assay für Hauttoxizität zur Bewertung der Auswirkungen eines mutmaßlichen Toxins auf die Haut zur Verfügung gestellt wird. Der Assay stellt auch ein wirtschaftlich vorteilhaftes Mittel zur in-vitro-Bewertung der Auswirkungen mutmaßlicher Toxine zur Verfügung, wobei für den Assay keine lebenden Tiere Toxinen ausgesetzt werden müssen. Der Assay stellt ein Modell zur Verfügung, mit dem die Lebensfähigkeit von Zellen und die biochemische Reaktion in der dermatologischen Forschung und in Tests untersucht werden kann.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß einfache, kostengünstige und zuverlässige Mittel für die Beurteilung des Haarwuchses in vitro und zur Messung der Auswirkung von Zusammensetzungen auf das Haarwachstum zur Verfügung gestellt werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

In den Zeichnungen, die Teil der Offenbarung sind, wird folgendes gezeigt:
Fig. 1 stellt eine farbige Mikrofotografie einer für zwei Tage histokultivierten Mäusehaut dar, die wie in Beispiel 1 beschrieben zweifach mit BCECF-AM (grünlebende Zellen) und PI (rot - tote Zellen) gefärbt wurde. Konfokale Laser- Rastermikroskopie. 1000-fache Vergrößerung, Stereo-Abbildung.
Fig. 2 zeigt eine farbige Mikrofotografie einer für 6 Tage in Eagel's MEM histokultivierten Mäusehaut, die an den Tagen 3 bis 6 mit [³H]-Thymidin markiert wurde. Die Haut wurde für eine Autoradiographie fixiert und vorbereitet, sowie wie in Beispiel 1 beschrieben mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die Autoradiogramme wurden mit Hellfeld und polarisiertem Licht aufgenommen. Die mit [³H]-Thymidin markierten Kerne erscheinen in einem leuchtenden Grün. 1000-fache Vergrößerung.
Fig. 3 zeigt eine farbige Mikrofotografie, auf der die Lebensfähigkeit von Haarfollikeln einer für zwei Tage histokultivierten Mäusehaut dargestellt sind, die wie in Beispiel 2 beschrieben, nach Behandlung mit Ethanol zweifach mit BCECF-AM (grün - lebende Zellen) und PI (rot - tote Zellen) gefärbt wurde. Die Abbildungen auf der linken Seite zeigen die Haut vor der Behandlung mit Ethanol; die Abbildungen auf der rechten Seite zeigen die Haut nach der Behandlung. Die oberen Abbildungen zeigen die mit 0,5%-igem Ethanol (v/v) behandelte Haut. Die unteren Abbildungen zeigen Haut nach Behandlung mit 5%-igem Ethanol (v/v). Konfokale Laser-Rastermikroskopie. 1000-fache Vergrößerung. Stereoabbildung.
Fig. 4 zeigt eine grafische Darstellung der dosisabhängigen Auswirkungen von Ethanol auf für zwei Tage histokultivierte Mäusehaut. Die Toxizität wurde wie in Beispiel 2 beschrieben, als relative Aufnahme von BECEF-AM und PI nach fünfminütiger Behandlung mit Ethanol bewertet und ist als prozentualer Anteil der getöteten Zellen als Funktion der Ethanolkonzentration dargestellt.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der dosisabhängigen toxischen Auswirkungen von Doxorubicin auf die Lebensfähigkeit von für 4 Tage histokultivierter Mäusehaut. Die Toxizität wurde wie in Beispiel 2 beschrieben als die relative Aufnahme von DCECF-AM und PI Farbe nach einer 24-stündigen Behandlung mit Doxorubicin bestimmt und ist als prozentualer Anteil der toten Zellen als Funktion der Konzentration von Doxorubicin dargestellt.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung der dosisabhängigen toxischen Auswirkungen von Doxorubicin auf die Lebensfähigkeit verschiedener Zelltypen der Mäusehaut, die für 2 Tage histokultiviert wurde. Die Toxizität wurde als die Aufnahme von [³H]-Thymidin nach einer 24-stündigen Behandlung mit Doxorubicin bestimmt. Der prozentuale Anteil der Zell-Proliferation wurde als prozentualer Anteil der markierten Zellen in mit Doxorubicin behandelter Haut relativ zum prozentualen Anteil der markierten Zellen in einer Kontrolle mit unbehandelter Haut bestimmt.
Fig. 7 zeigt die dosisabhängigen Auswirkungen von Natriumhypochlorit auf die Lebensfähigkeit von histokultivierter Mäusehaut und auf die in vivo Reizung von Mäusehaut. Die Toxizität wird ausgedrückt als prozentualer Anteil der getöteten Zellen (per), sowie als ein primärer Reizungsungsindex (PII), jeweils als Funktion der Konzentration an Natriumhypochlorit, wie dies bei Beispiel 2 beschrieben ist.
Fig. 8 zeigt eine graphische Darstellung, in der das Haarwachstum bei verschiedenen Histokultivierungssystemen von Mäusehaut auf verschiedenen Matrizen mit dem Haarwachstum der Haut in vivo verglichen wird, wie dies in Beispiel 3 beschrieben wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Verfahren zur Histokultivierung unter Erhalt des natürlichen Zustands

Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Histokultivierung einer Hautprobe unter Erhalt des natürlichen Zustands, mit einer inneren und einer äußeren Fläche, welches die Schritte umfaßt, Übertragen der Hautprobe auf eine in einem Medium eingetauchte extrazelluläre Stützmatrix, wobei die innere Fläche benachbart zur Matrix ist und die äußere Fläche oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt ist und die Matrix mit der darauf befindlichen Haut bei Kultivierungsbedingungen für Haut gehalten wird.
Prinzipiell kann jegliche Haut von jeglichem Tier für den Assay verwendet werden. Vorzugsweise ist das Tier ein Säugetier. Beispielhafte Säugetiere sind Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen, Pinseläffchen, Affen und Menschen. Besonders bevorzugt ist das Tier ein Mensch.
Die Hautprobe weist dermale und epidermale Schichten auf und wird typischerweise einem Tier entnommen. Überschüssiges Fett, soweit vorhanden, wird entfernt. Die Hautprobe kann von einem haartragenden Tier entnommen werden, dessen Haut Haarwachstum unterstützen kann oder einem haarlosen Tier, dessen Haut keine Haare aufweist, beispielsweise einem athymischen, nackten Tier. Stammt die Hautprobe von einem haartragenden Tier, kann die Haut vor der Entnahme rasiert oder geschoren werden.
Eine Hautprobe, wie sie hier verstanden wird, weist eine innere und eine äußere Fläche auf. Unter dem Ausdruck "innere Fläche" wird die zur dermalen Seite orientierte Fläche verstanden; d. h. diejenige Seite, die im natürlichen Zustand der Haut im Tier keinen Außenwirkungen ausgesetzt ist. Unter dem Begriff "äußere Fläche" wird die zur epidermalen Seite gerichtete Fläche verstanden; d. h. diejenige Seite, die im natürlichen Zustand der Haut im Tier einer Außenwirkung ausgesetzt ist.
Hinsichtlich der Größe der Fläche sind dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Hautstück keine natürlichen Grenzen gesetzt. Typischerweise erstreckt sich der Bereich der äußeren Fläche der Hautprobe von etwa 1 bis ungefähr 10.000 mm². Ein bevorzugter Bereich für die Hautoberfläche liegt im Bereich von ungefähr 4 bis ungefähr 100 mm², besonders bevorzugt ist eine Fläche von ungefähr 10 mm². Die Dicke der Haut hängt vom Tier ab, dem sie entnommen wurde. Wird die Hautprobe einer Maus entnommen, beträgt die bevorzugte Dicke etwa 1 bis 2 mm.
Die Hautproben werden auf einer Stützmatrix kultiviert. Eine erfindungsgemäße Stützmatrix zeigt eine trabekuläre Struktur mit Zwischenräumen, die eine Kapillarwirkung entfalten können, wodurch wie im natürlichen Zustand wäßrige Nährstoffe aus dem Medium zur inneren Oberfläche (Basis) der Haut transportiert werden können. Die Stützmatrix stellt eine extrazelluläre Stützmatrix dar. Unter dem Begriff "extazelluläre Stützmatrix", wie er hier verwendet wird, wird eine feste Matrix, beispielsweise ein Gel oder ein Schwamm verstanden, die ein oder mehrere organische Moleküle oder Molekülaggregate umfaßt, wobei die Moleküle oder Aggregate denen entsprechen, die von Zellen erzeugt und in den extrazellulären Raum ausgeschieden werden und die in vivo als Stützmedium, Klebstoff und Gerüst dienen, um den dreidimensionalen Aufbau des Gewebes und seine Funktion zu erhalten. Beispiele für derartige Moleküle sind hochmolekulare Proteine und Glycoproteine wie Kollagen, Laminin, Fibronektin usw., komplexe Polysaccharide und vergleichbare Moleküle.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die extrazelluläre Stützmatrix ein kollagenhaltiges Gel auf. Beispielhafte kollagenhaltige Gele sind gelatinierte Schweinehaut wie GELFOAMTM (The Upjohn Company, Kalamazoo, MI) sowie eine Zusammensetzung, die Laminin, Kollagen, Proteoglycan und Entactin enthält, wie MATRIGELTM (Collaborative Research, Inc., Bedford, MA). GELFOAMTM ist ein patentiertes Erzeugnis, das im US-Patent Nr. 2,465,357 beschrieben ist, und dessen Offenbarung durch Bezugnahme aufgenommen wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die extrazelluläre Stützmatrix einen Schwamm aus einem Homopolysaccharid auf. Leighton, J., J. Nat'l Cancer Instit., 12: 545-561 (1951). Ein bevorzugtes Homopolysaccharid stellt Zellulose dar. Die Schwämme aus Homopolysacchariden, wie sie in der Erfindung verwendet werden, unterliegen in ihrer Webart oder der Netzgröße keinen Beschränkungen.
In einer weiteren Ausführungsform weist die extrazelluläre Stützmatrix eine Kombination aus einem kollagenhaltigen Gel und einem Schwamm aus einem Homopolysaccharid auf. Vorzugsweise weist eine derartige Kombination eine obere Schicht aus einem kollagenhaltigen Gel und eine untere Schicht aus einem Schwamm aus einem Homopolysaccharid auf. Das kollagenhaltige Gel ist vorzugsweise gelatinierte Schweinehaut und das Homopolysaccharid vorzugsweise Zellulose. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Stützmatrix eine Kombination aus einer oberen Schicht aus GELFOAMTM und eine untere Schicht aus einem Schwamm aus Zellulose auf, wobei es sich gezeigt hat, daß diese Matrix die besten Ergebnisse beim Erhalt des normalen Haarwuchses bei histokultivierter Haut aufweist (s. Beispiel 3).
Das Verhältnis der Größe der Hautprobe zur Größe der extrazellulären Matrix ist nicht vorgegeben. Die Matrix kann von einem Durchmesser, der ausreichend für die Unterstützung der Hautprobe ist, bis zu einer Größe gewählt werden, in der die Hautprobe deutlich überragt wird. Es können mehrere Hautproben auf einer Matrix vorgesehen werden, wobei die Hautproben sich nicht berühren sollten. Der bevorzugte Abstand zwischen den Hautproben beträgt ungefähr 1 bis 2 mm.
Die Hautprobe wird in der Weise auf der Matrix aufgebracht, daß die innere Fläche benachbart zur Matrix ist und die äußere Fläche von der Matrix abgewandt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform berührt die innere Fläche der Haut die Matrix. Mit dieser Anordnung kann die äußere Fläche der Haut mit Toxinen oder anderen Zusammensetzungen in Berührung gebracht werden, um so deren Auswirkungen entsprechend den beschriebenen Verfahren bestimmen zu können.
Die Matrix mit der darauf vorgesehenen Hautprobe wird in einer Menge von Medium eingetaucht, die ausreichend ist, um die Matrix zu berühren, ohne jedoch die Haut vollständig zu bedecken; d. h. die äußere Fläche der Haut wird nicht untergetaucht sondern ist oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt.
Vorzugsweise befindet sich die Oberfläche des Mediums zwischen 0,5 und 2 mm von der oberen Fläche der Matrix entfernt und steht durch eine Dochtwirkung mit der Hautprobe in einer wäßrigen Verbindung. Weist die Hautprobe beispielsweise eine Dicke von 1 bis 2 mm auf, befindet sich die Oberfläche des Mediums bevorzugt 0,5 bis 2 mm unterhalb der äußeren Fläche der Haut.
Die extrazelluläre Stützmatrix ist typischerweise weich und kann beim Auflegen der Hautprobe einbeulen, so daß die Kanten der Matrix die vertikalen Seiten der Hautprobe berühren können.
Die extrazelluläre Stützmatrix wird vor dem Auflegen der Hautprobe vorbehandelt, um die Matrix mit dem Medium zu äqulibrieren. Die Vorbehandlung besteht darin, daß die Matrix auf eine bestimmte Größe zugeschnitten wird und die zugeschnittene Matrix in einem sterilen Behälter für eine Zeit mit dem Medium getränkt wird, die ausreichend ist, um die Matrix mit dem Medium zu sättigen und zu äquilibrieren. Eine bevorzugte Einweichzeit ist 4 Stunden bei 37ºC.
Das für die vorliegende Erfindung herangezogene Medium ist ein Nährmedium, das so zusammengestellt ist, daß es die Lebensfähigkeit der Hautprobe fördert und erhält. Ein bevorzugtes Medium ist das Eagle's Minimales essentielles Medium (MEM), das mit 10% (v/v) fetalem Rinderserum und einem Antibiotikum ergänzt wird. Beispielhafte Antibiotika sind Gentamicin, Streptomycin, Penicillin, Kanomycin usw.. Ein bevorzugtes Antibiotikum ist Gentamicin. Die endgültige Konzentration des Antibiotikums im Medium hängt davon ab, welches spezielle Antibiotikum verwendet wird. Wird Gentamicin als Antibiotikum eingesetzt, beträgt die bevorzugte Konzentration ungefähr 0,2 mg pro ml Medium. Andere Medien können ebenfalls verwendet werden, vorzugsweise solche, die fetales Rinderserum enthalten, oder es können serumfreie Medien verwendet werden, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Die Matrix mit der darauf befindlichen Hautprobe kann für unbegrenzte Zeit im Medium gehalten werden. Vorzugsweise wird das Medium alle 2 bis 3 Tage gewechselt.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Histokultivierungssystems für Haut besteht darin, daß ein einfaches, billiges in vitro Modell zur Verfügung gestellt wird, wobei der natürliche Zustand und die dreidimensionale Gestalt der Haut über eine lange Zeitdauer erhalten werden können. In früher beschriebenen Kultivierungssystemen für Haut konnte die Lebensfähigkeit der Haut im günstigsten Fall nur für ein oder zwei Tage erhalten werden. Kao et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 81: 502-516 (1985).
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft eine extrazelluläre Stützmatrix, die in einem derartigen System verwendet werden kann. In einer Ausführungsform umfaßt die extrazelluläre Stützmatrix ein kollagenhaltiges Gel, wie GELFOAMTM oder MATRIGELTM. Bei einer anderen Ausführungsform umfaßt die extrazelluläre Stützmatrix einen Schwamm aus einem Homopolysaccharid, wie einen Schwamm aus Zellulose. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die extrazelluläre Stützmatrix eine Kombinationsmatrix, bestehend aus einer oberen Lage aus einem kollagenhaltigen Gel und einer unteren Lage aus einem Schwamm aus Homopolysacchariden. Besonders bevorzugt ist eine Kombinationsmatrix, welche eine obere Lage aus GELFOAMTM und eine untere Lage aus einem Schwamm aus einem Homopolysaccharid umfaßt. Eine derartige Matrix weist ausgezeichnete Eigenschaften für die Unterstützung des Haarwuchses bei histokultivierter Mäusehaut auf (siehe Beispiel 3).

B. Hauttoxizitäts-Assay

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Hauttoxizitäts- Assay, der die Schritte umfaßt, (a) Übertragen und Kultivieren einer Hautprobe mit einer inneren und einer äußeren Fläche auf einer extrazellulären Stützmatrix, wie sie im Abschnitt A beschrieben ist, (b) Aufbringen eines mutmaßlichen Toxins auf die Hautprobe, (c) Halten der Hautprobe und der Stützmatrix in Gegenwart des Toxins für eine bestimmte Zeit, und (d) Bewertung der Lebensfähigkeit der Hautprobe und damit der Hauttoxizität des Toxins.
Hautproben, die für diesen Toxizitätsassay verwendet werden, sind bevorzugt frei von Haaren. Eine bevorzugte Quelle für unbehaarte Haut ist ein unbehaartes Tier, wie ein athymsches nacktes Tier. Ein beispielhaftes nacktes Tier ist ein gezüchteter nackter Mäusestamm, der aus Balb/C nackten Mäusen abgeleitet ist.
Die extrazelluläre Stützmatrix, das Medium und die Kultivierungsbedingungen für den Hauttoxizitäts-Assay entsprechen den Bedingungen, wie sie oben unter Bezug auf das Verfahren zur Hisokultivierung unter Erhalt des natürlichen Zustands beschrieben wurden.
In einer Ausführungsform wird die Lebensfähigkeit beurteilt, indem der Einbau eines Indikators in die Zellen der Haut gemessen wird, der spezifisch für lebensfähige Zellen ist. Der Ausdruck "spezifisch für lebensfähige Zellen", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß der Indikator in lebenden Zellen, jedoch nicht in toten Zellen aufgenommen oder eingebaut wird.
Der für lebende Zellen spezifische Indikator kann ein Vorläufermetabolit sein oder ein Nicht-Metabolit, der in lebende Zellen eindringen kann. Beispielhafte Vorläufermetabolite sind Ribo- oder Desoxyribonucleinsäurevorläufer, wie Purine, Pyrimidine, Nukleoside und Nukleotide. Vorzugsweise ist der Vorläufermetabolit mit einem Indikationsmittel verbunden, um die Detektion zu erleichtern. Ein bevorzugtes. Indikatormittel für den Vorläufermetaboliten ist ein Radiolabel, wie ³&sup5;S, ³²P, ¹²&sup5;J, ³H usw.. Ein als Indikator besonders bevorzugter radioaktiv markierter Vorläufermetabolit ist ³H-Thymidin.
Ein bevorzugter nichtmetabolischer Indikator, der spezifisch für lebende Zellen ist, ist ein Farbstoff, der optisch detektiert werden kann. Jeder aus dem Stand der Technik als spezifisch für lebende Zellen bekannter Farbstoff kann für den erfindungsgemäßen Hauttoxizitätstest verwendet werden. Siehe z. B. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, R. P. Haugland (Hrsg.), Verlag Molecular Probes, Eugene, Oregon (1989-1991).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Farbstoff ein fluoreszierender Farbstoff. Beispielhafte fluoreszierende, für lebende Zellen spezifische Farbstoffe sind BCECF-AM (B-1150), Calcein-AM (C-1430), CFDA (Carboxyfluoresceindiacetat; C-195), Acridinorange (A-1301), Calceinblau (H-1426), Fura-2AM (F-1201), Fluoresceindiacetat (F-1303) oder das Carboxyanaloge (C-1431) usw.. Derartige Farbstoffe sind im Stand der Technik wohlbekannt und kommerziell erhältlich (Molecular Probes, Eugene OR). Besonders bevorzugt sind die Farbstoffe BCECF-AM oder Calcein-AM. Die Ziffern in Klammern beziehen sich auf die Produktnummern der katalogisierten Fluoreszenzfarbstoffe, die bei Molecular Probes erhältlich sind.
In einer Ausführungsform hängt der Einbau oder die Aufnahme des für lebende Zellen spezifischen Fluoreszenzfarbstoffes von der metabolischen Aktivität der lebenden Zelle ab. Nach dieser Ausführungsform werden nicht-fluoreszierende Farbstoffe von lebenden Zellen aufgenommen und durch ein intrazelluläres Enzym, wie eine Esterase, in ein fluoreszierendes Produkt umgewandelt. Das Auftreten intrazellulärer Fluoreszenz weist auf Lebensfähigkeit hin.
Bei einer anderen Ausführungsform wird die Lebensfähigkeit bestimmt, indem die Aufnahme oder der Einbau eines Indikators, der spezifisch für tote Zellen ist, in die Zellen der Hautprobe bestimmt wird. Der Begriff "spezifisch für tote Zellen", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß der Indikator nur von toten, nicht mehr lebenden Zellen aufgenommen oder eingebaut wird.
Typischerweise sind Farbstoffe, die spezifisch für tote Zellen sind, Verbindungen mit einer hohen Ionenladung und niedriger Permeabilität, so daß die Farbstoffe eine intakte Zellmembran nicht durchdringen können. Sterben die Zellen ab, wird die Membran in ihrer Struktur und Funktion zerstört, so daß Farbstoffe, die spezifisch für tote Zellen sind, in den intrazellulären Raum eindringen können, wo sie an intrazellulären Verbindungen, wie der Kernmembran, anbinden.
Ein bevorzugter, für tote Zellen spezifischer Indikator ist ein Farbstoff, der optisch detektiert werden kann. Ein bevorzugter, für tote Zellen spezifischer Farbstoff ist ein fluoreszierender Farbstoff, wie Propidiumiodid, Ethidiumbromid, ein Ethidiumhomodimer [(5,5'-Diazadecamethylen)-bis-(3,8-diamino-6-phenylphenanthridium)dichlorid, dihydrochlorid] usw.. Besonders bevorzugt ist Propidiumiodid. Propidiumiodid (PI) und andere für tote Zellen spezifische Farbstoffe sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt und können kommerziell bezogen werden (Molecular Probes, Eugene, OR).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Lebensfähigkeit bestimmt, indem gleichzeitig die Aufnahme oder der Einbau sowohl eines für lebende Zellen spezifischen Indikators als auch eines für tote Zellen spezifischen Indikators gemessen wird. Die Lebensfähigkeit bestimmt sich als das Verhältnis von lebenden zu toten Zellen. Sind sowohl der für lebende Zellen spezifische Indikator als auch der für tote Zellen spezifische Indikator fluoreszierende Farbstoffe, sollten diese Farbstoffe unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen, um die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen zu erleichtern. Zusammensetzungen und Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen durch die differentielle Aufnahme von Indikatoren, die spezifisch für lebende und tote Zellen in Gewebekulturproben sind, sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Haughland, aaO..
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Hauttoxizitätsassay weiter die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Hautprobe vor der Behandelung der Hautprobe mit einem mutmaßlichen Toxin und den Vergleich der bestimmten Lebensfähigkeit vor und nach der Behandlung mit dem mutmaßlichen Toxin und damit die Bestimmung der Toxizität des Toxins.
Die Mittel zur Bestimmung der Aufnahme oder des Einbaus von für lebende Zellen spezifischen Indikatoren hängen vom jeweils verwendeten Indikator ab und sind dem Fachmann wohlbekannt. Ein bevorzugtes Mittel zur Bestimmung radioaktiv markierter Vorläufermetabolite ist die Autoradiographie histologischer Schnitte von Hautproben, die den Vorläufer aufgenommen haben.
Ein bevorzugtes Mittel zur Bestimmung von Farbstoffen ist die mikroskopische Untersuchung. Die mikroskopische Untersuchung kann den Gebrauch jedes Mikroskops umfassen, mit dem es möglich ist, selektiv und reproduzierbar den Einbau des Indikators in bestimmte Zellen der Hautprobe an unterschiedlichen Orten innerhalb der dreidimensionalen, den natürlichen Zustand aufweisenden Hauthistokultur zu bestimmen.
Typischerweise erfordert die mikroskopische Untersuchung die Möglichkeit einer optischen Sektionierung. Unter optischer Sektionierung versteht man die Möglichkeit, vorgewählte Tiefen innerhalb des dreidimensionalen Aufbaus der Haut zu untersuchen, unter Vermeidung optischer Interferenzen, die durch die Anwesenheit von Luftbläschen, Fetttröpfchen und anderer Gewebebestandteile bedingt werden und Lichtreflexionen und optische Interferenzen verursachen.
Zusätzlich ermöglicht eine optische Sektionierung die Betrachtung verschiedener Ebenen innerhalb der dreidimensionalen Hauthistokultur. Indem nacheinander aufeinanderfolgende Schichten der Haut untersucht werden, kann ein komplettes Bild der Haut erhalten werden oder alternativ ein Bild eines Bereichs der Haut, in dem ein bestimmter Zelltyp von Interesse lokalisiert ist. Auf diese Weise können Vergleichsstudien in einer Vielzahl von Tiefen oder Bereichen der Haut durchgeführt werden. Auf diese Weise kann die Lebensfähigkeit von Zellen an der Oberfläche untersucht werden, von Zellen unterhalb der dermalen Schicht, von Zellen in der epidermalen Schicht oder von bestimmten anderen Zelltypen, wie Nervenzellen, talgabscheidenden Zellen, Haarfollikelzellen.
Die Dicke der optischen Schichten kann verändert werden und an die Zellgröße oder das zu untersuchende Gewebe angepaßt zu werden und kann zwischen ungefähr 0,1 bis 1000 Mikrometer betragen. Bevorzugt sind Schichtdicken im Bereich von 0,5-10 Mikrometer, vorzugsweise ungefähr 2 bis 6 Mikrometer.
Ein bevorzugtes Mikroskop, mit dem eine optische Sektionierung ausgeführt werden kann, ist das konfokale Laser-Rastermikroskop, wie das MRC-600 CONFOCAL IMAGING SYSTEM (Bio-Rad, Richmond, Ca.), montiert auf einem Nikon Optiphot unter Verwendung eines planen 10x PlanApo Objektivs. Ein derartiges konfokales Rastermikroskop wurde erfolgreich für Untersuchungen der Hauttoxizität (siehe Beispiele 1 und 2) eingesetzt. Andere verfügbare Verfahren zum optischen Rastern oder zur Sektionierung von Ebenen der Gewebeprobe können für die vorliegende Erfindung ebenfalls herangezogen werden.
Die Lebensfähigkeit wird auf der Grundlage der Aufnahme von Indikatoren, die jeweils spezifisch für lebende oder tote Zellen sind, an jedem beliebigen Ort innerhalb der Haut bestimmt als das Verhältnis von lebenden oder toten Zellen zur Gesamtheit der Zellen oder als Verhältnis von lebenden zu toten Zellen. Wird die Lebensfähigkeit sowohl vor wie auch nach der Behandlung mit einem mutmaßlichen Toxin bestimmt, liefert der Vergleich des Verhältnisses von lebenden zu toten Zellen, das vor und nach der Behandlung mit dem vermeintlichen Toxin bestimmt wurde, einen Maßstab für die Toxizität des vermeintlichen Toxins.
Das Verfahren, nach dem die Indikatoren der Hautkultur beigegeben werden variiert mit dem jeweils verwendeten Indikator. Typischerweise werden die Indikatoren ungefähr 6 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden nachdem die Hautprobe in das Medium gegeben wurde, dem Medium beigegeben. Nachdem der Indikator dem Medium beigegeben wurde, wird die Kultur für eine Zeitdauer bei Kultivierungsbedingungen gehalten, die ausreichend ist, daß der Indikator in die Zellen der Hautprobe eindringen und diese markieren kann. Bevorzugt wird die Kultur zwischen ungefähr 5 Minuten und ungefähr 2 Stunden in der Gegenwart des Indikators gehalten und besonders bevorzugt zwischen ungefähr 10 und 20 Minuten.
Die Konzentration des dem Medium zugegebenen Indikators variiert mit dem im speziellen Fall verwendeten Indikator. Werden die fluoreszierenden Farbstoffe PI und BCECF-AM verwendet, ist die Konzentration des Farbstoffs ungefähr 1 bis ungefähr 100x10-6 molar, und besonders bevorzugt jeweils ungefähr 5 · 10&supmin;&sup6; molar.
Typischerweise wird die Hautprobe mit dem mutmaßlichen Toxin in Kontakt gebracht, indem das Toxin direkt in das Medium gegeben wird. Alternativ kann das Toxin direkt auf die Oberfläche der Hautprobe gegeben werden. Nach der Zugabe des Toxins wird die Hautprobe für eine vorbestimmte Zeit im toxinhaltigen Medium belassen, wobei die Zeit von dem jeweils untersuchten Toxin abhängt.
Der erfindungsgemäße Hauttoxizitätsassay bietet gegenüber den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Verfahren zur Toxizitätsprüfung Vorteile und Nutzen. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, daß ein zuverlässiger in vitro Assay zur Verfügung steht, bei dem vermieden wird, daß lebende Tiere toxischen Substanzen ausgesetzt werden. Der vorliegende Assay kann daher die traditionellen Verfahren zur Toxizitätsprüfung, wie den Draize-Test, ersetzen.

C. Assay für Haarwachstum

Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Assay für Haarwachstum, umfassend die Schritte, Übertragen einer Hautprobe mit einer inneren und einer äußeren Fläche auf eine in einem Medium eingetauchte extrazellulären Stützmatrix, wobei die innere Fläche benachbart zur Matrix ist und die äußere Fläche oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt ist, Halten der Matrix mit der darauf vorgesehenen Hautprobe im Medium bei Bedingungen zur Kultivierung von Haut, und Bestimmung des Wachstums der Haare der Haut.
Für den Assay für Haarwachstum stammt die Hautprobe von einem behaarten Tier, weshalb die Hautprobe Haarzellen enthält, einschließlich der normalen ergänzenden Gewebebestandteile zur Unterstützung des Haarwachstums, einschließlich der Haarfollikel, des Haarschafts und verbundener Strukturen, die typischerweise in der die Haarwurzel umgebenden Haut gefunden werden. Bevorzugt enthält die Hautprobe mehrfache Haarschäfte. Ein besonders bevorzugtes Tier ist ein Jungtier. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Haut aus dem dorsalen Rücken, dem Nacken oder der Kopfhaut entnommen, wenngleich jede Art von Haarwachstum unterstützender Haut verwendet werden kann. Vor der Entnahme aus dem Tier wird die Hautprobe rasiert oder geschoren. Es können auch andere Verfahren zur Haarentfernung verwendet werden, wobei darauf geachtet werden muß, daß das Haarfollikel nicht aus der Haut entfernt wird und die Basis des Haarschafts nicht aus dem Follikel entfernt wird.
Die Art der extrazellulären Stützmatrix, die Zusammensetzung des Mediums und die Kultivierungsbedingungen sind im wesentlichen die gleichen, wie sie oben beim System zur Histokultivierung und beim Hauttoxizitätsassay beschrieben wurden.
Der Assay für Haarwachstum umfaßt die Schritte (a) Kultivierung einer von einem behaarten Tier erhaltenen Hautprobe mit einer Inneren und einer äußeren Fläche auf einer in einem Medium eingetauchten extrazellulären Stützmatrix, wobei die innere Fläche benachbart zur Matrix ist und die äußere Fläche oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt ist, (b) Ausführen einer ersten Bestimmung des Zustandes des Haarwuchses, (c) Halten der Hautprobe und der Matrix im Medium für eine vorbestimmte Zeitdauer, (d) Ausführen einer zweiten Bestimmung des Zustandes des Haarwuchses und (e) Vergleichen der ersten und zweiten Bestimmung des Zustandes des Haarwuchses und damit Bestimmung des Haarwachstums.
Unter dem Begriff "Zustand des Haarwuchses", wie er hier verwendet wird, wird jeder Parameter verstanden, der kennzeichnend für das Haarwachstum ist. Vorzugsweise ist ein derartiger Parameter eine physikalische Meßgröße des Haares und besonders bevorzugt die Haarlänge oder die Haardicke. Die Mittel zur Bestimmung des Zustandes des Haarwuchses hängen vom jeweils untersuchten Parameter ab. Wird die Haarlänge als Parameter herangezogen, wird die Haarlänge in situ auf der histokultivierten Hautprobe bestimmt. Wird als Parameter der Haardurchmesser herangezogen, wird der Durchmesser in situ unter Verwendung einer mikroskopischen Vergrößerung des Haarschafts bestimmt oder in vitro unter Verwendung von Mikrofotografien von histologisch geschnittenen Haarschäften. Assays zur Bestimmung des Haarwuchses sind im Stand der Technik wohlbekannt. Fraiter et al., J. Invest. Dermatol., 61: 72-81 (1973).
Neben der Bereitstellung von in vitro Mitteln zur Messung des Wachstums, ist der vorliegende Assay auch von Nutzen bei der Bewertung der Auswirkungen von mutmaßlichen Mitteln zur Förderung des Haarwuchses. Bei dieser Ausführungsform wird bei einer histokultivierten Hautprobe zunächst eine anfängliche Bestimmung des Zustandes des Haarwachstums durchgeführt, ein mutmaßliches Mittel zur Förderung des Haarwuchses mit der Hautprobe in Verbindung gebracht, die Hautprobe für eine bestimmte Zeit in Gegenwart des Haarwuchsmittels gehalten, eine zweite Bestimmung des Zustandes des Haarwuchses durchgeführt und ein Vergleich der Veränderungen der Haarwachstums in Gegenwart und in Abwesenheit des Wirkmittels gezogen. Eine derartige Ausführungsform ist beispielsweise beim Test der Hypertrichosiseffekte von Drogen wie Minoxidil, Diazoxid usw. von großem Nutzen.
Alternativ kann der Assay für Haarwachstum auch so modifiziert werden, daß neben dem Haarwuchs andere Eigenschaften des Haars studiert werden können. Beispielsweise kann der Assay auch dazu verwendet werden, um die Wirksamkeit und die Sicherheit von Zusammensetzungen, wie Farbstoffe, die zur Änderung der Haarfarbe entwickelt worden sind, zu testen. Der vorliegende Assay und seine Abwandlungen stellt den Herstellern von Substanzen, die zur Beeinflussung des Wachstums oder der Eigenschaften des Haares entwickelt wurden, eine Möglichkeit zur Verfügung, ihre Substanzen in vitro zu testen, ehe damit an lebenden Tieren, wie auch Menschen, experimentiert wird.

D. Anti-Alterungs- /Anti-Falten-Assays

Das erfindungsgemäße Histokultivierungssystem für Haut unter Erhalt des natürlichen Zustands kann auch für Assays verwendet werden, mit denen die Anti- Alterungs- oder die Anti-Falten-Wirkung mutmaßlicher Substanzen gegen Alterung oder Faltenbildung bewertet werden können. Bei derartigen Assays ist die extrazelluläre Stützmatrix, das Medium und die Kultivierungsbedingungen für die Haut im wesentlichen gleich wie oben in Bezug auf den Hauttoxizitäts-Assay beschrieben. Die beim Anti-Alterungs oder Anti-Falten-Assay verwendeten Hautproben können jedoch sowohl von haartragenden wie auch von haarlosen Tieren stammen.
Beim Anti-Alterungs-Assay wird ein für das Hautalter kennzeichnender Parameter bestimmt. Beispielhafte, für das Alter kennzeichnende Parameter umfassen die Dicke der Epidermis (die Epidermis wird mit fortschreitendem Alter dünner), der Melaningehalt der Epidermis (der Melaningehalt nimmt mit dem Alter ab) und die Anzahl epidermaler Drüsen (die Anzahl nimmt mit dem Alter ab). Cecil Textbook of Medicine, 15. Auflage, Beeson et al. (Hrsg.), W. B. Saunders, Philadelphia, S. 27 und 2272, (1979).
Beim Anti-Falten-Assay werden Parameter beurteilt, die kennzeichnend für die Faltenbildung sind. Beispielhafte, für die Faltenbildung kennzeichnende Parameter umfassen den Kollagen- und den Elastingehalt (bei beiden nimmt dieser in Abhängigkeit von zunehmender Faltenbildung ab), die Hautelastizität und physikalische Meßgrößen, wie die Anzahl und die Verteilung von Falten in der Epidermis. Textbook of Medicine, aaO..
In einer Ausführungsform des Anti-Alterungs-Assays und des Anti-Falten-Assays wird die Hautprobe einem älteren tierischen Donor entnommen, bei dem die Haut bereits Alterungserscheinungen oder Faltenbildung zeigt und die mutmaßlichen Wirkstoffe gegen Alterung oder Faltenbildung werden auf ihre Fähigkeit untersucht, den Alterungsvorgang oder die Faltenbildung umzukehren oder abzuschwächen.
In einer anderen Ausführungsform wird die Hautprobe einem jungen Tier entnommen und der mutmaßliche Wirkstoff gegen Alterung oder Faltenbildung auf seine Fähigkeit getestet, einen Alterungsprozeß oder eine Faltenbildung zu verhindern.
Der Anti-Alterungs- oder der Anti-Falten-Assay hat mehrere Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten. Die Assays können verwendet werden, um die Auswirkungen von Kosmetika zu testen, wie Feuchtigkeitscremes, Trägersubstanzen, Linderungsmittel, Emulgatoren usw..
In einer Ausführungsform können zahlreiche Parameter der Hautprobe vor und nach der Behandlung mit den Testsubstanzen bestimmt werden. Auf diese Weise können gleichzeitig im selben Histokultivierungssystem Daten bestimmt werden, die die Auswirkungen verschiedener Substanzen auf den Alterungsprozeß, die Faltenbildung, die Toxizität und das Haarwachstum betreffen.
Die folgenden Experimente dienen dazu, bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zu verdeutlichen und beschränken die Beschreibung und die Ansprüche in keiner Weise.

Beispiele

1. Histokultur für Haut unter Erhalt des natürlichen Zustands

Hautproben mit einer äußeren Oberfläche von ungefähr 10 mm² und einer Dicke von ungefähr ein bis zwei mm wurden einer athymischen nackten Maus entnommen und auf einer GELFOAMTM-Matrix aufgebracht, die in Eagle's MEM eingetaucht war, dem ungefähr 0,2 mg/ml Gentamicin und ungefähr 10% (v/v) fetales Rinderserum beigegeben war. Vor der Anwendung wurde die Matrix für vier Stunden bei 37ºC im Medium eingeweicht, um die Matrix im Medium zu äquilibrieren.
Die Hautproben wurden auf der Matrix bei einer Temperatur von ungefähr 37ºC in einem begasten Inkubator unter einer Mischung von 95% Luft und 5% CO&sub2; im Medium gehalten. Die Lebensfähigkeit der kultivierten Hautproben wurde, wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt, zu verschiedenen Zeiten nach dem Beginn der Kultivierung beurteilt. Die Lebensfähigkeit wurde als die Aufnahme eines Indikators bewertet, der spezifisch für lebende Zellen ist (BCECF-AM) und eines Indikators, der spezifisch für tote Zellen ist (Propidiumiodid PI), oder als Aufnahme von [³H]-Thymidin.
Die als Indikatoren verwendeten fluoreszierenden Farbstoffe BCECF-AM und PI (Molecular Probes, Eugene, OR) wurden in einer endgültigen Konzentration von 5 · 10&supmin;³ mol/l direkt in das Medium gegeben. Der Einbau der Farbstoffe wurde 30 Minuten nach der Zugabe der Farbstoffe zum Medium mikroskopisch durch optisches Scannen unter Verwendung eines MRC-600 konfokalen Abbildungssystem (Bio-Rad, Richmond, CA) ausgewertet, das auf einem mit einem 10x PlanApo Objektiv ausgerüsteten Nikon Optiphot montiert war.
Die Proben wurden untersucht unter Verwendung optischer Sektionen von ungefähr 4 Mikrometern.
Das [³H]-Thymidin wurde bis zu einer Endkonzentration von 4 uCi/ml direkt in das Medium gegeben. Die Hautproben wurden für 3 Tage in dem Thymidin-haltigen Medium gehalten. Nach 3 Tagen wurden die Hautkulturen mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (pH = 7,0) gewaschen, in histologische Kapseln überführt und mit 10%-igem Formalin (v/v) fixiert. Die fixierten Hautkulturen wurden anschließend dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und nach Standardverfahren, die einem Fachmann auf dem Gebiet der Histologie wohlbekannt sind, auf Objektträgern aufgebracht. Die Schnitte wurden entparaffiniert, mit einer Kodak NTB-2 Emulsion bedeckt, für 5 Tage freigelegt und entwickelt. Siehe Freeman et al., Proc. Soc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2694-2698 (1986) sowie Hoffman et al., Proc. Soc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2013-2017 (1989). Die entwickelten Schnitte wurden gespült, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und mit einem mit einer epi-Illumination Polarisation ausgerüsteten Nikon oder Olympus Photomikroskop untersucht.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt.
Wie in Fig. 1 dargestellt, zeigt eine auf einer in Eagle's minimalem essentiellen Medium treibenden GELFOAMTM Matrix für 2 Tage histokultivierte Mäusehaut für alle wesentlichen Zelltypen einen Erhalt des natürlichen Zustands und des dreidimensionalen Aufbaus des Gewebes. Bei Haarfollikeln, epidermalen Zellen und dermalen Fibroplasten konnte problemlos der Einbau von BCECF-AM (grün, lebende Zellen) jedoch nicht von PI (rot, tote Zellen) durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden, wobei diese die normale Morphologie aufzuweisen scheinen. Die Histokulturen der Haut waren für zumindest 10 Tage lebensfähig.
Wie in Fig. 2 gezeigt, behielten die Zellen der Haut-Histokultur ihre Proliferationsfähigkeit für bis zu 6 Tage. Die DNS-Synthese und die Replikation, sichtbar gemacht durch histologische Autoradiographie unter Verwendung polarisierender Photomikroskopie ([³H]-Thymidin markierte Kerne erscheinen leuchtend grün), konnte in Haarfollikeln, epidermalen und dermalen Zellen nachgewiesen werden. Der prozentuale Anteil der [³H]-markierten Zellen betrug für die Follikel, die epidermalen und die dermalen Zellen jeweils 38,6%, 75,2%, sowie 10,2%.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Hautproben bei der Histokultivierung auf einer GELFOAMTM-Matrix in Eagle's MEM für zumindest mehrere Tage lebensfähig bleiben.

2. Hauttoxizitäts-Assay

Hautproben von athymischen nackten Mäusen wurden unter Verwendung von BCECF-AM und [³H]-Thymidin als für lebende Zellen spezifischer Indikator und von PI als für tote Zellen spezifischen Indikator nach dem Verfahren aus Beispiel 1 kultiviert. Die Lebensfähigkeit wurde vor und nach der Zugabe eines mutmaßlichen Toxins bestimmt. Die Aufnahme dieser Indikatoren wurde nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ausgewertet.
Eine erste Bestimmung der Lebensfähigkeit wurde 2 Tage nach dem Beginn der Hautkultivierung unter Verwendung von BCECF-AM und PI durchgeführt. Unmittelbar nach dieser Bewertung wurden verschiedene Konzentrationen der Toxine Ethanol, Doxorubicin oder Natriumhypochlorit mit den Hautproben in Kontakt gebracht. Die Endkonzentration der Toxine schwankte von etwa 0,5% bis etwa 70% (v/v) für Ethanol, von etwa 29 bis etwa 725 mg/ml für Doxorubicin und von etwa 0,6% bis etwa 60% (v/v) für Natriumhypochlorit.
Die Hautproben wurden für jeweils ungefähr 5 Minuten, für ungefähr 24 Stunden und für ungefähr 2 Stunden mit Ethanol, Doxorubicin und Natriumhypochlorit in Kontakt gebracht. Nach diesen Kontaktzeiten wurde das toxinhaltige Medium durch frisches, toxinfreies Medium ersetzt und die Hautproben unter Verwendung von BCECF-AM und PI erneut auf ihre Lebensfähigkeit untersucht. Die Lebensfähigkeit wurde vor und nach dem Kontakt mit dem Toxin jeweils im selben Bereich der Hautprobe durchgeführt.
Zusätzlich wurden die Hautproben, welche mit Doxorubicin in Kontakt gebracht worden waren, auf ihre Lebensfähigkeit untersucht, indem 24 Stunden nach dem Kontakt mit dem Toxin die Aufnahme von [³H]-Thymidin gemessen wurde.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Fig. 3-7 zusammengefaßt.
Fig. 3 zeigt eine farbige Mikrofotografie einer histokultivierten Mäusehaut vor und nach der Behandlung mit Ethanol. Die Toxizität von Ethanol wurde bestimmt, indem die Lebensfähigkeit der Hautprobe vor und nach der Behandlung mit Ethanol bestimmt wurde und die beiden Messungen der Lebensfähigkeit verglichen wurden. Wie bei der oben in Beispiel 1 beschriebenen Bestimmung der Lebensfähigkeit werden die lebenden Zellen grün gefärbt, während die toten Zellen rot gefärbt sind. Die Mikrofotografien zeigen, daß vor der Behandlung mit Ethanol (linke Abbildungen) die überwiegende Zahl der Zellen in der Mäusehaut lebensfähig waren. Nach einer Behandlung mit entweder 0,5% (v/v) (Abbildung rechts oben) oder mit 5% Ethanol (Abbildung rechts unten) starb eine große Zahl der Zellen ab. Die Daten zeigen weiter, das 5,0% Ethanol toxischer ist (ein höherer Verlust der Lebensfähigkeit) als 0,5% Ethanol. Die Ergebnisse, die bei Verwendung von Ethanol mit einem Gehalt von 30%, 50% und 70% erhalten wurden, zeigen eine steigende Abnahme der Lebensfähigkeit, welche die bei Verwendung von 5%-igem Ethanol beobachteten Verluste übersteigen (Daten nicht gezeigt).
Die Ergebnisse aus Fig. 4 zeigen die dosisabhängige toxischen Wirkungen von Ethanol auf histokultivierte Mäusehaut. Bei dieser Studie wurde die Toxizität als prozentualer Anteil der abgetöteten Zellen ausgedrückt. Der Anteil der abgetöteten Zellen (PI-positive Zellen) relativ zur Gesamtzahl der Zellen (PI-positive Zellen (rot) plus BCECF-AM-positive Zellen (grün)) in den behandelten Kulturen wird mit Hilfe von konfokaler Fluoreszenz-Rastermikroskopie gemessen und zur Bestimmung der Zytotoxizität mit einer unbehandelten Kontrolle verglichen. Der prozentuale Anteil der abgetöteten Zellen wird ausgedrückt als die Zahl der roten Zellen nach er Behandlung minus der Zahl der roten Zellen vor der Behandlung dividiert durch die Gesamtzahl der Zellen (grüne Zellen nach der Behandlung plus rote Zellen nach der Behandlung). Die Ergebnisse zeigen, das der prozentuale Anteil der abgetöteten Zellen (Toxizität) mit steigender Ethanolkonzentration ansteigt.
In gleicher Weise wie oben für Ethanol beschrieben, wurden auch die Auswirkungen von Doxorubicin und Natriumhypochlorit auf die Hauttoxizität bestimmt.
Die Daten aus Fig. 5 zeigen die dosisabhängigen Wirkungen von Doxorubicin auf histokultivierte Mäusehaut. Die Ergebnisse zeigen, daß die Toxizität von Doxorubicin im wesentlichen proportional zur Konzentration des dem Histokultivierungssystem zugegebenen Doxorubicin ist.
Die Daten aus Fig. 6 zeigen die dosisabhängige toxische Wirkung von Doxorubicin auf verschiedene Zelltypen der in einem natürlichen Zustand histokultivierten Mäusehaut, nämlich auf dermale Zellen, epidermale Zellen und auf Follikelzellen. Wird histokultivierte Mäusehaut für 24 Stunden Doxorubicin ausgesetzt, so zeigt sich eine dosisabhängige Inhibierung der DNS-Synthese in den Hautzellen. Bei dieser Untersuchung wird die Toxizität als prozentuale Zellproliferation ausgedrückt. Die prozentuale Zellproliferation wurde berechnet aus dem Verhältnis von (1) dem prozentualen Anteil von mit [³H]-Thymidin markierten Zellen an der Gesamtzahl der mit Doxorubicin behandelten Zellen und (2) dem prozentualen Anteil von mit [³H]- Thymidin markierten Zellen an der Gesamtheit der Gesamtzahl der Zellen einer Kontrolle aus unbehandelten Zellen. Im Vergleich zur Kontrolle bewirkt eine Behandlung mit Doxorubicin eine dosisabhängige Abnahme der Zellproliferation. Die Daten zeigen auch, daß die Wirkung von Doxorubicin in Abhängigkeit vom Zelltyp variiert. Die Toxizität von Doxorubicin war am stärksten bei Haarfollikelzellen ausgeprägt.
Fig. 7 zeigt eine Vergleichsstudie, die durchgeführt wurde, um die Zuverlässigkeit der Hauttoxizitätsprüfungen unter Verwendung der erfindungsgemäßen in vitro histokultivierten Hautproben im Vergleich zu in vivo durchgeführten Hauttoxizitätsprüfungen zu bewerten. Die in vivo Toxizitätsprüfung wurde nach einem Standardtest für Hautreizungen durchgeführt, wie er im weiteren beschrieben ist.
Kleine Stücke von Gazepapier (Größe ca. 1,5 cm²), die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumhypochlorit getränkt worden waren, wurden an drei unterschiedlichen Stellen eng an der dorsalen Fläche der Mäuse angelegt. Die Hautstellen wurden 0,5 und 1 Stunde nach Entfernung des Natriumhypochlorits an Hand einer von 1 bis 4 reichenden Skala auf Erytheme und Ödeme bewertet. Für jede Konzentration an Natriumhypochlorit wurde nach der folgenden Formel der primäre Reizungsindex (PII) berechnet:
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Fig. 7 zusammengefaßt.
Die Daten aus Fig. 7 zeigen eine hohe positive Korrelation zwischen der in vivo und der mit histokultivierter Mäusehaut ermittelten Toxizität. Im besonderen zeigen die Ergebnisse, das die Schwelle für die Toxizität (ca. 0,6% Natriumhypochlorit) in beiden Systemen gleich war.
Diese Daten zeigen, daß der erfindungsgemäße Hauttoxizitäts-Assay für die zuverlässige und genaue Bestimmung der Wirkung von mutmaßlichen Toxinen verwendet werden kann.

3. Haarwachstums-Assay

Hautproben behaarter Mäuse wurden entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1 histokultiviert, wobei drei verschiedene Zusammensetzungen der extrazellulären Stützmatrix verwendet wurden. Die drei Zusammensetzungen der extrazellulären Stützmatrix waren:
eine GELFOAMTM-Matrix,
eine Kombinationsmatrix aus einer oberen Schicht aus MATRIGELTM und aus einer unteren Schicht aus einem Zelluloseschwamm, und
eine Kombinationsmatrix aus einer oberen Schicht aus GELFOAMTM und einer unteren Schicht aus einem Zelluloseschwamm.
Das Haarwachstum wurde als Veränderung der Haarlänge während einer Histokultivierung von 6 Tagen beurteilt. Zum Vergleich wurde das Haarwachstum auch in vivo während der gleichen Dauer von 6 Tagen bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Fig. 8 zusammengefaßt.
Die Daten aus Fig. 8 zeigen, daß die histokultivierte Mäusehaut das normale Ausmaß an Haarwachstum zeigt. Das Haarwachstum der histokultivierten Hautproben näherte sich am nächsten der Wachstumsrate in vivo an, wenn die Kombinationsmatrix eine obere Schicht aus GELFOAMTM und eine untere Schicht aus einem Zelluloseschwamm aufwies.
Diese Daten zeigen zusammen mit den Ergebnissen der Beispiele 1 und 2, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren histokultivierte Hautproben (1) den natürlichen Zustand sowie ihren dreidimensionalen Aufbau beibehalten, (2) für mehrere Tage Ihre Lebensfähigkeit erhalten, (3) eine Zellproliferation zeigen, und (4) normales Haarwachstum zeigen. Zusätzlich zeigen diese Ergebnisse, daß mit derartigen Verfahren zur Histokultivierung zuverlässige in vitro Assays für Hauttoxizität und Haarwachstum zur Verfügung gestellt werden können.

Claims

1. Verfahren zur Histokultivierung einer Hautprobe in natürlichem Zustand, welche eine innere und eine äußere Fläche aufweist, umfassend die Schritte:

(a) Übertragen der Hautprobe auf einer extrazellulären Stützmatrix, wobei die Stützmatrix in einem Kulturmedium eingetaucht ist und auf diesem schwimmt,

und weiter die Matrix eine trabekuläre Struktur mit Zwischenräumen aufweist, die wie unter natürlichen Bedingungen zum Transport von Nährstoffen aus dem Medium zur inneren Fläche der Haut eine Kapillarwirkung zeigen,

wobei die innere Fläche benachbart zur Matrix ist und die äußere Fläche oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt ist; und

(b) die Matrix mit der darauf vorgesehenen Haut bei Kultivierungsbedingungen für Haut gehalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautprobe menschlichen Ursprungs ist.

3. Haarwachstums-Assay, umfassend die Schritte:

(a) Kultivierung einer Haarzellen enthaltenden Hautprobe mit einer inneren und einer äußeren Fläche auf einer extrazellulären Stützmatrix, wobei die Matrix in einem Medium eingetaucht ist und auf diesem schwimmt,

und weiter die Matrix eine trabekulare Struktur mit Zwischenräumen aufweist, die wie unter natürlichen Bedingungen zum Transport von Nährstoffen aus dem Medium zur inneren Fläche der Haut eine Kapillarwirkung zeigen,

wobei die innere Fläche benachbart zur Matrix ist und die äußere Fläche oberhalb der Oberfläche des Mediums freigelegt ist;

(b) Ausführung einer ersten Bestimmung des Zustandes des Haarwachstums;

(c) Halten der Hautprobe und der Matrix im Medium für eine vorbestimmte Zeit;

(d) Ausführung einer zweiten Bestimmung des Zustandes des Haarwachstums; und

(e) Vergleich der ersten und der zweiten Bestimmung des Zustandes des Haarwachstums und damit Bestimmung des Haarwuchses.

4. Assay nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Zustand des Haarwachstums als physikalische Größe des Haares ausgedrückt ist.

5. Assay nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautprobe menschlichen Ursprungs ist,

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die extrazelluläre Stützmatrix ein kollagenhaltiges Gel und/oder einen Schwamm aus einem Homopolysaccharid umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das kollagenhaltige Gel gelatinierte Schweinehaut und das Homopolysaccharid Zellulose ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die extrazelluläre Stützmatrix eine obere Schicht aus einem kollagenhaltigen Gel und eine untere Schicht aus einem Schwamm aus einem Homopolysacchridschwamm aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Homopolysaccharid Zellulose und das kollagenhaltige Gel gelatinierte Schweinehaut ist.

10. Hauttoxizitäts-Assay, umfassend die Schritte:

(a) Übertragen und Kultivieren einer Hautprobe auf einer extrazellulären Stützmatrix nach Anspruch 1;

(b) Kontaktieren der Hautprobe mit einem mutmaßlichen Toxin;

(c) Halten der Hautprobe und der Matrix in Gegenwart des Toxins für eine vorbestimmte Zeit; und

(d) Bestimmung der Lebensfähigkeit der Hautprobe und damit Hauttoxizität des Toxins.

11. Assay nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautprobe einem athymischen, nackten Tier entnommen ist.

12. Assay nach einem der Ansprüche 10 bis 11, weiter umfassend die Schritte einer Bestimmung der Lebensfähigkeit einer Hautprobe vor der Kontaktierung der Hautprobe mit einem mutmaßlichen Toxin und eines Vergleichs der vor und nach der Kontaktierung mit dem mutmaßlichen Toxin bestimmten Lebensfähigkeit zur Bestimmung der Toxizität des Toxins.

13. Assay nach einem der Ansprüche 10 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß die Lebensfähigkeit bestimmt wird, indem der Einbau eines für lebende Zellen spezifischen Indikators in die Zellen der Hautprobe gemessen wird.

14. Assay nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator radioaktiv markiertes Thymidin oder ein optisch detektierbarer Farbstoff oder ein fluoreszierender Farbstoff ist.

15. Assay nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der fluoreszierende Farbstoff BCECF-AM, Calcein-AM, CFDA, Acridinorange, Calceinblau, Fura-2AM, Fluoresceindiacetat oder das Carboxyanaloge ist.

16. Assay nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Bestimmung der Lebensfähigkeit ausgeführt wird, indem dem Medium ein erster Farbstoff zugegeben wird, der spezifisch für lebende Zellen ist, und ein zweiter Farbstoff, der spezifisch für tote Zellen ist, das farbstoffhaltige Medium für eine vorbestimmte Zeit beibehalten wird, und die Hautprobe zur Quantifizierung der Verteilung des ersten und des zweiten Farbstoffs in der Hautprobe optisch gescannt wird.

17. Assay nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der erste und der zweite Farbstoff fluoreszierende Farbstoffe mit unterschiedlichem Emissionsspektrum sind.

18. Assay nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der erste fluoreszierende Farbstoff BCECF-AM, Calcein-AM, CFDA, Acridinorange, Calceinblau, Fura-2AM, Fluoresceindiacetat oder das Carboxyanaloge ist und/oder der zweite fluoreszierende Farbstoff Propidiumiodid, Ethidiumbromid oder ein Ethidiumhomodimer ist.

19. Assay zur Bestimmung einer Wirkung gegen Alterung oder Faltenbildung eines mutmaßlichen Wirkstoffs gegen Alterung oder Faltenbildung, wobei der Assay die Schritte umfaßt:

(b) Kontaktierung der Hautprobe mit einem mutmaßlichen Wirkstoff gegen Alterung oder Faltenbildung;

(c) Halten der Hautprobe und der Matrix in Gegenwart des mutmaßlichen Wirkstoffs für eine vorbestimmte Zeit;

(d) Bewertung der Wirkung des mutmaßlichen Wirkstoffs durch Bestimmung eines für Hautalterung oder Faltenbildung bezeichnenden Parameter.

20. Assay nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, daß der die Hautalterung bezeichnende Parameter aus der von der Dicke der Epidermis, dem Melaningehalt der Epidermis und der epidermalen Drüsenzahl gebildeten Gruppe ausgewählt ist und/oder der die Faltenbildung bezeichnende Parameter aus der von dem Kollagen- und dem Elastingehalt, der Hautelastizität, und der Zahl und der Verteilung der epidermalen Falten gebildeten Gruppe ausgewählt ist.

21. Assay nach Anspruch 10 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die extrazelluläre Stützmatrix ein kollagenhaltiges Gel und oder einen Schwamm aus einem Homopolysaccharid umfaßt.

22. Assay nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das kollagenhaltige Gel gelatinierte Schweinehaut und das Homopolysaccharid Zellulose ist.

23. Assay nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die extrazelluläre Stützmatrix eine obere Schicht aus einem kollagenhaltigen Gel und eine untere Schicht aus einem Schwamm aus einem Homopolysaccharid aufweist.

24. Assay nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Homopolymer Zellulose und das kollagenhaltige Gel gelatinierte Schweinehaut ist.

25. Extrazelluläre Stützmatrix zur Histokultivierung von Haut unter Erhalt des natürlichen Zustands, umfassend eine obere Schicht aus einem kollagenhaltigen Gel und eine untere Schicht aus einem Schwamm aus einem Homopolysaccharid, wobei die Matrix eine trabekuläre Struktur mit Zwischenräumen aufweist, die wie unter natürlichen Bedingungen zum Transport von Nährstoffen aus dem Medium zur inneren Oberfläche der Haut eine Kapillarwirkung entfalten können.

26. Matrix nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das kollagenhaltige Gel gelatinierte Schweinehaut und das Homopolysaccharid Zellulose ist.