DE69126302T2

DE69126302T2 - Monoklonaler antikörper gegen herzglykosid und dessen verwendung

Info

Publication number: DE69126302T2
Application number: DE69126302T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Nakazato; Yoshitake Terano
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1990-12-28
Filing date: 1991-09-24
Publication date: 1997-09-04
Anticipated expiration: 2011-09-25
Also published as: EP0517918B1; DE69126302D1; EP0517918A1; WO1992012252A1; EP0517918A4

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die das Strukturelement erkennen, welches den in einer cis- Konfiguration des Steroidstrukturelements eines Herzglycosids gebundenen D-Ring enthält, zusammen mit ihrer Verwendung.

HINTERGRUND DER TECHNIK

Es sind polyklonale Antikörper bekannnt, die mit Digoxin spezifisch reagieren, jedoch mit Steroidhormonen keine Kreuzreaktion eingehen (Smith, T.W. et al., Biochemistry 9(2), 331-337, 1970). Außerdem sind monoklonale Antikörper bekannt, die eine starke Affinität für Digoxin haben (Hunter, M.M. et al., J. Immunol. 129(3), 1165-1172, 1982). Darüber hinaus ist ebenso bekannt, daß monoklonale Antikörper zu Digoxin eine starke neutralisierende Wirkung gegen Digoxineffekte in der Herzvorkammer des Guinea-Schweins zeigen (Wong, P.C. et al., Eur. J. Pharmacol. 136, 437-440, 1987). Es gibt jedoch keine genauen Befunde betreffend den Ort, der durch diese monoklonalen Antikörper in bezug auf die Struktur von Digoxin erkannt wird.
Zu bemerken ist, daß die Erfinder der vorliegenden Erfindung polyklonale Antikörper zu Ouabain hergestellt haben und berichteten, daß diese mit Herzglycosiden reagieren, insbesondere Ouabain, Digoxin, und endogenen Ouabain-ähnlichen Substanzen (Masugi, F. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 135(1), 41-45, 1986).
Der Artikel "Generation of monoclonal anti-digoxin antibodies" von Kehayov I.R. et al., Hybridoma, 1990, S. 493-509 betrifft einen monoklonalen Antikörper, der eine Struktur, wie beispielsweise Digoxin, erkennt.
Obwohl Antikörper mit klar definierten Spezifitäten für die genaue Messung der Herzglycosid- Blutkonzentrationen in verschiedenen Formen von Forschung und klinischen Anwendungen von Herzglycosiden erforderlich sind, wie vorher angegeben wurde, sind solche Antikörper gegenwärtig nicht bekannt. So stellt die vorliegende Erfindung monoklonale Antikörper bereit, die nur mit Herzglycosiden mit einer spezifischen Struktur spezifisch reagieren.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Als eine Folge von verschiedenen, durch die Erfinder zur Lösung der oben genannten Probleme durchgeführten Studien gelang den Erfindern die Herstellung von Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper erzeugen, welche das Strukturelement spezifisch erkennen, welches den in einer cis-Konfiguration innerhalb der Steroidstruktur des Herzglycosids gebundenen D-Ring enthält, durch die Verwendung eines Immunogens, in welchem Rinderserumalbumin an den Zuckeranteil von Ouabain gebunden ist, wodurch die vorliegende Erfindung vollendet wurde. Darüber hinaus haben die Erfinder entdeckt, daß die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung mit Substanzen spezifisch reagieren, die die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ inhibieren.
Die vorliegende Erfindung stellt Produkte und Verfahren, wie durch die Ansprüche definiert, bereit.
So stellen die Erfinder monoklonale Antikörper bereit, die eine integrierte Struktur erkennen, welche umfaßt: den in der cis-Konfiguration gebundenen D-Ring; eine in der β-Konfiguration an der C13-Position gebundene Methylgruppe; eine in der β-Konfiguration an der C14-Position gebundene Hydroxylgruppe; und eine in der β-Konfiguration an der C17-Position gebundene α,β-ungesättigte Lactongruppe in der Steroidstruktur des Herzglycosids oder seinem Aglycon.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung auch monoklonale Antikörper bereit, welche die Struktur des gemeinsamen Teils von Steroidsubstanzen erkennen, die die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase- Aktivität in der gleichen Form wie Ouabain inhibieren, oder in anderen Worten, in der Form eines Kaliumionkonzentration- Antagonisten.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Hybridomzellen bereit, die die oben genannten monoklonalen Antikörper erzeugen.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der oben genannten monoklonalen Antikörper bereit.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Reaktionsschema, das das Herstellungsverfahren des Immunogens zur Erzeugung der Hybridomzellen der vorliegenden Erfindung angibt.
Fig. 2 liefert Graphen, die die Reaktivität von monoklonalen Antikörpern im Kulturüberstand der Hybridomzellen der vorliegenden Erfindung mit Ouabain und Digoxin im ELISA-Antikörpereinfangverfahren angeben.
Fig. 3 liefert Graphen, die die Kreuzreaktivität von monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung mit verschiedenen Herzglycosiden und ihren Aglyconen angeben.
Fig. 4 liefert Graphen, die die Beziehung zwischen den gemessenen Radioaktivitätswerten und den Konzentrationen von Ouabain und Digoxin, wie mittels einem Scintillationsnäherungsversuch unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung gemessen, angeben.
Fig. 5 liefert Graphen, die die Beziehung zwischen der Extinktion und den Konzentrationen von Ouabain und Digoxin, wie mittels ELISA gemessen, unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung angeben.
Fig. 6 zeigt das Steroidstrukturelement des Herzglycosids und seines Aglycons, das durch die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung erkannt wird.
Fig. 7 ist ein Graph, der die Neutralisationseffekte auf die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-Aktivität-inhibierende Wirkung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 8 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Extinktion und der Konzentration einer HPLC-gereinigten, menschlichen Plasma-OLF-Fraktion, wie mittels ELISA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung gemessen, zeigt.
Fig. 9 und 10 sind Graphen, die die Beziehung zwischen der Extinktion und der Digoxinkonzentration, wie mittels ELISA (Antikörpereinfangverfahren) und das offizielle Meßverfahren (Keller-Kiliani-Verfahren) gemessen, zeigen.
Fig. 11 ist ein Graph, der zeigt, daß die gemessenen Werte in enger Übereinstimmung in dem Falle sind, wenn das Injektionspräparat nach der direkten Verdünnung gemessen wird, und wenn das Digoxin nach der ersten Extraktion des Digoxins gemessen wird.
Fig. 12 ist ein Graph, der die Ergebnisse der Messung von drei Typen von Deslanosidinjektionspräparaten und eines Typs von Regibufogenin mittels ELISA zeigt.
Fig. 13 ist ein Graph, bei dem die quantitative Bestimmung einer Substanz, wie beispielsweise Bufalin, das in Herztabletten enthalten ist, mittels EUSA vorgenommen wird.
Fig. 14 ist ein Graph, der bei der quantitativen Bestimmung einer Herzsubstanz, wie beispielsweise Bufalin, das in Senso (roher Arzneimittelbestandteil) enthalten ist, mittels EUSA vorgenommen wurde.
Fig. 15 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen der Extinktion und der Herzglycosidkonzentration, wie mittels ELISA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung gemessen, zeigt.

GENAUE BESCHREIBUNG

Obwohl verschiedene Herzglycoside für ein Immunogen zur Herstellung von Hybridomzellen verwendet werden können, die monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung erzeugen, ist ein spezifisches Beispiel eines Herzglycosids, das verwendet werden kann, dasjenige, worin Rinderserumalbumin kovalent an den Zuckerrest von Ouabain gebunden ist. Beispielsweise werden nach dem Abspalten des Zuckerrestes von Ouabain mit Periodsäureion die resultierenden zwei Aldehydgruppen mit den freien Aminogruppen des Rinderserumalbumins umgesetzt. Das Immunogen kann dann durch Entfernen der resultierenden Hydroxylgruppen mittels Reduktion hergestellt werden. Ein Beispiel davon ist im Beispiel 1 beschrieben, und das Reaktionsschema ist in Fig. 1 gezeigt.
Die Herstellung der Hybridomzellen kann gemäß der gewöhnlich verwendeten Verfahren durchgeführt werden (Koehler, G. et. al., Nature 256, 495-497, 1975). Ein Beispiel davon ist in Beispiel 2 beschrieben. Als Ergebnis wurden 10 Stränge Hybridomzellen erhalten, die monoklonale Antikörper erzeugen, welche mit Ouabain reagieren. Durch weiteres Screening dieser Hybridomzellen mit dem ELISA-Antikörpereinfangverfahren wurden Hybridomzellen 249F8 und 278A9 erhalten, welche monoklonale Antikörper erzeugen, die quantitativ mit sowohl Ouabain als auch mit Digoxin reagieren. Die Auswirkungen des ELISA-Antikörpereinfangverfahrens auf die Kulturüberstände dieser Hybridomzellen sind in Fig. 2 angegeben.
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch in vitro- oder in vivo-Kultivierung von beispielsweise der oben genannten Hybridomzellen erzeugt werden. Ein spezifisches Beispiel der in vivo-Kultivierung ist in Beispiel 3 beschrieben. Im in vitro-Verfahren können die monoklonalen Antikörper nach der Kultivierung der Hybridomzellen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von gewöhnlich verwendeten Verfahren isoliert und gemäß dem gleichen in Beispiel 3 für die in vivo-Kulturen beschriebenen Reinigungsverfahren gereinigt werden. Als der auf diese Weise hergestellte Titer des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung mittels ELISA gemessen wurde, betrug der Titer 4300 Einheiten/mg für den monoklonalen Antikörper 249F8 (der von den Hybridomzellen 249F8 erzeugte monoklonale Antikörper), und der Titer betrug 2200 Einheiten/mg für den monoklonalen Antikörper 278A9 (der von den Hybridomzellen 278A9 erzeugte monoklonale Antikörper).
Eine Studie der Kreuzreaktivität der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in bezug auf verschiedene Substanzen wurde für die 46 Substanzen, die in Tabelle 1 von Beispiel 4 angegeben sind, durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 und Fig. 3 gezeigt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden diese Substanzen in diejenigen unterteilt, die mit den monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung reagieren (als Typ I-Substanzen bezeichnet), und diejenigen, die nicht reagieren (als Typ II-Substanzen bezeichnet). Es wurde entdeckt, daß alle Typ I-Substanzen, die mit den monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung reagieren, entweder Herzglycoside oder ihre Aglycone sind, und daß alle solchen Substanzen eine gemeinsame Struktur besitzen, die durch die durchgezogenen Linien in Formel (I) unterhalb angegeben ist, oder in anderen Worten, eine integrierte Struktur, welche umfaßt: einen in der cis-Konfiguration in bezug auf den C-Ring gebundenen D-Ring; eine in der β-Konfiguration an die C13-Position gebundene Methylgruppe; eine in der β-Konfiguration an die C14-Position gebundende Hydroxylgruppe; und eine in der β- Konfiguration an der C17-Position gebundene α, β-ungesättigte Lactongruppe.
worin R die folgende Cardenolid- oder Bufagenolid-Form darstellt:
Darüber hinaus geben die mit gestrichelten Linien in der oben genannten Struktur angedeuteten Stellen diejenigen Stellen innerhalb der Steroidstruktur an, die im wesentlichen keinen Effekt auf das Erkennen durch den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung haben. Die oben genannten Eigenschaften sind sowohl für monoklonale Antikörper 249F8 als auch für 278A9 der vorliegenden Erfindung gemeinsam. Außerdem ist dasjenige, welches die oben genannte Struktur erkennt, wie beispielsweise die Verbindung, ausgedrückt in beispielsweise Formel (II):
worin R die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben hat, und R' eine Piperizylgruppe, eine Piperizinogruppe oder ihre Derivate angibt, in der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingeschlossen, selbst wenn es ein Antikörper ist, der mit anderen Substanzen eine Kreuzreaktion eingeht.
Als nächstes wurde die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierende Aktivität vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ (Ouabaintyp) für mehrere der in Tabelle 1 angegebenen Substanzen geprüft. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß alle Substanzen, die eine Kreuzreaktivität mit einem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zeigen, eine Aktivität besitzen, die die oben genannten Enzyme inhibiert.
Die Ergebnisse in bezug auf die Kreuzreaktivität als auch die Ergebnisse der in Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierenden Wirkung vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ (Tabelle 2) sind zusammen mit der Gegenwart oder der Abwesenheit der in der oben genannten Formel (I) gezeigten spezifischen Struktur in Tabelle 3 gezeigt. Wie aus dieser Tabelle deutlich wird, liegt das durch den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung erkannte spezifische Strukturelement auch in denjenigen Substanzen vor, die eine Aktivität zeigen, welche die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ inhibiert. So kann die Spezifität der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung für das Screening, die Isolierung, Reinigung und Messung etc. von physiologisch aktiven Substanzen verwendet werden, die eine Aktivität besitzen, welche die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ inhibiert.
Bekannte Verfahren können für die Messung, Detektion oder Auswahl der physiologisch aktiven Substanzen mit einer inhibierenden Wirkung gegen die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann dies in der Weise der nachfolgend beschriebenen Beispiele durchgeführt werden.
In anderen Worten wird der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung zuerst an die Oberfläche eines geeigneten festen Trägers adsorbiert und fixiert. Als nächstes wird dieser Antikörper mit der Probe in Kontakt gebracht. Infolgedessen bindet die Testsubstanz innerhalb der Probe spezifisch an den an den festen Träger fixierten monoklonalen Antikörper. Folglich wird die Testsubstanz innerhalb der Probe an den festen Träger mittels dem auf den festen Träger fixierten monoklonalen Antikörper im voraus fixiert.
Als nächstes wird der oben genannte Träger, der als ein sekundärer Träger dient, in Kontakt mit beispielsweise einer Lösung gebracht, welche einen polyklonalen Antikörper zu der Testsubstanz und einen Anti-Maus IgG-Antikörper enthält. Folglich bindet der polyklonale Antikörper an beliebige sekundäre Epitope der Testsubstanz, die bei der Bindung mit dem monoklonalen Antikörper nicht verwendet wurden. Infolgedessen bindet der sekundäre Antikörper an den festen Träger mittels dem monoklonalen Antikörper und die Testsubstanz, die im voraus fixiert wurden. In diesem Fall spiegelt die Menge des sekundären Antikörpers, die fixiert ist, die Menge der Testsubstanz in der Probe, oder in anderen Worten, die Menge der fixierten Testprobe.
So kann durch Messen der Menge des fixierten sekundären Antikörpers die Menge der Testsubstanz in der Probe bestimmt werden. Eine genaue Beschreibung des Verfahrens zur Messung der Menge des fixierten sekundären Antikörpers ist im folgenden angegeben.
In dem oben genannten Verfahren können beispielsweise Mikrotiterplatten, wie beispielsweise aus Polyvinylchlorid hergestellte Mikrotiterplatten oder aus Polystyrol hergestellte Mikrotiterplatten, für den festen Träger verwendet werden. Das Fixieren des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch Verdünnen des monoklonalen Antikörpers in einem geeigneten Puffer, wie beispielsweise ein Carbonatpuffer oder Phosphatpuffer, Auftragen dieser Pufferlösung auf die Oberfläche des festen Trägers, und dann Inkubieren für wenigstens 30 Minuten bei einer Temperatur von 4 - 37ºC, durchgeführt werden.
Als nächstes wird der nicht absorbierte monoklonale Antikörper durch mehrmaliges Waschen des festen Trägers mit einer Waschlösung, wie beispielsweise ein Puffer, welcher eine oberflächenaktive Substanz wie Tween 20 enthält, entfernt. Beispiele dieser Waschlösung schließen Phosphatpuffer, Tris- Puffer und Boratpuffer ein.
Um die freien Bindungsgruppen, die an der Oberfläche des festen Trägers vorhanden sind, zu blockieren, wird als nächstes der feste Träger mit einem blockierenden Puffer behandelt. Dieser blockierende Puffer ist beispielsweise ein Puffer, welcher 1 bis mehrere Prozent Rinderserumalbumin (BSA), Eiweißalbumin, Magermilch oder dergleichen, enthält. Beispiele von Puffern, die verwendet werden können, schließen Phosphatpuffer, Tris-Puffer, Boratpuffer und dergleichen ein. Die Behandlung kann durch Inkubieren für wenigstens 30 Minuten bei einer Temperatur von 4 - 37ºC durchgeführt werden.
Als nächstes wird der blockierende Puffer durch Waschen des festen Trägers entfernt. Dieses Waschen kann in gleicher Weise wie das oben genannte Waschen durchgeführt werden, auf die Fixierung der monoklonalen Antikörper folgend. So ist die Herstellung des festen Trägers abgeschlossen.
Als nächstes wird dieser feste Träger mit einer in einem geeigneten Puffer, wie beispielsweise einem Phosphatpuffer, Tris-Puffer oder Boratpuffer, verdünnten Probe in Kontakt gebracht. Dieser Kontakt kann durch Inkubieren für wenigstens 30 Minuten bei einer Temperatur von 4 - 37ºC durchgeführt werden. Der feste Träger wird dann in der oben beschriebenen Art gewaschen.
Als nächstes wird ein Puffer, der den sekundären Antikörper enthält, in Kontakt mit dem oben genannten festen Träger gebracht. Beispiele von Puffern, die in diesem Fall verwendet werden können, schließen Phosphatpuffer, Tris-Puffer und Boratpuffer ein. Dieser Kontakt kann durch Inkubieren für wenigstens 30 Minuten bei einer Temperatur von 4 - 37ºC durchgeführt werden. Der feste Träger wird dann in der oben beschriebenen Art gewaschen.
Als nächstes kann die Detektion und die Messung des sekundären Antikörpers, der in der oben beschriebenen Weise fixiert ist, gemäß irgendeinem herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Es ist auch möglich, den sekundären Antikörper selbst zu markieren, beispielsweise durch Verwendung von Radionukliden, Fluoreszenzsubstanzen oder Enzymen, und die Detektion und Messung direkt durchzuführen. Das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt jedoch die Verwendung eines durch verschiedene Verfahren markierten spezifischen tertiären Antikörpers zu dem sekundären Antikörper ein.
Der tertiäre Antikörper ist ein Antikörper einer von der bei der Herstellung des sekundären Antikörpers verwendeten Tierspezies unterschiedlichen Tierspezies. Es wird ein Antikörper oder sein Fragment zu dem Immunoglobulin der bei der Herstellung des sekundären Antikörpers verwendeten Tierspezies verwendet. Beispielsweise kann, wenn der sekundäre Antikörper unter Verwendung eines Kaninchens hergestellt wurde, ein Ziegenantikörper zu dem Kaninchenimmunoglobulin für den tertiären Antikörper verwendet werden.
Herkömmliche Markierungssubstanzen können verwendet werden, um den tertiären Antikörper zu markieren. Beispiele dieser Substanzen schließen Radionuklide wie beispielsweise ¹²&sup5;I, ³H und ¹&sup4;C; Fluoreszenzsubstanzen, wie beispielsweise Fluorescein Isothiocyanat (FITC), Rhodamin und Texas-Rot; und Enzyme, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und Urease, ein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Enzym zum Markieren des tertiären Antikörpers verwendet, und Enzymimmunoassay (ELISA) für das Sandwiching-Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet. Ein zu dem Enzym korrespondierendes Substrat, und vorzugsweise ein farbgebendes Enzymsubstrat, wird für die Detektion des Enzyms verwendet. Beispielsweise wird, wenn Peroxidase für das Enzym verwendet wird, Wasserstoffperoxid für das Substrat verwendet, während Beispiele der Farbstoffe, die verwendet werden können, ortho-Phenylendiamin und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin einschließen.
Außerdem können in dem oben genannten Verfahren die primären und sekundären Antikörper abwechselnd verwendet werden. Darüber hinaus können bei der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu dem oben genannten Meßverfahren Enzym-verknüpftes Immunosorbens-Assay oder Radioimmunoassay gemäß den konventionellen Verfahren unter Verwendung eines markierten Antigens zusammen mit dem monoklonalen Antikörper durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Meßausrüstung bereit. Diese Ausrüstung enthält wenigstens einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung. Der monoklonale Antikörper kann in Lösung oder gefriergetrocknet sein, oder er kann auch an einen festen Träger fixiert werden. In dem Falle, daß die Ausrüstung einen an einen festen Träger fixierten monoklonalen Antikörper enthält, ist dieser feste Träger vorzugsweise in der Ausrüstung enthalten, nachdem dieser mit einem blockierenden Mittel behandelt worden ist.
Die Meßausrüstung kann auch einen sekundären oder tertiären Antikörper als ihr drittes Element einschließen. In dem Falle, daß die Markierung des sekundären oder tertiären Antikörpers in diesem Fall ein Enzym ist, kann die Ausrüstung auch einen Farbstoff einschließen, welcher das Substrat des Enzyms enthält. Kommerziell erhältliche Produkte können jedoch für den markierten sekundären und tertiären Antikörper als auch den entsprechenden Farbstoff verwendet werden, die keine wesentlichen Elemente der Ausrüstung der vorliegenden Erfindung sind.
Die Meßausrüstung der vorliegenden Erfindung kann auch einen Probenverdünnungspuffer, verschiedene Arten von Reagensverdünnungspuffern, eine Waschlösung, Standardantigene, etc. als wahlweise Elemente enthalten.
Darüber hinaus kann das Verfahren zum Sammeln einer physiologisch aktiven Substanz, welche eine Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierende Aktivität vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung besitzt, auch Antigensammelverfahren unter Verwendung von gewöhnlichen Antigen-Antikörper-Reaktionen sein.
Ein Beispiel der Messung von Herzglycosiden (Na&spplus;,K&spplus;-ATPase inhibierende Substanzen vom Kaliumionkonzentration-Antagonist- Typ) unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung ist in Beispiel 5 angegeben. In diesem Beispiel werden Ouabain und Digoxin als Herzglycoside verwendet, und die Beziehung zwischen ihren Konzentrationen und den Radioaktivitätsmeßwerten (CPM) im Scintillationsnäherungsassay (SPA) ist in Fig. 4 angegeben.
Außerdem ist die Beziehung zwischen der Extinktion und den Konzentrationen von Ouabain und Digoxin, wie mittels ELISA unter Verwendung eines zu dem in Beispiel 1 ähnlichen Verfahrens gemessen, in Fig. 5 gezeigt. Jeder dieser Fälle zeigt, daß der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung für die Messung von Herzglycosiden verwendet werden kann.

EFFEKT DER ERFINDUNG

Wie oben beschrieben, erlaubt die Verwendung der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung die Erkennung der immunochemischen Verteilung und Lokalisierung im Gewebe, und die Isolierung und quantitative Analyse von in natürlichen Substanzen enthaltenen herzaktiven Substanzen. Sie erlaubt auch eine leichte Identifizierung der Eigenschaften von herzaktiven Substanzen, oder in anderen Worten, die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierende Wirkung vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ für existierende oder neue synthetische Verbindungen. Darüber hinaus wird von ihr erwartet, daß sie direkt zur pathophysiologischen Forschung beiträgt, welche die essentielle Hypertonie und verschiedene Typen von Herzkrankheiten, ihre Diagnose und Behandlung, als auch die Schaffung von neuen Arzneimitteln auf diesen Gebieten betrifft, welche auf die Übernahme einer strukturellen Annäherung basiert (Rezeptor-(Na&spplus;,K&spplus;-ATPase)- Antagonisten der Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierenden Substanzen resultierend aus der Übernahme einer strukturellen Annäherung an die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierende Aktivität vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ, oder in anderen Worten, die Schaffung von therapeutischen Arzneimitteln zur Behandlung von essentieller Hypertonie).

BESTE AUSFÜHRUNGSFORM ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG

Obwohl das Folgende eine genaue Erklärung der vorliegenden Erfindung durch Beispiele bereitstellt, schränken die Beispiele den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht ein.

Beispiel 1: Herstellung von Immunogen

Ouabain (0,2 mM) und Natriumperiodat (0,25 mM) wurden in 5 ml destilliertem Wasser gelöst und für 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, dann mit 10 ml Ethanol versetzt und der pH mit Natriumhydroxid auf 8,35 eingestellt. Rinderserumalbumin (2 µm) wurde hinzugefügt und der pH mit Natriumhydroxid auf 9,35 eingestellt und die Lösung anschließend über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Als nächstes wurden 0,8 mM Natriumcyanoborhydrid zugesetzt, dann die Lösung für 48 Stunden mit entionisiertem Wasser dialysiert, wonach sie zusätzlich drei Mal mit destilliertem Wasser dialysiert wurde, gefolgt von Gefriertrocknung.
So wurde ein Ouabain-Protein-Komplex hergestellt, in welchem Rinderserumalbumin kovalent an das terminale Ende der Zuckerkette von Ouabain gebunden ist. Gemäß dieser Ergebnisse der Messungen der Extinktion bei 370 nm in einer 50 %igen Schwefelsäurelösung waren 33 Ouabainmoleküle pro Molekül Rinderserumalbumin gebunden.

Beispiel 2: Herstellung von Hybridomzellen

Das in Beispiel 1 hergestellte gefriergetrocknete Immunogen wurde in einer geeigneten Menge destillierten Wassers aufgelöst, die Lösung dann mit Dalvecco's PBS(-) (abgekürzt als D'PBS(-)) verdünnt, um die unverdünnte Immunogenlösung mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml herzugstellen. Die oben genannte unverdünnte Immunogenlösung wurde mit dem kompletten Freud'schen Adjuvants bei einem Verhältnis von 3 : 2 vermischt, um eine Wasser-in-Öl-artige Emulsion herzustellen. Die anfängliche Immunisierung wurde durch subkutanes Injizieren dieser Emulsion in BALB/C-Mäuse (SPF, weiblich, 5 Wochen alt) bei einer Dosis von 20 µg Antigen pro Tier durchgeführt. Durch Mischen von inkomplettem Freud'schen Adjuvants und der oben genannten unverdünnten Immunogenlösung bei einem Verhältnis von 3 : 2 wurde eine weitere Wasser-in-Öl-artige Emulsion hergestellt, die dann für die zusätzliche Immunisierung durch eine intraperitoneale Injektion in Mäuse bei einer Dosis von 10 µg Antigen pro Tier verwendet wurde. Eine zusätzliche Immunisierung wurde drei Mal in 3-Wochen-Intervallen (4 Mal einschließlich der ursprünglichen Immunisierung) durchgeführt. 1 Woche bis 10 Tage nach der Endimmunisierung wurden Testproben aus dem venösen fundus nidus entnommen. Der Titer des Serumantikörpers wurde dann, zur nachfolgenden Beschreibung mit ELISA, gemessen, und diejenigen Mäuse, die sensibilisiert waren, wurden ausgewählt. 20 µg Antigen pro Tier wurde intravenös in die Mäuse 3 Tage vor Durchführung der Zellfusion injiziert.
Zu beachten ist, daß der oben genannte ELISA-Vorgang wie oben beschrieben durchgeführt wurde. Zunächst wurden die wäßrigen Lösungen (1 mg/ml) jedes Antigens (Ouabain-BSA-Komplex, Ouabain, Digoxin und Rinderserumalbumin) hergestellt. Diese wurden auf eine Konzentration von 10 µg/ml mit einem Beschichtungspuffer (0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6) verdünnt. Diese Lösungen wurden dann in jede Vertiefung bzw. well einer Mikrotiterplatte verteilt, wobei 100 µl in jede Vertiefung eingebracht wurden. Die Platten wurden dann über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Der Überstand wurde aus der Platte abgesaugt und die Platte drei Mal mit Waschlösung (D'PBS(-), welche 0,1 Gew./Vol.% Tween 20 und 0,1 Gew./Vol.% NaN&sub3; enthielt) gewaschen. Als nächstes wurden 150 µl blockierender Lösung (D'PBS(-), welche 0,1 % (Gew./Vol.) NaN&sub3; und 0,1 % (Gew./Vol.) Gelatine enthielt) jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC. Nach dem Entfernen der blokkierenden Lösung wurden die Platten drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurden 100 µl der Probe (primärer Antikörper) (serumverdünnte Lösung) jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei 37ºC. Nach dem Entfernen der Probe wurden die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen.
Als nächstes wurden 100 µl sekundärer Antikörper (biotinierte Schaf-Antimaus-Immunoglobulin, Amersham, 500 Mal verdünnt) jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei 37ºC. Nach Entfernen des Überstands wurde die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurden 100 µl mit Alkaliphosphatase-markierten Avidins (Dakopatts) jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC. Der Überstand wurde aus jeder Vertiefung entfernt und die Platten drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurden 100 µl Enzymsubstrat (p-Nitrophenylphosphat-dinatriumsalz (PNPP), gelöst in 10 mM Diethanolaminpuffer (pH 9,5), welches 0,5 mM MgCl&sub2; enthielt, bei einer Konzentration von 100 mg/100 ml) jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von Stehenlassen für ungefähr 20 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes wurde, nach dem Abbrechen der Reaktion durch die Zugabe von 50 µl pro Vertiefung einer reaktionsabbrechenden Lösung (3 N NaOH) die Extinktion jeder Vertiefung bei 405 nm unter Verwendung einer automatischen Extinktionsmeßvorrichtung gemessen.
Nach dem Ausbluten der sensibilisierten Mäuse wurde das Serum aus dem ganzen Blut abgetrennt und als das Assay-Kontrollserum gefriergetrocknet. Die Milz wurde sofort unter Verwendung von sterilen Bedingungen aus den ausgebluteten Mäusen durch das Vornehmen eines Schnittes in die Bauchhöhle extrahiert. Die extrahierte Milz wurde dann in einen mit RPMI-1640 gefüllten Behälter eingebracht. Die folgende Vorgehensweise wurde an einem sterilen Arbeitstisch durchgeführt. Nach dem Waschen der extrahierten Milz zwei Mal mit RPMI-1640-Medium und Wegschneiden jeglichem anhaftenden Fettgewebefragmenten wurde die Milz mit einer Schere vertikal in zwei Bereiche geschnitten und schließlich dann mit einer Pinzette in ein Kulturmedium dispergiert. Die Zellsuspension wurde mit einem autoklavierten Sieb oder Nylongewebe filtriert und gesammelt. Nach dem Entfernen des Überstands, auf das Zentrifugieren der Zellsuspension bei niedriger Geschwindigkeit (800 U/min für 3 Minuten) folgend, und Dispergieren der zusammengeballten Zellen, die sich durch leichtes Klopfen zu einem Niederschlag formten, wurden die Zellen mit kalter Hämocytocathereselösung (eine Mischung von 0,83 % NH&sub4;Cl und Tris-HCl (pH 7,65) bei einem Verhältnis von 9 : 1) resuspendiert. Nach dem Sammeln der Zellen durch niedertourige Zentrifugation und einmaligem Waschen mit RPMI-1640-Medium wurde die Anzahl der Zellen nach dem Resuspendieren in RPMI-1640-Medium gezählt.
Andererseits wurde nach dem Zentrifugieren von frischen Myelomzellen, (P&sub3;-X63-Ag8-U&sub1;) (P&sub3;U&sub1;) rasch für 2 - 3 Tage in GIT- Medium (Nippon Seiyaku) rasch vermehrt, bei niedriger Geschwindigkeit (1000 U/min für 3 Minuten) unter Verwendung von Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden, Entfernen des Überstands und Dispergieren der zusammengeballten Zellen, die sich durch Klopfen zu einem Niederschlag formten, die Anzahl der Zellen nach dem Suspendieren in RPMI-1640 (auf 37ºC erhitzt) basischem Medium gezählt.
Nach dem Fraktionieren der Myelomstrang-P&sub3;U&sub1;-Zellen, die in RPMI-1640-Medium im voraus suspendiert wurden, und Milzzellen in Röhrchen mit rundem Boden für die Zellfusion in einem Verhältnis von annähernd 1 : 5 in bezug auf die kalkulierte Anzahl Zellen, Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit und Entfernen des Überstandes, wurden die zusammengeballten Zellen, die sich zu einem Niederschlag formten, durch leichtes Klopfen dispergiert. Eine Lösung, in der Polyethylenglycol (PEG) bei einer Temperatur von 50ºC oder weniger nach dem Autoklavieren vorher in einem gleichen Volumen von RPMI-1640- Medium aufgelöst wurde, wurde langsam unter den Röhrchen aufgeteilt und über den Verlauf von annähernd 20-30 Sekunden unter Beibehaltung der Temperatur bei 37ºC mit den dispergierten Zellen vermischt. Als nächstes wurden, nachdem die Röhrchen für 1-2 Sekunden sanft geschüttelt wurden, die Röhrchen für 15 Sekunden bei 1100 U/min bei einer Temperatur von 25-37ºC zentrifugiert. Als nächstes wurden die Lösungen mit einer Pipette unter allmählicher Zugabe von 7 ml RPMI-1640-Medium bei einer Temperatur von 37ºC vermischt.
Als nächstes, nach dem Entfernen des Überstands durch Zentrifugieren für 3 Minuten bei 800 U/min bei einer Temperatur von 25-37ºC, und Resuspendieren der zusammengeballten Zellen unter allmählicher Zugabe von 10 ml HT-Medium, wurden die Zellen unter Verwendung einer ähnlichen Vorgehensweise gewaschen. Die Zellen wurden dann unter Verwendung von HT-Medium (RPMI-1640, das Thymidin, Hypoxanthin und 10 % fötales Kalbserum enthielt) resuspendiert, so daß die berechnete Anzahl Myelomzellen 1 x 10&sup6; Zellen/ml betrug. Diese Zellsuspendion wurde dann in eine 96-well-Mikroplatte zur Zellkultivierung verteilt, wobei man 0,1 ml in jede Vertiefung einbrachte, gefolgt von Kultivierung in einem CO&sub2;-Inkubator (CO&sub2;-Konzentration: 5 %, 37ºC).
50 µl HAT-Medium (RPMI-1640-Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin und 10 % fötales Kalbserum enthielt) wurden dann am zweiten Tag der Zellkultivierung jeder Vertiefung zugesetzt. Darüber hinaus wurde das Medium alle 3 Tage unter Verwendung von 10 µl HAT-Medium pro Vertiefung ersetzt. Das Ausmaß der Vermehrung der Hybridomzellenkolonien wurde 2 Wochen später mikroskopisch beobachtet. Die Antikörpertiter wurden in gleicher Weise wie die Titermessungen von Serumantikörpern mittels ELISA für die ersetzten Kulturüberstände der Vertiefungen gemessen, in denen Hybridomzellenkolonien zu dieser Zeit bestätigt wurden. Diejenigen Zellen, in denen die Erzeugung des gewünschten Antikörpers bestätigt wurde, wurden in einen T-Kolben für eine Vermehrung in großem Maßstab durch aufeinanderfolgendes Überführen von 1 ml pro Vertiefung, bis ein Endvolumen von 10 ml erreicht war, wobei man GIT-Medium nach dem Ändern der Kulturflüssigkeit vom HAT-Medium zum HT- Medium transferiert, um die Zellen zu vermehren. Diejenigen Zellen wurden dann so schnell wie möglich in eine Tiefkühllagerung gebracht.
Die Thymusdrüsen von weiblichen Mäusen (BALB/c, 4 Wochen alt) wurden extrahiert und in GIT-Medium suspendiert, zu welchem HT zugesetzt wurde (5 x 10&sup6; Zellen/ml). Die Hybridomzellen wurden dann unter Verwendung dieser Thymuszellen (5 Zellen/0,1 ml/Vertiefung, 2,5 Zellen/0,1 ml/Vertiefung, 1,25 Zellen/0,1 ml/Vertiefung und 0,625 Zellen/0,1 ml/Vertiefung) ultraverdünnt. Nach dem Kultivieren für 10 Tage bis 2 Wochen in einem CO&sub2;-Inkubator (5 % CO&sub2;, 37ºC) wurden das Ausmaß der Zellvermehrung und der Antikörpertiter des Kulturüberstands gemessen. Das Reklonieren der Zellen, Subkultivieren, und Tiefkühllagerung wurden wie erforderlich durchgeführt. Die Tiefkühllagerung wurde wie unten beschrieben durchgeführt. Die kultivierten Zellen wurden zentrifugiert (1000 U/min, 15-25ºC, 3 Minuten) und der Überstand wurde entfernt. Nach dem Dispergieren der zusammengeballten Zellen, die durch sanftes Klopfen des Röhrchens einen Niederschlag formten, wurden die Zellen durch Zugabe von kaltem gefrorenen Speichermedium (4ºC) resuspendiert (5 x 10&sup6; Zellen/ml). 1 ml jeder Zellsuspension wurde in 1,8 ml Gefrierröhrchen fraktioniert. Nach dem Stehenlassen der Röhrchen für wenigstens eine Nacht bei -80ºC wurden die Zellen in flüssigen Stickstoff bei einer Temperatur von -194ºC eingebracht und im Falle von Langzeitlagerung gelagert. 10 positive Hybridomzellen wurden auf diese Weise erhalten.
Als nächstes wurden die Unterklassen der in dem Kulturüberstand aus dem GIT-Medium dieser Hybridomzellen enthaltenen Antikörper mittels ELISA bestimmt. In anderen Worten wurden 100 µl des Zellkulturüberstands direkt jeder Vertiefung einer Cobind-Platte zugesetzt, die Platte für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, der Überstand wurde entfernt, und die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurden 150 µl blockierender Lösung jeder Vertiefung zugesetzt, die Platte wieder für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, die Flüssigkeit wurde entfernt, und die Platte dann drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurden 100 µl biotinierter, von einer Ziege abstammender spezifischer Antikörper (Amersham) jeder Klasse, der Unterklasse, und ein Typ Mausimmunoglobulin jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von Inkubation der Platte für 60 Minuten bei 37ºC, Entfernen der Flüssigkeit, und Waschen der Platte drei Mal mit Waschlösung.
Als nächstes wurden jeder Vertiefung 100 µl Alkaliphosphatasemarkierten Avidins zugesetzt, die Platte für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, der Überstand wurde entfernt, und die Platte wurde drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Nach der Zugabe von 100 µl PNPP-Enzymsubstrat zu jeder Vertiefung und Stehenlassen der Platte bei Raumtemperatur für annähernd 20 Minuten, um eine geeignete Farbentwicklung zu gestatten, wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl der reaktionsabbrechenden Lösung zu jeder Vertiefung abgebrochen. Die Extinktionen jeder Vertiefung wurden dann bei 405 nm unter Verwendung einer automatischen Extinktionsmeßvorrichtung gemessen. Als Ergebnis wurde bestimmt, daß es sich bei allen Antikörpern um IgG1-κ handelt.
Als nächstes wurden die Hybridomzellen ausgewählt, die monoklonale Antikörper erzeugten, welche quantitativ sowohl mit Ouabain als auch Digoxin, durch Antikörpereinfang unter Verwendung von ELISA binden. Als erstes wurde Digoxinantigen in einer geringen Menge von 60 %igem Ethanol gelöst. Als nächstes wurde dieses auf eine Konzentration von 0,01 mg/ml mit der Beschichtungslösung (0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,5) verdünnt. 0,10 ml dieser Lösung wurden in jede Vertiefung einer 95-well- Platte mit flachem Boden verteilt und über Nacht bei 4ºC stehengelassen.
Als nächstes, nach dem Entfernen der Antigenlösung, wurde die Platte 3 Mal mit Waschlösung gewaschen. Nach der Zugabe von 0,15 ml blockierender Lösung zu jeder Vertiefung, Inkubieren für 30 Minuten bei 37ºC und Entfernen der blockierenden Lösung, wurde die Platte 3 Mal mit Waschlösung gewaschen, was zu einer Digoxin-absorbierten Platte führte.
Andererseits ließ man Antigendigoxin und Ouabain separat für 30 Minuten bis 1 Stunde bei 37ºC in dem Hybridomzellenkulturüberstand, welcher den getesteten monoklonalen Antikörper enthielt, reagieren, wonach 0,10 ml dieser Reaktionslösung jeder Vertiefung zugesetzt wurden, gefolgt von Inkubieren für 1 Stunde bei 37ºC. Diese Flüssigkeit wurde dann entfernt und die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurden 0,10 ml Biotin-behandelter sekundärer Antikörper (Anti-Maus Ig-Antikörper, 500 Mal verdünnt) in jede Vertiefung verteilt, gefolgt von Inkubieren für 1 Stunde bei 37ºC. Nach dem Entfernen der Reaktionslösung wurde die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurden 0,10 ml Alkaliphosphatasemarkierten Avidins (Dakopatts Ltd., D365, 500 Mal verdünnt) in jede Vertiefung verteilt, gefolgt von Inkubation der Platte für 30 Minuten bei 37ºC und dreimaligem Waschen mit Waschlösung.
Als nächstes wurden 0,10 ml Enzymsubstrat (in welchem 100 mg p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz (PNPP) in 100 ml 10 mM Diethanolaminpuffer (pH 9,5), der 0,5 mM MgCl&sub2; enthielt, gelöst waren) jeder Vertiefung zugesetzt und bei Raumtemperatur stehengelassen. Als sich die Farbe auf ein geeignetes Maß entwickelt hatte (normalerweise 20 Minuten), wurden 0,05 ml der reaktionsabbrechenden Lösung (3N NaOH) jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von Messung der Extinktion bei 405 - 410 nm unter Verwendung einer automatischen Extinktionsmeßvorrichtung.
Als Ergebnis wurde entdeckt, daß zwei Hybridomzellen von 249F8 und 278A9 mit sowohl Ouabain als auch Digoxin quantitativ reagierten, und diejenigen Hybridomzellen wurden in späteren Experimenten verwendet. Die Ergebnisse des oben genannten ELISA- Antikörpereinfangs für Hybridomzellen 249F8 und 278A9 sind in Fig. 2 gezeigt.
Des weiteren wurde die Hybridomzelle 249F8 Maushybridomzellinie SBM 319 genannt und dem Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology am 12. Dezember 1990 als Fermentation Research Institut Deposit Nr. 3197 (FERM BP-3197) anvertraut, während Hybridomzelle 278A9 Maushybridomzellinie SBM 320 genannt wurde und ebenso am 12. Dezember 1990 als Fermentation Research Institute Deposit Nr. 3198 (FERM BP-3198) anvertraut wurde.

Beispiel 3: Herstellung von monoklonalem Antikörper durch invivo Kultivierung

Hybridomzellen 249F8 und 278A9 wurden in GIT-Medium kultiviert, um Zellsuspensionen von 10&sup7; Zellen/ml nach dem Waschen mit basischem RPMI-1640-Medium herzustellen. 0,5 ml pro Maus Pristan wurden intraperitoneal in 5 - 6 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse injiziert, gefolgt von intraperitonealer Injektion von 0,5 ml der oben genannten Hybridomzellensuspension zwei Wochen später. Als sich Aszite in annähernd 1 - 10 Tagen unter Herbeiführung von Hypertrophie des Abdomens akkumulierten, wurden diese mit einer Spritze entfernt. 5 - 10 ml Aszite wurden in dieser Weise pro Maus erhalten.
Diese Aszite wurden durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 4ºC und 3000 U/min abgetrennt und der Überstand gesammelt. Der Überstand wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens gesättigter Ammoniumsulfatlösung (mit Ammoniakwasser auf pH 7,4 eingestellt) ausgesalzen. Diese Mischung wurde dann durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 4ºC und 14000 U/min (1000 x G) abgetrennt und der Überstand wurde entfernt. Der Niederschlag wurde in einer geeigneten Menge physiologischer Kochsalzlösung, aufgelöst und das restliche Ammoniumsulfat entweder durch Dialysieren dieser Lösung mit physiologischer Kochsalzlösung oder Fraktionieren mit einer Sephadex G25 M-Säule entfernt. Das Entfernen von Ammoniumsulfat wurde mittels Nessler's Reagens bestätigt. Als nächstes, nach dem Entfernen von jeglichem Fett unter Verwendung von kalter Klärungssubstanz (Friegen), wurde die Proteinmenge gemessen, die Lösung wurde entweder für folgende Experimente als unraffinierte Antikörperfraktionsprobe bereitgestellt, oder in Tiefkühllagerung eingebracht.
Als nächstes wurde der Antikörper durch Protein G-Sepharose - Säulenchromatographie gereinigt. Eine mit Protein G- Sepharose gefüllte Säule wurde mit 20 Bettvolumen Bindungspuffer (Affi-Gel Protein AMAPS-II Puffer, Bio-Rad, 153-6160, pH 9,0) gewaschen. Unraffinierte Antikörperfraktionsprobe, welche annähernd 5 mg/ml IgG enthielt, wurde in einem 1 : 1- Verhältnis mit dem oben genannten Bindungspuffer vermischt und auf die oben genannte Säule aufgetragen, gefolgt von Waschen der Säule mit 15 Bettvolumen Bindungspuffer.
Als nächstes wurde die IgG-Fraktion mit 10 Bettvolumen Elutionspuffer (mit der gleichen Zusammensetzung wie der auf pH 3,0 eingestellte Bindungspuffer) eluiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden 8 ml 1 M Tris-HCl-Puffer pro 25 ml Eluent in das Empfangsgefäß im voraus eingebracht, um den pH des Eluents in einem Neutralbereich zu neutralisieren. Das Medium der gesammelten Antikörperfraktion wurde mit physiologischer Kochsalzlösung durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Molekularsiebs (MW: 30000) ersetzt. Die Proteinkonzentration der resultierenden Antikörperlösung wurde gemessen, und nach Einstellen auf eine geeignete Proteinkonzentration wurde die Lösung gefriergetrocknet und für die Verwendung in späteren Experimenten gelagert.

Beispiel 4: Bestimmung der charakteristischen Merkmale des monoklonalen Antikörpers

A. Messungen des Antikörpertiters mittels ELISA

Wenn der monoklonale Antikörper durch das in Beispiel 1 beschriebene ELISA-Verfahren gemessen wurde, betrug der Titer des monoklonalen Antikörpers 249F8 (der von Hybridomzellen 249F8 erzeugte monoklonale Antikörper) 4300 Einheiten/mg, und der Titer des monoklonalen Antikörpers 278A9 (der von Hybridomzellen 289A9 erzeugte monoklonale Antikörper) betrug 2200 Einheiten/mg.

B. Monoklonale Antikörper-Kreuzreaktivität

Die Kreuzreaktivität der monoklonalen Antikörper 249F8 und 278A9 der vorliegenden Erfindung als auch das polyklonale Kaninchenantiserum R49 wurde in bezug auf verschiedene Substanzen (Antigene) unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen ELISA-Antikörpereinfangassays geprüft. Die in der folgenden Tabelle 1 gezeigten Substanzen wurden als Antigene in dieser Prüfung verwendet. Tabelle 1
Ferner deutet die Bezeichnung "trans-trans-cis" etc., nach den Substanztypen gezeigt, die Sequenz des Bindungstyps der A- und B-Ringe, der B- und der C-Ringe und der C- und D-Ringe innerhalb der Steroidstruktur entsprechend ihren cis- und trans- Konfigurationen, an.
Ein Teil der Ergebnisse der oben genannten Prüfung ist nachnachfolgend in Tabelle 3 beschrieben. Ferner sind diejenigen Ergebnisse auch in Fig. 3 gezeigt. Als Ergebnis dieser Prüfung wurde entdeckt, daß beide der zwei Typen von monoklonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung Steroidstrukturen haben, und diejenigen Antikörper nur mit Substanzen spezifisch reagieren, in denen die Bindung zwischen den C- und D-Ringen vom "cis"-Typ ist.

C. Korrelation zwischen der Reaktivität von verschiedenen Substanzen in bezug auf die monoklonalen Antikörper und die Na+,K+-ATPase-inhibierende Aktivität

Es ist bekannt, daß Ouabain die Enzymaktivität der Na&spplus;,K&spplus;- ATPase inhibiert. Als solches wurde die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierende Aktivität der als Antigene in Beispiel 4, Teil B verwendeten verschiedenen Substanzen geprüft, um die Korrelation zwischen dieser inhibierenden Aktivität und der Reaktivität mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zu untersuchen.
1,35 ml TES-Puffer (80 mM TES, 200 mM NaCl, 9 mM MgSO&sub4; 7H&sub2;O und 10 mM EGTA, eingestellt mit NaOH auf pH 7,4), 0,27 ml 0,2 % ODG (Octyl-D-glucosid), 0,27 ml 10&supmin;&sup5; M Probe (10&supmin;&sup6; M während der Reaktion), und 0,44 ml destilliertes Wasser wurden in ein Kunststoffteströhrchen eingebracht, das dann in einen Inkubator bei 25ºC eingebracht wurde. 0,27 ml 1 mM oder 100 mM KCl und 50 µl ATPase-Lösung (Lagerlösung, in der 5 Einheiten K&spplus;,K&spplus;-ATPase (Sigma) in 2 ml 10 mM TES (pH 7,4) mit 10 mM TES (pH 7,4), 2,5 Mal verdünnt aufgelöst, wie erforderlich) wurden zugesetzt, gefolgt von Inkubation für 5 - 10 Minuten bei 25ºC. Als nächstes wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 µl ATP- Lösung (71 mg ATP, gelöst in 5 ml 10 mM TES (pH 7,4) (Sigma)) begonnen.
Die Reaktion wurde bei 25ºC 30 Minuten in dem Falle der Verwendung von 1 mM KCl (0,1 mM in der Reaktionslösung), und 10 Minuten in dem Falle der Verwendung von 100 mM KCl (10 mM in der Reaktionslösung) fortgesetzt. Als nächstes wurden 0,03 ml 1 % Triton X-100-Lösung (in destilliertem Wasser) und 0,3 ml 2,5 % AmM-Lösung (5 g (NH&sub4;)&sub6;MO&sub7;O&sub2;&sub4; 4H&sub2;O, gelöst in 6 N H&sub2;SO&sub4; und auf ein Volumen von 200 ml gebracht) sofort vor der Verwendung (auf eine Gesamtmenge von 0,33 ml) vermischt und dann der Reaktionslösung zugesetzt, gefolgt von Inkubation für 10 Minuten bei 25ºC, um die Reaktion zu unterbrechen und Farbe zu entwickeln. Die Extinktion der Reaktionslösung wurde dann bei 660 nm gemessen und die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-Inhibierungsrate (%) gemäß der folgenden Formel berechnet.
Na&spplus;,K&spplus;-ATPase Inhibierungsrate (%) = [(Ao-Aw)/Ao] x 100
Ao: Na&spplus;,K&spplus;-ATPase Aktivität, wenn keine Probe zugesetzt war
Aw: Na&spplus;,K&spplus;-ATPase Aktivität, wenn eine Probe zugesetzt war
Als Ergebnis der oben genannten Messung wurden die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse erhalten. Tabelle 2
SPAI-1: Bezugnehmend auf Araki, K. et al. (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun. 64(1), 496-502.
Die Beziehung zwischen der oben genannten Kreuzreaktivität, der in der oben genannten Tabelle 2 angegebenen Na&spplus;,K&spplus;-ATPase- inhibierenden Aktivität, und der Gegenwart einer C-D-Ring cis- Bindungsstruktur innerhalb der Testsubstanzen ist in Tabelle 3 unterhalb angegeben. Tabelle 3
Wie aus der obigen Tabelle gesehen werden kann, haben die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper 249F8 und 278A9 gemeinsame Eigenschaften. Wie aus diesen Ergebnissen klar wird, weisen diejenigen Substanzen, die mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern reagieren, eine Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierende Wirkung auf. In anderen Worten wurde es klar, daß diejenigen Substanzen, die mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern reagieren, und diejenigen Substanzen, die eine Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierende Aktivität vom Kaliumionkonzentration-Antagonist-Typ haben, einen gemeinsamen Strukturbereich aufweisen, der aus einem cis-gebundenen D-Ring und seinen begleitenden Substitutionsgruppen besteht.

Beispiel 5: Quantitative Bestimmung der Herzglycoside durch Scintillationsnäherungsassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers

Das Folgende beschreibt das Prinzip des Scintillationsnäherungsassay (SPA). Nach dem Markieren eines zum Testantigen identischen Antigens mit einem Radioisotop wurde ein Antikörper (primärer Antikörper) mit diesem Antigen umgesetzt. Ein weiterer Antikörper zu dem primären Antikörper (sekundärer Antikörper) und eine Fluoreszenzsubstanz werden an einen festen Träger gebunden und man läßt diesen Antikörperträger mit dem Reaktionsprodukt des oben genannten primären Antikörpers und dem markierten Antigen reagieren. Als Ergebnis bindet der oben genannte primäre Antikörper an den sekundären Antikörper an dem festen Träger, wodurch es wiederum in der Fluoreszenzsubstanz, die an den festen Träger gebunden ist, dazu führt, daß diese in enge Nähe an das an den primären Antikörper markierte Antigen gebracht wird. Die Fluoreszenzsubstanz wird durch die Radioisotopmarkierung beeinträchtigt, wodurch die Fluoreszenzsubstanz zum Fluoreszieren gebracht wird. So erlaubt das Messen der Intensität dieser Fluoreszenz die Bestimmung der Menge an markiertem Antigen, welches mit dem primären Antikörper reagiert hat. In der oben genannten Reaktion, wenn das markierte Antigen zusammen mit dem dazu identischen Testantigen vorhanden ist, konkurrieren die zwei Antigene gegenseitig um den primären Antikörper. Infolgedessen inhibiert das Testantigen die Reaktion zwischen dem markierten Antigen und dem primären Antikörper. Als Ergebnis kann die Menge an Testantigen durch Messen der Intensität der Fluoreszenz gemessen werden.
0,1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4, 0,9 % NaCl und 0,01 % Triton X-100 enthaltend), 0,1 ml primäre Antikörperlösung (monoklonaler Antikörper 249F8 oder 278A9, gelöst in Tris-HCl- Puffer auf eine Proteinkonzentration von 0,001 mg/ml), 0,1 ml markierte Antigenlösung (250 µCi/250 µl [21, 22-³H]Ouabain (Amersham) in Toluol/Ethanol (1 : 9), 1000 Mal verdünnt, wenn verwendet), und 1 ml der Probe oder des markierten Antigens (Ouabain oder Digoxin, in destilliertem Wasser auf Konzentrationen von 10&supmin;&sup4;, 10&supmin;&sup5;, 10&supmin;&sup6;, 10&supmin;&sup7; und 10&supmin;&sup8; M gelöst) wurden in RIA-Assayröhrchen eingebracht und gerührt. Nach der Zugabe von 0,1 ml SPA-Anti-Maus-Ig-Reagens und adäquatem Rühren zur Bildung einer gleichmäßigen Suspension wurden die Röhrchen für 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert.
Die Menge der an die Kügelchen gebundenen Radioisotope wurde mit einem β-Scintillationszähler gemessen. Die Beziehung zwischen der Konzentration an Ouabain oder Digoxin und der Radioaktivität in diesem Fall ist in Fig. 4 angegeben.
Die detektierbaren Bereiche in dem Fall, daß die oben genannte Messung unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper durchgeführt wird, sind in Tabelle 4 angegeben. Des weiteren sind die detektierbaren Bereiche in dem Fall, daß der ELISA-Antikörpereinfang unter Verwendung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper durchgeführt wird, ebenfalls in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

Beispiel 6: Blockierung von Ouabain-Na&spplus;,K&spplus;-ATPase Inhibierung durch Anti-Ouabain-Antikörper

Der Effekt der Zugabe von Anti-Ouabain-Antikörper zur Ouabainlösung auf die reduzierte Inhibierung von Na&spplus;,K&spplus;-ATPase durch Ouabain wurde gemäß dem Verfahren von Youngberg und Youngberg gemessen.
Eine geeignete Menge von Ouabain und Antikörper (278A9 oder 3B10) wurden für 1 Stunde bei 37ºC umgesetzt. Auf die Beendingung der Reaktion folgend, wurde die Lösung mit Centricon 30 (Molekulargewicht 30000, Cutoff-Filter) deproteinisiert. Als nächstes wurde die Ouabainaktivität dieser deproteinisierten Lösung gemäß dem oben genannten Verfahren von Youngberg und Youngberg gemessen. Diese Ergebnisse sind in Fig. 7 angegeben.
Obwohl Anti-Ouabain-Antikörper 278A9 die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase- inhibierende Wirkung von Ouabain bei einer Proteinkonzentration von 1,5 mg/ml oder mehr blockierte, blockierte der Anti- TNF-Antikörper 3B10 diese Wirkung über den gleichen Konzentrationsbereich nicht. Auf diese Weise war es deutlich, daß Anti- Ouabain-Antikörper 278A9 die aktiven Stellen der Molekularstruktur von Ouabain erkennt, welche die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-inhibierende Wirkung herbeiführen.
Des weiteren wurde die Messung der Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-Aktivität gemäß dem Verfahren von Youngberg und Youngberg wie unten beschrieben durchgeführt.
100 µl Puffer (60 mM Tris-HCl (pH 7,2), 220 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 1 mM EGTA und 8 mM MgCl&sub2;), 40 µl der Probe, 40 µl ATPase- Lösung (50 mM Tris-HCl (pH 7,2), in der 5 Einheiten 12 ml ATPase mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,2) 22,5 Mal verdünnt waren), und 40 µl ATPase-Lösung (50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 10 mM ATP enthaltend) wurden in die Vertiefungen einer Assayplatte eingebracht und für 30 Minuten bei Raumtemperatur der Reaktion überlassen.
Als nächstes wurden 50 µl Ammoniummolybdat-Schwefelsäurelösung (14 % (Vol./Vol.) Ammoniummolybdat, in Schwefelsäure gelöst) jeder Vertiefung zugegeben, um die Reaktion abzubrechen. Als nächstes wurden 50 µl Zinn(II)-chlorid-Salzsäurelösung (2 g SnCl&sub2; 2H&sub2;O, gelöst in 5 ml konzentrierter Salzsäure, gefolgt von Verdünnung mit destilliertem Wasser auf einen Faktor von 200) jeder Vertiefung zugesetzt, wonach 2 - 5 Minuten für die Reduktion des Molybdats gestattet wurden. Als solches wurde ein von Na&spplus;,K&spplus;-ATPase erzeugter anorganischer Phosphor als Molybdat gebildet und die Reduktion dieses Molybdats erzeugte eine blaue Farbe, deren Extinktion bei 690 nm gemessen wurde.

Beispiel 7: Messung von menschlicher Plasma-OLF-(Ouabain-Like- Faktor)-Fraktion gereinigt durch HPLC mittels ELISA unter Verwendung von Anti-Ouabain-Antikörper

Menschliches Plasma, gereinigt durch HPLC (315 ml Plasma) wurde in 50 µl Ethanol gelöst, gefolgt von der Zugabe von 380 µl destilliertes Wasser auf ein Gesamtvolumen von 430 µl. 30 µl 0,1 % Gelatin-PBS(-) wurden zu 90 µl dieser Probe zugesetzt, gefolgt von geeigneter Verdünnung. Man ließ dies mit Anti- Ouabain 278A9 für 1 Stunde bei 37ºC reagieren. 100 µl/Vertiefung des oben genannten Reaktionsgemisches wurde in eine Digoxin-beschichtete Assayplatte verteilt, gefolgt von Reaktion für 1 Stunde bei 37ºC. Als Ergebnis reagierten der Biotin-behandelte sekundäre Antikörper (Anti-Maus-Ig), das Alkaliphosphatase-markierte Avidin und das Substrat p-Nitrophenylphosphat (PNPP) nacheinander mit dem an das Digoxin der Platte gebundene 278A9, wonach die Extinktion des Gemisches bei 405 nm gemessen wurde. Diese Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt.
Die Reaktion zwischen der Probe und dem Anti-Ouabain- Antikörper 278A9 wurde bei einer hohen Probenkonzentration von einer nahezu 1/3-Verdünnung oder mehr beobachtet. So wurde bewiesen, daß eine Substanz im HPLC-gereinigten menschlichen Plasma vorhanden ist, die mit Anti-Ouabain-Antikörper reagiert.
Basierend auf diese Ergebnisse wurde bewiesen, daß 278A9 auch in der Reinigung von OLF verwendet werden kann.

Beispiel 8: Vergleich des Immunoeinfang-ELISA-Verfahrens der vorliegenden Erfindung und der offiziellen Untersuchung

Um das Immunoeinfang-ELISA-Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers mit dem offiziellen Prüfungsverfahren zu vergleichen, wurden gemäß diesen Verfahren verschiedene Herzglycoside gemessen. Digoxin (Sigma Chemical Co., Code Nr. D-6003) wurde für die Standardsubstanz verwendet, und Digoxintabletten (Sando Pharmaceutical, Chargen Nr. 7271), Digoxininjektionspräparat (Chugai Pharmaceutical, Chargen Nr. B0L01), Deslanosidinjektionslösung [Digilanogen C Injektionslösung, (Fujisawa Pharmaceutical Co. (abgekürzt als Firma F), Chargen Nr. 1560), Deslanosidinjektion (Kobayashi Kako (abgekürzt als Firma K), Chargen Nr. Y020), Cediland Injektionslösung (Sando Pharmaceutical (abgekürzt als Firma S), Chargen Nr. 7303)] und Resibufogenininjektionslösung (Taisho Pharmaceutical, Chargen Nr. 0198P) wurden für die Testproben verwendet.
Die Standardlösung und die Testlösungen wurden aus den oben genannten Proben in der unten beschriebenen Weise hergestellt. Die Standardlösung für die offizielle Prüfung und Messung der extrahierten Reagenzien wurde durch genaues Wiegen von 25,0 mg Standarddigoxin, Auflösen in 50 mg warmen Ethanol, gefolgt von Abkühlung, und schließliche Zugabe von Ethanol auf ein genaues Endvolumen von 100 ml hergestellt. 10 ml dieser Lösung wurde dann genau gemessen, gefolgt von der Zugabe von Ethanol auf ein genaues Endvolumen von 100 ml. So betrug die Konzentration der auf diese Weise hergestellten Standardlösung 2,5 mg/100 ml. Der Standard für die Messung der nicht extrahierten Proben wurde durch Verdünnen einer 60 %igen wäßrigen Ethanollösung von Digoxin (1 mg/ml) mit Wasser auf einen Faktor von 10 hergestellt. Dies wurde dann auf weitere 250 Mal mit ELISA- Verdünnungsmittel (0,1 % Gelatine und 0,1 % NaN&sub3; in D'-PSB(-)) auf eine Endkonzentration von 400 ng/ml verdünnt.
Die aus Kapseln hergestellte Probelösung wurde wie unten beschrieben hergestellt. Zwanzig oder mehr Kapseln wurden gewogen und zu einem Pulver verarbeitet. Als nächstes wurde eine zu 2,5 mg Digoxin (C&sub4;&sub1;H&sub6;&sub4;O&sub1;&sub4;) äquivalente Pulvermenge genau ausgewogen, gefolgt von der Zugabe von 5 ml kochendem n- Propanol und heftigem Rühren. Als nächstes ließ man die Lösung unter gelegentlichem Rühren für 20 Minuten abkühlen. Die Lösung wurde in einen Scheidetrichter eingebracht, und 20 ml Wasser wurden zugesetzt, gefolgt von zwei Extraktionen mit 30 ml Chloroform/n-Propanol-Gemisch (5 : 1). Die Extrakte wurden jedes Mal mit 5 ml Wasser gewaschen und in einen 100 ml- Meßkolben unter Verwendung von in Chloroform getränkter Saugwatte filtriert. Ethanol wurde auf ein Endvolumen von 100 ml zugegeben, was zur Gewinnung der Probelösung mit einer Konzentration von 25 mg/100 ml führte.
Um die Probelösung für das Reagens der offiziellen Untersuchung aus den Injektionslösungen herzustellen, wurde eine zu 2,5 mg Digoxin äquivalente Menge Injektionslösung genau gemessen und in einen Scheidetrichter eingebracht, gefolgt von der Zugabe von Wasser auf ein Volumen von 50 ml. 1 ml verdünnte Schwefelsäure (Zugabe von 5,7 ml Schwefelsäure zu 10 ml Wasser, gefolgt von der Zugabe von Wasser auf ein Volumen von 10 ml nach dem Abkühlen) wurden zugesetzt, gefolgt von Extraktion mit 35 ml, 30 ml und 30 ml eines Chloroform/n-Propanol- Gemisches (5 : 1). Jedes dieser Extrakte wurde mit 5 ml Wasser gewaschen. Die Extrakte wurden dann in einen 100 ml-Meßkolben unter Verwendung von in Chloroform getränkter Saugwatte überführt, wo sie sich vereinigten, gefolgt von der Zugabe von Ethanol auf ein Endvolumen von 100 ml. Die Konzentration der resultierenden Probelösung betrug 2,5 mg/100 ml.
Die Probelösung für ELISA aus den Injektionslösungen wurde durch Verdünnen der Injektionslösungen (250 µg/ml) 2,5 Mal mit Wasser auf eine Konzentration von 100 µg/ml und Verdünnen weitere 250 Mal mit ELISA-Verdünnungsmittel (0,1 % Gelatine und 0,1 % NaN&sub3; in D'-PBS(-)) auf eine Endkonzentration von 400 ng/ml erhalten.
Die offizielle Untersuchung wurde in der unten beschriebenen Weise durchgeführt. 10 ml jeder Standardlösung und der Probelösungen, wie oben beschrieben hergestellt, wurden genau gemessen und in separate Erlenmeyer-Kolben eingebracht. Diese wurden nahezu in Trockene eingedampft, während man Luft über ein Wasserbad zuführte. Nach dem Stehenlassen für 15 Minuten in einem Exsikkator (reduzierter Druck, Phosphorpentoxid) wurden die getrockneten Feststoffe durch Zugabe von 5 ml jeweils von saurem Eisenchloridreagens (1 ml saures Chloridreagens, hergestellt durch Auflösen von 9 g Eisenchlorid in Wasser auf ein Volumen von 100 ml, und 5 ml Schwefelsäure, zugegeben zu 10 ml Heißessig) gelöst. Die Lösungen wurden für 10 Minuten unter Lichtausschluß bei einer Temperatur von 30ºC oder weniger unter gelegentlichem Rühren stehengelassen. Die Lösungen wurden unter Verwendung von Glasfasern wie erforderlich filtriert. Die maximalen Extinktionswerte für die resultierenden Lösungen wurden durch Messen der Extinktion für 2 Minuten bei 590 nm unter Verwendung eines Hitachi U-3200-Spektralphotometers und saurem Eisenchloridreagens als Kontrolle bestimmt.
ELISA wurde in der unten beschriebenen Weise durchgeführt. Digoxin, das als das Standardantigen diente, wurde in 60 %igem Ethanol auf eine Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst. Dies wurde zusätzlich mit Beschichtungslösung (1,59 mg Na&sub2;CO&sub3;, 2,93 mg NaHCO&sub3; und 0,20 mg NaN&sub3;, gelöst in 1000 ml destilliertes Wasser: Carbonat/Bicarbonat 0,1 M, pH 9,5) auf eine Konzentration von 0,01 mg/ml verdünnt. Dies wurde dann in eine Assay- Platte (Serocluster 96-well-Platte mit flachem Boden, Costar, Code Nr. 3590) aufgeteilt, wobei 0,10 ml in jede Vertiefung eingebracht wurden. Diese Platte wurde dann abgedichtet und dann über Nacht bei 4ºC stehengelassen.
Andererseits wurden geeignete Konzentrationen von Antigenlösung und Antikörperlösung (monoklonale Maus-IgG1-κ Anti- Ouabain:MAaf278A9, Endkonzentration: 0,8 µg/ml) unter Verwendung des Verdünnungsmittels (Gelatine von RIA-Reinheit (Bio Rad Ltd., 170-6537, Kontrolle M3354) in pH 7,5 D'PBS(-) (Nissui Ltd., RPN-05913)) hergestellt, 70 µg/Vertiefung in eine Reaktionsplatte 5 (Serocluster V-low-98-well, Costar, Code Nr. 3897) verteilt, und für 30 Minuten bis 1 Stunde bei 37ºC der Reaktion überlassen.
Als nächstes wurde die Antigenlösung von der Assayplatte entfernt, wonach die Platte drei Mal mit Waschlösung (PBS-T) (pH 7,4 D'PBS(-), 0,1 % Gew./Vol. Tween 20 (Bio Rad Ltd., 1706537) und 0,17 % Gew./Vol. NaN&sub3; enthaltend) gewaschen. Als nächstes wurden 0,15 ml/Vertiefung blockierender Lösung (1 % Gew./Vol. Gelatine in pH 7,4 D'-PBS(-), 0,1 % Gew./Vol. NaN&sub3; enthaltend) der Platte zugefügt, gefolgt von Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC. Die blockierende Lösung wurde entfernt und die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen.
Als nächstes wurden 0,1 ml/Vertiefung der Lösung, die man zuvor in den oben genannten Vertiefungen der Platte mit V-förmigem Boden reagieren ließ, zugesetzt, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei 37ºC. Die Reaktionslösung wurde entfernt und die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen. 0,10 ml/Vertiefung vom biotinierten sekundären Antikörper (Schafbiotinierter Anti-Maus Ig-Gesamtantikörper (Amersham Ltd., RPN. 1021, Charge 13) 500 Mal verdünnt) wurden zugefügt, gefolgt von Inkubation für 60 Minuten bei 37ºC. Die Reaktionslösung wurde entfernt und die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen.
Als nächstes wurden 0,10 ml/Vertiefung Alkaliphosphatase- markiertes Avidin (Dakopatts Ltd., D365, Charge 029, 500 Mal verdünnt) zugefügt, gefolgt von Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC. Die Reaktionslösung wurde dann entfernt und die Platte drei Mal mit Waschlösung gewaschen. Als nächstes wurde das Enzymsubstrat (PNPP, 100 mg Natrium-p-Nitrophenylphosphatsalz, gelöst in 10 ml pH 9,5 10 mM Diethanolaminpuffer, das 0,5 mM MgCl&sub2; enthielt) in die Platte aufgeteilt und bei Raumtemperatur stehengelassen.
0,05 mg/Vertiefung der reaktionsabbrechenden Lösung (wäßrige 3 N NaOH-Lösung) wurden hinzugefügt, wenn eine geeignete Stärke der Farbentwicklung erhalten wurde (normalerweise annähernd 20 Minuten).
Schließlich wurde die Extinktion bei 405 - 410 nm unter Verwendung einer automatischen Extinktionsmeßvorrichtung (Micro ELISA Auto Reader MR 580, ein Dynatech-Produkt) gemessen.
Die oben genannten Ergebnisse sind in Fig. 9 und Fig. 10 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, beträgt der optimale Konzentrationsbereich für die Messung unter Verwendung des offiziellen Prüfungsverfahrens 3 - 30 µg/ml, während derjenige für das ELISA-Verfahren 0,01 - 0,3 µg/ml beträgt, was zeigt, daß die Nachweisempfindlichkeit des ELISA-Verfahrens annähernd 300 Mal größer als diejenige des offiziellen Prüfungsverfahrens ist. So können Proben mit niedriger Konzentration mit dem ELISA-Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit quantitativ bestimmt werden.
Das offizielle Prüfungsverfahren (Keller-Kiliani-Verfahren) ist ein kolorimetrisches Verfahren, worin der Zuckerkette-Rest eines Herzglycosids in der Form von Digitoxose durch saures Eisenchloridreagens gefärbt ist. Obwohl es im offiziellen Prüfverfahren notwenig ist, das Digoxin im voraus durch einen Extraktionsvorgang abzutrennen, wie in Fig. 11 und Tabelle 5 gezeigt ist, kann im Falle der Messung des Digoxins eines Digoxininjektionspräparats mittels ELISA die Messung direkt unter Weglassen des Extraktionsvorgangs durchgeführt werden. Tabelle 5 Beziehung zwischen dem Digoxin-gemessenen Werten im Falle der Messung nach dem direkten Verdünnen des Digoxininjektionspräparats, und in dem Falle der Messung auf die Extraktion von Digoxin folgend
Die Ergebnisse der Messung von Digoxintabletten und Digoxininjektionslösung durch das offizielle Prüfverfahren (Keller- Kiliani-Verfahren) und ELISA (Antikörpereinfangverfahren) sind in der folgenden Tabelle angegeben. Tabelle 6
Wie oben gezeigt ist, gab es eine gute Übereinstimmung zwischen den mit dem offiziellen Prüfverfahren gemessenen Werten und den mit ELISA gemessenen Werten sowohl für Tabletten als auch für Injektionspräparate. Darüber hinaus geht man davon aus, daß die Tatsache, daß die gemessenen Werte in dem Falle von Tabletten 76 - 78 % den angezeigten Werten entsprechen, die Extraktionseffizienz wiederspiegelt.
Da es bewiesen wurde, daß Digoxininjektionspräparate unter Verwendung des ELISA-Verfahrens gemessen werden können, ohne daß ein Extraktionsvorgang erforderlich ist, wurde eine quantitative Bestimmung für drei weitere Herzglycosid-Deslanosid- Injektionspräparate durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in Fig. 12 und Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Konzentration an Herzglycosid, in Digoxin- und Deslanosidinjektionspräparaten enthalten, mittels ELISA unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, wurden die gemessenen Werte wie für alle Beispiele angegeben erhalten. Andererseits, obwohl die quantitative Bestimmung von Resibufogenin (welches keinen Zucker enthält) versucht wurde, wurde, als sich die optimale Meßkonzentration aufwärts verschob, bewiesen, daß das ELISA-Verfahren die spezifische quantitative Bestimmung von Ouabain-artigen Herzglycosiden wie beispielsweise Deslanosid und Digoxin erlaubt, selbst wenn derartige Herzglycoside identische Geninstrukturen aufweisen.

Beispiel 9: Quantitative Bestimmung von in pharmazeutischen Präparaten und pharmazeutischen Bestandteilen enthaltenen Herzglycosiden durch das Immunoeinfangassay (ELISA-Verfahren) der vorliegenden Erfindung

Die Herzglycosidmengen, die in den folgenden pharmazeutischen Präparaten und pharmazeutischen Bestandteilen enthalten waren, wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 8 bestimmt.
Pharmazeutisches Präparat: Kyushin (Kyushin Pharmaceutical, Code-Nr. BA6653, Chargen Nr. L20)
Pharmazeutischer Bestandteil: Senso (Tochigi Tenkaido, Chargen Nr. 30607-Z).
Zusätzlich wurde Bufalin (Sigma Chemical Co., Code No. B-0261) für die Standardsubstanz verwendet. Die Kyushin-Probelösung und Senso-Probelösung, die in der Untersuchung verwendet wurden, wurden in der unten beschriebenen Weise erhalten.

Kyushin Probelösung

Kyushin wurde in einem Mörser nach dem Einwickeln in pharmazeutisches Verpackungspapier und dem Zerdrücken zermahlen. 175,6 mg des gemahlenen Pulvers wurden dann ausgewogen. Nach der Zugabe von 10 ml kochendem n-Propanol und heftigem Rühren ließ man die Lösung unter häufigem Rühren abkühlen. Diese Lösung wurde unter Verwendung von in n-Propanol getränkter Saugwatte filtriert. Das Filtrat wurde in einen Scheidetrichter überführt, gefolgt von Extraktion nach der Zugabe von 20 ml Wasser und 25 ml Chloroform. Die Extraktion wurde mit einem Gemisch von 25 ml Chloroform und 5 ml n-Propanol wiederholt. Der Extrakt wurde jedes Mal mit 5 ml Wasser gewaschen. Der Extrakt wurde dann unter Verwendung von in Chloroform getränkter Saugwatte filtriert. Das Filtrat wurde mit einem Rotationsverdampfer verdampft, um die Probelösung durch Auflösen des Restes in 1 ml Ethanol zu erhalten.

Sensoprobelösung

Nach dem Schaben von Senso zu kleineren Bruchstücken und Mahlen mit einem Mörser wurden 1,0 g des Pulvers ausgewogen. Nach der Zugabe von 10 ml kochendem n-Propanol und heftigem Rühren ließ man die Lösung unter heftigem Rühren aufkühlen. Die Lösung wurde dann unter Verwendung in n-Propanol getränkter Saugwatte filtriert. Das Filtrat wurde in einen Scheidetrichter überführt, gefolgt von Extraktion nach der Zugabe von 20 ml Wasser und Chloroform. Die Extraktion wurde mit einem Gemisch von 25 ml Chloroform und 5 ml n-Propanol wiederholt. Der Extrakt wurde jedesmal mit 5 ml Wasser gewaschen. Der Extrakt wurde unter Verwendung von in Chloroform getränkter Saugwatte filtriert und das Filtrat mit einem Rotationsverdampfer verdampft. Der Rest wurde in 1 ml Ethanol gelöst, um die Probelösung zu erhalten.
Die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung sind in Fig. 13, Fig. 14 und Tabelle 8 gezeigt. Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, können Herzsubstanzen in pharmazeutischen Präparaten oder pharmazeutischen Bestandteilen, wie beispielsweise Kyushin und Senso, mittels ELISA unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers quantitativ bestimmt werden. Die herzaktiven Steroidkomponenten, die in Kyushin und Senso enthalten sind, bestehen aus Bufalin, Regibufogenin, Cinobufagin, Bufotalin, Cinobufotalin, Gamabufotalin, Telocinobufagin und Hellebrigenin, etc. (Karigome, T. et al. (1976), Japanese Pharmacopoeia Guidebook, 9te Ausgabe, Japan Official Documentation Association, Hirokawa Shoten, Tokyo D-512 - D- 515), und diese Substanzen werden als zu messen betrachtet. Obwohl das Verfahren, das zur Extraktion von herzaktiven Substanzen aus pharmazeutischen Präparaten und pharmazeutischen Bestandteilen verwendet wurde, in diesem Fall einfach ist, sollte zur präzisen Messung des Gehalts der herzaktiven Substanzen das Extraktionsverfahren so modifiziert werden, daß die Extraktion durch Erhitzen und Refluxieren durchgeführt wird. Tabelle 8 Konzentration an herzaktiven Substanzen, enthalten in Kyushin und Senso

Beispiel 10: Affinität von verschiedenen Herzglycosiden und dem erfindungsgemäßen Antikörper gemäß dem Immunoeinfangassay (ELISA) der vorliegenden Erfindung

Die Affinität zwischen dem erfindungsgemäßen Antikörper und Digoxin, Ouabain, Digoxigenin, Bufalin und Regibufogenin wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 8 bewertet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 15 beschrieben.
Herzglycoside mit Teilstrukturen eines cis-gebundenen D-Rings innerhalb der Steroidstruktur als auch einer begleitenden, in der β-Konfiguration an der C13-Position gebundenen Methylgruppe, eine in der β-Konfiguration an der C14-Position gebundenen Hydroxylgruppe, und einer in der β-Konfiguration an der C17- Position gebundenen α, β-ungesättigten Lactongruppe zeigten eine starke Affinität zum Antikörper (40 ng/ml bis 400 ng/ml) Außerdem wurde auch bewiesen, daß, wenn das Sauerstoffatom des β-OH der C14-Position mit einer Ether-gebundenen Gruppe in der β-Konfiguration zwischen den C14- und C15-Positionen substituiert war, die Affinität deutlich abnahm (100 ng/ml bis 4 µg/ml).

Industrielle Anwendbarkeit

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper erkennt eine spezifische Struktur des steroidstrukturellen Bereichs des Herzglycosids, und ist für die Messung, Aufarbeitung, Reinigung, Assay, Auswahl und so weiter von Herzglycosiden nützlich.
Bezugnahme auf hinterlegte Mikroorganismen unter Regel 13-2 und
Hinterlegungsbehörde: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki
Maushybridomzellinie SBM 319
FERM BP-3197, hinterlegt am 12. Dezember 1990.
Maushybridomzellinie SBM 320
FERM BP-3198, hinterlegt am 12. Dezember 1990.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der eine Steroidstruktur von allen der folgenden Verbindungen (a), (b), (c) und (d) erkennt:

(a) ein Herzglycosid, dargestellt durch die Formel (I-a):

worin R die folgende Cardenolid-Form darstellt:

R¹ eine Zuckergruppe darstellt, dargestellt durch die Formel:

und worin der D-Ring an den C-Ring in der cis-Konformation gebunden ist;

(b) ein Herzglycosid, dargestellt durch die Formel (I-b):

worin R die folgende Bufagenolid-Form darstellt:

R¹ eine Zuckergruppe darstellt, dargestellt durch die Formel:

und worin der D-Ring an den C-Ring in der cis-Konformation gebunden ist;

(c) ein Aglycon eines Herzglycosids, dargestellt durch die Formel (I-c):

worin R die folgende Cardenolid-Form darstellt:

R¹ eine Hydroxylgruppe darstellt, und worin der D-Ring an den C-Ring in der cis-Konformation gebunden ist;

(d) ein Aglycon eines Herzglycosids, dargestellt durch die Formel (I-d):

worin R die folgende Bufagenolid-Form darstellt:

worin die Verbindungen (a) bis (d) eine inhibierende Wirkung auf die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-Aktivität als ein Kaliumionenkonzentration-Antagonist haben.

2. Monoklonaler Antikörper, beschrieben in Anspruch 1, der eine durch die Formel (II) dargestellte Verbindung erkennt:

worin R eine Cardenolid-Form darstellt:

oder eine Bufagenolid-Form:

und R' eine Piperizylgruppe, eine Piperizinogruppe oder ihre Derivate darstellt.

3. Monoklonaler Antikörper, erzeugt vom Hybridom 249F8 (FERM BP-3197) oder von Zellinien, die von diesem Hybridom abstammen.

4. Monoklonaler Antikörper, erzeugt vom Hybridom 278A9 (FERM BP-3198) oder von Zellinien, die von diesem Hybridom abstammen.

5. Hybridom 249F8 (FERM BP-3197) und Zellinien, die von diesem Hybridom abstammen.

6. Hybridom 278A9 (FERM BP-3198) und Zellinien, die von diesem Hybridom abstammen.

7. Messung, Assay oder Auswahlverfahren einer physiologisch aktiven Substanz mit einer inhibierenden Wirkung auf die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-Aktivität vom Kaliumkonzentration-Antagonist- Typ, worin die Testprobe mit einem in irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 beschriebenen monoklonalen Antikörper umgesetzt wird.

8. Verfahren zur Abtrennung oder Reinigung einer physiologisch aktiven Substanz mit einer inhibierenden Wirkung auf die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-Aktivität vom Kaliumionenkonzentration-Antagonist-Typ, worin die Substanz und der in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beschriebene monoklonale Antikörper infolge des Inkontaktbringens eines die Substanz enthaltenden Materials mit dem monoklonalen Antikörper gebunden werden, dieser gebundene Komplex abgetrennt wird, und die Substanz von dem monoklonalen Antikörper dissoziiert wird, um die Subtanz zu gewinnen.

9. Reagens für die immunochemische Messung, Assay oder Abtrennung einer physiologisch aktiven Substanz mit einer inhibierenden Wirkung auf die Na&spplus;-,K&spplus;-ATPase-Aktivität vom Kaliumionenkonzentration-Antagonist-Typ, welches den in irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 beschriebenen monoklonalen Antikörper umfaßt.

10. Verfahren für die Messung, Assay oder Abtrennung einer physiologisch aktiven Substanz mit einer inhibierenden Wirkung auf die Na&spplus;-,K&spplus;-ATPase-Aktivität vom Kaliumionenkonzentration- Antagonist-Typ, das die Schritte umfaßt:

(a) Umsetzen einer Testprobe mit dem monoklonalen Antikörper, welcher eine Steroidstruktur von allen der folgenden Verbindungen (a), (b), (c) und (d) erkennt:

(a) ein Herzglycosid, dargestellt durch die Formel (I-a):

worin R die folgende Cardenolid-Form darstellt:

R¹ eine Zuckergruppe darstellt, dargestellt durch die Formel:

und worin der D-Ring an den C-Ring in der cis-Konformation gebunden ist;

(b) ein Herzglycosid, dargestellt durch die Formel (I-b):

worin R die folgende Bufagenolid-Form darstellt:

R¹ eine Zuckergruppe darstellt, dargestellt durch die Formel:

und worin der D-Ring an den C-Ring in der cis-Konformation gebunden ist;

(c) ein Aglycon eines Herzglycosids, dargestellt durch die Formel (I-c):

worin R die folgende Cardenolid-Form darstellt:

(d) ein Aglycon eines Herzglycosids, dargestellt durch die Formel (I-d):

worin R die folgende Bufagenolid-Form darstellt:

worin die Verbindungen (a) bis (d) eine inhibierende Wirkung auf die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-Aktivität als ein Kaliumionenkonzentration-Antagonist haben;

(b) Detektieren eines Komplexes des monoklonalen Antikörpers und der physiologisch aktiven Substanz; und

(c) Korrelieren des detektierten Komplexes mit der Gegenwart der physiologisch aktiven Substanz in der Testprobe;

worin ein monoklonaler Antikörper irgendeine physiologisch aktive Substanz, dargestellt durch die Formel (a), (b), (c) oder (d), messen, untersuchen oder selektieren kann.

11. Verfahren zur Abtrennung oder Reinigung einer physiologisch aktiven Substanz mit einer inhibierenden Wirkung auf die Na&spplus;,K&spplus;-ATPase-Aktivität vom Kaliumionenkonzentration-Antagonist-Typ, das die Schritte des Inkontaktbringens der Substanz mit einem monoklonalen Antikörper, um die Substanz an den monoklonalen Antikörper unter Bildung eines Komplexes zu binden, Abtrennen des Komplexes, Dissoziieren des Komplexes, und Gewinnen der Substanz vom monoklonalen Antikörper umfaßt;

worin der monoklonale Antikörper eine Steroidstruktur von allen der folgenden Verbindungen (a), (b), (c) und (d) erkennt:

(a) ein Herzglycosid, dargestellt durch die Formel (I-a):

worin R die folgende Cardenolid-Form darstellt:

R¹ eine Zuckergruppe darstellt, dargestellt durch die Formel:

und worin der D-Ring an den C-Ring in der cis-Konformation gebunden ist;

(b) ein Herzglycosid, dargestellt durch die Formel (I-b):

worin R die folgende Bufagenolid-Form darstellt:

R¹ eine Zuckergruppe darstellt, dargestellt durch die Formel:

und worin der D-Ring an den C-Ring in der cis-Konformation gebunden ist;

(c) ein Aglycon eines Herzglycosids, dargestellt durch die Formel (I-c):

worin R die folgende Cardenolid-Form darstellt:

(d) ein Aglycon eines Herzglycosids, dargestellt durch die Formel (I-d):

worin R die folgende Bufagenolid-Form darstellt:

R¹ eine Hydroxylgruppe darstellt, und worin der D-Ring an der C-Ring in der cis-Konformation gebunden ist;

worin ein monoklonaler Antikörper irgendeine der physiologisch aktiven Substanz, dargestellt durch die Formel (a), (b), (c) oder (d), abtrennen oder reinigen kann.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der monoklonale Antikörper durch das Hybridom 249F8 (FERM BP-3197) oder das Hybridom 278A9 (FERM BP-3198) oder eine von beiden Hybridomzellen abstammende Zellinie erzeugt wird.