DE69033072T2

DE69033072T2 - Verfahren und Mittel zum Nachweis von Krankheitszuständen aus Änderungen im Östrogenstoffwechsel

Info

Publication number: DE69033072T2
Application number: DE69033072T
Authority: DE
Inventors: H. Leon Bradlow; Jack Fishman; Richard J. Hershcopf; Jon J. Michnovicz
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1989-07-17
Filing date: 1990-07-17
Publication date: 1999-10-28
Anticipated expiration: 2010-07-18
Also published as: JPH03215745A; EP0409176A2; DE69033072D1; EP0409176A3; CA2021309C; AU5905190A; ATE179522T1; AU641409B2; CA2021309A1; EP0409176B1

Description

Die Anmelder sind Autoren oder Mitautoren der folgenden Artikel, die sich mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung befassen: (1) [die Anmelder Michnovicz, Hershcopf, Bradlow und Fishman sind Co- Autoren mit Hiroshi Naganuma] "Increased Urinary Catechol Estrogen Excretion In Female Smokers", STEROIDS 52/1-2, Seite 69-83 (Juli-August, 1988); (2) [die Anmelder sind Co-Autoren mit Nancy J. Haley] "Cigarette Smoking Alters Hepatic Estrogen Metabolism in Men: Implications for Atherosclerosis", METABOLISM 38 (6), Seite 537-541 (Juni, 1989); (3) [der Anmelder Michnovicz als Co-Autor mit Richard A. Galbraith] "The Effects of Cimetidine 011 the Oxidative Metabolism of Estradiol", N. ENGL. J. MED., 321/5: Seiten 269-274 (3. August, 1989); (4) [der Anmelder Michnovicz als Co-Autor mit Richard A. Galbraith] "Effects of Exogenous Thyroxine on C-2 and C-16 Hydroxylations of Estradiol in Humans", STEROIDS, 55: 22-26 (Januar, 1990); und (5) [die Anmelder Michnovicz und Bradlow als Co-Autoren] "Induction of Estradiol Metabolism by Dietary Indole-3-Carbinol in Humans", J. NATL. CANCER INS. (Veröff. Juni, 1990).
Die Erfindung betrifft die Diagnose von Krankheitszuständen in Säugetieren und besonders den Vergleich der Niveaus von Östrogenmetaboliten und die Korrelation von Metabolitenniveaus mit dem Einsetzen oder Vorhandensein von verschiedenen Krankheitszuständen in Säugetieren und besonders beim Menschen.
Der Metabolismus von Östrogen war Gegenstand zahlreicher Untersuchungen mit dem Ziel, die Gegenwart bestimmter Krankheitszustände, wie Endometrium-Karzinom und Brustkrankheit (Mamma-Karzinom) mit der Anwesenheit und Menge bestimmter Östrogenmetabolite zu korrelieren. So haben sich Untersuchungen gerichtet auf Metabolite von Östron, wie 2α-Hydroxyöstron, Östradiol und Östriol und haben in gewissem Grad Spekulationen entwickelt, ob diese Metaboliten überhaupt eine Rolle und welche Rolle sie in bestimmten Krankheitszuständen spielen könnten. Besonders im Fall von 16-α-Hydroxyöstron haben diese Untersuchungen eine direkte pathophysiologische Beteiligung nahegelegt. Siehe z. B. Fishman et al., J. CLIN. ENDOCRINOL. METAB. 51 (3): Seiten 611-615 (1980). Jedoch hat die Konstitution dieses Metaboliten davon abgehalten, ihn weiter für entweder diagnostische oder therapeutische Zwecke in Betracht zu ziehen.
Gegenwärtig wird die Diagnose der erwähnten Krankheitszustände und Abnormitäten im allgemeinen durchgeführt, nachdem der Patient einen abnormalen Zustand erfahren hat, z. B. Fehlen von Energie, Kopfschmerzen, Rektalblutungen, Knoten usw. oder wie er vorab vorläufig aufgefunden wurde während einer jährlichen physischen Untersuchung. Nachdem einmal solche abnormalen physischen Symptome aufgetreten sind, werden dann diagnostische Verfahren und/oder andere Maßnahmen eingeleitet und ausgewertet, um den pathologischen Zustand qualitativ und quantitativ hinsichtlich des Ausmaßes des Fortschreitens des pathologischen Zustands oder Befindens zu bewerten. Zu diagnostischen Verfahren können Röntgenuntersuchungen, z. B. Mammographie für Brustkrebs usw. gehören.
Zusätzlich können nachdem einmal das Vorhandensein eines Krankheitszustandes gefunden und als spezifischer Krankheitszustand festgestellt worden ist, Heilungsmaßnahmen eingeleitet werden, um den Einfluß des Krankheitszustands zu verringern, wie Medikation, Bestrahlungstherapie, Chemotherapie, diätetische und andere Maßnahmen der Lebensführung und dergleichen Verschreibungen, oder es wird stattdessen der Krankheitszustand beispielsweise chirurgisch beseitigt. In jedem Fall ist die Wirksamkeit der Heilmethoden schwer kurzfristig zu ermessen. Beispielsweise können bei der chirurgischen Entfernung von Krebsgewebe nur anschließende Biopsien von benachbartem Gewebe eine vollständige Entfernung zeigen, und selbst das nicht notwendigerweise mit einer hundertprozentigen Gewißheit, geschweige denn die Möglichkeit von Metastasen.
Es sind Tests entwickelt worden, worin eine Zellprobe isoliert und nach verschiedenen Methoden auf individuelle Funktionsfähigkeit untersucht wird. Solche Verfahren sind kostspielig und zeitaufwendig und sind nicht spezifisch für einen bestimmten Krankheitszustand. Auch sind die Ergebnisse solcher Tests schwierig zu interpretieren, geschweige denn zu korrelieren. So kann beispielsweise zwar die Mammographie die Größe, den Ort usw. eines Knotens in der Brust einer Frau zeigen, jedoch lassen die Ergebnisse nicht immer erkennen, ob der Knoten krebsartig oder gutartig ist. Eine solche pathologische Bewertung wird durchgeführt durch pathologische Beobachtung der tatsächlichen Zellstruktur nach Biopsie oder chirurgischer Entfernung des Knotens.
Zwar sind krankheitsbedingte Veränderungen im Östrogenmetabolismus schon früher festgestellt worden, jedoch hat die Art der Metaboliten von Bemühungen abgehalten, dieses Phänomen für die Entwicklung eines einfachen diagnostischen Tests anzuwenden. Das liegt daran, daß das Niveau von Östrogen und sein Metabolismus in Abhängigkeit vom Menstruations-Zyklus bei Frauen sowie auch in Abhängigkeit vom zirkadianen Rhythmus bei Männern und Frauen schwankt. Es besteht weiterhin ein Bedarf, einen sicheren und vorzugsweise nicht invasiven, zuverlässigen und billigen Test für die Bewertung der obigen und anderer Krankheitszustände und Abnormitäten zu schaffen, worin der Metabolismus von Östrogen eine Rolle spielen kann.
Der Artikel von Michnovicz et al., Steroids, Band 52, S. 69-83, (August 1988), "Increased Urinary Catechol Estrogen Excretion in Female Smokers", wurde verfaßt von mehreren der Erfinder als Co-Autoren und betrifft eine Studie, welche radiometrische Assays verwendet, in welchen das zu metabolisierende Steroid exogen hergestellt, radiomarkiert, für den Ablauf des Metabolismus den Versuchspersonen verabreicht und dann analysiert wurde.
Michnovicz et al., Metabolism, Band 38, No. 6, Juni 1998, "Cigarette Smoking alters hepatic estrogen metabolism in men: Implications for atherosclerosis" ist eine weitere Veröffentlichung von bestimmten der vorliegenden Anmelder als Co-Autoren. Wie im Fall der oben erwähnten Steroid-Veröffentlichung betrifft diese Untersuchung die Verwendung von radiomarkiertem exogen zugeführtem Östradiol und dessen Metabolismus bei männlichen Rauchern.
Michnovicz et al., New England Journal of Medicine, Band 315, no. 21, (1986) "Increased 2- hydroxylation of estradiol as a possible mechanism for the anti-estrogenic effect of cigarette smoking", ist wieder eine Veröffentlichung von bestimmten der Erfinder der vorliegenden Anmeldung als Co- Autoren und befaßt sich wiederum mit der Analyse von exogen zugeführtem radiomarkiertem Östradiol und dessen Metaboliten.
Adlercreutz et al., Journal of Steroid Biochemistry, Band 24, no. 1, 1986 "Urinary estrogen profile determination in young Finnish vegetarian and omnivorous women" befaßt sich mit Untersuchungen, die an gesunden Individuen mit verschiedener Ernährung durchgeführt wurden. Jedoch wurden die Bestimmungen von Adlercreutz alle mit gesunden Individuen durchgeführt, so daß die Ergebnisse nicht als eine Diagnose eines Krankheitszustands verwendet werden konnten, da kein solcher während dieser Untersuchungen beobachtet wurde. Zweitens scheinen die Ergebnisse von Adlercreutz zu zeigen, daß die Östrogen-Profilbestimmung nicht zur Diagnose eines Krankheitszustands verwendet werden könnte, da die Untersuchung feststellte, daß die Faseraufnahme mit der Ernährung den Östrogenmetabolismus signifikant beeinflußt. Obgleich Adlercreutz in der Zusammenfassung angibt, daß "...Diät den Östrogenmetabolismus und auf diese Weise das Brustkrebsrisiko beeinflussen kann...", stützen seine Ergebnisse in keiner Weise die Verwendung eines Verhältnisses von Östronmetaboliten zum Diagnostizieren von Krankheitszuständen, wie Brustkrebs.
Ganz im Gegenteil werden ein Verfahren und zugehörige Mittel zum Nachweis von Krankheitszuständen aus Abweichungen im Östrogenmetabolismus in Säugetieren hier mitgeteilt. Das Verfahren umfaßt das Isolieren von wenigstens zwei verschiedenen Metaboliten von Östron aus einer biologischen Probe, die von dem untersuchten Säugetier genommen ist, das Bestimmen der Menge jedes der Metaboliten in der Probe, das Korrelieren der Menge jedes der Metaboliten miteinander, um einen Quotienten der Metaboliten zu erhalten, und das Vergleichen des Quotienten mit einem extrinsischen Quotienten, der entweder zuvor von dem getesteten Säugetier abgeleitet wurde, wie durch eine vorherige Durchführung oder innerhalb des Tests, oder vom Testen anderer Subjekte der gleichen Spezies, um irgendwelche Abweichungen in dem Östrogenmetabolismus aufzufinden.
Diese Bestimmung der Menge jedes der Metaboliten in der Probe kann erfolgen durch Messen der Konzentration der Produkte in der Probe und diese Messung der Konzentration kann durchgeführt werden durch chromatographische, immunochemische oder radiometrische Analyse oder durch ein Rezeptorassay. Zu den Metaboliten von Östron gehören Produkte der enzymatischen Hydroxylierung, Produkte der enzymatischen Reduktion von Östron, Produkte der enzymatischen Oxidation von Östron und Produkte der enzymatischen Methylierung von Östron. Die Metabolite von Östron umfassen in einem weiten Sinn 2-Hydroxyöstron, 4- Hydroxyöstron, 15α-Hydroxyöstron, 16α-Hydroxyöstron, 2-Methoxyöstron und Östriol, 17β- Östriol, Epiöstriol, 16-Ketoöstradiol und 15α-Hydroxyöstradiol, und besonders bestehen sie im wesentlichen aus 2-Hydroxyöstron und Östriol.
Wie hier verwendet bezeichnet der Ausdruck "Hydroxylierungsprodukte von Östron" nicht nur die verschiedenen Hydroxyl-substituierten Östrone, sondern auch nachfolgende Metabolite derselben, die beispielsweise durch Oxidation oder Reduktion der substituierten Östrone mit dem Enzym 17-Oxidoreduktase gebildet werden.
In einer besonderen Ausführungsform umfaßt das vorliegende Verfahren die quantitative Erfassung der Niveaus der Produkte der enzymatischen Östron-Hydroxylierung und besonders der Niveaus von 2-Hydroxyöstron (2OHE&sub1;) und Östriol (E&sub3;), und die Bestimmung eines Quotienten oder Index, der durch die Formel [2OHE&sub1;]/[E&sub3;] definiert ist.
Die Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Index beseitigt die Notwendigkeit, Korrekturen vorzunehmen, um biologische Abweichungen zu berücksichtigen, welche auf dem Menstruationszyklus bei weiblichen Personen und den Zirkadian- Rhythmus bei sowohl männlichen als auch weiblichen Personen beruhen. Das gegenwärtige Verfahren liefert dadurch die Basis für diagnostische Tests, die klinisch signifikante Daten mit einem weniger komplexen Verfahren liefern.
Das vorliegende Verfahren und die spezifischen Protokolle (Maßnahmen oder Verschreibungen), die davon abgeleitet werden können, wie im folgenden angegeben, sind brauchbar zum Auffinden von Krankheitszuständen, bei denen eine Veränderung im Östrogenmetabolismus eintritt, wie Autoimmun-Krankheiten, Leberkrankheiten, Osteoporose, Endometriose, Fettleibigkeit, Atherosklerose, endometrisches Karzinom, Mammakarzinom und Herzkrankheit. Ebenso können das vorliegende Verfahren und zugehörige Testpackungen verwendet werden, um den Verlauf einer Therapie zu verfolgen oder die Wirksamkeit von neuen Arzneimitteln und dergleichen zu testen.
Demgemäß betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von stimulierten, spontanen oder idiopathischen Krankheitszuständen in Säugetieren durch Messen der Aktivität und Anwesenheit der angegebenen Metaboliten von Östron. Besonders kann die Menge oder Aktivität der Östron-Metaboliten direkt verfolgt werden durch die später diskutierten Assay-Methoden (Meßmethoden) unter Verwendung einer geeigneten Menge von geeignet markierten Metaboliten. Stattdessen können die Östronmetaboliten verwendet werden, um Bindungspartner oder Antikörper zu erzeugen, die ihrerseits markiert und in ein Medium wie Serum eingeführt werden können, um auf die Anwesenheit von Östronmetaboliten darin zu testen und so den Zustand des Organismus zu bestimmen, von dem das Medium entnommen wurde.
So können sowohl die Östronmetaboliten und irgendwelche dafür entwickelte Antikörper in Verbindung mit verschiedenen diagnostischen Verfahren verwendet werden, einschließlich Immunoassays, wie Radioimmunoassay, in dem beispielsweise ein Antikörper für die Hydroxylierungsprodukte verwendet wird, der durch entweder radioaktiven Zusatz, Reduktion mit Natriumborhydrid oder Radioiodierung markiert wurde.
In einem exemplarischen Immunoassay kann eine Kontrollmenge eines Östronmetaboliten, seines Antikörpers oder dergleichen hergestellt und mit einem Enzym, einem spezifischen Bindungspartner und/oder einem radioaktiven Element markiert und dann in eine Urin-, Blut-, Speichel- oder andere physiologische Fluidprobe eines Säugetiers gegeben werden, von dem man annimmt, daß es sich in einem Krankheitszustand befindet. Nachdem das markierte Material oder sein Bindungspartner (seine Bindungspartner) Gelegenheit hatte, mit Bindungsplätzen in der Probe zu reagieren, kann die erhaltene Masse mittels bekannter Methoden untersucht werden, die je nach der Art der angebrachten Markierung verschieden sein können.
Im Fall, wo eine radioaktive Markierung, wie die Isotopen ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I &sup5;&sup7;Co, &sup5;&sup9;Fe und ³&sup5;S verwendet wird, können bekannte gegenwärtig verfügbare Zählverfahren verwendet werden. Falls die Markierung ein Enzym ist, kann die Erfassung durch irgendeine der gegenwärtig verwendeten colorimetrischen, spektrophotometrischen, thermometrischen, amperometrischen, fluorospektrophotometrischen oder gasometrischen Verfahren erfolgen.
Zu den erfindungsgemäß entwickelten und gemäß der Erfindung verwendbaren Materialien gehört ein Assay-System, das in Form einer Testpackung für die quantitative Analyse des Ausmaßes des Vorhandenseins des Östronmetaboliten hergestellt werden kann. Das System oder die Testpackung können eine markierte Komponente umfassen, die durch eine der hier diskutierten radioaktiven und/oder enzymatischen Methoden hergestellt wurde und direkt oder indirekt eine Markierung an den Östronmetaboliten kuppelt; und ein oder mehrere zusätzliche immunochemische Reagenzien, von denen wenigstens eines ein freier oder immobilisierter Ligand ist, der sich entweder an die markierte Komponente, deren Bindungspartner, eine der zu bestimmenden Komponenten oder deren Bindungspartner binden kann, wobei die Östronmetaboliten so ausgewählt sind, daß der 2-Hydroxylierungs- und der 16α- Hydroxylierungweg des Östronmetabolismus verglichen werden. Demgemäß ist es ein erstes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Krankheitszustand in einem Säugetier vorliegt, anzugeben.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein solches Verfahren anzugeben, das in einfacher und billiger Weise durchgeführt werden kann.
Ferner ist es ein Ziel der Erfindung, eine zuverlässige Methode zu schaffen, um mit falls überhaupt minimalen Meßfehlern zu bestimmen, ob ein Krankheitszustand in einem Säugetier vorliegt.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine einfache Methode zu schaffen, um in Reihenuntersuchungen den Verlauf eines bekannten Krankheitszustandes in einem Säugetier zu erfassen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Methode zu schaffen, um die Wirksamkeit eines chirurgischen Eingriffs bei einem Säugetier zur Beseitigung eines Krankheitszustandes zu bestimmen oder einen Krankheitsrückfall zu erfassen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Methode zu schaffen, um die Wirksamkeit einer Medikation oder Diät oder dergleichen Maßnahmen bei einem Säugetier mit einem bekannten Krankheitszustand zu verfolgen.
Noch ein weiteres Ziel ist es, eine Methode zu schaffen, um den Reproduktionsstatus oder den Schwangerschaftsverlauf von einem Säugetier zu bestimmen.
Weitere Ziele und Vorteile sind für den Fachmann ersichtlich aus der folgenden Beschreibung, die sich auf die beigefügten erläuternden Zeichnungen bezieht.
Fig. 1A ist ein Flußdiagramm, welches die Wege des Metabolismus von Östron zeigt.
Fig. 1B ist ein Flußdiagramm, welches die Wege des Metabolismus von Östradiol zeigt.
Die Fig. 2A und 2B sind graphische Darstellungen der Ergebnisse der 2-Hydroxylierung von Östron bei weiblichen Rauchern und Nichtrauchern.
Fig. 2A ist eine Punkt-Diagrammdarstellung der erfindungsgemäß bestimmten Verhältnisse und
Fig. 2B zeigt die bestätigenden radiometrischen Messungen der gleichen Gruppen verglichen mit den in Fig. 2A dargestellten Verhältnisdaten.
Die Fig. 3A und 3B sind Graphe, die Ergebnisse von radiometrischen Messungen des Prozentsatzes von Östradiol-2-Hydroxylierung bei Gruppen von männlichen Rauchern und Nichtrauchern aufzeigen.
Fig. 3A zeigt die radiometrische Messungen und Fig. 3B zeigt den Vergleich von Verhältnissen von den gleichen Gruppen.
Fig. 4 ist ein Graph, der das radiometrische Ausmaß von 2-Hydroxylierung gegen [2OHE&sub1;]/[E&sub3;] im Urin für jedes Individuum angibt, wobei sich eine starke Korrelation zwischen den zwei Messungen zeigt (r = 0,71, P < 0,002). Die Linie zeigt die kleinsten Quadrate, die zu den Punkten passen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und zugehörige Materialien zum Erfassen von pathologischen Zuständen aus Veränderungen im Östrogenmetabolismus in Säugetieren. Bei der vorliegenden Methode werden wenigstens zwei verschiedene Metaboliten von Östron aus einer biologischen Probe isoliert, die von dem untersuchten Säugetier genommen ist, wobei die Östronmetaboliten so ausgewählt sind, daß die 2-Hydroxylierungs- und 16α- Hydroxylierungs-Wege des Östronmetabolismus verglichen werden, die Menge jedes der Metabolite in der Probe bestimmt wird, das Verhältnis der Mengen jedes der Metabolite zueinander korreliert wird, um ein Verhältnis der Metabolite zu erhalten, und das Verhältnis mit einem entweder zuvor von dem untersuchten Säugetier abgeleitet oder von der Untersuchung anderer Individuen der gleichen Spezies abgeleiteten extrinsischen Verhältnis verglichen wird, um irgendwelche Veränderungen in dem Östrogenmetabolismus zu erfassen, welche das Vorhandensein des Krankheitszustandes identifizieren.
Die Östronmetaboliten, die gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen und verfolgt werden können, umfassen die Produkte und können ausgewählt werden aus den Produkten der enzymatischen Hydroxylierung von Östron, der enzymatischen Reduktion von Östron, der enzymatischen Oxidation von Östron und der enzymatischen Methylierung von Östron. Wie oben erwähnt, schließen die Produkte der enzymatischen Hydroxylierung von Östron solche hydroxylierten Östrone ein, die weiter enzymatisch oxidiert oder reduziert werden können, wie durch die Wirkung von 17-Oxidoreduktase.
Demgemäß und wie in Fig. 1A gezeigt, umfassen die hier interessierenden Östronmetabolite 2-Hydroxyöstron, 4-Hydroxyöstron, 15α-Hydroxyöstron, 16α- Hydroxyöstron, 2- Methoxyöstron, Östriol, 17β-Östriol, Epiöstriol, 16-Ketoöstradiol und 15α-Hydroxyöstriol. Die Produkte der enzymatischen Hydroxylierung umfassen im weiten Sinne 2- Hydroxyöstron, 16α- Hydroxyöstron, 2-Methoxyöstron und Östriol und besonders 2- Hydroxyöstron und Östriol.
Weiter umfaßt die Erfindung besonders die Messung und quantitative Erfassung der Produkte der enzymatischen Östron-Hydroxylierung und die Bestimmung einer algorithmischen Bezie hung zwischen bestimmten dieser Hydroxylierungsprodukte, welche eine verläßliche Anzeige eines Krankheitszustandes liefert.
Demgemäß kann in einer Ausführungsform ein Verhältnis oder Quotient zwischen den Metaboliten 2-Hydroxyöstron (2OHE&sub1;) und Östriol (E&sub3;) bestimmt werden, der ausgedrückt wird als
[2OHE&sub1;]/[E&sub3;]
und das verglichen werden kann mit entweder zuvor oder anschließend aus der Messung der jeweiligen Niveaus dieser Östronmetaboliten im gleichen Individuum oder Individuen der gleichen Spezies gewonnenen Verhältnissen. Im ersten Fall kann der Arzt oder der Patient den Index periodisch verfolgen, um irgendwelche Veränderungen festzustellen, welche es erwünscht erscheinen lassen würden, auf einen der Krankheitszustände oder Zustände spezieller zu testen, welche als Ursache für Schwankungen im Östrogenmetabolismus bekannt sind. Im zweiten Fall kann der individuelle Index oder Quotient verglichen werden mit einem Kontinuum ähnlicher Daten, die von sowohl gesunden als auch mit spezifischen Krankheitszuständen behafteten Individuen entwickelt wurden, um zu versuchen, in einer annähernd qualitativen Art den Krankheitszustand des getesteten besonderen Individuums zu identifizieren.
Wie oben erwähnt, wurde die Theorie der Erfindung teilweise abgeleitet aus Untersuchungen des Östrogenmetabolismus bei Rauchern. Mehrere epidemiologische Untersuchungen haben gezeigt, daß Zigarettenrauchen dem Umsatz von Östrogen in Frauen erheblich verändert (Baron, A.J., AM. J. EPIDEMIOL., 119: 9-22 (1984)). Es wurde gefunden, daß weibliche Raucher eine Abnahme von endometrischem Karzinom zeigen (Weiss, N.S., et al., MATURITAS, 2: 185-190 (1980); Tyler, C.W. et al., AM. J. OBSTET. GYNECOL., 151: 899- 905 (1985); Lesko, S.M., et al., N. ENGL. J. MED., 313: 593-596 (1985); Baron, J.A., et al., JNCI, 77: 677-680 (1986)), eine verringerte Endometriosis (Cramer, D.W., et al., JAMA, 255: 1904-1908 (1986)), eine verringerte gutartige Brusterkrankung (Berkowitz, G.S., et al., J. EPIDEMIOL. COMMUNITY HEALTH, 39: 308-313 (1985)), erhöhte Osteoporose (Daniell, H.W., ARCH. INTERN. MED., 136: 298-304 (1976); Jensen, J., et al., N. ENGL. J. MED., 313: 973-975 (1985)), und frühere natürliche Menopause (Willett, W.L., AM. J. EPIDEMIOL., 117: 651-658 (1983)).
Kürzlich wurde berichtet, daß Rauchen verbunden ist mit einem deutlichen Anstieg der Östradiol-2-Hydroxylierung, gemessen bei Frauen vor der Menopause durch ein in vivo durchgeführtes radiometrisches Verfahren (Michnovicz, J.J., et al., N. ENGL. J. MED., 315: 1305-1309 (1986)). Diese bedeutende irreversible Bioumwandlung wird im Östrogenmetabolismus-Reaktionsweg der Fig. 1B gezeigt und folgt der Umwandlung von Östradiol (E&sub2;) in Östron (E&sub1;) und liefert die Catecholöstrogene 2-Hydroxyöstron (OHE1) und 2- Methoxyöstron (2MeOE&sub1;), die beide minimale periphere östrogene Aktivität zeigen (Fishman, J., et al., J. BIOL. CHEM., 235: 3104-3107 (1960); Martucci, C.P., et al., ENDOCRINOLOGY, 105: 1288-1292 (1979); Jellinek, P.H., et al., ENDOCRINOLOGY, 108: 1848-1854 (1981)).
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die quantitative Erfassung und Analyse anderer Wege, einschließlich der 4-Hydroxylierungs-, 15-Hydroxylierungs- und 16α- Hydroxylierungswege, wobei die 16α-Hydroxylierung zur Bildung von 16α-Hydroxyöstron (16αOHE&sub1;) und Östriol (E3) führt, welche östrogen-agonistische Aktivität behalten (Fishman, J., et al., J. CLIN. ENDOCRINOL, METAB., 51: 611-615 (1980)). Zu den in diesem Reaktionsweg der Fig. 1A beteiligten spezifischen Enzymen gehören 17-Oxidoreduktase, welche mitwirkt bei der Umwandlung von Östradiol zu Östron, 16α-Hydroxyöstron zu Östriol, 15a- Hydroxyöstron zu 15α-Hydroxyöstradiol und von Epiöstriol zu 16-Ketoöstriol; 2- Hydroxylase, welche mitwirkt bei der Hydroxylierung von Östron zu 2-Hydroxyöstron; Catechol-O-Methyltransferase, welche mitwirkt bei der Umwandlung von 2-Hydroxyöstron in 2- Methoxyöstron; 15α-Hydroxylase, welche mitwirkt bei der Hydroxylierung von Östron zu 15α-Hydroxyöstron; 4-Hydroxylase, welche mitwirkt bei der Bildung von 4-Hydroxyöstron; und 16α-Hydroxylase, welche mitwirkt bei der Hydroxylierung von Östron zu 16α- Hydroxyöstron.
Es wurde postuliert, daß eine ähnliche Beziehung in der männlichen Säugetierpopulation existiert, da beispielsweise Männer eine höhere Mortalitätsrate von ischemischen Herzkrankheiten zeigen als im Alter entsprechende Frauen (Kuller, L.H., et al., AM. J. EPIDEMIOL, 104: 425-426 (1976); Heller, R.F., et al., BR. MED. J., 1: 472-474 (1978), Kannel, W.B., et al., ANN. INTERN. MED., 85: 477-452 (1976); Bush, T.L., et al., EPIDEMIOL. REV., 7: 80- 104 (1985)). Zusätzlich steigt das Auftreten von Herzkrankheiten bei Frauen wesentlich nach der Menopause, übereinstimmend mit der Abnahme der ovarialen Östrogenproduktion (Kannel, W.B., et al., ANN. INTERN. MED. 85: 477-452 (1976)). Diese epidemiologischen Daten weisen auf Östrogen als einen Schutzfaktor gegen Herzkrankheit (Bush, T.L., et al., EPIDEMIOL. REV., 7: 80-104 (1985)). Frauen vor der Menopause haben einen größeren Mittelwert von hochdichtem Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C) als im Alter entsprechende Männer (Rifkind, B.M., et al., LIPIDS, 14: 105-112 (1979); Conner, S.L., et al., CIRCULATION, 65: 1290-1298 (1980); Wahl, P.W., et al., ATHEROSCLEROSIS, 39: 111- 124 (1981)), außer unter solchen androgenisierenden Bedingungen wie polycystischem Ovarsyndrom (Wild, R.A., et al., J. CLIN. ENDOCRINOL. METAB., 61: 946-951 (1985)). Die Gabe von Östrogen bewirkt sowohl bei Männern als auch bei Frauen günstige Veränderungen in den Lipoproteinen mit erhöhtem HDL-C und verringertem Low-Density-Lipoprotein- Cholesterin (LDL-C) und Gesamt-Cholesterin.
Als Ergebnis der obigen Erkenntnisse und wie bestätigt durch die Ergebnisse der im folgenden in den Beispielen 1 bis 5 dargelegten Untersuchungen wurde gefunden, daß der Index oder Quotient der Produkte des enzymatischen Metabolismus von Östrogen sich mit dem Vorhandensein und Ausmaß von Krankheitszuständen verändert und von anderen systemischen Faktoren genügend unabhängig ist, daß er als ein verläßlicher Indikator von Krankheitszuständen dienen kann.
Die Krankheitszustände, deren unspezifisches Vorhandensein durch die Erfindung identifiziert wird, schließen ein Osteoporose, Endometriose, Übergewicht (Obesity), Atherosklerose, Endometriumkarzinom, Mammakarzinom, Herzinfarkt, myokardialer Infarkt, Trauma, vaskulare Thrombose, Unfruchtbarkeit, gastrointestinale Krankheiten, Autoimmunkrankheiten, Krankheiten des zentralen Nervensystems usw. und jeden Krankheitszustand oder Zustand, der den Östrogenmetabolismus eines Säugetiers beeinflußt, wobei vom Fachmann verstanden wird, daß der spezifische Krankheitszustand, oder Zustand, der in einem getesteten Säugetier existiert, nach einer positiven Bestimmung des Vorhandenseins eines Krankheitszustands oder Zustands gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren im allgemeinen qualifiziert wird. Der Ausdruck "Säugetiere" wie hier gebraucht, umfaßt sowohl homo sapiens als auch Nutztiere, z. B. Rennpferde.
Die Erfindung betrifft auch verschiedene diagnostische Anwendungen, einschließlich Methoden zur Bestimmung des Vorliegens einer Krankheit durch Bezugnahme auf die Möglichkeit, Abweichungen im Östrogenmetabolismus festzustellen, welche durch das Vorhandensein verschiedener Krankheitszustände in Säugetieren beeinflußt werden. Die vorliegende Methode kann auch verwendet werden, um solche Vorkommnisse zu verfolgen, welche direkt mit dem Niveau der Östrogenmetaboliten zusammenhängen, wie die männliche und weibliche Fruchtbarkeit der Spezies und der Verlauf von Schwangerschaft. Die Methode kann daher verwendet werden als ein Hilfsmittel für die Therapie von Impotenz oder Unfruchtbarkeit oder bezüglich möglicher Unregelmäßigkeiten während der Schwangerschaft, des weiblichen Menstruationszyklus oder zu Beginn oder während der Menopause. Wie oben erwähnt, können die Östronmetaboliten verwendet werden, um durch verschiedene bekannte Verfahren Antikörper zu erzeugen, und solche Antikörper können dann isoliert und beispielsweise in Tests auf Abweichungen im Östrogenmetabolismus in Säugetieren verwendet werden, wo man solche vermutet.
Ein oder mehrere Antikörper für Metaboliten können nach Standard-Methoden hergestellt und isoliert werden, einschließlich der bekannten Hybridoma-Methoden. Eingeschlossen sind sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper, jedoch werden monoklonale Antikörper bevorzugt. Monoklonale Antikörper können hergestellt werden gemäß den Anweisungen von Kohler, G., et al., NATURE 256: 495-497 (1975), wobei diese Referenz hier nur zur Illustration zitiert wird und nicht als Einschränkung. Besonders können Antikörper hergestellt werden, welche mit mehr als einem Metaboliten über Kreuz reagieren (cross-react) und beispielsweise kann ein monoklonaler Antikörper hergestellt werden, der an E&sub3; und 16OHE&sub1; bindet, um Verhältnisse zu bestimmen, die teilweise auf 16OHE&sub1; und E&sub3; beruhen. Zur Vereinfachung werden der oder die Antikörper für Östronmetaboliten hier als Ab&sub1; und der(die) Antikörper für eine andere Spezies als Ab&sub2; bezeichnet.
Die Gegenwart von Östronmetaboliten in Säugetieren kann durch die üblichen immunologischen Verfahren, die für solche Bestimmungen anwendbar sind, bestimmt werden. Eine Anzahl brauchbarer Verfahren sind bekannt. Vier solcher Verfahren, die besonders brauchbar sind, verwenden entweder den mit einer erkennbaren Markierung markierten Östronmetaboliten, den mit einer erkennbaren Markierung markierten Antikörper Ab&sub1; oder den mit einer erkennbaren Markierung markierten Antikörper Ab&sub2; oder ein chemisches Konjugat mit dem Hydroxylierungsprodukt von Östron, das mit einer erkennbaren Markierung markiert ist. Die Verfahren können summarisch durch die folgenden Gleichungen angegeben werden, worin der Stern angibt, daß das Teilchen markiert ist und "OHE" in diesem Fall für alle Östronmetaboliten steht:
A. OHE* + Ab&sub1; = OHE*Ab&sub1;
B. OHE + Ab&sub1;* = OHEAb&sub1;*
C. OHE + Ab&sub1; + Ab&sub2;* = OHEAb&sub1;Ab&sub2;*
D. Träger*OHE + Ab&sub1; = Träger*OHEAb&sub1;
Die Verfahren und deren Anwendung sind alle dem Fachmann bekannt und werden hier nur zur Erläuterung und ohne Einschränkung von Verfahren angegeben, die erfindungsgemäß angewandt werden können. Das "kompetitive" Verfahren A ist beschrieben in den USA- Patenten Nr. 3,654,090 und 3,850,752. Verfahren C, das "Sandwich"-Verfahren, ist beschrieben in den USA-Patenten Nr. RE 31,006 und 4,016,043. Noch andere Verfahren sind bekannt, wie das "Doppel-Antikörper" oder "DASP"-Verfahren. Ein weiteres diagnostisches Verfahren verwendet mehrfach markierte Verbindungen in einer einzigen Lösung für simultanes Radioimmungssay. In diesem Verfahren, das im USA-Patent 4,762,028 für Olson beschrieben ist, kann eine Zusammensetzung von zwei oder mehr Analyten in einer Koordinationsverbindung mit der Formel Radioisotop-Chelator-Analyt hergestellt werden.
In jedem Fall bildet das Hydroxylierungsprodukt von Östron mit einem oder mehreren Antikörper(n) oder Verbindungspartnern Komplexe, und ein Teil des Komplexes ist mit einer erkennbaren Markierung markiert. Die Tatsache, daß ein Komplex gebildet wurde und falls gewünscht dessen Menge, kann bestimmt werden durch bekannte Verfahren, die für die Erfassung von Markierungen anwendbar sind.
Wie aus dem obigen ersichtlich, ist eine charakteristische Eigenschaft von Ab&sub2;, daß es mit Ab&sub1; reagiert. Das beruht darauf, daß Antikörper, die in einer Säugetierspezies erzeugt wurden, in einer anderen Spezies als ein Antigen verwendet wurden, um Antikörper wie Ab&sub2; zu erzeugen. Beispielsweise kann Ab&sub2; in Ziegen unter Verwendung von Kaninchen-Antikörpern als Antigenen erzeugt werden. Ab2 wäre damit ein Anti-Kaninchen-Antikörper, der in Ziegen erzeugt ist. Für die Zwecke dieser Beschreibung und Ansprüche wird Ab&sub1; als ein primärer oder Anti-Östrogenmetabolit-Antikörper und Ab&sub2; als ein sekundärer oder Anti-Ab&sub1;- Antikörper bezeichnet.
Die für diese Untersuchungen zumeist verwendeten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht fluoreszieren und andere.
Eine Anzahl von fluoreszierenden Materialien sind bekannt und können als Markierungen verwendet werden. Dazu gehören beispielsweise Fluorescein, Rhodamin und Auramin. Ein besonderes Detektormaterial ist ein in Ziegen erzeugter Anti-Kaninchen-Antikörper, der durch ein Isothiocyanat mit Fluorescein konjugiert ist.
Die hydroxylierten Produkte von Östron oder Träger derselben oder ein oder mehrere Bindungspartner derselben können auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert werden. Die radioaktive Markierung kann durch irgendeine der gegenwärtig verfügbaren Zählmethoden erfaßt werden. Die bevorzugten Isotope können ausgewählt werden aus ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I, &sup5;&sup7;Co, &sup5;&sup9;Fe und ³&sup5;S.
Auch Enzymmarkierungen sind brauchbar und können durch irgendeine der gegenwärtig verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen, thermometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Verfahren erfaßt werden. Das Enzym wird an die Östrogene oder deren Bindungspartner oder Trägermoleküle durch Reaktion mit Brückenmolekülen, wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyde und dergleichen gebunden.
Viele Enzyme, die in diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können benutzt werden. Bevorzugt sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D- Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase, Galactoseoxidase plus Peroxidase, Hexokinase plus GPDase, Glucoseoxidase plus Alkali-Phosphatase, NAD-Oxidoreduktase plus Luciferase, Phosphofructokinase plus Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Aspartatamiriotransferase plus Phosphoenolpyruvatdecarboxylase, und Alkali-Phosphatase. Auf USA- Patent Nr. 3,654,090, 3,850,752 und 4,016,043 wird beispielsweise hingewiesen wegen ihrer Offenbarung von alternativen Markierungsstoffen und Methoden. Ein besonderes Assay- System, das erfindungsgemäß entwickelt und verwendet wurde, ist bekannt als ein Rezeptorassay. In einem Rezeptorassay wird das zu prüfende Material in geeigneter Weise markiert, und es werden dann bestimmte Zelltestkolonien mit einer Menge von sowohl dem markierten als auch dem unmarkierten Material geimpft, wonach Bindungsuntersuchungen durchgeführt werden, um das Ausmaß zu bestimmen, in dem sich das markierte Material an die Zellrezeptoren bindet. Auf diese Weise kann man Unterschiede in der Affinität zwischen Materialien feststellen.
Demgemäß kann eine gereinigte Menge der hydroxylierten Produkte von Östron radiomarkiert werden und es können danach Bindungsstudien unter Verwendung von beispielsweise MCF-7 Mammakarzinomzellen (ATCC Zugangsnummer HTB 22) durchgeführt werden. Es werden dann Lösungen hergestellt, welche verschiedene Mengen von markierten und unmarkierten MCF-7-Zellproben enthalten, die geimpft und danach inkubiert werden. Die erhaltenen Zell-Monoschichten werden dann gewaschen, solubilisiert und dann in einem Scintillationszähler für eine genügend lange Zeit gezählt, um einen Standard-Fehler von unter 5% zu erhalten. Diese Daten werden dann der Scatchard-Analyse unterworfen, wonach Beobachtungen und Schlüsse bezüglich der Materialaktivität gezogen werden können. Während das vor angehend angegebene Protokoll als Beispiel dient, erläutert es die Art, wie ein Rezeptorassay durchgeführt und verwendet werden kann, in dem Fall, wo die zelluläre Bindungsfähigkeit des dem Assay unterworfenen Materials als ein Unterscheidungsmerkmal dienen kann.
Eine Abwandlung des oben beispielhaft dargestellten Rezeptorassays ist offenbart in USA- Patent 4,818,684. In diesem Assay wird ein kompetitives Protokoll verwendet, welches monoklonale Antikörper verwendet, die an einen Steroid-Rezeptor binden können, der seinerseits kompetitiv durch Antisteroid-Antikörper gebunden wird, die an das Steroid binden können. Das Assay verläuft durch den Wettbewerb zwischen den Antisteroid-Antikörpern und dem Rezeptor. Die Gegenwart oder Menge des so gebildeten monoklonalen Antikörper- Antisteroid-Antikörper-Komplexes steht in Beziehung zur Menge des in dem Assay unterworfenen Material vorhandenen Steroidrezeptors.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können kommerzielle Testpackungen, die von einem medizinischen Spezialisten verwendet werden können, hergestellt werden, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Hydroxylierungsprodukten von Östron in einem zu untersuchenden Säugetier festzustellen. Beispielsweise enthält eine Klasse solcher Packungen wenigstens eine markierte Komponente, die ausgewählt ist aus den Hydroxylierungsprodukten von Östron oder deren Bindungspartnern, beispielsweise einen dafür spezifischen Antikörper, und Anweisungen, die selbstverständlich von der gewählten Methode abhängen, z. B. "kompetitiv", "Sandwich", "DASP" und dergleichen. Die Packungen können auch zugehörige Reagenzien, wie Puffer, Stabilisatoren usw. enthalten.
Demgemäß kann eine Testpackung hergestellt werden zur Demonstration des veränderten Östrogenmetabolismus eines Säugetier-Hosts, der folgendes umfaßt:
a) eine vorbestimmte Menge von wenigstens einer markierten immunochemisch reaktiven Komponente, die durch direkte oder indirekte Bindung der vorliegenden Östronmetaboliten oder eines dafür spezifischen Bindungspartners mit einer erkennbaren Markierung erhalten wurde, wobei die Östronmetaboliten so ausgewählt sind, daß die 2- Hydroxylierungs- und 16α-Hydroxylierungswege des Östronmetabolismus verglichen werden;
b) anderen Reagenzien und
c) Anweisungen zur Verwendung der Testpackung
Spezieller kann die diagnostische Testpackung umfassen:
a) eine bekannte Menge von wenigstens einem der oben beschriebenen Östronmetaboliten (oder einem Bindungspartner), der im allgemeinen an eine feste Phase gebunden ist, um einen Immunosorbenten zu bilden, oder stattdessen an einen geeigneten Marker (Tag) gebunden ist oder jeweils eines von mehreren solcher Endprodukte usw. (oder deren Bindungspartnern);
b) falls nötig, andere Reagenzien, und
c) Gebrauchsanweisungen für die Testpackung.
In einer weiteren Abwandlung kann die Testpackung hergestellt und verwendet werden für die oben angegebenen Zwecke und gemäß einem vorbestimmten Protokoll (z. B. "kompetitiv", "Sandwich", "Doppel-Antikörper", homogenes Enzym-Immunoassay, simultanes Immunoassay mit mehreren Analyten usw.) arbeiten und umfassen:
a) eine markierte Komponente, die erhalten wurde durch Kuppeln von wenigstens einem der Östronmetaboliten an eine erfaßbare Markierung, wobei die Östronmetaboliten so ausgewählt sind, daß die 2-Hydroxylierungs- und 16α-Hydroxylierungswege des Östronmetabolismus verglichen werden;
b) ein oder mehrere zusätzliche immunochemische Reagenzien, von denen wenigstens ein Reagens ein Ligand oder ein immobilisierter Ligand ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe:
(i) ein Ligand, der mit der markierten Komponente a) binden kann;
(ii) ein Ligand, der mit einem Bindungspartner der markierten Komponente a) binden kann;
(iii) ein Ligand, der mit der oder wenigstens einer der zu bestimmenden Komponenten binden kann und
(iv) ein Ligand, der mit wenigstens einem der Bindungspartner von der oder wenigstens einer der zu bestimmenden Komponenten binden kann und
c) Anweisungen zur Durchführung eines Protokolls für die Erfassung und/oder Bestimmung von einer oder mehrerer Komponenten einer immunochemischen Reaktion zwischen den Östronmetaboliten und einem dafür spezifischen Bindungspartner.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Untersuchungen von weiblichen und männlichen Rauchern bei einer Bemühung, eine Beziehung zwischen Östrogenmetabolismus und den Krankheitszuständen der getesteten Individuen zu identifizieren. Als Ergebnis der folgenden Tests wurde die Beziehung zwischen dem Vorhandensein und Verhältnis der enzymatisch hydroxylierten Östronprodukte 2-Hydroxyöstron und Östriol identifiziert und bestätigt. Die im folgenden angegebenen spezifischen Materialien und Methoden sind nur als Beispiel an gegeben und können verändert werden, so daß das folgende nur zur Erläuterung dient und nicht als Begrenzung zu verstehen ist.

BEISPIEL 1

Im vorliegenden Beispiel wurde ein ziemlich vollständiges Profil von Östrogenmetaboliten bei Raucherinnen und Nichtraucherinnen untersucht, einschließlich Assays von 16α-OHE&sub1; und 2OHE&sub1; im Urin, sowie die klassischen Östrogene E&sub1;, E&sub2; und E&sub3;. Die erhaltenen Daten legen nahe, daß Catecholöstrogene einen signifikant größeren Anteil der gesamten im Urin gemessenen Östrogene in Raucherinnen im Vergleich mit Nichtraucherinnen bilden und führten zur Bestimmung des Catecholöstrogenindex, der den erfindungsgemäßen Quotienten umfaßt.

Materialien und Methoden

Versuchspersonen

Eine Gesamtzahl von 15 Raucherinnen und 14 Nichtraucherinnen nahm an dieser Untersuchung teil. Radiometrische Daten von einigen dieser Personen wurden in einem früheren Bericht veröffentlicht (Michnovicz, J.J., et al., N. ENGL. MED., 315: 1305-1309 (1986)). Alle Aspekte dieser Untersuchung waren genehmigt vom Rockefeller University Institutional Review Board. Die Personen waren gesunde Frauen ohne Übergewicht vor der Menopause im Alter 21-44 ohne Geschichte von vorhandener Menstruationsdysfunktion, Gebrauch oraler empfängnisverhütender Mittel, Dysthyroidismus oder ungewöhnlicher Diät. Der Körper- Massen-Index (Gewicht (kg)/Körpergröße (m)2) reichte von 19 bis 23 ohne signifikante Unterschiede in den Mittelwerten der zwei Gruppen. Alle Personen verneinten den Gebrauch von verschreibungspflichtigen oder illegalen Drogen außer gelegentlich Aspirin oder Acetaminophen für wenigstens 2 Monate vor der Untersuchung. Urinproben (30 ml) wurden erhalten zwischen 8.00 und 12.00 Uhr vor der Einleitung des radiometrischen Testens (siehe unten), welches innerhalb 12 Tagen nach dem angegebenen Beginn der Menses durchgeführt wurde. Die Raucherinnen gaben an, daß sie 15 bis 30 Zigaretten täglich rauchten, während Kontrollpersonen angaben, daß sie auf aktives Zigarettenrauchen vollständig verzichteten. Cotinin, ein hauptsächlicher Metabolit von Nikotin, war im Plasma von Nichtraucherinnen nicht nachweisbar und lag zwischen 190 und 400 ng/mL bei Raucherinnen (Assay freundlicherweise durchgeführt von Dr. Nancy Haley der American Health Foundation, Valhalla, NY).

Radioimmunoassays

Die radiomarkierten 2-Hydroxy-[6,7-³H]Östron (sp. act. 45,6 Ci/mmol), [2,4,6,7-³H]Östron (sp. act. 87,5 Ci/mmol), [2,4,6,7-³H]Östradiol (sp. act. 97,8 Ci/mmol) und [2,4,6,7-³H]Östriol (sp. act. 94,0 Ci/mmol) wurden gekauft von New England Nuclear, (Boston, MA). 16α- Hydroxy-[6,7-³H]östron (sp. act. 58 Ci/mmol) wurde wie früher beschrieben hergestellt (S. Ikegawa, et al., STEROIDS 39: 557-567 (1979)). Ascorbinsäure wurde erhalten von Sigma (St. Louis, MO). Unmarkierte E&sub1;, E&sub2; und E&sub3; wurden erhalten von Steraloids (Wilton, NH), während unmarkierte 16αOHE&sub1; und 2OHE&sub1; nach Standardmethoden synthetisiert wurden. Nichtradioaktive Steroide wurden vor dem Gebrauch umkristallisiert. Sep-pac-Patronen (Waters Assoc., Milford, MA), Glusulase (β-Glucuronidase und Aryl-Sulfatase) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), und Anti-E&sub1;-Antikörper (Endocrine Sciences, Tarzana, CA) wurden im Handel erhalten.
Antikörper für 16α-OHE&sub1;, E&sub2; und E&sub3; wurden wie oben beschreiben entwickelt (Fishman, J., et al., SCIENCE, 204: 1089-1091 (1979); Ikegawa, S., et al., J. STEROID BIOCHEM., 18: 329- a332 (1983)), während das Anti-2OHE&sub1;-Antiserum von Dr. Kanbegawa (Teikyo University, Japan) überlassen wurde und gegen Rinderserumalbumin verbunden mit 2-Hydroxyöstron-17- Carboxymethyloxim entwickelt wurde. Kreuzreaktivitäten des 2OHE&sub1;-Antiserums mit E&sub1;, E&sub2; und E&sub3;, 16α-OHE&sub1; 2MeOE&sub1; und 2-Hydroxyöstradiol (2OHE2) betrugen 1,3%, 0,6%, 0,01%, 0,03%, 0,11% bzw. 1,7%.
Jede Urinprobe (1 oder 2 ml) enthielt etwa 3000 dpm stabil markiertes Steroid, das verwendet wurde, um die Rückgewinnung zu bestimmen, und wurde zu einer C&sub1;&sub8; Sep-pac-Patrone gegeben, gefolgt von Elution mit 5 ml Methanol. Das Eluat wurde im Vakuum getrocknet und mit Glusulase 12 Stunden bei 37ºC hydrolysiert. Die hydrolysierten Steroide wurden wiederum auf einer C&sub1;&sub8; Sep-pac-Patrone extrahiert und mit 5 ml Methanol eluiert. Aliquots dieses End- Eluats wurden genommen zur Bestimmung der Rückgewinnung (durchschnittlich 90-95%) und für Duplikat-Radioimmunoassay (100 ul). Um eine Autooxidation der Catecholöstrogene zu verhindern, wurde in allen Stufen des Assays 1% Ascorbinsäure verwendet. Radiomarkierte Steroide und Antiseren wurden über Nacht bei 4ºC mit den Proben inkubiert, und die Radioaktivität wurde mit einem Scintillationszähler Packard Modell 3000 gemessen. Die Östrogenniveaus sind ausgedrückt relativ zur Kreatinin-Konzentration im Urin. Die statistische Analyse wurde mit einem ungepaarten t-Test durchgeführt. Soweit nicht anders angegeben, sind alle Werte als Mittelwerte ± SEM angegeben.

Radiometrisches Testen

Die radiometrische Methode wurde bereits früher im einzelnen beschrieben (Michnovicz, J. J., et al., N. ENGL. J. MED., 315: 1303-1309 (1986); Fishman, J., et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 77: 4957-4960 (1980)). Kurz gesagt erhielten die Testpersonen intravenös 6 uCi [2-³H]Östradiol (NEN, sp. act. 25,3 Ci/mmol). Blut- und Urinproben wurden im Verlauf der nächsten 48 Stunden gesammelt, lyophilisiert und auf ³H&sub2;O gezählt. Das Ausmaß der Reaktion wurde berechnet, indem man die ³H-spezifische Aktivität des gesamten Körperwasservolumens durch die Menge des ³H in der zugeführten Dosis dividierte.

Ergebnisse

Die Mengen der verschiedenen Östrogenmetabolite im Urin von Raucherinnen und Nichtraucherinnen sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben, zusammen mit dem Ausmaß der 2- Hydroxylierung, wie sie durch das radiometrische Verfahren für jede Versuchsperson bestimmt wurde. Die gesamte Östrogenausscheidung, definiert als die Summe der gemessenen Metaboliten im Urin in diesen Zufallsproben der Follikularphase unterschied sich nicht wesentlich zwischen Raucherinnen und Nichtraucherinnen (55,3 ± 4,2 gegenüber 51,7 ± 4,5 ug/g Kreatinin). Obgleich versucht wurde, alle Urinproben innerhalb von 12 Tagen nach dem angegebenen Beginn der Menses zu sammeln, erschien die Östrogenausscheidung bei einigen Versuchspersonen etwas höher als der Durchschnitt, was nahelegt, daß diese Personen sich dem präovulatorischen Anstieg im Plasmaöstradiol näherten. Dennoch ist deutlich, daß Rauchen im allgemeinen einen geringen Einfluß auf die gesamte mittelfollikulare Östrogenausscheidung hatte. Tabelle 1 zeigt, daß der radiometrisch gemessene durchschnittliche Grad der Östradiol-2-Hydroxylierung bei Raucherinnen um etwa 50% erhöht war (51,6 ± 2,7 gegenüber 33,3 ± 1,7%). Tabelle 1 Vergleich des Östrogenmetabolismus bei Raucherinnen und Nichtraucherinnen
Die Werte sind Mittelwerte ± SEM; NS = Nicht nachweisbar
* Östrogenmetabolite ausgedrückt in ug/g Kreatinin
2OHE&sub1; im Urin war signifikant erhöht bei Raucherinnen im Vergleich mit Nichtraucherinnen (17,2 ± 2,4 gegenüber 9,4 ± 1,2 ug/g Kreatinin P < 0,02). Eine parallele Verringerung von E&sub3; im Urin wurde auch bei Raucherinnen beobachtet (10,7 ± 1,1 gegenüber 15,6 ± 1,8 ug/g Kreatinin P < 0,05). Dagegen wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet in den Niveaus von E&sub2;, E&sub1; oder 16αOHE&sub1; im Urin. Als ein Ergebnis dieser veränderten Urinniveaus stellte 2OHE&sub1; bei Raucherinnen 31,1% der gesamten gemessenen Östrogene dar, im Vergleich mit nur 18,2% bei Nichtraucherinnen. Eine erhöhte Ausscheidung von 2OHE&sub1; trat so weitgehend auf auf Kosten einer verringerten Ausscheidung des 16α-hydroxylierten Metaboliten E&sub3;.
Verschiedene Verhältnisse von 2-hydroxylierten zu 16α-hydroxylierten Metaboliten wurden untersucht als ein Mittel zur Differenzierung der Urinprofile von Raucherinnen und Nichtraucherinnen. Ein Urin-Catecholöstrogenindex definiert durch [2OHE&sub1;]/[E&sub3;], wurde gewählt als ein Verhältnis der hauptsächlichen Metabolite von jedem Weg.
Fig. 2A zeigt die scharfen Unterschiede im Catecholöstrogenindex zwischen den zwei Gruppen, während die Werte für Nichtraucherinnen eng um den Mittelwert von 0,59 ± 0,08 (Bereich 0,15 bis 1,10) gruppiert sind, sind die Mittelwerte für Raucherinnen signifikant erhöht auf 1,67 ± 0,21 (Bereich 0,80 bis 2,82, P < 0,001). Zwischen den zwei Gruppen bestand auch nur geringe Überlappung, und Werte für mehrere Raucherinnen waren 3 bis 5 mal größer als der Mittelwert für Nichtraucherinnen.
Die Östrogenverhältnisse im Urin waren über den Menstruationszyklus verhältnismäßig relativ konstant trotz großer Veränderungen der Östrogenproduktion. Beispielsweise waren bei zwei Frauen, bei denen Urinproben an jedem Tag eines normalen Menstruationszyklus genommen wurden, die Mittelwerte ± SEM (n = 27 und 30) der verschiedenen Östrogenverhältnisse für jede Testperson wie folgt:
[2OHE&sub1;]/(ΣGesamt] 0,165 ± 0,004 und 0,155 ± 0,004; [16αOHE&sub1; + E&sub3;]/[ΣGesamt] 0,391 ± 0,012 und 0,485 ± 0,007; [2OHE&sub1;]/[E&sub3;] 0,689 ± 0,034 und 0,433 ± 0,014.

Diskussion

Die obigen Daten zeigen für Frauen vor der Menopause, daß die Muster der mitt-follikularen Östrogenausscheidung im Urin von Raucherinnen sich signifikant unterscheiden von denen von Nichtraucherinnen. Die hauptsächliche Abweichung betrifft erhöhte 2OHE&sub1;- Ausscheidung und entsprechend verringerte E&sub3;-Ausscheidung unter Raucherinnen, wobei keine signifikante Differenz im Gesamtwert dieser 5 gemessenen Östrogene auftrat. Diese Daten stimmen überein mit den früheren Befunden von radiometrisch gemessener erhöhter Östrogen-2-Hydroxylierung bei Raucherinnen (Michnovicz. J.J., et al., N. ENGL. J. MED., 315: 1305-1309 (1986)).
MacMahon et al., (N. ENGL. J. MED., 307: 1062-1065 (1982)) berichteten bereits, daß Zigarettenraucherinnen verringerte Ausscheidung von E&sub2;, E&sub1; und E&sub3; im Urin während der lutealen, jedoch nicht der follikularen Phase des Menstruationszyklus hatten. Sie schlossen daraus, daß Raucherinnen in der lutealen Phase eine verringerte Östrogenproduktion hatten. Die vorliegende Untersuchung zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Gesamtöstrogenausscheidung im Urin in der follikularen Phase auf. Jedoch zeigt die Verschiebung in Richtung auf Catecholöstrogenausscheidung bei Raucherinnen, daß der Ausschluß von 2OHE&sub1; von der früheren Analyse eine genaue Schätzung der Gesamtöstrogenproduktion verhinderte. Die vorliegenden Daten zeigen, daß von den klassischen Östrogenen nur E&sub3; in der follikularen Phase von Raucherinnen verringert wird. Da sich die relativen Verhältnisse der verschiedenen Metaboliten während des Menstruationszyklus nicht wesentlich verändern, sollte der Unterschied voraussichtlich sowohl in der follikularen wie auch in der lutealen Phase beobachtet werden.
Die Entdeckung und Analyse des Catecholöstrogenindex im Urin [2OHE&sub1;]/[E&sub3;] legt nahe, daß nach Zufallskriterien gesammelte Urinproben eine zuverlässige Abschätzung von erhöhter 2-Hydroxylierung in ausgewählten Populationen liefern können. Urinassays würden die Notwendigkeit beseitigen, radiometrische in vivo-Tests durchzuführen, wenn 2- und 16α- Hydroxylierung in Populationen verglichen werden, bei denen man eine Differenz im Östrogenmetabolismus vermutet. Obgleich Östrogenverhältnisse im Urin, wie [2OHE&sub1;]/[E&sub3;] empfindlich auf Inter- und Intra-Assay-Schwankungen reagieren (typischerweise 5 bis 10%) (Fishman, J., et al., SCIENCE, 204: 1089-1091 (1979)), sollten signifikante Unterschiede in den Mittelwerten von gut definierten Populationen immer noch deutlich werden, wie bei diesen weiblichen Rauchern vor der Menopause im Vergleich mit zugeordneten (matched) Nichtrauchern. Kombinierte radiometrische und Urin-Assays bei Männern haben auch die Brauchbarkeit des Catecholöstrogenindex gezeigt (Michnovicz, J.J. et al. METABOLISM 38: 537-541 (1989)).
Das obige Experiment konnte nicht 2MeOE&sub1; im Urin messen, welches ein anderer, möglicherweise wichtiger Metabolit im 2-Hydroxylierungsweg ist (siehe Fig. 1). Dennoch legen veröffentlichte Daten nahe, daß die relativen Mengen dieses Metaboliten im Urin von Frauen vor der Menopause nur etwa 10 bis 15% des 2OHE&sub1; betragen (Adlercreutz, H., et al., J. STEROID BIOCHM., 24: 289-296 (1986)). So ist es unwahrscheinlich, daß Veränderungen in der Ausscheidung dieses Metaboliten bei Raucherinnen die Gültigkeit des Catecholöstrogenindex im Urin beeinträchtigen, der nur durch [2OHE&sub1;]/[E&sub3;] definiert ist, um Unterschiede im Metabolismus zwischen ausgewählten Populationen aufzuzeigen.
Obgleich sowohl Rauchen als auch Übergewicht möglicherweise die Östrogenproduktion beeinflussen, können die oben erwähnten Metabolismus-Veränderungen auch hormonabhängige Krankheitszustände bei Menschen verändern. Zusätzlich zu Rauchen und verändertem Körpergewicht gehören zu anderen Faktoren, welche die 2-Hydroxylierung bei Menschen beeinflussen kurzzeitige (Anderson, K.E., et al., J. CLIN. ENDOCRINOL. METAB. 59: 103- 107 (1984)) und Langzeit-Diätveränderungen (Adlercreutz, H. et al., J. STEROID BIOCHEM. 24: 289-295 (1986)), Dysthyroidismus (Fishman, J., et al., J. CLIN. ENDOCRINOL. METAB., 25: 365-368 (1964)), und Leberkrankheiten (Zumoff, B., et al., J. CLIN. INVEST., 47: 20-25 (1968)). Die vorliegenden Studien und die daraus folgende Identifizierung des Quotienten oder Index gemäß Erfindung erhellen die Steuerung des Östrogenmetabolismus und sollten nützlich sein bei der Formulierung sichererer therapeutischer Maßnahmen mit dem Ziel der Risikoverringerung für mit Östrogen zusammenhängende Krankheitszustände.

BEISPIEL 2

In dieser Reihe von Versuchen wurden Gruppen von männlichen Rauchern und Nichtrauchern durch Analyse des Catecholöstrogenindex im Urin gemäß der Erfindung in Verbindung mit in vivo-radiometrischer Analyse zur Bestätigung untersucht. Die Verfahren und Ergebnisse der Versuche sind im folgenden dargelegt.

Materialien und Methoden

Personen

Alle untersuchten Personen (n = 36) waren gesunde, nicht übergewichtige Männer im Alter von 19 bis 57 Jahren ohne Gebrauch von Arzneimitteln, außer gelegentlich Aspirin oder Acetaminophen. Alle Verfahren wurden genehmigt vom Rockefeller University Institutional Review Board und wurden durchgeführt, nachdem der informierte Teilnehmer schriftlich zugestimmt hatte. Die physische Untersuchung und Routine-Blutuntersuchungen waren für jede Person normal. Es wurde keinen signifikanten Unterschiede im mittleren Alter, Gewicht, Größe oder Körpermassenindex zwischen den Rauchern und Nichtrauchern gefunden (Tabelle 2). Nichtraucher verneinten aktives Rauchen und Raucher wurden nur eingeschlossen, wenn sie die tägliche Inhalation von wenigstens 15 Zigaretten (Mittel 24 ± 4; Bereich 15 bis SS) berichteten. Tabelle 2 Klinische Daten von 20 Rauchern und 16 Nichtrauchern (Kontrolle)
Um Östradiol-2-Hydroxylierung radiometrisch zu messen, (Fishman, J., et al., PROC. ACAD. SCI. USA, 77: 4957-4960 (1980); Michnovicz, J.J., e al., N. ENGL. J. MED., 315: 1305-1309 (1986)), erhielt jeder Teilnehmer intravenös 6 uCi [2-³H]-Östradiol (New England Nuclear Corporation, Boston; spezifische Aktivität 25,3 Ci/mmol). Blut- und Urinproben, die während der nächsten 48 Stunden gesammelt wurden, wurden lyophilisiert und auf 3H&sub2;O gezählt. Das Ausmaß der Reaktion für jeden Teilnehmer wurde berechnet, indem man das gesamte im Körperwasservolumen vorhandene ³H dividierte durch das als [2-³H]-Östradiol zugeführte ³H. Das Körperwasservolumen wurde bestimmt unter Verwendung einer bioelektrischen Impedanzvorrichtung (Modell BIA-103, RJL Systems, Detroit).
Cotinin, ein Hauptmetabolit von Nikotin und ein biochemischer Marker von Tabakverbrauch wurde durch Radioimmunoassay gemessen (Haley, N.J., AM. J. PUBLIC HEALTH, 73: 1204-1207 (1983)). Mit einer Assay-Empfindlichkeit von 0,4 ng/ml war Cotinin im Serum aller Nichtraucher nicht nachweisbar und betrug von 89 bis 487 ng/ml des Serums bei den Rauchern.
Zufallsurinproben (30 ml), die zwischen 8 und 12 Uhr morgens vor dem radiometrischen Test erhalten waren, wurden für spätere Analyse bei -60ºC in Gegenwart von Ascorbinsäure (1%) gelagert. Gefrorene Urinproben waren nicht verfügbar für Assay bei drei der Teilnehmer (zwei Raucher und ein Nichtraucher). Radioimmunoassays von Östrogenmetaboliten im Urin wurden nach enzymatischer Hydrolyse von Konjugaten durchgeführt, wie früher beschrieben (Michnovicz, J.J., et al., STEROIDS, 52 (1988)). Die Interassay-Koeffizienten der Variabilität für die Östrogenassays im Urin schwankten zwischen 5,0% und 10,0%. Die statistische Signifikanz wurde bestimmt unter Verwendung von Student's t Test, und alle Werte sind angegeben als Mittel ± SEM, soweit nicht anders angegeben.

Ergebnisse

Die Ergebnisse des radiometrischen Assay bei Rauchern und Nichtrauchern sind in Fig. 3A dargestellt. Der durchschnittliche Grad der Östradiol-2-Hydroxylierung bei 16 Nichtrauchern (NS) war 24,6% ± 1,9% der zugeführten Dosis. Für die 20 Raucher (S) lag der Grad der Reaktion bei durchschnittlich 43,4 ± 1,9%, ein Anstieg von ungefähr 70% (p < 0,001). Die Cotinin-Niveaus bei den Rauchern lagen durchschnittlich bei 242 ± 22 ng/ml (Bereich 89 bis 487 ng/ml). Einzelne Cotinin-Werte korrelierten nicht gut mit dem Ausmaß der 2-Hydroxylierung in dieser Gruppe von starken Rauchern (P = 0,61).
Die in Fig. 3A dargestellten Daten zeigen, daß die Werte für 2-Hydroxylierung bei vielen Rauchern mit denen der nichtrauchenden Population überlappten. Einige schmächtige Teilnehmer rauchten über 2 Packungen pro Tag und ließen so einen höheren Grad von Reaktion erwarten (Fishman, J, et al., CLIN. PHARMACOL., THER., 22: 721-728 (1977)), waren jedoch manchmal noch im Normalbereich. Das legt die Gegenwart anderer Variabler nahe, welche den induzierenden Effekten von Tabak entgegenwirken könnten. Werte von Männern, die erheblichen Ethanolverbrauch berichteten (gewöhnlicher Verbrauch an Wochenenden wenigstens 12 Dosen Bier oder dessen Äquivalent in Spirituosen), sind in Fig. 3A mit einem größeren Kreis angegeben. Die Werte für vier der fünf dieser Teilnehmer fielen unter ihren jeweiligen Mittelwert.
Östrogenmetaboliten im Urin wurden gemessen, um zu bestimmen, ob die radiometrischen Daten sich in endogenen Östrogen-Ausscheidungsmustern widerspiegeln. Werte von Östrogenmetaboliten im Urin in beiden Populationen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Eine signifikante Erhöhung in der Ausscheidung von 2OHE&sub1; wurde bei den Rauchern gefunden (10,4 ± 1,3 ug Kreatinin gegenüber 6,3 ± 0,7, P = 0,011), sowie ein Trend zu verringertem E&sub3;, was zu der radiometrisch gemessenen metabolischen Verschiebung paßt.
Ein Catecholöstrogenindex im Urin definiert durch [2OHE&sub1;]/[E&sub3;], der wie zuvor gezeigt mit dem Ausmaß der 2-Hydroxylierung gemäß der vorliegenden Erfindung korreliert, wurde für weibliche Raucher berechnet. Dieser Index minimiert den Effekt von Veränderungen in der Absolutmenge des in einer Zufallsurinprobe vorhandenen Östrogens (Michnovicz, J.J., et al., STEROIDS, 52 (1988). Die Ergebnisse sind für beide Gruppen in Fig. 3B gezeigt. Der Durchschnitt für die Raucherinnen (S) (1,46 ± 0,19) war signifikant größer als der der Nicht raucherinnen (NS) (0,81 ± 0,11, P = 0,006). Eine stärkere Variation in diesem Verhältnis wurde unter den Raucherinnen gefunden, sowie eine erhebliche Überlappung mit den Werten der Nichtraucherinnen. Eine starke Korrelation wurde gefunden zwischen dem Catecholöstrogenindex im Urin und dem radiometrischen Reaktionsgrad von jeder Teilnehmerin (r = 0,71, P = 0,001; Fig. 4). Tabelle 3 Zusammenfassung der Östrogenmetabolite im Urin
NS bedeutet: Nicht signifikant
Östrogenmetaboliten (Mittel ± SEM) sind ausgedrückt als ug/g Kreatinin
* Dieses bedeutet die Summe von E&sub1;, E&sub2;, E&sub3;, 16αOHE&sub1; und 2OHE&sub1;.

Diskussion

Die hier berichteten radiometrischen Daten zeigen, daß die Induktion von Östradiol-2- Hydroxylierung bei Männern mit einem mäßig starken Tabakgenuß einhergeht. Die Ausscheidung von endogenem 2-Hydroxyöstrogen im Urin ist bei männlichen Rauchern signifikant erhöht, sowohl in der absoluten Menge und relativ zu Östriol, was nahelegt, daß die gesteigerte 2-Hydroxylierung die Bioverfügbarkeit der aktiven Östrogenmetaboliten 16α- Hydroxyöstron und Östriol verringert. Da 2-Hydroxyöstrogene schwache Agonisten sind (Martucci, C.P., et al., ENDOCRINOLOGY, 105: 1288-1292 (1979)), verringert ihre gesteigerte Bildung wahrscheinlich die gesamtöstrogenische Stimulierung in der Leber, die vorherrschende Stelle der 2-Hydroxylierung (Barbieri, R.L, et al., STEROIDS, 32: 529-538 (1978)).
Zusätzlich dazu, daß die Anti-Östrogeneffekte von Rauchen sowohl bei Männern als auch Frauen identifiziert werden und als die zugrundeliegenden physiologischen und biochemischen Ursachen und Folgen dieser Effekte vorgestellt werden, bestätigen die obigen Ergebnisse weiter, daß der erfindungsgemäß bestimmte Quotient eine konsistente Information hinsichtlich des Krankheitszustandes liefert, der sowohl für Männer als auch Frauen gültig und unabhängig von physiologischen Schwankungen ist.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel ist entnommen aus einer Untersuchung, die von Galbraith et al. durchgeführt wurde und hier als Referenz (3) bezeichnet ist und die Aktivität des Histamin-H&sub2;-Rezeptor- Antagonisten Cimetidin betrifft, der weithin verwendet wurde, um Magengeschwüre (ulcus pepticum) zu behandeln. Die von Galbraith et al durchgeführte Untersuchung wurde veranlaßt durch die früher bemerkte Aktivität von Cimetidin, Gynäkomastie und sexuelle Dysfunktion bei bestimmten Männern zu verursachen, in Kombination mit der gezeigten Aktivität als ein Inhibitor der von Cytochrom P-450 abhängigen Biotransformierung bestimmter Medikamente. Die Forscher versuchten demgemäß zu bestimmen, ob Cimetidin auch den von Cytochrom P-450 abhängigen Östradiolmetabolismus hemmt.
Die Untersuchung umfaßte die radiometrische Analyse von Urin- und Serumproben, die von neun normalen männlichen Freiwilligen genommen waren, die über eine Periode von zwei Wochen zwei mal täglich orale Dosen von 800 mg pro Dosis Cimetidin erhalten hatten. Die Untersuchung zeigte, daß während dieser Zeit die 16α-Hydroxylierung des Östradiols nicht beeinflußt war, jedoch nahm die Ausscheidung von 2-Hydroxyöstron im Urin um ungefähr 25% (P < 0,0002) ab, und die Serumkonzentration des Östradiols stieg um ungefähr 20% an (P < 0,04).
Eine Prüfung dieser Untersuchung und besonders von Tabelle 2 auf Seite 271 derselben zeigt den Vorhersagewert des aus dem Verhältnis [2OHE&sub1;]/[E&sub3;] bestimmten Index. Diese Tabelle 2 ist hier als Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle 4 Wirkung von Cimetidin auf die Ausscheidung von Östrogenen* im Urin
* Zeitbestimmte Morgenurinproben wurden gesammelt und assayed, wie in Methoden beschrieben, vor und nach der Behandlung mit Cimetidin (800 mg oral, 2 mal täglich während 14 Tagen). Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwerte ± SEM, die Anzahl der Messungen betrug neun in jedem Fall.
** Die P-Werte wurden berechnet unter Verwendung von gepaarten Student t-Tests, NS bedeutet nicht signifikant.
*** Die Gesamtöstrogene umfassen Östron, Östradiol, Östriol, 16α-Hydroxyöstron und 2- Hydroxyöstron.
Wie in dem Artikel von Galbraith et al. bemerkt, war das Verhältnis von 2-Hydroxyöstron zu Östriol nach Cimetidin-Behandlung um etwa 40% verringert. Die Autoren stellen weiterhin fest, daß Cimetidin anscheinend therapeutischen Wert bei der Hemmung ven östrogenabhängigen Krankheitszuständen hat. Die obigen Daten sind hier dargelegt, um zu bekräftigen, daß der erfindungsgemäße Index und Quotient einen Vorhersagewert hinsichtlich Krankheitszuständen aufweist, der über das Ausmaß und die Fälle hinausgeht, die in den Beispielen 1 und 2 angegeben sind.

BEISPIEL 4

Dieser Versuch ist einer Veröffentlichung von Michnovicz und Galbraith entnommen, die hier als Referenz (4) aufgeführt ist. In diesem Fall untersuchten die Autoren die Wirkung einer kurzen Periode von Hyperthyroidismus auf die Östradiolhydroxylierung sowohl an der C- 2 als auch an der C-16α-Position. Es wurde ein in vivo-radiometrisches Assay mit gesunden männlichen Freiwilligen verwendet, und eine zweiwöchige Behandlung mit Thyroxin (4,3 mcg/kg/d) wurde durchgeführt. Während das primäre Ziel dieser Untersuchung zeigte, daß der C-2-Weg gesteuert werden kann, während der C-16α-Weg gebrochen erscheint, zeigen die gesammelten und in Tabelle 1 der Publikation auf deren Seite 23 analysierten Daten wiederum in kumulativer Form die Gültigkeit und den möglichen Wert des Index von [2OHE&sub1;]/[E&sub3;]. Diese Tabelle 1 ist im folgenden als Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5 Wirkung von Thyroxin auf Östrogenea im Urin
a Östrogenmetabolite (Mittelwerte ± SEM) sind ausgedrückt als ug Kreatinin
b Vorher: Grundlinienuntersuchung
c Nachher: Nach zwei Wochen Gabe von Thyroxin 1.5.
Wie aus der Tabelle ersichtlich, wurde eine signifikante Erhöhung des Index festgestellt, und es wurde gefunden, daß 2-Hydroxyöstron im Urin nach Thyroxingabe signifikant größer war und daß sich der Index nahezu verdoppelte, hauptsächlich infolge der erhöhten Ausscheidung von 2OHE&sub1;. Klarerweise würde ein Zustand von Hyperthyroidismus deutlich in der Erhöhung des erfindungsgemäßen Index reflektiert, so daß dieser genau zur Vorhersage dieses besonderen Krankheitszustandes dienen kann. Demgemäß sind die von Michnovicz et al. veröffentlichten Daten eine weitere Bestätigung von Umfang und Wert des erfindungsgemäßen Index.

BEISPIEL 5

In dieser kürzlich veröffentlichten Untersuchung von zwei der Erfinder dieser Anmeldung wurden bestimmte Indole in der Nahrung auf ihre Induktion von hepatischer Östradiol-2- Hydroxylierung untersucht. Im besonderen wurde Indol-3-Carbinol (I3C) Versuchspersonen mit einer Dosis von 500 mg pro Tag für eine Woche zugeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, daß I3C das Ausmaß der Östradiol-2-Hydroxylierung signifikant erhöht und daß I3C den Östradiolmetabolismus beim Menschen stark beeinflußt.
In Verbindung mit dieser Untersuchung wurden bestimmte Vergleichsdaten zwischen der Gabe von I3C an Frauen und Männer, und der Zuführung einer faserreichen Diät an Frauen ermittelt. Die Vergleichsergebnisse sind in den folgenden Tabellen 6A, 6B und 6C angegeben, wobei die Tabelle 6A die Daten von Frauen, die I3C einnehmen, Tabelle 6B die Daten von Frauen, die auf eine faserreiche Diät gesetzt waren und Tabelle 6C die Daten der Probe von Männern, denen I3C gegeben wurde, darstellen. Tabelle 6A Frauen - Einnahme von I3C (N = 5) Tabelle 6B Frauen auf faserreicher Diät (N = 6) Tabelle 6CB Männer - Einnahme von I3C (N = 7)
Die Untersuchung von Michnovicz et al. hinsichtlich Indol 3-Carbinol bestätigte frühere Daten hinsichtlich des therapeutischen und prophylaktischen Werts der Einnahme von diese Verbindung enthaltenden Lebensmitteln. In dieser Hinsicht bestätigten sowohl die I3C- Einnahme wie die faserreiche Diät, wie in den obigen nicht veröffentlichten Daten in den obi gen Tabellen 6A bis 6C dargestellt, daß I3C und hoher Fasergehalt (Ballast) Östradiol-2- Hydroxylierung stark induzieren, ähnlich der durch Rauchen auftretenden Wirkung, wie im Beispiel 1 gezeigt. Die in den Tabellen 6A bis C dargelegten Daten umfassen Vergleiche des C-2-Wegindex, der ebenso diesen therapeutischen Effekt bestätigt. So sind die hinsichtlich des Indexes in den Tabellen 6A bis 6C dargelegten Daten kumulativ und bestätigen den diagnostischen Voraussagewert des erfindungsgemäßen Index und seine entsprechende therapeutische Relevanz.
Klarerweise können die Komponenten des Index verfolgt werden und können entsprechend dem Kliniker Daten hinsichtlich des Krankheitszustands von Patienten liefern, denen ein potentielles Heilmittel, wie I3C oder Arzneimittel gegeben wird, oder Mittel, welche die Aktivität von I3C oder anderen therapeutischen Mitteln nachahmen, welche eine Wirkung auf den Östrogenmetabolismus als Teil ihres Aktivitätsprofils haben.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Krankeitszuständen in Säugetieren mit folgenden Schritten:

A) Isolieren von wenigstens zwei verschiedenen Metaboliten von Östron aus einer biologischen Probe, die von dem untersuchten Säugetier genommen ist, wobei die Metaboliten ausgewählt sind zum Vergleichen der 2-Hydroxylierungs- und 16α-Hydroxylierungswege des Östron-Metabolismus;

B) Bestimmen der Menge jedes dieser Metabolite in der Probe;

C) in Beziehung Setzen des Verhältnisses der Mengen jeder der Metabolite zueinander zur Ermittlung eines Verhältnisses der Metabolite und

D) Vergleichen des Verhältnisses mit einem äußeren Verhältnis, das entweder zuvor von dem untersuchten Säugetier oder von der Untersuchung anderer Subjekte der gleichen Spezies gewonnen wurde, um alle Abweichungen im Östrogen-Metabolismus nachzuweisen, welche das Vorhandensein der Krankheitszustände aufzeigen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Östron-Metabolite ausgewählt sind aus der Gruppe von Produkten der enzymatischen Hydroxylierung von Östron, Produkten der enzymatischen Reduktion von Östron, Produkten der enzymatischen Oxidation von Östron und Produkten der enzymatischen Methylierung von Östron.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Produkte ausgewählt sind aus der Gruppe 2-Hydroxyöstron, 4-Hydroxyöstron, 15α-Hydroxyöstron, 16α-Hydroxyöstron, 2-Methoxyöstron, Östriol, 17β-Östriol, Epiöstriol, 16-Ketoöstradiol und 15α-Hydroxyöstradiol.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zu den Produkten 2-Hydroxyöstron und Östriol gehören.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Konzentration durch chromatographische Analyse gemessen wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Konzentration durch immunochemische Analyse gemessen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Konzentration durch radiometrische Analyse gemessen wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Konzentration durch Rezeptor- Untersuchung gemessen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Krankheitszustand ausgewählt ist aus Osteoporose, Endometriose, Übergewicht, Arteriosklerose, endometrisches Carcinom, Brustcarcinom, Herzkrankheit, Unfruchtbarkeit, Krankheit des Verdauungstraktes, Krankheit des zentralen Nervensystems und Kombination derselben.

10. Verfahren zur Messung der Anwesenheit von Metaboliten von Östron in einem Säugetier bei einer Veränderung des Östrogen-Metabolismus, wobei die Metaboliten ausgewählt sind zum Vergleichen der 2-Hydroxylierungs- und 16α-Hydroxylierungswege des Östron- Metabolismus, wobei jeder Metabolit gemessen wird durch folgende Schritte:

A) Herstellen wenigstens eines Antikörpers, der spezifisch an einen Östron-Metaboliten bindet;

B) Anbringen einer detektierbaren Markierung an entweder dem Metaboliten oder dem Antikörper;

C) Immobilisieren des unmarkierten Materials des Schritts B) an einem festen Träger;

D) in Berührung Bringen des markierten Materials des Schritts B) und des immobilisierten Materials des Schritts C) mit einer biologischen Probe von einem Säugetier, in welchem die Veränderung des Östrogen-Metabolismus vermutet wird;

E) Abtrennen des markierten Materials der Stufe D), das an das immobilisierte Material gebunden ist, vom Material der Stufe D), das an das immobilisierte Material nicht gebunden ist;

F) Untersuchung des gebundenen Materials auf die Anwesenheit des markierten Materials, um durch Bezug auf einen Standard die Menge jedes der Östron-Metabolite in der Probe zu bestimmen, Korrelieren der Mengen jedes der Metabolite miteinander, um ein Verhältnis der Metabolite zu gewinnen, und Vergleichen des Verhältnisses mit einem äußeren Verhältnis, das entweder zuvor von dem untersuchten Säugetier oder vom Testen anderer Subjekte der gleichen Spezies abgeleitet wurde, um jede Veränderung im Östrogen-Metabolismus zu bestimmen und daraus das Vorhandensein eines Krankheitszustandes nachzuweisen.

11. Verfahren zum Messen der Anwesenheit von Östron-Metaboliten in einem Säugetier, in welchem eine Veränderung des Östron-Metabolismus anzunehmen ist, um diese Veränderung zu bestimmen, wobei die Metaboliten ausgewählt sind zum Vergleichen der 2-Hydroxylierung oder 16α-Hydroxylierungswege des Östron-Metabolismus, und worin jeder der Metabolite gemessen wird durch folgende Stufen:

A) Herstellen wenigstens eines entsprechenden Antikörpers, der spezifisch an einen Östron-Metaboliten bindet;

B) Anbringen einer detektierbaren Markierung an entweder dem Metaboliten oder dem Antikörper der Stufe A);

C) Kontaktieren des markierten Materials der Stufe B) und des entsprechenden Antikörpers oder des nichtmarkierten Metaboliten mit einer biologischen Probe eines Säugetiers, worin die Veränderung des Östrogen-Metabolismus vermutet wird, um eine einheitliche Mischung zu bilden, und

D) Untersuchung der Mischung der Stufe C) auf das Vorhandensein von Aktivität des markierten Materials, um durch Bezug auf einen Standard die Menge jedes der Östron- Metaboliten in der Probe zu bestimmen, Korrelieren der Mengen jedes der Metabolite miteinander, um ein Verhältnis der Metabolite zu gewinnen, und Vergleichen dieses Verhältnisses mit einem äußeren Verhältnis, das entweder zuvor von dem untersuchten Säugetier oder vom Testen anderer Subjekte der gleichen Spezies abgeleitet wurde, um jede Veränderung im Östrogen-Metabolismus zu bestimmen und daraus das Vorhandensein eines Krankheitszustandes nachzuweisen.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die Markierung ein Enzym ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe von Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase, Galaktoseoxidase plus Peroxidase, Hexokinase plus GPDase, Glukoseoxidase plus alkalische Phosphatase, NADoxireduktase plus Luciferase, Phosphorfruktokinase plus Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Aspartataminotransferase plus Phosphoenolpyruvatdecarboxylase, und alkalische Phosphatase.

14. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die Markierung ein fluoreszierender chemischer Stoff ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin der chemische Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe Fluorescein, Rhodamin und Auramin.

16. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin die Markierung ein radioaktives Element ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das radioaktive Element ausgewählt ist aus der Gruppe ¹&sup4;C, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³&sup5;S, &sup5;&sup7;Co, &sup5;&sup9;Fe und ³H.

18. Testpackung zum Nachweis eines Krankheitszustandes, bei dem eine Veränderung im Östrogen-Metabolismus auftritt, unter Verwendung von Serum, Gewebe oder wäßrigem Medium eines untersuchten Säugetiers mit folgendem Inhalt:

A) eine vorbestimmte Menge von wenigstens einer markierten immunochemisch reaktiven Komponenten, die durch die direkte oder indirekte Bindung von einem oder mehreren Östron-Metaboliten oder einem spezifischen Bindungspartner an diese an eine detektierbare Markierung erhalten wurde, wobei die Östron-Metabolite ausgewählt sind zum Vergleichen der 2-Hydroxylierungs- und 16α-Hydroxylierungswege des Östron-Metabolismus;

B) andere Reagenzien und

C) Gebrauchsanweisungen für die Packung.

19. Testpackung nach Anspruch 18, worin die Markierung ein Enzym ist.

20. Testpackung nach Anspruch 19, worin die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase, Galaktoseoxidase plus Peroxidase, Hexokinase plus GPDase, Glukoseoxidase plus alkalische Phosphatase, NADoxireduktase plus Luciferase, Phosphorfruktokinase plus Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Aspartataminotransferase plus Phosphoenolpyruvatdecarboxylase, und alkalische Phosphatase.

21. Testpackung nach Anspruch 18, worin die Markierung ein fluoreszierender chemischer Stoff ist.

22. Testpackung nach Anspruch 21, worin der chemische Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe Fluorescein, Rhodamin und Auramin.

23. Testpackung nach Anspruch 18, worin die Markierung ein radioaktives Element ist.

24. Testpackung nach Anspruch 23, worin das radioaktive Element ausgewählt ist aus der Gruppe ¹&sup4;C, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³&sup5;S, &sup5;&sup7;Co, &sup5;&sup9;Fe und ³H.

25. In-vitro-Methode zur Verfolgung des Verlaufs und der Wirksamkeit einer Arzneimittel- oder Diät-Therapie, worin eine Veränderung des Östrogen-Metabolismus auftritt, wobei die Methode des Anspruchs 1 durchgeführt wird, um das Verhältnis periodisch zu überwachen und irgendwelche Veränderungen festzustellen.