DE69018576T2 - Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure und den Salzen davon. Diese Verbindungen sind als ein Zwischenprodukt für die Herstellung von (+)-Pilocarpinhydrochlorid nützlich, welches ein wertvolles Medikament für die Behandlung von grünem Star (Glaukoma) ist.
    • Stand der Technik
  • Derzeit werden die Verbindungen (+)-Pilocarpinhydrochlorid der Formel (III):
  • durch Extrahieren der Blätter der Pilocarpus jaborandi- Pflanze erhalten, welche in Brasilien und anderen Ländern einheimisch ist. Eine solche Methode beinhaltet jedoch ein Problem, indem die Versorgung von natürlich wachsendem Rohmaterial dem Einfluß des Klimas unterworfen ist und schwer konstant zur Verfügung gestellt werden kann.
  • Wenn (+)-Pilocarpinhydrochlorid durch Synthese hergestellt wird, wird es durch Hydrolyse einer Mischung (+ )-Homopilopinsäureester und (-)-Homopilopinsäureester (diese Mischung wird im folgenden als (±)-Homopilopinsäureester bezeichnet) unter stark sauren Bedindungen, der optischen Auflösung der resultierenden Mischung von (+)-Homopilopinsäure der Formel (IV):
  • und (-)-Homopilopinsäure der Formel (V):
  • (wobei diese Mischung im folgenden als (±)-Homopilopinsäure bezeichnet wird) unter Verwendung von d-α-Methylbenzylamin zur Entfernung von (-)-Homopilopinsäure und Umwandlung der (+)-Homopilopinsäure in (+)-Pilocarpinhydrochlorid hergestellt (J.I. DeGraw et. al., J. Pharm. Sci., 64:1700-1701, (1975)).
    • Mit der Erfindung zu lösende Probleme
  • Die Hydrolyse von (±)-Homopilopinsäureester unter stark sauren Bedindungen wie in dem oben beschriebenen Stand der Technik, verursacht die Spaltung des Lactonringes, und die Ausbeute an (+)-Homopilopinsäure ist niedrig. Auch bei der Hydrolyse unter alkalischen Bedingungen wird der Lactonring gespalten, und die Ausbeute nimmt beträchtlich ab. Daher ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure zur Verfügung zu stellen, das wirksam ist und hohe Ausbeuten liefert.
    • Mittel zur Lösung des Problems
  • Die Erfinder haben gefunden, daß (+)-Homopilopinsäure wirksam und in hoher Ausbeute hergestellt werden kann, indem die Hydrolyse unter milden Bedingungen unter Verwendung eines Mikroorganismus oder eines Enzymes durchgeführt wird, um die Spaltung des Lactonringes zu verhindern.
    • [Zusammenfassung der Erfindung]
  • Die vorliegende Erfindung betrifft (1) ein Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure und den Salzen davon, welches die Hydrolyse von (±)-Homopilopinsäureester, nämlich eine Mischung der Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) und (II), worin R&sub1; und R&sub2; gerade oder verzweigte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoffe bezeichnen, umfaßt, unter Verwendung eines Mikroorganismus, der der Gattung Arthrobacter, Aspergillus, Escherichia, Cunninghamella, Xanthomonas, Candida, Pseudomonas, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Mycobacterium, Rhizomucor, Rhodotorula oder Rhodococcus angehört oder einem behandelten Material davon (Verfahren 1).
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist es (2) ein Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure und den Salzen davon zu liefern, welches die Hydrolyse von (±)-Homopilopinsäureester, nämlich eine Mischung der Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) und (II), worin R&sub1; und R&sub2; gerade oder verzweigte C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoffe bezeichnen, umfaßt, indem wenigstens ein Enzym von Lipasen, Esterasen, Cholesterolesterasen und Lipoproteinlipasen verwendet wird (Verfahren 2).
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es (3) ein Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure und den Salzen davon zu liefern, welches die Hydrolyse einer Mischung von (+)-Homopilopinsäureester der allgemeinen Formel (I), worin R&sub1; geraden oder verzweigten C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoff bezeichnet, und (-)-Homopilopinsäureester der allgemeinen formel (II), worin R&sub2; geraden oder verzweigten C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoff bezeichnet, unter Verwendung entweder einer Hydrolase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lipasen, Esterasen und Cholesterolesterasen oder eines Mikroorganismus, der der Gattung Brevibacterium, Escherichia oder Rhodotorula angehört oder einem behandelten Material davon, das Abtrennen des nicht umgesetzten (+)-Homopilopinsäureester, danach die Hydrolyse des nicht umgesetzten (+ )-Homopilopinsäureesters umfaßt, unter Verwendung entweder einer Hydrolase, ausgewählt aus Lipasen und Esterasen, oder eines Mikroorganismus, der der Gattung Asperqillus, Escherichia, Xanthomonas, Candida, Pseudomonas, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus, Flavobacterium, Brevibacterium, Mycobacterium, Rhizomucor oder Rhodococcus angehört, oder einer behandelten Materie davon (Verfahren 3).
  • Fig. 1 zeigt das NMR-Spektrum des Methylesters des Produktes von Beispiel 37 in CDCl&sub3; in Gegenwart von 0,5 Äquivalenten Eu(hfc)&sub3;.
  • Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben.
  • Geeignete R&sub1;- und R&sub2;-Gruppen sind gerade oder verzweigte C&sub1;- C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoffe, typischerweise Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl und Octyl.
  • Geeigente Mikroorganismen für Verfahren 1 der vorliegenden Erfindung sind Arthrobacter globiformis IFO 12136, Aspergillus sojae IAM 2703, Aspergillus terreus IAM 2179, Escherichia coli IFO 3366, Cunninghamella echinulata IFO 4443, Xanthomonas campestris IFO 13303, Xanthomonas oryzae IFO 3510, Candida utilis IFO 4961, Pseudomonas aeruginosa IAM 1275, Serratia plymuthica JCM 1244, Cellulomonas turbata FERM P-9059, Nocardia erythropolis IAM 1484, Nocardia opaca IAM 12123, Nocardia corallina IAM 12121, Nocardia rubropertincta JCM 3204, Bacillus subtilis IFO 3108, Flavobacterium lutescens IFO 3084, Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588, Mycobacterium rhodochrous IFO 13161, Rhizomucor miehei IFO 9740, Rhodococcus erythropolis IFO 12682, Rhodotorula rubra IFO 0383, und dergleichen.
  • Obwohl Verfahren 1 der vorliegenden Erfindung durch Züchtung eines dieser Mikroorganismen in einem Medium, das einen (±)- Homopilopinsäureester enthält, ausgeführt werden kann, wird es bevorzugt, durch Züchtung dieser Mikroorganismen in einem Medium, das Hefeextrakt, Pepton, Glucose, Mineralsalze, etc., bei 20 bis 37ºC während eines Zeitraums von 1 Tag bis zu 1 Woche durchgeführt und die resultierende Kultur, Zellen, den Überstand oder ein behandeltes Material davon, wie eine Rohenzymlösung, welche durch Zerbrechen der Zellen in der Kultur erhalten wird, mit (±)-Homopilopinsäureester in Kontakt zu bringen.
  • Beispielsweise kann (+)-Homopilopinsäure in einer wäßrigen Lösung erhalten werden, indem von 0,1 bis 30%, bevorzugt 0,5 bis 10 Gew.-% (±)-Homopilopinsäureester zu Phosphatpuffer oder Tris-HCl mit einem pH von 5 bis 9, bevorzugt von 6,0 bis 8,0, welcher die Kultur, Zellen, den Überstand oder die behandelte Materie davon enthält, zugesetzt werden, und die Mischung bei 20 bis 37ºC während 2 bis 100 Stunden geschüttelt wird. Der pH-Wert der Reaktionslösung nimmt mit fortschreitender Hydrolyse ab, und daher ist es bevorzugt, 0,5 N Natriumhydroxid, gesättigtes Natriumhydrogencarbonat oder gesättigtes Natriumcarbonat hinzuzufügen, um den pH-Wert zu neutralisieren und einzustellen. Nach der Umsetzung kann (+ )-Homopilopinsäure durch gewöhnliche Lösungsmittelextraktion, Ionenaustauschchromatographie, etc. aus der Reaktionsmischung gewonnen und gereinigt werden. Insbesondere können die nicht umgesetzten Ausgangsester durch Extraktion mit Diethylether entfernt werden. Der pH-Wert der verbleibenden wäßrigen Schicht wird auf 2 bis 4 mit 2 N HCl oder 2 N H&sub2;SO&sub4; eingestellt, und NaCl wird bis zur Sättigung zugesetzt. Dieser Mischung wird ein gleiches Volumen an Ethylacetat zugesetzt, heftig gerührt und zentrifugiert, um die Ethylacetatschicht zu gewinnen, welche dann unter reduziertem Druck getrocknet wird, um Rohkristalle von Homopilopinsäure zu liefern. Das Verhältnis von (+)-Homopilopinsäure und (-)-Isomer variiert von 91:9 bis 25:75, abhängig von der Art des verwendeten Mikroorganismus. Bevorzugt wird Rhizomucor miehei IFO 9740 verwendet, um (+)-Homopilopinsäure in hoher Ausbeute zu erhalten. Kontaminierende (-)-Homopilopinsäure kann durch Behandlung mit einem Mittel, das gewöhnlich zur optischen Auftrennung verwendet wird, wie d-α-Methylbenzylamin, entfernt werden. Aus der so erhaltenen (+)-Homopilopinsäure kann Pilocarpinsäure der gleichen Art wie der der natürlich vorkommenden Substanz durch bekannte Methoden erhalten werden.
  • Typische Enzyme, welche für das Verfahren 2 der vorliegenden Erfindung erwähnt werden können, beinhalten Lipase PS (Amano Pharmaceutical Co. LTD), abgeleitet von Pseudomonas sp., Lipase (Seikagaku Kogyo Co. LTD) abgeleitet von Rhizopus delemar, Lipozym IM 20 (Novo Nordisk Bioindustry LTD), abgeleitet von Rhizomucor miehei, Lipase B von Pseudomonas fragi und Lipase OF von Candida cylindraceae (Meito Sangyo Co. LTD), Lipase T-01 (Toyo Jozo Co. LTD) von Pseudomonas fragi, Esterase (Boehringer Mannheim) von Schweineleber, Cholesterol Esterase T-18 (Toyo Jozo Co. LTD) von Pseudomonas sp. und Lipoprotein Lipase (Wako Pure Chemical Industries Co. LTD) von Pseudomonas sp.
  • In Verfahren 2 der Erfindung wird die Reaktion durch Auflösung eines der oben erwähnten Enzyme in Wasser oder anderen geeigneten Puffern und Inkontaktbringen mit (+ )-Homopilopinsäureester durchgeführt. Das Verhältnis von Enzym, (+ )-Homopilopinsäureester und dem Lösungsmittel variiert abhängig von dem verwendeten Enzym und liegt gewöhnlich im Bereich von 1:0,5-1.000:2-1.000.000 Gewichtsteilen. Bevorzugt wird die Reaktion durch Schütteln bei 20 bis 37ºC während 2 bis 100 Stunden in einem Phosphatpuffer oder Tris-HCl bei einem pH von 5 bis 9, bevorzugt von 6,0 bis 8,0 durchgeführt, wobei (+)-Homopilopinsäure in der wäßrigen Lösung gebildet wird. Die Reaktion kann durch Hinzufügung eines oberflächenaktiven Mittels, wie Tween 80, in einer Konzentration von 0,02 bis 1 Gew.-% beschleunigt werden. Der pH-Wert der Reaktionsmischung nimmt mit fortschreitender Bildung von (+)-Homopilopinsäure ab, und daher ist es bevorzugt, den pH-Wert mit 0,5 N Natriumhydroxid, gesättigtem Natriumhydrogencarbonat oder gesättigtem Natriumcarbonat zu neutralisieren und einzustellen. Nach der Umsetzung kann das Natriumsalz von (+ )-Homopilopinsäure in analoger Weise wie in Verfahren 1 durch gewöhnliche Lösungsmittelextraktion, Ionenaustauschchromatographie, etc. aus der Reaktionsmischung gewonnen und gereinigt werden. Das durch Lösungsmittelextraktion gewonnene Verhältnis von (+)- Form und (-)-Form von Homopilopinsäure liegt im Bereich von 84:16 bis 10:90, abhängig von dem besonderen verwendeten Enzym. (+)-Homopilopinsäure kann in bester Reinheit durch Verwendung von Paratase M 1000L (Novo Nordisk Bioindustry LTD) erhalten werden. Kontaminierende (-)-Homopilopinsäure kann durch Behandlung mit einem Mittel, wie d-α-Methylbenzylamin, das gewöhnlich zur optischen Auflösung verwendet wird, entfernt werden. Aus der so erhaltenen (+)-Homopilopinsäure kann (+)-Pilocarpinhydrochlorid von gleicher Art wie der natürlichen Substanz durch bekannte Techniken erhalten werden (97,5% Reinheit).
  • Anders als die Verfahren 1 und 2 benötigt Verfahren 3 der vorliegenden Erfindung nicht den Schritt der optischen Auflösung bzw. Abtrennung. Verfahren 3 ist dadurch gekennzeichnet, daß es den schwierigen Schritt der optischen Auflösung vermeidet, wobei eine Verbesserung der Ausbeute erzielt wird.
  • Verfahren 3 umfaßt den ersten Schritt der selektiven Hydrolyse von (-)-Homopilopinsäureester in (±)-Homopilopinsäureester, um (+)-Homopilopinsäureester zu gewinnen und den zweiten Schritt der Hydrolyse des gewonnenen (+ )-Homopilopinsäureesters, um (+)-Homopilopinsäure zu ergeben.
  • Typische Enzyme, welche für den obigen ersten Schritt erwähnt werden können, sind Lipase T-01 aus Chromobacterium viscosum und Cholesterol Esterase T-18 aus Pseudomonas sp. (Toyo Jozo Co. LTD), Lipase B (Wako Pure Chemical Industries Co. LTD) aus Pseudomonas fragi, Lipase PS (Amano Pharmaceutical Co. LTD), abgeleitet aus Pseudomonas sp., Lipase (Sigma), abgeleitet aus Chromobacterium viscosum und dergleichen. Typische Mikroorganismen, welche im ersten Schritt verwendet werden können, beinhalten Brevibacterium ammoniagens IFO 12072, Escherichia vulneris JCM 1688, Rhodotorula rubra IFO 0893 und dergleichen. Die Umsetzung des ersten Schrittes wird durch Auflösung wenigstens eines der oben genannten Enzyme oder wenigstens einem der Mikroorganismen oder den behandelten Materien davon in Wasser oder einem geeignten Puffer und dem Inkontaktbringen mit (±)-Homopilopinsäureester durchgeführt. Das Verhältnis von Enzym, (±)-Homopilopinsäureester und Lösungsmittel variiert abhängig von dem verwendeten Enzym und liegt gewöhnlich im Bereich von 1:0,5-1.000:2-1.000.000 Gewichtsteile. Die Reaktion kann durch Hinzufügung eines oberflächenaktiven Mittels, wie Tween 80, in einer Konzentration von 0,02 bis 1 Gew.-% beschleunigt werden. Bevorzugt wird die Umsetzung durch Schütteln bei 20 bis 37ºC während 1 Stunde bis 1 Woche in einem Phosphatpuffer oder Tris-HCl bei einem pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt von 6,0 bis 8,0 durchgeführt, wobei (-)-Homopilopinsäure in der wäßrigen Schicht gebildet wird und (+)-Homopilopinsäure in der öligen Schicht verbleibt. Die Reaktionszeit variiert, abhängig von den entsprechenden Arten und Mengen des Enzyms und des Ausgangsesters, und bevorzugt wird die Umsetzung angehalten, wenn die Ausbeute an in der wäßrigen Schicht erzeugter Homopilopinsäure wenigstens 50% oder mehr erreicht hat. Der pH-Wert der Reaktionsmischung nimmt mit fortschreitender Bildung an Homopilopinsäure ab, und daher wird es bevorzugt, den pH-Wert auf 6 bis 8 mit 0,5 N Natriumhydroxid, gesättigtem Natriuhydrogencarbonat oder gesättigtem Natriumcarbonat einzustellen. Nach der Umsetzung kann der nicht umgesetzte (+ )-Homopilopinsäureester unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels, wie Diethylether oder Ethylacetat wiedergewonnen werden und dann als Ausgangsmaterial in dem zweiten Schritt verwendet werden.
  • Typische Enzyme, welche für den zweiten Schritt verwendet werden können, sind Lipase (Seikagaku Kogyo Co. LTD), abgeleitet aus Rhizopus delemar, Lipozym IM 20 (Novo Nordisk Bioindustry LTD), abgeleitet aus Rhizomucor miehei, Lipase OF (Meito Sangyo Co. LTD) aus Candida cylindraceae, Esterase (Boehringer Mannheim) aus Schweineleber, etc. Geeignete Mikroorganismen für den zweiten Schritt sind Aspergillus sojae IAM 2703, Escherichia coli IFO 3366, Xanthomonas oryzae IFO 3510, Candida utilis IFO 4961, Pseudomonas aeruginosa IAM 13130, Serratia plymuthica JCM 1244, Cellulomonas turbata FERM P-9059, Nocardia erythropolis IAM 1484, Nocardia rubropertincta JCM 3204, Bacillus subtilis IFO 3108, Flavobacterium lutescens IFO 3084, Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588, Mycobacterium rhodochrous IFO 13161, Rhizomucor miehei IFO 9740, Rhodococcus erythropolis IFO 12682 und dergleichen. Obwohl (+)-Homopilopinsäure durch Züchtung dieser Mikroorganismen in einem Medium, welches (+)-Homopilopinsäureester enthält, erhalten werden kann, wird es bevorzugt den Schritt unter Verwendung einer Kultur, welche durch Züchtung eines Mikroorganismus in einem Medium, das Hefextrakt, Pepton, Glucose, Mineralsalze und dergleichen enthält, bei 20 bis 37ºC während einer Zeit von 1 Tag bis 1 Woche erhalten wird, durchzuführen oder anderenfalls unter Verwendung von Zellen oder einem Überstand aus der Kultur oder einem behandelten Material davon, wie rohe Enzymlösung, die durch Zerbrechen der Zellen in der Kultur erhalten wird.
  • Namentlich kann die Reaktion des zweiten Schrittes bewirkt werden, indem wenigstens eines der Enzyme oder einer der Mikroorganismen oder einem behandelten Material davon in Wasser oder einem geeigneten Puffer gelöst oder Suspendiert werden und die Mischung mit dem nicht umgesetzten (+ )-Homopilopinsäureester, der im ersten Schritt wiedergewonnen wurde, in Kontakt gebracht wird. Das Verhältnis des Enzyms oder der enzymatisch akiven Substanz, des (±)-Homopilopinsäureester und des Lösungsmittels variiert abhängig von der Natur des verwendeten Enzyms oder Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 1:0,5-1.000:2-1.000.000 Gewichtsteile. Bevorzugt wird die Reaktion durch Schütteln bei 20 bis 37ºC während einer bis mehrere Stunden in einem Phosphatpuffer oder Tris- HCl bei einem pH-Wert von 5 bis 9, bevorzugt 6,0 bis 8,0 durchgeführt, wobei (+)-Homopilopinsäure in der wäßrigen Lösung gebildet wird. Die Reaktion kann wie im ersten Schritt durch Zufügung eines oberflächenaktiven Mittels beschleunigt werden oder durch Einstellung des pH-Wertes der Reaktionsmischung auf 6 bis 8 mit einer alkalischen Lösung. Die Vervollständigung der Umsetzung kann mittels HPLC, etc. aufgezeichnet werden. Nach der Umsetzung kann Natriumsalz von (+ )-Homopilopinsäure aus der Reaktionsmischung durch gewöhnliche Methoden, wie Lösungsmittelextraktion und Ionenaustauschchromatographie gewonnen und gereinigt werden. Die NMR-Analyse des Methylesters des gewonnenen Produktes zeigte keinen der (-)- Homopilopinsäure entsprechenden Peak, was anzeigt, daß im wesentlichen reine (+)-Homopilopinsäure gebildet wurde. Von der so erhaltenen (+)-Homopilopinsäure kann (+ )-Pilocarpinhydrochlorid von gleicher Natur wie der der natürlichen Substanz durch bekannte Methoden erhalten werden.
    • Wirkung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Umsetzung unter Verwendung eines Biokatalysators wie einem Enzym, einem Mikroorganismus, etc. durchgeführt und daher sind die Reaktionsbedingungen so mild, daß keine Spaltung des Lactonringes auftritt und die Ausbeute an (+)-Homopilopinsäure sehr hoch ist.
  • Verfahren 3 der Erfindung benötigt nicht den Schritt der optischen Auflösung, was zu einer einfacheren Verfahrensweise und einer Zunahme der Ausbeute führt. Daher trägt die Erfindung stark zur Produktivität von Pilocarpinhydrochlorid bei, das als Mittel zur Behandlung von grünem Star nützlich ist.
  • Die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele erläutern weiter die Erfindung.
  • In den Beispielen wurden NMR-Daten in CDCl&sub3; in Gegenwart von 0,5 Äquivalenten Eu(hfc){Tris-[3- (heptafluorpropylhydroxymethylen)-d-campher]-europium(III)} bestimmt.
  • Die folgenden Beispiele 1 bis 24 erläutern die Verfahrensweise von Verfahren 1 der vorliegenden Erfindung.
    • Beispiel 1
  • 100 ml des in Tabelle 1 angegebenen Mediums wurden mit einer Platinschleife Nocardia rubropertincta JCM 3024-Stamm geimpft und während 4 Tagen bei 30ºC kultiviert bzw. gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und das Pellet (126 mg Zellen, Trockengewicht) wurde in 1,9 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Der Suspension wurden 1 ul Tween 80 und 92 ul (±)-Homopilopinsäureoctylester zugesetzt und bei 30ºC unter Rühren 24 Stunden stehengelassen. Während der Umsetzung wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7 einzustellen. Nach der Umsetzung wurden 23 mg kristalline Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion erhalten. Der Gehalt an (+)-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch NMR-Spektroskopie nach der Umwandlung in den Methylester davon bestimmt und zu 87% gefunden, während der an (-)-Homopilopinsäure 13% betrug. Tabelle 1 Nährstoffmedium Hefeextrakt Glucose
  • Löse in 1 l Wasser auf und stelle auf pH 7,0 ein
    • Beispiel 2
  • 100 ml des in Tabelle 1 angegebenen Mediums wurden mit einer Platinschleife Escherichia coli IFO 3366-Stamm geimpft und 1 Tag bei 30ºC gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und das Pellet (220 mg in Trockengewicht) wurde in 1,6 ml 0,1 M Tris (pH 8,0) suspendiert. Der Suspension wurden 1 ul Tween 80 und 75 ul (±)-Homopilopinsäureethylester zugesetzt und bei 30ºC unter Rühren 24 Stunden reagieren gelassen. Während der Umsetzung wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 8 einzustellen. Nach der Umsetzung wurden 23 mg kristalline Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion erhalten. Der Gehalt an (+)-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch NMR-Spektroskopie nach der Bildung des Methylesters davon bestimmt und zu 78% gefunden, während der von der (-)-Form 22% betrug.
    • Beispiel 3
  • 5 ml des in Tabelle 2 angegebenen Mediums wurden mit Sporen von Rhizomucor miehei IFO 9740 geimpft und 3 Tage bei 30ºC gezüchtet. Die resultierende Kultur wurde in 100 ml desselben Mediums übertragen und weitere 4 Tage bei 30ºC gezüchtet. Die so erhaltene Kultur wurde filtriert, um den Überstand zu entfernen, und das Pellet (650 mg Zellen, Trockengewicht) wurde in 7,5 ml von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Der Suspension wurden 3 ul Span 80 und 200 ul (±)-Homopilopinsäureethylester zugesetzt und bei 30ºC unter Rühren 48 Stunden reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7 einzustellen. Nach der Umsetzung wurden 25 mg kristalline Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion erhalten. Der Gehalt an (+)-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch NMR-Spektroskopie nach der Umwandlung in den Methylester davon bestimmt und zu 91% gefunden, während der der (-)-Form 9% betrug. Tabelle 2 Hefeextrakt Malzextrakt Sucrose
  • Löse in 1 l Wasser auf und stelle auf pH 6,0 ein
    • Beispiel 4 bis 24
  • In analoger Weise wie in den Beispielen 1 bis 3 wurde (+ )-Homopilopinsäure unter Verwendung verschiedener Arten von Mikroorganismen hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Bsp. Nr. Stamm Ausgangsmaterial*1) Ausbeute (%) Gehalt*2) (%) Arthrobacter globiformis IFO 12136 Aspergillus sojae IAM 2703 Aspergillus tereus IAM 2179 Cunninghamella echinulata IFO 4443 Xanthomonas oryzae IFO 3510 Xanthomonas campestris IFO 13303 Candida utilis IFO 4961 Pseudomonas aeruginosa IAM 1275 Serratia plymuthica LCM 1244 Cellulomonas turbata FERM P-9059 Nocardia erythropolis IAM 1484 Nocardia opaca IAM 12123 Nocardia corallina IAM 12121 Nocardia rubropertincta JCM 3204 Bacillus subtilis IFO 3108 Flavobacterium lutescens IFO 3084 Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588 Mycobacterium rhodochrous IFO 13161 Rhizomucor miehei IFO 9740 Rhodococcus erythropolis IFO 12682 Rhodotorula rubra IFO 0383
  • *1) Ausgangsester: (±)-Homopilopinsäuremethylester (Me), Ethylester (Et), Isopropylester (iPr), t-Butylester (tBu), Octylester (Oct).
  • *2) Gehalt(%): [(+)-Homopilopinsäure/Gesamte erzeugte Homopilopinsäure] x 100
    • Beispiel 25
  • 36 mg Lipase (Seikagaku Kogyo), abgeleitet aus Rhizopus delemar wurden in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, 1 ul Tween 80 und 100 mg (±)-Homopilopinsäureethylester wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 30ºC unter Rühren 24 Stunden reagieren gelassen. Während der Umsetzung wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7 einzustellen. Nach der Umsetzung wurden 19 mg weiße Nadeln von Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion (Ausbeute 16%) erhalten. Der Gehalt an (+ )-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch NMR-Spektroskopie nach Bildung des Methylesters davon bestimmt und zu 69% gefunden, während der der (-)-Form 31% betrug.
  • 60 U (Einheiten) Esterase (1000 U/ml, Boehringer Mannheim) aus Schweineleber wurden in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, 1 ul Tween 80 und 100 mg (±)-Homopilopinsäurebutylester wurden zugesetzt, und die Mischung wurde bei 30ºC für 24 Stunden unter Rühren reagieren gelassen. Während der Umsetzung wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7 einzustellen. Nach der Umsetzung wurden 30 mg kristalline Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion (Ausbeute 25%) erhalten. Der Gehalt an (+)-Homopilopinsäure in dem Produkt wurde durch NMR-Spektroskopie nach Bildung des Methylesters davon bestimmt und zu 71% gefunden, während der der (-)-Form 29% betrug.
    • Beispiele 27 bis 35
  • In analoger Weise wie in den Beispielen 25 bis 26 wurde (+)- Homopilopinsäure unter Verwendung verschiedener Arten von Enzymen hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Bsp. Nr. Enzym Ausgangsester*1) (mg) Lösungsmittel*2) (ml) Reaktionszeit (h) Ausbeute (%) Gehalt *3) (%) Lipase OF (Meito) Lipase IM 20 (Novo) Paratase M 1000L Lipoproteinlipase Lipase T-01 (Toyo Jozo) Cholesterolesterase T18 (Toyo Jozo) Lipase P (Amano) Lipase B (Wako)
  • *1) Ausgangsester: (±)-Homopilopinsäuremethylester (Me), Ethylester (Et), Isopropylester (iPr) und Octylester (Oct)
  • *2) 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0)
  • *3) Gehalt (%) [(+)-Homopilopinsäure/Gesamte erzeugte Homopilopinsäure] x 100
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung gemäß dem Verfahren 3 der vorliegenden Erfindung.
  • Das NMR-Spektrum wurde bei 90 MHz bestimmt und die spezifische Drehung ([α]D) wurde in Chloroform bei Raumtemperatur bestimmt.
    • Beispiel 36
  • 8,5 mg Lipase B (Wako), abgeleitet aus Pseudomonas fragi wurden in 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, 4 ul Tween 80 und 600 mg (±)-Homopilopinsäureethylester wurden zugesetzt, und die Mischung wurde bei 30ºC unter Rühren reagieren gelassen. Während der Umsetzung wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7 einzustellen. Nach 19 Stunden Umsetzung wurde der pH der Reaktionsmischung auf 8,0 eingestellt, 10 ml Diethylether wurden zugesetzt, heftig gerührt und zentrifugiert, um die Etherphase zu gewinnen. Diese Extraktionsprozedur wurde 3mal wiederholt und aus den vereinten Etherextrakten wurden 235 mg (+)-Homopilopinsäureethylester gewonnen. [α]D: 76,1º.
    • Beispiel 37
  • 235 mg des gewonnenen Esters wie in Beispiel 36 erhalten wurden in Gegenwart von 3 ul Tween 80 und 150 mg Lipase OF und 12 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) hydrolysiert. Es wurden 127 mg kristalline Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion erhalten. Die Gesamtausbeute durch die Schritte 1 und 2 betrug an Homopilopinsäure 25%. [α]D: 79,4º. Das NMR- Spektrum des Produktes nach Bildung des Methylesters davon zeigte im wesentlichen kein Signal für (-)-Homopilopinyäuremethylester (Fig. 1).
    • Beispiel 38
  • Es wurde eine Kultur von Bacillus subtilis IFO 3108 hergestellt. 100 ml des in Tabelle 5 angegebenen Mediums wurden mit einer Platinschleife Bacillus subtilis IFO 3108 geimpft. Zur Erhöhung der Esterzersetzungsaktivität wurde Sojabohnenöl in einer Konzentration von 1% zugesetzt und bei 30ºC 1 Tag kultiviert. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert, um ein Pellet (360 mg Zellen, Trockengewicht) zu ergeben. Tabelle 5 Nährstoffmedium Hefeextrakt Glucose
  • Löse in 1 l Wasser auf und stelle auf pH 7,0 ein
    • Beispiel 39
  • 360 mg (Trockengewicht) des Pellets von Bacillus subtilis IFO 3108 wie in Beispiel 38 erhalten, wurden in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und 100 mg (+ )-Homopilopinsäureethylester wie in Beispiel 36 erhalten, und 2 ul Tween 80 wurden zugesetzt und unter Rühren bei 30ºC reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7 einzustellen. Nach 72 Stunden Reaktion wurden 71 mg Homopilopinsäure als weiße Nadeln durch Lösungsmittelextraktion erhalten (Ausbeute 84%). [α]D: 81,2º.
    • Beispiel 40
  • Es wurde eine Kultur von Rhizomucor miehei IFO 9740 hergestellt. 5 ml des in Tabelle 6 angegebenen Mediums wurden mit Sporen von Rhizomucor miehei IFO 9740 geimpft und bei 30ºC 3 Tage kultiviert. Die resultierende Kultur wurde verwendet, um 100 ml desselben Mediums zu impfen, und weitere 4 Tage bei 30ºC kultiviert. Die Kultur wurde filtriert, um den Überstand abzutrennen und 920 mg (Trockengewicht) der Zellen wurden erhalten. Tabelle 6 Hefeextrakt Malzextrakt Sucrose
  • Löse in 1 l Wasser auf und stelle auf pH 6,0 ein
    • Beispiel 41
  • 100 mg (+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 36 erhalten, 200 mg des gezüchteten Stammes von Rhizomucor miehei IFO 9740 wie in Beispiel 40 erhalten und 2 ul Tween 80 wurden 5 ml an 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) zugesetzt und bei 30ºC reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde alle 6 Stunden gesättigte Natriumcarbonatlösung zugesetzt, um den pH auf 7 einzustellen. Nach 68 Stunden Reaktion wurden 61 mg rohe, kristalline Homopilopinsäure durch Lösungsmittelextraktion erhalten (Ausbeute 72%). [α]D: 79,8ºC. Das NMR-Spektrum des Produktes nach Bildung des Methylesters zeigte im wesentlichen kein Signal von (-)-Homopilopinsäuremethylester.
    • Beispiele 42 bis 45
  • (+)-Homopilopinsäureester wurde unter Verwendung von vier Arten von Enzymen gewonnen, welche selektiv auf (-)-Homopilopinsäureester wirken. Die Reaktion wurde in 10 ml von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 30ºC durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 (Erster Schritt) Bsp. Nr. Enzym Ausgangsester*1) (mg) Reaktionszeit (h) Estergewinnung (%) Spezifische Drehung [α]D Lipase T-01 (Toyo Jozo) Cholesterolesterase T18 (Toyo Jozo) Lipase (Sigma) Lipase PS (Amano) *1) Et: (±)-Homopilopinsäureethylester, (Oct): (±)-Homopilopinsäureoctylester
    • Beispiele 46 bis 47
  • (+)-Homopilopinsäureester wie in Beispiel 44 gewonnen wurde unter Verwendung verschiedener Enzyme wie in Tabelle 8 angegeben hydrolysiert. Die Reaktion wurde in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 30ºC durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 (Zweiter Schritt) Bsp. Nr. Enzym Ausgangsester*1) (mg) Reaktionszeit (h) Ausbeute*2) (%) Spezifische Drehung [α]D Lipase (Seikagaku Kogyo) Esterase (Boehringer) Lipozyme IM 20 (Novo) Lipase OF (Meito)
  • *1) Beispiele 46 und 47: Es wurde der in Beispiel 44 gewonnene Ester verwendet.
  • Beispiele 48 und 49: Es wurde der in Beispiel 45 gewonnene Ester verwendet.
  • *2) Ausbeute an Homopilopinsäure.
    • Beispiele 48 bis 49
  • (+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 45 gewonnen, wurde wie in den obigen Beispielen unter Verwendung verschiedener Enzyme, die auf (+)-Homopilopinsäureester wirken, hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
    • Beispiele 50 bis 52
  • 110 mg (+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 42 gewonnen, wurden unter Verwendung verschiedener Enzyme, welche auf (+)-Homopilopinsäureester wirken, hydrolysiert. Die Reaktion wurde in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) bei 30ºC während 48 Stunden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 (Zweiter Schritt unter Verwendung von Mikroorganismen) Bsp. Nr. Stamm Trockengew. d. Mikroorganismus (mg) Ausgangsester *1) Ausbeute (%) Aspergillus sojae IAM 2703 Escherichia coli IFO 3366 Xanthomonas oryzae IFO 3510 Candida utilis IFO 4961 Pseudomonas aeruginosa IAM 13130 Serratia plymuthica JCM 1244 Cellulomonas turbata FERM P-9059 Nocardia erythropolis IAM 1484 Nocardia rubropertincta JCM 3204 Flavobacterium hetescens IFO 3084 Brevibacterium ketoglutaricum ATCC 15588 Rhodococcus erythropolis IFO 12682 Mycobacterium rhodoclass IFO 13161
  • *1) Et: (+)-Homopilopinsäureethylester, Oct: (+)-Octylester. In den Beispielen Nr. 50-52, 53-58, 59-61 und 62 wurden die in den Beispielen 42, 43, 45 bzw. 44 gewonnenen Ester verwendet.
  • *2) Nach Kultivierung in dem in Tabelle 1 gezeigten Medium bei 30ºC während 24 Stunden wurde der gewonnene Ester (110 mg) zugesetzt und 48 Stunden reagieren gelassen.
    • Beispiele 53 bis 58
  • (+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 43 gewonnen, wurde wie in den obigen Beispielen unter Verwendung verschiedener Enzyme hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
    • Beispiele 59 bis 61
  • (+)-Homopilopinsäureethylester, wie in Beispiel 45 gewonnen, wurde wie in den obigen Beispielen unter Verwendung verschiedener Enyzme hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
    • Beispiel 62
  • (+)-Homopilopinsäureoctylester wie in Beispiel 44 gewonnen wurde wie in den obigen Beispielen unter Verwendung des in Tabelle 9 gezeigten Enzyms hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
  • Die folgenden Beispiele 63 bis 65 erläutern die Herstellung der im ersten Schritt von Verfahren 3 zu verwendenden Kultur.
    • Beispiel 63
  • Ein Stamm Brevibacterium ammoniagens IFO 12072 wurde in 100 ml des in Tabelle 5 angegebenen Mediums bei 30ºC während 1 Tag kultiviert, um 270 mg (Trockengewicht) der Zellen zu ergeben.
    • Beispiel 64
  • Ein Stamm Escherichia vulneris JCM 1688 wurde in 100 ml des in Tabelle 5 angegebenen Mediums bei 30ºC während 1 Tag kultiviert, um 540 mg (Trockengewicht) der Zellen zu ergeben.
    • Beispiel 65
  • Ein Stamm Rhodotorula rubra IFO 0893 wurde in 100 ml des in Tabelle 5 angegebenen Mediums bei 30ºC während 2 Tagen kultiviert, um 750 mg (Trockengewicht) der Zellen zu ergeben.
    • Beispiele 66 bis 68
  • Diese Beispiele erläutern die Herstellung von (+ )-Homopilopinsäure durch Kombination des ersten Schrittes unter Verwendung der in den Beispielen 63 bis 65 erhaltenen Zellen und des zweiten Schrittes unter Verwendung des gewonnenen (+ )-Homopilopinsäureesters und Lipase OF. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10 Erster Schritt*1) Zweiter Schritt*2) Bsp. Nr. Spezif. Drehung des Products [α]D Mikroorganismus (mg) Gewonnener Ester (mg) Lipase OF Ausbeute (%)*3)
  • *1) 0,1 M Tris (pH 7,5): 2 ml, (±)-Homopilopinsäureethylester: 100 mg, 30ºC, 50 Stunden.
  • *2) 0,1 M Tris (pH 7,5): 1 ml; Lipase OF, 30ºC, 50 Stunden.
  • *3) Ausbeute an Homopilopinsäure.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure oder einem Salz davon, welches die Hydrolyse einer Mischung von (+)-Homopilopinsäureester der allgemeinen Formel
worin R&sub1; einen geraden oder verzweigten C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoff bezeichnet und (-)-Homopilopinsäureester der allgemeinen Formel (II):
worin R&sub2; einen geraden oder verzweigten C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Kohlenwasserstoff bezeichnet, in Gegenwart einer Kultur, Zellen, Kulturüberstand oder behandelte Materie eines Mikroorganismus, der der Gattung Arthrobacter, Aspergillus, Escherichia, Cunninghamella, Xanthomonas, Candida, Pseudomonas, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Mycobacterium, Rhizomucor, Rhodotorula oder Rhodococcus angehört, umfaßt.
2. Verfahren zur Herstellung von (+)-Homopilopinsäure oder einem Salz davon, welches die Hydroyse einer Mischung von (+)-Homopilopinsäureester und (-)-Homopilopinsäureester wie in Anspruch 1 angegeben umfaßt, indem wenigstens eine Lipase, Esterase, Cholesterolesterase und/oder Lipoproteinlipase verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, welches des weiteren die Rückgewinnung von nicht umgesetztem (+ )-Homopilopinsäureester und die Hydrolyse dieses nicht umgesetzten (+)-Homopilopinsäureesters umfaßt, indem entweder eine Lipase oder eine Esterase, oder eine Kultur, Zellen, Kulturüberstand oder behandelte Materie eines Mikroorganismus, der der Gattung Aspergillus, Escherichia, Xanthomonas, Candida, Pseudomonas, Serratia, Cellulomonas, Nocardia, Bacillus, Flavobacterium, Brevibacterium, Mycobacterium, Rhizomucor oder Rhodococcus angehört, verwendet wird.
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