DE60319693T2

DE60319693T2 - Marker fur lungentumoren

Info

Publication number: DE60319693T2
Application number: DE2003619693
Authority: DE
Inventors: Johannes Coy; Rainer Hipfel; Birgit Wasser
Original assignee: Roche MTM Laboratories AG
Current assignee: Roche MTM Laboratories AG
Priority date: 2002-05-21
Filing date: 2003-05-16
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2023-05-17
Also published as: ATE389033T1; WO2003097871A8; ES2316501T3; US7355025B2; DE60229920D1; ATE414789T1; CA2486583C; EP1506317A2; AU2003238077A1; AU2003238077A8; US20050176930A1; ES2303595T3; EP1365032A1; JP2005525826A; EP1365032B1; WO2003097871A3; US20090098544A1; DE60319693D1; WO2003097871A2; CA2486583A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft lungenkrebsassoziierte Nukleinsäuren und Polypeptide. Die Erfindung betrifft spezifischer Nukleinsäuren, deren Expression im Zusammenhang mit Lungenkrebs signifikant verändert ist und die hiervon transkribierten Polypeptide. Die Erfindung betrifft eine Reihe differenziell gespleißter Transkripte des hier offenbarten Gens, welche mit Tumoren der Atemwege in Verbindung stehen. Des Weiteren liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur frühen Diagnose von Lungentumoren.
In den entwickelten Ländern sank die Anzahl der durch Krebs verursachten Todesfälle im letzten Jahrzehnt. Ausgenommen hiervon ist die Anzahl der durch Lungenkrebs verursachten Todesfälle. Lungenkrebs ist einer der wenigen Krebsarten, bei der weltweit immer noch zunehmende Neuerkrankungen verzeichnet werden. Lungenkrebs ist bei Frauen wie Männern die am häufigsten zum Tod führende Krebsart. Überdies ist die Überlebensrate bei Lungenkrebs bis heute sehr niedrig und trotz wissenschaftlicher und medizinischer Bemühungen in diesem Bereich gab es kaum eine Verbesserung der Überlebensrate.
Bei Lungentumoren besteht, wie auch bei den meisten anderen Tumoren, eine starke Korrelation zwischen der Überlebenschance nach der Ersttherapie und dem Stadium, in der die Krankheit diagnostiziert wurde. Je früher der Krebs entdeckt wird, desto größer sind daher die Überlebenschancen des Patienten. Aus diesem Grund sind sensitive Testverfahren erforderlich, um die Tumore frühzeitig zu erkennen.
Die vielversprechendsten Verfahren für die Früherkennung von Tumoren sind solche, die Tumorzellen spezifische molekulare Marker, einsetzen.
Lungenkrebs ist eine ziemlich heterogene Krankheit. Viele Regulatoren des Zellwachstums können an der Entstehung von Krebs beteiligt sein. Diese regulatorischen Elemente des Zellzyklus können entweder positive Regulatoren sein, die im Fall dass sie mutiert vorliegen Onkogene genannt werden, sodass ein transformierter Zustand erreicht wird, oder negative Regulatoren, die Tumorsuppressor-Gene genannt werden. Die Anzahl der bekannten Faktoren, die an der Regulierung des Zellzyklus beteiligt und potenzielle Kandidaten für die Entwicklung von Krebs sind, übersteigt 100 und steigt immer noch an.
Die Moleküle, die an der Entstehung des kanzerösen Zustandes einer Zelle beteiligt sind, können zur Unterscheidung zwischen Krebszellen und normalem Gewebe verwendet werden. Auf diese Weise kann kanzeröses Gewebe durch den Nachweis von Molekülen entdeckt werden, welche für Krebszellen charakteristisch sind. Dies ist wiederum erweist sich als ziemlich schwierig aufgrund der hohen Anzahl von Molekülen, die potenziell bei der Entstehung des Krebses eine Rolle spielen.
Für eine verbesserte Diagnose von Tumoren besteht Bedarf an neuen Markermolekülen zur Diagnose von Krebs, vor allem von Lungenkrebs, welche eine spezifische Früherkennung ermöglichen und die Möglichkeit bieten, die Funktionsstörungen in einem frühen Stadium zu behandeln.
Vorliegend werden Nukleinsäuren und Polypeptide offenbart, welche in Zusammenhang mit Lungenkrebs stehen. Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Moleküle als molekulare Marker verwendet werden, die einen umfangreichen Nachweis von Lungentumoren selbst in frühen Stadien ermöglichen.
Die Chromosomalen Nukleinsäuren und Maushomologe der LUMA1-Nukleinsäuren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung offenbart werden, sind im Stand der Technik vorbekannt. Die chromosomale humane Sequenz des LUMA1-Gens wurde von Tracy, A. unter der Zugangsnummer AL359711.18 bei der EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbank (Einreichungsdatum 01. März 2001) offengelegt. Ein Maushomolog für LUMA1-mRNA wurde von Arakawa, T. et al im Jahre 2001 unter der Zugangsnummer BB653919 bei der EMBL/GeneBank/DDBJ-Datenbank (Einreichungsdatum 6. Juli 2001) offengelegt. Ein Lebertumor einer Maus wurde als Gewebequelle verwendet, aus der die Nukleinsäure isoliert wurde. Ein anderes Maushomolog, welches eine Sequenzhomologie mit den hier offenbarten LUMA1-Sequenzen aufweist, wurde unter der Zugangsnummer BI107698 in der NCl-NIH-Nukleinsäuredatenbank (Erstellungsdatum 28. Juni 2001) veröffentlicht. Drmanac, RT., et al., offenbarten in WO0175067 unter der Seq. ID Nr. 5135 eine humane Nukleinsäure, die eine Homologie mit der hier offenbarten LUMA1-Nukleinsäure aufweist. Ein Homo sapiens-cDNA-Klonhomolog zu bestimmten Splice-Varianten der hier offenbarten LUMA1-Nukleinsäuren wird unter der Zugangsnummer BF223759 präsentiert. In keinem dieser Dokumente wurden weder Splicing-Sites noch Splice-Varianten offenbart, die möglicherweise für die von der chromosomalen Sequenz transkribierten Nukleinsäuren vorhanden sind. In diesem Kontext wurden keine Informationen bezüglich der Verbindung des Expressionslevels der LUMA1-Sequenzen zu Tumoren in Menschen mitgeteilt. Insbesondere geben die Dokumente keinerlei Hinweis dahingehend, dass spezifische Exons umfassende Splice-Varianten für den Nachweis von Tumoren geeignet sein könnten und Splice-Varianten ohne diese Exons möglicherweise nicht geeignet sein könnten.
Chen, Sei-Yu, et al. offenbart in WO0161055 Nukleinsäuresequenzen zur Diagnose und Behandlung von Lungentumoren (lungenspezifische Gene LSG) sowie Verfahren, die mit besagten Genen in Zusammenhang stehen. In diesem Dokument gibt es weder Informationen hinsichtlich LUMA1 noch Informationen, welche zur Identifizierung von Tumor-assoziierten Splice-Varianten von LUMA1 führen könnten.
Die vorliegende Offenbarung liefert somit Polypeptide und Nukleinsäuren, deren Expression in Zusammenhang mit Lungentumoren signifikant verändert ist und dadurch eine verbesserte Prognose und Diagnose von Krankheiten ermöglichen, die im Zusammenhang mit abnormalem Zellwachstum stehen. Des Weiteren umfassen die hier offenbarten Nukleinsäuren Transkripte, die aus alternativem Gensplicing entstehen und die in normalem Gewebe nicht in dem Ausmaß vorkommen wie in Tumorgewebe.
Während der Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde ein Gen entdeckt, dessen Expression im Zusammenhang mit Lungentumoren steht. Die vorliegende Erfindung basiert des Weiteren auf den in Beispiel 1 und 2 gezeigten Ergebnissen der Erfinder, die darauf basieren, dass der Expressionslevel von Nukleinsäuren und Polypeptiden, die von dem Markergen aus 1–7 transkribiert werden, es ermöglicht, Lungentumore zu diagnostizieren und einzustufen, um den Verlauf der Krankheit zu prognostizieren sowie die Krankheit nach der Erstbehandlung zu verfolgen.
Die vorliegende Offenbarung liefert somit neuartige Nukleinsäuren und Polypeptide, die in Zusammenhang mit Lungenkrebs stehen.
Gemäß einem Aspekt ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung besonders nützlich für die Früherkennung von Lungentumoren sowie für den Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Verlauf der Diagnose der „Minimal Residual Disease".
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die hier offenbarten Nukleinsäuren oder Polypeptide bei der Diagnose von Lungentumoren in Proben wie Tumorresektionen, Biopsien oder ähnliches verwendet werden. In diesem Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zur Verfügung, welches es ermöglicht, eine Strategie für die Therapie von Krankheiten im Hinblick auf ihre molekularen Eigenschaften aufzubauen. Gemäß der vorliegenden Offenbarung kann der Level besagter Polypeptide und/oder Nukleinsäuren als molekularer Marker für die Prognose, Überwachung und zur Ausarbeitung einer Strategie für die Tumortherapeutik dienen.
Die vorliegende Erfindung liefert Tumor-assoziierte Nukleinsäuren und Polypeptide, die durch die in 1–11 dargestellten Sequenzen charakterisiert sind.
Markermoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung können Nukleinsäuren und Polynukleotide umfassen. Auf der Ebene von Nukleinsäuren können Markermoleküle DNA oder RNA umfassende genomische DNA, cDNA und RNA, wie zum Beispiel mRNA oder hnRNA, sein. In einer Ausführungsform der Erfindung können Nukleinsäuren, die aus bestimmten differenziellen Splicing-Vorgängen entstehen, Markermoleküle sein.
Expression gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel die Expression von Proteinen umfassen. Die Transkription auf RNA und somit der Level der mRNA können auch als Expression gemäß der vorliegenden Erfindung angesehen werden.
Die Expression einer Verbindung wird gemäß der vorliegenden Erfindung als signifikant verändert bezeichnet, wenn sich der Expressionslevel um mehr als 30% unterscheidet. Die Veränderung der Expression kann zum Beispiel eine erhöhte oder eine verringerte Expression besagter Verbindung umfassen. Ein anderer Aspekt der veränderten Expression kann eine Veränderung in der Art sein, dass die Verbindung unter Nicht-Wildtyp-Umständen exprimiert wird. Dies kann beinhalten, dass die Verbindung zum Beispiel in Situationen exprimiert wird, in denen normalerweise die Expression unterdrückt wird oder in Situationen nicht exprimiert wird, in denen normalerweise die Expression der Verbindung hervorgerufen wird.
Veränderung der Expression gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch eine Veränderung des Transkriptionsmusters eines Gens beinhalten. Zum Beispiel kann die Veränderung des Transkriptionsmusters alternatives Splicing des Gens beinhalten. Die Veränderungen im Transkriptionsmuster können die Polypeptide beeinflussen, die von den veränderten Transkripten translatiert werden oder können auf nicht-translatierte Regionen beschränkt sein. Die Veränderung im Transkriptionsmuster eines Gens kann die Verwendung von neuartigen Exons in den Transkripten, die Beseitigung von Exons in den Transkripten oder die Veränderung des Ratios verschiedener Splicing-Varianten in Zellen umfassen. Somit können Veränderungen in den Transkriptionsmustern von Genen gemäß der vorliegenden Erfindung die Entstehung von Nukleinsäuren wie z. B. mRNA, cDNA etc. umfassen, die zusätzliche Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen im Vergleich zu den in Kontrollgewebe vorkommenden Wildtyp-Nukleinsäuren beinhalten. Alternativ hierzu können die Nukleinsäuren, die durch alternative Splicing-Muster, Nukleinsäuren produziert werden, bei denen von Nukleinisäuren fehlen, welche in Wildtyp-Polynukleotiden vorhanden sind. Das Vorhandensein von zusätzlichen Abschnitten kann gleichzeitig mit dem Fehlen von ursprünglichen Sequenzabschnitten in einzelnen Transkripten erfolgen. Veränderungen der Genexpression können gemäß der vorliegenden Erfindung auch eine Veränderung des Expressionslevels von Splicing-Varianten von Genen umfassen. Dies kann eine erhöhte oder verringerte Expression von bestimmten Splicing-Varianten beinhalten sowie die Expression von Varianten, die nicht in Wildtyp-Geweben vorhanden sind, oder die ausbleibende Expression von in Wildtyp-Gewebe vorhandenen Splicing-Varianten. In einer Ausführungsform kann die Expressionsveränderung der Splicing-Varianten die Veränderung der Ratios der verschiedenen Splicing-Varianten in besagtem Gewebe umfassen.
Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Polynukleotide oder deren Fragmente. Bevorzugte Polynukleotide umfassen mindestens 20 aufeinander folgende Nukleotide, vorzugsweise mindestens 30 aufeinander folgende Nukleotide und weiter bevorzugt mindestens 45 aufeinander folgende Nukleotide, die identisch sind, die gleiche Sequenzhomologie besitzen oder für identische oder homologe Polypeptide kodieren, im Vergleich zu den Polypeptiden, die im Zusammenhang mit den hier offenbarten proliferativen Funktionsstörungen stehen. Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können auch zu allen genannten Polynukleotiden komplementär sein. Polynukleotide können zum Beispiel einzelsträngige (Sense oder Antisense) oder doppelsträngige Moleküle beinhalten und können DNA (genomisch, cDNA oder synthetisch) oder RNA sein. RNA-Moleküle umfassen sowohl hnRNA (enthalten Introns) als auch mRNA (enthalten keine Introns). Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Polynukleotide mit jeglichen anderen Molekülen gekoppelt sein, wie z. B. unterstützende Materialien oder Nachweismarkermoleküle, und können, müssen jedoch nicht, zusätzliche kodierende oder nicht-kodierende Sequenzen enthalten.
Die Polynukleotide gemäß der vorliegenden Offenbarung können native Sequenzen und Varianten davon sein. Die Varianten können eine oder mehrere Subtitutionen, Hinzufügungen, Deletionen und/oder Insertionen enthalten, sodass die Immunogenität der kodierten Polypeptide im Bezug auf die jeweiligen nativen Proteine nicht vermindert wird. Die Varianten weisen vorzugsweise 70%, besser noch 80% und am besten 90% an Sequenzidentität mit den nativen Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung auf. Verfahren zur Bestimmung von Sequenzähnlichkeiten sind dem Fachmann bekannt.
Ein Beispiel zur Bestimmung der Sequenzähnlichkeit kann mit der FastA und/oder BlastN Bioinformatics-Software durchgeführt werden, die über den HUSAR-Server des DKFZ Heidelberg zugänglich ist.
Des Weiteren sind Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Offenbarung alle Polynukleotide, welche unter stringenten Bedingungen an Sonden hybridisieren, die für die hier offenbarten Sequenzen spezifisch sind. Stringente Bedingungen, die für die Hybridisierungsreaktion angewendet werden, sind dem Fachmann bekannt und können in Sambrook et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989, nachgelesen werden.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch Polynukleotide zur Verfügung, welche obwohl sie nicht den Prozentanteil der Sequenzhomologie zeigen wie zuvor für Nukleinsäuresequenzen beschrieben, dennoch aufgrund der Degeneration des Gencodes die Polypeptide kodieren, die normalerweise von den hier offenbarten Nukleinsäuren kodiert werdeni. Derartige Nukleinsäuren können durch Ersetzen der in den offenbarten Sequenzen vorhandenen Codons durch degenerierte Codons und entsprechende Herestellung von synthetische Nukleinsäure entstehen.
Die Nukleotidsequenzen gemäß der vorliegenden Offenbarung können mit einer Vielfalt anderer Nukleinsäuresequenzen mit den bekannten rekombinanten DNA-Techniken verbunden werden. Die Sequenzen können zum Beispiel in eine Vielzahl von Klonierungs-Vektoren geklont werden, wie zum Beispiel Plasmide, Phagemide, Lambda-Phage-Derivate und Kosmide. Des Weiteren können Vektoren wie Expressionsvektoren, Replikationsvektoren, Sonden generierende Vektoren und Sequenziervektoren mit den hier offenbarten Sequenzen verbunden werden. Sequenzen von besonderem Interesse, welche mit den Nukleinsäuren der vorliegenden Offenbarung geklont werden könnten, sind zum Beispiel nicht-kodierende Sequenzen und regulatorische Sequenzen umfassend Promoter, Enhancer und Terminatoren.
Die Expression von Nukleinsäuresequenzen in Zielzellen kann durch jegliches dem Fachmann bekannte Verfahren erreicht werden. Die Nukleinsäuren können zum Beispiel zu Elementen zusammengeführt werden, welche sich eignen, ihre Expression in einer Wirtszelle zu ermöglichen. Derartige Elemente können Promoter oder Enhancer, wie z. B. CMV-, SV40-, RSV-, Metallothionein I- oder Polyhedrin-Promoter beziehungsweise CMV- oder SV40-Enhancer umfassen. Mögliche Verfahren zur Expression sind zum Beispiel Einfügen der Polynukleotide in einen viralen Vektor einschließlich Adenovirus, Adeno-assoziierter Virus, Retrovirus, Vacciniavirus, oder Pockenvirus. Virale Vektoren zum Zwecke der Expression von Nukleinsäuren in Säugetier-Wirtszellen können pcDNA3, pMSX, pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, etc. umfassen. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt.
Andere Formulierungen für die Verabreichung zu therapeutischen Zwecken beinhalten kolloidale Dispersionssysteme, wie zum Beispiel Makromolekülkomplexe, Mikrosphären, Beads, Micellen und Liposome.
Generell ist es bei konventionellen molekularen biologischen Prozessen möglich (siehe z. B. Sambrook et al., supra), verschiedene Mutationen in die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung einzubringen. Als Ergebnis werden die erfindungsgemäßen mit Lungentumoren assoziierten Polypeptide oder damit verbundene Polypeptide mit möglicherweise veränderten biologischen Eigenschaften synthetisiert. Eine Möglichkeit ist die Erzeugung von Deletionsmutanten, in denen Nukleinsäuremoleküle durch kontinuierliche Deletionen von dem 5'- oder 3'-Terminal der kodierenden DNA-Sequenz erzeugt werden, die zu der Synthese der Polypeptide führen und entsprechend gekürzt werden. Eine andere Möglichkeit ist die Einpunkt-Mutation an Positionen, wo eine Modifikation der Aminosäuresequenz zum Beispiel die proliferationsspezifischen Eigenschaften beeinflusst. Durch dieses Verfahren können zum Beispiel Muteine produziert werden, die einen modifizierten Km-Wert besitzen oder welche nicht länger den Regulationsmechanismen, die normalerweise in einer Zelle existieren, z. B. hinsichtlich allosterischer Regulation oder kovalenter Modifikation, unterliegen. Derartige Muteine könnten auch als therapeutisch nützliche Antagonisten des erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Markers wertvoll sein.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryotischen Zellen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingeführt werden um somit eine Mutagenese oder eine Modifikation einer Sequenz durch Rekombination der DNA-Sequenzen ermöglichen. Mittels konventioneller Verfahren (cf. Sambrook et al., supra) können Basen ausgetauscht und natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Um die DNA-Fragmente miteinander zu verbinden, können Adapter oder Linker zu den Fragmenten hinzugefügt werden. Des Weiteren können Manipulationen durchgeführt werden, welche geeignete Spaltungs-Stellen liefern oder die überflüssige(n) DNA oder Spaltungs-Stellen entfernen. Wenn Einfügungen, Deletionen oder Ersetzungen möglich sind, können In-vitro-Mutagenese, Wiederherstellung von Primer, Restriktion oder Ligation durchgeführt werden. Als Analyseverfahren werden üblicherweise die Sequenzanalyse, die Restriktionsanalyse und andere biochemische oder molekulare biologische Verfahren verwendet.
Die Polypeptide, die von den verschiedenen Varianten der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung kodiert werden, zeigen gewisse gemeinsame Eigenschaften, wie zum Beispiel Aktivität in der Regulation von Zellproliferation und -differenzierung, molekulares Gewicht, immunologische Reaktivität oder Konformation oder physische Eigenschaften wie die elektrophoretische Mobilität, chromatografisches Verhalten, Sedimentationskoeffizient, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH-Optimum oder Temperaturoptimum.
Die Offenbarung betrifft überdies Vektoren, welche die erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Nukleinsäuremoleküle enthalten. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um Plasmide, Kosmide, Viren, Bakteriophagen und andere Vektoren, die üblicherweise im Bereich der Gentechnik verwendet werden. Vektoren, die sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, T7-basierte Dualexpressionsvektoren (Expression in Prokaryoten und Eukaryoten) zur Expression in Säugetierzellen und vom Baculovirus abgeleitete Vektoren zur Expression in Insektenzellen. Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül der Offenbarung mit den regulatorischen Elementen im rekombinanten Vektor der Erfindung verbunden, welche die Transkription und Synthese einer translatierbaren mRNA in prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen sicher stellen. Die zu transkribierende Nukleotidsequenz kann mit einem Promoter wie T7, Metallothionein I oder dem Polyhedrinpromoter verbunden werden.
Die vorliegende Offenbarung betrifft rekombinante Wirtszellen, die vorübergehend oder dauerhaft die Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren der Erfindung enthalten. Eine Wirtszelle wird als ein Organismus verstanden, der in der Lage ist, in vitro rekombinante DNA aufzunehmen und je nachdem die durch die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung kodierten Polypeptide zu synthetisieren. Bei diesen Zellen handelt es sich vorzugsweise um prokaryotische oder eukaryotische Zellen, wie zum Beispiel Säugetierzellen, Bakterienzellen, Insektenzellen oder Hefezellen. Die Wirtszellen der Offenbarung sind vorzugsweise durch die Tatsache gekennzeichnet, dass das eingebrachte Nukleinsäuremolekül der Offenbarung entweder heterolog in Bezug auf die transformierte Zelle ist, d. h. es kommt normalerweise nicht in diesen Zellen vor, oder sich an einer Stelle im Genom befindet, die sich von der entsprechenden, natürlich vorkommenden Sequenz unterscheidet.
Die Offenbarung betrifft ein Polypeptid, welches eine biologische Eigenschaft des Lungentumor-assoziierten Markers aufweist und von den Nukleinsäuremolekülen der Offenbarung kodiert wird, sowie auf Verfahren für deren Herstellung, wobei, z. B. eine Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, welche die Synthese des Polypeptids zulassen und das Polypeptid anschließend von den kultivierten Zellen und/oder von dem Kulturmedium isoliert wird. Die Isolation und Reinigung des rekombinant hergestellten Polypeptids kann mit konventionellen Mitteln durchgeführt werden, einschließlich präparativer Chromatografie sowie Affinitäts- und immunologische Aufreinigung zum Beispiel unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen die Lungentumor-assoziierten Markerproteine gerichtet ist, oder kann beispielsweise mit der Einschritt-Methode von Smith and Johnson, Gene 67; 31–40 (1988) aufbereitet werden. Diese Polypeptide umfassen jedoch nicht nur rekombinant hergestellte Polypeptide, sondern auch isolierte, natürlich vorkommende Polypeptide, synthetisch hergestellte Polypeptide oder Polypeptide, die durch eine Kombination dieser Verfahren hergestellt werden. Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide oder verwandte Polypeptide sind dem Fachmann bekannt. Diese Polypeptide sollten vorzugsweise im Wesentlichen aufgereinigt sein.
Die Herstellung eines Polypeptids kann zum Beispiel in einem zellfreien In-vitro-Transkriptions- und/oder -Translationssystem erfolgen. Solche Systeme sind dem Fachmann bekannt. Ein Beispiel kann ein Intro-Translationssystem sein, wie das „Roche Molecular Biochemicals' Rapid Translation System".
Polypeptide umfassen zumindest einen immunogenen Teil des hier offenbarten Tumor-assoziierten Markerproteins. Die Polypeptide können jegliche Länge aufweisen. Immunogener Teil, wie zuvor verwendet, bedeutet ein Teil eines Proteins, der durch einen B-Zell- und/oder T-Zelloberflächen-Antigenrezeptor erkannt wird. Die immunogenen Teile umfassen mindestens 10 Aminosäurenrereste, vorzugsweise mindestens 20 Aminosäurereste des Proteins, welches mit Lungentumoren in Zusammenhang gebracht wird. Bestimmte Bereiche des Proteins, wie zum Beispiel Transmembran-Bereiche oder N-Terminal-Leadersequenzen, können gelöscht worden sein. Die immunogenen Teile reagieren mit Antiseren oder spezifischen Antikörpern mit der gleichen oder fast gleichen Intensität wie die nativen Volllängenproteine.
Die immunogenen Teile werden im Allgemeinen anhand der dem Fachmann bekannten Techniken identifiziert. Mögliche Techniken sind zum Beispiel Screening der Polypeptide auf die Fähigkeit zur Reaktion mit Antigen-spezifischen Antikörpern, Antiseren und/oder T-Zelllinien oder Klonen.
Die lungentumorassoziierten Polypeptideumfassen auch Varianten des nativen Proteins. Diese Varianten können sich in einer oder mehreren Veränderungen von dem nativen Protein unterscheiden, wie z. B. Ersetzungen, Deletionen, Hinzufügungen und/oder Einfügungen. Die Immunreaktivität der Varianten wird im Vergleich zu den nativen Proteinen nicht wesentlich vermindert.
Varianten können in einem oder mehreren Teilen fehlerhaft sein, wie zum Beispiel N-Terminal-Leader-Sequenzen, transmembrane Bereiche oder kleine N- und/oder C-Terminal-Sequenzen. Die Varianten sind zu 70%, besser zu 90% und am besten zu 95% mit den in der vorliegenden Erfindung offenbarten Polypeptiden identisch.
Die Varianten sind vorzugsweise konservative Substitutionen, sodass die veränderten Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt sind. Die betroffenen Eigenschaften können Polarität, Ladung, Solubilität, Hydrophobie, Hydrophilität, und/oder amphipatische Beschaffenheit der Aminosäurenrückstände umfassen. Die hier offenbarten Varianten können auch zusätzliche Terminal-Leader-Sequenzen, Linker oder Sequenzen umfassen, welche eine Synthese, Reinigung oder Stabilität der Polypeptide auf leichtere oder komfortablere Weise ermöglichen.
Die Polypeptide umfassen auch Polypeptide, welche Fusions- oder chimerische Polypeptide sind, welche die Aminosäuresequenz umfassen, die von der Nukleinsäuresequenz des hier offenbarten erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Markers kodiert wird. Die Polypeptide können an jeglichen geeigneten Aminosäuresequenzen fusioniert werden. Diese Sequenzen können beispielsweise antigene Fragmente, Rezeptoren, Enzyme, Toxine, chelatbildende Epitope etc. umfassen. Die Aminosäuresequenzen, welche an die offenbarten Polypeptide fusioniert werden, können Tags sein, wie z. B. His-Tags oder Myc-Tags, welche bei der Reinigung oder Rückgewinnung der Polypeptide nützlich sind. Die fusionierten Aminosäuresequenzen können direkt miteinander verbunden werden, oder durch beliebige Linker oder Spacer-Sequenzen getrennt werden.
Die Polypeptide und Polynukleotide liegen isoliert vor. Dies bedeutet, dass die Moleküle aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt werden. Natürlich vorkommende Proteine sind isoliert, wenn sie von manchen oder allen in der natürlichen Umgebung koexistierenden Materialien getrennt sind. Polynukleotide werden zum Beispiel isoliert, wenn sie in Vektoren geklont werden.
Die Bezeichnung Bindeagens umfasst eine Vielfalt von Substanzen wie Oligopeptide, Antikörper, peptidomimetische Moleküle umfassende antigenbindende Oligopeptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, organische Zusammensetzungen etc. Der Begriff Antikörper bezieht sich vorzugsweise auf Antikörper, welche hauptsächlich aus konzentrierten monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen epitopischen Spezifitäten sowie ausgeprägten monoklonalen Antikörperpräparationen bestehen. Monoklonale Antikörper werden mit dem Fachmann bekannten Verfahren (siehe z. B. Köhler et al., Nature 256 (1975), 495) aus einem Antigen hergestellt, das Fragmente der Polypeptide der Erfindung enthält. Die hier verwendete Bezeichnung „Antikörper" (Ab) oder „monoklonaler Antikörper" (Mab) soll intakte Moleküle sowie Antikörperfragmente (wie z. B. Fab und F(ab')2 Fragmente) einschließen, welche die Fähigkeit besitzen, spezifisch an ein Protein zu binden. Fab und f(ab')2 Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, werden schneller aus dem Kreislauf entfernt und verfügen möglicherweise über eine geringere nicht-spezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper. (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316–325 (1983)). Somit werden diese Fragmente sowie die Produkte einer FAB- oder anderen Immunglobulin-Expressionsbibliothek bevorzugt. Des Weiteren umfassen Antikörper der vorliegenden Offenbarung chimerische, Einketten- sowie humanisierte Antikörper.
Bindeagenzien gemäß der vorliegenden Offenbarung können zum Beispiel für die Hemmung der Aktivität der hier offenbarten Lungentumor-assoziiierten Marker-Polypeptide verwendet werden. In dieser Hinsicht bezieht sich der Begriff „Bindeagenzien" auf Agenzien, die spezifisch an die von den neuartigen Lungentumor-assoziierten Nukleinsäuren transkribierten Polypeptide binden und somit die Aktivität besagter Polypeptide hemmen. Diese Bindeagenzien können zum Beispiel Nukleinsäuren (DNA, RNA, PNA etc.), Polypeptide (Antikörper, Rezeptoren, antigene Fragmente, Oligopeptide), Kohlenhydrate, Lipide, organische oder anorganische Verbindungen (Metallionen, Schwefelverbindungen, Borane, Silikate, Reduktionsmittel, Oxidationsmittel) umfassen. Die Bindeagenzien können vorzugsweise mit dem Polypeptid durch Binden an Epitope interagieren, die für die biologische Aktivität wichtig sind. Die Interaktion kann reversibel oder irreversibel sein. Bei der Bindung kann es sich um eine nicht-kovalente oder sogar um eine kovalente Bindung an das Polypeptid handeln. Des Weiteren können die Bindeagenzien Veränderungen in das Polypeptid einbringen, welche die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids verändern oder verringern.
Für bestimmte Zwecke, zum Beispiel diagnostische Methoden, kann der Antikörper oder das Bindeagens nachweisbar markiert werden, zum Beispiel mit einem Radioisotop, einer biolumineszenten Verbindung, einer chemilumineszenten Verbindung, einer fluoreszenten Verbindung, einem Metallchelat oder einem Enzym. Des Weiteren kann jede Methode verwendet werden, die für den Nachweis der intermolekularen Interaktion geeignet ist.
Der Antikörper oder das antigenbindende Agens wird als spezifisch reagierend angesehen, wenn es auf einem nachweisbaren Level mit einem hier offenbarten Protein reagiert und nicht signifikant mit anderen Proteinen reagiert. Bei den Antikörpern kann es sich um monoklonale oder polyklonale Antikörper handeln. Andere Moleküle, die in der Lage sind, sich spezifisch zu binden, können zum Beispiel antigenbindende Fragmente von Antikörpern sein, wie beispielsweise Fab-Fragmente, RNA-Moleküle oder Polypeptide. Bindeagenzien können isoliert oder in Kombination verwendet werden. Mittels Kombination ist es möglich, einen höheren Grad an Empfindlichkeit zu erzielen.
Die für die Methoden gemäß der vorliegenden Offenbarung nützlichen Antikörper können weitere Bindungsstellen entweder für therapeutische Agenzien oder andere Polypeptide umfassen, oder können an diese therapeutischen Agenzien oder Polypeptide gekoppelt sein. Therapeutische Agenzien können Medikamente, Toxine, Radionuklide sowie Derivate davon umfassen. Die Agenzien können zum Beispiel durch einen Linker oder eine Carrier-Gruppe entweder direkt oder indirekt an die Bindeagenzien gekoppelt sein. Die Funktion der Linker-Gruppe kann beispielsweise darin bestehen, die Kopplungsreaktion zwischen dem Bindeagens und dem therapeutischen oder anderen Agens zu aktivieren, oder der Linker kann als Spacer zwischen den verschiedenen Teilen des Fusionsmoleküls fungieren. Der Linker kann unter bestimmten Umständen auch spaltbar sein, um das gebundene Agens unter diesen Bedingungen freizusetzen. Die therapeutischen Agenzien können direkt oder mittels einer Linker-Gruppe kovalent an Carrier-Gruppen gekoppelt sein. Das Agens kann auch nicht-kovalent an den Carrier gekoppelt sein. Carrier, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel Albumine, Polypeptide, Polysaccharide oder Liposome.
Der Antikörper kann an ein oder mehrere Agenzien gekoppelt sein. Die an einen Antikörper gekoppelten multiplen Agenzien können alle von derselben Spezies oder mehrere verschiedene Agenzien sein, die an einen Antikörper gebunden sind.
Die Offenbarung betrifft ebenfalls ein transgenes, nicht-humanes Tier, wie zum Beispiel transgene Mäuse, Ratten, Hamster, Hunde, Affen, Kaninchen, Schweine, Caenorhabditis elegans und Fische, wie zum Beispiel Torpedofische, die ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor der Erfindung umfassen, wobei besagtes Nukleinsäuremolekül oder besagter Vektor vorzugsweise dauerhaft in das Genom dieses nicht-humanen Tiers integriert werden kann, und zwar vorzugsweise so, dass das Vorhandensein des besagten Nukleinsäuremoleküls oder Vektors zur Expression des Lungentumor-assoziiierten Marker-Polypeptids (oder verwandten Polypeptids) führt, oder anderweitig vorübergehend innerhalb des nicht-humanen Tiers exprimiert werden kann. Besagtes Tier kann eine oder mehrere Kopien der gleichen oder verschiedenen Nukleinsäuremoleküle besitzen, welche eine oder mehrere Formen des erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Markerpolypeptids oder mutanten Formen davon kodieren. Dieses Tier ist in mehrfacher Hinsicht nützlich, unter anderem als Forschungsmodell für die Regulierung der Zellproliferation und -differenzierung und stellt daher ein neuartiges und wertvolles Tier für die Entwicklung von Therapien, Behandlungen usw. von Krankheiten dar, die durch Mangel oder Fehlen des mit Lungentumor-assoziierten Markerproteins verursacht werden, das an der Entwicklung von Lungentumoren beteiligt ist. In diesem Falle handelt es sich bei dem nicht-humanen Säugetier vorzugsweise um ein Labortier, wie zum Beispiel eine Maus oder Ratte.
Das transgene nicht-humane Tier umfasst außerdem vorzugsweise mindestens ein inaktiviertes Wildtyp-Allel des entsprechenden Gens, welches das erfindungsgemäße Lungentumor-assoziierte Polypeptid kodiert. Diese Ausführungsform ermöglicht zum Beispiel die Untersuchung der Interaktion verschiedener mutanter Formen der Lungentumor-assoziierte Markerpolypeptide beim Einsetzen der klinischen Symptome der mit der Regulierung der Zellproliferation und -differenzierung zusammenhängenden Erkrankung. Alle Anwendungen, die hier zuvor im Hinblick auf ein transgenes Tier erörtert wurden, gelten ebenfalls für Tiere, die zwei, drei oder mehrere Transgene tragen. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, die Lungentumor-assoziierte Markerprotein-Expression oder -Funktion in einer bestimmten Phase der Entwicklung und/oder des Lebens des transgenen Tiers zu inaktivieren. Die kann erreicht werden, indem zum Beispiel gewebespezifische, Entwicklungs- und/oder zellregulierte und/oder induzierbare Promoter verwendet werden, welche die Expression zum Beispiel eines Antisense-Nukleotids oder Ribozyms antreiben, das gegen das RNA-Transkript gerichtet ist, welches die den erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Marker kodierende mRNA kodiert; siehe auch supra. Ein geeignetes, induzierbares System ist zum Beispiel die durch Tetrazyklin regulierte Genexpression, wie sie beispielsweise durch Gossen und Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547–5551) sowie Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58–62) beschrieben wird. Auf ähnliche Weise kann die Expression des mutanten Lungentumor-assoziierten Proteins durch solche regulatorischen Elemente gesteuert werden.
Des Weiteren betrifft die Offenbarung ebenfalls eine transgene Säugetierzelle, die ein Nukleinsäuremolekül oder einen Teil davon enthält (vorzugsweise dauerhaft oder vorübergehend in sein Genom eingebracht), wobei die Transkription und/oder Expression des Nukleinsäuremoleküls oder eines Teils davon zur Reduzierung der Synthese eines Lungentumor-assoziierten Markerproteins führt. Die Reduzierung kann durch einen Antisense, Sinn, ein Ribozym, eine Co-Suppression und/oder einen dominanten mutierenden Effekt erreicht werden. „Antisense" und „Antisense-Nukleotide" steht für DNA- oder RNA-Konstrukte, welche die Expression des natürlich vorkommenden Genprodukts blockieren. Die native Nukleinsäuresequenz, die für das Lungentumor-assoziierte Markerpolypeptid kodiert, kann durch eine Variante besagter Nukleinsäuresequenz verändert oder ersetzt werden, zum Beispiel mittels Rekombination, wodurch das Lungentumor-assoziierte Markergen funktionslos gemacht wird. Somit kann ein Organismus, der nicht über die Aktivität eines Lungentumor-assoziierten Markerpolypeptids verfügt, durch Knock-Out-Experimente produziert werden.
Die Bereitstellung des Nukleinsäuremoleküls gemäß der Offenbarung eröffnet die Möglichkeit, transgene nicht-humane Tiere mit einem reduzierten Level des Lungentumor-assoziierten Markerproteins zu produzieren, wie vorstehend beschrieben und somit mit einem Defekt in der Regulierung der Zellproliferation und -differenzierung. Die Techniken, um dies zu erreichen, sind dem Fachmann bekannt. Diese beinhalten zum Beispiel die Expression von Antisense-RNA, Ribozymen, von Molekülen, die Antisense- und Ribozym-Funktionen miteinander kombinieren und/oder von Molekülen, die für einen Co-Suppressionseffekt sorgen. Wird der Antisense-Ansatz für die Reduzierung der Menge der Lungentumor-assoziierten Markerproteine in Zellen verwendet, ist das die Antisense-RNA kodierende Nukleinsäuremolekül im Hinblick auf die für die Transformation verwendete Tierspezies vorzugsweise homologen Ursprungs. Es ist jedoch ebenfalls möglich, Nukleinsäuremoleküle zu verwenden, die einen hohen Grad an Homologie mit endogen vorkommenden Nukleinsäuremolekülen aufweisen, welche ein Lungentumor-assoziiertes Markerprotein kodieren. In diesem Fall ist die Homologie vorzugsweise höher als 80%, besonders höher als 90% und vorzugsweise höher als 95%. Die Reduzierung der Synthese eines Polypeptids in den transgenen Säugetierzellen kann zu einer Veränderung führen, wie zum Beispiel einem Abbau der endogenen Proteine. Bei transgenen Tieren, die über solche Zellen verfügen, kann dies zu verschiedenen physiologischen, Entwicklungs- und/oder morphologischen Veränderungen führen.
Somit betrifft die vorliegende Offenbarung ebenfalls transgene nicht-humane Tiere, die über die vorstehend beschriebenen transgenen Zellen verfügen. Diese können zum Beispiel aufgrund des dauerhaften oder vorübergehenden Vorhandenseins einer fremden DNA einen Mangel in der Regulierung der Zellproliferation und/oder -differenzierung im Vergleich zu Wildtyp-Tieren aufweisen, was zu mindestens einer der folgenden Eigenschaften führt:

(a) Unterbrechung eines endogenen Gens/von endogenen Genen, welches/welche den erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Marker kodiert/kodieren;
(b) Expression mindestens einer Antissense-RNA und/oder eines Ribozyms gegen ein Transkript, das ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst;
(c) Expression einer Sense- und/oder nicht translatierbaren mRNA des Nukleinsäuremoleküls der Erfindung;
(d) Expression eines Antikörpers der Erfindung;
(e) Inkorporation einer funktionalen oder nicht funktionalen Kopie der regulatorischen Sequenz der Erfindung; oder
(f) Inkorporation eines rekombinanten DNA-Moleküls oder Vektors der Erfindung.

Methoden zur Erzeugung eines transgenen nicht-humanen Tiers, vorzugsweise einer transgenen Maus, sind dem Fachmann bekannt. Diese Methoden umfassen zum Beispiel das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls oder Vektors der Erfindung in eine Keimzelle, eine Elastomere, Stammzelle, ein Ei oder eine daraus abstammende Zelle. Das nicht-humane Tier kann für eine Screening-Methode verwendet werden und kann ein nicht-transgenes gesundes Tier sein, oder kann an einer Funktionsstörung leiden, vorzugsweise einer Funktionsstörung, die durch mindestens eine Mutation im Lungentumor-assoziierten Markerprotein verursacht wurde. Solche transgenen Tiere sind beispielsweise hervorragend für pharmakologische Medikamentenstudien in Zusammenhang mit mutanten Formen des vorstehend beschriebenen Lungentumor-assoziierten Marker-Polypeptids geeignet. Die Produktion transgener Embryos und deren Screening können so durchgeführt werden, wie zum Beispiel von A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press, beschrieben. Die DNA der Embryonalhülle von Embryos kann zum Beispiel unter Verwendung der Southern-Blot-Techniken mit einer entsprechenden Sonde, Amplifikationstechniken auf der Grundlage von Nukleinsäuren (z. B. PCR) etc. analysiert werden; siehe supra.
Ein weiterer Aspekt des vorliegenden Dokuments ist eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung bei der Behandlung von Funktionsstörungen, die mit abnormaler Zellproliferation zusammenhängen. Die Polypeptide, Polynukleotide und Bindeagenzien (besonders Antikörper) können in pharmazeutische oder immunogene Zusammensetzungen eingebaut werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf jede geeignete Weise verabreicht werden, die dem Fachmann bekannt ist. Die Verabreichung kann zum Beispiel aus einer Injektion, wie beispielsweise intrakutaner, intramuskulärer, intravenöser oder subkutaner Injektion, einer intranasalen Verabreichung, zum Beispiel mittels Einatmen oder einer oralen Verabreichung bestehen. Um den pharmazeutischen Nutzen der Behandlung sicherzustellen, sollte eine geeignete Dosis gemäß der Parameter gewählt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie zum Beispiel Alter, Geschlecht, Körpergewicht etc. des Patienten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen besagte Verbindungen sowie einen physiologisch verträglichen Carrier. Die Art des Carriers, der für die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, ist von der Verabreichungsart abhängig. Für eine parenterale Verabreichung, wie zum Beispiel eine subkutane Injektion, setzt sich der Carrier vorzugsweise aus Wasser, Salzlösung, Alkohol, einem Lipid, einem Wachs und/oder einem Puffer zusammen. Für eine orale Verabreichung kann jeder der zuvor aufgeführten Carrier oder ein fester Carrier verwendet werden, wie zum Beispiel Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glukose, Saccharose und/oder Magnesiumkarbonat. Biologisch abbaubare Mikrospheren (z. B. Polylaktidglykolid) können ebenfalls als Carrier für die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete biologisch abbaubare Mikrospheren werden zum Beispiel in den U.S.-Patenten Nr. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Impfstoff kann zum Beispiel DNA enthalten, die für eine oder mehr Polypeptide gemäß des vorliegenden Dokuments kodiert. Die DNA kann auf eine Weise verabreicht werden, die es ermöglicht, dass Polypeptide in situ erzeugt werden. Geeignete Expressionssysteme sind dem Fachmann bekannt. Bei den Nukleinsäuren kann es sich zum Beispiel um Antisene-Konstrukte handeln. Pharmazeutische Zusammensetzungen können ebenfalls Nukleinsäuremoleküle umfassen, die in einem Säugetier- oder humanen Wirtssystem exprimierbar sind, das ein virales oder anderes Expressionssystem umfasst, wie zum Beispiel ein adenovirales Vektorsystem.
Die Nukleinsäure kann ebenfalls als „nackte" Nukleinsäure verabreicht werden. In diesem Falle kann eine entsprechende physikalische Darreichungsform verwendet werden, welche die Aufnahme von Nukleinsäure verbessert, wie zum Beispiel Beschichtung der Nukleinsäure auf biologisch abbaubare Beads, welche wirkungsvoll in die Zellen transportiert werden. Die Verabreichung von „nackten" Nukleinsäuren kann zum Beispiel für eine vorübergehende Expression innerhalb eines Wirts oder einer Wirtszelle von Nutzen sein.
Alternativ hierzu können die pharmazeutischen Zusammensetzungen ein oder mehrere Polypeptide umfassen. Bei den in die pharmazeutischen Zusammensetzungen eingebauten Polypeptiden kann es sich um Lungentumor-assoziierte Polypeptide handeln. Das Polypeptid kann optional in Kombination mit einem oder mehreren anderen bekannten Polypeptiden verabreicht werden, wie zum Beispiel Enzymen, Antikörpern, regulatorische Faktoren, wie beispielsweise Zykline, Zyklin-abhängigen Kinasen oder CKIs, oder Toxinen.
Polypeptide des vorliegenden Dokuments oder Fragmente davon, die einen immunogenen Teil des Lungentumor-assoziierten Proteins umfassen, können in immunogenen Zusammensetzungen verwendet werden, in denen das Polypeptid beispielsweise die patienteneigene Immunreaktion auf Tumorzellen stimuliert. Ein Patient kann unter einer Erkrankung leiden, oder frei von einer erkennbaren Erkrankung sein. Dementsprechend können die hier offenbarten Verbindungen verwendet werden, um Krebs zu behandeln oder die Entwicklung von Krebs zu hemmen. Die Verbindungen können entweder vor oder nach einer konventionellen Tumorbehandlung verabreicht werden, wie zum Beispiel chirurgische Entfernung von Primärtumoren, Strahlenbehandlung, konventionelle Chemotherapie oder jegliche andere Behandlungsmethode des entsprechenden Krebses oder dessen Vorstufen.
Immunogene Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Impfstoffe, können ein oder mehrere Polypeptide sowie einen unspezifischen Verstärker der Immunreaktion umfassen, wobei der unspezifische Verstärker der Immunreaktion in der Lage ist, eine Immunreaktion auf ein exogenes Antigen auszulösen oder zu verstärken. Jeder geeignete Verstärker der Immunreaktion kann in den Vakzinen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. So kann zum Beispiel ein Adjuvans zugesetzt werden. Die meisten Adjuvanzien enthalten eine Substanz, die das Antigen vor schnellem Abbau schützen soll, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid oder Mineralöl sowie ein unspezifisches Stimulanz der Immunreaktion, wie beispielsweise Lipid A, Bordetella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis. Solche Adjuvanzien sind kommerziell erhältlich, wie zum Beispiel Freunds inkomplettes Adjuvans und komplettes Adjuvans (Difco Laborstories, Detroit, Mich.) und Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.).
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe können ebenfalls weitere Epitope von Tumorantigenen enthalten, entweder in ein Fusionsprotein eingebaut, wie zuvor beschrieben (d. h. ein einzelnes Polypeptid, das mehrere Epitope enthält) oder innerhalb eines separaten Polypeptids vorhanden.
Durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnete Funktionsstörungen, wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, können zum Beispiel Neoplasmen umfassen, wie benigne und maligne Tumore, Karzinome, Sarkome, Leukämien, Lymphome oder Dysplasien. Tumore können folgende Tumore umfassen: Tumore des Kopfes und des Halses, Tumore des Respirationstrakts, Tumore des Gastrointestinaltrakts, Tumore der Harnorgane, Tumore des Fortpflanzungssystems, Tumore des endokrinen Systems, Tumore des Zentral- und peripheren Nervensystems, Tumore der Haut und Hautanhangsgebilde, Tumore der Weichteile und Knochen, Tumore des lymphopoetischen und hämopoetischen Systems, Brustkrebs, kolorektales Karzinom, anogenitales Karzinom etc.
In der Erfindung handelt es sich bei den Funktionsstörungen um Lungentumore. Lungentumore gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Zustände des Respirationstraktes, die durch abnormale Wachstumseigenschaften der Zellen oder des Gewebes im Vergleich zu den Wachstumseigenschaften normaler Kontrollzellen oder normalen Kontrollgewebes charakterisiert sind. Das Wachstum der Zellen oder des Gewebes kann zum Beispiel abnormal beschleunigt oder abnormal reguliert sein. Eine abnormale Regulierung, wie zuvor verwendet, kann jede Form des Vorhandenseins oder Fehlens von Nicht-Wildtyp-Reaktionen der Zellen oder des Gewebes auf natürlich vorkommende wachstumsregelnde Einflüsse sein. Die Abnormalitäten im Wachstum der Zellen oder des Gewebes können zum Beispiel neoplastisch oder hyperplastisch sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Lungentumoren um Krebs oder präkanzeröse Zustände des Respirationstraktes.
Eine Probe gemäß der Methode der vorliegenden Erfindung ist jegliche Probe, die Zellen, Gewebe oder Körperflüssigkeiten enthalten kann. Des Weiteren kann jede Probe, die potenziell die nachzuweisenden Marken-Moleküle enthält, eine Probe gemäß der vorliegenden Erfindung sein. Solche Proben sind zum Beispiel Blut, Plasma, Serum, Abstriche, Lavagen, Sputum, Zell- und Gewebeproben oder Biopsien.
Biopsien, so wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, können zum Beispiel Resektionsproben von Tumoren, endoskopischerhaltene Gewebeproben oder Nadelbiopsien sein. Des Weiteren kann jede Probe, die potenziell die nachzuweisenden Marker-Moleküle enthält, eine Probe gemäß der vorliegenden Erfindung sein.
Die Methode zum Nachweis des Polynukleotid- oder Polypeptidlevels gemäß der vorliegenden Erfindung ist jegliche Methode, die geeignet ist, sehr kleine Mengen spezifischer Moleküle in Proben nachzuweisen. Die Nachweisreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel ein Nachweis entweder auf der Ebene von Nukleinsäuren oder auf der Ebene von Polypeptiden sein. Beim Nachweis kann es sich entweder um einen Nachweis des Polypeptid- oder Nukleinsäurelevels in intakten Zellen oder in Zelllysaten handeln, oder um einen Nachweis des Polypeptid- oder Nukleinsäurelevels in ausgeprägten subzellulären Regionen. Die Methoden zur Bestimmung der subzellulären Verteilung von Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. In einer Ausführungsform der Erfindung kann der Nachweis der Markermoleküle den Nachweis von bestimmten Splicing-Varianten umfassen. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Nachweismethode den Nachweis der Methylierung von Nukleinsäuremolekülen in Proben umfassen.
Anwendbare Formate für die Nachweisreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung können Blotting-Techniken wie zum Beispiel Western Blot, Southern Blot, Northern Blot sein. Die Blotting-Techniken sind dem Fachmann bekannt und können zum Beispiel als Elektroblots, Semidry-Blots, Vakuumblots oder Dot Blots durchgeführt werden. Des Weiteren können immunologische Methoden zum Nachweis von Molekülen angewendet werden, wie zum Beispiel Immunpräzipitation oder immunologische Assays, wie ELISA, RIA, Lateral Flow Assays etc.
Methoden zum Nachweis der Methylierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt und können zum Beispiel Methoden der chemischen Vorbehandlung der Nukleinsäuren, beispielsweise mit Natriumhydrogensulfit, Permanganat oder Hydrazin, sowie einen nachfolgenden Nachweis der Veränderung mittels spezifischen Restriktionsendonukleasen oder mittels spezifischer Sonden, beispielweise im Verlauf einer Amplifikationsreaktion, umfassen. Der Nachweis der Methylierung kann des Weiteren unter Verwendung von methylierungsspezifischen Restriktionsendonukleasen durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis des Markermoleküllevels durch den Nachweis des Nukleinsäurelevels durchgeführt, die für die Markermoleküle oder Fragmente davon kodieren, die in der Probe vorhanden sind. Die Mittel für den Nachweis der Nukleinsäuremoleküle sind dem Fachmann bekannt. Der Nachweis von Nukleinsäuren kann zum Beispiel durch eine Bindungsreaktion des nachzuweisenden Moleküls an komplementäre Nukleinsäuresonden durchgeführt werden, Proteine mit Bindungsspezifität für die Nukleinsäuren oder jegliche anderen Entitäten, die besagte Nukleinsäuren spezifisch erkennen und sich an diese binden. Diese Methode kann sowohl in vitro als auch direkt in situ, zum Beispiel im Verlauf einer Nachweisfärbereaktion, durchgeführt werden. Eine andere Art, die Markermoleküle in einer Probe auf der Ebene der Nukleinsäuren nachzuweisen, die in der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, ist eine Amplifikationsreaktion von Nukleinsäuren, die quantitativ durchgeführt werden kann, wie zum Beispiel PCR, LCR oder NASBA.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis des Markermoleküllevels durch die Bestimmung des Expressionslevels eines Proteins durchgeführt. Die Bestimmung der Markermoleküle auf der Proteinebene kann zum Beispiel in einer Reaktion durchgeführt werden, die ein spezifisches Bindeagens für den Nachweis der Markermoleküle umfasst. Diese Bindeagenzien können zum Beispiel Antikörper sowie antigenbindende Fragmente, bifunktionelle Hybridantikörper, minimal antigenbindende Epitope enthaltende Peptidomimetika etc. umfassen. Die Bindeagenzien können in vielen verschiedenen Nachweistechniken verwendet werden, zum Beispiel Western Blot, ELISA, Lateral Flow Assay, Latexagglutination, immunchromatografische Streifen oder Immunpräzipitation. Generell kann ein auf einem Bindeagens basierender Nachweis sowohl in vitro als auch direkt in situ, zum Beispiel im Verlauf einer immunzytochemischen Färbereaktion, durchgeführt werden. Jegliche andere, zur Bestimmung der Menge bestimmter Polypeptide in Lösungen biologischer Proben geeignete Methode, wie zum Beispiel biochemische, chemische, physikalische oder physikochemische Methoden, kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Markerlevel ist im Vergleich zu einer nicht-tumorösen Testprobe signifikant erhöht. In diesem Fall ist der Marker in der Probe überexprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Level bestimmter Splicing-Varianten des Markergens in den Testproben im Vergleich zum Wildtyp-Gewebe verändert. Dies kann zu veränderten Levels von Splicing-Varianten, neuen Splicing-Varianten, Neopeptiden, veränderten Ratios unterschiedlicher Splicing-Varianten von Genen führen.
Der Nachweis des Levels der molekularen Marker gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Nachweis des Levels einzelner Markermoleküle in getrennten Reaktionsansätzen sowie der gleichzeitige Nachweis einer Kombination von Markern sein. Die Kombination kann die hier offenbarten molekularen Marker umfassen und zusätzlich weitere, für den Nachweis von Tumoren nützliche Markermoleküle umfassen.
Der Nachweis kann in Lösung oder unter Verwendung von festphasengebundenen Reagenzien durchgeführt werden. Der Nachweis eines oder mehrerer molekularen Marker kann in einer einzelnen Reaktionsmischung oder in zwei oder getrennten Reaktionsmischungen durchgeführt werden. Die Nachweisreaktionen für mehrere Markermoleküle können zum Beispiel gleichzeitig in Multi-Well-Reaktionsgefäßen erfolgen. Die für die hier offenbarten Lungentumore charakteristischen Marker können unter Verwendung von Reagenzien nachgewiesen werden, die speziell diese Moleküle erkennen. Gleichzeitig können ein oder mehrere weitere Marker unter Verwendung von Reagenzien nachgewiesen werden, die diese speziell erkennen. Die Nachweisreaktion für jeden einzelnen Marker kann eine oder mehrere Reaktionen mit Nachweisagenzien umfassen, die entweder die ursprünglichen Markermoleküle erkennen, oder vorzugsweise Moleküle erkennen, die zum Erkennen anderer Moleküle verwendet werden. Solch eine Reaktion kann zum Beispiel die Verwendung von primären und sekundären sowie weiteren Antikörpern umfassen. Die Nachweisreaktion kann weiter eine Nachweisreaktion umfassen, die den Level der erfindungsgemäßen, mit Lungentumoren assoziierten Polypeptide anzeigt. Bei der Nachweisreaktion kann es sich zum Beispiel um eine Reaktion handeln, die eine gefärbte Verbindung, eine Biolumineszenzreaktion, eine Fluoreszenzreaktion, generell eine Strahlung aussendende Reaktion etc. produziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Nachweis von Markergenprodukte exprimierendem Gewebe in Form molekularer bildgebender Verfahren durchgeführt. Die jeweiligen Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Bei den bildgebenden Verfahren im Kontext der vorliegenden Erfindung kann es sich zum Beispiel um MRI, SPECT, PET sowie andere für eine In-vivo-Bildgebung geeignete Methoden handeln.
In einer Ausführungsform kann die Methode auf der enzymatischen Konversion von inerten oder markierten Verbindungen zu Molekülen basieren, die im Verlauf der molekularen bildgebenden Methoden durch die Markermoleküle nachweisbar sind.
Die offenbarten Markermoleküle können zur Diagnose, Überwachung des Krankheitsverlaufs sowie zur Prognose von Lungentumoren verwendet werden.
Die Diagnose von mit der Expressionen des Gens zusammenhängenden Funktionsstörungen, wie hier verwendet, kann zum Beispiel den Nachweis von Zellen oder Gewebe umfassen, welche(s) von abnormalem Wachstum betroffen sind/ist. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet Diagnose den primären Nachweis einer Erkrankung in einem Organismus oder in einer Probe. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Methode für die Diagnose von Lungentumoren in routinemäßigen Screening-Tests für vorbeugende Aspekte angewendet werden, um besagte Erkrankung in einer frühen Phase des Einsetzens der Funktionsstörung nachzuweisen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die diagnostische Methode verwendet werden, um die Minimal Residual Disease eines Tumors nach einer Primärtherapie zu bestimmen. In dieser Hinsicht kann die Methode der Erfindung angewendet werden, um gemäß der vorliegenden Erfindung Zellen in Körperproben zu bestimmen, die eine für Lungentumore charakteristische abnormale Expression der Markermoleküle aufweisen. Somit kann eine Ausbreitung der betroffenen Zellen in Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die hier offenbarten Methoden für den Nachweis und die Identifizierung von Metastasen verwendet werden. Die Methode kann entweder für den Nachweis von Metastasen in Körpergewebe oder Organen durch die hier beschriebenen Nachweismethoden verwendet werden, oder die Metastasen können im Hinblick auf die Prognose und Vorhersage des Krankheitsverlaufs diagnostiziert werden.
Die Überwachung des Krankheitsverlaufs kann die Bestimmung der Markermoleküllevel zu verschiedenen Zeitpunkten, den Vergleich dieser Levels zu den verschiedenen Zeitpunkten sowie die Beurteilung einer Diagnose über die Weiterentwicklung der Erkrankung über den abgedeckten Zeitraum hinweg umfassen. Somit kann die Überwachung die Beurteilung der Prognose und/oder das Konzept einer entsprechenden Therapie für einen bestimmten Patienten ermöglichen.
Die Prognose des Krankheitsverlaufs von Lungentumoren kann die Bestimmung des Expressionslevels eines oder mehrerer Markermoleküle, den Vergleich der Levels mit Daten aus darauffolgenden Studien in einer Datenbank sowie die Vorhersage des Krankheitsverlaufs anhand dieses Vergleichs umfassen. Die Methode kann den Nachweis der Levels eines Satzes Markermoleküle umfassen, deren unterschiedliche Levels unterschiedliche Phasen im Krankheitsverlauf charakterisieren können. Die Kombination der Levels einer Kombination von Markern kann ein Anzeichen für die Prognose des weiteren Krankheitsverlaufs sein und kann die Grundlage für das Konzept einer entsprechenden Therapie schaffen.
Die vorliegende Erfindung liefert außerdem Kits, wie in den beigefügten Patentansprüchen beschrieben, zur Verwendung beispielsweise bei Forschungs- oder Diagnosemethoden. Solche Kits können zwei oder mehr Komponenten zur Durchführung eines wissenschaftlichen oder diagnostischen Assays enthalten. Komponenten können Verbindungen, Reagenzien, Behälter und/oder Geräte sein. Eine Komponente kann ein Antikörper oder ein Fragment davon sein, der sich spezifisch an ein mit Lungentumoren zusammenhängendes Polypeptid bindet. Das Kit kann zusätzlich Reagenzien, Puffer oder anderes beinhalten, das dem Fachmann als notwendig für die Durchführung des diagnostischen Assays bekannt ist. Alternativ dazu kann das Forschungskit oder diagnostische Kit Nukleotidsonden oder Primer für den Nachweis von DNA oder RNA enthalten. Solch ein Kit sollte entsprechende zusätzliche, dem Fachmann bekannte Reagenzien und Puffer enthalten.
Ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Folgendes:

a) Reagenzien für den Nachweis der molekularen Markermoleküle
b) die Reagenzien und Puffer, die üblicherweise zur Durchführung einer Nachweisreaktion verwendet werden, wie zum Beispiel Puffer, Nachweismarker, Carrier-Substanzen und andere.

Das Reagenz für den Nachweis der Marker umfasst jegliches Agens, das sich an das Markermolekül binden kann. Solche Reagenzien können Proteine, Polypeptide, Nukleinsäuren, Glykoproteine, Proteoglykane, Polysaccharide oder Lipide umfassen.
Die Probe zur Durchführung einer positiven Kontrolle kann zum Beispiel Nukleinsäuren in anwendbarer Form, wie zum Beispiel Lösung oder Salz, Peptide in anwendbarer Form, Proben von Gewebesektionen oder positive Zellen umfassen, welche die mit Lungentumoren zusammenhängenden Moleküle exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt der Nachweis der Markermoleküle auf der Ebene der Polypeptide. In dieser Ausführungsform kann es sich bei den Bindeagenzien zum Beispiel um für die Markermoleküle oder deren Fragmente spezifische Antikörper handeln.
In einer anderen Ausführungsform des Testkits erfolgt der Nachweis der Markermoleküle auf der Ebene der Nukleinsäure. In dieser Ausführungsform der Erfindung kann es sich bei den Reagenzien für den Nachweis zum Beispiel um Nukleinsäuresonden oder Primer handeln, die komplementär zu besagten Markermolekül-Nukleinsäuren sind.
Die Lungentumor-assoziierten Polypeptide und/oder Polynukleotide können gemäß des vorliegenden Dokuments für eine Impfung gegen zellproliferative Funktionsstörungen verwendet werden. Impfung kann die Verabreichung einer immunogenen Verbindung an ein Individuum zum Zweck der Stimulation einer Immunreaktion sein, die gegen besagte immunogene Verbindung gerichtet ist und somit besagtes Individuum gegen besagte immunogene Verbindung immunisiert. Die Stimulation einer Immunreaktion kann die Auslösung der Produktion von Antikörpern gegen besagte Verbindung sowie die Stimulation zytotoxischer T-Zellen umfassen. Zum Zwecke der Impfung können die Polypeptide, Nukleinsäuren und Bindeagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung in einer physiologisch annehmbaren Form verabreicht werden. Die an Individuen zu verabreichende Zusammensetzung kann ein oder mehrere antigene Komponenten, physiologisch annehmbare Carrier-Substanzen oder Pufferlösungen, Immunstimulanzien und/oder Adjuvanzien umfassen. Adjuvanzien können zum Beispiel Freunds inkomplettes Adjuvans oder Freunds komplettes Adjuvans umfassen, das dem Fachmann bekannt ist.
Die Zusammensetzung kann auf jede anwendbare Weise verabreicht werden, wie zum Beispiel intravenös, subkutan, intramuskulär etc. Die Dosis der Zusammensetzung hängt von dem besonderen Fall und dem Zweck der Impfung ab. Die Dosis muss an die Parameter des behandelten Individuums angepasst werden, wie zum Beispiel Alter, Gewicht, Geschlecht etc. Des Weiteren muss der Typ der auszulösenden Immunreaktion berücksichtigt werden. Generell kann es besser sein, wenn ein Individuum 100 μg–1 g eines Polypeptids oder 10⁶–10¹² MOI einer rekombinanten Nukleinsäure erhält, die eine Nukleinsäure gemäß des vorliegenden Dokuments in einer Form enthält, die in situ exprimiert werden kann.
Individuen zum Zwecke der Impfung können jegliche Organismen sein, welche die Lungentumor-assoziierten Polypeptide und/oder Polynukleotide enthalten und von zellproliferativen Funktionsstörungen betroffen werden können.
Eine Impfung von Individuen kann zum Beispiel bei veränderten, Nicht-Wildtyp-Sequenzen oder einer Struktur der Markermoleküle, die mit den zellproliferativen Funktionsstörungen zusammenhängt, vorteilhaft sein.
Polypeptide können ebenfalls bei einer adoptiven Immuntherapie zur Behandlung von Krebs verwendet werden. Eine adoptive Immuntherapie kann grob in eine aktive oder passive Immuntherapie eingeteilt werden. Bei der aktiven Immuntherapie baut die Behandlung auf die In-vivo-Stimulation des Immunsystems des endogenen Wirts, mit der Verabreichung von Immunreaktion-modifizierenden Agenzien (zum Beispiel Tumorvakzine, bakterielle Adjuvanzien und/oder Zytokine) gegen Tumore zu reagieren.
Bei der passiven Immuntherapie beinhaltet die Behandlung die Darreichung biologischer Reagenzien mit festgelegter Tumor-Immunreaktivität (wie zum Beispiel Effektorzellen oder Antikörper), die direkt oder indirekt Antitumor-Effekte vermitteln können, und hängt nicht unbedingt von einem intakten Immunsystem des Wirts ab. Beispiele für Effektorzellen sind unter anderem T-Lymphozyten (zum Beispiel, CD8+ zytotoxische T-Lymphozyte, CD4+ T-Helfer, tumorinfiltrierende Lymphozyten), Killerzellen (wie zum Beispiel natürliche Killerzellen, Lymphokin-aktivierte Killerzellen), B-Zellen oder Antigen-präsentierende Zellen (wie zum Beispiel dendritische Zellen und Makrophagen), welche die offenbarten Antigene exprimieren. Die hier offenbarten Polypeptide können ebenfalls verwendet werden, um Antikörper oder anti-idiotypische Antikörper (wie in U.S. Pat. Nr. 4,918,164 ) für eine passive Immuntherapie zu erzeugen.
Die vorherrschende Methode der Beschaffung einer entsprechenden Anzahl von T-Zellen für eine adoptive Immuntherapie besteht darin, Immun-T-Zellen in vitro zu züchten. Kulturbedingungen, um aus einzelnen Antigen-spezifischen T-Zellen mehreren Milliarden mit Beibehaltung der Antigen-Erkennung in vivo zu gewinnen, sind dem Fachmann bekannt. Bei diesen In-vitro-Kulturbedingungen wird typischerweise eine zeitweilige Stimulation mit Antigen benutzt, oft in Anwesenheit von Zytokinen, wie zum Beispiel IL-2, sowie nicht teilende Feederzellen. Wie zuvor angemerkt, können die hier beschriebenen immunreaktiven Polypeptide verwendet werden, um Antigen-spezifische T-Zell-Kulturen schnell zu vergrößern, damit eine ausreichende Zahl an Zellen für die Immuntherapie erzeugt wird. Insbesondere können Antigen-präsentierende Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen, Makrophagen oder B-Zellen unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standard-Techniken mit immunreaktiven Polypeptiden gepulst oder mit (einer) Nukleinsäuresequenz(en) transfiziert werden. Antigen-präsentierende Zellen können zum Beispiel mit einer Nukleinsäuresequenz transfiziert werden, wobei besagte Sequenz eine für die Steigerung der Expression geeignete Promoter-Region enthält und können als Teil eines rekombinanten Virus oder anderen Expressionssystems exprimiert werden. Damit kultivierte T-Zellen bei einer Therapie wirksam sein können, müssen die kultivierten T-Zellen wachsen und sich weit ausbreiten können, um langfristig in vivo überleben zu können. Studien haben gezeigt, dass kultivierte T-Zellen veranlasst werden können, in vivo zu wachsen und langfristig in beträchtlicher Zahl mittels wiederholter Stimulation mit einem mit IL-2 ergänzten Antigen überleben zu können (siehe zum Beispiel Cheever, M., et al, "Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited," Immunological Reviews, 157: 177, 1997).
Die hier offenbarten Polypeptide können ebenfalls verwendet werden, um Tumor-reaktive T-Zellen zu erzeugen und/oder zu isolieren, die anschließend dem Patienten verabreicht werden können. Bei einer Technik können Antigen-spezifische T-Zelllinien durch In-vivo-Immunisierung mit kurzen Peptiden erzeugt werden, die den immunogenen Teilen der offenbarten Polypeptide entsprechen. Die daraus resultierenden Antigen-spezifischen CD8+ CTL-Klone können aus dem Patienten isoliert, unter Verwendung standardmäßiger Gewebekulturtechniken expandiert und dem Patienten wieder verabreicht werden.
Alternativ dazu können den immunogenen Teilen der Polypeptide entsprechende Peptide verwendet werden, um Tumor-reaktive T-Zell-Subsets durch selektive In-vitro-Stimulation und Ausdehnung der autologen T-Zellen zu erzeugen, um Antigen-spezifische T-Zellen zu liefern, die anschließend auf den Patienten übertragen werden können, wie zum Beispiel von Chang et al. (Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22(3), 213, 1996) beschrieben. Zellen des Immunsystems, wie zum Beispiel T-Zellen, können aus dem Peripherblut eines Patienten unter Verwendung eines kommerziell verfügbaren Zellseparationssystems isoliert werden, wie zum Beispiel dem System CellPro Incorporated's (Bothell, Wash.) CEPRATE.^TM (siehe U.S. Pat. Nr. 5,240,856 ; U.S. Pat. Nr. 5,215,926 ; WO 89/06280 ; WO 91/16116 and WO 92/07243 ). Die separierten Zellen werden mit ein oder mehreren immunreaktiven Polypeptiden stimuliert, die in einem Vektor wie zum Beispiel einer Mikrosphere enthalten sind, um Antigen-spezifische T-Zellen zu liefern. Die Population der Tumorantigen-spezifischen T-Zellen wird anschließend unter Verwendung von Standardtechniken expandiert und die Zellen werden dem Patienten wieder verabreicht.
In einer anderen Ausführungsform können Polypeptid-spezifische T-Zell- und/oder Antikörper-Rezeptoren geklont, expandiert und in andere Vektoren oder Effektorzellen transferiert werden, die bei der adoptiven Immuntherapie verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform können syngene oder autologe dendritische Zellen mit Peptiden gepulst werden, die mindestens einem immunogenen Teil eines hier offenbarten Polypeptids entsprechen. Die daraus resultierenden Antigen-spezifischen dendritischen Zellen können entweder in einen Patienten transferiert werden, oder zur Stimulation von T-Zellen verwendet werden, um Antigen-spezifische T-Zellen zu liefern, die wiederum einem Patienten verabreicht werden können. Die Verwendung von Peptid-gepulsten dendritischen Zellen zur Erzeugung Antigen-spezifischer T-Zellen und die anschließende Verwendung solcher Antigen-spezifischer T-Zellen zur Ausrottung von Tumoren in einem Mäusemodell wurden durch Cheever et al, Immunological Reviews, 157: 177, 1997 nachgewiesen.
Zusätzlich können die offenbarten Nukleinsäuren exprimierende Vektoren in Stammzellen eingebracht werden, die dem Patienten entnommen wurden und in vitro für eine autologe Transplantation zurück in den Körper des gleichen Patienten klonal propagiert werden.
Monoklonale Antikörper können ebenfalls als therapeutische Verbindungen verwendet werden, um Tumore zu verkleinern oder zu eliminieren. Die Antikörper können allein (zum Beispiel zur Hemmung von Metastasen) oder an ein oder mehrere therapeutische Agenzien gekoppelt verwendet werden. In dieser Hinsicht geeignete Agenzien umfassen Radionuklide, Differenzierungsinduktoren, Medikamente, Toxine und Derivate davon. Bevorzugte Radionuklide umfassen 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At und 212Bi. Bevorzugte Medikamente umfassen Methotrexat sowie Pyrimidin- und Purinanaloge. Bevorzugte Differenzierungsinduktoren umfassen Phorbolester und Buttersäure. Bevorzugte Toxine umfassen Rizin, Abrin, Diphtherietoxin, Choleraenterotoxin, Gelonin, Pseudomonas Exotoxin, Shigella Toxin sowie antivirales Protein der Kermesbeere.
Die Therapie von durch abnormale Zellproliferation gekennzeichnete Funktionsstörungen kann die Verabreichung von Antisense-Konstrukten oder Ribozymen umfassen. Die Methoden für die Verabreichung von Ribozymen oder Antisense-Konstrukten sind dem Fachmann bekannt. Die Verabreichung kann als Verabreichung von „nackten" Nukleinsäuren oder als Verabreichung von Nukleinsäuren erfolgen, die für die Expression der relevanten aktiven Produkte in situ geeignet sind.
Die Behandlung von Funktionsstörungen kann die Verabreichung von Bindeagenzien umfassen, die gegen die Lungentumor-assoziierten Moleküle gerichtet sind. Diese Bindeagenzien können zum Beispiel an andere Verbindungen wie Toxine, Enzyme, Radioisotope etc. gekoppelt sein.
Die Therapie von Funktionsstörungen, die mit einer abnormalen Expression der vorgestellten Lungentumor-assoziierten Moleküle zusammenhängen, kann die Verabreichung von Antagonisten oder Agonisten der Lungentumor-assoziierten Moleküle, von Bindungspartnern der Lungentumor-assoziierten Polypeptide, von Inhibitoren oder Enhancern der Expression der Lungentumor-assoziierten Polypeptide oder von durch Assays nachweisbaren Medikamenten umfassen, die die Messung der Aktivität der Lungentumor-assoziierten Polypeptide beinhalten. Die Methoden zur Identifizierung dieser Substanzen sind dem Fachmann bekannt.
Ein Beispiel für eine Methode zur Identifizierung eines Bindungspartners von Lungentumor-assoziierten Polypeptiden (oder verwandten Polypeptiden) und/oder Polynukleotiden kann Folgendes umfassen:

(a) das erfindungsgemäße Lungentumor-assoziierte Polypeptid der Erfindung mit einer zu untersuchenden Verbindung in Kontakt bringen, und
(b) Bestimmung, ob die Verbindung eine Aktivität des Polypeptids bewirkt.

Die Lungentumor-assoziierten Polypeptide können verwendet werden, um nach Proteinen oder anderen Verbindungen zu suchen, die sich an die Lungentumor-assoziierten Polypeptide binden oder nach Proteinen oder anderen Verbindungen zu suchen, an die sich die sich die Lungentumor-assoziierten Polypeptide binden. Die Bindung eines Lungentumor-assoziierten Polypeptids und des Moleküls kann die Aktivität des Lungentumor-assoziierten Polypeptids oder des gebundenen Moleküls aktivieren (Agonist), steigern, hemmen (Antagonist) oder verringern. Beispiele für solche Moleküle sind unter anderem Antikörper, Oligonukleotide, Proteine (z. B. Rezeptoren) oder kleine Moleküle.
Vorzugsweise stehen solche Moleküle in engem Zusammenhang mit dem natürlichen Ligand des Lungentumor-assoziierten Polypeptids, zum Beispiel einem Fragment des Liganden, oder einem natürlichen Substrat, einem Ligand, einem strukturellen oder funktionellen Mimetikum, siehe zum Beispiel Coligan, Current Protocols in Immunology 1(2) (1991); Kapitel 5. Das Molekül kann auch in engem Zusammenhang mit dem natürlichen Rezeptor stehen, an den sich das Lungentumor- assoziierte Polypeptid binden kann, oder mindestens mit einem Fragment des Rezeptors, das durch das Lungentumor-assoziierte Polypeptid (z. B. aktive Stelle) gebunden werden kann. In beiden Fällen kann das Molekül unter Verwendung der bekannten Techniken rationell konstruiert werden.
Vorzugsweise beinhaltet die Suche nach diesen Molekülen die Herstellung entsprechender Zellen, welche das Lungentumor-assoziierte Polypeptid entweder als abgesondertes Protein oder auf der Zellmembran exprimieren. Bevorzugte Zellen sind unter anderem Zellen von Säugetieren, Hefe, Drosophila oder E. coli. Das Lungentumor-assoziierte Polypeptid exprimierende Zellen (oder das exprimierte Polypeptid enthaltende Zellmembran) werden anschließend vorzugweise mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht, welche potenziell das Molekül enthält, um Bindung, Stimulation oder Hemmung der Aktivität des Lungentumor-assoziierten Polypeptids zu beobachten.
Mit dem Assay kann die Bindung einer Kandidatenverbindung an das Lungentumor-assoziierte Polypeptide einfach getestet werden, wobei die Bindung mittels eines Markers oder in einem Assay nachgewiesen wird, das einen Wettbewerb mit einem markierten Kompetitor beinhaltet. Mit dem Assay kann weiter getestet werden, ob die Kandidatenverbindung zu einem Signal führt, das durch die Bindung an das Lungentumor-assoziierte Polypeptid erzeugt wird.
Alternativ dazu kann das Assay unter Verwendung von zellfreien Präparationen, an einen festen Träger gebundenen Polypeptiden/Molekülen, chemischen Bibliotheken oder natürlichen Produktmischungen durchgeführt werden. Das Assay kann ebenfalls einfach folgende Schritte umfassen: Mischen einer Kandidatenverbindung mit einer Lösung, welche das Lungentumor-assoziierte Polypeptid enthält, Messen der Aktivität oder Bindung des Lungentumor-assoziierten Polypeptids sowie Vergleichen der Aktivität oder Bindung des Lungentumor-assoziierten Polypeptids mit einem Standard.
Der Level des Lungentumor-assoziierten Polypeptids oder die Aktivität in einer Probe (z. B. einer biologischen Probe) kann vorzugsweise mit einem ELISA-Assay unter Verwendung eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers gemessen werden. Der Antikörper kann das Level des Lungentumor-assoziierten Polypeptids oder die Aktivität messen, indem er sich entweder direkt oder indirekt an das Lungentumor-assoziierte Polypeptid bindet oder mit dem Lungentumor-assoziierten Polypeptid um ein Substrat konkurriert. Alle vorstehenden Assays können als diagnostische oder prognostische Marker verwendet werden. Die mit diesen Assays entdeckten Moleküle können verwendet werden, um die Erkrankung zu behandeln oder ein spezielles Ergebnis in einem Patienten zu bewirken (z. B. Eliminierung eines epithelialen Tumors oder Anhalten der Weiterentwicklung des Tumorwachstums), indem das Lungentumor-assoziierte Molekül aktiviert oder gehemmt wird. Des Weiteren können mit den Assays Agenzien entdeckt werden, welche die Produktion des Lungentumor-assoziierten Polypeptids von entsprechend manipulierten Zellen oder Geweben hemmen oder steigern können.
Eine Methode zur Identifizierung von Verbindungen, die sich an das erfindungsgemäße Lungentumor-assoziierte Polypeptid binden und aus folgenden Schritten besteht: (a) Inkubation einer Verbindung, die den Kandidaten bindet mit einem Polypeptid der Erfindung (das erfindungsgemäße Lungentumor-assoziierte Polypeptid); und (b) Bestimmung, ob die Bindung erfolgt ist, wird beschrieben.
Des Weiteren wird eine Methode zur Identifizierung von Aktivatoren/Agonisten oder Inhibitoren/Antagonisten des Lungentumor-assoziierten Polypeptids beschrieben, die aus folgenden Schritten besteht: (a) Inkubation einer Kandidatenverbindung mit einem Polypeptid der Erfindung; b) Untersuchung einer biologischen Aktivität und (c) Bestimmung, ob eine biologische Aktivität des Polypeptids verändert wurde.
Das Dokument beschreibt eine Methode zur Identifizierung und zum Erhalt eines Medikamentenkandidaten zur Therapie einer Funktionsstörung, die durch abnormale Zellproliferation charakterisiert ist und folgende Schritte umfasst:

(a) in Kontakt bringen eines Lungentumor-assoziierten Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder einer Zelle, die besagtes Polypeptid in Gegenwart von Komponenten exprimiert, die ein nachweisbares Signal liefern können als Reaktion auf die geänderte Regulierung der Zellproliferation die geänderte Zelldifferenzierung, wobei dieser Medikamentenkandidat unter Bedingungen untersucht wird, die einen Proteinabbau ermöglichen und
(c) Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens eines Signals oder einer Zunahme des Signals, das durch den Proteinabbau erzeugt wird, wobei das Vorhandensein oder die Zunahme des Signals ein Anzeichen für ein mutmaßliches Medikament ist.

Experimente unter Verwendung von Tieren oder isolierten Zellen oder Zelllinien können verwendet werden, um das proliferative Verhalten von Zellen oder Gewebe in Abhängigkeit von der Aktion des erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Polypeptids zu untersuchen. Die gleichen Verfahren können für die Untersuchung der Zelldifferenzierung verwendet werden.
Der Medikamentenkandidat kann eine einzelne Verbindung oder eine Vielzahl von Verbindungen sein. Der Begriff „Vielzahl von Verbindungen" bei einer Methode der Erfindung ist als eine Vielzahl von Substanzen zu verstehen, welche identisch sein können oder nicht.
Besagte Verbindung oder Vielzahl von Verbindungen kann chemisch synthetisiert oder mikrobiologisch hergestellt werden und/oder zum Beispiel in Proben wie Zellextrakten von beispielsweise Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen enthalten sein. Des Weiteren kann/können besagte Verbindung(en) dem Fachmann bekannt sein, wobei bis jetzt noch nicht bekannt ist, dass diese die erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Polypeptide unterdrücken oder aktivieren können. Die Reaktionsmischung kann ein zellfreier Extrakt sein, oder eine Zelle oder Gewebekultur umfassen. Geeignete Anordnungen für die Methode der Erfindung sind dem Fachmann bekannt und werden zum Beispiel generell in Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, dritte Ausgabe (1994) sowie in den angehängten Beispielen beschrieben. Die Vielzahl von Verbindungen kann zum Beispiel zur Reaktionsmischung und zum Kulturmedium hinzugefügt werden, in eine Zelle injiziert oder anderweitig dem transgenen Tier verabreicht werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das bei der Methode verwendet wird, ist vorzugsweise eine Wirtszelle, Säugetierzelle oder ein nicht-humanes transgenes Tier wie beschrieben.
Wird eine Probe, welche eine Verbindung oder eine Vielzahl von Verbindungen enthält, in der erfindungsgemäßen Methode identifiziert, ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe zu isolieren, bei der festgestellt wurde, dass diese die Verbindung enthält, die das Lungentumor-assoziierte Polypeptid unterdrücken oder aktivieren kann, oder die Originalprobe kann weiter unterteilt werden, falls diese zum Beispiel aus einer Vielzahl von Verbindungen besteht, um die Anzahl der unterschiedlichen Substanzen pro Probe zu verringern und die Methode mit Unterteilungen der Originalprobe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Proben können die vorstehend beschriebenen Schritte mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise bis die gemäß der Methode der Erfindung identifizierte Probe nur eine begrenzte Zahl von Substanzen oder nur eine Substanz umfasst. Besagte Probe umfasst vorzugsweise Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften und am besten sind besagte Substanzen identisch.
Mehrere Methoden zur Erstellung und zum Durchsuchen großer Bibliotheken, um Verbindungen zu identifizieren, die über eine spezielle Affinität zu einem Target verfügen, sind dem Fachmann bekannt. Diese Methoden umfassen die Phage-Display-Methode, bei der randomisierte Peptide von einem Phagen angezeigt und mittels Affinitätschromatografie auf einen immobilisierten Rezeptor untersucht werden, siehe zum Beispiel WO 91/17271 , WO 92/01047 , US-A-5,223,409 . Bei einem anderen Ansatz werden auf einem Chip immobilisierte kombinatorische Polymerbibliotheken unter Verwendung der Fotolithografie synthetisiert, siehe zum Beispiel US-A-5,143,854 , WO 90/15070 und WO 92/10092 . Die immobilisierten Polymere werden mit einem markierten Rezeptor in Kontakt gebracht und auf einen Marker gescannt, um Polymere zu identifizieren, die sich an den Rezeptor binden. Die Synthese und das Durchsuchen der Peptidbibliotheken auf kontinuierlichen Zellulosemembranträgern, die für die Identifizierung von Bindungsliganden des Polypeptids der Erfindung und somit von möglichen Inhibitoren und Aktivatoren verwendet werden kann, wird zum Beispiel beschrieben in Kramer, Methods Mol. Biol. 87 (1998), 25–39. Diese Methode kann zum Beispiel ebenfalls dazu benutzt werden, die Bindungsstellen sowie die Erkennungsmotive im Polypeptid der Erfindung zu bestimmen. Auf ähnliche Weise wurden die Substratspezifität des DnaK-Chaperons sowie die Kontaktstellen zwischen humanem Interleukin-6 und dessen Rezeptor bestimmt; siehe Rudiger, EMBO J. 16 (1997), 1501–1507 und Weiergraber bzw. FEBS Lett. 379 (1996), 122–126. Des Weiteren können die zuvor erwähnten Methoden für die Konstruktion von Bindungssupertopen verwendet werden, die vom Polypeptid der Erfindung stammen. Ein ähnlicher Ansatz wurde für Peptidantigene des monoklonalen Antikörpers anti-p24 (HIV-1) beschrieben, siehe Kramer, Cell 91 (1997), 799–809. Ein genereller Weg zur Fingerprint-Analyse der Peptid-Antikörper-Interaktionen unter Verwendung der geclusterten Aminosäurepeptid-Bibliothek wurde in Kramer, Mol. Immunol. 32 (1995), 459–465 beschrieben. Des Weiteren können Antagonisten des Lungentumor-assoziierten Polypeptids aus monoklonalen Antikörpern abgeleitet und identifiziert werden, die spezifisch mit dem Polypeptid der Erfindung in Übereinstimmung mit den in Doring, Mol. Immunol. 31 (1994), 1059–1067 beschriebenen Methoden reagieren.
Kürzlich wurden in WO 98/25146 weitere Methoden zum Durchsuchen von Bibliotheken von Komplexen auf Verbindungen beschrieben, welche die erwünschte Eigenschaft, besonders die Fähigkeit aufweisen, ein Peptid oder dessen zellulären Rezeptor zu agonisieren, zu binden oder zu antagonisieren. Die Komplexe in solchen Bibliotheken umfassen eine Verbindung, welche gerade getestet wird, ein Tag, welches zumindest einen Schritt der Synthese der Verbindung aufzeichnet sowie einen Substituenten, der empfindlich gegenüber der Modifizierung durch ein Reportermolekül ist. Eine Modifizierung des Substituenten wird verwendet, um anzuzeigen, dass ein Komplex eine Verbindung mit den gewünschten Eigenschaften enthältt. Das Tag kann dekodiert werden, um zumindest einen Schritt in der Synthese solch einer Verbindung aufzudecken. Andere Methoden zur Identifizierung von Verbindungen, die mit den Polypeptiden gemäß der Erfindung interagieren oder von Nukleinsäuremolekülen, die solche Moleküle kodieren, sind zum Beispiel In-vitro-Screening mit dem Phage-Display-System sowie Filterbindungsassays oder „Echtzeit"-Messung der Interaktion zum Beispiel mit dem BIAcore-Gerät (Pharmacia).
All diese Methoden können verwendet werden, um Aktivatoren/Agonisten und Inhibitoren/Antagonisten des Lungentumor-assoziierten Polypeptids oder des verwandten Polypeptids zu identifizieren.
Verschiedene Quellen können für die Grundstruktur solch eines Aktivators oder Inhibitors verwendet werden und umfassen zum Beispiel mimetische Analoge des Polypeptids der Erfindung. Mimetische Analoge des Polypeptids der Erfindung oder biologisch aktive Fragmente davon können zum Beispiel erzeugt werden durch Ersetzen von vermutlich für die biologische Aktivität wichtigen Aminosäuren durch zum Beispiel Stereoisomere, d. h. D-Aminosäuren; siehe zum Beispiel Tsukida, J. Med. Chem. 40 (1997), 3534–3541. Des Weiteren können, falls Fragmente für die Konstruktion von biologisch aktiven Analogen verwendet werden, pro-mimetische Komponenten in ein Peptid eingebaut werden, um zumindest einige der Konformationseigenschaften wiederherzustellen, die möglicherweise beim Entfernen eines Teils des Originalpolypeptids verloren gegangen sind; siehe zum Beispiel Nachman, Regul. Pept. 57 (1995), 359–370. Des Weiteren kann das Lungentumor-assoziierte Polypeptid verwendet werden, um synthetische chemische Peptidomimetika zu identifizieren, die sich an ein Ligand, Substrat, einen Bindungspartner oder das Polypeptid der Erfindung so effektiv wie an das natürliche Polypeptid binden oder als solche fungieren können; siehe zum Beispiel Engleman, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2284–2292. So können zum Beispiel Faltungssimulationen sowie Neukonstruktion der strukturellen Motive des Polypeptids der Erfindung mit entsprechenden Computerprogrammen durchgeführt werden (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286–299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675–679). Computermodelle der Proteinfaltung können für die Konformations- und energetische Analyse von detaillierten Peptid- und Proteinmodellen verwendet werden (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995–1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37–45). Die entsprechenden Programme können besonders für die Identifizierung von interaktiven Stellen des Lungentumor-assoziierten Polypeptids und dessen möglichen Rezeptor, seines Liganden oder anderer interagierender Proteine mittels computerunterstützter Suche nach komplementären Peptidsequenzen verwendet werden (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114–120). Weitere entsprechende Computersysteme für die Konstruktion von Protein und Peptiden werden nach dem bekannten Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033–1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1–13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987–5991. Die mit der zuvor beschriebenen Computeranalyse erzielten Ergebnisse können zum Beispiel für die Herstellung von PeptidoMimetika des Proteins der Erfindung oder von Fragmenten davon verwendet werden. Solche Pseudopeptid-Analoge der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins können das Stammprotein sehr wirkungsvoll nachahmen (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218–33224). So führt zum Beispiel die Inkorporation von leicht verfügbaren achiralen *-Aminosäurerückständen in ein Protein der Offenbarung oder ein Fragment davon dazu, dass Amidbindungen durch Polymethyleneinheiten einer aliphatischen Kette ersetzt werden, wodurch eine passende Strategie für die Konstruktion eines Peptidomimetikums geschaffen wird (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769–777). Superaktive peptidomimetische Analoge kleiner Peptidhormone in anderen Systemen sind nach dem bekannten Stand der Technik beschrieben (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327–331). Entsprechende Peptidomimetika des Proteins der vorliegenden Erfindung können ebenfalls durch die Synthese von peptidmimetischen kombinatorischen Bibliotheken durch aufeinanderfolgende Amidalkylierung und Prüfung der daraus resultierenden Verbindungen zum Beispiel auf ihre Bindungs- und immunologischen Eigenschaften identifiziert werden. Methoden zur Erzeugung und Verwendung von peptidomimetischen kombinatorischen Bibliotheken werden nach dem bekannten Stand der Technik beschrieben, wie zum Beispiel in Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220–234 und Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715. Des Weiteren kann eine dreidimensionale und/oder kristallografische Struktur des Polypeptids für die Konstruktion von peptidmimetischen Inhibitoren der biologischen Aktivität des Polypeptids der Erfindung verwendet werden (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933–12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545–1558).
Die strukturbasierte Konstruktion und Synthese von synthetischen Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, welche die Aktivität des nativen biologischen Polypeptids nachahmen, ist weiter beschrieben zum Beispiel in Dowd, Nature Biotechnol. 16 (1998), 190–195; Kieber-Emmons, Current Opinion Biotechnol. 8 (1997), 435–441; Moore, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 115–119; Mathews, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 121–125; Mukhija, European J. Biochem. 254 (1998), 433–438.
Es ist dem Fachmann ebenfalls bekannt, dass es möglich ist, Mimetika von kleinen organischen Verbindungen zu konstruieren, synthetisieren und zu bewerten, die zum Beispiel als Substrat oder Ligand für das Lungentumor-assoziierte Polypeptid der Verbindung oder das verwandte Polypeptid fungieren können. So wurde zum Beispiel beschrieben, dass D-Glukose-Mimetika von Hapalosin bei der Antagonisierung des „Multidrug Resistance Assistance-Associated"-Proteins bezüglich der Zytotoxizität eine ähnliche Wirksamkeit aufwiesen wie Hapalosin; siehe Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981–987.
Das Nukleinsäuremolekül kann auch als Ziel für Aktivatoren und Inhibitoren fungieren. Aktivatoren können zum Beispiel Proteine umfassen, die sich an die mRNA eines Gens binden, welches das erfindungsgemäße Lungentumor-assoziierte Polypeptid kodiert, und somit die native Konformation der mRNA stabilisieren und die Transkription und/oder Translation erleichtern, so wie zum Beispiel das Tat-Protein auf die HIV-RNA wirkt. Des Weiteren werden in der Literatur Methoden beschrieben, um Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren, wie zum Beispiel ein RNA-Fragment, welches die Struktur eines definierten oder undefinierten Ziel-RNA-Moleküls nachahmt, an das sich eine Verbindung im Inneren einer Zelle bindet, was zu einer Verlangsamung des Zellwachstums oder zum Zelltod führt; siehe zum Beispiel WO 98/18947 sowie darin zitierte Verweise. Diese Nukleinsäuremoleküle können zur Identifizierung von unbekannten Verbindungen verwendet werden, die von pharmazeutischem und/oder landwirtschaftlichem Interesse sind sowie zur Identifizierung von unbekannten RNA-Zielen, die für die Behandlung einer Krankheit verwendet werden können. Diese Methoden und Zusammensetzungen können bei der Suche nach neuartigen Antibiotika, Bakteriostatika oder Modifizierungen davon, oder für die Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die für die Veränderung des Expressionslevels von Proteinen nützlich sind, welche durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert werden. Alternativ dazu kann die Konformationsstruktur des RNA-Fragments, welches die Bindungsstelle nachahmt, bei einem rationellen Medikamentendesign verwendet werden, um bekannte Antibiotika so zu verändern, dass diese sich bereitwilliger an das Ziel binden. Eine solche Methode ist die Kernspinresonanz, die für die Identifizierung von Medikamenten- und RNA-Konformationsstrukturen nützlich ist. Weitere Methoden sind zum Beispiel die in WO 95/35367 , US-A-5,322,933 beschrieben Medikamentendesign-Methoden, bei denen die Kristallstruktur eines RNA-Fragments abgeleitet werden kann und Computerprogramme genutzt werden, um neuartige Bindungsverbindungen zu konstruieren, welche als Antibiotika fungieren können.
Einige genetische Veränderungen führen zu veränderten Protein-Konformationszuständen. So kann zum Beispiel ein Mutant der Lungentumor-assoziierten Polypeptide eine tertiäre Struktur aufweisen, durch welche diese weit weniger zu einem Proteinabbau in der Lage sind. Die Wiederherstellung der normalen oder geregelten Konformation von mutierten Proteinen ist das eleganteste und spezifischste Mittel, diese molekularen Defekte zu korrigieren, obwohl dies schwierig sein kann. Pharmakologische Manipulationen können somit auf eine Wiederherstellung einer Wildtyp-Konformation des erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Polypeptids abzielen. Somit können die Nukleinsäuremoleküle und kodierten Polypeptide der vorliegenden Offenbarung ebenfalls verwendet werden, um Moleküle zu konstruieren und/oder zu identifizieren, welche in der Lage sind, die Wildtyp-Funktion eines Lungentumor-assoziierten Polypeptids oder eines verwandten Polypeptids zu aktivieren.
Bei den Verbindungen, welche getestet und identifiziert werden können, kann es sich um Expressionsbibliotheken, zum Beispiel cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Hormone, Peptidomimetika, PNAs oder ähnliches handeln (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879–880; Hupp, Cell 83 (1995), 237–245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193–198 sowie zitierte Verweise supra). Des Weiteren können Gene, welche einen mutmaßlichen Regulator des Lungentumor-assoziierten Polypeptids kodieren und/oder welche ihre Auswirkungen vor oder hinter dem Lungentumor-assoziierten Polypeptid ausüben, beispielsweise unter Verwendung von Insertionsmutagenese identifiziert werden, bei der zum Beispiel Gen-Targetingvektoren verwendet werden, welche dem Fachmann bekannt sind. Bei besagten Verbindungen kann es sich ebenfalls um funktionelle Derivate oder Analoge bekannter Inhibitoren oder Aktivatoren handeln. Solche nützlichen Verbindungen können sich zum Beispiel an das Lungentumor-assoziierte Polypeptid bindende Transaktionsfaktoren oder regulatorische Sequenzen des kodierenden Gens sein. Die Identifizierung der Transaktionsfaktoren kann durch dem Fachmann bekannte Standardmethode erfolgen (siehe zum Beispiel Sambrook, supra, und Ausubel, supra). Zur Bestimmung, ob sich ein Protein an das Protein selbst oder an regulatorische Sequenzen bindet, können standardmäßige native Gel-Shift-Analysen durchgeführt werden. Zur Identifizierung eines Transaktionsfaktors, welcher sich an das Protein oder die regulatorische Sequenz bindet, kann das Protein oder die regulatorische Sequenz als ein Affinitätsreagenz bei Standard-Proteinreinigungsmethoden oder als eine Sonde für das Durchsuchen einer Expressionsbibliothek verwendet werden. Die Identifizierung von Nukleinsäuremolekülen, welche Polypeptide kodieren, die mit den vorstehend beschriebenen Tumor-assoziierten Polypeptiden interagieren, kann ebenfalls, wie zum Beispiel in Scofield (Science 274 (1996), 2063–2065) beschrieben, mit dem sogenannten Hefe-Zweihybrid-System erfolgen. Bei diesem System ist das durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung oder durch einen kleineren Teil davon kodierte Polypeptid mit dem DNA-Bindungsbereich des GAL4-Transkriptionsfaktors verbunden. Ein Hefestamm, der dieses Fusionspolypeptid exprimiert und ein lacZ-Reportergen umfasst, welches durch einen entsprechenden Promoter angetrieben wird, der durch den GAL4-Transkriptionsfaktor erkannt wird, wird mit einer Bibliothek von cDNAs transformiert, die Pflanzenproteine oder Peptide davon exprimieren, welche zu einer Aktivierungsdomäne fusioniert werden. Somit ist, falls ein durch eine der cDNAs kodiertes Peptid mit dem Fusionspeptid interagieren kann, welches ein Peptid eines erfindungsgemäßen Lungentumor-assoziierten Polypeptids umfasst, der Komplex zu einer direkten Expression des Reportergens in der Lage. Auf diese Weise können die Nukleinsäuremoleküle sowie das kodierte Peptid verwendet werden, um Peptide und Proteine zu identifizieren, die mit dem Lungentumor-assoziierten Protein interagieren. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass dieses und ähnliche Systeme für die Identifizierung von Inhibitoren der Bindung der Lungentumor-assoziierten Proteine weiter genutzt werden können.
Ist der Transaktionsfaktor einmal identifiziert, kann die Veränderung seiner Bindung an das Lungentumor-assoziierte Polypeptid oder die Regulierung der Expression dieses Lungentumor-assoziierten Polypeptids verfolgt werden, beginnend zum Beispiel mit der Suche nach Inhibitoren gegen die Bindung des Transaktionsfaktors an das Protein der vorliegenden Offenbarung. Die Aktivierung oder Unterdrückung der Lungentumor-assoziierten Proteine kann anschließend in Tieren durch die Anwendung des Transaktionsfaktors (oder seines Inhibitors) oder des Gens, das es kodiert, zum Beispiel in einem Expressionsvektor, erreicht werden. Außerdem können, falls die aktive Form des Transaktionsfaktors ein Dimer ist, dominant-negative Mutanten des Transaktionsfaktors geschaffen werden, um dessen Aktivität zu hemmen. Des Weiteren können bei der Identifikation des Transaktionsfaktors weitere Komponenten auf dem Weg identifiziert werden, der zu einer Aktivierung (zum Beispiel Signaltransduktion) oder Unterdrückung eines an der Kontrolle des Lungentumor-assoziierten Polypeptids beteiligten Gens führen. Anschließend kann die Veränderung der Aktivitäten dieser Komponenten verfolgt werden, um zusätzliche Medikamente und Methoden zur Veränderung des Stoffwechsels des Proteinabbaus in Tieren zu entwickeln. Somit beschreibt das vorliegende Dokument ebenfalls die Verwendung des zuvor definierten Zweihybrid-Systems für die Identifizierung des Lungentumor-assoziierten Polypeptids oder der Aktivatoren oder Inhibitoren des Lungentumor-assoziierten Polypeptids.
Die durch die vorstehenden Methoden isolierten Verbindungen dienen ebenfalls als Wegweiser-Verbindungen für die Entwicklung von analogen Verbindungen. Die Analoge sollten über eine stabilisierte elektronische Konfiguration sowie eine molekulare Konformation verfügen, die es ermöglichen, dass wichtige funktionelle Gruppen dem Lungentumor-assoziierten Polypeptid oder dessen möglichem Rezeptor auf weitgehend die gleiche Weise wie die Wegweise-Verbindung präsentiert werden. Besonders die analogen Verbindungen verfügen über räumliche elektronische Eigenschaften, die mit der Bindungsregion vergleichbar sind, können jedoch kleinere Moleküle als die Wegweiser-Verbindung sein und weisen oft ein Molekulargewicht von unter ungefähr 2 kD und vorzugsweise unter ungefähr 1 kD auf. Die Identifizierung der analogen Verbindungen kann durch verschiedene Techniken erfolgen, wie zum Beispiel der SFC-Analyse, CI-Analyse sowie Normal Mode Dynamics Analysis. Computerprogramme für die Implementierung dieser Techniken stehen zur Verfügung; zum Beispiel Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Methoden für die Herstellung chemischer Derivate und Analoge sind dem Fachmann bekannt und werden zum Beispiel in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA beschrieben. Des Weiteren können besagte Derivate und Analoge auf ihre Auswirkungen gemäß der dem Fachmann bekannten Methoden getestet werden; siehe ebenfalls supra. Des Weiteren können zum Beispiel Peptidomimetika und/oder computerunterstützte Konstruktion von entsprechenden Derivaten und Analogen gemäß der vorstehend beschriebenen Methoden verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der zuvor beschriebenen Methoden ist besagte Zelle eine Zelle oder im zuvor beschriebenen transgenen nicht-humanen Tier enthalten.
Wurde die beschriebene Verbindung identifiziert und erzielt, wird sie vorzugsweise in einer therapeutisch annehmbaren Form bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode bereit, wie in den beigefügten Patentansprüchen beschrieben, um Lungenkrebs auf der Grundlage des Expressionslevels des Lungentumor-assoziierten Gens in biologischen Proben nachzuweisen. Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Forschungs- oder Diagnosekit bereit, wie in den beigefügten Patentansprüchen beschrieben, um die Reaktionen durchzuführen, die am Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens und/oder des Überexpressionslevels des Lungentumor-assoziierten Gens beteiligt sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Human-LUMA1-mRNA-Variante 1 sowie die hierdurch kodierte LUMA1-Protein-Isoform 1.
2: Human-LUMA1-mRNA-Variante 2. Differenzielles Spleißen von Exon 7 führt zu einer Deletion eines Teils des Exon 7, was einen Frame-Shift in die 3'-Sequenz der Splice-Variante einführt. Im Vergleich zur mRNA-Variante 1 ist das kodierte Protein in Variante 2 kürzer als das in mRNA-Variante 1. Der Frame-Shift führt zu einer Protein-Isoform mit einer anderen C-Terminal-Sequenz. Außerdem kann das komplette Exon herausgespleißt werden (nicht gezeigt).
3: Human-LUMA1-mRNA-Variante 3. Diese Variante ist durch eine 3 bp-Deletion sowie eine unterschiedliche Polyadenylationsstelle gekennzeichnet, was zu einer kürzeren 3'-Sequenz führt.
4: Human-LUMA1-mRNA-Variante 4. Diese Variante ist durch eine Deletion von Exon 3 gekennzeichnet.
5: Human-LUMA1-mRNA-Variante 5. Diese Variante ist durch eine Deletion von Exon 3 und Exon 4 gekennzeichnet.
6: Human-LUMA1-mRNA-Variante 6. Diese Variante ist durch eine Deletion von Exon 3, 4 und 5 gekennzeichnet.
7: Human-LUMA1-mRNA-Variante 7, die Protein 1 kodiert. Protein 1 wird durch ein einen offenen Leserahmen kodiert, welcher sich am 5'-Ende der mRNA befindet.
8: Human-LUMA1-mRNA-Variante 8, die Protein 2 kodiert. Protein 2 wird beginnend an Basenpaar 2242 durch einen offenen Leserahmen kodiert. Der offene Leserahmen wird durch ein Stoppcodon an Basenpaar 2863-65 terminiert. Das Stoppcodon fehlt bei der mRNA-Variante 9, die Protein 3 kodiert (siehe 9).
9: Human-LUMA1-mRNA-Variante 9, die Protein 3 kodiert. Der N-Terminal-Teil von Protein 3 ist bei Protein 2 vorhanden. Aufgrund des Fehlens des Stoppcodons an Basenpaar 2863-65 erstreckt sich der offene Leserahmen bis Basenpaar 4290.
10: Human-LUMA1-mRNA-Variante 10, die Protein 4 kodiert. Protein 4 wird durch einen offenen Leserahmen beginnend an Basenpaar 2866 aufgrund des Vorhandenseins eines 5'-Stoppcodons bei Basenpaar 2863-65 kodiert. Protein 3 (9) und Protein 4 beherbergen einen anderen C-Terminus im Vergleich zum in 1 abgebildeten Protein, und zwar aufgrund eines differenziellen Spleißens bei Exon 8 (Exon T), durch welches das Exon bis zum 5'-Ende verlängert wird, was zu einem Frame-Shift führt.
11: Genomsequenz des Human-LUMA1-Gens. LUMA1-Exonsequenzen sind in roten oder magentafarbenen Buchstaben dargestellt und unterstrichen. Die Genomsequenz beherbergt LUMA1-Exon 1 bis -Exon 8. Zwei verschiedene Splice-Akzeptor-Stellen sind an Exon 3 nachweisbar und führen zu einem zusätzlichen Codon, das durch (>) angezeigt wird. Exon 3 oder die Exons 3 und 4 oder die Exons 3, 4 und 5 sind differenziell gespleißt. Außerdem wurde differenzielles Spleißen eines Teils von Exon 7 nachgewiesen. Während Deletionen von Exon 3, den Exons 3 und 4 sowie den Exons 3, 4 und 5 zu einer in-frame Deletion der internen LUMA1-Aminosäuresequenzen führen, erzeugt das differenzielle Spleißen eines Teils von Exon 7 einen Frame-Shift. Dieser Frame-Shift erzeugt unterschiedliche C-Terminal LUMA1 Protein-Isoformen. Die beiden Splice-Akzeptor-Stellen an Exon 7 werden durch (>) angezeigt. Außerdem werden zwei unterschiedliche Polyadenylationsstellen des LUMA1-Gens angezeigt.
12: Maus-LUMA1-mRNA-Sequenz
13: Nukleotidsequenzvergleich von Human- und Maus-LUMA1-mRNA. Über die gesamte kodierende Sequenz ist eine starke Sequenz-Konservierung während der Entwicklung nachweisbar.
14: Nukleotidsequenzvergleich von Human- und Maus-LUMA1-mRNA. Sequenzblöcke, die bei Human- und Maus-LUMA1 identisch sind, sind blau eingerahmt.
15: Aminosäuresequenzvergleich von Human- und Maus-LUMA1-Protein. Sequenzblöcke, die bei Human- und Maus-LUMA1 identisch sind, sind blau eingerahmt. Stark konservierte Peptidsequenzen sind vorhanden und ein Anzeichen für eine stark konservierte Funktion während der Entwicklung.
16–20: Nachweis der Expression von LUMA1 in Lungenadenokarzinomen mit der Echtzeit-PCR-Technik (ABI TaqMan 7700). Für eine Amplifikation des LUMA1-Gens wurden folgende Primer verwendet: LUMA1-A: CTCGTCAGGCGACCTTATATC; LUMA1-B: TGTCAGTTGAACATTTTCTGCC. Für die Analyse wurden entsprechende Tumor- und normale Proben verwendet.
21: Gelelektrophorese der Endpunkt-PCR der Amplifikation des LUMA1-Transkripts in Lungenadenokarzinomen und entsprechendem normalem Gewebe. In Tumor T1 und T3 wurde eine verstärkte Expression von LUMA1 festgestellt, in Tumor T4 und T5 eine starke Überexpression von LUMA1 im Vergleich zur entsprechenden normalen Probe. Die auf dem Agarose-Gel analysierten PCR-Produkte wurden aus Echtzeit-PCR-Reaktionen abgeleitet, die in 16–20 zu sehen sind.
22: Gelelektrophorese der Endpunkt-PCR der Amplifikation des LUMA1-Transkripts in Lungenadenokarzinomen und entsprechendem normalem Gewebe. Während in der normalen Probe N1, N3 und N4 kein LUMA1-Transkript nachweisbar war, wurde im Lungenadenokarzinom T1 und T3 eine Expression des LUMA1-Transkripts nachgewiesen. In T4 war keine Amplifikation sichtbar. In T5 und T6 wurde eine stärkere Expression nachgewiesen. Für eine Amplifikation des LUMA1-Gens wurden folgende Primer verwendet: LUMA1-C: CTCGTCAGGCGATACTCCC; LUMA1-D: CACCAGTCAGCTCTAAATGGG.
23: Gelelektrophorese der Endpunkt-PCR der Amplifikation der beiden verschiedenen LUMA1-Exon 7-(Exon S)-Transkripte in normalem Gewebe. 11 normale Gewebeproben wurden auf Expression der langen Variante von Exon 7 getestet. Nur in Testis und Leber wurde eine Expression dieser Exon 7-Splice-Variante nachgewiesen. Außerdem konnte die Expression der kurzen Exon 7-Splice-Variante in Testis, Leber und Magen beobachtet werden. NTC = Kontrolle ohne Zugabe von Template.
24: Immunhistochemische Analyse des Lungenadenokarzinoms (B) und des entsprechenden normalen Gewebes (A) unter Verwendung eines gegen LUMA-Exon 2 gerichteten primären Antikörpers. Im Karzinomgewebe und im entsprechenden normalen Lungengewebe wurde eine zytoplasmatische Färbung mit dem polyklonalen Antikörper nachgewiesen, der gegen die Proteinsequenzen von Exon 2 gerichtet ist. Es wurde kein Unterschied im Färbemuster zwischen normalem und Tumorgewebe beobachtet.
25: Immunhistochemische Analyse des Lungenadenokarzinoms (B) und des entsprechenden normalen Gewebes (A) unter Verwendung eines gegen LUMA-Exon 7 gerichteten monoklonalen primären Antikörpers. Im Karzinom der vorgelegten Probe ist eine starke Überexpression der Luma-Exon 7-Protein-Isoform (langes Transkript) nachweisbar. Die Tumorzellen zeigen ein zytoplasmatisches Färbemuster. Im entsprechenden normalen Lungengewebe wurde mit dem Exon 7-spezifischen monoklonalen Antikörper keine Färbung nachgewiesen.
26: Immunhistochemische Analyse des Lungenkarzinoids (A) und des Plattenepithelkarzinoms (B) unter Verwendung eines gegen LUMA-Exon 7 gerichteten monoklonalen Antikörpers. Im Karzinoid (A) und im Plattenepithelkarzinom (B) wurde eine starke Überexpression der LUMA-Exon 7-Protein-Isoform (langes Transkript) nachgewiesen. Die Tumorzellen zeigen ein zytoplasmatisches Färbemuster.
Die folgenden Beispiele werden nur zum Zwecke der Veranschaulichung gegeben und sollen nicht den Umfang der hier offenbarten Erfindung einschränken.
Beispiel 1: Echtzeit-RT-PCR-Analyse der LUMA1-Expression in Tumorproben einschließlich Dickdarmkarzinom, Magenkarzinom, kleinzelliger Lungentumor und Lungenadenokarzinom.
Eine Hochregulierung der LUMA1-Transkripte wurde in 60% der getesteten Lungenadenokarzinome nachgewiesen, während in Dickdarmkarzinom, Magenkarzinom und kleinzelligem Lungentumor keine Hochregulierung gefunden wurde.
1.1. Theoretische Grundlage
Quantitative Werte wurden ermittelt bezogen auf die Nummer des Schwellenwert-Zyklus, bei dem der Beginn der Zunahme des, dem exponentiellen Wachstum von PCR-Produkten zugeordneten, Signals, festgestellt wird (unter Verwendung der Analyse-Software von PE Biosystems), gemäß der Handbücher des Herstellers.
6,25 ng cDNA Oligo dT geprimter Gesamt-RNA wurde zu jeder Echtzeit-PCR hinzugegeben. Wir haben Transkripte des Beta-Aktin-Gens (ACTB-Aktin, Primer-Aktin 1-CCTAAAAGCCACCCCACTTCTC, Primer-Aktin 2-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG) welches humanes Aktin kodiert, Beta (ACTB) als die endogene RNA-Kontrolle quantifiziert.
Die Endergebnisse, als N-fache Unterschiede in der Zielgen-Expression relativ zum Referenzgen ACTB, als 'Ntarget' bezeichnet, wurden wie folgt bestimmt: Ntarget = 2(delta Ctsample – delta Ctreference gene)wobei Delta-Ct-Werte der Probe und der Referenz durch Subtraktion des Durchschnitts-Ct-Wertes des WT1-Gens vom Durchschnitts-Ct-Wert des ACTB-Gens bestimmt werden.
Primer für WT1 und ACTB-Gen wurden mit Unterstützung des Computerprogramms PRIMER (Husar-Programmpaket, DKFZ Heidelberg)
und Primer Express (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) gewählt. Die folgenden Nukleotidsequenzen von Primern für die Amplifikaiton des LUMA1-Gens wurden verwendet: LUMA1-A: CTCGTCAGGCGACCTTATATC und LUMA1-B: TGTCAGTTGAACATTTTCTGCC; LUMA1-C: CTCGTCAGGCGATACTCCC und LUMA1-D: CACCAGTCAGCTCTAAATGGG.
1.2. RNA-Extraktion
Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des QIAamp RNA Mini Protokolls (Qiagen, Hilden, Germany) aus Gewebeproben extrahiert.
1.3. cDNA-Synthese
1 μg Gesamt-RNA wurde mit DNAse I für 15 Min. bei 25°C in einem Endvolumen von 20 μl verdaut, welches 1 μl DNAse I Amp Grade (1 Einheit/μl; Invitrogen) und 2 μl DNAse Reaktionspuffer (10×; Invitrogen) enthält. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl EDTA (25 mM; Invitrogen) und Inkubation für 10 Min. bei 65°C gestoppt. Die reverse Transkription wurde 2 Stunden bei 37°C in einem Endvolumen von 40 μl durchgeführt, welches 4 μl 10 × RT-Puffer, 4 μl 5 mM dNTP, 1 μl RNAsin 40 U/μl Promega), 4 μl Oligo dT Primer 0,5 μg/ml und 2 μl Omniscript 4 U/μl (Qiagen, Hilden, Germany) enthält. Die reverse Transkription wurde durch Erhitzen auf 93°C (5 Min.) und Abkühlen auf 4°C (5 Min.) inaktiviert.
1.4. PCR-Amplifikation
Alle PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung eines ABI Prism 7700 Sequenz-Detektionssystem (Perkin-Elmer Applied Biosystems) durchgeführt. Die PCR wurde mit dem SYBR^® Green PCR Mix (Perkin-Elmer Applied Biosystems) durchgeführt. Die Thermocyclerbedingungen umfassten einen ersten Denaturierungsschritt bei 95°C für 10 Min. und 40 Zyklen bei 95°C für 15 Sek. und 60°C für 1 Min. Experimente wurden mit Duplikaten für jeden Datenpunkt durchgeführt.
Wie in 16–20 gezeigt, wurde eine stärkere Expression von LUMA1-Transkripten in Lungenadenokarzinomen nachgewiesen. Für eine Verstärkung der LUMA1-Transkripte wurden folgende Primer verwendet: LUMA1-A: CTCGTCAGGCGACCTTATATC und LUMA1-B: TGTCAGTTGAACATTTTCTGCC. Die PCR mit den Primern LUMA1-A und LUMA1-B verstärken die Splice-Variante, die das komplette Exon 7 beherbergt, während die Primer LUMA1-C (CTCGTCAGGCGATACTCCC) und LUMA1-D (CACCAGTCAGCTCTAAATGGG) die Splice-Variante verstärken, die nur einen Teil von Exon 7 repräsentiert. Bei der Verwendung dieser Primer-Kombinationen wurde eine Hochregulierung beider Splice-Varianten in Echtzeit-PCR-Experimenten beobachtet. In 16 ist die Echtzeit-Amplifikation von Tumor 1 und der entsprechenden normalen Probe 1 gezeigt (Primer LUMA1-A und LUMA1-B). Es wurde ein Schwellenwert-Zyklus- Unterschied von drei beobachtet, während mit den Referenzprimern für das ACTB-Gen kein Unterschied nachgewiesen wurde (nicht gezeigt). Dies ist ein Anzeichen für eine 8-fache Überexpression des LUMA1-Transkripts im Lungenadenokarzinom eines Individuums. In einem anderen Individuum wurden keine Unterschiede zwischen normalem Gewebe und Lungenkarzinomgewebe beobachtet (14). Bei einem weiteren Individuum zeigte sich eine 13-fache Überexpression im Tumorgewebe (15). Mehr Individuen waren durch das Fehlen des LUMA1-Transkripts im normalen Gewebe und eine starke Hochregulierung im Tumorgewebe (mehr als das 400-fache) gekennzeichnet (16, 17).
Die PCR-Produkte der beiden in 23 gezeigten verschiedenen analysierten Exon 7-Varianten wurden durch die vorstehend beschriebene Echtzeit-PCR erzielt und wurden mittels Gelelektrophorese analysiert.
Beispiel 2: Klonierung von differenziell gespleißten LUMA1-Transkripten
Unter Verwendung von speziellen Primern für das LUMA1-Transkript wurde die PCR mit zufällig geprimter humaner cDNA durchgeführt, die vom Lungenadenokarzinom, Magenkarzinom und fetalem Gehirn abgeleitet wurde.
Vorwärts-Primer:
Rückwärts-Primer:
Die folgenden Primer wurden zur Amplifikation verwendet:
LUMA1-C + LUMA1-H; LUMA1-E + LUMA1-G; LUMA1-E + LUMA1-H; LUMA1-F + LUMA1-G; LUMA1-F + LUMA1-H
Die folgenden PCR-Bedingungen wurden verwendet, um die differenziell gespleißten LUMA1-Transkripte zu amplifizieren:
95°C 1 Min., (95°C 30 Sek., 60°C 1 Min., 68°C 3,5 Min.) – 34 Zyklen
Die TaqAdvantage-Polymerase (Clontech) wurde verwendet.

1 μl dNTP (20 mM), 0,5 μl 50 × TaqAdvantagell (Clontech), 2,5 μl 10 × Puffer, 3 μl cDNA (100 ng), 1,5 μl (Vorwärts-Primer, 10 μm), 1,5 μl (Rückwärts-Primer, 10 μm), 15 μl H₂O.

Die PCR-Produkte wurden direkt sequenziert oder zuerst in den pCR2.1-Vektor (Invitrogen) geklont und anschließend sequenziert. Sequenzanalyse und Datenbanksuchen wurden mit dem HUSAR-Programmpaket (DKFZ Heidelberg) durchgeführt. Die Sequenzanalyse der geklonten PCR-Produkte zeigte ein umfassendes Splicing des LUMA1-Transkripts. Ein Transkript wurde identifiziert, das durch das Fehlen von Exon 3 gekennzeichnet war. Bei einem anderen Transkript fehlten Exon 3 und 4. Außerdem wurde in Transkript geklont, bei dem Exon 3, 4 und 5 herausgespleißt war. Herausspleißen der Exons 3 oder 4 oder 5 oder Kombinationen davon bewirkt keine Veränderung des Leserahmens und führt zu internen Deletionen in den kodierten LIMA1-Protein-Isoformen. Im Gegensatz zu diesen Splice-Varianten führt das differenzielle Spleißen bei Exon 7 zu einem Frame-Shift. Ist das komplette Exon 7 im Transkript vorhanden, erstreckt sich der offene Leserahmen fast bis zum 3'-Ende des Transkripts. Ist der erste Teil von Exon 7 im daraus resultierenden Transkript herausgespleißt, wird ein Frame-Shift erzeugt, welcher zu einem kürzeren C-Terminus des kodierten Proteins führt. Es zeigte sich, dass beide Exon 7-Splice-Varianten in Lungenadenokarzinomen hochreguliert waren (13–17, 18–19).
Beispiel 3: Volllängenklonierung von LUMA1
Volllängenklonierung von LUMA1 (Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden)
Das Volllängenklonieren wurde mit dem SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) durchgeführt, um das 5'-Ende der LUMA1-cDNA zu amplifizieren.
Die PCR-Reaktion wurde wie folgt vorbereitet: 1 μl dNTP (10 mM), 1 μl 50 × TaqAdvantagell (Clontech), 5 μl 10 × Puffer, 2,5 μl cDNA, Plazenta (Clontech) (1 μg/μl), 5 μl Universal Primer Mix (Clontech)(10 ×), 1 μl genspezifischer Primer, rückwärts (Clontech), 34,5 μl H₂O.

Universal Primer Mix: CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT (0,4 μm), CTAATACGACTCACTATAGGGC (0,2 μm)
Für LUMA1-Gen spezifischer Primer, rückwärts: GGAGATGGAGCTGTTTGACCTGA

Da durch die PCR-Reaktion keine distinkte Bande erzielt wurde, wurde eine nested PCR durchgeführt:
5 μl primäres PCR-Produkt wurde in 245 μl Tricine-EDTA-Puffer (Clontech) verdünnt (10 mM Tricine-KOH (pH 8,5), 1 mM EDTA)
Die PCR-Reaktion wurde wie folgt vorbereitet: 1 μl dNTP (10 mM), 1 μl 50 × TaqAdvantagell (Clontech), 5 μl 10 × Puffer, 5 μl verdünntes primäres PCR-Produkt, 1 μl Nested Universal-Primer (Clontech)(10 ×), 1 μl nested genspezifischer Primer, rückwärts (Clontech)(10 μm), 36 μl H₂O.

Nested Universal-Primer: AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
Für das LUMA1-Nested-Gen spezifischer Primer, rückwärts: TGTCAGTTGAACATTTTCTGCC

Die folgenden PCR-Bedingungen wurden verwendet, um Volllängentranskripte zu erzeugen:
(94°C 30 Sek. 72°C 3 Min.) – 5 Zyklen
(94°C 30 Sek., 70°C 30 Sek., 72°C 3 Min.) – 5 Zyklen
(94°C 30 Sek., 68°C 30 Sek., 72°C 3 Min.) – 27 Zyklen
Das RACE-Produkt wurde in der Agarose-Gel-Elektrophorese nachgewiesen. Die Banden wurden unter Verwendung des High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) gelgereinigt. Die DNA-Bande wurde aus dem Agarose-Gel (1%) unter Verwendung eines mit Ethanol gereinigten Skalpells ausgeschnitten. Ein Agarose-Gel-Stückchen wurde in ein Röhrchen gegeben und 2 Minuten in flüssigen Stickstoff transferiert. Das Gel-Stückchen wurde in ein Sterilfilter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und 10 Minuten bei 1300 U/min zentrifugiert. 500 μl Bindungspuffer wurden zu jeweils 100 μl Durchfluss hinzugegeben und in ein neues Sterilfilter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Zentrifugierung 1 Min. bei 1300 U/min. Die Probe wurde zwei Mal mit 500 μl Waschpuffer gewaschen und 1 Min. bei 1300 U/min zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. 50 μl Elutionspuffer wurden zum oberen Behälter des Filterröhrchens hinzugegeben. Zentrifugierung 1 Min. bei 1300 U/min. Das Mikrozentrifugenröhrchen enthielt die gereinigte DNA.
Die gereinigte DNA wurde in den pCR-XL-TOPO-Vektor (Invitrogen) geklont und anschließend sequenziert. Sequenzanalyse und Datenbankrecherchen wurden mit dem HUSAR-Programmpaket (DKFZ Heidelberg) durchgeführt. Durch die Sequenzanalyse der geklonten PCR-Produkte wurden 12 neue Exons (A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L) und ein neuer Teil von Exon1 (Exon M) sowie eine 5'-Verlängerung von Exon 8 (Exon T) identifiziert.
Zusätzliche LUMA1-Exons wurden mit den RACE-Experimenten identifiziert. Die Lage der LUMA1-Exons wird im Hinblick auf den genomischen Klon AL359711 angegeben (VERSION AL359711.18 Gl:13234940/Human-DNA-Sequenz von Klon RP11-425D10 auf Chromosom 6, komplette Sequenz) (Zugangsnummer al359711).

Basenpaar

Exon A 16742–16898

Exon B 17967–18132

Exon C 22671–22809

Exon ist differenziell gespleißt

Exon D 28399–28552

Exon E 30422–32094

Exon F 36503–36732

Exon G 37720–37858

Exon H 39288–39408

Exon I 46143–46290

differenziell gespleißt, in der fetalen Lunge vorhanden

Exon J 51443–51552

Exon K 58808–58957

Exon L 59836–59889

Exon M Exon 1 60888–61055

Exon N Exon 2 63342–63494

Exon O Exon 3 63739(63742)–63873

alternativer Start an Basenpaar 63742, Exon ist differenziell gespleißt

Exon P Exon 4 64839–64991

Exon ist differenziell gespleißt

Exon Q Exon 5 66427–66636

Exon ist differenziell gespleißt

Exon R Exon 6 70867–70987

Exon S Exon 7 75227(75279)–75354

alternativer Start von Exon an Basenpaar 75279, beide Exon-Varianten sind differenziell gespleißt, der alternative Start von Exon führt zu einem Frame-Shift, komplettes Exon kann herausgespleißt werden

Exon T Exon 8 76537(77287)–77410

alternativer Start von Exon an Basenpaar 77287, der alternative Start von Exon führt zu einem Frame-Shift
Beispiel 4: Erzeugung von Antikörpern
LUMA1-Peptide wurden verwendet, um gegen diese Polypeptide gerichtete monoklonale sowie polyklonale Antikörper zu produzieren. Für LUMA-Exon 2 wurde das folgende Peptid zur Immunisierung verwendet (C E L I G E V R T E G I D N M K D L K), um polyklonale Antikörper zu erzeugen. Für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern wurden durch das LUMA-Exon 7b (lange Variante) kodierte Peptidsequenzen verwendet (R F L K T N L K G S K I T R C).
A. Produktion der polyklonalen Antikörper:
Die polyklonalen Antikörper wurden durch Affinitätschromatografie gereinigt und anschließend für den Nachweis der entsprechenden Polypeptide in Patientenproben verwendet. Die Verfahren wurden wie folgt durchgeführt:
NZW-Kaninchen (New Zealand White) werden mit 100 μg an KLH (Grundimmunisierung) gekoppelten LUMA1 Peptiden in Freunds komplettem Adjuvans immunisiert und 4 Mal in Intervallen von 4 Wochen mit der gleichen Menge an Protein in Freunds inkomplettem Adjuvans geboostet.
Blut wird eine Woche nach dem 2. Boost genommen und auf dem immobilisierten Antigen einem ELISA unterzogen. Eine Woche nach dem letzten Boost werden Tiere einer Exsanguination unterzogen. Nach der Koagulation wird das endgültige Blut bei 4000 × g 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand aus diesem Schritt wird erneut bei 16600 × g 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand stellt das LUMA1-Rohantiserum dar.
Das Antiserum wird in 2 Schritten gereinigt. Schritt 1 stellt eine konventionelle Protein A-Chromatographie dar. In Schritt 2 wird die Ig-Fraktion von Schritt 1 durch Affinitätschromatografie auf dem auf Sepharose immobilisierten Antigen gereinigt. Das Eluat aus Schritt 2 stellt das gereinigte LUMA1-Antiserum dar.
Das gereinigte Antiserum wird in mehreren Verdünnungen 1/1000–1/1000 000 auf dem immobilisierten Antigen durch Peptid-ELISA getestet. Hiermit werden spezifische Antikörper durch an Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelte sekundäre Anti-Kaninchen-Reagenzien nachgewiesen, mit einer nachfolgenden kolorimetrischen Reaktion (zum Beispiel TMB).
In einem zweiten Ansatz wird das gereinigte Antiserum durch Western Blot mit immobilisiertem Antigen nach SDS-PAGE und dem Transfer auf Nitrozellulose ausgewertet.
Im letzten Auswertungsschritt wird das Antiserum durch Immunhistochemie (IHC) auf Gewebearrays getestet. Mit der Western Blot-Analyse sowie mit IHC werden gebundene Antikörper mit an HRP konjugierten sekundären Anti-Kaninchen-Reagenzien sichtbar gemacht, die eine kolorimetrische Reaktion katalysieren.
B. Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper, die gegen die durch das LUMA-Exon 7b (lange Variante) kodierte Peptidsequenz (R F L K T N L K G S K I T R C) gerichtet sind, wurden wie in Harlow und Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, 1^st Edition, 1988 beschrieben, erzeugt.
Beispiel 6: Immunhistochemischer Nachweis der Expression von LUMA1
Schnitte von in Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben der Lunge wurden unter Verwendung von für LUMA1 spezifischen Antikörpern immunhistochemisch gefärbt.
Diese Schnitte wurden durch Inkubation in Xylol und einer aufsteigenden Alkoholreihe rehydriert und in Aqua bidest transferiert. Die Antigen-Rückgewinnung wurde mit 10 mM Zitratpuffer (pH 6,0) durchgeführt. Deshalb wurden die Objektträger in einem Wasserbad 40 Minuten bei 95°C erhitzt. Die Objektträger wurden 20 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt, in den Waschpuffer transferiert (PBS/0,1% Tween20).
Zur Inaktivierung der endogenen Peroxidase werden die Proben mit 3% H₂O₂ 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 5 bis 10 Minuten in PBS/0,1% Tween20 gewaschen.
Die Objektträger wurden anschließend mit den für Exon 2 (24) bzw. Exon 7 (25, 26) spezifischen primären Antikörpern (2 μg/ml) inkubiert (1 Stunde bei Raumtemperatur) und anschließend mit Waschpuffer gespült und 5 Minuten in ein frisches Pufferbad gesetzt.
Anschließend wurden die Objektträger 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem sekundären Antikörper (Ziege-Anti-Kaninchen (1:500) oder Ziege-Anti-Maus (1:500)) inkubiert. Sie wurden 3 Mal 5 Minuten gewaschen. Die Objektträger wurden 10 Minuten mit 200 μl Substrat-Chromogen-Lösung (DAB) bedeckt. Anschließend wurden die Objektträger wie zuvor gewaschen und 2 Minuten in einem Hämatoxylin-Bad gegengefärbt. Das restliche Hämatoxylin wurde mit destilliertem Wasser abgespült und die Proben wurden mit einem wässrigen Fixiermittel fixiert und eingedeckt.
Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger zeigt, dass die Tumorzellen eine spezifische Immunreaktivität mit dem monoklonalen LUMA1-Antikörper aufweisen, der gegen Exon 7-kodierte Sequenzen gerichtet ist. In den Tumorzellen ist eine spezifische Färbung im Zytoplasma sichtbar.

Die immunochemische Analyse des peripheren venösen Bluts, des Knochenmarks und der Lymphozyten durch die beschriebenen Methoden zeigte keine Immunreaktivität für LUMA1 in Proben, die von normalen Kontrollindividuen stammten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass disseminierte Tumorzellen, welche mit LUMA1 immunreaktiv sind, in diesen Proben durch spezifische immunochemische Färbung mit gegen LUMA1 gerichteten Antikörpern identifiziert werden können. Zusammenfassung der immunhistochemische Analyse von Lungentumorgewebe und entsprechendem normalem Gewebe unter Verwendung eines gegen LUMA1-Exon 7 gerichteten monoklonalen Antikörpers.

Position des Mehrfachgewebearrays	Fallnummer	T/N	Diagnose	Positivität im Epithel	Positivität im Bindegewebe
1 + 2	00-13369	T	Alveolarzellenkarzinom	Tumorzellen 2+ zytoplasmatisch	negativ
3 + 4	00-13369	N	normale Lunge	negativ	negativ
5 + 6	00-30716	T	NSCLC, zum Teil Plattenepithel	Tumorzellen 1–2+ zytoplasmatisch	negativ
7 + 8	00-30716	N	normale Lunge	negativ	einzelne Alveolarmakrophagen
9 + 10	00-24442	T	NSCLC, NOS	negativ	Granulozyten, Plasmazellen 3+
11 + 12	00-24442	N	normale Lunge	negativ	negativ
13 + 14	00-25861	T	NSCLC, zum Teil Plattenepithel	Tumorzellen 1–2+ zytoplasmatisch	Granulozyten
15 + 16	00-25861	N	normale Lunge	negativ	negativ
17 + 18	00-22890	T	Transitionalzellkarzinom	Tumorzellen 1+ zytoplasmatisch	Plasmazellen 3+
19 + 20	00-22890	N	eitrige Pneumonie, alv.-Makrophag	Bronchialepithel, zytoplasmatisch	Granulozyten
21 + 22	00-6335	T	NSCLC, NOS	negativ	Granulozyten, Plasmazellen 3+
23 + 24	00-6335	N	normale Lunge	fehlt	fehlt
25 + 26	01-3009	T	Plattenepithelkarzinom, G3	Tumorzellen 1+ zytoplasmatisch	Granulozyten, Plasmazellen 3+
27 + 28	01-3009	N	normale Lunge	einzelne Pneumozyten	negativ
29 + 30	01-1437	T	Adenokarzinom, G3	Tumorzellen 1+ zytoplasmatisch	Plasmazellen 1+
31 + 32	01-1437	N	normale Lunge	negativ	negativ
33 + 34	01-20774	T	Dysplasie in der Bronchialschleimhaut	n. a.	Fibroblasten 1+
35 + 36	01-20774	N	normale Lunge	negativ	negativ
37 + 38	01-19729	T	Adenokarzinom, G2	negativ	negativ
39 + 40	01-19729	N	Emphysem, Blutgefäß	negativ	negativ
41 + 42	01-9819	T	Karzinoid	Tumorzellen 1–2+ zytoplasmatisch	Plasmazellen 2+
43 + 44	01-9819	N	normale Lunge	negativ	einzelne Granulozyten
45 + 46	00-13368	T	Klarzellenkarzinom	Tumorzellen 0–1 + zytoplasmatisch	Granulozyten 2+
47 + 48	00-13186	N	lymphat. Gewebe,	n. a.	negativ
			Blutgefäße
49 + 50	00-13186	T	Adenokarzinom	negativ	negativ
51 + 52	00-5335	N	normale Lunge	negativ	negativ
53 + 54	00-5879	N	normale Lunge	negativ	negativ
55 + 56	00-11844	T	Plattenepithelkarzinom, G3	negativ	Granulozyten
57 + 58	01-545	N	Duodenalschleimhaut	einzelne Epithelzellen	negativ
59 + 60	01-6112	N	Adipozyten, Bindegewebe, Magen	n. a.	negativ

T = Tumor	maligner Tumor
N = Normal	positiv in normaler Lunge

14 Lungentumore wurden auf die Expression der LUMA-Exon 7-Protein-Isoform analysiert. 8 Tumore wiesen eine positive Färbung auf. Das entsprechende normale Gewebe wies keine Färbung auf. Im Bindegewebe einiger Lungentumore wurde eine Färbung der Entzündungszellen nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Färbung mit für LUMA1-Exon 7-Sequenzen spezifischen Reagenzien es ermöglicht, Tumorzellen in biologischen Proben zu identifizieren. Die auf der Proteinebene erzielten Ergebnisse korrelieren mit den Ergebnissen der Echtzeit-PCR. In beiden Experimenten hat sich gezeigt, dass die LUMA1-Exon 7-Sequenzen (RNA-Sequenzen und Proteinsequenzen) in Tumorzellen spezifisch hochreguliert sind. Im Gegensatz zu den Exon 7-Sequenzen weist das Exon 2 von LUMA keine Hochregulierung auf, weder auf RNA-Ebene noch auf der Proteinebene in Tumorzellen. Dies ist ein eindeutiges Anzeichen dafür, dass nur spezifische LUMA1-Splice-Varianten sowie kodierte Proteinvarianten tumorspezifisch sind.

Claims

In-vitro-Verfahren zur Diagnose von Lungentumoren umfassend die Schritte a. Bestimmung der Level von einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen, die von dem in 11 dargestellten Gen transkribiert wurden oder deren revers-komplementäre Sequenz oder der Polypeptidmoleküle, welche von besagten Nukleinsäuremolekülen kodiert werden, wobei die Nukleinsäuremoleküle, welche von dem in 11 dargestellten Gen transkribiert wurden ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend i. ein Nukleinsäuremolekül umfassend ein Exon mit der Nukleotidsequenz der Nukleotide 15227 bis 15354 oder Nukleotide 15279 bis 15354 gemäß 11 oder deren revers-komplementäre Sequenz; ii. ein Nukleinsäuremolekül umfassend die Nukleotidsequenz oder deren revers-komplementäre Sequenz gemäß 1, 2 oder 3; iii. ein Nukleinsäuremolekül, das sich von der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls gemäß (i)–(ii) aufgrund der Entartung des genetischen Codes unterscheidet; iv. ein Nukleinsäuremolekül, welches eine allele Variante des Nukleinsäuremoleküls aus (i)–(iii) darstellt, und v. ein Polypeptid-kodierendes Nukleinsäuremolekül, welches die Aminosäuresequenz gemäß 1, 2 oder 3 aufweist; b. Vergleichen der Level besagter Nukleinsäuren oder Polypeptide innerhalb besagter Probe mit den Level innerhalb einer entsprechenden Testprobe, die nicht von den getesteten Lungentumoren betroffen ist, c. wobei die Diagnose gestellt wird indem eine Erhöhung des Levels von mindestens einer der besagten Nukleinsäuren oder Polypeptide um mindestens 30% gegenüber dem Wildtyp-Levels als Hinweis auf die Anwesenheit besagter Lungentumoren gewertet wird.
In-vitro-Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Probe ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend a. eine Flüssigkeit, die Nukleinsäuren, Polypeptide oder Fragmente davon enthält; b. eine Flüssigkeit, die Zellen oder Zelltrümmer enthält; c. eine Gewebprobe; d. eine Zellprobe; und e. eine Biopsie.
In-vitro-Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Flüssigkeit, die Nukleinsäuren, Polypeptide oder Fragmente davon enthält, oder die Flüssigkeit, die Zellen oder Zelltrümmer enthält ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend a. eine Körperflüssigkeit; b. Blut; c. Plasma; d. Serum; e. Sputum; und f. ein Sekret.
In-vitro-Verfahren gemäß eines beliebigen der Ansprüche 1–3, wobei die Nukleinsäuremoleküle ausgewählt sind aus mRNA und cDNA.
In-vitro-Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1–4, wobei der Nachweis des Levels der Nukleinsäuren oder Polypeptide mit mindestens einem Bindeagens, welches spezifisch an die nachzuweisenden Nukleinsäuremoleküle oder Polypeptide bindet durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Bindeagens eine nachweisbare Markierung trägt.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Markierung ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Radioisotope, biolumineszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, Metall-Chelate, Biotine, Digoxygenin oder Enzyme.
Verfahren gemäß der Ansprüche 5–7, wobei mindestens ein Bindeagens ein Antikörper ist ausgewählt aus einer Gruppe umfassend a. monoklonale Antikörper; b. polyklonale Antikörper; c. Fab-Fragmente; und d. Einzelketten-Antikörper.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Nachweis ein immunzytochemisches Nachweisverfahren umfasst.
Verfahren gemäß der Ansprüche 5–7, wobei für den Nachweis der Markermoleküle mindestens ein Bindeagens verwendet wird, welches eine Nukleinsäure ist, die an eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 hybridisiert,.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Nachweisreaktion eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion umfasst.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 10–11, welches als In-Situ-Nachweis verwendet wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1–12, welches im Verlauf einer molekularen Bildgebungsmethode verwendet wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1–13, welches im Verlauf von Diagnosen von Funktionsstörungen, von „Minimal Residual Disease" Diagnosen oder vorbeugender Screening-Tests, jeweils im Zusammenhang mit Lungentumoren, durchgeführt wird.
Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1–14, umfassend mindestens a. Reagenzien zur Bestimmung der Level eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle oder durch besagte Nukleinsäuremoleküle kodierte Polypeptidmoleküle, wobei die Nukleinsäuremoleküle Transkripte des Gens aus 11 sind oder deren revers-komplementäre Sequenz und mindestens eines der folgenden umfassen: i. ein Nukleinsäuremolekül umfassend die Nukleotidsequenz von α) Nukleotid 15227 bis 15354; oder β) Nukleotid 15279 bis 15354 gemäß 11 oder deren revers-komplementäre Sequenz; ii. ein Nukleinsäuremolekül, dessen Sequenz sich von der Sequenz des Nukleinsäuremoleküls gemäß (i) aufgrund der Entartung des genetischen Codes unterscheidet; iii. ein Nukleinsäuremolekül, welches eine allele Variante des Nukleinsäuremoleküls gemäß (i)–(ii) darstellt, und iv. ein Polypeptid-kodierendes Nukleinsäuremolekül, welches die Aminosäuresequenz gemäß 1, 2 oder 3 aufweist und b. Reagenzien und Puffer, die üblicherweise für die Durchführung der Nachweisreaktion verwendet werden, wie z. B. Puffer, Detektionsmarker und Trägersubstanzen.
Testkit gemäß Anspruch 15, wobei das Reagenz für den Nachweis des Polynukleotid und/oder Polypeptid ein Agens ist, welches spezifisch an besagtes Polynukleotid und/oder Polypeptid bindet.
Testkit gemäß Anspruch 16, wobei das Reagenz für den Nachweis des Polypeptids ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend a. monoklonale Antikörper; b. polyklonale Antikörper; c. Fab-Fragmente; und d. Einzelketten-Antikörper.