DE69114150T2

DE69114150T2 - Verfahren zur Herstellung eines getrockneten Kollagen-Schwammes.

Info

Publication number: DE69114150T2
Application number: DE69114150T
Authority: DE
Inventors: Kazuya Matsuda; Shinichiro Morita; Takeshi Shimamoto; Shigehiko Suzuki; Nobuya Takahashi
Original assignee: Gunze Ltd
Current assignee: Gunze Ltd
Priority date: 1990-01-31
Filing date: 1991-01-30
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2011-01-31
Also published as: DE69114150D1; EP0440198A3; US5116552A; JPH03224573A; EP0440198B1; EP0440198A2; JPH07100B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines getrockneten Kollagen-Schwammes.
Kollagen-Schwamm wird in großem Maße als Material für medizinische Artikel wie künstliche Haut verwendet. Der Kollagen- Schwamm wird im allgemeinen mit den folgenden Verfahren hergestellt. Eine wässrige Lösung von Atherokollagen wird direkt oder gegebenenfalls nach Homogenisierung unter Eiskühlung in eine geeignete Form gegeben; der Formkörper wird unter Erhalt eines mikroporösen Schwammes lyophilisiert, und der erhaltene Schwamm wird wie folgt vernetzt. Der lyophilisierte Schwamm wird auf eine Temperatur von etwa 100 bis etwa 110º C erhitzt, um ein intramolekulares Vernetzen zu erreichen, welches Wasserbeständigkeit verleiht, und er wird in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels weiterbehandelt, um intermolekulares Vernetzen einzuleiten, was den Schwamm gegenüber Hydrolyse mit Kollagenase resistent macht. Die hier verwendete Bezeichnung "Vernetzen" umfaßt das oben genannte intramolekulare Vernetzen und intermolekulare Vernetzen. Nach der Vernetzungsbehandlung wird der Schwamm mit destilliertem Wasser oder physiologischer Salzlösung gewaschen, uxn das Vernetzungsmittel zu entfernen. Danach wird das destillierte Wasser oder die Salzlösung durch eine wässrige Lösung von Alkohol ersetzt. Der in die Alkohollösung getauchte Schwamm wird in einem dicht geschlossenen Behälter gelagert und vor dem Gebrauch daraus entnommen. Bei Verwendung wird die Alkohollösung in dem Schwamm durch eine physiologische Salzlösung ersetzt; sodann ist der Schwamm gebrauchsfertig, z. B. als künstliche Haut.
Der Kollagen-Schwamm, der in nassem Zustand - wie oben beschrieben - gelagert wird, verändert jedoch seine Eigenschaften und wird unvorteilhafter Weise zur Verwendung als künstliche Haut ungeeignet. Des weiteren ist der nasse Schwamm beim Verpacken, beim Transport oder bei der Sterilisation unbequem zu handhaben, was erhöhte kosten verursacht, so daß er unzweckmäßig ist.
Zur Lösung dieses Problems haben die Erfinder den folgenden Versuch unternommen. Der in herkömmlicher Weise hergestellte und vernetzte Kollagen-Schwamm wird direkt abermals lyophilisiert, sterilisiert und anstelle der Lagerung durch Eintauchen in Alkohollösung trocken gelagert. Bei dem Versuch wurde der vernetzte Kollagen-Schwamm mit physiologischer Salzlösung oder destilliertem Wasser gewaschen, um das Vernetzungsmittel zu entfernen. Dann wurde der Schwamm abermals lyophilisiert, worauf dieser merklich schrumpfte und einen harten Oberflächengriff ergab, mit anderen Worten, er schrumpfte so viel, daß er zur Verwendung als künstliche Haut ungeeignet war. Die Erfinder wendeten die Lyophilisierung auch bei geringerer Temperatur an, um eine Kontraktion zu verhindern, fanden jedoch, daß der Schwamm während des Trocknens leicht zur Rißbildung neigte, was dessen Verwendbarkeit als künstliche Haut einschränkte. Soweit bekannt, ist kein vernetzter Kollagen-Schwamm, der in trockenem Zustand gelagert werden kann, für diese Zwecke erhältlich.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Kollagen- Schwamm zu schaffen, der die vorgenannten Probleme nicht aufweist und der in trockenem Zustand gelagert werden kann, ohne daß sich seine Eigenschaften über einen längeren Zeitraum verändern, und ein Verfahren zur Herstellung eines getrockneten Kollagen-Schwammes zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines getrockneten Kollagen-Schwammes zur Verfügung zu stellen, wobei ein vernetzter Kollagen-Schwamm lyophilisiert werden kann, ohne daß die unerwünschte Kontraktion und unerwünschtes Brechen bzw. Rissigwerden auftreten.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines riß bzw. bruchfreien getrockneten Kollagen- Schwammes mit einem Schrumpfungsfaktor bis zu 14% geschaffen, wobei der Schrumpfungsfaktor als prozentuale Flächenabnahme angegeben ist, errechnet aus der Differenz zwischen der Flächengröße vor und nach der Lyophilisierung, und das Verfahren die Schritte des lmprägnierens des vernetzten Kollagen-Schwamms mit einer wässrigen Lösung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels, das Gefrieren des Schwamms bei einer Temperatur von -80º C oder weniger und das Trocknen des Schwamms unter Vakuum umfaßt.
Die Forschungen ergaben das Folgende. Wenn der vernetzte Kollagen-Schwamm mit einer wässrigen Lösung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels vor der Lyophilisierung imprägniert wird, kann die Lyophilisierung erfolgen, ohne daß Risse bzw. Brüche bei einer niedrigen Temperatur von -80º C oder darunter auftreten, die ausreicht, um die Kontraktion des Schwamms zu verhindern. Es wird ein Kollagen-Schwamm erhalten, dessen Oberfläche sich wie die von künstlichen Häuten anfühlt. Der getrocknete Kollagen-Schwamm kann in trockenem Zustand ohne Veränderung der Eigenschaften über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesen neuen Erkenntnissen.
Der erfindungsgemäße vernetzte Kollagen-Schwamm kann durch Lyophilisierung einer wässrigen Lösung von Atherokollagen zu dem Schwamm, einer intramolekularen Vernetzungsreaktion des Schwamms durch Erhitzen zur Verleihung von Wasserbeständigkeit und einer intermolekularen Vernetzungsreaktion in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels zur Verleihung von Widerstandsfähigkeit gegenüber Hydrolyse durch Kollagenase hergestellt werden. Eine wässrige Lösung von Atherokollagen kann in herkömmlicher Weise hergestellt werden, indem man Protease in einem sauren Bereich auf Tiergewebe einwirken läßt, das einen hohen Gehalt an Kollagen hat wie z. B. Haut von Säugetieren, Eingeweide, Sehnen etc., um das Kollagen löslich zu machen. Die wässrige Lösung von Atherokollagen wird auf eine Konzentration von 0,2 bis 5 Gew./Vol-% eingestellt und erforderlichenfalls unter Rühren und Kühlen mit Eis homogenisiert, um ein Schäumen einzuleiten. Danach wird die Atherokollagenlösung in eine geeignete Form gegeben, gefroren und getrocknet und ergibt einen mikroporösen Schwamm. Das Gefrieren und Trocknen kann unter herkömmlichen Bedingungen erfolgen. Der Schwamm wird bei einer niedrigen Temperatur von -20 bis -50º C gefroren und bei einer Temperatur von -30 bis 40º C in einem Vakuum von 0,01 bis 0,2 mm Hg vakuumgetrocknet. Der in dieser Stufe erhaltene Schwamm hat eine weiße Farbe und weist Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 5 bis 1000 um, vorzugsweise 50 bis 120 um und ein prozentuales Porenvolumen von 90 bis 99% auf.
Der so erhaltene Schwamm wird erhitzt, um intramolekulares Vernetzen zu bewirken, welches Wasserbeständigkeit verleiht. Eine bevorzugte Erhitzungstemperatur liegt im Bereich von 100 bis 110º C. Erforderlichenfalls kann das Erhitzen in einem Vakuum erfolgen, um das Ausmaß des Trocknens zu erhöhen. Dann wird der Schwamm zum Zwecke der intermolekularen Vernetzungsreaktion in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels behandelt, wodurch der Schwamm gegenüber der Hydrolyse durch Kollagenase resistent wird. Beispiele geeigneter Vernetzungsmittel sind vielfältig und umfassen herkömmliche Vernetzungsmittel wie Formaldehyd, Hexamethylendiisocyanat, Glutaraldehyd. Die Vernetzungsreaktion wird in herkömmlicher Weise durchgeführt, indem der Schwamm bei Raumtemperatur oder unter Kühlen, gewöhnlich bei 4 bis 25º C, in eine Lösung eines Vernetzungsmittels getaucht wird.
Der vernetzte Schwamm wird kontinuierlich mit destilliertem Wasser gewaschen, um damit die Lösung des Vernetzungsmittels zu ersetzen, bis das Lösungsmittel vollständig entfernt ist. Die Verfahren bis zu dem vorhergehenden Schritt sind auf dem Fachgebiet bekannt und nicht darauf beschränkt. Es sind viele Verfahren zum Erhalt des vernetzten Kollagen-Schwamms anwendbar, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird der so erhaltene Kollagen-Schwamm mit einer wässrigen Lösung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels imprägniert. Beispiele geeigneter hydrophiler organischer Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol, Propanol und ähnliche niedere aliphatische (vorzugsweise C&sub1;-C&sub4;) Alkohole, Aceton und ähnliche niedere aliphatische (vorzugsweise C&sub3;-C&sub6;) Ketone; von diesen werden niedere aliphatische Alkohole bevorzugt, am meisten bevorzugt wird Ethanol. Eine geeignete Konzentration des hydrophilen organischen Lösungsmittels in der wässrigen Lösung liegt im Bereich von 5 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 30 Gew.-%, obwohl diese je nach Typ des organischen Lösungsmittels variabel ist.
Der Schwamm kann mit einer wässrigen Lösung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels in der folgenden Weise imprägniert werden. Der Schwamm, der die Waschüberreste nach der Vernetzungsreaktion enthält, kann direkt in eine wässrige Lösung eines organischen Lösungsmittels getaucht werden, um die Waschreste zu ersetzen. Alternativ kann der Schwamm mit der Lösung durch Tauchen, Sprühen oder andere geeignete Methoden imprägniert werden, und zwar nach dem Entfernen der Waschreste durch Trocknen, Auspressen und Reiben. Während des lmprägnierungsverfahrens kann die Lösung kontinuierlich zirkulieren. Gegebenenfall kann der Schwamm ausgedrückt, gerieben oder in anderer geeigneter Weise behandelt werden, um eine wirksamere lmprägnierung zu erhalten. Der Schwamm wird mit der Lösung in solcher Weise imprägniert, daß die Lösung wenigstens 90 Vol.- % des Schwamms ausmacht.
Erfindungsgemäß wird der auf diese Weise mit der wässrigen Lösung des hydrophilen organischen Lösungsmittels imprägnierte Schwamm bei einer niedrigen Temperatur von -80º C oder darunter gefroren. Ist die Gefriertemperatur höher als -80º C, kann leicht eine Kontraktion auftreten. Erfindungsgemäß wird das Gefrieren ohne eine Rißbildung bei einer niedrigen Temperatur von -80º C oder darunter, bei der eine Kontraktion vermieden wird, erreicht. Die bevorzugte Gefriertemperatur ist -80 bis -135º C. Der gefrorene Schwamm wird in herkömmlicher Weise bei einer Temperatur von -30 bis 40º C in einem Vakuum von 0,01 bis 0,2 mm Hg getrocknet.
Der erfindungsgemäß erhaltene Kollagen-Schwamm weist keine Risse bzw. Brüche auf und hat einen ausgesprochen geringen Schrumpfungsfaktor von bis zu 14%, vorzugsweise bis zu 12%.
Der Schwamm hat Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 5 bis 1000 um, vorzugsweise 50 bis 120 um und einen Porenanteil von 90 bis 99%, und er fühlt sich so weich wie künstliche Haut an. Demzufolge kann der erfindungsgemäße Schwamm vorteilhaft als künstliche Haut verwendet werden. Der getrocknete erfindungsgemäße Kollagen-Schwamm wird sterilisiert und kann über einen längeren Zeitraum und sterilen Bedingungen gelagert werden. Selbst nach einer langen Lagerzeit, z. B. einer Lagerung für 1 bis 3 Jahre, zeigt der erfindungsgemäße Kollagen-Schwamm keine Veränderung seiner Eigenschaften. Die Sterilisation kann mit herkömmlichen, allgemein für medizinische Artikel verwendeten Verfahren erfolgen, wie Anwendung von Ethylenoxidgas oder durch Bestrahlung mit Gammastrahlen. Der erfindungsgemäße Kollagen-Schwamm kann in einem dicht verschlossenen Behälter aus Aluminium oder dergleichen gelagert werden.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele näher beschrieben.

Beispiele 1 und 2

Eine Menge von 50 g Atherokollagen (Konzentration 0,3 Gew./Vol-%, pH-Wert 3,0), das aus Schweinesehnen stammte, wurde unter Kühlen mit Eis (unter Rühren bei 1800 bis 2000 UPM für eine Dauer von 60 Min.) in eine Aluminiumform mit einer rechteckigen Vertiefung von 10 cm Länge, 7,6 cm Breite und 1,5 cm Tiefe, gegeben und rasch auf -40º C gefroren. Die gefrorene, geformte Masse wurde 48 Stunden bei 30º C unter einem Vakuum von 0,1 mm Hg getrocknet und ergab einen Schwamm. Der Schwamm wurde dann zum Zwecke einer intramolekularen Vernetzungsreaktion unter Vakuum und unter Erhitzen auf 105º C 24 Stunden getrocknet. Der Schwamm wurde in eine Lösung von 0,2 Gew.-% Glutaraldehyd in 0,05 M Essigsäure getaucht und bei 4º C für eine Dauer von 24 Stunden einer intermolekularen Vernetzungsreaktion unterzogen. Es wurde kontinuierlich mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Lösung bis zur vollständigen Entfernung des Glutaraldehyds zu ersetzen. Der erhaltene Schwamm hatte eine leicht gelbe Farbe und Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 50 bis 120 um. Der vernetzte Schwamm wurde dann in eine 15% wässrige Lösung von Ethanol getaucht, um damit das destillierte Wasser zu ersetzen, und in einem Kühlschrank mit extrem niedriger Temperatur bei -80º C (Beispiel 1) oder -135º C (Beispiel 2) gefroren. Der vollständig gefrorene Schwamm wurde bei 30º C in einem Vakuum von etwa 0,1 mm Hg für eine Dauer von 24 Stunden in einer Vorrichtung zur Vakuum-Lyophilisierung getrocknet.
Auf diese Weise wurden die Kollagen-Schwämme (Beispiel 1 und 2) hergestellt. Die Schwämme erwiesen sich als riß- bzw. bruchfrei, hatten eine leicht gelbe Farbe und waren mit Poren von 50 bis 120 um im Durchmesser schwamm-ähnlich.

Vergleichsbeispiel 1

Ein vernetzter, mit destilliertem Wasser imprägnierter Schwamm wurde in der gleichen Weise in in Beispiel 1 lyophilisiert, jedoch ohne daß das destillierte Wasser durch eine wässrige Lösung von Ethanol ersetzt wurde.
Die erhaltene Probe des Kollagen-Schwammes wies viele Risse bzw. Brüche und ein überaus beeinträchtigtes Erscheinungsbild auf und war daher als künstliche Haut ungeeignet.

Vergleichsbeispiel 2

Eine Probe eines Kollagen-Schwammes wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt mit der Ausnahme, daß der vernetzte Schwamm bei -40º C lyophilisiert wurde.
Die Eigenschaften der Schwämme aus den Beispielen 1 und 2 und dem Vergleichsbeispiel 2 wurden mit den folgenden Methoden getestet.

Bestimmung des Schrumpfungsfaktors

Die Länge und Breite der nach den Beispielen 1 und 2 und dem Vergleichsbeispiel 2 erhaltenen Schwämme wurde an drei Punkten jeden Schwammes mittels Gleittastern vor und nach der Lyophilisierung gemessen. Die Mittelwerte der Messungen wurden zur Berechnung der Flächengröße multipliziert. Der Schrumpfungsfaktor wurde als eine prozentuale Abnahme der Fläche, errechnet aus der Differenz zwischen der Flächengröße vor und nach der Lyophilisierung, angegeben.
Von den Proben der hergestellten Schwämme nach jedem der Beispiele und Vergleichbeispiele wurde ein Durchschnitt von 3 Messungen bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Lyophilisierungstemperatur (ºC) Schrumpfungs-Faktor (%)
Die Brauchbarkeit der Schwamm-Proben als künstliche Haut wurde von einem Dermatologen bestimmt. Die Ergebnisse sind wie folgt. Die Schwamm-Probe (Vergleichsbeispiel 2), die durch Lyophilisierung bei -40º C hergestellt worden war und eine Schrumpfungsrate von 15,1% aufwies, fühlte sich hart an und war zum Gebrauch ungeeignet.
Die Schwamm-Proben, bei denen die Lyophilisierung bei -80º C und -135º C vorgenommen worden war, waren weich und zum Gebrauch geeignet. Zum Gebrauch am besten geeignet war die Schwamm-Probe, die durch eine Behandlung bei -135º C erhalten worden war.

Gebrauchsfähigkeitsprüfung

Die nach Beispiel 2 erhaltenen Kollagen-Schwämme (10 cm breit, 20 cm lang, 2 mm dick) wurden mit physiologischer Salzlösung durchnäßt. Die Schwamm-Proben wurden mittels einem "Autograph S-100 WZ" (Warenzeichen für das Produkt von Shimadzu Seisakusho K.K., Japan) mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/Min. gezogen bis der Schwamm brach, wobei die Festigkeit und die Dehnung am Brechpunkt sowie der Youngsche Modul anhand der Steigung der Kurve bestimmt wurden.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Schwamm-Proben, die durch Waschen mit destillierten Wasser nach der Vernetzungsreaktion mit Glutaraldehyd in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden als Schwämme des Vergleichsbeispiels 3 für Vergleichszwecke verwendet. In der Tabelle 2 werden auch die Ergebnisse von Vergleichsbeispiel 3 angegeben. Tabelle 2 Beispiel Festigkeit (X Dyn/cm²) Youngscher Modul (X Dyn/cm²) Dehnung (%)

Lagerfähigkeitstest

Die nach Beispiel 1 und 2 erhaltenen Kollagen-Schwämme wurden mit einem Ethylenoxidgas sterilisiert und in ein Aluminiumgefäß gegeben. Das dicht verschlossene Gefäß wurde in einem Wärmeschrank unter beschleunigenden Testbedingungen gelagert: bei einer Temperatur von 50º C und einer Luftfeuchtigkeit von 80%.
Zu Vergleichszwecken wurde eine Schwamm-Probe durch eine Vernetzungsreaktion und Waschen in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, in eine 70%ige wässrige Lösung von Ethanol getaucht und unter nassen Bedingungen in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur unter beschleunigenden Testbedingungen von 50º C gelagert.
Die Testergebnisse sind wie folgt.
Schwamm-Probe nach Beispiel 1 und 2: die Schwämme zeigten selbst nach 3 Monaten keine Farbveränderung.
Schwamm-Vergleichsprobe: der Schwamm wies eine deutliche Gelbverfärbung innerhalb von einer Woche auf.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines riß bzw. bruchfreien getrockneten Kollagen-Schwammes mit einem Schrumpfungsfaktor bis zu 14%, wobei der Schrumpfungsfaktor als prozentuale Flächenabnahme angegeben ist, errechnet aus der Differenz zwischen den Flächengrößen vor und nach der Lyophilisierung, und das Verfahren die Schritte des Imprägnierens des vernetzten Kollagen-Schwamms mit einer wässrigen Lösung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels, das Gefrieren des Schwamms bei einer Temperatur von -80º C oder weniger und das Trocknen des Schwamms unter Vakuum umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das hydrophile organische Lösungsmittel ein niederer aliphatischer Alkohol ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der niedere aliphatische Alkohol Ethanol ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der vernetzte Schwamm mit einer wässrigen Lösung des hydrophilen organischen Lösungsmittels imprägniert wird, so daß die Lösung wenigstens 90 Volumen-% des Schwamms ausmacht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Lyophilisierung bei einer Temperatur von -80 bis -135º C erfolgt.

6. Riß- bzw. bruchfreier, getrockneter Kollagen-Schwamm mit einem Schrumpfungsfaktor von bis zu 14%, wobei der Schrumpfungsfaktor als prozentuale Flächenabnahme angegeben ist, errechnet aus der Differenz zwischen den Flächengrößen vor und nach der Lyophilisierung, der mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhalten werden kann.

7. Verwendung des Kollagen-Schwamms nach Anspruch 6 als künstliche Haut.