DE68921533T2 - Verwendung einer Protease zur Extraktion von Antigenen aus Chlamydia, Gonokokken und Herpes. - Google Patents
Verwendung einer Protease zur Extraktion von Antigenen aus Chlamydia, Gonokokken und Herpes.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Protease bei der Bestimmung von Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum Extrahieren von nachweisbaren Antigenen aus diesen Organismen, die in biologischen Proben, die auch Vollblut oder Schleim enthalten, vorliegen.
- In den letzten Jahren sind Immunoassays zum Nachweis des Vorliegens von Infektionserkrankungen verwendet worden. Damit der Test brauchbar ist, muß er einen bestimmten Organismus mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit nachweisen. In den meisten Fällen ist dazu die Isolierung und die Reaktion von den Organismen eigenen Antigenen mit entsprechenden Antikörpern erforderlich. Damit der Test kommerziell erfolgreich ist, muß er auch relativ kostengünstig, einfach zu verwenden und schnell sein.
- Ein solcher Organismus, der mittels Immunoassay nachgewiesen werden kann, ist Chlamydia trachomatis (hier C. trachomatis), eine der beiden Mikroorganismusarten des Genus Chlamydiaceae, Ordnung Chlamydiales. Es gibt 15 oder mehr Stämme dieser Spezies, die die Ursache einer Reihe von Erkrankungen des Auges und der Genitalien beim Menschen verursachen, einschließlich Trachoma, Einschlußkonjunktivitis, Lymphogranul om venereum, nichtgonokokkale Urethritis und Proktitis. Infektionen durch C. trachomatis kommen in der gesamten Bevölkerung überall vor, so daß angenommen wird, daß jedes Jahr Millionen Fälle alleine von nichtgonokokkaler Urethritis auftreten.
- Trotz der zunehmenden Kontrolle von verschiedenen Viren durch Impfungen und verschiedene antivirale Mittel bleiben Infektionen durch Organismen wie dem Herpes simplex-Virus (HSV) ein ernsthaftes Problem. Es gibt zwei Typen von HSV, nämlich Typ 1, der hauptsächlich um den Mund herum auftritt, während Typ 2 in erster Linie um den Genitalbereich des menschlichen Körpers herum auftritt. Hautinfektionen und virale Encephalitis sind lediglich zwei der schwerwiegenden Folgen von HSV-Infektionen.
- Gonorrhoe ist eine Erkrankung, die üblicherweise durch sexuellen Kontakt übertragen wird und durch ein Bakterium des Neisseria-Genus, insbesondere N. gonorrhoeae, verursacht wird. Die Erkrankung hat die Menschheit seit Tausenden von Jahren geplagt, und obwohl Antibiotika geholfen haben, ihre Ausbreitung unter Kontrolle zu bringen, besteht sie in vielen Teilen der Welt noch in epidemischen Ausmaßen weiter. Die Bedeutung des Nachweises und der Behandlung dieses Organismusses wird durchaus erkannt. N. meningitidis und N. lactamica sind ebenfalls Spezies von beträchtlichem medizinischem und diagnostischem Interesse.
- Aufgrund der weit verbreiteten Natur dieser Erkrankungen besteht ein beträchtliches Interesse daran, einen schnellen, einfachen und zuverlässigen Test zum Nachweis von Chlamydien-, Gonokokken- und Herpesorganismen zu besitzen. Es sind beträchtliche Untersuchungen durchgeführt worden, um brauchbare Wege zum Extrahieren von nachweisbarem Antigen aus den Organismen zu finden.
- Die Extraktion von Antigen aus den Organismen in einer biologischen Probe ist entscheidend um einen genauen, raschen und empfindlichen Test bereitzustellen. Es sind viele verschiedene Techniken zum Extrahieren verwendet worden, einschließlich physikalischem Aufbrechen der Zellen durch Schallbehandlung, Erwärmen oder Zentrifugieren. Chemische Extraktionszusammensetzungen sind ebenfalls entwickelt worden. Beispielsweise ist in der EP-A-0 193 431 das Lipopolysaccharidantigen von C. trachomatis unter Verwendung eines Gemischs aus Phenol und Wasser extrahiert worden.
- Tests für C. trachomatis und N. gonorrhoeae, die unter Verwendung eines festen Trägers durchgeführt worden sind, sind in den US-Patenten 4,497,899 und 4,497,900 beschrieben. Die beschriebenen Tests werden durchgeführt, indem Antigen aus dem Organismus extrahiert wird, wobei eine Kombination aus einem anionischen oder nichtionischen Surfactant, Desoxycholat und Dithiothreitol verwendet wird und ein nackter fester Träger damit überzogen wird. Das als Beschichtung aufgetragene Antigen wird dann mit entweder einem oder zwei Antikörpern nachgewiesen, von denen einer geeignet markiert ist. Die Bindung des Antigens wird offenbar erreicht, indem der beschichtete Träger für einen längeren Zeitraum, der ausreicht, um eine Adsorption des Antigens darauf zu verursachen, inkubiert wird.
- Manchmal liegt Vollblut und Schleim in biologischen Proben vor und beeinträchtigt die Antigenextraktion. Darüber hinaus reduziert das Vorliegen von Blut oder Schleim oftmals die Empfindlichkeit des Tests, sogar dann, wenn die Extraktion von Antigen schnell und effizient ist. Die zuvor beschriebenen Extraktionstechniken überwinden die durch das Vorliegen von Blut oder Schleim in der Probe verursachten Probleme nicht wirksam.
- In der WO 89/00695 wird die Verwendung einer Protease (z. B. Proteinase K) bei der Extraktion von Lipopolysaccharid- Antigenen aus Chlamydienorganismen beschrieben. Eine ähnliche Lehre ist in der FR 2,339.622 für Tests für Gonokokkenorganismen zu finden.
- Es wäre wünschenswert, einen viel schnelleren Test für Chlamydien-, Gonokokken- und Herpesorganismen zu besitzen, der eine hohe Zuverlässigkeit aufweist und bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann. Es wäre ebenfalls wünschenswert, Antigen wirksam zu extrahieren und einen effizienten Test dafür bereitzustellen, selbst wenn Vollblut oder Schleim in der Probe vorliegen. Darüber hinaus wäre es wünschenswert, Testreagenzien zu besitzen, wie Proteasen, die über längere Zeit stabil sind und somit in Testkits für längere Zeit vor der Verwendung aufbewahrt werden können.
- Die zuvor angesprochenen Probleme werden mit einem Verfahren zum Extrahieren von Antigen aus Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen überwunden, umfassend:
- A. Bereitstellen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen enthält und
- B. Extrahieren von Chlamydien-, Gonokokken- oder respektive Herpesantigen, aus den Organismen,
- wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß vor oder nach dem Extraktionsschritt B die Probe mit einer Protease in Kontakt gebracht wird, die ein Analog eines Bacillus subtilisin mit einer Aminosäuresequenz, die eine Asn-Gly- Sequenz umfaßt, ist wobei einer oder beide Reste der Sequenz deletiert oder durch einen Rest einer anderen Aminosäure ersetzt sind.
- Ein Verfahren zur Bestimmung eines Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantigens umfaßt:
- A. Das Extrahieren von Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantigen aus einer Probe, von der angenommen wird, daß sie Chlamydien-, Gonokokken- oder respektive Herpesorganismen enthält, mit dem zuvor beschriebenen Verfahren,
- B. In-Kontakt-Bringen des extrahierten Antigens mit Antikörpern gegen das Antigen, um einen immunologischen Komplex zu bilden, und
- C. Bestimmen des Vorliegens des Komplexes als einem Nachweis für das Vorliegen von Chlamydien-, Gonokokken- oder respektive Herpesorganismen in der Probe.
- Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren lysiert Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen in einer biologischen Probe rasch und effektiv, wobei ausreichend Antigen für einen empfindlichen Test freigesetzt wird. Die vorliegende Erfindung ist daher eine Verbesserung, da sie ein Mittel bereitstellt, um das extrahierte Antigen in Gegenwart von Vollblut, Schleim oder Komponenten davon wirksam nachzuweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sowohl Lipopolysaccharid- als auch Hauptproteinantigene der äußeren Membran von C. trachomatis extrahiert, obwohl in erster Linie das Lipopolysaccharid von Interesse ist. Darüber hinaus weisen die erfindungsgemäß verwendeten Proteasen verbesserte Haltbarkeit auf. Sie sind daher nach einer Langzeitlagerung, z. B. in Testkits, wirksamer. Diese Vorteile werden durch die Verwendung einer spezifischen Klasse von Proteasen entweder vor oder nach dem Extrahieren des Antigens erreicht, wobei ein beliebiges Extraktionsverfahren verwendet wird. Die Protease zersetzt das Vollblut und den Schleim wirksam, so daß sie den Test nicht stören bzw. sich mit dem Test nicht überlagern. Diese Proteasen sind so stabil, daß sie über einen langen Lagerungszeitraum hinweg stabil sind. Einzelheiten über brauchbare Proteasen sind im folgenden angegeben.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Extraktionsverfahren und ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen in einer biologischen Probe, die aus einem Patienten unter Verwendung von medizinischen und mikrobiologischen Standardtechniken erhalten wurde. Solche Proben schließen beispielsweise Proben mit ein, die aus dem Cervix, der Urethra, der Haut. den Augen, dem Rachen oder dem Anus eines Patienten erhalten wurden, und Körperflüssigkeiten, wie Synovialflüssigkeit oder Flüssigkeit aus Läsionen. Von den so erhaltenen biologischen Proben wird angenommen, daß sie Bakterien- oder Virenorganismen enthalten, die die zu bestimmenden Antigene aufweisen.
- Obwohl einige Tests des Stands der Technik so durchgeführt werden, daß Antigene aus intakten Bakterien- oder Virenorganismen nachgewiesen werden, ist es üblicherweise erwünscht, die Antigene aus den Organismen zu extrahieren, um die Empfindlichkeit des Tests zu erhöhen. Es können Standardtechniken zum Lysieren des Organismusses verwendet werden, um Antigen freizusetzen, einschließlich beispielsweise Verdünnung des Solvens oder Lysierungslösungen mit hohem pH, Enzymbehandlung und physikalische Behandlung, wie Schallbehandlung oder Zentrifugieren. Erwärmen als eine Lysetechnik wird in der EP-A-0 183 383 beschrieben. Die Verwendung von anionischen Detergentien oder Gallensalze wie Natriumdodecylsulfat und Desoxycholat ist in den US-Patenten 4,497,899, 4 497 900 und 4,663,291 beschrieben.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäß nachgewiesene Antigen das Lipopolysaccharid (Antigen der Glycolipidgruppe) von Chlamydienorganismen. wie beispielsweise in der FP-A-0 193 431 beschrieben ist. Zusätzlich kann auch das Hauptprotein der äußeren Membran des Organismusses extrahiert werden, das erfindungsgemäß in erster Linie interessierende Antigen ist jedoch das Lipopolysaccharid, da die Protease dazu neigt, das Hauptprotein der äußeren Membran abzubauen. Dieses Protein ist im US-Patent 4,427,782 beschrieben.
- In anderen Ausführungsformen werden verschiedene Gonokokkenorganismen, wie N. gonorrhoeae, bestimmt, indem das Vorliegen von extrahierten Hauptproteinantigenen der äußeren Membran, wie Protein 1A und 1B, von dem Organismus. Es kann ein einzelner Stamm nachgewiesen werden, oder vorzugsweise ein Gemisch von Stämmen nachgewiesen werden.
- Noch andere Ausführungsformen dienen dem Nachweis von HSV-Stämmen, und zwar entweder HSV-1 oder HSV-2 alleine oder beide zusammen. Glycoproteine der Virionen werden erfindungsgemäß extrahiert und nachgewiesen. Zusätzlich können viral infizierte Zellen lysiert und solubilisiert werden, um intrazelluläre virale oder membrangebundene virale Antigene freizusetzen.
- Vor oder nach der Antigenextraktion wird die Probe mit einer oder mehreren Proteasen in Kontakt gebracht. Proteasen sind eine Gruppe von Enzymen, die die Peptidbindungen von Proteinen hydrolysieren und kleinere Peptide bilden.
- Bevorzugte Proteasen zur erfindungsgemäßen Verwendung sind in der WO 87/04461 beschrieben. Diese Proteasen sind Analoge einer Bacillus subtilis-Protease mit einer Aminosäuresequenz, die eine oder mehrere Asn-Gly-Sequenzen umfaßt, wobei eine oder beide Aminosäurereste der Sequenz deletiert sind oder durch einen Rest einer anderen Aminosäure ersetzt sind, beispielsweise Serin oder Asparaginsäure. Es ist insbesondere erwünscht, daß die Asparaginreste in den Positionen 109 und 218 durch Serinreste ersetzt werden. Diese Proteasen sind so stabil, daß sie langfristig haltbar sind,
- Eine am meisten bevorzugte Protease weist die zuvor angegebenen Eigenschaften auf, weist jedoch zusätzlich einen oder mehrere Aminosäurereste an Calciumbindungsstellen auf, die in der Aminosäuresequenz vorliegen, die durch eine negativ geladene Aminosäure ersetzt ist. Beispielsweise kann der Aminosäurerest von Asparagin in Position 76 der Sequenz durch Asparaginsäure ersetzt werden, was für eine verbesserte Lagerungsstabilität bzw. Haltbarkeit von großem Vorteil ist. Die Verfahren zum Herstellen derartiger Proteasen sind die allgemein aus dem Stand der Technik bekannten und die in der WO 87/04461 beschriebenen.
- Eine besonders bevorzugte Protease, die in dieser Erfindung brauchbar ist, ist als Amideck von der BioProducts Division der Eastman Kodak Company erhältlich.
- Die allgemeine Vorgehensweise zur Herstellung der hier brauchbaren bevorzugten Proteasen umfaßt:
- 1) die Isolierung des repräsentativen Subtilisingens aprA aus B. subtilis,
- 2) Klonieren des aprA-Gens in einem Vektor, der den Einsatz einer gerichteten Mutagenese mittels eines Oligonukleotids erlaubt, um gewünschte Modifikationen zu bilden,
- 3) gerichtete Mutagenese und Sequenzieren der erhaltenen DNA, um das Vorliegen der gewünschten Mutation zu bestätigen,
- 4) Konstruktion eines Expressionsvektors, um die Synthese des mutierten Enzyms in B. subtilis zu lenken,
- 5) Konstruktion von mutierten B. subtilis-Strängen, die kein Subtilisin und keine neutrale Protease synthetisieren,
- 6) Isolieren des Enzyms in dem extrazellulären Wachstumsmedium und seine Reinigung und
- 7) Durchführen von Verfahren zur Insertion des Gens, das das verbesserte Enzym kodiert, in das Chromosom eines vorher mutierten B. subtilis-Stamms, um die Synthese von endogenen Proteasen zu blockieren.
- Ein spezielles Herstellungsverfahren ist im folgenden unmittelbar vor dem Beispiel angegeben.
- Die Proteasemenge, die bei der Durchführung der Erfindung verwendbar ist, hängt von der speziell verwendeten Protease, ihrer Quelle, ihrer Aktivität und der Menge an Vollblut oder Schleim in der Testprobe, die abzubauen ist, und von anderen Faktoren ab, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Generell kann die Mindestmenge durch das Verfahren bestimmt werden, das von Delmar et al., Anal. Biochem. 99, S. 316 - 320 (1979) , beschrieben ist. Für die zuvor als Amideck -Protease bezeichnete bevorzugte Protease beträgt die brauchbare Mindestmenge 10 Units/mg, wobei 100 bis 1000 Units/mg bevorzugt sind.
- Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren umfaßt zwei getrennte Schritte:
- (1) Verwenden einer Protease, die im allgemeinen auf einen pH von 7 bis 10 gepuffert ist, und
- (2) Verwenden einer hier beschriebenen Extraktionszusammensetzung mit hohem pH, die im allgemeinen einen pH von 8 bis 13.5 aufweist.
- Die Protease muß aus einem Milieu mit einem hohen pH (d. h. höher als 10) herausgehalten werden, oder sie wird inaktiviert. Daher ist die bevorzugte Reihenfolge der zuvor angegebenen Schritte die, daß die Protease zuerst verwendet wird. Die Schritte können jedoch umgekehrt werden, wenn der ph der Extraktionszusammensetzung mit hohem pH derart gesenkt wird, daß die Protease nicht deaktiviert wird. Einige Antigene, beispielsweise das chlamydiale Hauptprotein der äußeren Membran, können durch die Protease nachteilig beeinflußt werden. Ein Fachmann muß daher die Verwendung einer Protease in dem erfindungsgemäßen Verfahren je nach dem interessierenden Antigen gegebenenfalls anpassen.
- Die Extraktion kann in jedem beliebigen Gefäß durchgeführt werden. Einige Extraktionsvorrichtungen sind speziell für einen solchen Zweck gestaltet worden, und ein Fachmann weiß, wie sie zu benutzen sind. In dem US-Patent 4,746,614 sind bestimmte verwendbare Extraktionsvorrichtungen beschrieben.
- Wenn das Antigen aus dem Organismus herausextrahiert ist, ist es erwünscht, wenn auch nicht wesentlich, daß die Probe vorfiltriert wird, um Zelltrümmer, teilchenförmiges Material und andere unerwünschte Materialien vor der weiteren Handhabung zu entfernen. Das Vorfiltrieren kann in jedem beliebigen Gefäß oder Vorrichtung nach bekannten Verfahren durchgeführt werden.
- Extrahiertes Antigen kann einem beliebigen Analyseverfahren unterzogen werden, um sein Vorliegen zu bestimmen. Derartige Verfahren umfassen Kulturtechniken, sogenannte Counterimmunelektrophorese und serologische Tests, die, obwohl sie nicht bevorzugt sind, in bestimmten Fällen die einzige Wahl sein können.
- Vorzugsweise wird das extrahierte Antigen nachgewiesen, indem ein Immunoassay verwendet wird, in dem man es mit einem oder mehreren Antikörpern immunologisch reagieren läßt. Der erhaltene immunologische Komplex wird unter Verwendung eines geeigneten radiometrischen, colorimetrischen fluorometrischen oder enzymmarkierten Reagenzes nachgewiesen. In einigen Fällen ist das Reagenz ein auf das Antigen gerichteter markierter Antikörper, und in anderen Fällen ist der markierte Antikörper auf einen unmarkierten Antikörper gerichtet. der mit dem Antigen reagieren kann. Solche Immunoassays umfassen im allgemeinen die Bildung eines nachweisbaren immunologischen Komplexes auf einem festen Träger eines geeigneten Typs, entweder beschichtet oder unbeschichtet, worauf geeignete Nachweisverfahren folgen. Andere Tests umfassen die Agglutination des immunologischen Komplexes, wenn mindestens ein Reaktant (beispielsweise ein Antikörper) des Komplexes an geeignete markierte oder unmarkierte Partikel gebunden ist, die sich während der Komplexbildung zusammenballen.
- Beispiele von verwendbaren Tests umfassen kompetitive Immunoassays oder sogenannte ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assavs). Derartige Tests sind allgemein im US- Patent 4,427,782 und von Schmeer et al in J. Clin. Microbiol., 15(5). S. 830 - 834 (1982), beschrieben. Die verwendeten Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantikörper können gegen ein oder mehrere Antigene, die aus den Organismen extrahiert werden, gerichtet sein. In einer Ausführungsform sind Antikörper gegen ein einzelnes Antigen gerichtet, wie das Lipopolysaccharid von C. trachomatis. In anderen Ausführungsformen ist ein Gemisch aus verschiedenen Antikörpern gegen verschiedene Antigene gerichtet, wie die aus verschiedenen Gonokokkenstämmen extrahierten.
- Ein ähnlicher Festphasenimmunoassay wird in den US-Patenten 4,497,899 und 4,497,900 beschrieben, in denen extrahiertes Antigen an einen unbeschichteten Träger mittels Inkubation bei erhöhten Temperaturen für einen längeren Zeitraum adsorbiert wird.
- Ein bevorzugter Immunoassay wird durchgeführt, indem extrahiertes Antigen mit einem polymeren festen Träger in Kontakt gebracht wird, der eine Vielzahl positiv geladener Gruppen auf seiner Oberfläche aufweist. Dieser Träger kann aus jedem beliebigen natürlichen oder synthetischen polymeren Material aufgebaut sein, auf dem sich geeignete kationische Gruppen befinden, die an das extrahierte Antigen ionisch binden. Brauchbare Polymere umfassen Polyester, Polyamide, Polycarbonate, Polyethylenimine, Cellulosematerialien, Additionspolymere, die aus ethylenisch ungesättigten Vinylmonomeren hergestellt sind, und andere aus dem Stand der Technik bekannte, die die erforderlichen geladenen Gruppen aufweisen. Üblicherweise sind die kationischen Gruppen quaternäre Ammoniumsalze, quaternäre Phosphoniumsalze, quaternäre Sulfoniumsalze, quaternäre Pyridiniumsalze, quaternäre Pyrimidiniumsalze oder quaternäre Imidazoliumsalze, wobei quaternäre Ammoniumsalze bevorzugt sind.
- Der polymere Träger kann in jeder geeigneten Form gebildet sein, beispielsweise als Beads, Filme, Gele oder Membranen. Der Träger kann mit Surfactantien beschichtet sein, die die Testleistung verbessern können. Eine mikroporöse Membran ist bevorzugt, wie im folgenden beschrieben wird.
- Der hier beschriebene Träger kann in Kombination mit einer anderen Ausstattung (Flaschen, Teströhrchen, Tupfer, Bechergläser oder Tiegel) verwendet werden, um den Test durchzuführen. Alternativ und bevorzugt ist der Träger eine mikroporöse Membran, die in eine Einweg-Testvorrichtung eingepaßt ist, in der der Test durchgeführt werden kann und das sämtliche Flüssigkeiten aufnehmen kann. Brauchbare Anordnungen von Testvorrichtungen sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen die US-Patente 3,825,410, 3,888,629, 3,970,429 und 4,446,232, Besonders brauchbare Vorrichtungen sind in der EP-A-0 280 558 und in der EP-A-0 308 231 beschrieben.
- Bei den bevorzugten Ausführungsformen, bei denen ein mit einem Surfactant beschichteter oder ionisch geladener Träger verwendet wird, wird das Antigen nahezu unmittelbar bei Kontakt des Antigens mit dem Träger direkt und bevorzugt an den Träger gebunden. "Direkt" bedeutet. daß das Antigen nicht durch eine biologische Linker-Verbindung (wie beispielsweise einen Antikörper), die an den Träger gebunden ist, gebunden wird. "Bevorzugt" bedeutet. daß im wesentlichen lediglich das Antigen an den Träger gebunden wird und nicht andere Materialien in dem Reaktionsmedium.
- Daher wird innerhalb von 10 Minuten und vorzugsweise innerhalb von 1 bis 5 Minuten des Kontakts gebundenes Antigen mit entweder Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantikörper (je nach dem Antigen) in Kontakt gebracht, um so einen an den Träger gebundenen immunologischen Komplex zu bilden. Wenn der Test unter Verwendung einer Einweg-Testvorrichtung durchgeführt wird, kann der Träger eine mikroporöse Membran sein, durch die Flüssigkeit und ungebundene Materialien in der Probe gefiltert werden, wenn das Antigen an die Membran gebunden wird.
- Der chlamydiale, gonokokkale oder Herpesantikörper, der in diesem Test verwendet wird, betrifft einen Antikörper, der mit den Antigenen. die zum Nachweis in dem Test extrahiert werden, spezifisch immunologisch reagiert. Er kann polyklonal oder monoklonal sein, er kann gekauft oder mittels bekannter Verfahren hergestellt sein.
- In einer Ausführungsform ist der Antikörper für das Antigen zum Nachweis markiert. Brauchbare Marker sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen chemische oder biologische Verbindungen, die bei Verwendung geeigneter Verfahren und Geräte direkt nachweisbar sind, sowie Verbindungen, die durch weitere chemische oder spezifisch bindende Reaktionen, bei denen nachweisbare Spezies gebildet werden, nachgewiesen werden können. Beispiele für brauchbare Marker umfassen Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, phosphoreszierende Verbindungen, Biotin oder seine Derivate. Avidin oder seine Derivate, Ferritin, magnetisierbare Partikel, gefärbte Partikel und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Radioisotope oder Enzyme sind bevorzugte Marker. Die Marker können unter Verwendung bekannter Techniken an Antikörper gebunden werden. Ist der Marker nicht direkt nachweisbar, sind weitere Reagenzien oder Verbindungen notwendig, um die Reaktion oder das spezifisch bindende Produkt nachweisbar zu machen. Wenn der Marker beispielsweise Biotin ist, kann er mit Avidin umgesetzt werden, das mit einem Enzym konjugiert ist, um eine nachweisbare Spezies zu bilden. Ist der Marker ein Enzym, wie Glucoseoxidase, Urease, Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, sind ebenfalls Substrate und farbstoffbildende Reagenzien notwendig.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Marker Peroxidase, und an einem gewissen Punkt des Tests werden Wasserstoffperoxid und geeignete farbstoffbildende Reagenzien zugegeben, um einen nachweisbaren Farbstoff zu bilden. Brauchbare farbstoffbildende Reagenzien umfassen beispielsweise Tetramethylbenzidin und Derivate davon und Leukofarbstoffe, wie Triarylimidazol-Leukofarbstoffe (wie in dem US-Patent 4,089,747 beschrieben ist) oder andere Verbindungen, die in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid unter Bildung eines Farbstoffs reagieren (d. h. Verbindungen, die aufgrund der katalytischen Wirkung von Peroxidase unter Bildung eines Farbstoffs reagieren).
- In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der chlamydiale, gonokokkale oder Herpesantikörper nicht markiert, und der Nachweis des gebildeten und an den Träger gebundenen Antikörper-Antigen-Komplexes wird erreicht, indem ein zweiter Antikörper (im folgenden beschrieben) verwendet wird, der geeignet markiert und für den unmarkierten Antikörper spezifisch ist.
- Der chlamydiale, gonokokkale oder Herpesantikörper kann mit dem trägergebundenen Antigen in Gegenwart von einem oder mehreren Proteinen, die nichtspezifische Wechselwirkungen auf dem Träger reduzieren. in Kontakt gebracht werden. Verwendbare Proteine sind allgemein bekannt und umfassen beispielsweise Casein, α-Casein, fetales Rinderserum und Schweine-Gammaglobulin.
- Um die Bildung des an den Träger gebundenen immunologischen Komplexes zu beschleunigen, werden der Antikörper und das Antigen üblicherweise bei einer Temperatur von 15 bis 30 ºC bis zu 10 Minuten lang inkubiert. Vorzugsweise findet die Inkubation bei Raumtemperatur (von 18 bis 25 ºC) bis zu 5 Minuten lang statt.
- Nach der Inkubation und innerhalb von 10 Minuten nach dem Antikörper-Antigen-Kontakt wird der gebundene Komplex einmal oder mehrmals mit einer gepufferten Waschlösung gewaschen, die üblicherweise einen pH von 7 bis 11 aufweist. Die Lösung enthält vorzugsweise ein oder mehrere Surfactantien, um das Abtrennen von nicht komplexierten Materialien aus dem Komplex auf dem Träger zu unterstützen.
- In der zuvor beschriebenen Ausführungsform, in der der chlamydiale, gonokokkale oder Herpesantikörper markiert ist, soll das Testverfahren nach dem Waschen den Marker direkt oder indirekt nach Zugabe geeigneter Reagenzien nachweisen. Dies geschieht relativ rasch nach dem Waschen des gebundenen Komplexes. Falls gewünscht, kann der Markernachweis durch Inkubieren beschleunigt werden, falls die Reagenzien dies zulassen. Der Marker wird dann unter Verwendung von Standardgeräten und -verfahren nachgewiesen.
- In der bevorzugten Ausführungsform ist der erste Antikörper nicht markiert, und nach dem Waschen des gebundenen Komplexes wird er mit einem markierten Antikörper in Kontakt gebracht, der gegen den nichtmarkierten Antikörper gerichtet ist. Dieser zweite Antikörper (d. h. ein Anti-Antikörper) ist mit einem beliebigen der zuvor beschriebenen Marker geeignet markiert. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und entweder käuflich erworben oder mittels bekannter Techniken hergestellt sein.
- Nach diesem Kontakt wird der erhaltene Antigen-Antikörper- Antikörper-Komplex, der an den Träger gebunden ist, bis zu 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 15 bis 30 ºC, und vorzugsweise bis zu 5 Minuten bei Raumtemperatur, inkubiert.
- Um nicht komplexierte Materialien zu entfernen, wird nochmals gewaschen, und geeignete Enzymsubstrate oder andere notwendige Reagenzien werden zugegeben, um eine nachweisbare Spezies zu bilden. Der gebundene Antigen-Antikörper-markierter-Antikörper-Komplex.wird dann auf dem Träger nachgewiesen, wobei radiometrische, colorimetrische, Fluoreszenzoder andere Standardnachweistechniken verwendet werden.
- Das folgende Beispiel soll die vorliegende Erfindung veranschaulichen, ihren Umfang jedoch nicht einschränken. Die in Beispiel 1 verwendeten Materialien werden wie folgt beschrieben.
- Serovar H-Antigen-gereinigte Elementarkörperchen wurden von Professor W. J. Newhall der Indiana University erhalten. Antigenvorratslösung (5 ul, enthält 3240 ng Antigen/ul) wurden zu einer Lösung (50 ul) von Rinderserum-Albumin in phosphatgepufferter Salzlösung (0,1 mg/ul) zugegeben und bei -80 ºC aufbewahrt, wobei man Lösung A erhielt. Diese Lösung wurde aufgetaut und mittels Verwirbeln und Schallbehandlung gemischt und anschließend mit 15 ul der Rinderserum- Albumin-Lösung (945 ul) durch Verwirbeln gemischt, wobei Lösung B erhalten wurde, und wobei die Antigenkonzentration 4,6 x 10&sup5; pg/100 ul betrug. Lösung B (100 ul) wurde dann mit Rinderserum-Albumin in Phosphatpufferlösung (900 ul) gemischt, wobei Lösung C mit einer Antigenkonzentration von 4,6 x 10&sup4; pg/100 ul erhalten wurde.
- Der monoklonale Mausantikörper gegen das chlamydiale Lipopolysaccharid (LPS)-Antigen wurde hergestellt, wobei eine Standard-Hybridomtechnologie und eine Mauszellinie verwendet wurden, und wurde in einer Lösung von phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4), die 0,01 Gewichts-% Natriumazid als ein Konservierungsmittel enthielt, aufbewahrt, Es wurde eine Antikörperlösung hergestellt, indem eine Probe (19 ul) der Antikörperlösung zu einer phosphatgepufferten Salzlösung (Verdünnung 1 : 800) zugegeben wurde, die Casein (0,5 Gewichts-%) als ein Blockierungsprotein und Lonzaine C als amphoteres Surfactant (0,01 Gewichts-%, erhältlich von Lonza Company) enthielt, und wurde dann durch einen 0,22 um Filter abfiltriert, wobei man eine Arbeitslösung erhielt.
- Der monoklonale Mausantikörper gegen das chlamydiale Hauptproteinantigen der äußeren Membran (MONP-Antigen) wurde unter Verwendung von Hybridoma-Standardtechnologie und einer Mauszellinie hergestellt und in einer Lösung von phosphatgepufferter Salzlösung (ph 7,4), die 0,01 Gewichts-% Natriumazid enthielt, aufbewahrt. Es wurde eine Antikörperlösung hergestellt, indem eine Probe (14 ul) der Antikörperlösung zu einer phosphatgepufferten Salzlösung (Verdünnung 1 : 1100) zugegeben wurde, die Casein (0,5 Gewichts-%) als ein Blockierungsprotein und Lonzaine C als amphoteres Surfactant (0,01 Gewichts-%) enthielt, dann durch einen 0,22 um Filter abfiltriert, wobei man eine Arbeitslösung erhielt.
- Der verwendete markierte polyklonale Antikörper war ein Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, Das Konjugat wurde auf 1 : 2000 in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt, die Casein (0,5 Gewichts-%) und Lonzaine C als amphoteres Surfactant (0,01 Gewichts-%) enthielt, dann durch einen 0,22 um Filter abfiltriert wobei man eine Arbeitslösung erhielt.
- Die Amideckr -Protease (Bioproducts Division, Eastman Kodak Company) war ein Subtilisin-Analog mit Asparaginsäure in Position 76 und Serin sowohl in Position 109 als auch 218.
- Einzelsträngige DNA aus dem Bakteriophagen M13mp18 apr4 [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] (aus dem M13mp18-Bakteriophagen, der von Bethesda Research Laboratories erhältlich ist) wurde ein Primer anhybridisiert:
- wobei G, C, T, A die Standartsymbole für die Nukleotidbasen sind und Ala, Leu, Asp, Asn, Ser und Ile die Standartabkürzungen für Aminosäuren sind. Dieser Primer wurde durch das Phosphitverfahren synthetisiert, das von Beaucage et al, Tetrahedron Letters 22, S. 1859 - 1862 (1981), beschrieben wurde. Er war homolog zu den Nukleotiden, die Codons für die Aminosäuren 74 bis 79 von aprA-Subtilisin umfaßten, mit Ausnahme einer Basenänderung (durch das Sternchen gekennzeichnet), wobei Adenin durch Guanin ersetzt war, um den Übergang zu ermöglichen, der Asn&sup7;&sup6; (Codon AAT) in Asp&sup7;&sup6; (Codon GAT) ändert.
- Der Primer wurde an M13mp18apr4 [Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;]-DNA bei 65 ºC anhybridisiert, und die hybridisierte DNA wurde langsam auf etwa 22 ºC abgekühlt und dann zwei Stunden lang bei 15 ºC in einem Reaktionsgemisch polymerisiert, das aus 12,5 ul hybridisierter DNA-Lösung, 20 ul von jeweils 10 mmolarem dATP, dCTP und dGTP, 20 ul von 12 mmolarem ATP, 0,1 ul Klenow-DNA-Polymerase, 0,1 ul T4-DNA-Ligase und 13 ul sterilem destilliertem Wasser bestand. Die erhaltene doppelsträngige, kovalent geschlossene circuläre DNA wurde mittels Transfektion in E. coli JM103 eingeschleust.
- Bakteriophagenplaques wurden auf Hybridisierungsmembranen (wie beispielsweise Gene Screen ) übertragen, und diejenigen, die DNA mit der gewünschten Basenänderung enthielten, wurden durch Hybridisierung mit einem radioaktiv markierten (Gamma³²P) synthetischen Oligonukleotid bei 46 ºC identifiziert. Eine positive Plaque enthielt einen Bakteriophagen, der als M13mp18apr4 [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;] bezeichnet wird. Doppelsträngige DNA aus dem Bakteriophagen wurde mit HindIII und KpnI in Kombination gespalten, dann wurde ein 750 bp Fragment, das die drei Mutationen des aprA-Subtilisingens trug, mit dem Plasmid pAMB106 ligiert, das zuvor mit HindIII und KpnI gespalten worden war. Das erhaltene Plasmid, pAMB131, wurde in B. subtilis-Wirtszellen für die Synthese und Sekretion von [Asp&sup7;&sup6;, Ser¹&sup0;&sup9;, Ser²¹&sup8;)-Subtilisin (d. h. Protease) eingeschleust.
- Die Aktivität dieser Protease wurde bestimmt, wobei das synthetische Peptid:
- Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-Nitroanilid als ein Substrat verwendet wurde, während die Geschwindigkeit der Zunahme der Absorption bei 410 nm aufgrund der Freisetzung von p-Nitroanilin aufgezeichnet wurde. Ein typisches Reaktionsgemisch (1 ml) enthielt Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid-Puffer (0,5 molar, pH 8) Calciumchlorid (1 mmolar), das zuvor angegebene Peptid (1 mmolar), und die Proteaseaktivität wurde kontinuierlich bei 25 ºC gemessen. Die spezifische Aktivität wird in Units/mg Feststoff angegeben, wobei eine Einheit zu einer Absorptionsänderung von 1.0, gemessen bei 410 nm in 1 Minute, äquivalent ist.
- Aus den folgenden Komponenten wurde eine Antigenextraktionslösung hergestellt: Natriumazid (0,027 molar), Natriumchlorid (0,27 molar) , Ethanolamin-Hydrochlorid (0,47 molar) Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (0,045 molar), kationisches Surfactant Emcol CC-36 (0,45 Gewichts-%, zugegeben aus einer 10 %-igen Lösung in Methanol) und Natriumhydroxid (0,66 molar, pH 11,0). Das kationische Surfactant Emcol CC-36 ist ein Gemisch aus quaternären Ammoniumchloriden von Polypropoxy-t-aminen.
- Die Einweg-Testvorrichtungen enthielten eine mikroporöse 5 um Membran, die auf ihrer Oberfläche quaternäre Ammoniumgruppen aufweist, und die als Biodyne -B-Membran erhältlich ist. Vor der Verwendung wurde die Membran mit Fluorad FC 135 behandelt. Jede Vertiefung wurde dann mit phosphatgepufferter Salzlösung (200 ul), die kationisches Surfactant Emcol CC-9 (0,75 Gewichts-%) enthielt, gewaschen.
- Dieses Beispiel veranschaulicht die Durchführung der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung des Lipopolysaccharidantigens von Chlamydienorganismen unter Verwendung der Amideck -Protease, die zuvor beschrieben wurde, die eine signifikant verbesserte Haltbarkeit aufweist.
- Achtzehn Proben wurden aus weiblichen Patienten erhalten, wobei endocervikale Tupfer verwendet wurden. Die Proben enthielten beträchtliche Mengen Vollblut oder Schleim oder beides und waren mittels Standardkulturtechniken auf das Vorliegen von C. trachomatis geprüft worden.
- Es wurde eine Extraktionsvorrichtung wie die in dem US- Patent 4,746,614 beschriebene hergestellt, die getrennte getrocknete Beschichtungen aufwies aus: (1) Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (aus 20 ul einer 1,65 molaren Lösung, pH 11,1) mit Thimerosal als Konservierungsmittel (0,01 Gewichts-%) und (2) Dithiothreitol (0,188 molar) aus einer 50 ul Lösung, die 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure- Puffer (10 mmolar), Natriumazid (1,54 mmolar), Ethylendiamintetraessigsäure (5,4 mmolar), Dimedon (21,4 mmolar) und Poly(acrylamid) (6,35 Gewichts-%).
- Es wurde eine Proteaselösung mit Amideck -Protease (4 mg/ml, 170 Units/mg), 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure-Puffer (10 mmolar, pH 6), Natriumchlorid (50 mmolar), Calciumchlorid (5 mmolar), 1,2-Propandiol (10 % Gew./Vol.) und Thimerosal als Konservierungsmittel (0,01 Gewichts-%) hergestellt.
- Eine Wasserstoffperoxidlösung wurde hergestellt, die 12 % (bezogen auf das Gewicht) Wasserstoffperoxid, Diethylentriaminpentaessigsäure (10 umolar) und Thimerosal als Konservierungsmittel (0,01 Gewichts-%) enthielt.
- Die Waschlösung enthielt 3-Cyclohexylamino-2-hydroxy-1- propansulfonsäurepuffer (pH 10,0, 0,05 molar), kationisches Surfactant Emcol CC-9 (0,75 Gewichts-%) und Konservierungsmittel (0,01 Gewichts-%).
- Eine Kontrollreagenzlösung umfaßte anti-Creatinkinase-MB- Antikörper (5 ug/ml), Casein (0,5 Gewichts-%), amphoteres Surfactant Lonzaine C (0,01 Gewichts-%), Konservierungsmittel (0,01 Gewichts-%) in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2).
- Monoklonale Antikörper gegen das Lipopolysaccharidantigen (4 ug/ml) wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2) bereitgestellt, die auch Casein, amphoteres Surfactant Lonzaine C und Konservierungsmittel enthielt, wie zuvor angegeben wurde.
- Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper, die mit Meerrettichperoxidase (Verdünnung 1 : 700) konjugiert waren, wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2) mit Casein, amphoterem Surfactant LonzaineR und Konservierungsmittel, wie zuvor beschrieben, sowie 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar) bereitgestellt.
- Eine Leukofarbstofflösung enthielt 2-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol (0,008 Gewichts-%), Poly(Vinylpyrrolidon) (1 Gewichts-%), Natriumphosphatpuffer (ph 6,8, 10 mmolar), Diethylentriaminpentaessigsäure (10 pmolar), 4'-Hydroxyacetanilid (2 mmolar) und Wasserstoffperoxid (10 mmolar).
- Der Test wurde wie folgt für jede der erhaltenen achtzehn Proben durchgeführt, wobei für jede Probe eine separate Testvorrichtung verwendet wurde. Die Proteaselösung (etwa 280 ul) wurde zu der Extraktionsvorrichtung zugegeben, und ein Patiententupfer wurde dann in diese hineingegeben, 5 - 10 Sekunden lang rotiert und anschließend 3 Minuten bei Raumtemperatur (d. h. 18 - 22 ºC) inkubiert.
- Die Extraktionslösung (etwa 280 ul) wurde dann zu der Vorrichtung, die den Tupfer enthielt, zugegeben, der dann für weitere 5 - 10 Sekunden rotiert und anschließend bei Raumtemperatur 3 Minuten lang inkubiert wurde.
- Die Wasserstoffperoxidlösung wurde zu der Vorrichtung zugegeben, und dasselbe Verfahren wurde wiederholt.
- Die erhaltene Lösung in der Extraktionsvorrichtung wurde dann aus der Vorrichtung mittels einer Pipette entfernt, vorgefiltert und in jede Vertiefung einer Einweg-Testvorrichtung wie der zuvor beschriebenen übertragen, wobei etwa 160 ul zu jeder Vertiefung zugegeben wurden. Eine Vertiefung (#1) einer jeden Testvorrichtung wurde als Vertiefung für die Kontrolle verwendet, während zwei andere (#2 und #3) als Testvertiefungen verwendet wurden. Die Belüftung in der Vorrichtung wurde geöffnet, um das Ablaufen sämtlicher Flüssigkeiten zu ermöglichen. Dann wurde jede Vertiefung mit der zuvor beschriebenen Waschlösung (160 ul) gewaschen und ablaufen gelassen.
- Die Antikörperkontrollösung (etwa 80 ul) wurde zu Vertiefung #1 zugegeben, während die anti-Lipopolysaccharidantikörperlösung (etwa 80 ul) zu jeder der Vertiefungen #2 und #3 ohne Ablaufen zugegeben wurde. Die Inkubation bei Raumtemperatur wurde 2 Minuten lang durchgeführt.
- Nach dem Ablaufenlassen wurde der Waschschritt wiederholt und die peroxidasemarkierte Antikörperlösung (etwa 80 ul) wurde zu sämtlichen Vertiefungen ohne Ablaufenlassen zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert.
- Die Leukofarbstoffzusammensetzung wurde anschließend an das Ablaufenlassen und einen weiteren Waschschritt zu jeder Vertiefung ohne Ablaufenlassen zugegeben. Nach 5-minütiger Inkubat ion bei Raumtemperatur wurde die Farbstoffbildung durch Zugabe von 0,01 %-iger Natriumazidlösung (etwa 120 ul) zu jeder Vertiefung gestoppt. Der auf der Membran einer jeden Vertiefung gebildete Farbstoff wurde visuell bestimmt und eingestuft (0 bis 10, wobei 0 keine Farbe bedeutet). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben und vergleichen die Testergebnisse mit denjenigen, die mittels Standardkulturtechniken gefunden wurden. Es ist ersichtlich, daß der Test äußerst genau war, sämtliche negativen Proben nachwies und 83 % der positiven Proben nachwies. TABELLE Kultur Visuelle Ablesungen Probe Ergebnisse Kontrolle Vertiefung Test Positiv Negativ * Kein Test d. h., das Testverfahren wurde nicht korrekt durchgeführt
Claims (13)
1. Verfahren zum Extrahieren von Antigen aus
Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen, umfassend:
A. Bereitstellen einer Probe, von der angenommen wird, daß
sie Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen enthält,
und
B. Extrahieren von Chlamydien-, Gonokokken- oder
Herpesantigen aus den Organismen,
wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß vor oder
nach dem Schritt B die Probe mit einer Protease in Kontakt
gebracht wird, die ein Analog eines Bacillus subtilisin mit
einer Aminosäuresequenz ist, die eine Asn-Gly-Sequenz
umfaßt, wobei einer oder beide Reste der Sequenz entfernt
sind oder durch einen Rest einer unterschiedlichen
Aminosäure ersetzt sind.
2. Verfahren zur Bestimmung eines Chlamydien-,
Gonokokken- oder Herpesantigens, umfassend:
A. Extrahieren von Chlamydien-, Gonokokken- oder
Herpesantigen aus einer Probe, von der angenommen wird, daß sie
Chlamydien-, Gonokokken- oder respektive Herpesorganismen
enthält, mit dem Verfahren nach Anspruch 1,
B. Kontaktieren des extrahierten Antigens mit Antikörpern
hierfür, um einen immunologischen Komplex zu bilden, und
C. Bestimmen des Vorliegens des Komplexes als einem
Nachweis für das Vorliegen von Chlamydien-, Gonokokken- oder
respektive Herpesorganismen in der Probe.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2. bei dem man den
Kontakt der Probe mit der Protease vor dem Schritt A
durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die
Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantikörper zum Nachweis
markiert sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Antikörper
mit einem Enzym markiert sind.
6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem die
Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantikörper nicht
markiert sind und der immunologische Komplex nachgewiesen wird,
indem markierte Antikörper gegen die unmarkierten Antikörper
verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 zum
Nachweis des Lipopolysaccharidantigens von C. trachomatis.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 zum
Nachweis des Protein IA-Antigens oder IB-Antigens von N.
gonorrhoeae.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem
die Antigenextraktion in einer Extraktionsvorrichtung
durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem
die Antigenextraktion bei einem pH von 8 bis 13,5
durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei
der Asn-Rest der Aminosäuresequenz der Protease in den
Positionen 109 und 218 durch einen Serinrest ersetzt ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei
in der Aminosäuresequenz der Protease der Asn-Rest in der
Position 76 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist.
13. Testkit zur Bestimmung eines Chlamydien-,
Gonokokken- oder Herpesantigens, umfassend in getrennten Packungen:
(a) einen Antikörper, der entweder für ein Chlamydien-,
Gonokokken- oder Herpesantigen spezifisch ist, und
(b) eine Protease, die ein Analog eines Bacillus subtilisin
mit einer Aminosäuresequenz ist, die eine Asn-Gly-Seguenz
umfaßt, in der einer oder beide Reste der Sequenz entfernt
sind oder durch einen Rest einer unterschiedlichen
Aminosäure ersetzt sind.
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