DE69016129T2

DE69016129T2 - Vakzin gegen Escherichia coli.

Info

Publication number: DE69016129T2
Application number: DE69016129T
Authority: DE
Inventors: Den Bosch Johannes Francis Van
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-07-23
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2010-07-24
Also published as: DK0413378T3; JPH03184996A; CN1049523A; NZ234933A; KR0177510B1; HU210965B; CA2022420C; IL95175A; ES2070266T3; GR3015782T3; EP0413378B1; ZA906100B; EP0413378A1; DE69016129D1; HU905053D0; AU6109990A; CA2022420A1; HU211827A9; AU635062B2; JP3031561B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff für den Schutz von Individuen gegen Escherichia coli (E. coli)- Infektion, auf ein Toxin zur Verwendung in einem solchen Impfstoff und auf ein Verfahren zur Reinigung eines solchen Toxins.
E. coli ist ein weitverbreitetes Bakterium, welches den Verdauungstrakt der meisten Lebewesen besiedelt. Im allgemeinen erfolgt eine solche Besiedelung ohne ernstliche negativen Wirkungen - in den meisten Fällen trägt das Bakterium sogar zu Prozessen bei, welche für seinen Wirt günstig sind. Gelegentlich jedoch erzeugt E. coli ernsthafte Erkrankungen, insbesondere bei jungen Lebewesen. Dies kann auch bei Vögeln auftreten, und in kommerziellen Geflügelzuchten kann eine solche Infektion epidemisch werden und zu ernstlichen Schwächungen oder sogar zu massiver Mortalität unter den jungen Vögeln führen.
Selbstverständlich wurde versucht, solche E. coli- Infektionen beim Geflügel mittels Impfungsprogrammen unter Kontrolle zu bringen. Zu diesem Zweck wurden reife Küken mit Bakterinen - inaktivierten E. coli-Bakterien geimpft [Avian Diseases 29(4), 1108-17 (1985)]. Ein Nachteil der Bakterin-Impfungen besteht in den gleichzeitigen ernstlichen Nebenreaktionen. Ausserdem führt die Bakterin-Impfung in erster Linie zu Antikörpern gegen Lipopolysaccharide, welche nur für einen bestimmten E. coli-O-Serotyp spezifisch sind und demzufolge nicht gegen andere E. coli- Serotypen Schutz bieten.
Für die Bekämpfung von E. coli-Infektionen werden auch häufig Impfstoffe verwendet, welche auf Pili, erhalten aus diesen Bakterien, beruhen. Diese Impfstoffe führen jedoch nur zu einem beschränkten Schutz von nicht mehr als etwa 80% der geimpften Individuen. Aus diesem Grund enthalten E. coli-Impfstoffe oft als Komponente noch einen anderen Virulenzfaktor: inaktiviertes Toxin von E. coli.
Viele Typen von E. coli enthalten Geisseln, welche eine Aufgabe in der Fortbewegung besitzen. Für E. coli wurden Geisseln nicht als Faktor der Virulenz betrachtet, und wurden daher nicht in E. coli-Impfstoffe eingeschlossen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die Geisseln von E. coli mit einer tiefgreifenden toxischen Wirksamkeit gegen Verozellen assoziiert sind, was bisher nicht erkannt wurde, und dass diese flagellaren Toxine einen wesentlichen Faktor der Virulenz darstellen.
Aufgrund dieser Erkenntnis wurden Impfstoffe hergestellt, welche abgeleitet sind von Geisseln von E. coli. Gemäss der vorliegenden Erfindung können ganze Geisseln von E. coli verwendet werden, wie auch Substrukturen davon, welche diese Geisseln bilden, z.B. Flagelline oder Fragmente oder Aggregate der Flagelline, welche damit geimpfte Individuen gegen E. coli-Infektionen schützen.
In Versuchen mit einer grossen Anzahl von E. coli-Stämmen, welche hauptsächlich aus Küken, aber auch aus anderen Tieren und Menschen isoliert wurden, wurde festgestellt, dass Geisseln mit der Toxizität gegen Verozellen assoziiert sind; diese toxische Wirksamkeit erwies sich als neutralisiert durch Antikörper gegen die Geisseln. Es erwies sich ferner, dass die Toxizität der Geisseln von allen untersuchten E. coli-Stämmen durch ein einziges Antiserum neutralisiert werden konnte, welches gegen die Geisseln von einem der Stämme gezogen worden waren.
In Anbetracht dieser Feststellung wird angenommen, dass die Impfung mit Geisseln, welche von einem einzigen E. coli- Stamm erhalten wurden, Schutz gegen Infektionen mit allen Geisseln tragenden E. coli-Stämmen ergibt.
In Anbetracht der obigen Ueberlegungen basiert der Impfstoff gemäss der Erfindung auf einer neuen Klasse von Toxinen, welche in E. coli gefunden werden und welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Proteinnatur aufweisen, assoziiert in und/oder mit Geisseln gefunden werden und ein Molekulargewicht zwischen 30-100 kD, gemessen in SDS-PAGE, aufweisen, keine gebundenen Kohlehydratreste enthalten, gegen Verozellen und eintägige Küken toxisch sind und diese Toxizität sogar nach Erhitzen während einer Stunde auf 100ºC beibehalten.
Die vereinten Kennzeichen unterscheiden diese neuen Toxine von den im Stand der Technik bekannten E. coli-Toxinen.
Die oben beschriebenen Toxine werden bei einer grossen Anzahl E. coli-Stämmen gefunden und werden hier als flagellare Toxine (FT) bezeichnet wegen ihrem auffallenden Vorkommen in flagellaren Strukturen. Diese Geisseln sind im allgemeinen wesentlich grösser als normale Fimbrien (welche typischerweise etwa 7 nm im Durchmesser und bis zu etwa um Länge aufweisen) und sind etwa 25 nm dick und 7 um lang.
Ein Glied der Klasse von Toxinen gemäss der vorliegenden Erfindung wurde aus dem Küken-E. coli-Stamm CH7 (015:K14:H10) nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert. Dieses CH7-FT kann in verschiedenen Formen isoliert werden: entweder assoziiert als native Geisseln von Typus H10 oder als das freie Toxin oder wieder assoziiert an kleine nadelartige Filamente, welche von dem freien Toxin erhalten werden. Typische Kennzeichen dieses CH7-FT zusätzlich zu den zuvor erwähnten allgemeinen Kennzeichen sind ein Untereinheitsmolekulargewicht von etwa 47 kD, wie durch SDS-PAGE bestimmt, ein isoelektrisches pH von etwa 4,8 und die partielle, aminoendständige Aminosäuresequenz:
Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln.
(Die Charakterisierung von CH7-FT ist in Beispiel 2 beschrieben).
Das gegen dieses CH7-FT gerichtete Antiserum erwies sich als gegen die FT von allen anderen untersuchten E. coli- Stämmen wirksam (Beispiel 3). Dementsprechend kann ein solches Antiserum gegen CH7-FT verwendet werden, um alle anderen FTs gemäss der vorliegenden Erfindung zu kennzeichnen. Ferner waren monoklonale Antikörper entweder spezifisch oder kreuzreaktionsfähig mit FT von allen anderen untersuchten E. coli-Stämmen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Impfstoffe mit immunisierender Wirksamkeit gegen E. coli-Infektion, in welchen der aktive Bestandteil ein inaktiviertes Toxin gemäss der vorliegenden Erfindung ist.
Solch ein Impfstoff enthält mit Vorteil die toxischen Geisseln, da diese Geisseln leicht erhalten werden können durch Züchtung von E. coli-Bakterien unter Bedingungen, welche die Bildung von Geisseln fördern, und Trennung der Geisseln oder der zellfreien überstehenden Flüssigkeit von den Bakterien. Das FT kann weiter gereinigt werden durch Entfernung der Komponenten mit niederem Molekulargewicht von der überstehenden Flüssigkeit unter Verwendung von Ultrafiltration und/oder Molekularsieb-Chromatographie.
Während dieses Reinigungsverfahrens kann die an FT angereicherte Fraktion durch ihre Reaktionsfähgikeit mit den gegen CH7-FT gerichteten monoklonalen Antikörpern überwacht werden.
Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann auch ein Fragment von FT enthalten, welches damit geimpfte Individuen gegen E. coli-Infektion schützt.
Ein in einen Impfstoff gemäss der Erfindung einzuverleibendes FT kann durch chemische Synthese, Reinigung aus E. coli-Zellkulturen oder durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden.
Im letzteren Fall können Nukleinsäuresequenzen, welche für das oben erwähnte Protein oder Fragmente davon codieren, identifiziert werden, beispielsweise durch Screenen einer genomischen E. coli-DNA-Bank auf individuelle Klone, welche diese Sequenzen enthalten, z.B. durch Verwendung einer spezifischen Reaktion mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, welche gegen FT elizitiert sind. Die Nukleinsäuresequenzen können an verschiedene, die Expression bewirkenden DNA-Sequenzen gebunden sein, was zu einem sogenannten rekombinanten Nukleinsäuremolekül führt, welches für die Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet werden kann. Solche hybride DNA-Moleküle können z.B. von Plasmiden, Phagen oder von in Viren vorhandenen Nukleinsäuresequenzen abgeleitet werden. Die Wirtszelle kann von prokariotischer Herkunft sein, z.B. von bakteriellem oder eukariotischem Ursprung, wie Säugetierzellen. Die transformierten Wirtszellen können verwendet werden, um das FT zu erzeugen, woraufhin das genannte Protein isoliert und anschliessend in einen Impfstoff gemäss der Erfindung einverleibt werden kann.
In einer anderen Ausführungsform kann ein lebender Vektorimpfstoff hergestellt werden, welcher nicht pathogene Mikroorganismen umfasst, z.B. Viren oder Bakterien, die das für FT codierende Gen enthalten.
Abgesehen vom FT kann ein Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung auch ein wässriges Medium oder eine wasserhaltige Suspension und/oder andere Bestandteile enthalten, z.B. um die Aktivität und/oder die Lagerfähigkeit zu erhöhen. Diese Bestandteile können Salze, Mittel zur Inaktivierung der toxischen Wirksamkeit von FT, während seine immunogenen Eigenschaften beibehalten werden (z.B. Formalin), pH-Puffer, Emulgatoren und Adjuvantien, um die Immunantwort zu erhöhen (z.B. Mineralöle, Muramyldipeptid, Aluminiumhydroxid, Saponin, Polyanionen und amphiphatische Substanzen), sein.
Der Impfstoff ist nützlich für die Immunisierung warmblütiger Tiere (einschliesslich Menschen) gegen E. coli- Infektionen und kann insbesondere verwendet werden, um E. coli-Infektionen bei Vögeln zu bekämpfen.
Zu diesem Zweck wird der Impfstoff vorzugsweise parenteral verabreicht, z.B. subkutan oder intramuskulär. Der Impfstoff kann auf diese Weise sowohl für die aktive Immunisierung der geimpften Vögel wie bei brütenden Vögeln für die passive Immunisierung ihrer Nachkommen verwendet werden. Bei der Immunisierung brütender Vögel werden die in ihnen entstandenen Antikörper selbstverständlich in die Dotter ihrer Eier eingeführt werden und daher anschliessend in die ausgeschlüpften Küken.
Sowohl die Zusammensetzung des Impfstoffs wie das Impfsystem können variiert werden und hängen vom Typ der zu schützenden Tiere, dem Alter und dem Gewicht der Tiere, der gewünschten Schutzdauer, der Verabreichungsart und der Frage, ob aktive Immunisierung oder passive Immunisierung mit Hilfe von mütterlichen Antikörpern erwünscht ist, ab. Die optimal wirksame Menge an aktiver Komponente im Impfstoff beträgt etwa 10-100 ug pro Dosis für parenterale Impfung von Geflügel. Der Impfstoff kann mit anderen relevanten Impfstoffen kombiniert werden.

Beispiel 1

Isolierung von flagellarem Toxin von E. coli-Stamm CH7

A. Herstellung von flagellarem Toxin

E. coli-Stamm CH7 (015:K14:H10) wurde über Nacht in einem Biostat E-Fermentor (Braun) in 12 Liter Trypticase Soy Broth (B.B.L.) bei einem pO&sub2;-Satz von 14% und variablem Rühren zwischen 100-500 Touren pro Minute gezüchtet. Die Kultur wurde auf etwa 1 Liter in einem Pellikon- Filtersystem (Millipore) in einem HVLP-Filter konzentriert. Die Bakterien wurden während 30 Minuten bei 10,000 Touren pro Minuten zentrifugiert (GSA-Rotor, Sorvall), die überstehende Flüssigkeit durch ein 0,45 um-Filter filtriert und zu dem HVLP-Filtrat zugesetzt.
Das Filtrat wurde auf etwa 1 Liter konzentriert und mit 3 mal 1 Liter 0,2 mol/l Tris HCl-Buffer gewaschen unter Verwendung eines PTTK-Filters.
Das PTTK-Konzentrat wurde wiederholt in Portionen von etwa 110-160 ml über einer Sepharose 4B-C1-Säule (Pharmacia, Uppsala Schweden) mit einer Höhe von 10 cm und einer Fläche von 154 cm² (Amicon Modell P140 x 250), welche in Phosphat- Puffer 50 mMol/l, pH 7,2, mit 0,1% NaN&sub3; als Konservierungs- mittel äquilibriert worden war (PB), eluiert. Die Säule wurde mit PB eluiert, bis die Grundlinie des Aufnahmegerätes wiederum auf Null abgefallen war.
Die Fraktionen der ersten Spitze, welche die Moleküle mit hohem Molekulargewicht enthielten, wurden vereint und auf einem YM-100 Ultrafiltrationsfilter (φ 62 mm Amicon, mit Amicon UF Modell 202) konzentriert, bis die Proteinkonzentration etwa 2-3 mg/ml betrug. Das Konzentrat wurde zweimal gegen 5 l Tris-HCl-Buffer 20 mMol/l PH 7,5 mit 0,1% NaN&sub3; als Konservierungsmittel dialysiert.

B. Herstellung von freiem Toxin

Das Konzentrat wurde präparativ nach der Methode von Laemmli (Nature 227, 680-4, 1970) der Elektrophorese unterworfen. Es wurde 1:1,67 in Probenpuffer, bestehend aus 20 ml Glyzerin, 20 ml Tris-HCl-Puffer 0,5 mol/l pH 6,8, 20 ml 10% SDS, 5 ml 2-Merkaptoäthanol (ME) und 2 ml 0,05% Bromphenolblau, verdünnt.
Dann wurde es während etwa 5 Minuten in Wasser gekocht, abgekühlt und auf einem 12%igen (Acrylamid:Bis30:0,8) präparativen Polyacrylamidschräggel von 16 x 0,6 cm der Elektrophorese unterworfen. Typische Probenbelastungen betrugen etwa 15-23 mg Protein pro Gel (7,5 ml Konzentrat und 5,0 ml Probenpuffer). Die Elektrophoresen wurden auf einer Proteanzelle Modell 1423 (Bio-Rad, Richmond USA) oder einem Modell SE600 (Hoefer, San Francisco, USA) durchgeführt. Nachdem die Front vom Gel eluiert war, wurde die Elektrophorese während einer weiteren Stunde bei 200V weitergeführt. Das Gel wurde in Scheiben von etwa 1,5-2 mm geschnitten.
Die Proteine wurden in 10 ml 0,89% Natriumchloridlösung + 0,1% NaN&sub3; während 3 Stunden bei Zimmertemperatur und über Nacht bei 4ºC unter kontinuierlicher Bewegung eluiert. Die Scheiben wurden entfernt, und die Lösungen wurden über ein 0,45 u Filter filtiert. Die Fraktionen, welche reine Toxin- Untereinheiten enthielten, wurden gesammelt und bei -20ºC gelagert.
Der Proteingehalt der Proben wurde nach einer modifizierten Folin-Ciocalteu-Methode (J. Biol.Chem. 73, 627; 1927) gemessen, das Polysaccarid wurde unter Anwendung der Phenol- Schwefelsäure-Methode gemäss Dubois (Anal. Chem. 28, 350-6; 1956) gemessen.

Beispiel 2

Kennzeichnung des Toxins von E. coli-Stamm CH7

A. Letalität für eintägige Küken

In einem ersten Versuch wurden 0,2 und 0,5 ml verschiedener E. coli-Toxinpräparate IP in eintägige SPF-Bratküken (GVP, Doorn) initiiert. In einem zweiten Versuch wurden 0,5 ml Toxinpräparate IV in drei Wochen alte Brathähnchen initiiert. Die Todesfälle wurden während 7 Tagen nach der Injektion aufgezeichnet.

Resultate

Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren Toxinpräparate sowohl von Küken-E. coli-Stämmen CH2 wie CH7 für eintägige Küken nach IP-Injektion tödlich. Für den Stamm CH7 waren sowohl die überstehende Flüssigkeit wie das Lysat toxisch, während für den Stamm CH2 insbesondere das Lysat toxisch war. Tabelle 1 Letalität für eintägige Küken: IP-Iniektion der überstehenden Flüssigkeit oder des Lysats aus E. coli-Stämmen. Initiiertes Präparat* Dosis (ml) Tote Küken/Total initiiert am Tag Sterile TSB * Die Stämme CH2 und CH7 sind Küken-E. coli-Isolate; Der Stamm ZF24 ist ein avirulentes E. coli-Isolat aus menschlichem Kot.sup = überstehende Flüssigkeit lys = Lysat
Die IV-Injektion ähnlicher Präparate in 3 Wochen alte Küken ergab keinerlei Wirkung (Daten hier nicht angeführt).

B. Vero-Test

Verozellen wurden bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre in Medium 6 (enthaltend pro Liter 85 ml MEM Eagle, 100 ml Tryptosephosphat-Bouillon, 50 ml 4,4% NaHCO&sub3;), ergänzt mit 5% Kälberfötusserum (FCS) und 200 E/ml Penizillin und 200 g/ml Streptomyzin, und nach Filtersterilisation ergänzt mit 2 ug/ml Fungizon, gezüchtet. Nach Trypsinisierung wurden die Zellen in Polystyrol-Kulturplatten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden (Greiner) mit 200 ul pro Vertiefung vollständigem Medium 6, enthaltend 2 x 10&sup5; Zellen pro ml geimpft. Nach Inkubation über Nacht wurden Monoschichten hergestellt. Das Medium wurde verworfen und durch 200 ul pro Vertiefung Medium 6 ohne FCS aber ergänzt mit 10 ug/ml Xanthin (3-isobutyl-1-methyl-xanthin; Sigma) ersetzt. Anschliessend wurden 20 ul präparaten zugesetzt. Die zytopathologische Wirkung (CPE) wurde nach 5 Tagen Inkubation aufgezeichnet.
Das Screenen von Stämmen für die Toxinerzeugung wurde zuerst durch Zusatz von 20 ul pro Vertiefung an unverdünnten und 1:2-verdünnten überstehenden Flüssigkeiten ausgeführt. Zweitens wurden Stämme, von welchen die überstehenden Flüssigkeiten im Vero-Test negativ waren, auf intrazelluläre Toxinerzeugung geprüft durch Zusatz von 50 ul pro Vertiefung an unverdünnten und 1:2 verdünnten bakteriellen Lysaten.

Resultate

Zuerst wurden die in Tabelle 2 aufgelisteten Stämme auf ihre Toxinerzeugung untersucht. Einige Stämme schieden Toxin in die überstehende Flüssigkeit aus, während bei anderen Stämmen das Toxin intrazellulär und/oder nur nach Ultraschall-Aufbrechen der Bakterienzellen nachweisbar war. Die zytopathologische Wirkung bestand im Rundwerden und Eingehen der Verozellen, während die Monoschicht in den meisten Fällen intakt blieb. Tabelle 2 Verozellentoxizität von verschiedenen E. coli-Stämmen Stamm* Serotyp Toxintiter ** in überstehender Flüssigkeit Lysat * JA221 ist ein E. coli K-12-Stamm; ZF24 siehe Tabelle 1; CH-Stämme sind Kükenisolate ** Der Toxintiter wird definiert als der reziproke Wert der letzten, eine toxische Wirkung ergebenden Verdünnung.

C. Stabilität des Toxins

Die vorbereitende Kennzeichnung des identifizierten Toxins erfolgte durch Untersuchung der Empfindlichkeit der Toxinpräparate auf verschiedene Behandlungen. pH-Empfindlichkeit wurde untersucht durch Einstellung des Toxins auf pH 3 bis 10 und Neutralisierung nach Inkubation über Nacht bei Zimmertemperatur vor der Toxizitätsuntersuchung.
Für die Untersuchung der Hitzeempfindlichkeit wurden die Toxinpräparate auf verschiedene Temperaturen erhitzt. Die Wirkung von SDS und ME wurde untersucht durch Erhitzen des Toxin in Gegenwart von 1% SDS und von 1% SDS mit 2,5% ME und anschliessendes Dialysieren gegen Kochsalzlösung. Zur Untersuchung der Empfindlichkeit auf Harnstoff wurden 6M Harnstoff zu den Toxinpräparaten während einer Stunde zugesetzt und gegen Kochsalzlösung dialysiert.
Die Formalinempfindlichkeit wurde untersucht durch den Zusatz von verschiedenen Konzentrationen an Formalin, Inkubation über Nacht bei verschiedenen Temperaturen und Dialysieren vor der Toxizitätsuntersuchung in dem Verozellentest. Die Empfindlichkeit auf Trypsin wurde untersucht durch Zusatz von 100 ug/ml Trypsin (Rinderpancrease; Millipore), Inkubation bei 37ºC während 4 Stunden und anschliessenden Zusatz von 150 ug/ml Trypsininhibitor (Sojabohne; Sigma) während 30 Minuten bei 37ºC vor der Toxizitätsuntersuchung.

Resultate

Da genaue Kükentoxintiterbestimmungen in dem Verozellen- Toxizitätsversuch nicht sehr gut reproduzierbar sind infolge der Aenderungen der Bedingungen der Verozellen an verschiedenen Tagen, sind die hier dargestellten Resultate nur als Beispiele typischer Versuche zu werten.
Die Behandlung von überstehender Flüssigkeit von CH5 und CH7 bei pH 3 bis zu und einschliesslich 10 beeinflusste die Toxizität nicht, die Toxintiter betrugen unveränderlich 32- 64 bzw. 128-256.
Die Hitzeempfindlichkeit und die Empfindlichkeit auf Behandlung mit SDS oder SDS + ME ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Wirkung von Küken-E. coli-Toxintiter auf das Erhitzen von Toxinpräparaten in Abwesenheit und in Gegenwart von SDS oder SDS + ME Behandlung Kontrolle lys. = Lysat sup. = überstehende Flüssigkeit
Obwohl die Toxizität des CH2-Lysats (lys.) und von CH5- und CH7-überstehenden Flüssigkeiten (sup.) nach längerer Einwirkung hoher Temperaturen etwas abnahm und vollständig verschwand nach Erhitzen auf 120ºC, muss das Toxin als verhältnismässig hitzebeständig betrachtet werden. Das Erhitzen während 10 Minuten in Gegenwart von SDS oder sogar SDS + ME hatte keine Wirkung auf die Toxizität der überstehenden Flüssigkeiten von CH5 und CH7.
Die Behandlung des CH2-Lysats und der überstehenden Flüssigkeiten von CH5 und CH7 mit 6 M Harnstoff hatte überhaupt keine Wirkung auf die jeweiligen VT-Titer.
Wie in Tabelle 4 dargestellt, wird die Toxizität der überstehenden Flüssigkeit von CH7 durch Formal in bei Zimmertemperatur und bei 37ºC inaktiviert.
Die Toxizität der überstehenden Flüssigkeiten sowohl von CH5 wie von CH7 verschwand vollständig nach Behandlung mit Trypsin, während Scheinbehandlung und Behandlung mit Trypsininhibitor allein keinerlei Wirkung auf die Toxizität ausübten. Tabelle 4 Inaktivierung der Toxizität der überstehenden Flüssigkeit von CH7 durch Inkubation über Nacht mit verschiedenen Konzentrationen an Formalin Formalinkonzentration (%) Toxintiter nach Inkubation bei Zimmertemperatur 37ºC

D. Molekulargewichtsbestimmung

Das Molekulargewicht des Toxins des Stammes CH7 wurde bestimmt durch analytische Gelelektrophorese in 12%igen Gelen (Acrylamid:Bis = 30:0,8) nach der Methode von Laemmli durch Vergleich mit Standarden.
Die Gele wurden mit Koomassie-Brilliantblau (CBB) eingefärbt. Die Abtastungen erfolgten unter Verwendung eines Gelsscanners Modell CS-930 und eines Aufzeichners DR-2 (Shimadzu, Kyoto Japan).
Figur 1 zeigt eine Abtastung nach Durchlauf des mit Molekulargewichtsmarkierungen beladenen Gels, eingefärbt mit Koomassie-Brillianblau.
Die Standards, entsprechend den Spitzen 1-6 weisen Molekulargewichte von 78,000 bzw. 66,000, 45,000, 30,000, 17,200 und 12,300 D auf (LKB 1860-12, Bromma, Schweden).
In den Figuren 2 und 3 sind Abtastungen der aus Stufe A bzw. Stufe B von Beispiel 1 erhaltenen Produkte dargestellt.
Das Molekulargewicht der Toxinuntereinheit von E. coli- Stamm CH7 wurde in diesen Versuchen mit etwa 47 kD festgestellt.

E. Bestimmung des isoelektrischen Punktes

Der isoelektrische Punkt des Toxins wurde bestimmt durch Fokussieren von 3 ml Toxin von E. coli-Stamm CH7, erhalten aus Stufe A von Beispiel 1, zusammen mit einem Gemisch 0,5 ml Servalytes pH 3-7 (analytische Qualität von Serva Heidelberg Deutschland) und 46,5 ml destilliertem Wasser während 5 Stunden bei 12 W (Rotofor, Bio-Rad Richmond USA). Der Toxingehalt wurde durch analytische Gelelektrophorese nachgewiesen.
Die Resultate dieses Versuches sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
Es wurde aus diesen Resultaten gefunden, dass das Toxin von E. coli-Stamm CH7 einen isoelektrischen Punkt bei etwa pH 4,8 besitzt. Resultate Tabelle 5 pH- und Toxinwerte nach Fokussieren von 3 ml Seph 4B-C1- Probe Fraktion pH Toxin* * - = kein sichtbares Toxin ± = gerade sichtbar + = sichtbar ++, +++, ++++ = zunehmende Mengen an Toxin

F. Saccaridgehalte

Das Toxin von E. coli-Stamm CH7, erhalten aus Stufe B von Beispiel 1, enthielt weder Polysaccarid noch irgendwelche Zucker, wie in der Phenol-Schwefelsäure-Untersuchung von Dubois et al. (Analytical Chemistry 28, 350-356; 1956) bestimmt. Im Limulus Amoebocyt-Lysat Test (Pyrotell, MA, USA) wurde keine wesentliche LPS (Endotoxin)-Aktivität festgestellt.

G. Aminosäure Analyse

Die N-endständige Aminosäuresequenz wurde bestimmt durch das Flüssigphasen-DABITC-Verfahren gemäss Chang (Methods Enzymology 91, 455-466; 1983). Die Identifizierung der DABTH-Aminosäuren erfolgte durch Dünnschichtchromatography. Die Aminosäurezusammensetzung wurde bestimmt durch PTC- Technik, wie von Janssen et al. (Chromatographia 22, 345- 358; 1986) beschrieben, unter der Annahme, dass das Untereinheits-Molekulargewicht von 47kD für CH7-FT einem Total von 446 Aminosäuren entspricht.

Resultate

Das Toxin von E. coli-Stamm CH7, erhalten aus Stufe A und Stufe B von Beispiel 1, wies die folgende N-endständige Aminosäurensequenz auf:
Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln
Diese Sequenz ist identisch mit der N-endständigen Aminosäuresequenz von E. coli K-12-Flagellin, wie beschrieben von Kuwajima et al. (Journal of Vacteriology 168, 1479- 1483; 1986).
Die Aminosäurezusammensetzung des Toxins ist in Tabelle 6 angegeben und zeigt auch die Homologie mit E. coli K-12- Flagellin in einem beträchtlichen Ausmass. Tabelle 6 Schätzung der Aminosäurezusammensetzung von CH7-FT und Vergleich mit der Aminosäurezusammensetzung von E. coli K-12- Flagellin: Anzahl Aminosäuren pro Untereinheit (Prozentsatz) Aminosäure CH7-FT1) E.-coli K-12-Flagellin²1) Geschätzt durch die PCT-Technik (Chromatographia 22, 345-358; 1986). 2) Berechnet auf der Basis der DNA-Sequenz (Journal of Bacteriology 168, 1479-1483; 1986).

Beispiel 3

Screening von Küken-E. coli-Stämmen auf FT-Expression und serologische Kennzeichnung von FT.

Ein Total von 124 Küken E.-coli-Isolaten von der ganzen Welt wurde auf ihre Toxizität, Motilität und Expression von FT-Antigen an der bakteriellen Obergläche gescreent. Polyklonale und monoklonale Antikörper wurden verwendet, um die FT zu visualisieren und um Kreuzreaktionen zu untersuchen.

Methoden

Toxizitätsuntersuchung und Toxinneutralisation

Die Stämme wurden auf ihre Toxizität auf Verozellen untersucht, wie in Beispiel 2B beschrieben. Für die Neutralisation wurden Toxinpräparate mit Antiserumverdünnungen während 2 Stunden bei 37ºC vor der Toxizitätsuntersuchung inkubiert.

Motilitätsuntersuchung

Die Motilität der Stämme wurde in U-förmigen Rohren untersucht, welche Nährflüssigkeit mit niederer (0,25%) Agarkonzentration enthielten. Diese U-Rohre wurden mit einem E. coli-Stamm an einer Seite inkubiert, und die Migration zu dem anderen Ende des Rohres wurde nach Inkubation über Nacht bei 37ºC aufgezeichnet.

Antisera-Herstellung

Antisera wurde in Kaninchen und Hähnchen gegen das FT von E. coli-Stamm CH7, hergestellt wie in Beispiel 1A beschrieben, entwickelt. Die Toxine der Stämme CH5 und CH7, hergestellt wie in Beispiel 1B beschrieben, wurden für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern (MoAb) verwendet. Für die Herstellung von MoAb wurden Milzzellen von immunisierten Mäusen mit Myelomazellen verschmolzen und die resultierenden Hybridomas wurden auf Antitoxin-Antikörper-Sekretion in einem ELISA-Test gescreent. Positive Hybridomas wurden durch begrenzende Verdünnung geklont. Askitische Flüssigkeit wurde hergestellt durch intraperitoneale Injektion von geklonten Hybridomas bei Mäusen. Askiten wurden inaktiviert bei 56ºC während 10 Minuten, Lipide wurden extrahiert mit 1,1,2-Trichlortrifluoräthan (Merck) und MoAbs wurden ausgefällt mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat.

FT-Antigen-Expression durch E. coli-Stämme

Kaninchenantiserum, gerichtet gegen das FT von Stamm CH7 (015:K14:H10) wurde während 24 Stunden bei Zimmertemperatur mit dem nichttoxigenen E. coli-Stamm RDEC-1 (015:K14) absorbiert. Dieses absorbierte Antiserum wurde verwendet, um Stämme auf FT-Expression in einem ganzen Bakterien-ELISA zu screenen, welcher wie folgt durchgeführt wurde.
Bakterien wurden während 6 Stunden in TSB ohne Bewegung gezüchtet, mit 3,000 Touren pro Minute während 15 Minuten ausgeschleudert (Sorvall RT6000) und in CBB-Puffer (1,59 g/l Na&sub2;CO&sub3;; 2,93 g/l NaHCO&sub3;; 0,2 g/l NaN&sub3;; PH 9,6) resuspendiert zu einer O.D. bei 660 nm von 0,140-0,180. Polystyrol-Mikrotitrierplatten mit flachem Boden (Greiner) wurden mit 100 ul pro Vertiefung von diesen bakteriellen Suspensionen geimpft und bei 50ºC über Nacht trocknen gelassen. Die Platten wurden mit Leitungswasser gewaschen und während 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit 110ul pro Vertiefung PBS-T-N (0,04 M PBS; pH 7,2; 0,5% Tween 80; 15% Serum neugeborener Kälber) blockiert. Anschliessend wurden 100ul pro Vertiefung serienmässiger Verdünnungen von absorbiertem Serum zugesetzt, verdünnt in PBS-T-N und ausgehend von einer Verdünnung von 1:100. Zwei Vertiefungen pro Stamm mit PBS-T-N dienten als Hintergrundkontrollen. Nach einer Stunde Inkubation bei 37ºC wurden diese Platten gewaschen und 100ul pro Vertiefung an peroxidase-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-IgG(H+L) wurden zu jeder Vertiefung in der entsprechenden Verdünnung in PBS-T-N zugesetzt. Nach Inkubation bei 37ºC während 10 Minuten wurden die Platten wiederum gewaschen. Antikörperbindung wurde kolorimetrisch nachgewiesen durch Zusatz von 100ul pro Vertiefung an TMB- Substratpuffer, welcher Harnstoff-Peroxidase (Organon Teknika, Oss) und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in Natriumacetat-Zitronensäure-Puffer (pH 5.5) enthielt. Die Reaktion wurde im Dunkeln während 10 Minuten entwickelt, durch Zusatz von 50 ul 4N H&sub2;SO&sub4; unterbrochen und in einem Microelisa-Lesegerät bei 450 nm gemessen. Titer wurden bestimmt als die höchste Antiserumverdünnung, welche ein A&sub4;&sub5;&sub0; von mindestens zwei Mal dem Hintergrund A&sub4;&sub5;&sub0; ergab.
In jedem Versuch wurden die Stämme CH7 und RDEC-1 als positive bzw. negative Kontrollen eingeschlossen.

Western Blotting

Immunoblotting oder Western blotting wurde im wesentlichen wie von Muilerman et al. (Anl. Biochem. 120, 46-51; 1982) beschrieben durchgeführt. Rohe FT-Präparate von Stämmen wurden hergestellt durch Züchtung von Bakterien in Trypticase-Soya-Bouillon während 6 Stunden unter Bewegung. Bakterien wurden entfernt durch Zentrifugieren nach starkem Vermischen und die überstehende Flüssigkeit wurde etwa 40 Mal durch Aethanolausfällung (1 Teil überstehende Flüssigkeit mit zwei Teilen 96%igem Aethanol, Inkubation über Nacht bei 4ºC, Zentrifugieren und Auflösen des Niederschlages in 0,04 Mol/l PBS, pH 7.2) konzentriert. Diese rohen FT-Präparate wurden in SDS-PAGE durchlaufen gelassen und auf Zellulosenitrat-Membranfilter transblottiert. Antigene wurden durch die sukzessive Inkubation mit Antikörpern, zutreffenden peroxidase-konjugierten Antispezies-IgG (H + L) und Harnstoffperoxid mit 3,3'-Diaminobenzidin.4HCl visualisiert.

Immunogold-Elektronenmikroskopie (IG-EM)

IG-EM wurde im wesentlichen ausgeführt, wie von Van Alphen et al. (Infect. Immun. 56, 1800-6; 1988) beschrieben. Kurz gesagt wurden Bakterien, die in Trypticase-Soya-Bouillon gezüchtet worden waren, mit Antikörperverdünnungen in PBS plus 1% BSA plus 0,05% Tween 20 (PBS-B-T) inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und mit Protein A, welches mit Goldkügelchen markiert war, in PBS-B-T inkubiert. Nach drei weiteren Waschungen mit PBS wurden die Bakterien auf mit Formvar überzogene Gitter verbracht und mit 1% Uranylacetat oder Phosphorwolframsäure negativ eingefärbt.

Resultate

In einer Sammlung von 124 Küken-E.coli-Stämmen aus der ganzen Welt schieden 73 Stämme (59%) nachweisbare Mengen an Toxin, welches auf Verozellen aktiv war, aus. Weitere 37 Stämme (30%) waren toxisch für Verozellen nach Lyse der Bakterien. Im ganze Bakterien-ELISA reagierten 52 Stämme (42%) mit gegen CH7-FT gerichtetem Antiserum. Alle Stämme, welche positiv im ELISA-Test waren, erzeugten auch extrazellulares Verotoxin (Tabelle 7) Tabelle 7 Verhältnis zwischen Vero-Toxizität und Reaktionsfähigkeit mit gegen CH7-FT gerichtetem Antiserum (Anzahl Stämme) Vero-Toxizität2) Anti CH7-FT Reaktionsfähigkeit1) 1) Reaktion in ganze Bakterien-Elisa mit CH7-FT-Antiserum. 2) Toxizität für Verozellen von überstehender Flüssigkeit von Bakterienkultur.
Ein starker Zusammenhang wurde gefunden zwischen der Vero- Toxin-Ausscheidung und der Motilität der Stämme (Tabelle 8). Tabelle 8 Beziehung zwischen Vero-Toxizität und Motilität (Anzahl der Stämme) Vero-Toxizität2) Motilität1) 1) Motilität in U-Rohren 2) Toxizität für Verozellen von Überstehendem von Bakterienkultur
Diese Resultate ergeben einen weiteren Beweis dafür, dass die toxische Wirksamkeit für Vero in den Geisseln liegt. Es wurde auch gefunden, dass die Verotoxizität nach Passage von Bakterien durch U-Rohre erhöht war. Ferner zeigen diese Resultate, dass die Toxine von verschiedenen Stämmen serologisch kreuzreaktionsfähig sind.
Die Kreuzreaktion zwischen den Toxinen von verschiedenen Stämmen wurde weiter untersucht. In Tabelle 9 wird gezeigt, dass sowohl Kaninchen- wie Hühnchenantiseren, welche gegen FT des Stammes CH7 gerichtet sind, die Verotoxizität von allen anderen untersuchten toxigenen Stämmen neutralisierten. MoAbs, gerichtet gegen FT der Stämme CH5 und CH7 neutralisierten die Toxizität überhaupt nicht. Tabelle 9 Neutralisierung von Verotoxizität in überstehender Kulturflüssigkeit durch gegen CH7-FT berichtete Antiseren. Verotoxin-Titer1) Stamm Serotyp Kontrolle2)1) siehe Tabelle 2 2) Scheinbehandelte überstehende Flüssigkeit oder behandelt mit Pre-immun-Serum 3) Kaninchen-Anti-CH7-FT-Antiserum, 1:10 verdünnt 4) Hähnchen-Anti-CH7-FT-Antiserum, 1:10 verdünnt. Tabelle 10 Western Blotting von rohen FT-Präparaten aus verschiedenen Stämmen mit Antisera und Vergleich mit entsprechendem Flagellin-Molekular-Gewicht Flagellin Stamm Serotyp Antikörper1) 1) KO7577 = Kaninchenantiserum gerichtet gegen CH7-FT; BB1-2 = Hähnchenantiserum gerichtet gegen CH7-FT; αH10 = Agglutinierendes Antiserum für H10-Geissel-Typen, bezogen von RIVM (Bilthoven); Intl-7 = MoAb gerichtet gegen CH7-FT; Int12-13 = MoAb gerichtet gegen CHS-FT. 2) Die Daten stellen ungefähr scheinbares Molekulargewicht von einzelnen oder Hauptbanden in Blott in kD dar.3) A.M. Lawn (J. Gen. Microbiol. 101, 112-130; 1977). 4) Eigene Beobachtungen mit H10-Geisseln-Referenz-Stämmen.
Die Resultate von Western Blotting von rohen FT-Präparaten mit verschiedenen Antiseren sind in Tabelle 10 gezeigt. Kaninchen und Hähnchenantisera, gerichtet gegen CH7-FT (KO7577 bzw. Bb1-2) reagierten mit allen anderen untersuchten FT-Präparaten, obwohl das Molekulargewicht der Banden zwischen den Stämmen differierte. Identische Resultate wurden erhalten unter Verwendung eines Anti-H10-Geisseln agglutinierenden Antiserums. Auch MoAb Int12-13, gerichtet gegen CH5-FT, zeigte ein identisches Muster im Western Blotting. MoAb Int1-7, gerichtet gegen CH7-FT, reagierte nur mit der 47kD-Bande von CH7-FT. Erstaunlicherweise waren die Flagellin-Molekulargewichte, welche mit den H-Typen der verschiedenen Stämme übereinstimmten, fast identisch mit den scheinbaren Molekulargewichten der respektiven FTs. Eine Anzahl Stämme mit H10-Typ Geisseln, erhalten von RIVM (Bilthoven), zeigten Banden bei entweder 4skD oder 47kD im Western Blotting mit den polyklonalen Antisera. MoAb Int1-7 reagierte nur mit der 47kD-Bande der H10 Geisselnstämme. Die Intensität der Banden im Western Blotting wurde verstärkt, wenn Stämme vor der Herstellung von rohem FT durch U-Rohre geleitet wurden.
Im IG-EM wurden geisselartige Filamente an beiden CH5- und CH7-Bakterien mit Goldkügelchen markiert, unter Verwendung von polyklonalen Antisera, gerichtet gegen CH7-FT. Mit MoAb Intl-7, gerichtet gegen CH7-FT, wurden nur geisselartige Filamente auf CH7- und nicht auf CH5-Bakterien mit Goldkügelchen markiert. Mit MoAb Int12-13, gerichtet gegen CH5- FT, hergestellt wie in Beispiel 1B beschrieben unter Verwendung von präparativem SDS-PAGE, wurden geisselartige Filamente nicht merklich markiert; nur einige Goldkügelchen wurden auf CH5- und CH7-Bakterienoberflächen beobachtet. Tatsächlich reagierte MoAb Int12-13 nur mit dissoziertem FT (Western Blot, ELISA) und nicht mit intaktem FT (IG-EM, ELISA).
Alle diese Resultate weisen darauf hin, dass die toxische Aktivität für Vero in den Geisseln sitzt oder dass FT identisch ist mit Geisseln. Ferner sind die FTs von verschiedenen Stämmen serologisch hochgradig kreuzreaktionsfähig und auch kreuzneutralisierend.

Beispiel 4

Schutz von Brathähnchen durch massive Immunisierung

Antiserum wurde gegen CH7-FT gerichtet durch Impfung von Hähnchen mit CH7-FT, hergestellt wie in Beispiel 1A beschrieben. Antisera aus verschiedenen Hähnchen wurden gesammelt und bei 56ºC während 10 Minuten inaktiviert.
Drei Wochen alte Brathähnchen (Euribrid, Boxmeer, Holland) wurden intravenös mit 1 ml von diesem CH7-FT-Antiserum geimpft. Innerhalb einer Stunde nach der Antiseruminjektion wurden die Hähnchen durch Injektion von 0,2 ml Bakteriensuspension in den rechten hinteren Thorax-Luftsack infiziert. Die Bakterien wurden über Nacht auf Blutagar-Basisplatten (Oxoid) gezüchtet, in PBS suspendiert und auf die richtige Konzentration verdünnt. Die verwendeten E. coli- Stämme waren alle aus befallenen Herzen von Hähnchen mit Colibazillosis isoliert. Kontrollhähnchen, welchen kein Antiserum oder nur negatives Kontrollserum verabreicht worden war, wurden mit derselben Dosis an Bakterien infiziert. Nach der Herausforderung wurden die Hähnchen in Isolatoren unter vermindertem Druck mit Futter und Wasser nach Belieben gehalten. Die Mortalität wurde während 7 Tagen nach der Herausforderung registriert.
Wie in Tabelle 11 gezeigt, ergab die passive Immunisierung der Hähnchen mit CH7-FT-Antiserum einen merklichen Schutz gegen die Herausforderung mit 3 von 5 untersuchten E. coli- Stämmen. Von diesen drei Stämmen, gegen welche ein beträchtlicher Schutz zu sehen war, schieden zwei Stämme toxische Aktivität in der überstehenden Kulturflüssigkeit aus und ein Stamm wies toxische Aktivität für Verozellen nur in bakteriellem Lysat auf. Die zwei Stämme, gegen welche kein merklicher Schutz zu sehen war, wiesen beide nur toxische Aktivität in bakteriellem Lysat auf. Erstaunlicherweise wurde ein beträchtlicher Schutz nur gegen die Herausforderung mit motilen Stämmen erzielt. Tabelle 11 Schutz von Brathähnchen gegen E. coli-Infektion durch passive Immunisierung mit CH7-FT-Antiserum Infektion mit Stamm CH7-FT Antiserum verabreicht Mortalität3) (Anzahl vom.Total Serotyp Toxin1) Motil2) Dosis 1) Toxische Aktivität auf Verozellen von überstehender Kulturflüssigkeit (sup) oder von Bakterienlysat allein (lys). 2) Motilität von Stämmen in U-förmigen Rohren.3) Anzahl toter Hähnchen von der Totalzahl innerhalb sieben Tagen nach Herausforderung. 4) Chi-square-Test für bedeutenden Schutz durch Antiserum.

Claims

1. Impfstoff zum Schutz eines Individuums gegen eine Infektion mit Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, dass er aus Geisseln von E. coli abgeleitet ist.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Geisseln toxische Wirksamkeit gegen Verozellen besitzen.

3. Toxin mit immunisierender Wirksamkeit gegen E. Coli-infektionen bei Warmblütern, dadurch gekennzeichnet, dass es

a. aus einer einzigen Polypeptidkette besteht;

b. ein Molekulargewicht zwischen 30-100 kD, gemessen in SDS-PAGE besitzt;

c. assoziiert in und/oder mit faserförmigen Aggregaten gefunden werden kann;

d. von Natur aus keine gebundenen Kohlehydratreste besitzt;

e. für Verozellen und eintägige Küken toxisch ist; und

f. seine Toxizität beim Erhitzen während 1 Stunde auf 100ºC beibehält;

oder ein Fragment dieses Toxins.

4. Toxin nach Anspruch 3, erhältlich aus E. coli eines zum Serotyp H10 gehörigen Stammes durch

a. Züchten dieser Bakterien in Tryptikase-Soya-Bouillon;

b. Konzentrieren der zellfreien, überstehenden Flüssigkeit der derart erhaltenen Kultur auf einem Filter mit einem Durchlässigkeitswert von 30 kD;

c. Waschen des auf diesem Filter zurückgehaltenen Materials mit 20 mMol/l Tris-HCl-Puffer;

d. Trennen des gewaschenen Materials auf einer "Sepharose" 4B-Säule;

e. Sammeln der Fraktion mit hohem Molekulargewicht;

f. Unterziehen dieser Fraktion unter präparativer SDS- PAGE;

oder ein Fragment dieses Toxins.

5. Toxin nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 47 kD in SDE-PAGE und ein isoelektrisches pH von etwa 4,8 sowie die partielle aminoendständige Aminosäurensequenz Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn- Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln,

oder ein Fragment dieses Toxins.

6. Impfstoff für den Schutz eines Individuums gegen Infektion mit Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, dass er von einem Toxin nach den Ansprüchen 3-5 abgeleitet ist.

7. Impfstoff für den Schutz eines Individuums gegen Infektion mit Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet, dass er einen transformierten Mikroorganismus enthält, der fähig ist, eine DNA-Sequenz zu exprimieren, die ein Toxin nach den Ansprüchen 3-5 oder ein Fragment dieses Toxins kodiert.

8. Verfahren zur Reinigung eines Toxins nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine zellfreie Fraktion von E. coli, die mit gegen Toxin des Stammes CH7 gerichtete Antikörper reaktionsfähig ist, durch Entfernung von Komponenten mit niederem Molekulargewicht aus der überstehenden Flüssigkeit gereinigt wird, zum Beispiel unter Verwendung von Ultrafiltration, Zentrifugieren und/oder Molekularsiebchromatographie, wobei die toxinhaltige Fraktion ausgewählt wird auf Grund ihrer Reaktionsfähigkeit mit diesen Antikörpern.