DE69018823T2

DE69018823T2 - Chymosin-wiedergewinnung und -reinigung.

Info

Publication number: DE69018823T2
Application number: DE69018823T
Authority: DE
Inventors: Henry G. Pacific Ca 94044 Heinsohn; Matthew B. San Francisco Ca 94122 Murphy
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Chr Hansen AS
Priority date: 1989-06-13
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 1995-12-07
Anticipated expiration: 2010-06-14
Also published as: NZ234058A; EP0477277A1; NO914886L; DK0477277T3; FI100110B; EP0477277B1; EP0477277A4; JPH05500301A; JP2974763B2; FI915812A0; DE69018823D1; NO914886D0; CA2058453A1; AU5852290A; AU629656B2; WO1990015865A1; CA2058453C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung und Reinigung von Chymosin aus wäßrigen Enzymgemischen, insbesondere aus durch Fermentationsverfahren hergestellten wäßrigen Enzymgemischen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Chymosin ist unter Einsatz verschiedener Techniken abgetrennt und gereinigt worden. Beispielsweise sind Kalbslab oder -abextrakte unter Verwendung von Affinitätsliganden von blauem Farbstoff gereinigt worden, wie in US-A-4,666,843 Subramanian, oder unter Verwendung einer Zellulose-Harzsäule, wie in US-A4,745,063 Birschbach beschrieben. Die gleichen Verfahren sind eingesetzt worden, um mikrobiell erzeugtes Chymosin zu gewinnen und zu reinigen, wie in US-A-4,743,551 Subramanian bzw. US-A4,721,673 Uren et al beschrieben. Die Offenbarungen dieser Patente sind hierin durch Verweis eingeschlossen.
Jedoch sind diese Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Chymosin bei der Herstellung von Chymosin durch mikrobielle Aktivität in industriellem oder kommerziellem Maßstab unzureichend. Zur industriellen Produktion in kommerziellem Maßsstab sind effizientere, wirtschaftlichere Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Chymosin erforderlich. Es ist auch wesentlich, daß solche Verfahren zur kommerziellen Produktion in wirtschaftlichen, größeren Maßstäben anwendbar sind.
Von besonderem Interesse bei der industriellen Produktion von Chymosin durch Mikroben ist die Produktion von Chymosin durch Fermentation von filamentösen Pilzen, die genetisch so modifiziert worden sind, daß sie Chymosin exprimieren und ausscheiden, wie in der hierin durch Verweis eingeschlossenen US-A-163,219 Lawlis et al., eingereicht am 26. Februar 1988, geoffenbart.
EP-A-123,928 offenbart unter anderem ein durch rekombinante DNA-Techniken erhaltenes Polypeptid, das Milchgerinnungswirkung aufweist. Eine Beschreibung der Reinigung und Gewinnung des Polypeptids ist eingeschlossen.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, effiziente Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von Chymosin aus wäßrigen Enzymgemischen bereitzustellen, insbesondere aus wäßrigen Gemischen, die durch Fermentation oder andere mikrobielle Aktivität hergestellt wurden, und insbesondere zur Herstellung von Chymosin in kommerziellem Maßstab.
Gemäß voriiegender Erfindung wird ein Verfahren zum Abtrennen von Chymosin aus einem wäßrigen Enzymgemisch bereitgestellt, umfassend:
(a) die Zugabe eines Salzes zum wäßrigen Gemisch, in einer Konzentration, die ausreicht, um sicherzustellen, daß Chymsoin im wesentlichen das einzige Enzym- Material ist, das an ein Phenyl-Sepharose-Harz bindet, und/oder das Verringern des pHs des wäßrigen Gemischs auf unter etwa 3;
(b) das In-Kontakt-Bringen des wäßrigen Enzymgemischs mit einem Phenyl-Sepharose- Harz über eine ausreichende Zeitspanne, um zu ermöglichen, daß sich das Chymosin an das Harz bindet;
(c) das Abtrennen des Harzes und des gebundenen Chymosins aus dem wäßrigen Gemisch; und
(d) das Eluieren des Chymosins aus dem Harz.
Die Zeichnung zeigt die Elution von Chymosin aus Phenyl-Sepharose-Harz als Reaktion auf die Salzkonzentration.
Die vorliegende Erfindung wird bezogen auf wäßrige Enzymgemische beschrieben, die Chymosin enthalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders nützlich bei wäßrigen Enzymgemischen, die durch mikrobielle Expression erhalten werden, wobei das Chymosin intrazellulär oder durch mikrobielle Expression hergestellt wird, wobei das Chymosin in den Zellen erzeugt und von den Zellen ausgeschieden wird. Ein gemäß vorliegender Erfindung nützliches, bevorzugtes wäßriges Enyzmgemisch ist das Ergebnis der Fermentation mikrobieller Expressionswirte, die das Chymosin ausscheiden, was zu extrazellulärem Chymosin führt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch angewandt werden, um Chymosin von wäßrigen Enzymgemischen abzutrennen, die aus anderen Quellen erhalten wurden, wie aus Kalbslabextrakten.
Bei einer bevorzugten Art der Durchführung der vorliegenden Erfindung wird eine Fermentations-Kulturbrühe, wie z.B. von der Fermentation von Aspergillus Niger, mit Schwefelsäure behandelt, um den pH-Wert auf etwa 2 zu senken. Etwa 1 bis 2 Gew.-% (basierend auf dem Gewicht des gesamten Gemischs) Essigsäure werden zugegeben, um die Fermentation zu beenden und die Zellen im wesentlichen vollständig abzutöten. Dann wird Ammoniumhydroxid zugegeben, um den pH-Wert auf etwa 5,9 zu bringen. Das Gemisch wird dann mit Wasser in etwa auf das Doppelte seines ursprünglichen Volumens verdünnt und filtriert, um Zellbruchstücke und andere Feststoffe zu entfernen. Entweder vor oder nach dem Filtrieren wird ein Salz, vorzugsweise Natriumchlorid, zugegeben, um das flüssige Filtrat auf eine Salzkonzentration von etwa 2 M zu bringen. Der pH-Wert wird bei etwa 5,9 gehalten, und das flüssige Filtrat wird auf eine Phenyl- Sepharose-Harzsäule aufgebracht. Das Chymosin bindet an das Harz, während die anderen Enzyme und die Salzlösung durch die Phenyl-Sepharose-Harzsäule hindurchgehen und verworfen werden. Die Harzsäule wird dann mit 2 M Natriumchlorid und 50 mM Phosphat gewaschen, um den pH-Wert bei etwa 5,9 zu halten. Nach dem Waschen wird das Chymosin mit Wasser oder mit verdünnter Salzlösung, wie 50 mM Phosphat, aus der Phenyl-Sepharose-Harzsäule eluiert. Das Chymosin wird auf einmal eluiert; es besteht nicht die Notwendigkeit für einen Gradienten oder schrittweises Eluieren, da Chymosin das einzige vorherrschende Enzym in solchen Enzymgemischen ist, das an das Phenyl-Sepharose-Harz bindet. Das nach diesem Verfahren hergestellte Chymosin ist im wesentlichen rein und hat im wesentlichen Lebensmittelqualität und muß nur mit Wasser verdünnt, filtriert und mit Natriumchlorid und Konservierungsmittel behandelt werden, damit das Produkt den erwünschten Anforderungen zum Verkauf als zur industriellen Verwendung geeignetes Chymosin-Endprodukt entspricht. Die Harzsäule wird dann mit 0,1 M bis etwa 1 M Natriumhydroxid gewaschen, dann mit Wasser gewaschen und wird für eine weitere Charge vorbereiteten Filtrats wiederverwendet.
Bei einem weiteren bevorzugten Art der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der pH-Wert des Fermentationsgemisches mit Schwefelsäure auf etwa 2 gesenkt, und etwa 1 bis 2 Gew.-% Essigsäure werden zugegeben, um den Fermentationsvorgang zu beenden und Zellabtötung zu bewirken. Bei diesem Verfahren wird der pH-Wert des Gemischs bei etwa 2 gehalten, während das Gemisch filtriert wird, um die Zellbruchstücke und andere Feststoffe zu entfernen und ein flüssiges Filtrat herzustellen, das ein Enzymgemisch enthält. Nachdem durch den Filtrationsschritt das Filtrat erhalten wurde, wird der pH-Wert weiter bei etwa 2 gehalten, während das Filtrat auf eine Phenyl-Sepharose-Harzsäule aufgebracht wird. Falls gewünscht, können dem Filtrat Salze zugegeben werden, bevor das Filtrat auf die Harzsäule aufgebracht wird. In manchen Fällen kann die Zugabe von Salz die Bindung von Chymosin an die Harzsäule verstärken. Beispiele für solche Salze sind 0,5 M Ammoniumsulfat oder 0,5 M Natriumsulfat. Beim Kontakt des Filtrats mit der Phenyl-Sepharose-Harzsäule bindet das Chymosin an das Harz in der Säule, während die anderen Enzyme und die Filtratlösung durch die Säule hindurchgehen und verworfen werden. Die das gebundene Chymosin enthaltende Phenyl-Sepharose-Harzsäule wird dann mit 0,2 M Natriumchloridlösung gewaschen. Während der pH-Wert bei etwa 2 gehalten und nach dem Eluieren auf eine gewünschte Höhe von etwa 5,9 angehoben werden kann, wird es vorgezogen, daß der pH-Wert an diesem Punkt im Verfahren mit einer 0,2 M Phosphatlösung auf etwa 5,9 angehoben wird. Nachdem die Harzsäule gewaschen und der pH-Wert eingestellt wurde, wird, falls gewünscht, das Chymsoin mit Wasser oder einer schwachen Salzlösung, wie 50 mM Phosphatlösung, auf einmal eluiert. Wie oben ist das eluierte Chymosin im wesentlichen rein und kann für Anwendungen verwendet werden, bei denen Lebensmittelqualität erforderlich ist. Das eluierte Chymosin wird auf die gewünschte Konzentration verdünnt, Natriumchlorid und ein Konservierungsmittel zugegeben und die Lösung filtriert, um das gewünschte Produkt für den Handel bereitzustellen. Ebenfalls wie oben wird die Harzsäule dann mit 0,1 M bis 1 M Natriumhydroxid und anschließend mit Wasser gewaschen, um die Harzsäule zur Wiederverwendung für eine weitere Charge hergestellten Filtrats vorzubereiten.
Es ist zu erkennen, daß die obigen Beschreibungen bevorzugte Arten der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellen und daß bei der Vorgangsweise den Lehren der vorliegenden Erfindung folgend zahlreiche Variationen der obigen Verfahren durchgeführt werden können. Die verschiedenen Verfahrensbedingungen können verändert werden, und die verwendeten Reagenzien können ausgetauscht werden, um verschiedene erwünschte oder optimale Arbeitsbedingungen für die Gewinnung von Chymosin aus jedem geeigneten wäßrigen Enzymgemisch, das Chymosin enthält, zu schaffen. Das wesentliche Merkmal des Verfahrens ist jedoch die Verwendung von Phenyl-Sepharose-Harz. Es ist festgestellt worden, daß das Phenyl-Sepharose-Harz einzigartig aktiv und selektiv hinsichtlich der Bindung von Chymosin aus wäßrigen Gemischen ist, die zahlreiche andere Bestandteile und Enzyme enthalten. Bei Sepharoseharzen mit anderen funktionellen Gruppen, wie Octyl, ist die gewünschte Chymosinselektivität nicht festgestellt worden. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird zwar nicht durch die folgende Theorie eingeschränkt oder interpretiert, es wird jedoch angenommen, daß die funktionelle Phenylgruppe auf dem Sepharoseharz für das hohe Ausmaß an Selektivität bezüglich Chymosin sorgt. Es ist festgestellt worden, daß das Phenyl-Sepharose-Harz besonders nützlich zum Abtrennen von Chymosin aus einer Fermentations-Kulturbrühe ist, da eine Fermentations- Kulturbrühe eine Vielfalt anderer Bestandteile, Enzyme und Verunreinigungen enthält. Im Gegensatz dazu stören derartige komplexe Gemische die Wirkung von Anionen- und Kationenaustauschharzen, wodurch sie diese für die Gewinnung von Chymosin aus einer Fermentations-Kulturbrühe unwirksam machen.
Bei der vorliegenden Erfindung ist ziemlich überraschend festgestellt worden, daß Chymosin im wesentlichen das einzige in einer Fermentations-Kulturbrühe vorhandene Enzymmaterial ist, das unter Bedingungen eines geringen pH-Werts und/oder einer hohen Salzkonzentration an das Sepharoseharz bindet. Normalerweise bindet eine Anzahl verschiedener Enzyme und anderer Materialien an Harze vom Sepharosetyp, dann wird das gewünschte Enzym durch sequentielle, teilweise oder schrittweise Elution als eine Fraktion gewonnen, indem der pH-Wert und/oder die Salzkonzentration der Eluierungsflüssigkeit allmählich geändert werden. Bei diesem Standardverfahren wird jedes Enzym zu einer anderen Zeit eluiert, wodurch getrennte Fraktionen erzeugt werden, von denen eine oder mehrere das gewünschte zu gewinnende Enzym enthält/enthalten. Fraktionelle Elution führt üblicherweise auch zu Überlappung der erzeugten Fraktionen, sodaß die gewünschten Produktelutionen zumindest teilweise in die vorangegangenen oder nachfolgenden Fraktionen übergreifen, was die Gesamtmenge des gewünschten Produktes verringert, zumindest jene, die mit einem gewünschten hohen Reinheitsgrad gewonnen werden kann. Derartige fraktionelle Eluierungsverfahren sind zur wirtschaftlichen, kommerziellen Verwendung bei Abtrennungen in großem Maßstab nicht effizient genug.
Im Gegensatz zu obigem ist beim erfindungsgemäßen Verfahren festgestellt worden, daß Chymosin im wesentlichen der einzige Bestandteil eines Fermentations- Kulturbrühenfiltrats ist, der an das Phenyl-Sepharose-Harz bindet. Folglich ist Gradienten- oder fraktionelle Elution beim erfindungsgemäßen Verfahren weder notwendig noch erwünscht; das Chymosin kann auf einmal eluiert werden. Dieses Verfahren bietet hohe Gewinnungsraten, weil das Phenyl-Sepharose-Harz zumindest etwa 95 Gew.-% des gesamten Chymosins aus dem Fermentations-Kulturbrühenfiltrat entfernt. Dieses Verfahren ist effizient, weil das Chymsoin rasch in einem Schritt aus der Harzsäule eluiert werden kann, ohne daß fraktionelles Eluieren erforderlich ist. Das resultierende Chymosinprodukt hat eine Reinheit von zumindest 90 Gew.-% und kann ohne wesentliche weitere Behandlung zur Entfernung von Verunreinigungen zur kommerziellen Verwendung bereitgestellt werden. Das kommerzielle Chymosinprodukt wird üblicherweise auf etwa 5 g pro Gallone oder etwa 1,5 g/l Chymosin verdünnt, die Salzkonzentration (üblicherweise NaCl) wird normalerweise auf etwa 18% gebracht, und ein Konservierungsmittel wie Natriumbezoat wird zugegeben. Das zur Verwendung mit Lebensmittelqualität bestimmte, fertige, kommerzielle Produkt wird üblicherweise auch abschließend filtriert, um jegliche, möglicherweise vorhandene, unerwünschte Feststoffe oder Teilchen zu entfernen.
Phenyl-Sepharose-Harze sind eine wohlbekannte Klasse von Harzen, die auch als vernetzte Phenyl-Agarose-Harze bekannt sind. "Phenyl-Sepharose CL-4B" ist ein Markenname für vernetzte Phenyl-Agarose-Harze der Pharmacia Fine Chemicals, AB, und wie hierin verwendet bezieht sich "Phenyl-Sepharose" auf jegliches vernetzte Agaroseharz mit ausreichender Phenylfunktionalität, um Chymosin aus wäßriger Lösung oder Suspension wirksam zu binden.
Das Phenyl-Sepharose-Harz kann in Teilchenform als Gesamtcharge mit einer Teilchengröße im Bereich von etwa 40 um bis etwa 400 um verwendet und mit dem wäßrigen Enzymgemisch vermischt werden, um die Bindung des Chymosins an das Harz zu ermöglichen. Das Harz kann dann von der wäßrigen Lösung abgetrennt und anschließend eluiert und rezykliert werden, wie oben beschrieben. Jedoch wird bevorzugt, das Phenyl-Sepharose-Harz in der Form einer gepackten Säule zu verwenden, wobei die Säule Teilchen des Harzes mit einer Teilchengröße im Bereich von etw 40 um bis etwa 400 um enthält.
Fachleute werden erkennen, daß die oben in der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens genannten Säuren, Basen und Salze geändert oder durch äquivalente Säuren, Basen oder Salze ersetzt werden können, die den gewünschten pH-Wert oder den gewünschten Salzegehalt aufweisen, ohne daß die Funktion des Phenyl-Sepharose- Harzes gemäß vorliegender Erfindung gestört wird, und die das Chymosin nicht denaturieren. Auch können, wie von Fachleuten erkannt, die oben angeführten pH- Werte innerhalb bestimmter Bereiche modifiziert und immer noch die gewünschten Ergebnisse erzielt werden. Beispielsweise kann die Fermentations-Kulturbrühe bei einem pH-Wert unter etwa 6 verarbeitet und filtriert werden, vorzugsweise liegt der pH- Wert unter etwa 3, und es wird am meisten bevorzugt, daß der pH-Wert in einem Bereich von etwa 2 gehalten wird. Ebenso kann, wenn der pH-Wert beim Verfahren vorzugsweise auf etwa 5,9 eingestellt wird, der pH-Wert an diesen Punkten im Verfahren im Bereich von etwa 5 bis etwa 6 und vorzugsweise zwischen etwa 5,5 and 6 biegen. Auf ähnliche Weise kann die Konzentration der konzentrierten Salze variiert werden, um das gewünschte Ergebnis zu liefern. Es ist festgestellt worden, daß das Chymosin in Gegenwart einer konzentrierten Salzlösung mit zumindest etwa 1 M und/oder bei einem pH-Wert des wäßrigen Gemischs von weniger als etwa 3 am besten an das Phenyl-Sepharose-Harz bindet. Normalerweise wird aufgrund seiner geringen Kosten die Verwendung von Natriumchlorid bevorzugt; Beispiele für andere brauchbare Salze sind Na&sub2;SO&sub4; und (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;. Eine bevorzugte Salzkonzentration der Lösung beträgt etwa 2 M, wenn auch höhere und geringere molare Konzentrationen des Salzes im wäßrigen Enzymgemisch, beispielsweise im Bereich zwischen etwa 1 M und 2 M, wirksam für die Bindung von Chymosin an das Phenyl-Sepahrose-Harz sein können. Beim Elutionsschritt ist festgestellt worden, daß das Chymosin leicht mit Wasser oder mit schwachen Salzlösungen durch Einzel- oder Gesamtelution aus dem Phenyl- Sepharose-Harz eluiert werden kann. Es wird angenommen, daß das Chymosin am besten an das Phenyl-Sepharose-Harz bindet, wenn die Ionenkonzentration in einer Salzlösung hoch ist, und dann leicht eluiert wird, wenn die Ionenstärke des Chymosins am Phenyl-Sepharose-Harz durch Eluieren mit Wasser oder verdünnter Salzlösung verringert wird.
Nachdem die vorliegende Erfindung durch die obigen bevorzugten Arten der Durchführung der vorliegenden Erfindung und deren Varianten beschrieben worden ist, wird die Erfindung nun durch die folgenden spezifischen Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel beschreibt ein Chymosin-Gewinnungsverfahren zur Herstellung von Chymosin mit Lebensmittelqualität. Das Chymosin wird durch Fermentation von Aspergillus Niger var. awamori gewonnen. Das Verfahren wird bezogen auf einen 3000 I-Fermentierer und ein gewonnenes Kulturbrühenvolumen von etwa 2500 l beschrieben. Nach Beendigung der Fermentation wird die Kulturbrühe durch Einstellung des pHs auf 2,0-2,5 mit Schwefelsäure und Zugabe von Essigsäure inaktiviert. (Siehe die am 13. Juni 1989 von Lawlis et al. eingereichte und hierin durch Verweis eingeschlossene US-A-07/365,945.) Die lnaktivierungsbedingungen werden 1 Stunde lang bei der Fermentationstemperatur und unter Luftzufuhr aufrechterhalten. Durch diese Inaktivierung wird ausreichende Reduktion lebensfähiger Zellen zur Freisetzung [von Chymosin] erreicht. Nach der Inaktivierung wird der pH-Wert mit Ammoniumhydroxid auf 5,5 eingestellt. Für die Inaktivierung und darauffolgende Einstellung des pH-Werts sind etwa 125 kg Schwefelsäure, 25 kg Eisessig und 80 l 28%- ige Ammoniumhydroxidlösung erforderlich.
Die inaktivierte Kulturbrühe wird unter Verwendung eines Rotationsvakuumtrommelfilters filtriert. Die Kulturbrühe wird mit entionisiertem Wasser (2500 l bis 6250 l) auf das 2,5fache verdünnt. Das verdünnte Material wird mit 3% Gew/Vol Manville Celite 545 versetzt und durch eine Anschwemmschicht aus Celite 545 filtriert. Der Kuchen wird gewaschen, um die Ausbeuten zu erhöhen. Das Filtratvolumen sollte gleich dem anfänglichen Feed sein.
Das Filtrat wird vor dem Phenyl-Sepharose-Harz-Kontaktschritt unter Anwendung von zweistufiger Kissenfiltration gereinigt. Das Filtrat wird mit 60/0 Gew/Vol NaCl und 1 % Gew/Vol HyFlo Super Cel versetzt und durch SEN Supra 200-Filterkissen filtriert. Das Filtrat aus dem ersten Schritt wird gesammelt unter Verwendung von Supra 50-Kissen gepreßt. Beim zweiten Filtrationsschritt wird keine Filterhilfe verwendet.
Das geklärte Filtrat wird durch eine 10 l-Phenyl-Sepharose-Harzsäule ("FAST FLOW L.S.", Teilchengröße 40-100 um, von Pharmacia Fine Chemicals, AB) geschickt. Nach dem Beladen wird die Säule mit 3 Volumsteilen (30 l) 6%-iger NaCl-Lösung gewaschen. Die Säule wird dann auf einmal mit dem 4fachen Säulenvolumen (40 l) 50 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 5,5 eluiert. Die eluierte Chymosinlösung wird zur kommerziellen Verwendung mit Lebensmittelqualität auf 17% NaCl eingestellt.

BEISPIEL II

Unter Verwendung des gleichen Filtrats und Phenyl-Sepharose-Harzes wie in Beispie I veranschaulicht dieses Beispiel eine Gradientenelution des Chymosins aus dem Harz. BEDINGUNGEN: 11,4 ML PHENYL-SEPHAROSE-HARZ BELADUNG UND ELUTION MIT 5,0 ML/MIN Nr. Beschreibung Volumen (ml) CHU insgesamt mg insgesamt Ausgangsmat. Inaktivieren + Wachen pH-Änderung Fraktion Gemisch (CHU = Chris. Hansen-Einheit) * Gradient: 2 M bis 0, wie in der Zeichnung gezeigt.
Die Gesamtausbeute an Chymosin beträgt etwa 85 Gew.-%. Die beiliegende Zeichnung zeigt die obige Elution von Chymosin als Funktion der Ammoniumsulfatkonzentration und veranschaulicht, wie einfach die Gewinnung des Chymosins in einer Einzelelution ist.

BEISPIEL III

Unter Verwendung eines Filtrats ähnlich wie in Beispiel I beträgt die Kapazität des Phenyl-Sepharose-Harzes unter den folgenden Bedingungen: Bedingungen Harzkapazität (mg Chymosin/l Harz)
Dieses Beispiel veranschaulicht, daß das bevorzugte Verfahren zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung jenes bei geringem pH-Wert ist.

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung von Chymosin aus einem wäßrigen Enzymgemisch, umfassend:

(a) die Zugabe eines Salzes zum wäßrigen Gemisch, in einer Konzentration, die ausreicht, um sicherzustellen, daß Chymosin im wesentlichen das einzige Enzym- Material ist, das an ein Phenyl-Sepharose-Harz bindet, und/oder das Verringern des pHs des wäßrigen Gemischs auf unter etwa 3;

(b) das In-Kontakt-Bringen des wäßrigen Enzymgemischs mit einem Phenyl- Sepharose-Harz über eine ausreichende Zeitspanne, um zu ermöglichen, daß sich das Chymosin an das Harz bindet;

(c) das Abtrennen des Harzes und des gebundenen Chymosins aus dem wäßrigen Gemisch; und

(d) das Eluieren des Chymosins aus dem Harz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das zugegebene Salz eine anorganische Salzlösung mit einer Konzentration von zumindest etwa 1 Mol/l umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Elutionsschritt die Verwendung einer verdünnten Salzlösung mit einer Konzentration von nicht mehr als etwa 0,5 Mol/l umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das anfängliche wäßrige Enzymgemisch in einem Fermentationsschritt gebildet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, worin das anfängliche wäßrige Enzymgemisch in einem Fermentationsschritt gebildet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Harz und das gebundene Chymosin vor dem Elutionsschritt mit einer Salzlösung mit einer Konzentration von zumindest etwa 1 Mol/l gewaschen werden.