DE68908253T2

DE68908253T2 - Verfahren zur Herstellung von Itaconsäure.

Info

Publication number: DE68908253T2
Application number: DE89401085T
Authority: DE
Inventors: Patrick Cros; Didier Schneider
Original assignee: Rhone Poulenc Chimie SA
Current assignee: Rhodia Chimie SAS
Priority date: 1988-05-02
Filing date: 1989-04-19
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2009-04-20
Also published as: FR2630751B1; BR8902017A; DE68908253D1; CA1340745C; MX169584B; EP0341112A1; ATE92964T1; EP0341112B1; ES2058567T3; FR2630751A1

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Itaconsäure mittels Fermentation von Kohlenhydraten mit Hilfe von Mikroorganismen. Sie betrifft insbesondere ein mikrobiologisches Verfahren der Umwandlung von Zuckern, die sich von Stärke ableiten.
Die Synthese von organischen Säuren durch Fermentation von Zuckern in Gegenwart eines geeigneten Mikroorganismus ist allgemein bekannt. Für solche mikrobiellen Fermentationen typische Säuren umfassen vor allem Essigsäure, Milchsäure, Citronensäure, Gluconsäure und 2-Ketogluconsäure, Fumarsäure und Itaconsäure. Diese Säuren werden in der Lebensmittelindustrie, in der pharmazeutischen Industrie, in der chemischen Industrie und für andere gewerbliche Zwecke verwendet. Herstellungsverfahren sind beispielsweise in "Chemicals by fermentation" S.J. Gutcho-Noyes Data Corporation 1973 beschrieben.
Bei den industriellen bzw. gewerblichen Fermentationen beruht die Wahl des Kohlenwasserstoffsubstrats gleichzeitig auf seiner Verfügbarkeit, seinem Preis und seiner Eignung für hohe Produktivitäten. Stärke wurde vielfach als billige Kohlenstoffquelle genannt. Es sind aber nicht alle Mikroorganismen in der Lage, Stärke zu metabolisieren, aber die meisten von ihnen metabolisieren Dextrose. Infolgedessen muß die Stärke vor der Fermentation hydrolysiert/verzuckert werden. Die Folge sind erhöhte Produktionskosten.
Hauptziel der Erfindung ist es, ein wirtschaftliches Fermentationsverfahren vorzuschlagen, bei dem Stärke als Kohlenstoff- Nährstoffquelle verwendet und eine Produktivität erzielt wird, die mindestens gleich ist derjenigen, die mit Glucose oder glucosereichen Stärkehydrolysaten erzielt wird.
Es wurde gefunden, daß Itaconsäure synthetisiert werden kann, indem die Fermentation mit Hilfe des produzierenden Mikroorganismus gleichzeitig mit der enzymatischen Hydrolyse der Stärke vorgenommen wird. Zusätzlich zum Zeitgewinn, der sich aus dem Wegfall der Vorstufe der Verzuckerung der Stärke ergibt, wird überraschenderweise die Produktionsgeschwindigkeit nicht beeinträchtigt, verglichen mit der Verwendung eines Glucosesubstrats, selbst wenn die Fermentationsbedingungen (pH-Wert und Temperatur) von den optimalen Bedingungen für die Aktivität des hydrolysierenden Enzyms abweichen.
Erfindungsgemäß ist das Verfahren zur Herstellung von Itaconsäure durch Fermentation mit Hilfe von Mikroorganismen eines wäßrigen Nährmediums, das Stärke als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation in Gegenwart von zusätzlich mindestens einem stärkespaltenden verzuckernden Enzym durchgeführt wird.
Die erfindungsgemäß als Kohlenstoffquelle verwendete Stärke kann irgendeine Getreidestärke, wie Stärke von Weizen, Mais, Sorghum, Reis, Tapioka, Roggen oder Hafer oder eine Knollenstärke wie Kartoffelstärke sein.
Die Stärke kann roh, in verflüssigter Form oder in partiell verzuckerter Form eingesetzt werden. Der Begriff "Stärke" schließt in dieser Beschreibung die Rohstärke in wäßriger Dispersion und die Stärkehydrolysate, die bei der unvollständigen Hydrolyse von Stärke als verflüssigte Stärke erhalten werden, Stärkesirupe und dextrosereiche Hydrolysate ein. Die Stärkehydrolysate unterscheiden sich untereinander durch ihren Hydrolysegrad, der in Dextroseäquivalent D.E. ausgedrückt wird, und durch ihren Gehalt an höheren Oligosacchariden und Polysacchariden. Die verflüssigten Stärken weisen ein D.E. im Bereich von 3 bis 20 auf und enthalten allgemein 50 bis 95% Polysaccharide mit einem Polymerisationsgrad von mehr als G 7 (7 Glucoseeinheiten). Die Stärkesirupe oder Glycosesirupe von geringem Dextroseäquivalent weisen ein D.E. im Bereich von 20 bis 68 mit 10 bis 50% Polysacchariden über G 7 auf. Die dextrosereichen Stärkehydrolysate oder -sirupe haben ein D.E. bis zu 90-98%. Die Herstellung der Stärkehydrolysate ist in der Technik allgemein bekannt. Üblicherweise werden die verflüssigten Stärken und die Stärkesirupe durch saure und/oder enzymatische Hydrolyse mit einer α-Amylase zur Verflüssigung, gegebenenfalls gefolgt von einer β-Amylase, erhalten. Um glucosereiche Hydrolysate zu erhalten, wird die Stärke meistens in einem zweistufigen Verfahren umgewandelt, durch Einwirkung eines Verzuckerungsenzyms wie Glucoamylase, auch unter der Bezeichnung Amyloglucosidase bekannt.
Bei der praktischen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise ein Stärkesirup und mehr bevorzugt eine verflüssigte Stärke eingesetzt. Die Verwendung von glucosereichen Hydrolysaten ist unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten nicht interessant, weil sie eine vorausgehende Verzuckerung erfordert und dies eine langandauernde Stufe ist, selbst unter maximalen Bedingungen für die Aktivität von Amyloglucosidase, die allgemein bei einer Temperatur über 50ºC und einem pH-Wert von 4,5-5 gegeben sind.
Stärke und ihre Hydrolyseprodukte können beim erfindungsgemäßen Verfahren direkt in nicht gereinigter Form nach Sterilisation eingesetzt werden. Selbstverständlich können auch im Handel erhältliche gereinigte konzentrierte oder dehydratisierte Produkte wie die Maltodextrine Verwendung finden.
Die Stärke ist in dem Fermentationsmedium in einer Menge vorhanden, die ausreicht, um 1 bis 15 Gew.-% Glucose, bezogen auf das Fermentationsmedium, zu liefern. Ausgedrückt als Rohstärke auf Trockensubstanzbasis liegen geeignete Mengen im Bereich von 10 bis 160 g/l, vorzugsweise 60 bis 140 g/l Fermentationsmedium.
Die stärkespaltenden Enzyme der Verzuckerung, die erfindungsgemäß dem Fermentationsmedium zugesetzt werden, das den Itaconsäure-produzierenden Mikroorganismus enthält, sind in der Lage, die Dextrine der Stärke in Glucose und Maltose umzuwandeln. Als Verzuckerungsenzyme können die verzuckernden α-Amylasen wie α-Amylase von Bacillus subtilis var.amylosaccharitiens, Pilz-α-Amylase, die β-Amylasen, Glucoamylase, Isoamylase und Pullulanase genannt werden. Diese Enzyme können einzeln oder im Gemisch miteinander eingesetzt werden.
Bevorzugt wird Glucoamylase aufgrund ihrer hohen Spezifität. Die Glucoamylase kann eine beliebige Pilz-Glucoamylase sein wie die Amylasen der Gattungen Aspergillus, Endomyces oder Rhizopus. Vor allem wenn Rohstärke als Kohlenstoffquelle genutzt wird, kann auch zusätzlich zum verzuckernden Enzym ein verflüssigendes Enzym eingesetzt werden, beispielsweise ein Gemisch aus verflüssigender α-Amylase und β-Amylase oder aus verflüssigender α-Amylase und Glucoamylase. Gewerbliche enzymatische Präparate werden in Encycl. of Pol. Sc. Bd.6, 5.46-53 (1967) beschrieben.
Das stärkespaltende Enzym zur Verzuckerung, gegebenenfalls der Verflüssigung, wird dem Fermentationsmedium in der notwendigen Menge zugesetzt, um die Verzuckerung bzw. die Verflüssigung der Stärke zu bewirken. Die brauchbare Mindestmenge hängt von der Aktivität des Enzyms, der Menge und dem D.E. der im Medium vorhandenen Stärke ab und kann vom Fachmann leicht bestimmt werden. Allgemein werden Mengen eingesetzt, die ausreichen, um 0,04 bis 2 Einheiten enzymatischer Aktivität, vorzugsweise 0,1 bis 1 Einheit je g Stärke (ausgedrückt als Trockensubstanz) zu liefern. Beispielsweise kann als Verzuckerungsenzym AMG 200 L , Handelsprodukt der NOVO INDUSTRY, das eine Glucoamylase ist, in einer Menge von 0,02 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die Feststoffe in der im Fermentationsmedium vorhandenen verflüssigten Stärke zugesetzt werden.
Irgendein Mikroorganismus, der in der Lage ist, in Gegenwart von Zuckern Itaconsäure zu produzieren, kann beim erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden. Genannt seien vor allem die Pilze, die den Spezies Aspergillus itaconicus und Aspergillus terreus angehören, wobei die letztere Spezies bevorzugt wird.
Abgesehen von der Kohlenstoffquelle und dem stärkespaltenden Enzym, wie sie erfindungsgemäß verwendet werden, können das Produktionsmedium und die Fermentationsbedingungen, wie in der Literatur beschrieben, gewählt werden.
Die Stickstoffquelle kann vor allem unter den metabolisierbaren organischen und/oder mineralischen Verbindungen, wie löslicher Extrakt von Mais (CSL) und/oder Soja, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat usw. und deren Gemischen, gewählt werden. Das Medium enthält außerdem Mineralsalze wie Sulfate, Chloride und Phosphate von Ca, Mg, Na, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Zn sowie andere gebräuchliche Zusätze wie Mittel zum Regeln des pH-Wertes und/oder Antischaummittel.
Der Mikroorganismus wird dem Fermentationsmedium in an sich bekannter Weise mit Hilfe eines Inokulums oder von Zwischenkulturen zugesetzt.
Das eiweißspaltende Enzym wird vorzugsweise dem sterilen Medium unmittelbar vor der Inokulation zugesetzt. Die Fermentation wird zweckmäßigerweise bei einem sauren pH-Wert im Bereich von etwa 1,8 bis 5 und bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 40ºC durchgeführt, wobei die optimalen Bedingungen von dem jeweiligen eingesetzten Stamm des Mikroorganismus abhängen. Hohe prozentuale Anteile an Itaconsäure wurden bei Verwendung von Aspergillus terreus bei einem pH-Wert von vorzugsweise im Bereich von 2 bis 4 und mehr bevorzugt von 2 bis 3,4 erhalten, wobei die Temperatur bei etwa 30-40ºC gehalten wurde.
Nach beendeter Fermentation kann die erzeugte Itaconsäure aus der der Brühe mit Hilfe bekannter Verfahren gewonnen und gereinigt werden beispielsweise durch Filtration, Konzentration, Kristallisation oder Extraktion mit Lösungsmitteln.
Die obige Beschreibung bezieht sich auf ein spezifisches Verfahren zur Herstellung von Itaconsäure durch Fermentation mit Hilfe von Mikroorganismen eines Mediums, das eine ausgehend von Stärke erzeugte Kohlenhydratquelle enthält, in Gegenwart von Enzymen, die die Stärke oder ihre Abbauprodukte zu Mono- und Disacchariden hydrolysieren können. Die Erfindung als solche ist nicht auf die genaue Zusammensetzung des Fermentationsmediums und auch nicht auf besondere Ausführungsformen beschränkt.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von verflüssigter Rohstärke

Eine wäßrige Lösung von Weizenstärke mit 350 g/l Trockensubstanz wurde homogenisiert, auf pH = 6,5 eingestellt und mit 0,175 g/l Enzym zur Verflüssigung (TERMANYL 120L - Novo Industry) versetzt. Die Lösung wurde in einen Sterilisator mit Dampfinjektion eingespeist. Die Temperatur wurde 7 min lang bei 100-105ºC gehalten; dann wurde auf 95ºC abgekühlt und diese Temperatur während 2 h in einem Rührkessel beibehalten; dann wurde auf 35ºC abgekühlt.

Fermentation

Die Lösung von verflüssigter Stärke, die 130 kg Trockensubstanz enthielt, wurde in einen 1400 l Fermenter eingespeist. Dann wurden zugegeben:
- eine 30 min bei 100ºC sterilisierte Nährlösung, die 0,5 kg Maisextrakt, 3,45 kg Magnesiumchlorid, 0,3 kg Magnesiumsulfat, 0,9 kg Harnstoff, 0,4 kg Natriumchlorid, 0,033 kg Zinksulfat, 0,05 kg Kaliumdihydrogenphosphat, 1 kg Calciumchlorid, 0,06 kg Kupfersulfat und 0,3 kg Schwefelsäure enthielt, und deren pH-Wert 3,6 betrug;
- 0,29 kg Amyloglucosidase (AMG 200L - Novo Industry).
Diese Produktionsmedium, dessen Endvolumen auf 1000 l eingestellt wurde, wurde belüftet und mit 20 l einer Kultur von Aspergillus terreus NRRL 1960 beimpft, die 35 h alt und bei 32-35ºC in einem Fermenter, der 25 g/l Glucose, 4,5 g/l Magnesiumsulfat, 0,4 g/l Natriumchlorid, 0,004 g/l Zinksulfat, 0,1 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Maisextrakt, 2,0 g/l Ammoniumnitrat und 0,5 g/l Schwefelsäure enthielt, hergestellt worden war
Die Temperatur der Brühe wurde auf 32-35ºC eingestellt.
Die Fermentation wurde gestoppt, sobald der Zucker erschöpft und die Azidität ihr Maximum erreicht hatte und beständig geworden war.
Proben der Brühe wurden in Zeitabständen entnommen, um den Gehalt an Itaconsäure, der mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie bestimmt wurde, zu bewerten. Fermentationsdauer Itaconsäure, akkumuliert
Die Produktivität betrug 0,937 g/l h.

Beispiel 2 (Vergleich)

Es wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 eine Fermentation mit Hilfe der gleichen Kultur von Aspergillus terreus durchgeführt. Das Produktionsmedium war identisch mit der Ausnahme, daß keine Glucoamylase zugesetzt und die verflüssigte Stärke durch die gleiche Menge (ausgedrückt als Trockensubstanz) eines Stärkehydrolysats ersetzt wurde, das zuvor durch enzymatische Verzuckerung entsprechend dem folgenden Verfahren erhalten worden war:
Nach Verflüssigung der Stärke in gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde die Lösung auf 60ºC abgekühlt, auf pH = 4,5 eingestellt, mit 168,4 g Amyloglucosidase AMG 200L versetzt und während 60 h bei 60ºC gehalten. Die Lösung (DE ≥ 96) wurde auf 30-35ºC abgekühlt und in den Fermenter eingebracht.
Nach Zugabe der Nährlösung wurde das Medium inokuliert und die Fermentation unter den Bedingungen des Beispiels 1 durchgeführt. Die Fermentation wurde gestoppt, nachdem die Glucose erschöpft und die Azidität sich auf ihr Maximum eingestellt und stabil geworden war.
Die Analyse der periodisch entnommenen Proben ergab folgende Resultate: Fermentationsdauer Itaconsäure, akkumuliert
Die Produktivität betrug 0,874 g/l h.

Beispiel 3 (Vergleich)

Eine Fermentation wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, aber in Abwesenheit von Amyloglucosidase und indem die verflüssigte Stärke durch 150 kg gereinigten Glucosesirup mit einem Trockensubstanzgehalt von 74% und einem DE von 96-98, vertrieben von der Firma ROQUETTE, ersetzt wurde.
Die Analyse der während der Fermentation entnommenen Proben ergab folgende Resultate: Fermentationsdauer Itaconsäure, akkumuliert
Die Produktivität betrug 0,684 g/l h.

Beispiel 4

Versuch A (Vergleich)

In einem belüfteten Rührfermenter wurden 36 l einer verflüssigten Stärkelösung DE 10-15 vorgelegt, hergestellt ausgehend von einer Lösung mit 180 g/l Weizenstärke, die homogenisiert, mit 4,86 g Enzym Termamyl 120L versetzt und auf pH = 6,5 eingestellt, während 1 h auf 102ºC erhitzt und dann auf 35ºC abgekühlt worden war.
Es wurde eine 30 min bei 100ºC sterilisierte Nährlösung zugegeben, die 25 g Maisextrakt, 172 g Magnesiumchlorid, 15 g Magnesiumsulfat 7H&sub2;O, 45 g Harnstoff, 20 g Natriumchlorid, 1,7 g Zinksulfat, 2,5 g Kaliumdihydrogenphosphat, 50 g Calciumchlorid, 3 g Kupfersulfat und 15 g Schwefelsäure enthielt.
Das Medium mit einem Endvolumen von 50 l und einem pH-Wert von 3,5 wurde auf 32-35ºC eingestellt und mit 1 l einer 35 h alten Kultur von Aspergillus terreus in NRRL 1960 beimpft, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war.
Die Fermentation wurde bei 32-35ºC unter Rühren mit 200 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 2 m³/h durchgeführt, wobei der pH-Wert im Verlauf der Fermentation frei schwankte.
Die Fermentationsdauer betrug 112 h. Die Brühe enthielt 47,5 g/l Itaconsäure entsprechend einer Produktivität von 0,424 g/l h.

Versuch B

Es wurde wie im Versuch A verfahren, aber vor dem Inokulieren wurden dem Produktionsmedium 18 g Amyloglucosidase AMG 200L zugesetzt
Die Fermentationsdauer unter den Bedingungen des Versuchs A betrug 80 h. Die Brühe enthielt 74,1 g/l Itaconsäure entsprechend einer Produktivität von 0,926 g/l h.

Beispiele 5 bis 9

Es wurde eine Reihe von Fermentationen, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt, indem die Menge an Amyloglucosidase, die dem Medium vor dem Inokulieren mit der Kultur von Aspergillus terreus zugesetzt wurde, verändert wurde.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt: Beispiele Verflüssigte Stärke g/l (Trockensubstanz) Fermentationsdauer h Produzierte Säure g/l Ausbeute/Äquivalent Glucose % Produktivität g/l h

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Itaconsäure durch Fermentation eines wäßrigen Nährmediums, das Stärke als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthält, mittels Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation in Gegenwart von zusätzlich mindestens einem stärkespaltenden verzuckernden Enzym durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke in verflüssigter oder teilweise verzuckerter Form eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke roh eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fermentationsmedium ein Verflüssigungsenzym zusätzlich zum verzuckernden Enzym enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke in der notwendigen Menge vorhanden ist, um 1 bis 15 Gew.-% Glucose, bezogen auf das Fermentationsmedium, zu liefern.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das verzuckernde Enzym unter den α-Amylasen, β-Amylasen, Glucoamylase, Isoamylase, Pullulanase und deren Gemischen ausgewählt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das verzuckernde Enzym in ausreichender Menge eingesetzt wird, um 0,04 bis 2 Einheiten enzymatischer Aktivität, vorzugsweise 0,1 bis 1 Einheit je g Stärke, ausgedrückt als Trockensubstanz, zu liefern.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das verzuckernde Enzym eine Glucoamylase ist und in einer Menge von 0,02 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf die in der Stärke enthaltenen Feststoffe, eingesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus unter den Pilzen ausgewählt wird, die zu den Spezies Aspergillus itaconicus und Aspergillus terreus gehören.