DE69218390T2

DE69218390T2 - Schnelle Kreuzkorrelation Frequenzbereichs Fluorometrie/Phosphorimetrie

Info

Publication number: DE69218390T2
Application number: DE69218390T
Authority: DE
Inventors: Beniamino Champaign Illinois 61820 Barbieri; Enrico Urbana Illinois 61801 Gratton
Original assignee: ISS USA Inc
Current assignee: ISS USA Inc
Priority date: 1991-12-13
Filing date: 1992-12-09
Publication date: 1997-10-02
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: JP3250023B2; EP0713088B1; CA2084742A1; EP0713088A3; JPH05264453A; EP0551736B1; US5212386A; DE69229606T2; DE69229606D1; EP0551736A1; DE69218390D1; EP0713088A2; ATE182212T1; ES2101813T3; ATE150547T1; CA2084742C

Description

ERFINDUNGSHINTERGRUND

Die beschriebene Erfindung betrifft eine verbesserte Form der Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometrie und/oder -Phosphorimetrie. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt und z.B. in der an Gratton erteilten US-Patentschrift Nr. 4,840,485 und des weiteren in einem umfangreichen Komplex technischer Literatur über dieses Fachgebiet beschrieben. Außerdem werden Instrumente zur Durchführung dieses Verfahrens u.a. von der I.S.S. Inc., 309 Windsor Road, Champaign, Illinois 61820, angeboten.
Instrumente zur Durchführung des obigen Verfahrens werden für Messungen des Fluoreszenzabklingens, des Phosphoreszenzabklingens, des Anisotropieabklingens der Fluoreszenz bzw. der Phosphoreszenz und anderer bekannter Anwendungen verwendet. Diese Instrumente unterscheiden sich von den gebräuchlicheren Stationärzustands-Spektralfluorometern, indem sie eine Einrichtung darstellen, die die zeitliche Entwicklung der Deaktivierung von Molekülen oder Atomen nach einer Anregung durch Licht aufzeichnen. Typische Zeiten dieser Vorgänge liegen in Zeitbereichen zwischen 1 Millisekunde und einer Pikosekunde. Derartige Frequenzbereich-Fluorometer (wobei dieser Begriff die entsprechenden Phosphorimeter mit einschließen soll) werden außerdem zur Messung von Zeiten bei anderen molekulardynamischen Vorgängen wie der Rotation von Molekülen oder Teilen großer Moleküle verwendet. Außerdem kann ein solche Einrichtung für die Zerlegung von Anregungs/Emissionsspektren verschiedener Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzmoleküle in einer Mischung verwendet werden; für die Bestimmung zeitlich aufgelöster Spektren; für die Auflösung des kinetischen Abklingens von Fluorophoren in einer Mischung; oder für die Messung von Reaktionen, die im angeregten Zustand der Elektronen auftreten.
In einem Frequenzbereich-Fluorometer wird der Lichtstrahl, der Fluoreszenzemissionen anregt, durch einen Lichtmodulator, z.B. eine Pockels-Zelle, amplitudenmoduliert, oder er ist bereits ursprünglich moduliert, wenn die Quelle ein phasengekoppelter Laser oder eine Synchrotron-Strahlungsquelle ist. Die Fluoreszenzemission ist phasenverschoben und in Bezug auf den Anregungs-Lichtstrahl demoduliert. Die Phasenverschiebung und die Demodulation stehen beide in Beziehung zu der Lebensdauer des angeregten Zustands des emittierenden Moleküls oder Atoms, und stellen somit eine Möglichkeit zur Bestimmung des Abklingverhaltens dar.
Derzeit sind zwei Typen von Frequenzbereich-Fluorometern im Handel erhältlich:
Bei einem ersten Instrumententyp wird der Anregungs-Lichtstrahl mit einer bestimmten Frequenz F moduliert, die im allgemeinen im Bereich 0,1 kHz bis 300 MHz liegt. Die Phasenverschiebung und die Demodulation der Fluoreszenz oder Phosphoreszenz werden mittels der Kreuzkorrelationsmethode gemessen. Die Messungen werden bei verschiedenen Modulationsfrequenzen wiederholt, normalerweise bei 10 bis 20 verschiedenen Frequenzen, die logarithmisch in einem gewünschten Frequenzintervall verteilt sind, das von der charakteristischen Abklingzeit der untersuchten fluoreszierenden oder phosphoriszierenden Moleküle abhängt. Dieser Instrumententyp wird in der Literatur als "serielles" Frequenzbereich-Fluorometer bezeichnet, da die verschiedenen Messungen bei unterschiedlichen Modulationsfrequenzen zeitlich aufeinanderfolgend vorgenommen werden.
Verschiedene Modelle solcher serieller Fluorometer sind im Handel erhältlich, z.B. das von I.S.S. 1989 eingeführte K2 und das SLM 48000, das von SLM Instruments vertrieben wird. Die Datenerfassung mit Instrumenten dieser Klasse erfordert normalerweise ein halbe bis eine Stunde zur Aufnahme von 10 bis 20 unterschiedlichen Frequenzen. Diese Instrumente bieten höchste Empfindlichkeit, was ein wichtiger Faktor bei der Arbeit mit Substanzen ist, die eine niedrige Fluoreszenzquantenausbeute aufweisen, oder bei Substanzen in niedriger Konzentration wie Proteine oder andere biologische Materialien. Des weiteren messen diese Instrumente die Rotationsgeschwindigkeiten der Moleküle auf differentielle Weise ohne die Erfordernis von Rücktransformations- bzw. Dekonvolutionsmethoden.
Ein zweiter Instrumententyp, wie in dem US-Patent Nr. 4,937,457 von Mitchell beschrieben und als Multiharmonisches Pikosekunden-Fourier-Fluorometer bezeichnet, wurde ebenfalls auf dem Markt eingeführt. Dieses Instrument wird als "paralleles" Frequenzbereich-Fluorometer bezeichnet, da Daten gleichzeitig bei verschiedenen Modulationsfrequenzen erfaßt werden. Normalerweise werden ungefähr 100 verschiedene Modulationsfrequenzen gleichzeitig erfaßt. Dieser Instrumententyp kann die Erfassungszeit um bis zu einer Größenordnung verringern, hat aber den Nachteil einer sehr geringen Empfindlichkeit. Der durch die Verringerung der Datenerfassungszeit erzielte Vorteil wird daher durch die Tatsache, daß die Anordnung nur zur Untersuchung von Systemen mit einem sehr starken Fluoreszenzsignal geeignet ist, ausgeglichen. Wenn das Signal niedrig ist, was bei den meisten Anwendungen im Bereich biologischer Materialien zutrifft, ist die einzige Möglichkeit, mit einer solchen Art von Instrument brauchbare Daten zu erhalten, eine Verlängerung der Datenerfassungszeit. Daher bietet das Instrument in vielen Fällen keinen echten Vorteil gegenüber einem standardmäßigen seriellen Instrument.
Das parallele Frequenzbereich-Fluorometer ist außerdem grundsätzlich teuerer, was einen weiteren Nachteil darstellt.
Die parallele Frequenzbereich-Fluorometrie ist in einer Veröffentlichung von B.A. Feddersen et al. mit den Titel Digital Acquisition in Frequency Domain Fluorometry, Rev. Sci. Instrum., Jahrg. 60, 1989, Seiten 2929-2936, beschrieben.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein neuer Typ eines Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometers und/oder -Phosphorimeters bereitgestellt, der gegenüber standardmäßigen seriellen Fluorometern eine deutlich verkürzte Zeit für die Erfassung eines einwandfreien Signals mit einem hohen Rauschabstand hat. Das Gerät entsprechend der vorliegenden Erfindung weist jedoch ebenfalls die hohe Empfindlichkeit für schwache Signale auf wie bei der seriellen Fluorometrie, während es eine Signalerfassungsgeschwindigkeit bietet, die derjenigen der parallelen Fluorometrie vergleichbar ist.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Gerät zur Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometrie und/oder -Phosphorimetrie. Das Gerät umfaßt eine Quelle für elektromagnetische Strahlung, wobei es sich typischerweise um Licht handelt, sowie eine Einrichtung zum Amplitudenmodulieren der elektromagnetischen Strahlung bei einer ersten Frequenz. Außerdem wird eine Einrichtung zum Richten der amplitudenmodulierten elektromagnetischen Strahlung auf eine zu untersuchende Probe bereitgestellt.
Außerdem wird eine Einrichtung zum Erfassen der Lumineszenz (oder Phosphoreszenz) der Probe bereitgestellt. Einrichtungen zum Liefern eines Signals, das kohärent mit amplitudenmodulierten Signalen ist, die durch die Amplitudenmodulationseinrichtung erzeugt werden, bei einer zweiten Frequenz an die Detektoreinrichtung sind vorhanden.
Außerdem sind Einrichtungen zum Modulieren der Verstärkung der Detektoreinrichtung oder zum Multiplizieren des Ausgangssignales der Detektoreinrichtung durch das Signal vorsehen. Die Einrichtung zur Modulation der Verstärkung umfaßt typischerweise Photovervielfacherröhren. Die alternative Ausgangsmultiplikationseinrichtung kann Photodioden und/oder Mikrokanalplatten für die äquivalente Funktion enthalten.
Die zweite Frequenz ist verschieden von der ersten Frequenz. Einrichtungen zum Ableiten eines sich ergebenden Signals aus der elektronagnetischen Strahlung und der Detektoreinrichtung bei einer Frequenz entsprechend der Differenz zwischen der ersten und zweiten Frequenz (wobei die Differenz die Kreuzkorrelationsfrequenz ist) sind bereitgestellt, um die Phasenverschiebungs- und Modulationsänderungen der Lumineszenz gegenüber der Quelle der elektromagnetischen Strahlung zu erfassen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Einrichtungen zum sequentiellen Durchführen von Läufen der Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometrie und/oder -Phosphorimetrie bei sequentiell unterschiedlichen ersten und zweiten Frequenzen durch das obenbeschriebene Gerät bereitgestellt. Zum Beispiel kann jede sequentiell unterschiedliche erste und zweite Frequenz entsprechend einer logarithmischen Folge verändert sein, jeweils aufeinanderfolgende erste und zweite Frequenzen können z.B. 10mal größer sein als die unmittelbar vorhergehenden ersten und zweiten Frequenzen, wobei typischerweise die Kreuzkorrelationsfrequenz während der sequentiell abgewickelten Läufe konstant bleibt. Einrichtungen zur Erfassung der Intensitäten von Signalantworten der Läufe bei der jeweiligen Frequenz, die die Differenz der jeweiligen ersten und zweiten Frequenzen ist, die in jedem Lauf verwendet werden, d.h. der Kreuzkorrelationsfrequenz eines jeden Laufes, werden bereitgestellt. Außerdem werden Einrichtungen bereitgestellt, um das Erfassen jeder Signalantwort bei den verschiedenen ersten und zweiten Frequenzen zu verlängern, bis ein integriertes Signal mit einer spezifizierten Standardabweichung für alle verschiedenen ersten und zweiten Frequenzen gewonnen ist.
Durch das Obige wird ein signifikanter Vorteil erzielt, da das mit den Messungen verbundene Rauschen nicht als für alle Modulationsfrequenzen gleich zu erwarten ist. Durch die vorliegende Erfindung werden die Messungen in einer solchen Weise vorgenommen, daß mehr Zeit aufgewendet wird, wenn bei Frequenzen gemessen wird, bei denen das Signal schwach ist, und, was wesentlich ist, es kann weniger Zeit bei Frequenzen aufgewendet werden, bei denen das Signal stark ist. Demzufolge können deutliche Zeiteinsparungen erzielt werden, da die Messung bei jeder Frequenz nur für den Zeitraum erfolgt, der erforderlich ist, um den gewünschten Rauschabstand für einen gewünschten Genauigkeitsgrad der Messung zu erhalten. Das heißt, die Erfassung ist "adaptiv" für jede Frequenz, da es möglich ist, eine annehmbare Standardabweichung für die Messung vorzugeben. Das Instrument gewinnt Daten bei der Kreuzkorrelationsfrequenz aller der verschiedenen ersten und zweiten Frequenzen, bis jeweils die spezifizierte Standardabweichung erreicht ist. Anschließend wird automatisch zum nächsten Satz von Frequenzen gewechselt.
Demgemäß kann im Gegensatz zu allen anderen Systemen nach dem Stand der Technik jede gewünschte Genauigkeit der Datenerfassung automatisch in der minimal erforderlichen Zeit für eine solche Erfassung erhalten werden.
Vorzugsweise werden Einrichtungen bereitgestellt, um automatisch ein Programm für die sequentiellen Läufe abzuarbeiten, um die Zeit, die für die Erfassung der gewünschten Daten erforderlich ist, nahezu auf das theoretische Minimum für das jeweils verwendete Gerät zu reduzieren.
Des weiteren kann eine Einrichtung bereitgestellt werden, um die Erfassung von Datenwellenformen, die durch die Signalableiteinrichtung bei jedem Lauf erfaßt werden, mit der Phase des Signals für das Modulieren der elektromagnetischen Strahlung bei der ersten Frequenz zu synchronisieren. Die obige Einrichtung veranlaßt auch die Überlagerung einander entsprechender Segmente der so erfaßten Wellenformen, um eine gemittelte Wellenform für jeden Lauf zu erhalten, die einen erhöhten Rauschabstand gegenüber den einzelnen Wellenformsegmenten hat. Dieser Prozeß gestattet die lineare Erhöhung des Rauschabstandes über der Zeit in einer Weise, die schneller ist, als die nach dem Stand der Technik verwendeten Verfahren.
Bei einem Ausführungsbeispiel enthält die Ableiteinrichtung für das sich ergebende Signal eine variable Frequenzdigitalfiltereinrichtung. Insbesondere ist die vorzugsweise Digitalfiltereinrichtung eingestellt, um Signalanworten bei im wesentlichen der Frequenz auszufiltern, die die Differenz der jeweiligen ersten und zweiten Frequenzen ist, d.h. bei der Kreuzkorrelationsfrequenz. Am besten ist es, wenn die Digitalfiltereinrichtung in der Lage ist, mit einer über der Zeit schmäler werdenden Bandbreite zu filtern, wenn eine Signalantwort erfaßt wird. Ein solches vorzugsweises Digitalfilter kann in dem Programm eines Personalcomputers bereitgestellt werden, der die Funktion des Geräts steuert. Das Digitalfilter beginnt mit einer breitbandigen Filterung, und wird anders als ein analoges Bandfilter, das immer die gleiche Bandbreite aufweist und nicht einstellbar ist, mit dem Fortschreiten des Prozesses schmalbandiger. Das variable Digitalfilter wickelt seinen Filtervorgang viel schneller ab, da zu Beginn eine Erfassung mit großer Bandbreite erfolgt, und dann auf die gewünschte Kreuzkorrelationsfrequenz zurückgegangen wird.
Zusätzlich kann als wesentliche Verbesserung die Filterfrequenz, auf die das Digitalfilter eingestellt ist, vom Anwender über die Computersoftware gewählt werden, und, sofern gewünscht, für verschiedenen Funktionen der Erfindung variieren. Somit kann bei der Wahl eines Satzes erster und zweiter Frequenzen für den Einsatz der Erfindung der Satz von Frequenzen typischerweise 10 oder 20 unterschiedliche erste und zweite Frequenzen für Untersuchungszwecke haben. Für eine einzelne Abtastung eines exponentiellen Abklingens kann man einfach nur einige Frequenzen wählen. Wahlweise können, wenn gewünscht, bis zu 50 Frequenzen oder mehr gewählt werden. Das erfindungsgemäße Gerät bietet die Möglichkeit, jede gewünschte Anzahl von Frequenzen für das Messen zu wählen, wobei dadurch das Verhältnis zwischen der Zeit, während der das Gerät Daten erfaßt, und der Zeit für die Vervollständigung der Messung (dem Bearbeitungszyklus) im Gegensatz zu Instrumenten, die derzeit dem Stand der Technik zuzurechnen sind, größer wird. Um eine geeignetere Frequenzverteilung für die Analyse zu erhalten, können des weiteren die Frequenzen gemäß einer linearen oder vorzugsweise einer logarithmischen Skala gewählt werden.
Zusätzlich kann das Signal von der Signalableiteinrichtung für das resultierende Signal automatisch in einer automatischen Verstärkungseinrichtung ohne Phasen- und Modulationsänderungen verstärkt werden, wenn eine Digitalfiltereinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Dies muß bei Verwendung von analogen Filtereinrichtungen wie beim Stand der Technik als nicht möglich angesehen werden.
Typischerweise werden die oben beschriebenen ersten und zweiten Frequenzen durch Frequenzsynthesizereinrichtungen, normalerweise phasengeregelte Frequenzsynthesizer, erzeugt. Obwohl zwischen den ersten und zweiten Frequenzen jede Differenz verwendet werden kann, ist es allgemein von Vorteil, eine Kreuzkorrelationsfrequenz von 100 bis 1000 Hz zu verwenden. Höhere Kreuzkorrelationsfrequenzen machen es möglich, eine größere Anzahl von überlagerten, einander entsprechenden Segmenten der Wellenform zu erhalten, so daß der Mittelwert der Wellenform für jeden Lauf einen höheren Rauschabstand hat und schneller erfaßt wird, wodurch eine insgesamte Erhöhung der Datenerfassungsgeschwindigkeit erzielt wird.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, daß die gewünschte Kreuzkorrelationsfrequenz, die durch das Digitalfilter bereitgestellt wird, in einfacher Weise auf eine Frequenz eingestellt werden kann, bei der das Signal klar empfangen wird. Zum Beispiel ist es möglich, wenn ein erfindungsgemäßes Instrument nahe bei einer Radarstation, einer Rundfunkstation oder einem Laborgebäude, in dem eine Kernspinresonanzeinrichtung betrieben wird, installiert ist, die ersten und zweiten Frequenzen und die Kreuzkorrelationsfrequenz des Digitalfilters neu einzustellen, um Interferenzprobleme zu vermeiden. Demgemäß können problemlos Messungen bei Kreuzkorrelationsfrequenzen von 10 Hz bis 100 kHz oder darüber vorgenommen werden.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Mehrfrequenz-Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometers;
Fig. 2 ist ein Blockdiagramm bestimmter Hardwarekomponenten und Funktionseinheiten des Fluorometers der Fig. 1;
Fig. 3 ist ein Blockdiagramm der Software-Kontrollroutine, die für das Fluorometer der Fig. 1 verwendet wird;
Fig. 4 ist ein Blockdiagramm der Software-Erfassungsroutine, die für das Fluorometer der Fig. 1 verwendet wird;
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung der Synchron- Erfassungsschaltung der Fig. 1;
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung der Steuerschaltung für die automatische Verstärkungseinrichtung, wie sie typischerweise im Personalcomputer der Fig. 1 eingesetzt wird; und
Fig. 7 ist ein beispielhafter Ausdruck von Daten, die mittels der Erfindung erfaßt wurden.

BESCHREIBUNG EINES TYPISCHEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS

Unter Bezugnahme auf Fig. 1 ist ersichtlich, daß das Fluorometer gemäß der Erfindung bis auf die hierin ausgeführten Ausnahmen in Aufbau und Funktion ungefähr den Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometern nach dem Stand der Technik entspricht.
Eine Lichtquelle 10 kann ein kontinuierlicher Laser oder eine kollimierte kohärente oder nicht kohärente Gleichspannungslichtquelle wie z.B. eine Bogenlampe sein. Licht vom Laser 10 durchläuft einen Lichtmodulator 12 wie z.B. eine Pockel-Zelle, um einen Lichtstrahl 14 bereitzustellen, der mit einer ersten Frequenz amplitudenmoduliert ist (wie oben ausgeführt). Das amplitudenmodulierte Licht durchläuft einen Strahlteiler 16 und gelangt in einen Drehkopf bzw. drehbaren Küvettenträger 18, um die darin befindliche Probe 20 zu bestrahlen. Der drehbare Küvettenträger kann anschließend um 180º gedreht werden, um eine Referenzprobe 22 zu bestrahlen.
Der erste Frequenzsynthesizer 24 ist wie gezeigt phasenfest mit einem zweiten Frequenzsynthesizer 26 gekoppelt (locked in) und gibt die erste Frequenz an die Pockel-Zelle 12 ab, die wiederum den Lichtstrahl 14 mit der ersten Frequenz abgibt. Wenn gewünscht, kann der Strahl 14 mittels eines optischen Faserbündels übertragen werden.
Der zweite Frequenzsynthesizer 26 moduliert über dem Verstärker 28 die Verstärkung der Lichtdetektoren 30, 32 mit der zweiten Frequenz, die von der ersten Frequenz verschieden ist. Die Detektoren 30, 32 können Photovervielfacherröhren, Photodioden, Mikrokanalplatten, ein Diodenarray, ein Ladungsverschiebeelement bzw. CCD-Detektor oder ein Lawineneffekt-Photodiodensystem sein.
Das Signal des Lichtstrahls 14 wird vom Strahlteiler 16 an dem Lichtdetektor 30 geschickt, während der Lichtdetektor 32 das Fluoreszenzlicht erfaßt, das von der bestrahlten Probe oder 22 im drehbaren Küvettenträger 18 ausgesendet wird, was wahlweise über ein optisches Faserbündel geschehen kann.
Das Signal vom Lichtdetektor 30 wird über die Drahtverbindung 34 über die Steckkarte 35 mit der automatischen Verstärkerschaltung an eine Steckkarte 36 mit einer digitalen Datenerfassungsschaltung übertragen, die typischerweise in einen Personalcomputer 38 angeordnet ist. Entsprechend wird das Signal vom Lichtdetektor 32 über die Drahtverbindung 40 an die gleiche Steckkarte 35 mit der automatischen Verstärkerschaltung und die Steckkarte 36 mit der digitalen Datenerfassungsschaltung übertragen. Die digitale Erfassungskarte 36 kann eine handelsübliche Schaltkarte sein, wie z.B. das Modell A2D-160 von DRA Laboratories in Sterling, Virginia, oder wahlweise die Metrabyte-Karte DAS20. Eine solche Karte muß mindestens zwei Datenerfassungskanäle für den Anschluß der Leitungen 34, 40 sowie die Möglichkeit einer Veränderung der Verstärkung unter Rechnerkontrolle, einen Digitalisierer mit einer Auflösung von mindestens 12 Bit, eine Digitalisierrate von etwa 100 kHz und die Möglichkeit des Startens des Digitalisierzyklus und der Einstellung der Abtastrate unter Kontrolle einer externen Auslösung haben. Die Schaltung der automatischen Verstärkerkarte 35 kann wie in Fig. 6 gezeigt sein.
Ein Synchronisierungssignal von den Frequenzsynthesizern wird wie in Fig. 5 gezeigt über die Karte 42 mit der synchronen Erfassungsschaltung an die Karte 36 angelegt. Der Zweck dieses Moduls ist die Bereitstellung eines synchronen Signals, das phasenfest mit dem Hauptoszillator des Synthesizers 24 oder 26 gekoppelt ist. Eine derartige Synchronisation erhöht dem Rauschabstand bei der Messung deutlich. Die Karte 36 kann wie in der Schaltung der Fig. 5 gezeigt zwei Module enthalten, die eine Strom/Spannungswandlereinrichtung und rechnergesteuerte Meßverstärker für jeden Kanal der Schaltkarte 36 bereitstellen.
Eine zusätzliche Leitung auf der Schaltkarte 36 stellt 5 V am Anschlußstift 9 des DB-Steckers zur Verfügung, um das Synchronisierungsmodul mit Strom zu versorgen. Die Karte 36 paßt in einen 8-Bit-Steckplatz des Personalcomputers 38 und hat zwei unabhängige Abtast- und Halteschaltungen und einen Digitalisierer mit einer Breite von 12 Bit. Die maximale Abtastrate beträgt 160 kHz. Bei der bevorzugten Betriebsweise gemäß der Erfindung verwendet die Karte 36 einen der DMA-Kanäle des Rechners, um die Zentraleinheit des Rechners von der Datenverarbeitung während der Erfassung zu entlasten, so daß Datenerfassung und -speicherung im Hintergrund ablaufen.
Wie früher angemerkt, liegt ein großer Vorteil der Erfindung in der Möglichkeit des Überstreichens eines vorbestimmten Frequenzbereichs unter Variation der Meßzeit bei jeder Modulationsfrequenz in Abhängigkeit vom Störrauschen bei der betreffenden Frequenz. Zunächst wird ein Satz von Frequenzen gewählt. Die Frequenzen sind vorzugsweise logarithmisch über dem interessierenden Frequenzbereich verteilt. Diese Möglichkeit wird im Gegensatz zu dem Verfahren mit mehreren Harmonischen nach dem Stand der Technik durch die Erfindung bereitgestellt. Weiter oben wurde gezeigt, daß der beste Weg zur Erfassung eines Abklingvorgangs einer Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzemission in einem Frequenzbereich darin besteht, die Frequenzen in logarithmischen Abständen um die Frequenz entsprechend dem reziproken Wert der charakteristischen Abklingzeit der untersuchten Probe zu verteilen.
Außerdem wurde in der Literatur gezeigt, daß eine Messung bei 10 bis 20 Frequenzen oftmals dem bestmöglichen Kompromiß zwischen der Datenerfassungszeit und der erhaltenen Information darstellt. Die Verbesserung des Rauschabstandes hängt von der dritten Wurzel der Anzahl der Frequenzen ab. Die Verwendung von 100 Frequenzen bringt daher nur eine marginale Verbesserung gegenüber 20 Frequenzen mit sich. Die zu erwartende Verbesserung liegt unter der Annahme, daß alle Frequenzen mit dem gleichen Rauschabstand gemessen werden, bei etwa 1,7.
Der Rauschabstand bei dem Verfahren mit mehreren Harmonischen ist nicht für jede Frequenz gleich, da beim Stand der Technik die gleiche Erfassungszeit für alle Frequenzen vorgesehen ist, das erfaßte Signal jedoch bei höheren Frequenzen viel schwächer ist. Durch die Erfindung kann demgegenüber viel Zeit eingespart werden, da bei jeder der seriellen Messungen, die gemäß der Erfindung durchgeführt werden, weniger Zeit für diejenigen Frequenzen aufgewendet wird, bei denen das Signal stärker ist, was insgesamt in einer Zeitersparnis resultiert.
Ein weiterer Vorteil dieses Ausführungsbeispiels betrifft die digitale Signalverarbeitung. Eine erste Operation, die mit der digitalisierten Wellenform vorgenommen wird, ist die "Faltung", wobei als Teil der Kontrollroutine, die in Fig. 3 und auch in Fig. 2 gezeigt ist, aufeinanderfolgende Perioden der Kreuzkorrelationsfrequenzwellen exakt in Phase gemittelt werden. Ein solches Softwareverfahren ist dem Stand der Technik zugehörig und wird z.B. von Malmstadt et al. in "Digital and Analog Data Conversions", Teil III, W.A. Benjamin, Inc. (1973), beschrieben.
Je mehr Wellen gemittelt werden, desto mehr nimmt der Rauschabstand linear mit der Anzahl der Wellen anstatt mit der Quadratwurzel der Anzahl der gemittelten Wellen zu. Dies liegt in der Tatsache begründet, daß bei immer mehr gemittelten Wellen jedes Signal, das nicht exakt in Phase mit der Kreuzkorrelationsfrequenz liegt, ausgeschieden wird, so daß eine digitale Filterfunktion für die Kontrollroutine bereitgestellt wird, insbesondere in dem Schritten 50, 52 und 54 der Kontrollroutine (Fig. 3). Die äquivalente Bandbreite dieses Digitalfilters ist eine Funktion der Zeit, und der Rauschabstand nimmt sehr rasch zu.
Unter der beispielhaften Annahme, daß die zu messende Grundwellenform bei 100 Hz liegt, sind nach der Faltung für eine Sekunde alle Frequenzanteile höher als 1 Hz durch Mittelung ausgeschieden, während diejenigen mit Frequenzen unter 1 Hz verbleiben. Aus dem gleichen Grund tragen nach einer Integrationsdauer von 5 Sekunden nur noch Frequenzanteile unter 0,2 Hz zu dem Signal bei. Die äquivalente Güte Q dieses Digitalfilters (definiert als Wert der Mittelfrequenz dividiert durch die Bandbreite) beträgt damit 500, und der Wert für Q erhöht sich mit einer Erhöhung der Kreuzkorrelationsfrequenz. Der neuartige digitale Erfassungsmodus gestaltet die Wahl der Kreuzkorrelationsfrequenz sehr einfach. Somit können Filter mit sehr hohen Güte Q ohne Mittelfrequenzdrift und Verstärkungsverzerrung in einfacher Weise realisiert werden.
Aus dem Obigen wird klar, daß die Verfügbarkeit eines (zur Kreuzkorrelationsfrequenz) synchronen Signals, wie es von der Schaltung auf der Synchronisierungskarte 42 bereitgestellt wird, wünschenswert ist, um dem Digitalisierungsprozeß auszulösen.
Ein weiterer Vorteil des Digitalfilters gegenüber einem äquivalenten Analogfilter liegt darin, daß die Datenerfassung unmittelbar nach der Wahl einer neuen Frequenz beginnen kann, da zu solchen frühen Zeitpunkten die Güte Q des Filters sehr niedrig ist. Im Gegensatz dazu sind bei Verwendung eines analogen Filters mit einem Q von 80 bei 40 Hz mindestens 2 - 3 Sekunden erforderlich, bis das Signal einen stabilen Wert angenommen hat. Unter diesen Bedingungen kann daher ein schnelles Überstreichen der Frequenzen nicht in effektiver Weise erfolgen.
Unter weiterer Bezugnahme auf die Kontrollroutine werden die Wellenformen des Eingangssignals 56 durch eine bekannte Software-Routine gefaltet (Bezugszeichen 50). Es wird bestimmt, ob hinreichend viele Wellenformen erhalten wurden, durch die auch die Bandbreite 52 des Filters bestimmt wird. Wurden nicht hinreichend viele Wellenformen erhalten, kehrt der Prozeß nach 58 zurück, um weitere Wellenformen 50 zu falten. Wenn hinreichend viele Wellenformen erhalten wurden, wird eine Prüfung 60 hinsichtlich Signalüberlauf und optimaler Verstärkung vorgenommen. Liefert diese ein Ergebnis "NEIN", wird nach der automatischen Verstärkungsregelung 62 eine bekannte Routine (64) zur Neuinitialisierung der Variablen aufgerufen, d.h. es wird eine automatische Suche für die Verstärkung realisiert. Die gesammelten Daten werden verworfen, und das System wird durch dem nächsten Signaleingang 56 für die Wellenformfaltung (50) neu gestartet (66).
Wird dagegen bei der Prüfung 60 hinsichtlich Signalüberlauf und optimaler Verstärkung das Ergebnis "JA" erhalten, wird eine schnelle Fouriertransformation berechnet (54). Die AC/DC-Phasenmodulation 68 wird durchgeführt und die Werte auf einem Monitor ausgegeben 70. Zusätzlich wird bei 72 bestimmt, ob ein ausreichender Rauschabstand gegeben ist. Ist dies nicht der Fall, wird über den Ausgang 74 der Signaleingang 56 reaktiviert, um weitere Wellenformen zu falten. Ist das Ergebnis "JA", wird ein Flag für "Daten bereit" gesetzt (76). Die Variablen werden neuinitialisiert (78), um die Frequenzen zu ändern und mit dem nächsten Schritt des Prozesses fortzufahren, der in einem Weiterarbeiten mit einer anderen Frequenz bestehen kann, oder in der Ansteuerung des drehbaren Küvettenträgers 18, um von einer Probe 20, 22 zur anderen oder umgekehrt zu wechseln. Anschließend wird bei 80 mit dem nächsten Schritt fortgefahren.
Typischerweise kann der erfindungsgemäße Prozeß wie folgt ablaufen:
1. Der Lichtverschluß des Geräts (herkömmliche Einrichtung) wird geschlossen, und es wird eine Hintergrundmessung für etwa 5 Sekunden durchgeführt, die typischerweise optimal ist.
2. Die Probe 20 wird bestrahlt, und die Datenerfassung beginnt sofort. Jede Sekunde werden die erfaßten Daten in einen Arbeitsvektor übertragen, ohne dabei dem Erfassungsprozeß zu unterbrechen, der im Hintergrund abläuft. Die Rauschpegelüberwachung 72, ein herkömmliches Software-Hilfsmittel, schätzt dem Betrag des Rauschens in der erfaßten Wellenform ab und vergleicht diesen mit einem vorbestimmten Wert. Bei lichtstarken Proben kann die Erfassungszeit eine Länge bis herab zu einer Sekunde betragen.
3. Die Erfassung wird fortgesetzt, bis der abgeschätzte Rauschpegel unter einem akzeptablen Wert liegt. Anschließend wird in dem Schritten 76, 78 und 80 eine neue Frequenz aus einer vorzugsweise in logarithmischen Abständen verteilten Frequenzfolge gewählt, und der Prozeß beginnt erneut, bis schrittweise alle Frequenzen des Satzes gemessen wurden.
4. Danach wird eine Referenzverbindung 22 bestrahlt und der gleiche Prozeß wie für die Probe wird schrittweise abgewickelt, bis alle Frequenzen gemessen wurden.
5. Das Phasen- und das Demodulationsverhältnis der Probe werden unter Bezug auf das Phasen- und das Demodulationsverhältnis der Referenzverbindung berechnet.
Der gesamte Prozeß ist sehr effizient und dauert etwa drei Minuten für Proben mittlerer Intensität und 10 Frequenzen. Wenn die Proben sehr lichtstark sind, kann der gesamte Prozeß in weniger als einer Minute für die Erfassung von 10 Frequenzen abgeschlossen werden.
Um die Vorteile der neuen Möglichkeiten, die durch die Erfindung geboten werden, zu nutzen, wird die Datenerfassung vorzugsweise ohne Verlust der Synchronisation durchgeführt, und es werden Daten einer großen Anzahl von Punkten für jede Wellenform erfaßt. Zusätzlich sollten die Wellenformen bei der höchsten möglichen Frequenz entsprechend der Geschwindigkeit der hierbei verwendeten Digitalkarte 36 liegen. Vorzugsweise sind Kreuzkorrelationsfrequenzen von bis zu 500 Hz besonders wünschenswert.
Die minimale Anzahl von Punkten je Wellenform, die genaue Phasen- und Modulationsbestimmungen zuläßt, liegt in einer Größenordnung von 128 Punkten. Der Wert entsprechend einer Zweierpotenz ist für die Anwendung der schnellen Fouriertransformation 54 erforderlich. Da mindestens zwei verschiedene Signale erfaßt werden müssen, eines vom Photovervielfacher 32 für die Probe und das andere vom Photovervielfacher für die Referenz, beträgt die Anzahl der pro Sekunde abzutastenden Punkte typischerweise etwa 126200. Dies entspricht ungefähr der maximalen Digitalisierrate der hierin verwendeten und oben beschriebenen digitalen Erfassungskarte 36.
Es ist außerdem wünschenswert, die Möglichkeit einer laufendem Bildschirmanzeige der Werte der Spannungen an jedem Detektor 30, 32, der Werte der Modulation der Probe und der Referenz 20, 22 und der durch die Software berechneten Phasendifferenz zwischen Probe und Referenz zu haben. Dieses Merkmal ist wichtig für die Einstellungen des Instruments vor jeder Messung und für die Überwachung der Messung während der Datenerfassung, da möglicherweise keine andere Information bezüglich der Menge des Lichts, das an den Detektor gelangt, verfügbar ist. Zusätzlich ist es wünschenswert, eine Möglichkeit zur Überwachung des Signalrauschens zu haben, um die geeignete Integration bei jeder Frequenz zu wählen.
Um unter anderem eine Überwachung der Instrumentensignale und des Rauschens während der Datenerfassung bereitzustellen, weist die in diesem Ausführungsbeispiel eingesetzte Software vorzugsweise die folgenden Eigenschaften auf:
1. Die Datenerfassung erfolgt mit konstanter Rate im Hintergrund unter Nutzung der DMA-Eigenschaften des IBM-Personalcomputers (ein IBM-kompatibler Rechner kann ebenfalls verwendet werden; genauer gesagt, jeder Rechner mit einer CPU aus der Intel iAPx86-Mikroprozessorfamilie, die mit dem 80286 beginnt und dem 80386 und den 80486 einschließt).
2. Die digitalisierten Daten werden in einem "Ringpuffer" gespeichert, der eine Maximalzahl von 64000 Punkten aufnehmen kann.
3. Mit jedem Taktimpuls des Rechners (18 mal je Sekunde) wird eine Interruptroutine angestoßen, die prüft, wie weit der Datenpuffer gefüllt ist.
4. Wenn der Datenpuffer zu mehr als der Hälfte gefüllt ist, wird die Hälfte des Puffers kopiert und in ein Arbeitsfeld gefaltet, das 256 Punkte aufnimmt. Das Signal wird in einer solchen Weise gefaltet, daß jede Periode der Wellenform exakt in Phase zur vorher gespeicherten Wellenform addiert wird. Wenn die zweite Hälfte des Puffers gefüllt ist, werden die Daten aus diesem Teil des Puffers verarbeitet, während der erste Teil die neuen Daten vom Digitalisierer aufnimmt.
5. Wenn eine bestimmte Anzahl von Wellenformen gefaltet wurde, wird die Kontrollroutine (Fig. 3) aufgerufen. Normalerweise wird die Anzahl der zu faltenden Wellenformen so gewählt, daß die Kontrollroutine nach jeweils 0,5 Sekunden aufgerufen wird.
6. Die Kontrollroutine führt eine Serie von Prüfungen der Signale durch; sie prüft auf Signalüberlauf, bestimmt die geeignetste Verstärkung für die mit jedem Kanal verbundenen Verstärker, und führt die schnelle Fouriertransormation des Signals durch, um die Werte für Phase und Modulation der Signale von dem beiden Detektoren zu bestimmen.
7. Je nach dem Betriebsbedingungen des Instruments übergibt die Kontrollroutine Daten an die Erfassungsroutine (Fig. 4) des Hauptprogramms, das diese sammelt, speichert und zur Ausgabe bringt.
8. Die Faltung von 64000 Datenpunkten, die Berechnung der schnellen Fouriertransformation (FFT), und die Bildschirmausgabe der verschiedenen Parameter des Instruments erfordern bei einem 386er-Rechner mit Mathematik-Coprozessor etwa 0,4 bis 0,6 Sekunden. Da diese Operationen etwa alle 0,5 bis 1 Sekunde ausgeführt werden sollten, bleibt offenkundig sehr wenig Zeit zur Abwicklung irgendwelcher anderer Aufgaben, wie z.B. Tastaturabfragen und Anzeigen, Ansteuern von Antrieben des Instruments sowie für Lesern und Schreiben von Plattendateien.
9. Für reine Beobachtungszwecke ist es nicht erforderlich, so viele Datenpunkte zu sammeln und die FFT auf 128 Punkte anzuwenden. Während der Datenerfassung führt der Rechner keine anderen Operationen wie das Ansteuern von Antrieben oder das Schreiben von Plattendateien aus. Demzufolge wurden zwei Betriebsarten realisiert: eine, die jeweils einen von acht Datenpunkten ausliest und eine FFT auf nur 16 Punkte anwendet, und eine zweite Betriebsart, bei der alle Datenpunkte verarbeitet werden.
10. Die Kontrollroutine (Fig. 3) kommuniziert mit dem Rest des Programms über eine Gruppe von Semaphoren. Diese signalisieren dem Kontrollprogramm dem Status des Instruments. Erfaßt das Instrument z.B. keine Daten, signalisiert das Semaphor die Verwendung eines jeden achten Punktes der gesammelten Daten anstelle der Gesamtheit der Datenpunkte. Andere Semaphore signalisieren, daß ein Lese oder Schreibvorgang stattfindet, oder daß ein Antrieb angesteuert wird. Die Ansteuerung eines Antriebs muß gleichförmig erfolgen, so daß dieser Vorgang nicht unterbrochen werden sollte. Außerdem benötigen alle Graphikfunktionen verhältnismäßig viel Zeit, was an die Kontrollroutine übermittelt wird.
Fig. 7 gibt einen typische Phasen- und Modulationsverlauf wieder, der in der für die Fluorometrie üblichen Weise dargestellt ist, und wie er durch das Gerät und das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann. Dabei wurde eine amplitudenmodulierte Xenon-Bogenlampen mit 300 W als Lichtquelle 10 verwendet, um die Lebensdauer von angeregtem Lysozime (der Sigma Chemical Co.) in einem 50 mM Phosphatpuffer bei 25ºC zu messen. Die Anregungswellenlänge von 300 nm wurde mittels eines Monochromators am Fluorometer gewählt. Die Referenzprobe 22 war Glykogendispersion, die das Licht mehr streut als absorbiert. Ein Hochpaßfilter Corming WG-320 wurde in der Abstrahlung verwendet. Zwei Lebensdauern von 1,2 ns und 3,4 ns wurden gemessen, die jeweils einer fraktionellen Intensität von 61% bzw. 39% entsprachen. Die verschiedenen Punkte über der Achse repräsentieren die Resultate der sequentiellen fluorometrischen Messungen bei verschiedenen Frequenzen wie hierin beschrieben. Die Erfassungszeit für sämtliche in dem Diagramm dargestellten Punkte lag unter 150 Sekunden. Die Kurvenpunkte, die durch Quadrate gekennzeichnet sind, gehören zur Modulationsachse und sind wie bekannt in willkürlichen Einheiten angegeben. Die Kurvenpunkte, die durch X gekennzeichnet sind, gehören zur Phasenachse und sind in Grad angegeben.
Die Erfindung kann zur Durchführung aller bekannten fluorometrischen oder phosphorimetrischen Messungen verwendet werden, insbesondere des Abklingens der Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, des Anisotropieabklingens der Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, zeitlich aufgelöster Spektren, Auflösung der Lebensdauerkinetik, Bestimmung der Spektren von Mischungen und dergleichen.
Die obige Beschreibung dient nur der Darstellung und ist nicht dazu gedacht, dem Geltungsbereich der Erfindung gemäß dieser Anmeldung einzugrenzen, der durch die folgenden Ansprüche bestimmt ist.

Claims

1. Gerät zur Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometrie-Phosphorimetrie, mit:

einer Quelle von elektromagnetischer Strahlung (10),

einer Einrichtung (12) zum Amplitudenmodulieren der elektromagnetischen Strahlung bei einer ersten Frequenz,

einer Einrichtung (16, 18) zum Richten der amplitudenmodulierten elektromagnetischen Strahlung bei einer Probe (20),

einer Einrichtung (32) zum Erfassen der Lumineszenz der Probe (20),

einer Einrichtung (26) zum Liefern eines Signales, das kohärent mit amplitudenmodulierten Signalen ist, die durch die Amplitudenmodulationseinrichtung (12) erzeugt sind, bei einer zweiten Frequenz zu der Detektoreinrichtung (32),

einer Einrichtung (28) zum Modulieren der Verstärkung der Detektoreinrichtung (32) oder zum Multiplizieren des Ausgangssignales der Detektoreinrichtung (32) durch das Signal,

wobei die zweite Frequenz von der ersten Frequenz verschieden ist, und

einer Einrichtung (36) zum Ableiten eines sich ergebenden Signales aus der elektromagnetischen Strahlung und der Detektoreinrichtung (32) bei einer Frequenz der Differenz zwischen den ersten und zweiten Frequenzen, um eine Phasenverschiebung und Modulationsänderungen der Lumineszenz von derjenigen der elektromagnetischen Strahlung zu erfassen,

dadurch gekennzeichnet, daß das Gerät außerdem umfaßt:

eine Einrichtung (76, 78, 80) zum sequentiellen Durchführen von Läufen der Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometrie-Phosphoriemetrie bei sequentiell abweichenden ersten und zweiten Frequenzen,

eine Einrichtung (36) zum Erfassen der Intensitäten von Signalantworten der Läufe bei der jeweiligen Kreuzkorrelationsfrequenz, die die Differenz der jeweiligen ersten und zweiten Frequenzen ist, die in jedem Lauf verwendet sind, und

eine Einrichtung (50, 58, 64) zum Verlängern des Erfassens jeder Signalantwort bei dem abweichenden ersten und zweiten Frequenzen, bis ein integriertes Signal mit einer spezifischen Standardabweichung bei jeder der abweichenden ersten und zweiten Frequenzen gewonnen ist.

2. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Einrichtungen vorgesehen sind, um automatisch ein Programm der sequentiell vorgenommenen Läufe auszuführen.

3. Gerät nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Einrichtungen (50, 52, 54) vorgesehen sind, um die Gewinnung der Datenwellenformen, die durch die Ableiteinrichtung (36) für das sich ergebende Signal erfaßt sind, in jedem der sequentiell vorgenommenen Läufe mit der Phase des Signalmodulierens der elektromagnetischen Strahlung bei der ersten Frequenz zu synchronisieren und um entsprechende Segmente der so erfaßten Wellenformen zu überlagern, um einen Mittelwellenformwert für jeden der sequentiell vorgenommenen Läufe mit einem erhöhten Rauschabstand über dem einzelnen Wellenformsegmenten zu erhalten.

4. Gerät nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ableiteinrichtung (36) für das sich ergebende Signal eine variable Frequenzdigitalfiltereinrichtung (50, 52, 54) umfaßt.

5. Gerät nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Digitalfiltereinrichtung (50, 52, 54) in der Lage ist, auf Filtersignalantworten bei im wesentlichen der Frequenz gesetzt zu sein, die die Differenz der jeweiligen ersten und zweiten verwendeten Frequenzen ist.

6. Gerät nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Digitalfiltereinrichtung (50, 52, 54) in der Lage ist, mit einer Bandbreite zu filtern, die über der Zeit schmäler wird, wenn eine Signalantwort erfaßt wird.

7. Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Signal von der Ableiteinrichtung (36) für das sich ergebende Signal automatisch durch die automatische Verstärkungseinrichtung (35) ohne Phasen- und Modulationsänderungen verstärkt wird.

8. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Frequenzen jeweils durch eine Frequenzsynthesizereinrichtung (24, 26) erzeugt sind, wobei die Frequenz der Differenz zwischen dem ersten und zweiten Frequenzen im wesentlichen 50 bis 1000 Hertz beträgt.

9. Verfahren zur Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometrie-Phosphoriemetrie, das die folgenden Schritte aufweist:

Vorsehen einer Quelle von elektromagnetischer Strahlung (10),

Amplitudenmodulieren der elektromagnetischen Strahlung bei einer ersten Frequenz,

Richten der amplitudenmodulierten elektromagnetischen Strahlung bei einer Probe (20),

Erfassen der Lumineszenz der Probe (20) mit einem Detektor (32), während die Verstärkung des Detektors (32) moduliert oder das Ausgangssignal des Detektors (32) mit einem Signal bei einer zweiten Frequenz multipliziert wird, wobei das Signal bei einer zweiten Frequenz kohärent mit der Modulation der elektromagnetischen Strahlung ist und die zweite Frequenz von der ersten Frequenz abweicht, und

Ableiten eines sich ergebenden Signales aus der elektromagnetischen Strahlung und dem Detektor (32) bei einer Frequenz der Differenz zwischen den ersten und zweiten Frequenzen, um eine Phasenverschiebung und Modulation der Lumineszenz aus derjenigen der elektromagnetischen Strahlung zu erfassen,

dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren weiterhin die folgenden Schritte umfaßt:

sequentielles und automatisches Durchführen von Läufen der Kreuzkorrelation-Frequenzbereich-Fluorometrie-Phosphoriemetrie bei sequentiell abweichenden Werten der ersten und zweiten Frequenzen (76, 78, 80),

Erfassen der Intensitäten von Signalantworten der Läufe bei der jeweiligen Frequenz, die die Differenz der jeweiligen ersten und zweiten Frequenzen jedes Laufes ist, und

Verlängern (50, 58, 64) der Zeit des Erfassens jeder Frequenzantwort bei jeder der verschiedenen ersten und zweiten Frequenzen, bis ein integriertes Signal mit einer spezifischen Standardabweichung bei jeder der abweichenden ersten und zweiten Frequenzen gewonnen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das sich ergebende Signal durch eine Einrichtung mit veränderlicher Frequenz, veränderlicher Bandbreite, einer Digitalfiltereinrichtung (50, 52, 54) abgeleitet ist, die eingestellt ist, um Signalantworten bei im wesentlichen der Frequenz zu filtern, die die Differenz der jeweiligen ersten und zweiten verwendeten Frequenzen ist.