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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von (+)-Homopilopinsäure und den Salzen davon. Diese
Verbindungen sind als ein Zwischenprodukt für die Herstellung
von (+)-Pilocarpinhydrochlorid nützlich, welches ein
wertvolles Medikament für die Behandlung von grünem Star
(Glaukoma) ist.
Stand der Technik
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Derzeit werden die Verbindungen (+)-Pilocarpinhydrochlorid
der Formel (III):
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durch Extrahieren der Blätter der Pilocarpus jaborandi-
Pflanze erhalten, welche in Brasilien und anderen Ländern
einheimisch ist. Eine solche Methode beinhaltet jedoch ein
Problem, indem die Versorgung von natürlich wachsendem
Rohmaterial dem Einfluß des Klimas unterworfen ist und schwer
konstant zur Verfügung gestellt werden kann.
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Wenn (+)-Pilocarpinhydrochlorid durch Synthese hergestellt
wird, wird es durch Hydrolyse einer Mischung (+
)-Homopilopinsäureester und (-)-Homopilopinsäureester (diese Mischung wird
im folgenden als (±)-Homopilopinsäureester bezeichnet) unter
stark sauren Bedindungen, der optischen Auflösung der
resultierenden Mischung von (+)-Homopilopinsäure der Formel (IV):
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und (-)-Homopilopinsäure der Formel (V):
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(wobei diese Mischung im folgenden als (±)-Homopilopinsäure
bezeichnet wird) unter Verwendung von d-α-Methylbenzylamin
zur Entfernung von (-)-Homopilopinsäure und Umwandlung der
(+)-Homopilopinsäure in (+)-Pilocarpinhydrochlorid
hergestellt (J.I. DeGraw et. al., J. Pharm. Sci., 64:1700-1701,
(1975)).
Mit der Erfindung zu lösende Probleme
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Die Hydrolyse von (±)-Homopilopinsäureester unter stark
sauren Bedindungen wie in dem oben beschriebenen Stand der
Technik, verursacht die Spaltung des Lactonringes, und die
Ausbeute an (+)-Homopilopinsäure ist niedrig. Auch bei der
Hydrolyse unter alkalischen Bedingungen wird der Lactonring
gespalten, und die Ausbeute nimmt beträchtlich ab. Daher ist es
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur
Herstellung von (+)-Homopilopinsäure zur Verfügung zu stellen,
das wirksam ist und hohe Ausbeuten liefert.
Mittel zur Lösung des Problems
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Die Erfinder haben gefunden, daß (+)-Homopilopinsäure wirksam
und in hoher Ausbeute hergestellt werden kann, indem die
Hydrolyse unter milden Bedingungen unter Verwendung eines
Mikroorganismus oder eines Enzymes durchgeführt wird, um die
Spaltung des Lactonringes zu verhindern.
[Zusammenfassung der Erfindung]
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Die vorliegende Erfindung betrifft (1) ein Verfahren zur
Herstellung von (+)-Homopilopinsäure und den Salzen davon,
welches die Hydrolyse von (±)-Homopilopinsäureester, nämlich
eine Mischung der Verbindungen der allgemeinen Formeln (I)
und (II), worin R&sub1; und R&sub2; gerade oder verzweigte
C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoffe
bezeichnen, umfaßt, unter Verwendung eines
Mikroorganismus, der der Gattung Arthrobacter, Aspergillus,
Escherichia, Cunninghamella, Xanthomonas, Candida,
Pseudomonas, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus,
Brevibacterium, Flavobacterium, Mycobacterium, Rhizomucor, Rhodotorula
oder Rhodococcus angehört oder einem behandelten Material
davon (Verfahren 1).
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist es (2) ein Verfahren
zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure und den Salzen davon
zu liefern, welches die Hydrolyse von
(±)-Homopilopinsäureester, nämlich eine Mischung der Verbindungen der allgemeinen
Formeln (I) und (II), worin R&sub1; und R&sub2; gerade oder verzweigte
C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoffe bezeichnen, umfaßt, indem
wenigstens ein Enzym von Lipasen, Esterasen, Cholesterolesterasen
und Lipoproteinlipasen verwendet wird (Verfahren 2).
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es (3) ein
Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure und den
Salzen davon zu liefern, welches die Hydrolyse einer Mischung
von (+)-Homopilopinsäureester der allgemeinen Formel (I),
worin R&sub1; geraden oder verzweigten C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoff
bezeichnet, und (-)-Homopilopinsäureester der allgemeinen
formel (II), worin R&sub2; geraden oder verzweigten
C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoff bezeichnet, unter Verwendung entweder einer
Hydrolase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lipasen,
Esterasen und Cholesterolesterasen oder eines
Mikroorganismus, der der Gattung Brevibacterium, Escherichia oder
Rhodotorula angehört oder einem behandelten Material davon, das
Abtrennen des nicht umgesetzten (+)-Homopilopinsäureester,
danach die Hydrolyse des nicht umgesetzten (+
)-Homopilopinsäureesters umfaßt, unter Verwendung entweder einer
Hydrolase, ausgewählt aus Lipasen und Esterasen, oder eines
Mikroorganismus, der der Gattung Asperqillus, Escherichia,
Xanthomonas, Candida, Pseudomonas, Serratia, Cellulomonas,
Nocardia, Bacillus, Flavobacterium, Brevibacterium,
Mycobacterium,
Rhizomucor oder Rhodococcus angehört, oder einer
behandelten Materie davon (Verfahren 3).
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Fig. 1 zeigt das NMR-Spektrum des Methylesters des Produktes
von Beispiel 37 in CDCl&sub3; in Gegenwart von 0,5 Äquivalenten
Eu(hfc)&sub3;.
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Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben.
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Geeignete R&sub1;- und R&sub2;-Gruppen sind gerade oder verzweigte C&sub1;-
C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoffe, typischerweise Methyl, Ethyl,
Isopropyl, t-Butyl und Octyl.
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Geeigente Mikroorganismen für Verfahren 1 der vorliegenden
Erfindung sind Arthrobacter globiformis IFO 12136,
Aspergillus sojae IAM 2703, Aspergillus terreus IAM 2179, Escherichia
coli IFO 3366, Cunninghamella echinulata IFO 4443,
Xanthomonas campestris IFO 13303, Xanthomonas oryzae IFO 3510,
Candida utilis IFO 4961, Pseudomonas aeruginosa IAM 1275,
Serratia plymuthica JCM 1244, Cellulomonas turbata FERM P-9059,
Nocardia erythropolis IAM 1484, Nocardia opaca IAM 12123,
Nocardia corallina IAM 12121, Nocardia rubropertincta JCM 3204,
Bacillus subtilis IFO 3108, Flavobacterium lutescens IFO
3084, Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588, Mycobacterium
rhodochrous IFO 13161, Rhizomucor miehei IFO 9740,
Rhodococcus erythropolis IFO 12682, Rhodotorula rubra IFO 0383,
und dergleichen.
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Obwohl Verfahren 1 der vorliegenden Erfindung durch Züchtung
eines dieser Mikroorganismen in einem Medium, das einen (±)-
Homopilopinsäureester enthält, ausgeführt werden kann, wird
es bevorzugt, durch Züchtung dieser Mikroorganismen in einem
Medium, das Hefeextrakt, Pepton, Glucose, Mineralsalze, etc.,
bei 20 bis 37ºC während eines Zeitraums von 1 Tag bis zu 1
Woche durchgeführt und die resultierende Kultur, Zellen, den
Überstand oder ein behandeltes Material davon, wie eine
Rohenzymlösung, welche durch Zerbrechen der Zellen in der
Kultur erhalten wird, mit (±)-Homopilopinsäureester in
Kontakt zu bringen.
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Beispielsweise kann (+)-Homopilopinsäure in einer wäßrigen
Lösung erhalten werden, indem von 0,1 bis 30%, bevorzugt 0,5
bis 10 Gew.-% (±)-Homopilopinsäureester zu Phosphatpuffer
oder Tris-HCl mit einem pH von 5 bis 9, bevorzugt von 6,0 bis
8,0, welcher die Kultur, Zellen, den Überstand oder die
behandelte Materie davon enthält, zugesetzt werden, und die
Mischung bei 20 bis 37ºC während 2 bis 100 Stunden geschüttelt
wird. Der pH-Wert der Reaktionslösung nimmt mit
fortschreitender Hydrolyse ab, und daher ist es bevorzugt, 0,5 N
Natriumhydroxid, gesättigtes Natriumhydrogencarbonat oder
gesättigtes Natriumcarbonat hinzuzufügen, um den pH-Wert zu
neutralisieren und einzustellen. Nach der Umsetzung kann (+
)-Homopilopinsäure durch gewöhnliche Lösungsmittelextraktion,
Ionenaustauschchromatographie, etc. aus der Reaktionsmischung
gewonnen und gereinigt werden. Insbesondere können die nicht
umgesetzten Ausgangsester durch Extraktion mit Diethylether
entfernt werden. Der pH-Wert der verbleibenden wäßrigen
Schicht wird auf 2 bis 4 mit 2 N HCl oder 2 N H&sub2;SO&sub4;
eingestellt, und NaCl wird bis zur Sättigung zugesetzt. Dieser
Mischung wird ein gleiches Volumen an Ethylacetat zugesetzt,
heftig gerührt und zentrifugiert, um die Ethylacetatschicht
zu gewinnen, welche dann unter reduziertem Druck getrocknet
wird, um Rohkristalle von Homopilopinsäure zu liefern. Das
Verhältnis von (+)-Homopilopinsäure und (-)-Isomer variiert
von 91:9 bis 25:75, abhängig von der Art des verwendeten
Mikroorganismus. Bevorzugt wird Rhizomucor miehei IFO 9740
verwendet, um (+)-Homopilopinsäure in hoher Ausbeute zu
erhalten. Kontaminierende (-)-Homopilopinsäure kann durch
Behandlung mit einem Mittel, das gewöhnlich zur optischen
Auftrennung verwendet wird, wie d-α-Methylbenzylamin, entfernt
werden. Aus der so erhaltenen (+)-Homopilopinsäure kann
Pilocarpinsäure der gleichen Art wie der der natürlich vorkommenden
Substanz durch bekannte Methoden erhalten werden.
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Typische Enzyme, welche für das Verfahren 2 der vorliegenden
Erfindung erwähnt werden können, beinhalten Lipase PS (Amano
Pharmaceutical Co. LTD), abgeleitet von Pseudomonas sp.,
Lipase (Seikagaku Kogyo Co. LTD) abgeleitet von Rhizopus
delemar, Lipozym IM 20 (Novo Nordisk Bioindustry LTD), abgeleitet
von Rhizomucor miehei, Lipase B von Pseudomonas fragi und
Lipase OF von Candida cylindraceae (Meito Sangyo Co. LTD),
Lipase T-01 (Toyo Jozo Co. LTD) von Pseudomonas fragi, Esterase
(Boehringer Mannheim) von Schweineleber, Cholesterol Esterase
T-18 (Toyo Jozo Co. LTD) von Pseudomonas sp. und Lipoprotein
Lipase (Wako Pure Chemical Industries Co. LTD) von
Pseudomonas sp.
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In Verfahren 2 der Erfindung wird die Reaktion durch
Auflösung eines der oben erwähnten Enzyme in Wasser oder anderen
geeigneten Puffern und Inkontaktbringen mit (+
)-Homopilopinsäureester durchgeführt. Das Verhältnis von Enzym, (+
)-Homopilopinsäureester und dem Lösungsmittel variiert abhängig von
dem verwendeten Enzym und liegt gewöhnlich im Bereich von
1:0,5-1.000:2-1.000.000 Gewichtsteilen. Bevorzugt wird die
Reaktion durch Schütteln bei 20 bis 37ºC während 2 bis 100
Stunden in einem Phosphatpuffer oder Tris-HCl bei einem pH
von 5 bis 9, bevorzugt von 6,0 bis 8,0 durchgeführt, wobei
(+)-Homopilopinsäure in der wäßrigen Lösung gebildet wird.
Die Reaktion kann durch Hinzufügung eines oberflächenaktiven
Mittels, wie Tween 80, in einer Konzentration von 0,02 bis 1
Gew.-% beschleunigt werden. Der pH-Wert der Reaktionsmischung
nimmt mit fortschreitender Bildung von (+)-Homopilopinsäure
ab, und daher ist es bevorzugt, den pH-Wert mit 0,5 N
Natriumhydroxid, gesättigtem Natriumhydrogencarbonat oder
gesättigtem Natriumcarbonat zu neutralisieren und einzustellen.
Nach der Umsetzung kann das Natriumsalz von (+
)-Homopilopinsäure in analoger Weise wie in Verfahren 1 durch gewöhnliche
Lösungsmittelextraktion, Ionenaustauschchromatographie, etc.
aus der Reaktionsmischung gewonnen und gereinigt werden. Das
durch Lösungsmittelextraktion gewonnene Verhältnis von (+)-
Form und (-)-Form von Homopilopinsäure liegt im Bereich von
84:16 bis 10:90, abhängig von dem besonderen verwendeten
Enzym. (+)-Homopilopinsäure kann in bester Reinheit durch
Verwendung von Paratase M 1000L (Novo Nordisk Bioindustry LTD)
erhalten werden. Kontaminierende (-)-Homopilopinsäure kann
durch Behandlung mit einem Mittel, wie d-α-Methylbenzylamin,
das gewöhnlich zur optischen Auflösung verwendet wird,
entfernt werden. Aus der so erhaltenen (+)-Homopilopinsäure kann
(+)-Pilocarpinhydrochlorid von gleicher Art wie der
natürlichen Substanz durch bekannte Techniken erhalten werden (97,5%
Reinheit).
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Anders als die Verfahren 1 und 2 benötigt Verfahren 3 der
vorliegenden Erfindung nicht den Schritt der optischen
Auflösung bzw. Abtrennung. Verfahren 3 ist dadurch gekennzeichnet,
daß es den schwierigen Schritt der optischen Auflösung
vermeidet, wobei eine Verbesserung der Ausbeute erzielt wird.
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Verfahren 3 umfaßt den ersten Schritt der selektiven
Hydrolyse von (-)-Homopilopinsäureester in
(±)-Homopilopinsäureester, um (+)-Homopilopinsäureester zu gewinnen und den
zweiten Schritt der Hydrolyse des gewonnenen (+
)-Homopilopinsäureesters, um (+)-Homopilopinsäure zu ergeben.
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Typische Enzyme, welche für den obigen ersten Schritt erwähnt
werden können, sind Lipase T-01 aus Chromobacterium viscosum
und Cholesterol Esterase T-18 aus Pseudomonas sp. (Toyo Jozo
Co. LTD), Lipase B (Wako Pure Chemical Industries Co. LTD)
aus Pseudomonas fragi, Lipase PS (Amano Pharmaceutical Co.
LTD), abgeleitet aus Pseudomonas sp., Lipase (Sigma),
abgeleitet aus Chromobacterium viscosum und dergleichen. Typische
Mikroorganismen, welche im ersten Schritt verwendet werden
können, beinhalten Brevibacterium ammoniagens IFO 12072,
Escherichia vulneris JCM 1688, Rhodotorula rubra IFO 0893 und
dergleichen. Die Umsetzung des ersten Schrittes wird durch
Auflösung wenigstens eines der oben genannten Enzyme oder
wenigstens einem der Mikroorganismen oder den behandelten
Materien davon in Wasser oder einem geeignten Puffer und dem
Inkontaktbringen mit (±)-Homopilopinsäureester durchgeführt.
Das Verhältnis von Enzym, (±)-Homopilopinsäureester und
Lösungsmittel variiert abhängig von dem verwendeten Enzym und
liegt gewöhnlich im Bereich von 1:0,5-1.000:2-1.000.000
Gewichtsteile. Die Reaktion kann durch Hinzufügung eines
oberflächenaktiven Mittels, wie Tween 80, in einer
Konzentration von 0,02 bis 1 Gew.-% beschleunigt werden. Bevorzugt
wird die Umsetzung durch Schütteln bei 20 bis 37ºC während 1
Stunde bis 1 Woche in einem Phosphatpuffer oder Tris-HCl bei
einem pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt von 6,0 bis 8,0
durchgeführt, wobei (-)-Homopilopinsäure in der wäßrigen Schicht
gebildet wird und (+)-Homopilopinsäure in der öligen Schicht
verbleibt. Die Reaktionszeit variiert, abhängig von den
entsprechenden Arten und Mengen des Enzyms und des
Ausgangsesters, und bevorzugt wird die Umsetzung angehalten, wenn die
Ausbeute an in der wäßrigen Schicht erzeugter
Homopilopinsäure wenigstens 50% oder mehr erreicht hat. Der pH-Wert der
Reaktionsmischung nimmt mit fortschreitender Bildung an
Homopilopinsäure ab, und daher wird es bevorzugt, den pH-Wert auf 6
bis 8 mit 0,5 N Natriumhydroxid, gesättigtem
Natriuhydrogencarbonat oder gesättigtem Natriumcarbonat einzustellen. Nach
der Umsetzung kann der nicht umgesetzte (+
)-Homopilopinsäureester unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wie
Diethylether oder Ethylacetat wiedergewonnen werden und dann
als Ausgangsmaterial in dem zweiten Schritt verwendet werden.
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Typische Enzyme, welche für den zweiten Schritt verwendet
werden können, sind Lipase (Seikagaku Kogyo Co. LTD),
abgeleitet aus Rhizopus delemar, Lipozym IM 20 (Novo Nordisk
Bioindustry LTD), abgeleitet aus Rhizomucor miehei, Lipase OF
(Meito Sangyo Co. LTD) aus Candida cylindraceae, Esterase
(Boehringer Mannheim) aus Schweineleber, etc. Geeignete
Mikroorganismen für den zweiten Schritt sind Aspergillus sojae
IAM 2703, Escherichia coli IFO 3366, Xanthomonas oryzae IFO
3510, Candida utilis IFO 4961, Pseudomonas aeruginosa IAM
13130, Serratia plymuthica JCM 1244, Cellulomonas turbata
FERM P-9059, Nocardia erythropolis IAM 1484, Nocardia
rubropertincta
JCM 3204, Bacillus subtilis IFO 3108,
Flavobacterium lutescens IFO 3084, Brevibacterium ketoglutaricum ATCC
15588, Mycobacterium rhodochrous IFO 13161, Rhizomucor miehei
IFO 9740, Rhodococcus erythropolis IFO 12682 und dergleichen.
Obwohl (+)-Homopilopinsäure durch Züchtung dieser
Mikroorganismen in einem Medium, welches (+)-Homopilopinsäureester
enthält, erhalten werden kann, wird es bevorzugt den Schritt
unter Verwendung einer Kultur, welche durch Züchtung eines
Mikroorganismus in einem Medium, das Hefextrakt, Pepton,
Glucose, Mineralsalze und dergleichen enthält, bei 20 bis 37ºC
während einer Zeit von 1 Tag bis 1 Woche erhalten wird,
durchzuführen oder anderenfalls unter Verwendung von Zellen
oder einem Überstand aus der Kultur oder einem behandelten
Material davon, wie rohe Enzymlösung, die durch Zerbrechen
der Zellen in der Kultur erhalten wird.
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Namentlich kann die Reaktion des zweiten Schrittes bewirkt
werden, indem wenigstens eines der Enzyme oder einer der
Mikroorganismen oder einem behandelten Material davon in Wasser
oder einem geeigneten Puffer gelöst oder Suspendiert werden
und die Mischung mit dem nicht umgesetzten (+
)-Homopilopinsäureester, der im ersten Schritt wiedergewonnen wurde, in
Kontakt gebracht wird. Das Verhältnis des Enzyms oder der
enzymatisch akiven Substanz, des (±)-Homopilopinsäureester und
des Lösungsmittels variiert abhängig von der Natur des
verwendeten Enzyms oder Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im
Bereich von 1:0,5-1.000:2-1.000.000 Gewichtsteile. Bevorzugt
wird die Reaktion durch Schütteln bei 20 bis 37ºC während
einer bis mehrere Stunden in einem Phosphatpuffer oder Tris-
HCl bei einem pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt 6,0 bis 8,0
durchgeführt, wobei (+)-Homopilopinsäure in der wäßrigen
Lösung gebildet wird. Die Reaktion kann wie im ersten Schritt
durch Zufügung eines oberflächenaktiven Mittels beschleunigt
werden oder durch Einstellung des pH-Wertes der
Reaktionsmischung auf 6 bis 8 mit einer alkalischen Lösung. Die
Vervollständigung der Umsetzung kann mittels HPLC, etc.
aufgezeichnet werden. Nach der Umsetzung kann Natriumsalz von (+
)-Homopilopinsäure aus der Reaktionsmischung durch gewöhnliche
Methoden, wie Lösungsmittelextraktion und
Ionenaustauschchromatographie gewonnen und gereinigt werden. Die NMR-Analyse des
Methylesters des gewonnenen Produktes zeigte keinen der (-)-
Homopilopinsäure entsprechenden Peak, was anzeigt, daß im
wesentlichen reine (+)-Homopilopinsäure gebildet wurde. Von der
so erhaltenen (+)-Homopilopinsäure kann (+
)-Pilocarpinhydrochlorid von gleicher Natur wie der der natürlichen Substanz
durch bekannte Methoden erhalten werden.
Wirkung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Umsetzung unter
Verwendung eines Biokatalysators wie einem Enzym, einem
Mikroorganismus, etc. durchgeführt und daher sind die
Reaktionsbedingungen so mild, daß keine Spaltung des Lactonringes
auftritt und die Ausbeute an (+)-Homopilopinsäure sehr hoch
ist.
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Verfahren 3 der Erfindung benötigt nicht den Schritt der
optischen Auflösung, was zu einer einfacheren Verfahrensweise
und einer Zunahme der Ausbeute führt. Daher trägt die
Erfindung stark zur Produktivität von Pilocarpinhydrochlorid bei,
das als Mittel zur Behandlung von grünem Star nützlich ist.
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Die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele erläutern weiter
die Erfindung.
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In den Beispielen wurden NMR-Daten in CDCl&sub3; in Gegenwart von
0,5 Äquivalenten Eu(hfc){Tris-[3-
(heptafluorpropylhydroxymethylen)-d-campher]-europium(III)}
bestimmt.
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Die folgenden Beispiele 1 bis 24 erläutern die
Verfahrensweise von Verfahren 1 der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
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100 ml des in Tabelle 1 angegebenen Mediums wurden mit einer
Platinschleife Nocardia rubropertincta JCM 3024-Stamm geimpft
und während 4 Tagen bei 30ºC kultiviert bzw. gezüchtet. Die
resultierende Kultur wurde zentrifugiert, um den Überstand zu
entfernen, und das Pellet (126 mg Zellen, Trockengewicht)
wurde in 1,9 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert.
Der Suspension wurden 1 ul Tween 80 und 92 ul
(±)-Homopilopinsäureoctylester zugesetzt und bei 30ºC unter Rühren 24
Stunden stehengelassen. Während der Umsetzung wurde alle 6
Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH
auf 7 einzustellen. Nach der Umsetzung wurden 23 mg
kristalline Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion erhalten.
Der Gehalt an (+)-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch
NMR-Spektroskopie nach der Umwandlung in den Methylester
davon bestimmt und zu 87% gefunden, während der an
(-)-Homopilopinsäure 13% betrug.
Tabelle 1
Nährstoffmedium
Hefeextrakt
Glucose
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Löse in 1 l Wasser auf und stelle auf pH 7,0 ein
Beispiel 2
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100 ml des in Tabelle 1 angegebenen Mediums wurden mit einer
Platinschleife Escherichia coli IFO 3366-Stamm geimpft und 1
Tag bei 30ºC gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde
zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und das Pellet
(220 mg in Trockengewicht) wurde in 1,6 ml 0,1 M Tris (pH
8,0) suspendiert. Der Suspension wurden 1 ul Tween 80 und 75
ul (±)-Homopilopinsäureethylester zugesetzt und bei 30ºC
unter Rühren 24 Stunden reagieren gelassen. Während der
Umsetzung wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung
zugesetzt, um den pH auf 8 einzustellen. Nach der Umsetzung
wurden 23 mg kristalline Homopilopinsäure durch
Lösungsmittelextraktion erhalten. Der Gehalt an (+)-Homopilopinsäure in
dem Produkt wurde durch NMR-Spektroskopie nach der Bildung
des Methylesters davon bestimmt und zu 78% gefunden, während
der von der (-)-Form 22% betrug.
Beispiel 3
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5 ml des in Tabelle 2 angegebenen Mediums wurden mit Sporen
von Rhizomucor miehei IFO 9740 geimpft und 3 Tage bei 30ºC
gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde in 100 ml desselben
Mediums übertragen und weitere 4 Tage bei 30ºC gezüchtet. Die
so erhaltene Kultur wurde filtriert, um den Überstand zu
entfernen, und das Pellet (650 mg Zellen, Trockengewicht) wurde
in 7,5 ml von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Der
Suspension wurden 3 ul Span 80 und 200 ul
(±)-Homopilopinsäureethylester zugesetzt und bei 30ºC unter Rühren 48 Stunden
reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde alle 6 Stunden
gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7
einzustellen. Nach der Umsetzung wurden 25 mg kristalline
Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion erhalten. Der
Gehalt an (+)-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch
NMR-Spektroskopie nach der Umwandlung in den Methylester
davon bestimmt und zu 91% gefunden, während der der (-)-Form 9%
betrug.
Tabelle 2
Hefeextrakt
Malzextrakt
Sucrose
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Löse in 1 l Wasser auf und stelle auf pH 6,0 ein
Beispiel 4 bis 24
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In analoger Weise wie in den Beispielen 1 bis 3 wurde (+
)-Homopilopinsäure unter Verwendung verschiedener Arten von
Mikroorganismen hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3
gezeigt.
Tabelle 3
Bsp. Nr.
Stamm
Ausgangsmaterial*1)
Ausbeute (%)
Gehalt*2) (%)
Arthrobacter globiformis IFO 12136
Aspergillus sojae IAM 2703
Aspergillus tereus IAM 2179
Cunninghamella echinulata IFO 4443
Xanthomonas oryzae IFO 3510
Xanthomonas campestris IFO 13303
Candida utilis IFO 4961
Pseudomonas aeruginosa IAM 1275
Serratia plymuthica LCM 1244
Cellulomonas turbata FERM P-9059
Nocardia erythropolis IAM 1484
Nocardia opaca IAM 12123
Nocardia corallina IAM 12121
Nocardia rubropertincta JCM 3204
Bacillus subtilis IFO 3108
Flavobacterium lutescens IFO 3084
Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588
Mycobacterium rhodochrous IFO 13161
Rhizomucor miehei IFO 9740
Rhodococcus erythropolis IFO 12682
Rhodotorula rubra IFO 0383
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*1) Ausgangsester: (±)-Homopilopinsäuremethylester (Me),
Ethylester (Et), Isopropylester (iPr), t-Butylester
(tBu), Octylester (Oct).
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*2) Gehalt(%): [(+)-Homopilopinsäure/Gesamte erzeugte
Homopilopinsäure] x 100
Beispiel 25
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36 mg Lipase (Seikagaku Kogyo), abgeleitet aus Rhizopus
delemar wurden in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert,
1 ul Tween 80 und 100 mg (±)-Homopilopinsäureethylester
wurden
hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 30ºC unter Rühren
24 Stunden reagieren gelassen. Während der Umsetzung wurde
alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um
den pH auf 7 einzustellen. Nach der Umsetzung wurden 19 mg
weiße Nadeln von Homopilopinsäure durch
Lösungsmittelextraktion (Ausbeute 16%) erhalten. Der Gehalt an (+
)-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch NMR-Spektroskopie nach
Bildung des Methylesters davon bestimmt und zu 69% gefunden,
während der der (-)-Form 31% betrug.
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60 U (Einheiten) Esterase (1000 U/ml, Boehringer Mannheim)
aus Schweineleber wurden in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH
7,0) suspendiert, 1 ul Tween 80 und 100 mg
(±)-Homopilopinsäurebutylester wurden zugesetzt, und die Mischung wurde bei
30ºC für 24 Stunden unter Rühren reagieren gelassen. Während
der Umsetzung wurde alle 6 Stunden gesättigte
Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7 einzustellen. Nach der
Umsetzung wurden 30 mg kristalline Homopilopinsäure durch
Lösungsmittelextraktion (Ausbeute 25%) erhalten. Der Gehalt an
(+)-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch
NMR-Spektroskopie nach Bildung des Methylesters davon bestimmt und zu
71% gefunden, während der der (-)-Form 29% betrug.
Beispiele 27 bis 35
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In analoger Weise wie in den Beispielen 25 bis 26 wurde (+)-
Homopilopinsäure unter Verwendung verschiedener Arten von
Enzymen hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Bsp. Nr.
Enzym
Ausgangsester*1) (mg)
Lösungsmittel*2) (ml)
Reaktionszeit (h)
Ausbeute (%)
Gehalt *3) (%)
Lipase OF (Meito)
Lipase IM 20 (Novo)
Paratase M 1000L
Lipoproteinlipase
Lipase T-01 (Toyo Jozo)
Cholesterolesterase T18 (Toyo Jozo)
Lipase P (Amano)
Lipase B (Wako)
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*1) Ausgangsester: (±)-Homopilopinsäuremethylester (Me), Ethylester (Et), Isopropylester (iPr) und Octylester (Oct)
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*2) 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0)
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*3) Gehalt (%) [(+)-Homopilopinsäure/Gesamte erzeugte Homopilopinsäure] x 100
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Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung gemäß dem
Verfahren 3 der vorliegenden Erfindung.
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Das NMR-Spektrum wurde bei 90 MHz bestimmt und die
spezifische Drehung ([α]D) wurde in Chloroform bei Raumtemperatur
bestimmt.
Beispiel 36
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8,5 mg Lipase B (Wako), abgeleitet aus Pseudomonas fragi
wurden in 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, 4 ul
Tween 80 und 600 mg (±)-Homopilopinsäureethylester wurden
zugesetzt, und die Mischung wurde bei 30ºC unter Rühren
reagieren gelassen. Während der Umsetzung wurde alle 6 Stunden
gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7
einzustellen. Nach 19 Stunden Umsetzung wurde der pH der
Reaktionsmischung auf 8,0 eingestellt, 10 ml Diethylether
wurden zugesetzt, heftig gerührt und zentrifugiert, um die
Etherphase zu gewinnen. Diese Extraktionsprozedur wurde 3mal
wiederholt und aus den vereinten Etherextrakten wurden 235 mg
(+)-Homopilopinsäureethylester gewonnen. [α]D: 76,1º.
Beispiel 37
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235 mg des gewonnenen Esters wie in Beispiel 36 erhalten
wurden in Gegenwart von 3 ul Tween 80 und 150 mg Lipase OF und
12 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) hydrolysiert. Es wurden
127 mg kristalline Homopilopinsäure durch
Lösungsmittelextraktion erhalten. Die Gesamtausbeute durch die Schritte 1
und 2 betrug an Homopilopinsäure 25%. [α]D: 79,4º. Das NMR-
Spektrum des Produktes nach Bildung des Methylesters davon
zeigte im wesentlichen kein Signal für
(-)-Homopilopinyäuremethylester (Fig. 1).
Beispiel 38
-
Es wurde eine Kultur von Bacillus subtilis IFO 3108
hergestellt. 100 ml des in Tabelle 5 angegebenen Mediums wurden
mit einer Platinschleife Bacillus subtilis IFO 3108 geimpft.
Zur Erhöhung der Esterzersetzungsaktivität wurde Sojabohnenöl
in einer Konzentration von 1% zugesetzt und bei 30ºC 1 Tag
kultiviert. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, um
ein Pellet (360 mg Zellen, Trockengewicht) zu ergeben.
Tabelle 5
Nährstoffmedium
Hefeextrakt
Glucose
-
Löse in 1 l Wasser auf und stelle auf pH 7,0 ein
Beispiel 39
-
360 mg (Trockengewicht) des Pellets von Bacillus subtilis IFO
3108 wie in Beispiel 38 erhalten, wurden in 5 ml 0,1 M
Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und 100 mg (+
)-Homopilopinsäureethylester wie in Beispiel 36 erhalten, und 2 ul Tween
80 wurden zugesetzt und unter Rühren bei 30ºC reagieren
gelassen. Während der Reaktion wurde alle 6 Stunden gesättigte
Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7
einzustellen. Nach 72 Stunden Reaktion wurden 71 mg Homopilopinsäure
als weiße Nadeln durch Lösungsmittelextraktion erhalten
(Ausbeute 84%). [α]D: 81,2º.
Beispiel 40
-
Es wurde eine Kultur von Rhizomucor miehei IFO 9740
hergestellt. 5 ml des in Tabelle 6 angegebenen Mediums wurden mit
Sporen von Rhizomucor miehei IFO 9740 geimpft und bei 30ºC 3
Tage kultiviert. Die resultierende Kultur wurde verwendet, um
100 ml desselben Mediums zu impfen, und weitere 4 Tage bei
30ºC kultiviert. Die Kultur wurde filtriert, um den Überstand
abzutrennen und 920 mg (Trockengewicht) der Zellen wurden
erhalten.
Tabelle 6
Hefeextrakt
Malzextrakt
Sucrose
-
Löse in 1 l Wasser auf und stelle auf pH 6,0 ein
Beispiel 41
-
100 mg (+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 36
erhalten, 200 mg des gezüchteten Stammes von Rhizomucor miehei
IFO 9740 wie in Beispiel 40 erhalten und 2 ul Tween 80 wurden
5 ml an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) zugesetzt und bei 30ºC
reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde alle 6 Stunden
gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7
einzustellen. Nach 68 Stunden Reaktion wurden 61 mg rohe,
kristalline Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion
erhalten (Ausbeute 72%). [α]D: 79,8ºC. Das NMR-Spektrum des
Produktes nach Bildung des Methylesters zeigte im
wesentlichen kein Signal von (-)-Homopilopinsäuremethylester.
Beispiele 42 bis 45
-
(+)-Homopilopinsäureester wurde unter Verwendung von vier
Arten von Enzymen gewonnen, welche selektiv auf
(-)-Homopilopinsäureester wirken. Die Reaktion wurde in 10 ml von 0,1 M
Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 30ºC durchgeführt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7 (Erster Schritt)
Bsp. Nr.
Enzym
Ausgangsester*1) (mg)
Reaktionszeit (h)
Estergewinnung (%)
Spezifische Drehung [α]D
Lipase T-01 (Toyo Jozo)
Cholesterolesterase T18 (Toyo Jozo)
Lipase (Sigma)
Lipase PS (Amano)
*1) Et: (±)-Homopilopinsäureethylester, (Oct): (±)-Homopilopinsäureoctylester
Beispiele 46 bis 47
-
(+)-Homopilopinsäureester wie in Beispiel 44 gewonnen wurde
unter Verwendung verschiedener Enzyme wie in Tabelle 8
angegeben hydrolysiert. Die Reaktion wurde in 5 ml 0,1 M
Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 30ºC durchgeführt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8 (Zweiter Schritt)
Bsp. Nr.
Enzym
Ausgangsester*1) (mg)
Reaktionszeit (h)
Ausbeute*2) (%)
Spezifische Drehung [α]D
Lipase (Seikagaku Kogyo)
Esterase (Boehringer)
Lipozyme IM 20 (Novo)
Lipase OF (Meito)
-
*1) Beispiele 46 und 47: Es wurde der in Beispiel 44 gewonnene Ester verwendet.
-
Beispiele 48 und 49: Es wurde der in Beispiel 45 gewonnene Ester verwendet.
-
*2) Ausbeute an Homopilopinsäure.
Beispiele 48 bis 49
-
(+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 45 gewonnen,
wurde wie in den obigen Beispielen unter Verwendung
verschiedener Enzyme, die auf (+)-Homopilopinsäureester wirken,
hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Beispiele 50 bis 52
-
110 mg (+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 42
gewonnen, wurden unter Verwendung verschiedener Enzyme, welche
auf (+)-Homopilopinsäureester wirken, hydrolysiert. Die
Reaktion wurde in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 30ºC
während 48 Stunden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9
(Zweiter Schritt unter Verwendung von Mikroorganismen)
Bsp. Nr.
Stamm
Trockengew. d. Mikroorganismus (mg)
Ausgangsester *1)
Ausbeute (%)
Aspergillus sojae IAM 2703
Escherichia coli IFO 3366
Xanthomonas oryzae IFO 3510
Candida utilis IFO 4961
Pseudomonas aeruginosa IAM 13130
Serratia plymuthica JCM 1244
Cellulomonas turbata FERM P-9059
Nocardia erythropolis IAM 1484
Nocardia rubropertincta JCM 3204
Flavobacterium hetescens IFO 3084
Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588
Rhodococcus erythropolis IFO 12682
Mycobacterium rhodoclass IFO 13161
-
*1) Et: (+)-Homopilopinsäureethylester, Oct: (+)-Octylester.
In den Beispielen Nr. 50-52, 53-58, 59-61 und 62 wurden
die in den Beispielen 42, 43, 45 bzw. 44 gewonnenen Ester
verwendet.
-
*2) Nach Kultivierung in dem in Tabelle 1 gezeigten Medium
bei 30ºC während 24 Stunden wurde der gewonnene Ester
(110 mg) zugesetzt und 48 Stunden reagieren gelassen.
Beispiele 53 bis 58
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(+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 43 gewonnen,
wurde wie in den obigen Beispielen unter Verwendung
verschiedener Enzyme hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9
gezeigt.
Beispiele 59 bis 61
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(+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 45 gewonnen,
wurde wie in den obigen Beispielen unter Verwendung
verschiedener Enyzme hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9
gezeigt.
Beispiel 62
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(+)-Homopilopinsäureoctylester wie in Beispiel 44 gewonnen
wurde wie in den obigen Beispielen unter Verwendung des in
Tabelle 9 gezeigten Enzyms hydrolysiert. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 9 gezeigt.
-
Die folgenden Beispiele 63 bis 65 erläutern die Herstellung
der im ersten Schritt von Verfahren 3 zu verwendenden Kultur.
Beispiel 63
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Ein Stamm Brevibacterium ammoniagens IFO 12072 wurde in 100
ml des in Tabelle 5 angegebenen Mediums bei 30ºC während 1
Tag kultiviert, um 270 mg (Trockengewicht) der Zellen zu
ergeben.
Beispiel 64
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Ein Stamm Escherichia vulneris JCM 1688 wurde in 100 ml des
in Tabelle 5 angegebenen Mediums bei 30ºC während 1 Tag
kultiviert, um 540 mg (Trockengewicht) der Zellen zu ergeben.
Beispiel 65
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Ein Stamm Rhodotorula rubra IFO 0893 wurde in 100 ml des in
Tabelle 5 angegebenen Mediums bei 30ºC während 2 Tagen
kultiviert, um 750 mg (Trockengewicht) der Zellen zu ergeben.
Beispiele 66 bis 68
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Diese Beispiele erläutern die Herstellung von (+
)-Homopilopinsäure durch Kombination des ersten Schrittes unter
Verwendung der in den Beispielen 63 bis 65 erhaltenen Zellen und
des zweiten Schrittes unter Verwendung des gewonnenen (+
)-Homopilopinsäureesters und Lipase OF. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 10
Erster Schritt*1)
Zweiter Schritt*2)
Bsp. Nr.
Spezif. Drehung des Products [α]D
Mikroorganismus (mg)
Gewonnener Ester (mg)
Lipase OF
Ausbeute (%)*3)
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*1) 0,1 M Tris (pH 7,5): 2 ml, (±)-Homopilopinsäureethylester: 100 mg, 30ºC, 50 Stunden.
-
*2) 0,1 M Tris (pH 7,5): 1 ml; Lipase OF, 30ºC, 50 Stunden.
-
*3) Ausbeute an Homopilopinsäure.