DE69028412T2 - Verfahren zum transport von molekülen in eukaryotenzellen - Google Patents
Verfahren zum transport von molekülen in eukaryotenzellenInfo
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Description
- In eukaryotischen Zellen grenzt die Kernhülle die zentralen genetischen Vorgänge der DNA-Replikation und der RNA-Synthese (d. h., der Transkription) gegeneinander ab. Der Zellkern enthält Nucleinsäuren (d. h., DNA und RNA) und verschiedene Proteine. Einige Proteine sind Strukturproteine, die an DNA binden und diese organisieren (z. B. Histone). Andere Proteine sind Regulatorproteine, die an DNA binden und so die Transkription positiv oder negativ regulieren (z. B. Aktivator- und Repressorproteine). Weitere Proteine sind Enzyme, die die DNA-Replikation und RNA- Synthese durchführen (z. B. DNA- und RNA-Polymerase).
- Gegenwärtig stehen eine Reihe von Verfahren zur Einführung von Molekülen, beispielsweise Proteine und Oligonucleotide, in Zellen zur Verfügung. Diese Verfahren sind beispielsweise für die Gentechnik und als potentielle Mittel zur Einführung von Arzneistoffen oder anderen potentiell diagnostisch, therapeutisch oder prophylaktisch nützlichen Substanzen in Zellen interessant.
- Verwendbare gentechnische Transferverfahren sind beispielsweise eine Membranfusion (z. B. Fusion von Zellen mit anderen Zellen oder mit Liposomen), Inkubation von Zellen mit einem Calciumphosphat-gefällten DNA-Fragment, DEAE- Dextran-vermittelte Transfektion, Elektroporation, direkte intrazelluläre Mikroinjektion von DNA-Fragmenten (z. B. mit Glaskapillaren) und Infektion von Zellen mit modifizierten Vektoren (z. B. viralen Vektoren).
- Sämtliche Verfahren können zur Einführung von genetischem Material in gezüchtete Zellen nur in vitro verwendet werden. Ferner sind diese Verfahren unzuverlässig und unspezifisch. Nicht alle Zellen werden verändert und viele Zellen überleben härtere Behandlungen nicht. Außerdem werden diese Verfahren nur zum Transfer von Nucleinsäuren (z. B. DNA oder RNA) in Zellen verwendet.
- Gegenwärtig gibt es kein einfaches Verfahren zur direkten in vitro- oder in vivo-Einführung von beliebigen Molekülen (z. B. Proteine oder Peptide und Nucleinsäuren) in den Zellkern. Es wäre sehr nützlich, wenn derartige Moleküle zuverlässig und spezifisch in den Zellkern eingeführt werden könnten.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des HIV-tat-Proteins (tat-Protein) zur in vitro- oder in vivo-Einschleusung eines gewünschten Moleküls in eukaryotische Zellen, besonders in den Zellkern. Sie betrifft ferner Konjugate, die ein gewünschtes Molekül und ein HIV-tat-Protein umfassen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem unerwarteten Befund, daß ein extrazellulär vorhandenes tat-Protein von Zellen leicht aufgenommen und spezifisch in den Zellkern eingeführt wird, was durch die Tatsache nachweisbar ist, daß die mit tat behandelten Zellen hohe Transaktivierungsniveaus zeigen.
- Im erfindungsgemäßen Verfahren werden ein gewünschtes Molekül und das tat-Protein mit Zellen, in die das gewünschte Molekül eingeführt werden soll, bei für das Eindringen in Zellen geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht. So dringen das tat-Protein und das gewünschte Molekül in Zellen ein, wobei sie spezifisch in den Kern gelangen.
- In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Konjugat aus einem gewünschten Molekül/tat-Protein, das ein gewünschtes Molekül (d. h., ein Molekül, das in Zellen eingeführt werden soll) und das tat-Protein umfaßt, mit Zellen, in die das gewünschte Molekül eingeführt werden soll, bei für seine Einführung in Zellen geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht. So dringt das Konjugat in Zellen ein, wobei es spezifisch in den Kern gelangt.
- In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das in Zellen einzuschleusende Molekül ein Protein, Peptid oder Oligonucleotid. Das vorliegende Verfahren ist besonders nützlich zur Einschleusung von Proteinen oder Peptiden in den Zellkern, beispielsweise von regulatorischen Faktoren, Enzymen, Antikörpern, Arzneimitteln oder Toxinen sowie DNA oder RNA.
- Ein Stabilisierungsmittel, das zur Erhöhung der tat-Stabilität und Aufnahme verwendet werden kann, kann zusammen mit dem gewünschten Molekül und dem tat- Protein mit Zellen in Kontakt gebracht werden. Beispielsweise können Metallionen, die an das tat-Protein binden und seine Stabilität und Aufnahme erhöhen, dazu verwendet werden.
- In einer anderen Ausführungsform wird zur Erhöhung der Aufnahme durch Zellen ein lysosomotrophes Mittel zusammen mit dem tat-Protein und einem gewünschten Molekül extrazellulär bereitgestellt. Das lysosomotrophe Mittel kann allein oder zusammen mit einem Stabilisierungsmittel verwendet werden. Lysosomotrophe Mittel, beispielsweise Chioroquin, Monensin, Amantadin und Methylamin, die bekanntermaßen die Aufnahme von tat in einigen Zellen um einige hundert Mal erhöhen, können beispielsweise dazu verwendet werden.
- In einer weiteren Ausführungsform wird zur Erhöhung der Aufnahme von tat ein basisches Peptid, beispielsweise tat 38-58 oder Protamin, mit tat und einem gewünschten Molekül extrazellulär bereitgestellt. Diese basischen Peptide können auch allein oder in Kombination oder mit Stabilisierungsmitteln oder lysosomotrophen Mitteln verwendet werden.
- Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können ein Arzneistoff oder eine andere diagnostisch, therapeutisch oder prophylaktisch nützliche Substanz in Zellen, besonders in den Zellkern, eingeführt werden.
- Figur 1 zeigt die Aminosäuresequenz des HIV-1-tat-Proteins.
- Figur 2 ist ein Dünnschichtchromatogramm (TLC), das eine durch 24-stündige Inkubation von HL3T1-Zellen in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen an tat erhaltene Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Aktivität zeigt, die ein Maß für die tat-Aufnahme ist.
- Figur 3 ist ein TLC, das die CAT-Aktivität zeigt, die durch Inkubation von HL3T1-Zellen mit 5 µg tat und einer Reihe von lysosomotrophen Mitteln erhalten wird.
- Figur 4 ist eine graphische Darstellung, die die zelluläre Aufnahme und Lage von ¹²&sup5;I-markiertem tat im Zellkern zeigt.
- Figur 5 zeigt ein Gel von Kernfraktionen von HL3T1-Zellen, die mit tat- Protein in Abwesenheit (-) oder Gegenwart (+) von Chioroquin behandelt wurden.
- Figur 6 zeigt mehrere graphische Darstellungen, die eine Chloroquin- Stimulierung der tat-Transaktivierung zeigen.
- Figur 6A ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung der Chloroquin- Konzentration auf die Aufnahme und Transaktivierung durch 2 µg tat im Medium zeigt.
- Figur 6B ist eine graphische Darstellung, die den zeitlichen Verlauf der Aufnahme und Transaktivierung durch 2 µg tat und 100 µM Chloroquin zeigt.
- Figur 6C ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung auf die Aufnahme und Transaktivierung durch mehrere tat-Konzentrationen bei 100 µM Chloroquin zeigt.
- Figur 7 ist ein TLC, das die CAT-Aktivität von H9-Lymphocyten, U937- Promonocyten und HeLa-Zellen, die mit tat-Protein in Abwesenheit oder Gegenwart von Chloroquin behandelt wurden, zeigt.
- Figur 8 ist ein TLC, das die CAT-Aktivität von HL3T1-Zellen und den Grad der Aktivierung des CAT-Reporter-Gens nach unterschiedlichen Exponierungszeiten gegen 1 µg tat + 100 µM Chioroquin zeigt.
- Figur 9 ist eine schematische Darstellung des retroviralen Vektors des Maus- Sarkomavirus (MSV), der zur Etablierung der H938-Reporter-Zellinie aus H9-Zellen verwendet wurde. Die Transkriptionsstartstellen des SV40-Promotors, der HIV- und MSV-LTRs sind durch Pfeile angegeben, und die Lage und Größe der Fragmente, die in der RNase-Analyse geschützt sind, werden durch Balken angegeben.
- Figur 10 zeigt die Ergebnisse eines RNase-Schutzexperiments in H938-Zellen unter Verwendung einer α-³²P-UTP-markierten HIV-1-LTR-Sonde, die einem 200 bp- Fragment von -120 bis +80 des viralen LTR entspricht und durch in vitro-Transkription hergestellt wurde.
- Figur 11 ist eine graphische Darstellung, die die Erhöhung der Transaktivierung in H938-Zellen nach der Zugabe von steigenden Mengen des tat 38- 58-Peptids mit 1 µg tat zeigt, wie sie als CAT-Aktivität nach einer 24-stündigen Inkubation mit Peptid und tat gemessen werden kann.
- Figur 12 ist eine graphische Darstellung, die die Transaktivierung eines tPA- Reporter-Gens unter der Kontrolle des HIV-1-LTR in HeLa.318-Zellen nach der Zugabe von exogenem tat oder einem tatE2C-Fusionsprotein zeigt.
- Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß das tat-Protein des Immunschwächevirus (z. B. HIV-1, HIV-2 und SIV) leicht in Zellen und dann in den Zellkern aufgenommen wird. tat ist ein potenter viraler Transaktivator und für die virale Replikation wesentlich. Da Proteine und Peptide üblicherweise nur schlecht in Zellen aufgenommen werden (L. A. Sternson, Ann. N. Y. Acad. Sci. 57 (1987), 19-21), ist der Befund, daß tat leicht aufgenommen wird, überraschend.
- Folglich kann das tat-Protein nun verwendet werden, um Moleküle (z B. Proteine, Peptide und Nucleinsäuren) in Zellen und besonders in den Zellkern einzuschleusen. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einschleusung eines gewünschten Moleküls in Zellen und insbesondere zur gezielten Einschleusung eines Moleküls in den Zellkern sowie ein für das Verfahren nützliches Konjugat. Jedes Molekül kann unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Zellen, speziell in den Zellkern, eingeführt werden.
- In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Konjugat aus einem gewünschten Molekül/tat-Protein, das ein an ein HIV-tat-Protein geknüpftes gewünschtes Molekül (d. h., ein Molekül, das in Zellen eingeschleust und in den Kern eingeführt werden soll) enthält, mit Zellen in Kontakt gebracht, in die das gewünschte Molekül eingeführt werden soll. Das Verfahren kann verwendet werden, um ein gewünschtes Molekül entweder in vitro oder in vivo einzuschleusen. Die Einschleusung kann beispielsweise in vitro durchgeführt werden, indem unter geeigneten Bedingungen ein Konjugat aus einem gewünschten Molekül/tat-Protein den gezüchteten Zellen zugesetzt wird, tat- oder tat-Konjugat-synthetisierende Zellen produziert werden oder eine von einer Person stammende Probe (z. B. Blut und Knochenmark) mit dem Konjugat kombiniert wird. Die in vivo-Einschleusung kann durch Verabreichung des gewünschten Moleküls und des tat-Proteins an eine Person durchgeführt werden, in der es für diagnostische, präventive oder therapeutische Zwecke verwendet werden soll.
- Nachstehend wird beschrieben: das HIV-tat-Protein, Aufnahme von tat in den Zellkern, das Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein und das Verfahren, in dem das Konjugat zur Einschleusung einer bestimmten Substanz in Zellen verwendet wird.
- Figur 1 zeigt die Aminosäuresequenz des tat-Proteins. Das vollständige tat- Protein ist 86 Aminosäuren lang und wird von zwei Exons codiert. Die 72 Reste am N- Terminus werden vom ersten Exon und die 14 Reste am C-Terminus vom zweiten Exon codiert. Das tat-Protein enthält einen stark basischen Bereich (2 Lysine und 6 Arginine von 9 Resten) und einen Cystein-reichen Bereich (7 Cysteine von 16 Resten).
- Es wird angenommen, daß der basische Bereich (d. h., Aminosäuren 49-57) für die Lokalisierung im Kern wesentlich ist (5. Ruben et al., J. Virol. 63 (1989), 1-8, und J. Hauber et al., J. Virol. 63 (1989), 1181-1187). Der Cystein-reiche Bereich vermittelt in vitro die Bildung von Metall-verbundenen Dimeren (A. D. Frankel et al., Science 240 (1988), 70-73), A. D. Frankel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 6297-6300) und ist für seine Aktivität als Transaktivator wesentlich (J. A. Garcia et al., EMBO J. 7 (1988), 3143, und M. R. Sadaie et al., J. Virol. 63 (1989), 1). Wie bei anderen regulatorischen Proteinen kann der N-terminale Bereich am Schutz gegen intrazelluläre Proteasen beteiligt sein (A. Bachmair und A. Varshavsky, Cell 56 (1989), 1019-1032).
- Es sollte beachtet werden, daß nicht alle 86 Aminosäuren des tat-Proteins für die Aufnahmeaktivität von tat erforderlich sind. Beispielsweise kann ein Proteinfragment oder ein Peptid, das weniger als 86 Aminosäuren umfaßt, das jedoch eine Aufnahme in Zellen und den Zellkern zeigt, verwendet werden (ein funktionell wirksames Fragment oder ein Teil von tat). Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, konnte gezeigt werden, daß ein tat-Protein mit den Resten 1-72 für eine Aufnahmeaktivität ausreicht und die tat-Reste 1-67 die Aufnahme eines heterologen Proteins in Zellen vermitteln. Ferner wurde gezeigt, daß auch ein synthetisches Peptid mit den tat-Resten 1-58 eine Aufnahmeaktivität aufweist. Ein tat-Peptid, das den die Einführung und Aufnahme in Zellen vermittelnden Bereich umfaßt, kann unter Verwendung von bekannten Verfahren weiter definiert werden (vgl. z. B. A. D. Frankel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7397-7401).
- Das tat-Peptid kann eine einzelne (d. h., kontinuierliche) Aminosäuresequenz im tat-Protein sein, oder es können zwei oder mehr Aminosäuresequenzen im tat-Protein vorhanden sein, die im natürlich vorkommenden Protein allerdings durch andere Aminosäuresequenzen getrennt werden. Wie hier verwendet, schließt das tat-Protein eine natürlich vorkommende, dem natürlich vorkommenden tat-Protein entsprechende Aminosäuresequenz, ihr funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalente Fragmente davon (Peptide) ein. Diese funktionellen Äquivalente oder funktionell äquivalenten Fragmente besitzen eine Aufnahmeaktivität in Zellen und in den Zellkern, die im wesentlichen der des natürlich vorkommenden tat-Proteins gleicht. Das tat-Protein kann aus natürlichen Quellen erhalten oder unter Verwendung von gentechnischen Verfahren oder einer chemischen Synthese produziert werden.
- Die Aminosäuresequenz von natürlich vorkommendem HIV-tat-Protein kann durch Zugabe, Deletion und/oder Substitution von mindestens einer im natürlich vorkommenden tat-Protein vorhandenen Aminosäure modifiziert werden, um ein modifiziertes tat-Protein (hier ebenfalls als tat-Protein bezeichnet) herzustellen. So können unter Verwendung von bekannten Verfahren ein modifiziertes tat-Protein oder modifizierte tat-Peptid-Analoge mit einer erhöhten Stabilität hergestellt werden. Daher können tat- Proteine oder -Peptide Aminosäuresequenzen aufweisen, die denen des natürlich vorkommenden tat-Proteins oder Teilen davon im wesentlichen gleichen, die mit ihm jedoch nicht identisch sind. Ferner können Cholesterin oder andere Lipidderivate dem tat- Protein zugesetzt werden, um ein modifiziertes tat mit einer erhöhten Löslichkeit in der Membran herzustellen.
- Varianten des tat-Proteins können entwickelt werden, um die intrazelluläre Lage von tat und des gewünschten Moleküls nach der Aufnahme in die Zelle oder bei der Expression in der Zelle zu modulieren. Bei einer exogenen Zugabe werden derartige Varianten so entwickelt, daß die Fähigkeit von tat erhalten bleibt, in Zellen einzudringen (d. h., die Aufnahme der Variante des tat-Proteins oder -Peptids in die Zelle gleicht im wesentlichen der des natürlich vorkommenden HIV-tat). Eine Veränderung des basischen Bereichs, der vermutlich für die Lokalisierung im Kern wesentlich ist (vgl. z B. C. V. Dang und W. M. F. Lee, J. Biol. Chem. 264 (1989), 18019-18023, J. Hauber et al., J. Virol. 63 (1989), 1181-1187, S. A. Ruben et al., J. Virol. 63 (1989), 1-8), kann beispielsweise eine cytoplasmatische oder partiell cytoplasmatische Lekalisierung von tat und damit auch des gewünschten Moleküls bewirken. Alternativ kann eine Sequenz, die an einen cytoplasmatischen Bestandteil binden kann, in tat eingeführt werden, um tat und das gewünschte Molekül im Cytoplasma zurückzuhalten oder um die Aufnahme von tat und des gewünschten Moleküls in den Kern zu regulieren.
- Bei dem Versuch zur Entwicklung eines geeigneten Tests für das tat-Protein wurden unterschiedliche Wege untersucht, um das tat-Protein in Zellen einzuführen, die ein Reporter-Gen enthielten (d. h., ein Gen, das transkribiert werden kann, um ein nachweisbares Protein, z. B. das Chloramphenicol-Acetyl-Transferase- oder CAT-Gen, zu exprimieren). "Scrape loading", wie von McNeil und Mitarbeitern beschrieben, erwies sich als ein geeignetes Verfahren, das eine quantitative und reproduzierbare Transaktivierung des HIV-1-Promotors lieferte (P. L. McNeil et al., J. Cell Biol. 98 (1984), 1556-1564). Es wird angenommen, daß "scrape loading" vorübergehend die Zellmembran schädigt, und es kann sich zwischen den Molekülen im Kulturmedium und dem Cytoplasma ein Gleichgewicht einstellen. Überraschenderweise konnte nach der Zugabe von tat zum Kulturmedium von HL3T1-Zellen (HeLa-Zellen, die das integrierte LTR-CAT-Plasmid enthielten) folgendes beobachtet werden: Die Expression von CAT vom integrierten HIV-1-Promotor erhöhte sich und war proportional zur tat- Konzentration, was anzeigt, daß tat aufgenommen wurde und den HIV-1-Promotor transaktivierte. Dieses Ergebnis war überraschend, da üblicherweise angenommen wird, daß Proteine und Peptide von Zellen kaum aufgenommen werden. L. A. Sternson, Ann. N. Y. Acad. Sci. 57 (1987), 19-21.
- Zur direkten Messung der zellulären Aufnahme wurden HL3T1-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Chloroquin mit ¹²&sup5;I-markiertem tat behandelt, und die Menge an radioaktivem tat in verschiedenen Zellfraktionen wurde ermittelt. Diese Versuche werden in Beispiel III genauer beschrieben.
- Figur 2 zeigt Meßergebnisse der CAT-Expression durch HL3T1-Zellen, die 24 Stunden mit tat-Protein in den angegebenen Konzentrationen inkubiert wurden. Die CAT-Expression vom integrierten HIV-1-Promotor erhöhte sich und war zur tat- Konzentration proportional. Es gab keine weitere Erhöhung der CAT-Aktivität nach 24 Stunden. Weitere kleine (2- bis 3fache) Erhöhungen der Aktivität wurden nach der Zugabe von 10 mM Zink oder 1 mM Cadmium beobachtet, was den Schluß zuläßt, daß die Metalle tat entweder während der Aufnahme oder später in der Zelle stabilisieren.
- Zur weiteren Untersuchung des Aufnahmevorgangs wurden dem Kulturmedium unterschiedliche lysosomotrophe Mittel zugesetzt. Es wird angenommen, daß lysosomotrophe Mittel die Rezeptor-vermittelte Endocytose hemmen (I. Mellman et al., Ann. Rev. Biochem. 55 (1986), 663-700).
- Figur 3 zeigt die Wirkung, die eine Reihe von lysosomotrophen Mitteln auf die Aufnahme und anschließende Transaktivierung durch tat in einem Gewebekulturmedium aufweist. HL3T1-Zellen wurden 24 Stunden mit 5 µg tat (100 nM) und jeweils einem der Mittel ihkubiert. Das Medium wurde ausgetauscht und nach 60 Stunden die CAT-Aktivität ermittelt. Die Aktivität von unbehandelten Zellen, von mit tat allein ihkubierten Zellen und von mit Chioroquin allein ihkubierten Zellen sind ebenfalls dargestellt. Der Grad der Aufnahme und anschließenden Transaktivierung von 5 µg tat zusammen mit Chloroquin in HL3T1-Zellen war im Vergleich zu unbehandelten Zellen etwa 7000fach höher, während Chloroquin nur eine geringe Erhöhung der Promotoraktivität in Abwesenheit von tat lieferte. Monensin, Amantadin und Methylamin erhöhten die Transaktivierung ebenfalls signifikant, während Ammoniumchlorid die Aktivität nur leicht erhöhte. Kein getestetes lysosomotrophes Mittel aktivierte den Promotor in Abwesenheit von tat signifikant. Die Parameter der Chloroquin-stimulierten tat-Aktivität sind in Beispiel IV genauer erläutert.
- Figur 4 zeigt, daß innerhalb von 6 Stunden nach der Behandlung von HL3T1- Zellen mit tat und Chloroquin eine signifikante Menge an radioaktivem tat (etwa 3 % der Gesamtmenge) von den Zellen aufgenommen wurde. Das meiste tat (< 80 %) wurde in der Kernfraktion lokalisiert. Trypsin-empfindliche Zerfälle, die an die Zelloberfläche gebundenes tat darstellen, blieben relativ konstant und stellten nach 12 Stunden weniger als 20 % im Vergleich zu den im Kern festgestellten Zerfallen dar.
- Figur 5 zeigt Kernextrakte, mit denen eine SDS-Gelelektrophorese durchgeführt wurde. Eine radioaktive Bande, die zusammen mit intaktem tat wanderte, ist leicht zu erkennen. HL3T1-Zellen, die mit tat, jedoch nicht mit Chloroquin behandelt wurden, zeigten eine ähnliche Kinetik der Aufnahme und der Lokalisierung im Kern, wenn sie durch Zählen der Zerfalle der zellulären Fraktionen getestet wurden, wobei jedoch nur abgebautes tat auf dem Gel beobachtet wurde.
- Die Fähigkeit von tat zum direkten Eindringen in Lymphocyten oder Monocyten wurde ebenfalls untersucht. tat gelangte leicht in beide Zelltypen, wie es durch einen hohen Grad an Transaktivierung von mit tat, allein oder mit Chioroquin, behandelten Zellen gezeigt wurde. H9-Lymphocyten und U937-Promonocyten (10&sup6; Zellen), die ein integriertes HIV-1-LTR-CAT-Plasmid (H938- bzw. U38-Zellen) (B. K Felber und G. N. Pavlakis, Science 239 (1988), 184) enthielten, wurden in RPMI-1640- Medium, das 10 % fötales Rinderserum (1 ml in 25 mm-Vertiefungen) enthielt, bei 37ºC (kein tat) inkubiert und mit 5 µg tat-Protein (tat) oder mit 5 µg tat und 100 µm Chioroquin (tat + CQ) behandelt. Zellen wurden 24 Stunden nach der tat-Behandlung geerntet und auf CAT-Aktivität getestet (C. M. Gorman et al., Mol. Cell Biol. 2 (1982), 1044). HeLa-Zellen (10&sup6; Zellen), die ein integriertes HIV-1-LTR-CAT-Plasmid (HL3T1) enthielten (B. K. Felber und G. N. Pavlakis, Science 239 (1988), 184), wurden in Dulbeccos-modifiziertem-Eagle's-Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (1 ml in 25 mm-Vertiefungen) ihkubiert und in älmlicher Weise mit tat- Protein oder mit tat und Chloroquin behandelt und auf CAT-Aktivität getestet. Nichtacetylierte (cm) und acetylierte (ac) Formen von ¹&sup4;C-Chloramphenicol wurden durch Dünnschichtchromatographie getrennt.
- Figur 7 zeigt die Ergebnisse, die nach der Einführung von tat in Lymphocyten und Monocyten gemessen wurden. Hohe Transaktivierungsniveaus wurden bei allen drei Zellinien beobachtet. In den HeLa-Zellen bewirkte die Zugabe von Chioroquin eine signifikante Stimulierung der tat-Aktivität. Anders als bei HeLa-Zellen bewirkte Chloroquin jedoch nur eine geringe Erhöhung der Aufnahme von tat in Lymphocyten oder Monocyten. Die Chloroquin-unabhängige Aufnahme in Lymphocyten und Monocyten läßt auf einen unterschiedlichen Aufnahmemechanismus schließen.
- Der Zeitverlauf der Bindung wurde in HeLa-Zellen, die ein integriertes HIV- 1-LTR-CAT-Plasmid (HL3T1-Zellen) enthielten, ermittelt (B. K. Felber und G. N. Pavlakis, Science 239 (1988), 184). Zellen (2 x 10&sup6;) wurden in Gewebekultur-Platten mit 12 Vertiefungen (Vertiefungen mit 12 mm Durchmesser) bis zur Konfluenz gezüchtet und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zellen wurden bei 37ºC in frischem DMEM mit 1 µg tat (1-72) und 100 µm Chloroquin unterschiedlich lange ihkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS zur Entfernung von tat wurde ftisches Medium zugesetzt und die Transaktivierung 24 Stunden nach der Zugabe von tat gemessen. Die CAT-Aktivität wurde als Maß der Transaktivierung verwendet.
- Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Figur 8 dargestellt. Das Grundniveau der Expression von HIV-1-LTR in Abwesenheit von tat ist in der Bahn mit der Kennzeichnung "kein tat" dargestellt. Die maximalen Transaktivierungsniveaus wurden nach einer fünfminütigen Exponierung gegen tat beobachtet. Somit erfolgt die Bindung schnell und eine kurze Exponierung kann eine Aufnahme durch Zellen bewirken, wie durch Transaktivierung getestet wurde.
- Die Zeit, die zur Beobachtung einer Antwort auf exogenes tat erforderlich war, wurde in H938-Zellen ermittelt. H938-Zellen wurden durch Infektion mit einem retroviralen Vektor des Maus-Sarkomavirus (MSV) von der lymphatischen H9-Zellinie abgeleitet (B. K. Felber und G. N. Pavlakis, Science 239 (1988), 184). Der integrierte MSV-Vektor enthält das CAT-Gen unter der Kontrolle des HIV-1-LTR und das neo-Gen unter der Kontrolle eines SV40-Promotors (Figur 9). H938-Zellen wurden in RPMI- 1640-Medium gehalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (250 E/ml) und Streptomycin (250 µg/ml) versetzt war. Die Zellen wurden mit 10 µg/ml tat-Protein (Aminosäuren 1-72) in Gegenwart von 100 µg/ml Protamin behandelt. RNA wurde präpariert und durch Schutz gegen Rnase analysiert. Eine α-³²P-UTP-markierte HIV-1- LTR-Sonde, die einem 200 bp-Fragment von -120 bis +80 des viralen LTR entsprach, wurde durch in vitro-Transkription hergestellt. Diese Verfahren werden in Beispiel V genauer beschrieben.
- Die Ergebnisse des Rnase-Schutztests sind in Figur 10 dargestellt. Zwei Hauptfragmente wurden geschützt. Das aus 80 Nudeotiden bestehende Fragment stammte von Transkripten, die von HIV-LTR exprimiert wurden, und das aus 200 Nucleotiden bestehende Fragment stammte von Transkripten, die entweder von stromaufwärts liegenden MSV- oder SV40-Promotoren exprimiert wurden. Die Transkription von HIV-LTR erhöhte sich nach einer 15-minütigen Exponierung gegen tat und erreichte ein Maximum nach 2 bis 6 Stunden. Im Gegensatz dazu erhöhte sich die Transkription von den stromaufwärts liegenden MSV- und SV40-Promotoren durch zugesetztes tat nicht, wodurch angezeigt wurde, daß exogen zugesetztes tat eine Spezifität für den HIV-Promotor behielt. Wenn das tat-Protein exogen zu Zellen zugesetzt wurde, erhöhte sich die Transkription in 15 Minuten signifikant, was anzeigte, daß tat in Zellen eindringen konnte, dann im Kern lokalisiert war, an seine Zielstelle TAR spezifisch band und die Transkription innerhalb von 15 Minuten förderte. (Die kurzen Transkripte, die Abbauprodukte von unvollständig verlängerten RNAs sein können, wurden durch tat nicht beeinflußt).
- Mehrere Peptidfragmente von tat wurden auf ihre Fähigkeit getestet, mit der tat-Bindung und Aufnahme in HL3T1- und H938-Zellen zu konkurrieren. In diesen Experimenten wurden 0,5 x 10&sup6; H938-Zellen pelletiert und in 0,5 ml frischem RPMI- 1640-Medium resuspendiert. Zellen wurden bei 37ºC mit 1 µg tat (1-72) und wachsenden Konzentrationen des Peptids ihkubiert. Extrakte wurden nach 24 Stunden hergestellt und auf eine CAT-Aktivität getestet. Überraschenderweise erhöhte tat 38-58, das den basischen Bereich von tat enthielt, tatsächlich die Wirkung von exogenem tat und erhöhte die Transaktivierung in einer konzentrationsabhängigen Weise. Figur 11 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments mit der H938-Zellinie. Die Daten wurden durch Ausschneiden der Flecken aus den TLC-Platten quantifiziert und die assozuerte Radioaktivität in einem Scintillationszähler gezählt.
- Es wurde ferner beobachtet, daß Protamin (Protaminsulfat, Sigma), ein anderes basisches Peptid, die Transaktivierung durch extrazelluläres tat in einer Konzentration von 100 µg/ml erhöhte. Ein kleineres tat-Peptid, das nur den basischen Bereich von 47-58 enthielt, wies jedoch unter den verwendeten Bedingungen keine Wirkung auf die Transaktivierung auf. Ein Gemisch der beiden Peptide tat 38-47 und tat 48-58, die Produkte der Chymotrypsin-Spaltung von tat 38-58 waren, wies ebenfalls unter diesen Bedingungen keine Wirkung auf die Transaktivierung auf. Es wurde keine Erhöhung der Aktivität durch Protamin beobachtet, wenn HL3T1-Zellen mit tat durch "scrape loading" transformiert wurden, was den Schluß zuließ, daß Protamin den Aufuahmevorgang direkt beeinflußte.
- Weitere Zellinien wurden ebenfalls auf eine tat-Aufnahme und Transaktivierungsaktivität getestet. Jurkat-T-Zellen zeigten bei einer Zugabe von tat zum Medium eine signifikante Transaktivierung und zeigten in Gegenwart von Chioroquin eine weitere Transaktivierung. Eine Vero-Linie (VNHIV-CAT, J. D. Mosca et al., Nature 325 (1987), 67-70) zeigte ebenfalls eine signifikante Transaktivierung nach einer Inkubation von Zellen mit tat und Chloroquin. Es wurde jedoch keine Aktivität mit tat allein beobachtet. Da jedoch die Grundexpression von CAT in dieser Zellinie niedrig ist, wäre auch eine mehrfache Erhöhung der CAT-Aktivität nicht nachweisbar gewesen.
- Um das Eindringen von tat in lebende Zellen direkt verfolgen zu können, wurde tat mit Rhodamin (TRITC-tat) markiert und seine Bewegung durch Fluoreszenzmikroskopie verfolgt. Eine getüpfelte Anfärbung, die der bei der Rezeptorvermittelten Endocytose glich, wurde unmittelbar nach der Inkubation mit TRITC-tat auf der Oberfläche von HL3T1- und H938-Zellen beobachtet. Nach einer Stunde wurde in HL3T1-Zellen eine klare Anfärbung des Kerns beobachtet. Eine getüpfelte Anfärbung des Cytoplasmas wurde ebenfalls beobachtet, was den Schluß zuließ, daß tat in Endosomen lokalisiert war. Eine Inkubation bei niedriger Temperatur, die die Endocytose blockierte, hemmte auch das Eindringen von Rhodamin-markiertem tat. Nach sechs Stunden war tat fast vollständig im Kern von HL3T1-Zellen, jedoch nicht in den Nudeoh enthalten. Bemerkenswerterweise wurde jede Zelle in der Kultur mit TRITC-tat markiert, wodurch eine effiziente Aufnahme von exogenem tat angezeigt wurde. (Die zelluläre Lokalisierung wurde auch in H938-Zellen untersucht, da jedoch der Kern den größten Teil der lymphocytischen Zelle ausmachte, war die Unterscheidung von Kern- und nicht-Kernbereichen schwierig). Im Transaktivierungstest wurde festgestellt, daß TRITC-tat die gleiche spezifische Aktivität wie das nicht-modifizierte tat aufwies.
- Eine Voruntersuchung der Fähigkeit von tat zur Vermittlung der Aufnahme eines gewünschten Moleküls wurde durchgeführt. Weitere Details dieser Analyse sind in Beispiel VII dargestellt. Der offene Leserahmen E2 des Rinder-Papillomavirus-1 (BPV- 1, E. Y. Chen. et al., Nature 299 (1982), 529-534) codiert sowohl positiv als auch negativ wirkende transkriptionelle Regulatoren (regulatorische Faktoren, R. Sousa et al., Biochim. Biophys. Acta 1032 (1990), 19-37, P. F. Lambert et al., J. Virol. 63(7) (1989), 3151-3154, und P. F. Lambert et al., Cell 50 (1987), 69-78). Ein Fusionsgen wurde konstruiert, in dem das HIV-1-tat-Gen an den Carboxyterminus des offenen Leserahmens E2 geknüpft war. Das Fusionsprotein-codierende Konstrukt pFTE103 (konstruiert von Dr. J. Barsoum, Biogen, Inc.) wurde zur Expression eines Proteins entwickelt, das die Aminosäuren 1 bis 67 von tat am Aminoterminus enthielt, gefolgt von den 105 Aminosäuren vom C-Terminus von E2 (Reste 306 bis 410 von BPV-1-E2), die die DNA-Bindungs-Domäne des offenen Leserahmens E2 enthalten (EP 0 302 758, Androphy et al., (6. Febr. 1989), 1. Gin und M. Yaniv, EMBO J. 7(9) (1988), 2823- 2829, A. A. McBride et al., EMBO J. 7(2) (1988), 533-539, E. J. Androphy et al.. Nature 325 (1987), 70-73. pFTE103 wurde in E. coli eingeführt und das tatE2C- Fusionsprotein unter Verwendung des T7-RNA-Polymerase-Expressionssystems exprimiert, wie von Studier et al. beschrieben (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89). Das gereinigte tatE2C-Fusionsprotein wanderte mit einem relativen Molekulargewicht von 20 000 bis 21 000 Dalton auf Proteingelen. Die Aufnahme des tatE2C-Fusionsproteins wurde nach der Zugabe zum Kulturmedium von Tierzellen getestet.
- Die Aufnahme des tat-Teils des Fusionsproteins (Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein) wurde durch Messung der Transaktivierung eines auf tat antwortenden, in HeLa-Zellen (HeLa. 318-Zellen) integrierten Reporterkonstrukts getestet. Das in HeLa.318-Zellen vorhandene, auf tat antwortende Reporterkonstrukt (pXB318) enthielt das cDNA-Reportergen des menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivators (tPA) von pTPA114 (Fisher et al., J. Biol. Chem. 260 (1985), 11223-11230) unter der Kontrolle des langen terminalen Repeats (LTR) von HIV-1 aus pU3R-III (Sodroski et al., Science 227 (1985), 171-173). Das tat-Protein (Aminosäuren 1-72) oder das tatE2C- Fusionsprotein wurden dem Kulturmedium von HeLa.318-Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen in Konzentrationen im Bereich von 2,5 nM bis 250 nM in Gegenwart von 100 µM Chloroquin im wesentlichen wie beschrieben (A. D. Frankel und C. O. Pabo, Cell 55 (1988), 1189-1193) zugesetzt. Das Kulturmedium wurde 24 Stunden später gewonnen und durch das Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (J. Exp. Med. 148 (1978), 223-234) auf eine tPA-Aktivität getestet. Die Zahl der Zellen wurde ermittelt und die tPA-Sekretion als ng/10&sup6; Zellen pro Tag ausgedrückt. Figur 12 zeigt die Ergebnisse, die von einem tPA-Test von HeLa.318-Medien 24 Stunden nach der Zugabe von tat oder tatE2C-Protein zum Kulturmedium erhalten wurden. In Abwesenheit von tat oder dem tatE2C-Protein war keine tPA-Aktivität nachweisbar (weniger als 0,1 ng/10&sup6; Zellen pro Tag). Eine Zugabe von tat bzw. dem tatE2C-Protein bewirkte jedoch eine Erhöhung der tPA-Produktion (Figur 12). So scheint es, daß tat (Reste 1-67) die Fähigkeit zum Eindringen in Zellen behält, wenn es an ein heterologes Protein gebunden ist.
- Genauso wie die Transaktivierung nach der Zugabe des tatE2C-Proteins etwas weniger effizient war als die, die nach der Zugabe von tat beobachtet wurde, war auch das tatE2C-Fusionsprotein in Transaktivierungstests weniger aktiv als tat, wenn die Proteine nach einer Transfektion der Gene in HeLa.318-Zellen intrazellulär produziert wurden. Es ist daher nicht klar, ob die offensichtliche Reduktion der Aktivität durch eine reduzierte Aufnahme oder reduzierte Aktivität des von E. coli produzierten und exogen zugesetzten Fusionsproteins bewirkt wurde. Es ist möglich, daß das tatE2C- Fusionsprotein einen Teil seiner tat-Aktivität bei der Denaturierung und erneuten Faltung während der Reinigung verliert.
- Die Aufnahme des E2-Teils des Konjugats wurde durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von polydonalem Kaninchenserum ermittelt, das gegen E2-C85 (die C-terminalen 85 Aminosäuren des in E. coli produzierten E2- Proteins) erzeugt wurde. Zur indirekten Immunfluoreszenzmessung wurden Maus-3T3- Zehen in Gewebekulturkammern/Objektträger von LAB-TEK (mit vier Kammern) gesäht. Am nächsten Tag wurden dem Kulturmedium 250 nM tatE2C-Fusionsprotein in Gegenwart von 100 µM Chloroquin zugesetzt. Nach sechs Stunden wurde die Immunfluoreszenz, wie in Beispiel VII beschrieben, gemessen.
- Während bei der Zugabe von E2.C85-Protein zu den Zellen (in der gleichen Konzentration und in Gegenwart von 100 µm Chloroquin) nur eine sehr schwache Hintergrundfluoreszenz beobachtet wurde, bewirkte die Zugabe des tatE2C- Fusionsproteins in allen beobachteten Zellen eine sehr intensive Fluoreszenz. Diese Zellen zeigten eine Fluoreszenz auf der Plasmamembran, im Cytosol und im Kern. Die Färbung zeigte sich nicht gleichmäßig in den Zellen verteilt, sondern in Form von hellen Flecken. Die Menge an E2-Fluoreszenz, die nach der Zugabe des tatE2C-Proteins zum Kulturmedium erhalten wurde, war weitaus größer als die Immunfluoreszenz die beobachtet wurde, wenn ein tatE2C-Gen in den gleichen Zellen exprimiert wurde. Diese Daten zeigen, daß das tat-Protein ein heterologes Protein, das als Teil eines Konjugats aus gewünschtem Molekül/-tat-Protein vorhanden ist, effizient in Zellen einschleusen kann.
- Ein gewünschtes Molekül (hier nachstehend als Arzneistoff bezeichnet), das üblicherweise ein Protein oder Peptid, eine Nucleotidsequenz oder eine andere Chemikalie ist, die eine diagnostische, prophylaktische oder therapeutische Verwendungsmöglichkeit besitzt, wird, wie nachstehend beschrieben, mit einem HIV-tat- Protein kombiniert, wobei ein Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein erhalten wird, und das erhaltene Konjugat wird mit der extrazellulären Oberfläche von Zellen in Kontakt gebracht.
- In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das gewünschte Molekül ein Protein, beispielsweise ein Enzym, Antikörper, Toxin oder regulatorischer Faktor (z B. Transkriptionsfaktor), dessen Einschleusung in Zellen und besonders in den Zellkern gewünscht wird. Einige virale Onkogene schalten beispielsweise ungünstig die Expression von zellulären Genen durch Bindung an ihre Promotoren ein. Durch Einführung eines kohkurrierenden Bindungsproteins in den Zellkern kann die virale Onkogen-Aktivität gehemmt werden.
- In einer weiteren Ausführungsform ist das gewünschte Molekül eine Nucleotidsequenz, die als diagnostisches Werkzeug (oder Sonde) oder als Therapeutikum verwendet werden kann, beispielsweise eine Oligonucleotidsequenz, die zu einem zellulären Zielgen oder Genbereich komplementär ist und die Aktivität des zellulären Gens oder Genbereichs durch Hybridisierung daran hemmen kann. In einer weiteren Ausführungsform ist das gewünschte Molekül ein Arzneimittel, beispielsweise ein Peptidanaloges oder ein kleines Molekül als Enzyminhibitor, dessen spezifische und zuverlässige Einführung in den Zellkern gewünscht ist.
- Das gewünschte Molekül kann unter Verwendung von bekannten Verfahren, beispielsweise durch chemische Synthese, gentechnische Verfahren und Isolierung aus Quellen, in denen es nalurlich vorkommt, erhalten oder produziert werden. Das gewünschte Molekül kann mit dem tat-Molekül kombiniert oder daran gebunden werden, wobei ein Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein, das Gegenstand der Erfindung ist, gebildet wird.
- Die Bindung des gewünschten Moleküls an tat zur Herstellung eines Konjugats aus gewünschtem Molekül/tat-Protein kann durch alle Verfahren erfolgen, die eine Verknüpfung zwischen beiden Bestandteilen erzeugen, die ausreichend stabil ist, daß sie den verwendeten Bedingungen standhält, und nicht die Funktion der Bestandteile verändert. Die Bindung zwischen den Bestandteilen ist vorzugsweise kovalent. Rekombinationsverfahren können beispielsweise zur kovalenten Bindung des tat-Proteins an Moleküle verwendet werden, beispielsweise durch Verknüpfung des das gewünschte Molekül codierenden Gens mit dem tat codierenden Gen und Einführung des erhaltenen Genkonstrukts in eine Zelle, die das Konjugat exprimieren kann. Alternativ können die beiden getrennten Nucleotidsequenzen in einer Zelle exprimiert oder chemisch synthetisiert und anschließend unter Verwendung von bekannten Verfahren verknüpft werden. Alternativ kann das gewünschte Protein/tat-Molekül auch chemisch als eine einzelne Aminosäuresequenz (d. h., eine, in der beide Bestandteile vorhanden sind) synthetisiert werden, und dann ist keine Verknüpfung erforderlich.
- Eine Kupplung der beiden Bestandteile kann über ein Kupplungs- oder Konjugationsmittel erfolgen. Es gibt mehrere verwendbare, intermolekulare Vernetzungsmittel (vgl. beispielsweise G. E. Means und R. E. Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, S.39-43). Beispiele für diese Reagenzien sind I-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) oder N,N'-(1,3-Phenylen)bismaleimid (beide sind für Sulfhydrylgruppen stark spezifisch und bilden irreversible Bindungen), N,N'-Ethylen-bis-(iodacetamid) oder ein anderes derartiges Reagens mit 6 bis 11 Kohlenstoff-Methylen-Brücken (die für Sulffiydrylgruppen relativ spezifisch sind) und 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol (das mit Aminogruppen und Tyrosinresten irreversible Bindungen bildet). Weitere für diesen Zweck verwendbare Vernetzungsmittel sind beispielsweise p,p'-Difluor-m,m'-dinitrodiphenylsulfon (das mit Amino- und Phenolgruppen irreversible Querverbindungen bildet), Dimethyladipimidat (das für Aminogruppen spezifisch ist), Phenol-1,4-disulfonylchlorid (das bevorzugt mit Aminogruppen reagiert), Hexamethylendiisocyanat oder Diisothiocyanat, sowie Azophenyl-p-diisocyanat (das bevorzugt mit Aminogruppen reagiert), Glutaraldehyd (das mit mehreren unterschiedlichen Seitenketten reagiert) und Bisdiazobenzidin (das bevorzugt mit Tyrosin und Histidin reagiert).
- Die vorliegende Erfindung kann zur in vitro- oder in vivo-Einschleusung eines gewünschten Moleküls in Zellen, besonders in den Zellkern, verwendet werden. Bei der in vitro-Verwendung, in denen das Molekül in Zellen in Kultur eingeschleust werden muß, wird das Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein dem Kulturmedium einfach zugesetzt. Dieses Verfahren kann beispielsweise zur Einschleusung von Substanzen, deren Wirkung auf die Zellfunktion untersucht werden soll, in den Zellkern verwendet werden. Es kann beispielsweise die Aktivität von gereinigten Transkriptionsfaktoren gemessen werden, oder der in vitro-Test kann zur Bereitstellung eines wichtigen Aktivitätstests für ein Molekül vor seiner Verwendung in der in vivo- Behandlung verwendet werden.
- Alternativ kann das Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein zu prophylaktischen oder therapeutischen Zwecken (zur Behandlung, Prophylaxe oder Diagnose einer Erkrahkung oder eines Zustandes) verwendet werden. Das Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein kann beispielsweise mit einer von einer Person erhaltenen Probe (z. B. Blut und Knochenmark) kombiniert werden, um das gewünschte Molekül in die in der Probe enthaltenden Zellen einzuführen, und nach dieser Behandlung wird die Probe in die Person zurückübertragen. Mehrere dieser Behandlungen können zur Verhinderung oder Hemmung der Wirkung eines infektiösen Mittels verwendet werden. Es kann beispielsweise Blut einer mit HIV oder anderen Viren infizierten Person oder einer Person mit einem genetischen Defekt entnommen werden. Das Blut kann anschließend mit einem Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat- Protein kombiniert werden, wobei das gewünschte Molekül ein Virus-inaktivierender Arzneistoff, eine an eine bestimmte Virussequenz hybridisierende und sie inaktivierende Oligonucleotidsequenz oder ein ein fehlendes oder defektes Protein ersetzendes Protein ist, unter Bedingungen, die für das Eindringen des Konjugats in Zellen geeignet sind, wobei die Probe in einem Zustand gehalten wird, der ihre Rückübertragung in die Person möglich macht. Nach der Behandlung wird das Blut an die Person rückübertragen.
- Alternativ kann ein Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein in vivo eingeschleust werden. Zellen, die das tat-Konjugat synthetisieren, können beispielsweise produziert und in eine Person implantiert werden, so daß das tat-Konjugat ständig vorhanden ist. In einer anderen Ausführungsform kann das Konjugat wie ein übliches Therapeutikum verwendet werden und kann ein Bestandteil eines Arzneimittels sein, das weitere Bestandteile einschließt, die beispielsweise für die Einschleusung, Stabilität oder Aktivität des Konjugats verwendet werden können. In dieser Ausführungsform kann ein Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein, beispielsweise ein bestimmtes Oligonucleotidsequenz-tat-Protein-Konjugat, in ausreichender Menge verabreicht werden, so daß es in Zellen, besonders in den Zellkern, eindringen und das verursachende Agens (z. B. Virus oder Bakterium) hemmen (verringern oder eliminieren) oder ein fehlendes oder defektes Protein ersetzen kann. Ein Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein kann auf unterschiedlichen Wegen verabreicht werden. Es kann beispielsweise durch Injektion, Infusion oder andere parenterale Wege (z. B. subcutane, intravenöse, intramuskuläre, intrasternale und intrakranielle Injektions- oder Infusionsverfahren) verabreicht werden. Entsprechend kann die Verabreichung, falls erforderlich, topisch (topische Verabreichung) erfolgen, das heißt, sie kann an einem bestimmten Körperteil (z. B. Haut, unterer Verdauungstrakt, vaginal und rectal) lokal erfolgen. Bei einer Papillomavirusinfektion ist beispielsweise eine topische Verabreichung geeignet.
- Ein Konjugat aus gewünschtem Molekül/tat-Protein kann ferner zur Herstellung eines Impfstoffs verwendet werden. Das gewünschte Molekül kann beispielsweise ein Antigen von Bakterien, einem Virus oder einem anderen infektiösen Agens sein, gegen das der Impfstoff immunisieren soll (z. B. pg120 von HIV). Durch Einführung des Antigens in das Zellcytoplasma kann die Zelle das Molekül verarbeiten und auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Expression des Antigens auf der Zelloberfläche induziert eine Antwort von Killer-T-Lymphocyten, wodurch eine Immunität induziert wird.
- Für in vivo-Verwendungen kann ein bestinnntes Konjugat beispielsweise in geeigneten Formulierungen, die pharmakologisch geeignete Träger, Adjuvanzien und Vehikel enthalten, formuliert werden. Diese Träger schließen üblicherweise wäßrige oder alkoholische/wäßrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung und gepufferte Medien, ein. Parenterale Vehikel können beispielsweise eine Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Laktat-versetzte Ringer-Lösung oder feste Öle einschließen. Intravenöse Vehikel können ferner Flüssigkeits-, Nährstoff- und Elektrolytergänzungszusätze, beispielsweise auf der Basis von Ringer-Dextrose, einschließen. Konservierungsmittel und weitere Zusätze können ebenfalls vorhanden sein, beispielsweise Antimikrobiotika, Antioxidantien, Chelatbildner und inerte Gase (Vgl. die Übersicht in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg., Mack, 1980). Die verabreichte Menge an Konjugat variiert und hängt von Faktoren ab wie dem jeweiligen Zustand oder der jeweiligen Erkrahkung, dem Verabreichungsweg und der Größe der Person.
- Die Erfindung wird nachstehend durch die folgenden Beispiele erläutert, die jedoch den Schutzbereich der Erfindung nicht einschränken sollen.
- Zwei Plasmide wurden zur Produktion des tat-Proteins in E. coli konstruiert. Ein Plasmid exprimiert die Aminosäuren 1 bis 86 (die vollständige codierende Sequenz) und das andere das erste codierende Exon von tat (Reste 1 bis 72). Es ist bekannt, daß das zweite Exon nicht für die Aktivität erforderlich ist (B. R. Cullen, Cell 46 (1986), 973-982, M. A. Muesing et al., Cell 48 (1987), 691-701, J. Sodroski et al., Science 229 (1985), 74-77, und A. D. Frankel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7397-7401). Synthetische tat-Gene wurden konstruiert und in die NdeI-Stelle des Plasmids pET-3a, das zur Expression von donierten Genen einen starken Promotor des Bakteriophagen T7 verwendet, ligiert (F. W. Studier und B. M. Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986), 113-130, A. H. Rosenberg et al., Gene 56 (1987), 125-135). Die erhaltenen Plasmide ptat72 und ptat86 exprimieren tat (Reste 1 bis 72 bzw. 1 bis 86) in einer Menge, die 1 % bis 5 % des gesamten E. coli-Proteins umfaßt. Beide Proteine lieferten in allen Experimenten ähnliche Ergebnisse. BL21(DE3)-Zellen wurden zur Expression verwendet. Diese Zellen enthielten ferner ein Plasmid, das das T7-Lysozymgen exprimierte, um jede vor der Induktion exprimierte T7-RNA-Polymerase zu hemmen (F. W. Studier, persönliche Mitteilung). tat wurde mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert (F. W. Studier und B. M. Moffat, J. Mol. Biol. 189 (1986), 113-130) und im wesentlichen wie beschrieben (A. D. Frankel et al., Science 240 (1988), 70-73) gereinigt, ausgenommen, daß tat aus dem Polyethylenimin-Pellet mit 10 % Ammoniumsulfat anstelle von 700 mM KCl extrahiert und die S-Sepharosechromatographie weggelassen wurde.
- Synthesen wurden unter Verwendung der Fmoc-Chemie auf einem Milligen/Biosearch-Peptidsynthesegerät Modell 9600 mit einem Peptidamid-Linker- Norleucin-4-methylbenzhydrylamin (PAL-Nle-MBHA)-Polystyrolharz (Milligen/Biosearch, 0,5 g) durchgeführt. Das Benzotriazolyloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat/1-Hydroxybenzotriazol (BOP/HOBt)-Kupplungsverfahren (D. Hudson, J. Org. Chem. 53 (1988), 617-624) wurde mit Kupplungszeiten von 1 bis 4 Stunden und mit doppelter Kupplung von His-33 verwendet. Schutzgruppen waren t- Butylester (für Glu und Asp), 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (Arg), t- Butyloxycarbonyl (Lys), Trityl (His und Cys), t-Butyl (Ser, Thr und Tyr) und Trimethoxybenzyl (Asn und Gln). Alle Peptide wurden als C-terrninale Amide synthetisiert. Nach Abschluß der Synthese wurden die Schutzgruppen entfernt und die Peptidketten mit Trifluoressigsäure/Ethandithiol/Thioanisol/Anisol (90:3:5:2, Vol./Vol.) vom Harz abgespalten. Das Gemisch wurde filtriert, und die Produkte wurden durch Zugabe von kaltem wasserfreiem Diethylether zum Filtrat erhalten. Der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen, gründlich mit Ether gewaschen und getrocknet.
- Die Peptide wurden 30 Minuten bei 37ºC mit 0,5 M Dithiothreit behandelt um die vollständige Reduktion der Cysteine sicherzustellen, und auf einer C&sub4;-HPLC- Säule (Vydac) unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten in 0,1 % Trifluoressigsäure gereinigt. Die Aminosäurezusammensetzung wurde durch Hydrolyse in 0,5 % Phenol enthaltender 6 M HCl bei 100ºC und durch Analyse auf einem LKB-Alpha- Plus-Analysator ermittelt. Die Reinheit der Peptide (> 90 %) wurde durch HPLC unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten von < 0,5 % pro Minute ermittelt.
- tat (Reste 1 bis 72) wurde durch 5-minütige Behandlung von 500 µg Protein mit 0,5 mCi ¹²&sup5;I und IODO-BEADS (Pierce) in 0,1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,5) mit ¹²&sup5;I bei Raumtemperatur markiert. Die Probe wurde zur Entfernung von ¹²&sup5;I, das nicht reagiert hatte, dialysiert. Die spezifische Aktivität war etwa 10&sup6; cpm/µg Protein. HL3T1-Zellen (2 x 10&sup6; Zellen pro Gefäß) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 100 µM Chloroquin mit 5 µg radioaktivem tat behandelt. Das Medium wurde zu verschiedenen Zeiten entfernt und die Zellen mit PBS und EDTA gewaschen. Die Zellen wurden 10 Minuten mit Trypsin behandelt. Pankreas-Trypsininhibitor wurde zugesetzt (5 µg/ml), die Zellen wurden auf 4ºC abgekühlt, mit 100 x g zentrifugiert und der Überstand wurde gewonnen. Das Zellpellet wurde zweimal mit serumfreiem DMEM und einmal mit PBS gewaschen, und die Kerne wurden durch Lyse in 0,5 % NP-40 wie beschrieben isoliert (F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley and Sons, 1987)). ¹²&sup5;I wurde unter Verwendung eines LKB- Gammazählers gezählt.
- Die Parameter der Chloroquin-stimulierten tat-Aktivität wurden genauer untersucht. Figur 6A zeigt, daß die Konzentrationsabhängigkeit von Chloroquin eine ziemlich steile Dosis-Antwort-Kurve mit maximaler Transaktivierung bei 100 µm Chloroquin ergibt. Diese Konzentration wird üblicherweise verwendet, um den pH-Wert der Vakuolen zu erhöhen (I. Meliman et al., Annu. Rev. Biochem. 55 (1986), 663- 700).
- Der zeitliche Verlauf der tat-Transaktivierung in Gegenwart von Chloroquin zeigte nach 24 Stunden ein Plateau (Figur 6B), und die Transaktivierung in Gegenwart von Chioroquin erhöhte sich mit steigender tat-Konzentration (Figur 6C). Eine Transaktivierung war schon bei tat-Konzentrationen von 1 nM nachweisbar.
- Kontrollen wurden durchgeführt, um festzustellen, ob die Transaktivierung von einer intakten TAR-Stelle abhängig ist, ob ein heterologer Promotor durch tat stimuliert werden kann und ob bei einer intrazellulären Produktion von tat Wirkungen, die mit Chloroquin beobachtet wurden, eintraten. Nach einer transienten Transfektion von HeLa-Zelien mit einem HIV-LTR-Plasmid (p-167/+80; C. A. Rosen et al., Cell 41 (1985), 813-823) wurden hohe Transaktivierungsniveaus beobachtet, wenn tat durch Cotransfektion mit einem tat-Expressionsplasmid (pSV2tat72), durch "scrape-loading" von gereinigtem tat oder durch Behandlung mit tat und Chioroquin eingeführt wurde. Eine Expression vom HIV-LTR, das eine mutierte TAR-Stelle enthielt, (p-167/+21; C. A. Rosen et al., Cell 41(1985), 813-823) oder vom frühen SV40-Promotor (PSV2- CAT; C. M. Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1044-1051) wurde jedoch nicht stimuliert, wenn tat durch diese Verfahren eingeführt wurde. Daher scheint es, daß eine Einführung von tat durch "scrape loading" oder durch Aufnahme mit Chloroquin das HIV-LTR durch den gleichen Mechanismus wie bei einer intrazellulären Produktion von tat transaktiviert wird. Chloroquin zeigte bei einer intrazellulären Produktion von tat keine Wirkung. Eine Chloroquin-Behandlung von HL3T1-Zellen, die mit pSV2tat72 transient transfiziert wurden, zeigte keine weitere Transaktivierung.
- Für das RNase-Schutzexperiment wurde Gesamt-RNA durch das Verfahren mit heißem saurem Phenol (C. Queen und D. Baltimore, Cell 33 (1983), 741-748) isoliert. HIV-1-spezifische Sonden wurden für alle Hybridisierungen durch in vitro- Transkription (mit α-³²P-UTP) eines EcoRV-linearisierten Plasmids, das das EcoRV (-120) bis HindIII (+80)-Fragment des viralen LTR (in das Plasmid sp73 doniert; Promega) enthielt, hergestellt. RNA-Sonden wurden auf Sephadex G-50-"Spin"-Säulen (Boehringer-Mannheim) gereinigt.
- RNase-Schutzexperimente wurden wie beschrieben durchgeführt (F. M. Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (New York: John Wiley and Sons, 1987)). 20 µg zelluläre RNA wurden über Nacht bei 38ºC in 40 µl 80 % Formamid, 40 mM PIPES (pH-Wert 6,7), 200 mM NaCl und 1 mM EDTA mit 5 x 10&sup5; cpm der RNA-Sonde hybridisiert. Einzeisträngige RNA wurde mit Rnase A (10 µg/ml) und Rnase T1 (45 E/ml) (Boehringer-Mannheim) in 400 µl 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA 1 Stunde bei Raumtemperatur gespalten. Geschützte Fragmente wurden durch Elektrophorese auf 6 % Polyacrylamid-7 M Harnstoff- Sequenziergelen analysiert. Geschützte RNAs wurden durch Autoradiographie mit Verstärkerfolien sichtbar gemacht und unter Verwendung eines Betascope 603 (Betagen) quantifiziert.
- 200 µg gereinigtes tat-Protein (Aminosäuren 1 bis 72) wurden durch 8-stündige Inkubation bei 4ºC in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3;, pH-Wert 9,0, mit 5 µg Tetramethylrhodaminisothiocyanat TRITC, das in 5 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst war an den Lysinresten markiert. Nicht-umgesetztes TRITC wurde mit 50 nM NH&sub4;Cl gequencht. Der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,0 verringert und das Rhodamin-markierte tat durch Dialyse gegen 50 mM Tris, pH-Wert 7, und 1 mM DTT von freiem TRITC gereinigt.
- HL3T1-Zellen wurden auf Deckgläschen gezüchtet und unterschiedlich lange mit Rhodamin-konjugiertem tat (TRITC-tat) in DMEM inkubiert. Suspendierte H938- Zellen wurden mit Rhodamin-konjugiertem tat in RPMI inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und lebend unter einem Zeiss-"Axiophot"-Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
- Die Mausembryo-Fibroblastenzellime BALB/c 3T3 (Clon A31; Aaronson und Todaro, J. Cell Physiol. 72 (1968), 141-148) wurde von der American Type Culture Collection erhalten. HeLa-Zellen wurden von Dr. Alan Frankel (Whitehead Institute, MIT) erhalten. Beide Zellinien wurden in Dulbecco-Minimal- Medium (GIBCO), das mit 10 % Donor-Kälberserum (Hazelton) und 4 mM Glutamin (Whittaker) versetzt war, gezüchtet. Die Zellen wurden in einem 5,5 % CO&sub2; enthaltenden Ihkubator bei 37ºC gezüchtet. Das Passagieren der Zellen wurde durchgeführt indem sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und zur Entfernung der Zellen von den Schalen mit Trypsin (beide von GIBCO) behandelt wurden, wonach Kulturmedium zugesetzt und die Zellen in frisches Kulturmedium enthaltende Schalen verdünnt wurden.
- Die HeLa-Zellinie, die ein auf tat antwortendes Reporterkonstrukt enthielt, (HeLa. 318) wurde hergestellt, indem Plasmid pXB318 (nachstehend beschrieben) durch Elektroporation wie von Chu et al. beschrieben (Chu et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 1311-1326) eingeführt und stabil selektiert wurde. Eine Transformation durch Elektroporation wurde mit pXB318-DNA zusammen mit dem selektierbaren Marker pSV2-neo durchgeführt (E. M. Southem und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341). Stabile Transfektanten wurden in Gegenwart von G418 selektiert (E. M. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341), und die Gegenwart von pXB318-DNA wurde durch Southem-Blot-Hybridisierungsanalyse bestätigt (E. M. Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975), 503-517).
- Alle molekularen Clonierungsreaktionen wurden durch von Maniatis et al. (T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)) beschriebene Verfahren unter Verwendung von Enzymen von New England Biolabs (Beverly, MA) durchgeführt.
- Das tatE2C-Fusionsprotein (Protein tatE2C), in dem HIV-tat an den carboxyterminalen Teil von BPV-1-E2 fusioniert war, wurde vom bakteriellen Expressionsplasmid pFTE103 exprimiert. Dieses Plasmid stammte vom ptat72 (vgl. Beispiel I), indem ein StyI-SpeI-Fragment, das aus dem Vektor pCO-E2 (Hawley- Nelson et al. EMBO J. 7 (1988), 525-531) isoliert wurde und den C-terminalen Teil des E2-Proteins codiert, insertiert wurde. Vier synthetische Desoxyoligonucleotide wurden in der nachstehend genauer beschriebenen Konstruktion verwendet.
- Das Plasmid ptat72 wurde mit den Restriktionsendonucleasen NdeI und BamHI gespalten, wobei der tat-codierende Teil des Vektors freigesetzt wurde Das Vektorfragment von 4603 Basenpaaren (bp) wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und ein 169 bp langes NdeI-AatII-Fragment des tat-codierenden Fragments isoliert. Der 3'-Teil der E2C-codierenden Sequenz wurde als ein 375 bp langes StyI- SpeI-Fragment aus pCO-E2 isoliert (Hawley-Nelson et al., EMBO J. 7 (1988), 525- 531); von Dr. Elliot Androphy, Tufts University/New England Medical Center Hospitals, erhalten). Das E2C-Fragment wurde mit dem tat-Fragment und dem Expressionsvektor unter Verwendung von zwei Paaren von komplementären Desoxyoligonucleotiden (gemäß Standardverfahren unter Verwendung eines Applied Biosystems "380A" DNA-Synthesegeräts synthetisiert) verknüpft. Ein komplementäres Paar von Oligonudeotiden wurde entwickelt, um das überstehende AatII-Ende des tat- Fragments mit dem überstehenden StyI-Ende des E2C-Fragments zu verbinden: oligo
- Ein zweites Paar von komplementären Oligonucleotiden wurde entwickelt, um das überstehende [SpeI]-Ende des E2C-Fragments mit dem überstehenden BamHI-Ende des aus ptat72 isolierten 4603 bp-Vektors zu verknüpfen: oligo
- Das tat-Fragment, das E2C-Fragment und die beiden Paare von Oligos wur den in den 4603 bp-ptat72-Vektor insertiert, wobei pFTE103 erhalten wurde. Das er haltene Fusionsgen wurde entwickelt, um die Expression eines Proteins zu ermöglichen das die Aminosäuren 1 bis 67 vom Aminoterminus von tat umfaßte, an die sich die C- terminalen 105 Aminosäuren von E2 (Reste 306 bis 410 von BPV01-E2) anschlossen.
- Das auf tat antwortende Reporterkonstrukt pXB318 wurde in drei Schritten konstruiert. Das Ausgangsplasmid warpBG312 (Cate et al., Cell 45 (1986), 685-698). Zwei Oligodesoxynudeotide wurden synthetisiert, die nach Aneinanderlagerung ein AatII-kompatibles überstehendes 5'-Ende und ein EcoRI-kompatibles überstehendes 3'- Ende aufwiesen und einen Polylinker mit internen XhoI-, HindIII- und BamHI- Restriktionsstellen bildeten:
- pBG312 wurde zur Entfernung des Promotors mit AatII und EcoRI gespalten und die vorstehend beschriebenen Polylinker wurden in den Vektor insertiert, wobei der Promotor-freie Vektor pXB100 erhalten wurde. Die lange terminale Wiederholungseinheit (LTR) von HIV-1 aus pU3R-III (Sodroski et al., Science 227 (1985), 171- 173) wurde als XhoI-HindIII-Fragment ausgeschnitten und in XhoI- und HindIII-Stellen des Polylinkers von pXB100 insertiert, wobei pXB301 erzeugt wurde. Der menschliche Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA)-cDNA-Reporter wurde als BamHI-Fragment von pTPA114 (Fisher et al., J. Biol. Chem. 260 (1985), 11223-11230) ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle von pXB301 insertiert, wobei pXB318 erzeugt wurde.
- Das tatE2C-Fusionsprotein wurde unter Verwendung des Vektors pFTE103 und des T7-RNA-Polymerase-Expressionsystems genau wie von Studier et al. (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89) beschrieben in E. coli exprimiert.
- Fast das gesamte tatE2C-Protein wurde in der unlöslichen Fraktion gefunden. Die nachstehend beschriebene Reinigung wurde durchgeführt:
- 1. E. coli wurde pelletiert, in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 10 mM DTT und 1 mM PMSF resuspendiert, wobei das Volumen dieser Lösung dem zehnfachen Volumen der pelletierten Zellen entsprach, und zur Lyse zweimal durch eine "French"-Presse geleitet.
- 2. Die Membranfraktion wurde durch 30-minütige Zentrifugation mit 10 000 Upm pelletiert.
- 3. Diese Membranfraktion wurde in 6 M Harnstoff resuspendiert.
- 4. Festes Guanidin-HCl wurde zu einer Endkonzentration von 6 M und DTF zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt.
- 5. Nach 30 Minuten bei 37ºC wurde die Lösung durch 30-minütige Zentrifugation mit 10 000 Upm geklärt.
- 6. Die Probe wurde auf eine A.5-Agarose-Gelfiltrationssäule in 6 M Guanidin-HCl, 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 5,4, und 10 mM DTT aufgetragen.
- 7. tatE2C-enthaltende Fraktionen wurden auf eine C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen- HPLC-Säule aufgetragen und mit einem Gradienten von 0 bis 75 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure eluiert.
- Das tatE2C-Protein erschien als einzelner Peak. Auf Proteingelen wanderte das tatE2C-Fusionsprotein mit einem relativen Molekulargewicht von 20 000 bis 21 000 Dalton.
- Eine Aufnahme wurde entweder als tat-Aktivität (Aktivierung eines tat-abhängigen Reporters in HeLa.318) oder durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von anti-E2-Antikörpern nachgewiesen.
- Die tat-Aktivität wurde durch Zugabe von 2,5 bis 250 nM tat-Protein (Aminosäuren 1 bis 72) oder tatE2C-Fusionsprotein zusammen mit 0,1 mM Chloroquin zum Kulturmedium von HeLa.318-Zellen in 24 Vertiefungen aufweisenden Platten im wesentlichen durch das Verfahren von Frankel und Pabo (A. D. Frankel und C. O. Pabo, Cell 55 (1988), 1189-1193) ermittelt. Das Kulturmedium wurde nach 24 Stunden geerntet und durch das Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (J. Exp. Med. 148 (1978), 223-234) getestet. Die Zahl der Zellen wurde ermittelt und die tPA-Sekretion als ng/10&sup6; Zellen pro Tag ausgedrückt. Die TPA-Sekretion war in Abwesenheit von zugesetztem tat oder tatE2C-Protein nicht nachweisbar (weniger als 0,1 ng/ 10&sup6; Zellen pro Tag).
- Zur indirekten Immunfluoreszenz wurden Maus-3T3-Zellen in Gewebekulturkammern/Objektträger (LAB-TEK) mit vier Kammern gesät. Nach einem Tag wurden tatE2C-Protein und Chloroquin dem Kulturmedium zu Endkonzentrationen von 250 nM bzw. 0,1 mM zugesetzt. Nach sechs Stunden wurde eine Messung der Immunfluoreszenz, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt:
- 1. Das Medium wurde entfernt, und die Vertiefungen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
- 2. Die Zellen wurden durch 10-minütige Behandlung mit 3,5 % Formaldehyd bei Raumtemperatur fixiert.
- 3. Die Zellen wurden in 0,2 % Triton X-100/2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS mit 1 mM MgCl&sub2;/0,1 mM CaCl&sub2; (PBS+) 5 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert.
- 4. Die Zellen wurden durch Behandlung mit vollständigem Ziegenserum (Cappel #5506-1380) bei einer 1:30-Verdünnung in PBS+/2 % BSA eine Stunde bei 4ºC blockiert.
- 5. Der primäre Antikörper war ein Affinitäts-gereinigter polydonaler Kaninchen-Antikörper, der durch Injektion von gereinigtem Protein E2.C85 (dazu wurden die 85 carboxyterminalen Aminosäuren in Bakterien unter Verwendung des T7- Polymerase-Expressionssystems exprimiert) in ein Kaninchen erzeugt worden war, wonach er durch Durchleiten des Bluts durch eine E2-Affinitätssäule gereinigt wurde Dieser Antikörper wurde den Vertiefungen in einer 1:100-Verdünnung in PBS +/2 % BSA eine Stunde bei 4ºC zugesetzt.
- 6. Der sekundäre Antikörper war ein Rhodamin-konjugiertes Ziegen-anti- Kaninchen-IgG (Cappel #2212-0081). Dieser Antikörper wurde in einer 1:100- Verdünnung in PBS+/0,2 % BSA 30 Minuten bei 4ºC zugesetzt.
- 7. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS+/0,2 % Tween-20/2 % BSA gewaschen.
- 8. Die Objektträger wurden in 50 % Glycerin in PBS gegeben und mit einein Fluoreszenzmikroskop mit einem Rhodamin-Filter angeschaut.
- Als Kontrolle wurde gereinigtes E2C-Protein (die 85 carboxyterminalen Aminosäuren, von denen festgestellt wurde, daß sie von der polyclonalen Antikörperpräparation erkannt wurden) den Vertiefungen in der gleichen Weise wie das tatE2C-Fusionsprotein zugesetzt.
Claims (25)
1. Verfahren zur Einschleusung eines gewünschten nicht-tat-
Moleküls in eine eukaryotische Zelle, umfassend den
Schritt des Inkontaktbringens eines Konjugats aus
gewünschtem nicht-tat-Molekül/tat-Protein mit der
extrazellulären Oberfläche einer Zelle, so daß das Konjugat
in die Zelle eindringt.
2. Verfahren zur Einschleusung eines gewünschten nicht-tat-
Moleküls in einen eukaryotischen Zellkern, umfassend den
Schritt des Inkontaktbringens eines Konjugats aus einem
gewünschten nicht-tat-Molekül/tat-Protein mit der
extrazellulären Oberfläche einer Zelle, so daß das Konjugat
in die Zelle eindringt und in den Kern gelangt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das tat-Protein
ausgewählt ist aus den Aminosäuren 1-67, 1-72 oder 1-58
des HIV-tat-Proteins wie in Figur 1 gezeigt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das gewünschte
Molekül ausgewählt ist aus Proteinen, Peptiden oder
Nucleinsäuren
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das gewünschte Molekül
ein Protein ist, ausgewählt aus regulatorischen
Faktoren, Antikörpern, Enzymen oder Toxinen.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Schritt (b)
außerdem den Schritt des Inkontaktbringens der Zielzelle
mit einem Stabilisierungsmittel zur Hemmung der
Proteolyse des Konjugats aus dem gewünschten
Molekül/tat-Protein umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das
Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus einem Metall oder einem
lysosomotrophen Mittel.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das lysosomotrophe
Mittel ausgewählt ist aus Chloroquin, Amantadin, Monensin,
Methylamin oder Ammoniumchlorid.
9, Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Schritt (b)
außerdem das Inkontaktbringen der Zelle mit einem
basischen Peptid umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das basische Peptid
ausgewählt ist aus Protamin oder den Aminosäuren 38-58
des HIV-tat-Proteins.
11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das gewünschte
Molekül ein Arzneistoff ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Arzneistoff ein
Peptidanalogon oder ein enzymhemmendes kleines Molekül
ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das gewünschte
Molekül eine diagnostische Sonde ist.
14. Verwendung eines Konjugats aus einem gewünschten
Molekül/tat-Protein, umfassend ein gewünschtes
nicht-tat-Molekül, das mit einem tat-Protein oder -Peptid mit einer
Aktivität für zelluläre Aufnahme kovalent verknüpft ist,
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung für
die Einschleusung des gewünschten nicht-tat-Moleküls in
eine Zelle.
15. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 14, wobei das
tat-Protein ausgewählt ist aus den Aminosäuren 1-67, 1-
72 oder 1-58 des HIV-tat-Proteins wie in Figur 1
gezeigt.
16. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 14 oder 15, wobei das
gewünschte Molekül ausgewählt ist aus Proteinen,
Peptiden oder Nucleinsäuren.
17. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 16, wobei das
gewünschte Molekül ein Polypeptid ist, ausgewählt aus
regulatorischen Faktoren, Antikörpern, Enzymen oder
Toxinen.
18. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 14 oder 15,
wobei das gewünschte Molekül ein Arzneistoff ist.
19. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 18, wobei der
Arzneistoff ein Peptidanalogon oder ein enzymhemmendes
kleines Molekül ist.
20. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 14 oder 15,
wobei das gewünschte Molekül eine diagnostische Sonde ist.
21. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 14
bis 20, wobei das Arzneimittel außerdem ein
Stabilisierungsmittel umfaßt.
22. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 21, wobei das
Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus einem Metall
oder einem lysosomotrophen Mittel.
23. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 22, wobei das
lysosomotrophe Mittel ausgewählt ist aus Ohloroquin,
Amantadin, Monensin, Methylamin oder Ammoniumchlorid.
24. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 21, wobei das
Arzneimittel außerdem ein basisches Peptid umfaßt.
25. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 24, wobei das
basische Peptid ausgewählt ist aus Protamin oder den
Aminosäuren 38-58 des HIV-tat-Proteins.
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