DE69104357T2

DE69104357T2 - Klonierungs- und/oder expressionsvektoren, verfahren zur ihrer herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE69104357T2
Application number: DE69104357T
Authority: DE
Inventors: Beatrice F-75006 Paris Cameron; Joel F-75012 Paris Crouzet; Sophie F-75007 Paris Levy Schil
Original assignee: Rhone Poulenc Biochimie SA
Current assignee: Rhone Poulenc Biochimie SA
Priority date: 1990-04-24
Filing date: 1991-04-23
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2011-04-24
Also published as: ES2060385T3; CN1057567C; EP0528925A1; CA2077347C; DE69104357D1; EP0528925B1; HUT63196A; FR2661188B1; HU215259B; DK0528925T3; CA2077347A1; JP3058186B2; ATE112319T1; CN1056712A; JPH06501379A; WO1991016439A1; FR2661188A1; RU2127312C1

Description

Die Erfindung betrifft neue Clonierungs- und/oder Expressionsvektoren mit einem breiten Wirtsspektrum bei gramnegativen Bakterien. Sie betrifft ebenso die Verwendung dieser Vektoren insbesondere zur Produktion von rekombinanten Proteinen oder Metaboliten oder in Biotransformationsreaktionen, sowie die, diese Vektoren enthaltenden, Wirtszellen.
Jüngste Fortschritte der Molekularbiologie führten zur Entwicklung neuer Vektoren, die in den gentechnischen Verfahren verwendbar sind und ein breites Wirtsspektrum besitzen. Diese Vektoren stehen denjenigen mit einem engen Wirtsspektrum, wie ColE1, durch den auf taxonomischer Ebene ubiquitären Charakter der Wirte, in denen sie sich replizieren, entgegen. Dieser Charakter ist für bestimmte Plasmide, die sich in fast allen gramnegativen Bakterien replizieren, sehr ausgeprägt. Derartige Plasmide besitzen die Eigenschaft, bei Bakterien, wie Escherichia coli, verwendet werden zu können, um die notwendigen Konstruktionen zu ergeben, die anschließend direkt in den gewählten gramnegativen Wirt eingeschleust werden können. Eine andere charakteristische Eigenschaft dieser Vektoren liegt in der Eigenschaft, daß sie für den konjugativen Transfer von einem Donorbakterium in ein Rezeptorbakterium sich entweder mobilisieren können oder mobilisiert werden können. Diese konjugativen Transfers erfolgen im allgemeinen mit einer sehr erhöhten Häufigkeit (zwischen 1 und 10&supmin;²), die den bekannten Transformationssystemen bei weitem überlegen ist.
Die Plasmide mit einem breiten Wirtsspektrum bei gramnegativen Bakterien, die in der Literatur beschrieben sind, gehören den Inkompatibilitätsgruppen C, N, P, Q und W (incC, incN, incP, incQ und incW) an. Unter diesen sind die Plasmide der Inkompatibilitätsgruppen P und Q diejenigen, die besser untersucht sind, und diejenigen, für die eine erhöhte Anzahl von Derivaten konstruiert wurde (Schmidhauser et al., 1988). Es sind ebenso diejenigen, die fast ausschließlich verwendet werden. In dieser Hinsicht wird beschrieben, daß diese Plasmide sich bei allen gramnegativen Bakterien, die untersucht wurden, außer Myxococcus xanthus, Bradyrhizobium japonicum und den Bakterien der Gattung Bacteroides (Kües et Stahl, 1989) replizieren. Die Plasmide der Inkompatibilitätsgruppe W werden nur beschränkt verwendet, einerseits weil sie weniger Vorteile als die Plasmide der Inkompatibilitätsgruppen P und Q besitzen und andererseits, weil sie weniger gut bekannt sind.
Die Inkompatibilitätsgruppe P ist in zwei Untergruppen aufgeteilt: incPα und incPβ, wobei die am meisten untersuchten Plasmide sind: RK2, RP4 (die in der Tat zwei unabhängige Isolate des gleichen Plasmids sind) und R751. Diese Plasmide besitzen die Eigenschaft, daß sie autokonjugativ sind, d.h. daß sie die Konjugationsfunktionen (tra und mob) tragen. Außerdem sind dies große Plasmide (RK2 besitzt eine Größe von 60 kb) mit einer geringen Kopienzahl (RK2 besitzt eine Kopienzahl zwischen 4 und 7 bei E. coli).
Die Replikation dieser Plasmide wurde ausführlich von Kües und Stahl untersucht. So weiß man, daß der Replikationsorigin oriV aus (i) 8 Segmenten zu 17 bp, (ii) einem vermutlichen Promotor, der von Bindungsstellen des Proteins DnaA von E. coli umgeben ist, und einer vermutlichen Bindungsstelle des IHF-Proteins von E. coli, (iii) einer AT-reichen Sequenz zu 9 bp, gefolgt von einer Bindungsstelle des Proteins DnaA, anschließend (iv) einer GC-reichen Region, zusammengesetzt ist. Der mit dem Gen trfA. assoziierte Replikationsorigin, der in zwei Proteine A1 und A2 translatiert wird, die im gleichen Leseraster codiert werden, aber an verschiedenen Codonen beginnen, stellt ein Replicon dar, das die gleiche Häufigkeit, wie RK2, besitzt. Je nach den Wirten scheint entweder A2 für die Replikation notwendig zu sein, oder sind A1 und A2 alle beide unverzichtbar (Thomas, 1986). Die Replikation dieser Plasmide wird durch ein komplexes Regulationsnetz kontrolliert, in dem die Gene kil und kor beteiligt sind. Die kor-Gene (für kil-override) antagonisieren die letalen Wirkungen der kil-Gene (kilA, kilB, kilC und kilD) und regulieren negativ die Expression von trfA. Fünf kor-Gene wurden identifiziert (korA, korB, korC, korE und korF). Es wurde erkannt, daß das Regulationsnetz dieser Gene untereinander und mit trfA die Anpassung des Replikons RK2 an den Wirt, in dem es sich repliziert (Kües und Stahl, 1989), erlaubt. Schmidhauser und Helinski (1985) zeigten auch, daß die Deletion von bestimmten dieser Gene bei bestimmten Wirten zu einer viel schwächeren Segregationsstabilität führt.
Es scheint nun, daß alle diese Gene notwendig sind, um die bestmögliche Stabilität der Derivate von RK2 und RP4 zu beobachten.
Mehrere Derivate von RK2 wurden als Vektoren für eine Vielzahl von Wirten konstruiert. Dies sind Plasmide, die das Tetracyclinresistenzgen des Ausgangsvektors konserviert haben, da dieses nahe bei dem Replikationsorigin (oriV) liegt. Es handelt sich beispielsweise um die Plasmide pRK290, pRK404, pRK415 (Ditta et al., 1980 und 1985, Keen et al., 1988, Schmidhauser at al., 1988). Unter diesen ist insbesondere das Plasmid pRK290 (Ditta et al., 1980) zu nennen, das die Eigenschaften einer großen Stabilität bei einer guten Anzahl von gramnegativen Bakterien zeigt (Schmidhauser et Helinski, 1985). Dieses Plasmid zeigt sich stabil bei Escherichia coli, Azotobacter, Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas sphaeroides. Jedoch ist das gleiche Plasmid bei anderen gramnegativen Bakterien nicht ebenfalls stabil. Es handelt sich um Agrobacterium tumefaciens, Acetinobacter, Caulobacter und Pseudomonas aeruginosa (Schmidhauser et Helinski, 1985). Das Plasmid pRK290 besitzt eine Größe von 20 kb, was für einen Clonierungsvektor groß ist. Es wurde durch eine Reihe von aufeinanderfolgenden Deletionen aus RK2 erhalten. Außer den Transferfunktionen (tra-Gene), dem Kanamycinresistenzgen und dem Transposon Tn1 beseitigten diese Deletionen die kilA- und kilC-, korC- und korE-Funktionen (Schmidhauser et Helinski, 1985). Es scheint nun, daß es möglich ist, eine bestimmte Stabilität bei einem RK2-Derivat trotz des Verlusts bestimmter kil- und kor- Funktionen zu beobachten. Jedenfalls wurde beobachtet, daß der einfache Verlust der kilB-Funktion sich in eine deutliche Verringerung der Stabilität des Plasmids bei mehreren gramnegativen Bakterien übersetzt, und daß alle getesteten RK2-Derivate, die eine kleinere Größe als das pRK290 hatten, deutlich weniger stabil waren (Schmidhauser et Helinski, 1985).
Abgesehen von den Untersuchungen, die die jeweilige Bedeutung der verschiedenen Determinanten von RK2, die an dem System der Regulation der Expression von trfA beteiligt sind, beleuchtet haben, wurde ein Fragment gefunden, das für die Segregationsstabilität dieser Plasmide verantwortlich sein könnte (Sauruger et al., 1986). Dieses Fragment, das zwischen der tra2-Region und dem Kanamycinresistenzgen angeordnet ist, codiert ein Verteilungssystem (par). Es wurde gezeigt, daß dieses Fragment bei Escherichia coli die Plasmide pBR322 und pACYC177 stabilisieren kann (Sauruger et al., 1986).
Was die natürlichen Plasmide der Inkompatibilitätsgruppe Q betrifft, so kann man beispielsweise RSF1010, R1162 und R300B nennen. Diese Plasmide besitzen eine Kopienzahl zwischen 10 und 60, je nach den Mikroorganismen. Die Größe dieser Plasmide liegt gut unter der der Plasmide der Inkompatibilitätsgruppe P; in der Tat liegt sie unter 10 kb.
Es gibt eine Region, die in cis für die Replikation dieser Plasmide notwendig ist, die zwei Unterregionen umfaßt: (i) eine Region, gebildet aus 3,5 wiederholten Sequenzen zu 40 bp, reich an AT, 60 bp, reich an GC, und eine vermutliche Bindungskassette des Proteins DnaA in E. coli; (ii) andererseits eine Region mit einer invers repetierten Sequenz, die eine Sekundärstruktur mit einem Stamm aus 40 bis 60 bp bilden kann. Die Initiierung der Replikation von RSF1010 benötigt das Vorhandensein von drei Proteinen, die durch das Plasmid RepA, RepB und RepC codiert werden, die durch die Gene repA, repB und repC codiert werden. RepC erkennt den Replikationsorigin (auf der Ebene der repetierten Sequenzen) und reguliert positiv die Initiierung der Replikation; RepA besitzt eine Helicaseaktivität; RepB und RepB* (die zwei Proteinen, die im gleichen Leseraster, aber beginnend an einem anderen Codon, codiert werden, entsprechen) besitzen die Aktivität einer RSF1010-spezifischen Primase in vitro. Die Replikation von RSF1010 hängt von der DNA-Polymerase III und der Gyrase des Wirts ab. RSF1010 kann aus einem gramnegativen Bakterium in ein anderes gramnegatives Bakterium durch die tra-Funktionen der Plasmide der Inkompatibilitätsgruppen IncIα, IncM, IncX und insbesondere IncP (Derbyshire et Willets, 1987) mobilisiert werden.
Keine Untersuchung betreffend die Stabilität von RSF1010 und seiner Derivate wurde bis zum heutigen Tag beschrieben. Außerdem konnte, obwohl die Sequenz von RSF1010 bekannt ist (Scholz et Scherzinger, 1989), keine Determinante für die Stabilität des Plasmids identifiziert werden, weder durch eine funktionelle Analyse noch durch eine Molekularanalyse. Es besteht jeder Grund zu der Annahme, daß die Plasmide der Inkompatibilitätsgruppe Q nicht so stabil sind wie diejenigen der Inkompatibilitätsgruppe P.
Trotz dieser Arbeiten besitzen die bekannten Plasmide mit einem großen Wirtsspektrum eine bestimmte Anzahl von Nachteilen in Bezug auf ihre Leistungsfähigkeiten und ihre Verwendung in der Industrie.
Insbesondere müssen für eine industrielle Verwendung unabhängig von dem bakteriellen Wirt, Plasmidvektoren eine bestimmte Anzahl von Eigenschaften besitzen, die den Beschränkungen bezüglich der Verwertung und der biologischen Sicherheit entsprechen.
Die Beschränkungen der Verwertung sind wesentlich mit der Segregationsstabilität des Plasmids verbunden. In der Tat ist es sehr wünschenswert, in industriellem Maßstab die Verwendung von Antibiotika zur Gegenselektion des Verlusts des Plasmids zu vermeiden. In dieser Hinsicht muß ein Vektoren zur industriellen Verwendung eine große Segregationsstabilität besitzen. Diese muß über mindestens 25 aufeinanderfolgende Generationen groß sein, was die Anzahl der Generationen darstellt, die notwendig ist, um vom Zustand der Konservierung des rekombinierten Stammes bis zum Ende eines industriellen Fermenters mit 200 m³ zu gehen (Stanburry et Whitaker, 1984). Weiterhin müssen diese Stabilitätseigenschaften für die Derivate derartiger Plasmide, die eine Nucleotidinsertion tragen, die die DNA-Sequenzen enthält, die man amplifizieren, exprimieren, etc. möchte, ähnlich sein.
Die Beschränkungen bezüglich der biologischen Sicherheit belegen rekombinierte Stämme außerdem mit einer großen biologischen Beschränkung. Das System der biologischen Sicherheit der Ebene 1 (BL1), beschrieben in "Guidelines for research involving recombinant DNA molecules" vom NIH vom 7. Mai 1987 entspricht schwächeren Beschränkungen. Dieses System, ebenso wie bei Escherichia coli und bei Pseudomonas putida, hat die Verwendung von nicht-konjugativen und nicht-mobilisierbaren Plasmiden zur Voraussetzung. In der Tat, wenn durch einen Unfall der rekombinierte Mikroorganismus zufällig in die Umwelt freigesetzt wird, ist es zwingend notwendig, daß derartige Plasmide sich nicht in andere Organismen übertragen können (Trevors et al., 1987).
Unter den in der Literatur beschriebenen Plasmiden mit einem großen Wirtsspektrum erfüllt keiner vollständig diese Bedingungen. Zuerst wurde eine sehr große Segregationsstabilität niemals ubiquitär erreicht. In der Tat, wenn bestimmte dieser Plasmide bei bestimmten Wirten sehr stabil sind, ist es trotzdem nicht das gleiche in allen gramnegativen Bakterien. Außerdem wurde die Stabilität dieser Plasmide meistens nach Insertion eines DNA-Fragments, das beispielsweise die Sequenzen, die man amplifizieren oder exprimieren möchte, enthält, nicht studiert. Dies ist insbesondere bei dem Plasmid pRK290 der Fall, dessen Stabilitätseigenschaften nach Insertion eines DNA-Fragments niemals studiert wurden. Außerdem beruht eine andere Eigenschaft der Plasmide mit einem breiten Wirtsspektrum, die im Stand der Technik beschrieben sind, auf der Tatsache, daß sie sich für den konjugativen Transfer von einem Donorbakterium zu einem Rezeptorbakterium mobilisieren können oder mobilisiert werden können. Das ist auch der Fall bei dem Plasmid pRK290, das den mob-Locus besitzt. Diese Plasmide sind somit mit den Beschränkungen der biologischen Sicherheit nicht kompatibel, da im Falle der zufälligen Freisetzung des rekombinierten Organismus man nicht ausschließen kann, daß das Plasmid mit den DNA-Sequenzen, die es trägt, mit einer relativ erhöhten Frequenz bei anderen Mikroorganismen mobilisiert wird.
Außerdem ist der Mangel an Stabilität bei bestimmten dieser Plasmide ebenso synonym mit einer schwachen Effizienz bei der Produktion von Proteinen oder Metaboliten und somit von beschränktem Interesse für die industriellen Fermentationsverfahren.
Einer der Gegenstände der Erfindung betrifft genau einen Clonierungs- und/oder Expressionsvektor mit einem breiten Wirtsspektrum, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er sich in fast allen gramnegativen Bakterien replizieren kann, eine große Segregationsstabilität besitzt und nicht mobilisierbar ist. Die Erfindung betrifft auch alle Derivate dieses Vektors. Erfindungsgemäß umfassen die Derivate dieses Vektors Vektoren, die trotz einiger Veränderungen oder Modifikation (Deletionen, Mutationen, Insertionen,...) in den Regionen mit relativer Bedeutung die vorstehend angegebenen Eigenschaften beibehalten.
Die erfindungsgemäßen Vektoren stammen von Plasmiden mit einem breiten Wirtsspektrum bei gramnegativen Bakterien der Inkompatibilitätsgruppe P. Insbesondere besitzen sie einen Replikationsorigin, abgeleitet von einem Plasmid, das der Inkompatibilitätsgruppe P angehört. Vorteilhafterweise leiten sie sich vom Plasmid RK2 ab. Sie vereinen Eigenschaften, die für einen Vektor niemals beschrieben wurden, nämlich: ein breites Wirtsspektrum bei gramnegativen Bakterien, eine große Stabilität und das Fehlen von Mobilisierungsfunktionen.
Die große Stabilität der erfindungsgemäßen Vektoren stammt aus dem Einbau eines speziellen Nucleotidfragments, das stabilisierende Eigenschaften besitzt. Insbesondere kann man ein spezielles Fragment, das aus dem natürlichen Plasmid RP4 stammt, verwenden. Das clonierte Fragment, das als par-Fragment bezeichnet wurde, wurde von Saurugger et al., 1986, beschrieben, sowie dessen Fähigkeit, bestimmte Plasmide bei E. coli zu stabilisieren. Es wurde nun gefunden, daß die Insertion des par-Fragments von einem sehr bedeutenden Stabilitätsgewinn unabhängig von dem gewählten Wirtsorganismus und dessen Natur (Gen, Promotor...) oder der Größe der Nucleotidinsertion begleitet ist. In der Tat, die Segregationsstabilität der erfindungsgemäßen Vektoren sowie ihrer Derivate ist viel höher, als die der RK2-Derivate, die als Clonierungsvektoren dienen können, und dies in allen getesteten gramnegativen Bakterien.
Der Verlust der Mobilisierungsfunktionen ist eine zweite Eigenschaft der erfindungsgemäßen Vektoren. Sie hat zur Folge, daß im Gegensatz zu plasmiden, wie pRK290, die erfindungsgemäßen Vektoren aus einem gramnegativen Bakterium in ein anderes nicht mobilisierbar sind. Sie bilden somit mit diesen Wirts-Vektor-Paare der Klasse 1 und entsprechen der industriellen Reglementierung. Diese sehr vorteilhafte Eigenschaft der erfindungsgemäßen Vektoren kann insbesondere durch Deletion einer Region, die den mob-Locus trägt, erhalten werden.
Die dritte Eigenschaft der erfindungsgemäßen Vektoren liegt in ihrer Fähigkeit, sich in der überwiegenden Anzahl der gramnegativen Bakterien zu replizieren. Diese Eigenschaft ist besonders vorteilhaft, da sie insbesondere das Arbeiten mit E. coli zur Durchführung der gewünschten Konstruktionen vor der Einschleusung des Vektors in dem gewählten gramnegativen Wirt erlaubt. Sie erlaubt ebenso die Wahl des am meisten geeigneten Wirts als Funktion der gewünschten Verwendung der Vektoren (Amplifikation, Expression...) oder der Natur und der Größe der Nucleotidinsertionen.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Vektoren eine Mehrfachclonierungsstelle mit einer bestimmten Anzahl einziger Clonierungsstellen, was die Integration der Nucleotidinsertionen, die man zu amplifizieren oder zu exprimieren wünscht, beträchtlich erleichtert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform tragen die erfindungsgemäßen Vektoren einen Selektionsmarker, wie insbesondere ein Antibiotikaresistenzgenu Bevorzugt enthalten sie das Tetracyclinresistenzgen von RK2. Dieses Resistenzgen erlaubt die Selektion des Vorhandensein des Plasmids bei fast allen gramnegativen Bakterien. Andere Resistenzgene könnten in die erfindungsgemäß beschriebenen Vektoren sowie ihre Derivate insertiert werden.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen Clonierungs- und/oder Expressionsvektor mit einem breiten Wirtsspektrum bei gramnegativen Bakterien, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er von dem Plasmid RK2 stammt, eine Größe kleiner als 20 Kb besitzt, ein DNA-Fragment enthält, das die par-Region des Plasmids RP4 trägt, und den mob-Locus nicht enthält und gegebenenfalls eine Mehrfachclonierungsstelle und einen Selektionsmarker enthält.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können zur Amplifikation oder Expression von gegebenen DNA-Sequenzen verwendet werden. Die Erfindung betrifft somit die vorstehend definierten Vektoren, die ein rekombinantes DNA-Fragment enthalten.
Insbesondere enthält die rekombinante DNA in Abhängigkeit von Sequenzen zur Regulation der genetischen Expression ein oder mehrere Strukturgene, die ein oder mehrere gegebene Polypeptide codieren. Immer noch erfindungsgemäß können die Strukturgene unter der Abhängigkeit der eigenen Regulationssignale oder anderer Regulationssignale stehen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Sequenzen zur Regulation der genetischen Expression aus einem oder mehreren Elementen ausgewählt aus Promotoren, Terminatoren, Signalpeptiden und Ribosomenbindungsstellen.
Die Strukturgene, die ein Polypeptid codieren, können insbesondere aus den Genen, die Enzyme, Hormone oder Wachstumsfaktoren codieren, ausgewählt sein. Bevorzugt sind sie aus den Strukturgenen von Albumin, tPA, TIMP, Interleukinen, Apolipoproteinen und Interferonen ausgewählt.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist/sind das oder die Strukturgen(e) Gene, die auf genetischer oder biochemischer Ebene an der Biosynthese eines Metaboliten beteiligt sind, d.h. Gene, die Polypeptide codieren, die an dem Biosyntheseweg eines Metaboliten beteiligt sind. Insbesondere kann der Metabolit ein Vitamin, eine Aminosäure, ein Antibiotikum oder jeder andere bakterielle Metabolit sein. Bevorzugt ist der Metabolit aus Vitamin B12, Biotin, Riboflavin, Lysin, Threonin, Methionin, Penicillin oder Tetracyclin ausgewählt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Vektoren ein Strukturgen, das ein gegebenes Protein codiert, dem Signale vorausgehen, die dessen Expression und gegebenenfalls die Sekretion des Proteins erlauben.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines Metaboliten, das dadurch gekennzeichnet ist, däß man
- in ein gramnegatives Bakterium einen Vektor, wie vorstehend definiert, der das Strukturgen, das das Protein codiert, oder ein oder mehrere Gene, die auf genetischer oder biochemischer Ebene an der Biosynthese des Metaboliten beteiligt sind, enthält, einschleust,
- dieses Bakterium unter Expressionsbedingungen des oder der Gens/Gene züchtet, und
- das gebildete Protein oder den gebildeten Metaboliten isoliert.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Vektoren können in industriellem Maßstab bei fast allen gramnegativen Bakterien verwendet werden. Im Falle des Plasmids pXL1635 kann er bei allen gramnegativen Bakterien verwendet werden, in denen sich das Plasmid RK2 repliziert, d.h. alle gramnegativen Bakterien außer Myxococcus xanthus, Bradyrhizobium japonicum und die Bakterien der Gattung Bacteroides (Kües et Stahl, 1989). Man kann sie wie folgt verwenden: ein oder mehrere DNA-Fragmente, die das oder die Gen(e) tragen, das bzw. die beispielsweise amplifiziert werden muß/müssen, werden in eine Mehrfachclonierungsstelle cloniert. Das so konstruierte Plasmid wird dann in das Bakterium, das man in industriellem Maßstab verwenden möchte, eingeschleust. Ein Transformationssystem, wie die Elektroporation (Wirth et al., 1989) kann verwendet werden, um das konstruierte Plasmid einzuschleusen. Die rekombinanten Clone werden durch die durch das Plasmid eingebrachte Resistenz selektioniert. Diese Clone können anschließend nach klassischen Konservierungstechniken für rekombinante Stämme zur industriellen Verwendung konserviert werden (Standburry und Whitaker, 1984).
Die Erfindung betrifft auch gramnegative Bakterien, die die erfindungsgemäßen Vektoren tragen, sowie ihre Verwendungen. Insbesondere können derartige Bakterien zur Erzeugung eines Proteins oder eines Metaboliten oder direkt in einer Biokonversionsreaktion verwendet werden.
Andere Gegenstände und Vorteile der Erfindung gehen aus den nachstehenden Beispielen hervor, die der Erläuterung und nicht der Beschränkung dienen sollen.

Allgemeine Clonierungstechniken der Molekularbiologie und der Biochemie

Die klassischen Methoden der Molekularbiologie, wie die Zentrifugation der Plasmid-DNA in einem Caesiumchlorid/Ethidiumbromid-Gradienten, die Spaltungen durch Restriktionsenzyme, die Gelelektrophorese, die Elektroelution der DNA-Fragmente von Agarosegelen, die Transformation in E. coli, die Präzipitation der Nucleinsäuren etc. sind in der Literatur beschrieben (Maniatis et al., 1982, Ausubel et al., 1987). Die Nucleotidsequenzen wurden nach dem Kettenabbruchverfahren nach dem bereits beschriebenen Protokoll bestimmt (Ausubel et al., 1987).
Die Restriktionsenzyme wurden von New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) oder Amersham Ltd. (Amersham) zur Verfügung gestellt.
Für die Ligierungen wurden die DNA-Fragmente gemäß ihrer Größe auf 7%igen Agarosegelen oder 8%igen Acrylamidgelen getrennt, durch Elektroelution gereinigt, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt, anschließend in einem Puffer aus 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 2 mM ATP in Gegenwart der DNA-Ligase des T4-Phagen (Biolabs) inkubiert.
Gegebenenfalls wurden die DNA-Fragmente mit 5'-überstehenden Enden durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIP, Pharmacia) bei 37ºC während 30 min in dem folgenden Puffer dephosphoryliert: 100 mM Glycin, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM ZnCl&sub2;, pH 10,5.
Die gleiche Technik wurde zur Dephosphorylierung der 3'- überstehenden oder offenen Enden verwendet, aber die Behandlung dauerte 15 Minuten bei 37ºC und dann 15 Minuten bei 56ºC. Das Enzym wurde durch 15-minütiges Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 68ºC in Gegenwart von 1% SDS und 100 mM NaCl mit einer anschließenden Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanolfällung inaktiviert.
Die Auffüllung der 5'-überstehenden Enden wurde durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) durchgeführt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur in einem Puffer aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,4 mM dNTPs, 10 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM DTT, 50 µg/ml BSA durchgeführt. Das Auffüllen und/oder das Spalten der 3'- überstehenden Enden wurde in Gegenwart der DNA-Polymerase des T4-Phagen (Biolabs) nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
Die Oligonucleotide wurden unter Verwendung der Chemie der durch eine Cyanoethylgruppe β-geschützten Phosphoramidite (Sinha et al., 1984, Giles 1985) mit einem automatischen DNA-Synthesegerät Biosearch 8600, gemäß den Empfehlungen des Herstellers, synthetisiert.
Die in vitro-Mutagenese durch Oligodesoxynucleotide wurde nach dem von Tayor et al., 1985 entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham France, SA, vertriebenen Kits durchgeführt.
Die mit Hilfe der Exonuclease III und der Nuclease S1 nach der Technik von Henikoff, 1984, durchgeführten Deletionen wurden unter Verwendung des Kits Erase-a-Base -System von Promega (Madison, WI, USA) und nach dem vom Hersteller beigefügten Protokoll durchgeführt.
Die DNA-Ligierungen wurden zur Transformation eines kompetent gemachten Stammes durchgeführt: E. coli MC1060 [Δ(lacIOPZYA)ΦX74, galU, galK, strAr, hsdR] (Casadaben et al., 1983) und HB101 [hsdS20, supE44, recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, λ-] (Maniatis et al., 1982) für die Plasmide oder E. coli TG1 [Δ(lac proA.B), supE, thi, hsdD5/F' traD36, proA&spplus;, B&spplus;, lacIq, lacZΔM15] (Gibson, 1984) für die replikativen Formen der Phagen, die von dem Bakteriophagen M13 abgeleitet sind. Der verwendete polA-Stamm ist SF800 (Stachel et al., 1985), wobei dieser Stamm gegenüber Nalidixinsäure (Nalr) resistent ist. Ein spontan Rifampicin-resistenter Clon des Stammes C600 (C600 Rifr) (50 µg/ml) [thi-1, thr1, leu-B6, lacY1, tonA21, supE44, λ-] (Maniatis et al., 1982) wurde als Rezeptorstamm während der Konjugationen von E. coli nach E. coli verwendet.
Die Plasmid-DNA wurden nach der Technik von Birnboim et Doly, 1979, gereinigt. Die Minipräparationen der Plasmid- DNA wurden nach dem Protokoll von Klein et al., 1980, durchgeführt.
Das LB-Kulturmedium wurde für den bakteriologischen Teil verwendet (Maniatis et al., 1982). Die Stämme von Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr, Agrobacterium tumefaciens C58C9 (Cameron et al., 1989), Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian et al., 1981), Rhizobium meliloti 102F34 (Leong et al., 1982) wurden ebenfalls im LB-Medium gezüchtet, aber die Inkubationstemperatur betrug 30ºC.
Die Konjugationen wurden wie beschrieben (Ditta et al., 1980) durchgeführt. 10&sup9; Zellen jedes an der Konjugation beteiligten Bakteriums wurden filtriert und auf einem Millipore-Filter mit 0,45 µm adsorbiert. Die Filter wurden anschließend in Schalen mit LB-Medium bei 37ºC inkubiert, und dann wurden die Zellen in 1 ml 10 mM MgSO&sub4; resuspendiert. Die Verdünnungen der Bakteriensuspension wurden anschließend in Schalen mit LB-Medium, die mit geeigneten Antibiotika supplementiert waren, ausgebracht.

Beispiel 1: Konstruktion des Plasmids pXL1635

Dieses Beispiel erläutert, wie ein Mehrfachwirtsvektor bei nicht-mobilisierbaren gramnegativen Bakterien und mit einer großen Segregationsstabilität konstruiert werden kann.

Beispiel 1,1: Erhalt eines Derivats von pRK290 mit Verlust des mob-Locus.

Dieses Beispiel erläutert, wie der mob-Locus von RK2 von einem RK2-Derivat deletiert werden kann.
Die Deletion dieses Locus wird erschwert im Sinne, daß keine einzigartige Restriktionsspaltstelle in der Nähe des mob-Locus bekannt ist. Wenn dies der Fall wäre, wäre es möglich gewesen, eine in vitro-Deletion unter Verwendung beispielsweise der Exonuclease Bal 31 durchzuführen, wie dies beschrieben ist (Maniatis et al., 1982). Um diese Deletion durchzuführen, haben die Erfinder eine einzigartige Restriktionsspaltstelle in den mob-Locus von RK2 eingeführt. Dies wurde durch gerichtetet Mutagenese gemäß der Technik von Taylor et al., 1985, durchgeführt. Die Techniken der gerichteten Mutagenese lassen sich nur an kleinen Fragmenten durchführen. Die Erfinder sind nun in drei Stufen vorgegangen: erstens, Subclonierung eines RK2-Fragments, welches den Transferorigin (oriT) enthält, in einen Phagen, der von dem M13-Phagen abgeleitet ist, anschließend gerichtete Mutagenese, um eine einzigartige Restriktionsspaltstelle einzuführen; zweitens wurde das so mutierte Fragment anschließend in das Plasmid pUC13 (Viera et Messing, 1982) cloniert, und dann wurde eine Kassette, die das Kanamycinresistenzgen trug, in die Restriktionsspaltstelle, die in dem Transferorigin vorhanden ist, cloniert, die dann als Marker der eingeführten Mutation dienen wird; drittens wurde das mutierte Fragment durch doppelte Rekombination mit dem Wildfragment, das von pRK290 getragen wird, ausgetauscht. Das so erhaltene Plasmid ist ein Derivat von pRK290 und besitzt eine einzigartige Restriktionsspaltstelle auf der Ebene des Transferorigins. Es ist somit möglich, eine Mutagenese durch Deletion durchzuführen, indem man Exonucleasen und dann eine DNA- Ligase einwirken läßt. Die Einzelheiten dieser Konstruktionen sind nachstehend angegeben.
Das 760 bp lange HaeII-Fragment von RK2, das in cis ausreicht, um die Mobilisierung zu bewirken (Guiney et Yakobson, 1982), wurde in M13 mp10 (Viera et Messing, 1982) cloniert. Dieses Fragment enthält den Transferorigin von RK2 (Guiney et Yakobson, 1983) und, wenn es in ein Plasmid cloniert wird, macht es dieses in trans durch die tra-Funktionen von RK2 mobilisierbar. Dieses Fragment wurde, ausgehend von einer HaeII-Spaltung von RK2 gereinigt, und die Enden wurden mit der DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4 gespalten. Weiterhin wurde die replikative Form des Phagen M13 mp10 durch Spaltung mit PstI und SstI linearisiert; die Enden wurden mit der DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4 gespalten. Die so erhaltene replikative Form und das gereinigte Fragment wurden zusammen ligiert und anschließend in kompetent gemachten Zellen von Escherichia coli TG1 transformiert. Die rekombinanten Phagen wurden wie beschrieben detektiert (Viera et Messing, 1982). Eine so erhaltene replikative Form wurde als pXL1418 bezeichnet (siehe Figur 1).
Die Sequenz des 112 bp langen HpaII-Fragments, welches den Transferorigin von RK2 enthält, wurde publiziert (Guiney et Yakobson, 1983). Dieses Fragment ist in dem 760 bp langen HaeII-Fragment, das in pXL1418 vorhanden ist, enthalten. Es wurde beobachtet, daß es eine invers repetierte Sequenz gibt, die eine Haarnadelstruktur bilden kann, wobei jede repetierte Sequenz 19 bp besitzt (siehe Figur 2). Eine gerichtete Mutagenese nach dem von Taylor et al. (1985) entwickelten verfahren wurde mit einzelsträngiger Phagen-DNA, erhalten aus dieser replikativen Form, durchgeführt. Das verwendete Oligonucleotid besaß die folgende Sequenz: 5'-CCC GTT GAG CTC CGC CAG GTG C-3'. In Figur 2 sind die Sequenzen des 112 bp langen HpaII-Fragments, sowie die des Oligonucleotids, angegeben. Wie in dieser Figur angegeben ist, unterscheidet sich die Sequenz des Oligonucleotids von der des Fragments nur durch ein einziges Nucleotid; diese Mutation führte eine SstI-Spaltstelle ein. Es wurde zuerst bestätigt, daß das Oligonucleotid der einzelsträngigen DNA, erhalten durch Infektion von E. coli TG1 mit der replikativen Form von pXL1418, gut komplementär war. Dazu wurde das in Frage kommende Oligonucleotid als Starter für die Nucleotidsequenz verwendet. Es wurde beobachtet, daß eine Sequenzreaktion stattfand. Die Nucleotidsequenz wurde abgelesen, und die ersten Basen entsprechen gut der Sequenz des rechten Endes des oberen Stranges, wie in Figur 2 angegeben.
Die gerichtete Mutagenese wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Mutierte Clone wurden erhalten, die eine SstI-Spaltstelle, die an der gewünschten Position eingeführt ist, enthielten. Eine dieser replikativen Formen wurde als pXL1454 bezeichnet (siehe Figur 1).
Das pXL1454 wurde durch EcoRI und HindIII gespalten. Das 760 bp lange Fragment wurde gereinigt, dann mit pUC13, welches durch EcoRI und HindIII gespalten war, ligiert. Nach Transformation wurden rekombinante Clone erhalten. Ein Plasmidclon wurde zurückbehalten und als pxL1461 bezeichnet (siehe Figur 1).
Bei der folgenden Stufe wurde eine Kassette, die Antibiotikaresistenz verlieh, an der SstI-Spaltstelle eingeschleust, damit darin ein selektiver Marker vorhanden ist. Dazu wurde pXL1461 durch SstI linearisiert, und dann mit dem gereinigten SstI-Fragment von pUC4KIXX (Pharmacia France, SA) ligiert. Dieses 1,6 kb lange Fragment trägt das Kanamycinresistenzgen des Transposons Tn5. Die rekombinanten Clone wurden nach Transformation in einem LB-Medium, das mit Ampicillin und Kanamycin supplementiert war, selektioniert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pXL1462 bezeichnet (siehe Figur 1).
Das Plasmid pRK290 wurde in einen Escherichia coli polA, SF800-Stamm (Stachel et al., 1985) transformiert. In einem derartigen Stamm replizieren sich die von RK2 abgeleiteten Plasmide, da ihre Replikation unabhängig von der DNA-Polymerase I von E. coli ist, während sich pUC13 nicht repliziert. Das pXL1462 wurde anschließend in den Stamm SF800 pRK290 transformiert. Nach der Transformation wurden die Bakterien auf ein LB-Medium, das mit Tetracyclin, Kanamycin und Ampicillin supplementiert war, ausgebracht. Durch die Tatsache, daß sich das Plasmid pXL1462 in diesem Stamm nicht replizieren kann, kann der Erwerb der durch dieses Plasmid getragenen Resistenzen nur durch homologe Kombination zwischen den beiden Plasmiden erfolgen. In der Tat besitzen diese beiden Plasmide das 760 kb lange HaeII- Fragment, das den Transferorigin trägt, gemeinsam. Es kann nun eine homologe Rekombination zwischen den homologen Regionen der zwei Plasmide stattfinden, was das Ergebnis einer Fusion zwischen den zwei Replicons ist. Die Plasmid- DNA eines gegenüber den drei Antibiotika resistenten Clons wurde durch Restriktion analysiert. Es erwies sich durch eine Analyse auf einem Agarosegel, daß sie nur ein einziges Plasmid enthielt. Die Analyse dieses Plasmids durch Restriktionsspaltungen zeigte, daß pXL1462 mit dem Plasmid pRK290 auf der Ebene des Transferorigins rekombiniert hatte. Das aus der Fusion der zwei Replicons hervorgehende Plasmid trägt zwei Transferorigins von RK2: einen Wildtyp und einen, der eine durch Mutagenese eingeschleuste SstI- Spaltstelle besitzt, in welche sich eine hineinclonierte Kassette vorfand, die ein Kanamycinresistenzgen trug (siehe Figur 3). Ein Clon, der ein derartiges Plasmid enthielt, wurde anschließend durch Verdünnungskulturen in mit Tetracyclin und Kanamycin supplementiertem LB-Medium gezüchtet. Das Fehlen von Ampicillin erlaubte, daß die einfachen Rekombinationsereignisse mit Exzision von pUC13, welches eine Wildkopie des 760 bp-Fragments des Transferorigins trägt, nicht gegenselektioniert wurden. Wenn pUC13 und die davon abgeleiteten Plasmide sich nicht replizieren, geht das herausgeschnittene Plasmid sofort verloren. Nach einer Reihe von Verdünnungskulturen in einem flüssigen selektiven Medium für pRK290 und für den Marker des mutierten Replikationsorigins, entsprechend 60 Generationen, wurden die Bakterien auf einem mit den gleichen Antibiotika supplementierten LB-Medium ausgebracht. 2000 Kolonien wurden auf dem gleichen Medium und auf Schalen mit mit Ampicillin supplementiertem LB-Medium, erneut ausgebracht. 2 Ampicillin-sensible Clone wurden erhalten. Die von diesen Clonen getragenen Plasmide wurden gereinigt und durch Restriktion analysiert. Diese Analysen zeigen, daß diese Plasmide genau der Exzision von pUC13 mit der Wildkopie des Transferorigins von RK2 entsprechen. Dieses Plasmid wurde als pXL1561 bezeichnet (siehe Figur 3). Da dieses Plasmid 2 HindIII-Spaltstellen auf der Ebene des Transferorigins besitzt, ist es möglich, eine Delektion durch Spaltung durch eine Exonuclease nach Spaltung des Plasmids durch HindIII durchzuführen (siehe Figur 3). Das Plasmid pXL1561 wurde so durch HindIII gespalten, und dann wurde eine Reihe von Deletionen durch die Technik nach Henikoff (1984) durchgeführt; bei dieser Technik wird die aufeinanderfolgende Wirkung der Exonuclease III und der S1-Nuclease verwendet; die erhaltenen Deletionen sind bidirektionell. Diese Deletionen werden anschließend ligiert, und die Ligatur wird in MC1060 transformiert. Die Plasmid-DNA der so erhaltenen Transformanten wurde durch Restriktionsspaltung analysiert. Mehrere Clone zeigen, daß sie eine Deletion auf der Ebene des mob-Locus erlitten hatten. Es wurde ein Plasmid zurückgehalten, das eine 3,5 kb-Deletion erlitten hatte. Diese Deletion muß, wenn die Exonuclease III die DNA des Plasmids mit den gleichen Kinetiken beiderseits der HindIII-Spaltstellen gespalten hat, einer Deletion von 1,75 kb beiderseits des Transferorigins des Plasmids entsprechen. Das so erhaltene Plasmid wurde als pXL1570 (siehe Figur 3) bezeichnet.
pXL1570 besitzt EcoRI und BglII als einzigartige Restriktionsspaltstellen. Die Erfinder versuchten eine Mehrfachclonierungsstelle an EcoRI einzuschleusen, damit das so erhaltene Plasmid mehrere Clonierungsstellen enthält.
Das pFR10-Plasmid (Shapira et al., 1983), das eine Mehrfachclonierungsstelle trägt, die von zwei EcoRI-Spaltstellen begrenzt wird, wurde als Quelle für eine Mehrfachclonierungsstelle verwendet. pFR10 wurde durch EcoRI genauso wie pXL1570 gespalten. Die beiden Spaltungen wurden ligiert, und die Ligatur wurde in E. coli MC1060 transformiert. Rekombinante Clone wurden erhalten, von denen einer als pXL1594 bezeichnet wurde (siehe Figur 4), und dessen Orientierung der Mehrfachstelle bestimmt wurde.

Beispiel 1.2: Konstruktion eines nicht-mobilisierbaren Derivats von pRK290, das den par-Locus von RK2 besitzt.

Dieses Beispiel erläutert, wie durch Clonierung eines Fragments, das den par-Locus von RP4 trägt, in ein RK2-Derivat ein Plasmid erhalten wird, das eine größere Segregationsstabilität besitzt.
Das 2,2 kb lange BamHI-Fragment von pGMA28 (Gerlitz et al., 1988), das den par-Locus von RP4 enthält, wurde gereinigt, mit pXL1594, das durch BglII linearisiert worden war, ligiert. Die Ligatur wurde in E. coli MC1060 transformiert. Die Plasmid-DNA der 24 Transformanten wurde durch Restriktionsspaltung analysiert, und 3 Clone trugen das 2,2 kb lange Fragment. 2 davon besaßen das Fragment in der gleichen Orientierung, der 3. entsprach der umgekehrten Orientierung. Das den beiden ersten Clonen entsprechende Plasmid wurde als pXL1635 bezeichnet, während das, das das Fragment in der anderen Orientierung enthielt, als pxL1635 bezeichnet wurde (siehe Figur 4).
Die so erhaltenen Plasmide leiten sich von RK2 und noch genauer, von pRK290 mit einer Deletion von 3,5 kb um den Transferorigin, Integration der par-Region von RP4 und gegebenenfalls einer Mehrfachclonierungsstelle ab. Die folgenden Spaltstellen können für symmetrische Clonierungen verwendet werden: EcoRI, BamHI, PstI, HindIII, CIaI, XbaI, XhoI und SstI; für asymmetrische Clonierungen muß EcoRI ausgeschlossen werden, aber die anderen Enzyme können verwendet werden.

Beispiel 2: Mobilisierung von pXL1635

Die Mobilisierung von pXL1635 wurde untersucht. Sie wurde an einem konjugativen Transfer von E. coli nach E. coli durchgeführt. Ein Transfer mit drei Partnern (gemäß der bereits von Ditta et al., 1980 beschriebenen Technik) wurde unter Verwendung der nachstehenden Stämme durchgeführt
- Stamm, der das zu mobilisierende Plasmid trägt HB101 (pXL1635) oder HB101 (pRK290) oder HB101 (pXL1570) oder HB101 (pUC9tet).
- Stamm, der das "Helper"-Plasmid für die Mobilisierung der RK2-Derivate enthält: HB101 pRK2013
- Rezeptorstamm, C600 Rifr.
Das Plasmid pUC9tet stammt von Pharmacia France S. A.; es handelt sich um ein nicht-mobilisierbares Plasmid, das von pBR322 abgeleitet ist, und das die gleiche Resistenz, wie die Plasmide pRK290, pXL1635 und pXL1570 verleiht.
Die Transkonjuganten wurden auf einem mit Tetracyclin und Rifampicin supplementierten LB-Medium selektioniert. Die Konjugationshäufigkeiten wurden berechnet, wie dies üblicherweise als das Verhältnis der Anzahl der Rezeptorzellen, die effektiv die Resistenz des Plasmids erhalten hatten, zu der Gesamtanzahl der Rezeptorzellen durchgeführt wird (Ditta et al., 1980). Die Konjugation wurde mit HB101 als Donorstamm durchgeführt. Es handelt sich um einen recA-Stamm, was die homologe Rekombination vermeidet, die zwischen pRK2013 und pXL1570, pRK290, pXL1635 und pUC9tet auftreten könnte, da diese Plasmide homologe Sequenzen besitzen. Tabelle: Konjugationshäufigkeit der RK2-Derivate von E. coli HB101 gegenüber C600 Rifr. Die Einzelheiten des Versuchs sind im Text angegeben; -: Fehlen des Donorplasmids. Plasmid Konjugationshäufigkeit
Wie klar aus dieser Tabelle hervorgeht, übersetzt sich der Verlust des mob-Locus in einen fast vollständigen Verlust der Mobilisierung um mindestens den Faktor von 2.10&sup4; zwischen der Konjugationshäufigkeit von pXL1570 und der von pRK290, während diese Plasmide sich nur durch eine Deletion von 3,5 kb unterscheiden. pXL1635 besitzt die gleichen Mobilisierungseigenschaften, wie pXL1570. Es ist wahrscheinlich, wie dies bereits vorstehend beschrieben wurde, daß die hier mit pXL1570 und pXL1635 beobachtete Konjugation auf eine homologe Rekombination zwischen diesen Plasmiden (die direkt von pRK290 abstammen) und pRK2013, die homologe Regionen besitzen (Ditta et al., 1980) zurückzuführen ist. Das nicht-mobilisierbare Kontrollplasmid pUC9tet wird mit Häufigkeiten mobilisiert, die sich von denen, die für pXL1635 und pXL1570 beobachtet werden, nicht unterscheiden, was zeigt, daß diese Plasmide ihre Fähigkeit zur Mobilisation verloren haben, und daß sie nur durch Rekombination mobilisiert werden können, selbst wenn in dem beschriebenen Versuch die Donorstämme recA sind (es muß sich bei diesem Versuch um eine recA-unabhängige Rekombination handeln). Da der Mechanismus des konjugativen Transfers von pRK290 der gleiche zwischen zwei E. coli-Stämmen und zwischen zwei gramnegativen Bakterien ist, muß das Plasmid pXL1635 als nicht-mobilisierbar gelten, unabhängig vom Wirt.

Beispiel 3: Einschleusung von pXL1635 in gramnegative Bakterien außer Escherichia coli.

Dieses Beispiel erläutert, wie das nicht-mobilisierbare Plasmid pXL1635 in verschiedene gramnegative Bakterien eingeschleust werden kann.
Da das Plasmid pXL1635 keinen Transferorigin trägt, kann es von Escherichia coli nicht in ein anderes gramnegatives Bakterium mobilisiert werden. Zur Einschleusung von pXL1635 in verschiedene gramnegative Bakterien wurde das Transformationsverfahren durch Elektroporation (Wirth et al., 1989) verwendet. Die folgenden Bakterien wurden mit den Plasmiden pRK290, pXL1570 und pXL1635 durch dieses Verfahren transformiert:
- Pseudomonas denitrificans SC510 Rif
- Agrobacterium tumefaciens C58C9
- Pseudomonas putida KT2440
- Rhizobium meliloti 102F34
Für jedes Bakterium wurde ein rekombinanter Clon reisoliert; die Plasmid-DNA wurde gereinigt und erwies sich als nicht unterschiedlich von derjenigen des Ausgangsplasmids durch mehrere Restriktionsspaltungen. Das Plasmid pXL1635 kann somit in gramnegative Bakterien eingeschleust werden.

Beispiel 4: Stabilität von pXL1635

Dieses Beispiel erläutert wie pXL1635 bei mehreren gramnegativen Bakterien stabiler ist als pRK290.
Die verschiedenen rekombinanten Bakterien, sowie die Ausgangsstämme, wurden in LB-Medium ohne Zusatz von Antibiotika gezüchtet. Als die stationäre Phase erreicht wurde, wurde eine Verdünnung auf 1/1000 durchgeführt. Die Stämme wurden so im Mittel 50 Generationen lang gezüchtet (die Anzahl der Generationen wurde auf 50 geschätzt, und ist in einer Verzweigung von 40 bis 60 erhalten). Verdünnungen der Kulturen wurden anschließend auf Gelose-haltiges LB- Medium aufgebracht. Für jede Kultur wurden 200 unabhängige Clone in ein Selektivmedium für das Plasmid erneut aufgebracht. Die Häufigkeit der Clone, die die Resistenz verloren hatten und somit das Plasmid, wurde berechnet. Dieser Wert ist in der nachstehenden Tabelle enthalten. Tabelle: Prozentuale Häufigkeiten des Verlusts der Plasmide pRK290, pXL1570 und pXL1635 bei verschiedenen gramnegativen Bakterien. Stämme Escherichia coli MC1060 Pseudomonas denitrificans SC510 Rif Aurobacterium tumefaciens C58C9 Pseudomonas putida KT2440 Rhizobium meliloti
Die Werte entsprechen der prozentualen Häufigkeit der Clone, die die Resistenz des Plasmids nach 50 Kulturgenerationen auf nicht-selektivem LB-Medium verloren hatten.
Aus dieser Tabelle folgt klar, daß pXL1635 viel stabiler ist, als pRK290 und als pXL1570; diese Eigenschaft trifft bei allen untersuchten Bakterien zu. Diese beiden zuletzt genannten Plasmide besitzen die gleichen Häufigkeiten der Clone, die das Plasmid verloren hatten. Die beobachteten Unterschiede sind in statistischer Hinsicht nicht signifikant. Die Deletion von 3,5 kb beeinträchtigt nun nicht die Eigenschaften der Replikation und der Stabilität von pRK290. Im Gegenteil, die Clonierung des 2,2 kb langen Fragments von pGMA28 führt einen sehr großen Stabilitätsgewinn herbei. Diese Ergebnisse zeigen klar, daß das Plasmid pXL1635 ein Plasmid ist, das viel interessantere Eigenschaften als pRK290 hinsichtlich der Stabilität besitzt. Diese Vorteile sind natürlich die gleichen bei den anderen RK2-Derivaten, die gemäß der veröffentlichten Literatur weniger vorteilhaft als pRK290 für eine industrielle Verwendung sind (Schmidhauser et al., 1988).

Beschreibung der Figuren

Figur 1: Konstruktion von pXL1418, pxL1454, pXL1461 und pXL1462. Die Einzelheiten der Konstruktionen sind in der Beschreibung angegeben.
Figur 2: Sequenz des 110 bp langen HpaII-Fragments, enthaltend den Transferorigin von RK2 (gemäß Guiney et Yakobson, 1983). Die Sequenz des Oligonucleotids, das zur Mutagenese gedient hat, ist angegeben, sowie die SstI-Spaltstelle, die eingeführt wurde. Die beiden invers repetierten Sequenzen, die eine Haarnadelstruktur bilden müssen, sind durch einen Pfeil unterstrichen.
Figur 3: Konstruktion von pXL1561 und pXL1570. Die Einzelheiten der Konstruktionen sind in der Beschreibung angegeben.
Figur 4: Konstruktion von pXL1594, pXL1635 und pXL1634. Die Einzelheiten der Konstruktionen sind in der Beschreibung angegeben.

Definition der verwendeten Ausdrücke und der Abkürzungen.

Rekombinante DNA: Gesamtheit der Techniken, die entweder die Assoziation der DNA-Sequenzen, die nicht natürlicherweise vorhanden sind, im gleichen Mikroorganismus erlauben, oder die spezifische Mutagenese eines DNA-Fragments erlauben.
ATP: Adenosin-5'-triphosphat
BSA: Rinderserumalbumin
Stoppcodon: Codon zur Beendigung der Translation
dNTP: 2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphat
DTT: Dithiothreit
kb: Kilobasen
bp: Basenpaare

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Claims

1. Clonierungs- und/oder Expressionsvektor mit einem breiten Wirtsspektrum, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Replikationsorigin, abgeleitet von einem Plasmid mit einem breiten Wirtsspektrum bei den gramnegativen Bakterien der Inkompatibilitätsgruppe P, besitzt, der ihm die Replikation in fast allen gramnegativen Bakterien erlaubt, ein DNA-Fragment, das die par-Region des Plasmids RP4 trägt, enthält und nicht mobilisierbar ist.

2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er den Replikationsorigin des Plasmids RK2 besitzt.

3. Vektor nach Anspruch 1, worin der mob-Locus deletiert worden ist.

4. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin eine Mehrfachclonierungsstelle enthält.

5. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin einen Selektionsmarker, bestehend bevorzugt aus einem Antibiotika-Resistenzgen, enthält.

6. Clonierungs und/oder Expressionsvektor mit einem breiten Wirtsspektrum bei gramnegativen Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß er von dem Plasmid RK2 abgeleitet ist, kleiner als 20 kb ist, ein DNA-Fragment, das die par-Region des Plasmids RP4 trägt, enthält, keinen mob-Locus enthält und gegebenenfalls eine Mehrfachclonierungsstelle und einen Selektionsmarker enthält.

7. Plasmid pXL1635, dadurch gekennzeichnet, daß es von dem Plasmid RK2 abgeleitet ist, kleiner als 20 kb ist, ein DNA-Fragment, das die par-Region des Plasmids RP4 trägt, enthält, keinen mob-Locus enthält und eine Mehrfachclonierungsstelle und ein Antibiotika- Resistenzgen enthält, wie in Figur 4 dargestellt.

8. Vektor nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin eine rekombinante DNA enthält.

9. Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA in Abhängigkeit von Sequenzen zur Regulation der genetischen Expression ein oder mehrere Strukturgene, die ein oder mehrere gegebene Polypeptide codieren, enthält.

10. Vektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Strukturgene unter der Abhängigkeit ihrer eigenen Regulationssequenzen oder verschiedener Sequenzen stehen können.

11. Vektor nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzen zur Regulation der genetischen Expression aus einem oder mehreren Elementen, ausgewählt aus Promotoren, Terminatoren, Signalpeptiden und Ribosomen-Bindungsstellen bestehen.

12. Vektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Strukturgen(e) ein Protein codiert/codieren, das aus Enzymen, Hormonen, Wachstumsfaktoren und bevorzugt aus Albumin, tPA, TIMP, Interleukinen, Apolipoproteinen und Interferonen ausgewählt ist.

13. Vektor nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die Strukturgen(e) Gene ist/sind, die auf genetischer oder biochemischer Ebene an der Biosynthese eines Metaboliten beteiligt sind.

14. Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Metabolit aus Vitaminen, Antibiotika, Aminosäuren und jedem anderen bakteriellen Metaboliten ausgewählt ist.

15. Vektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Metabolit aus Vitamin B&sub1;&sub2;, Biotin, Riboflavin, Lysin, Threonin, Methionin, Penicillin und Tetracyclin ausgewählt ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines proteins oder eines Metaboliten, dadurch gekennzeichnet, daß man

- in ein gramnegatives Bakterium einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 bis 15, der das Strukturgen, das das Protein codiert, oder ein oder mehrere Gene, die auf genetischer oder biochemischer Ebene an der Biosynthese des Metaboliten beteiligt sind, enthält, einschleust,

- dieses Bakterium unter Expressionsbedingungen des oder der Gens/Gene züchtet, und

- das gebildete Protein oder den gebildeten Metaboliten isoliert.

17. Gramnegatives Bakterium, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15.

18. Verwendung eines Bakteriums nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Proteins oder eines Metaboliten.

19. Verwendung eines Bakteriums nach Anspruch 17 direkt in einer Biokonversionsreaktion.