DE60316044T2

DE60316044T2 - Markierungsfreies verfahren zur klassifizierung und charakterisierung zellulärer ereignisse

Info

Publication number: DE60316044T2
Application number: DE60316044T
Authority: DE
Inventors: Vivian Burlingame LIU; Chris Oakland FULLER; Simon San Francisco PITCHFORD; Ed San Jose VERDONK
Original assignee: MDS Inc
Current assignee: Nordion Inc
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2023-07-15
Also published as: EP1664765B1; ATE371865T1; WO2005005979A1; AU2003250657A1; JP2007504801A; CA2531342C; EP1664765A1; DE60316044D1; CA2531342A1; JP4668786B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für ein Marker-freies Ermitteln und Charakterisieren der physiologischen Reaktionen von Zellen unter Verwendung von elektromagnetischer Energie. Insbesondere erlaubt die vorliegende Erfindung ein Überwachen einer spezifischen Rezeptoraktivierung von allen Klassen von Rezeptoren nach einer Störung der Zelle in Echtzeit ohne die Verwendung von Tracermolekülen oder den Bedarf für Systemverstärkungen (wie z.B. eine Transfektion und/oder eine Überexpression) durch Überwachen der zellulären Physiologie (durch elektrische Eigenschaften) in einem Einzeltestformat. Obwohl das Verfahren für viele Klassen von Zelloberflächen- und Cytoplasmarezeptoren verwendet werden kann, haben wir unsere Dikussion nur auf zwei Klassen von Zelloberflächenrezeptoren fokussiert: G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR's) und Proteintyrosinkinase-Rezeptoren (PTKR's). Innerhalb des Gebiets von GPCR's wurden drei Hauptfamilien beschrieben. Diese Familien werden gemäß dem G-Protein klassifiziert, das den Primärsignalübertragungsweg vermittelt, der von den GPCR genutzt wird. Sie werden als Gi, Gs und Gq bezeichnet. Es gibt Subtypen jeder dieser Familien, jedoch haben wir für Studien, welche die Eignung dieser Erfindung zeigen, Liganden verwendet, die nur einen Subtyp von Rezeptoren der Gi-, Gs-, Gq- oder PTKR-Klassen stimulieren. Die Primärsignalgebungswege, die durch eine Stimulation dieser drei Rezeptorfamilien aktiviert werden, sind 1) für Gi-gekoppelte Rezeptoren eine Abnahme von intrazellulärem 3',5'-cyclischen Adenosinmonophosphat (cAMP), 2) für Gs-gekoppelte Rezeptoren eine Zunahme von cAMP und 3) für Gq-gekoppelte Rezeptoren eine Zunahme von intrazellulären Calciumionen.
Experimente, die eine Bioimpedanz und eine zelluläre Analyse verknüpfen, wurden in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Bestehende zelluläre Bioimpedanzmessvorrichtungen, welche die Rezeptorstimulation überwachen, nutzen nur morphologische Änderungen oder üblicherweise nur eine Frequenz. Gheorghiu zeigte, dass α- und β-Verteilungen, die bei 100 Hz bis 10 kHz bzw. bei 100 kHz bis 10 MHz erscheinen, in jedwedem Modell des dielektrischen Verhaltens einer Zelle berücksichtig werden sollten (Gheorghiu: „Characterising Cellular Systems by Means of Dielectric Spectroscopy" (Bioelectromagnetics 17, 475-482 (1996)). α-Verteilungsinformationen ermöglichen die Bewertung des Ruhepotenzials der biologischen Zelle und der Zellmorphologie, während sich Informationen bezüglich der Permittivität und der Leitfähigkeit von zellulären Subkompartimenten – wie z.B. der Zellmembran, des Cytoplasmas – nur im β-Verteilungsbereich zeigen. Mit den bekannten biochemischen Veränderungen sowohl in der Zellmembran als auch im Cytoplasma beim Binden eines Li ganden an einen Membranrezeptor ist ein System, das Bioimpedanzmessungen über den vollen α- und β-Verteilungsfrequenzbereich durchführen kann, in dem Gebiet der Arzneistoffentwicklung nützlich (Smith, Duffy, Shen und Oluff: „Dielectric Relaxation Spectroscopy and Some Applications in the Pharmaceutical Sciences" (Journal of Pharmaceutical Sciences 84, 1029-1044 (1995)), Foster und Schwann: „Dielectric Properties of Tissues and Biological Materials: A Critical Review" (Critical Review in Biomedical Engineering 17, 25-104 (1989))).
Wegener et al. diskutieren Experimente, welche die Verwendung von Messungen der elektrischen Impedanz zur Überwachung der β-adrenergen Stimulation von Rinderaorta-Endothelzellen umfassen (wobei der β-adrenerge ein Rezeptor für den Gs-Subtyp ist) (Eur. J. Physiol. (1999) 437, 925-934), geben jedoch nur Impedanzdaten für eine einzelne Frequenz an, nachdem die Schlussfolgerung gezogen worden ist, dass ein Mehrfrequenz-Abtastmodus für eine Überwachung von schnellen Änderungen von zellulären Eigenschaften nicht so gut geeignet ist wie ein Einzelfrequenzmodus, und geben kein Verfahren zur Klassifizierung von Rezeptorreaktionen an. Ihre gewählte Betriebsfrequenz von 10 kHz scheint im Hinblick auf eine Gewichtung der gemessenen Zellreaktion bezüglich einer Empfindlichkeit vorwiegend im Hinblick auf Änderungen der α-Verteilungsparameter und nicht der β-Verteilungsparameter empfindlich zu sein, wobei es sich um einen Punkt handelt, den die Autoren in der Diskussion ihrer Ergebnisse würdigen. Ihre Ergebnisse sind explizit auf die Modulierung der Ionenströme zwischen den Zellen und dem Substrat, an dem sie haften, sowie auf die Ströme in den parazellulären Räumen zurückzuführen.
Technologien, bei denen eine zelluläre Aktivität und Bioimpedanzmessungen gekoppelt sind, könnten in dem Bereich der Arzneistoffentwicklung eingesetzt werden. Innerhalb dieses Gebiets gibt es viele Technologien zur Durchführung von Zellmessungen. Die meisten der gegenwärtigen Technologien nutzen jedoch einen optischen Marker oder einen radioaktiven Marker als Schlüsselkomponente ihres Nachweisschemas. Ein Beispiel für eine Technologie zur Überwachung eines Rezeptor-Ligand-Bindens ist die FLIPR-Vorrichtung, die von Molecular Devices angeboten wird. Diese Vorrichtung nutzt eine Fluoreszenzsonde zum Nachweis der Freisetzung von Calcium innerhalb einer Zelle als Reaktion auf die Stimulation von Gq-verknüpften GPCR's. Die FLIPR-Technologie nutzt diese Fluoreszenzsonde zum Erreichen der Verstärkung, die zum Nachweis einer Reaktion erforderlich ist. Eine inhärente Hintergrundfluoreszenz von Zellen und von Zellkultivierungsmaterialien ist zusammen mit der Tatsache, dass nur der Gq-Weg mit diesem Ansatz einfach ermittelt werden kann, ein Nachteil.
Ein weiteres Beispiel für Technologien, die auf dieses Gebiet angewandt werden, ist die Verwendung stabil transfizierter Reportergensysteme zur Charakterisierung von GPCR's, wie es von Vertex Pharmaceuticals angeboten wird. Diese Systeme nutzen ein promiskuitives G-Protein, das die mehreren GPCR-Subtypen (Gi, Gs oder Gq) durch einen Weg (typischerweise durch Luciferase- oder beta-Lactamase-Expression) verknüpft, so dass jedwedes G-Protein nur durch die Messung der Lichtabgabe charakterisiert werden kann. Diese Systeme werden häufig auf ein Ligandensuche für die Orphan-GPCR (dabei handelt es sich um GPCR's, deren Ligand unbekannt ist) verwendet, wodurch das Erfordernis für mehrere Testplattformen zum Nachweis der verschiedenen Signalgebungswege vermieden wird. diese Systeme weisen zwei Hauptnachteile auf. Erstens kann die Lichtabgabe von dem Reportergenprodukt innerhalb der Zelle ausgelöscht werden, wodurch ein höheres Expressionsniveau des Rezeptors erforderlich ist, um einen vernünftigen Nachweis zu erreichen. Zweitens erfordert die Bestimmung des tatsächlichen Signalübertragungswegs, sobald der Ligand für die GPCR gefunden worden ist, beträchtliche zusätzliche Arbeiten.
WO 03016887 beschreibt ein Marker-freies Verfahren zum Nachweis einer Änderung der zellulären Aktivität als Ergebnis der Zugabe einer Testsubstanz zu dem Medium, in dem sich die Zellen befinden. Gemäß dieses Verfahrens werden Mikrowellen mittels einer Anwendungsvorrichtung, die z.B. einen Mikrostreifen oder einen coplanaren Wellenleiter umfasst, auf die Zellen angewandt. Die Reaktion dieser Anwendungsvorrichtung auf Mikrowellen wird z.B. mittels eines Netzwerkanalysegeräts bei einer Mehrzahl von Frequenzen gemessen. WO 03016887 beschreibt, dass das Verfahren in einem typischen Arzneistoffentwicklungsverfahren (z.B. Treffernachweis, Leadauffindung oder Leadoptimierung) verwendet werden könnte. In einer spezifischen Ausführungsform wurde der muskarinische m1-Rezeptor, der in CHOk1-Zellen (Eierstock-Wildtyp-Zellen vom chinesischen Hamster) transfiziert worden ist, um (transfizierte) CHOm1-Zellen zu bilden, in der Gegenwart eines Agonisten aktiviert. In einem solchen Test wurden CHOm1- und CHOk1-Zellen mit Carbachol, einem bekannten Aktivierungsmittel des m1-Rezeptors, behandelt. Messungen wurden über dem Bereich von 50 MHz bis 1 GHz durchgeführt. In einer ersten Reihe von Messungen, die 7 min nach der Zugabe von Carbachol durchgeführt wurden und über den angegebenen Frequenzbereich aufgetragen worden sind, waren nicht-transfizierte Zellen (CHOk1) Kontrollen ähnlich, während transfizierte Zellen (CHOm1), die mit 10 μM Carbachol behandelt worden sind, bei allen Frequenzen über dem getesteten Bereich eine signifikante Signaländerung zeigten. In manchen Fällen wurde das Signal über dem 50 MHz- bis 1 GHz-Bereich integriert und das resultierende Integral für das Signal einer Testverbindung/eines zellulären Systems wurde mit dem integrierten Signal für einen Puffer/zelluläres System verglichen. In einem solchen Test zeigten CHOk1-Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Carbachol behandelt worden sind, im Wesentlichen keine Änderung des Signals im Zeitverlauf, während transfizierte CHOm1-Zellen nach der Zugabe verschiedener Konzentrationen an Carbachol einen typischen Dosis/Reaktion-Effekt einer erhöhten Aktivität im Zeitverlauf zeigten. Gemäß WO 03016887 kann dieses Verfahren folglich verwendet werden, um eine Agonisten- und Antagonistenaktivität nachzuweisen und zu unterscheiden.
Demgemäß besteht ein Bedarf zur Entwicklung von Marker-freien Bioimpedanzcharakterisierungsverfahren, die über einen Frequenzbereich messen, der groß genug ist, um sowohl α-als auch β-Verteilungsinformationen zu liefern, so dass die physiologische Reaktion einer Zelle auf eine Stimulation genauer charakterisiert wird. Die vorliegende Erfindung bringt die Details der Änderung von elektrischen Eigenschaften mit dem ausgelösten Weg der Familie der zweiten Messenger in Zusammenhang und zeigt das Vermögen zur Klassifizierung von Wegen auf der Basis von Änderungen der zellulären elektrischen Eigenschaften ohne jedwede vorherige Kenntnis des untersuchten Rezeptors oder Wegs. Das Vermögen zum Zuordnen eines unbekannten Liganden zu einer Wechselwirkung mit einem spezifischen Weg stellt einen Hauptvorteil gegenüber der bekannten Technologie dar. Keine bekannte Technologie kann alle diese Signalübertragungswege gleichzeitig klassifizieren. Mit unserem System wird die Wegklassifizierung für den Orphan-Rezeptor gleichzeitig mit der Ermittlung des Liganden und ohne das Erfordernis der Erzeugung stabiler transfizierter Zelllinien, die Reportergensysteme enthalten, erreicht. Darüber hinaus erfordert die vorliegende Erfindung anders als andere Charakterisierungstechnologien nicht die Verwendung von Markern, um die Stimulation von Wegen nachzuweisen, und sie muss die Rezeptoranzahl durch eine Transfizierung nicht künstlich verstärken, um eine Reaktion nachzuweisen.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Die Erfindung wird lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen weiter beschrieben, worin:
1a ein Blockdiagramm ist, das eine Ausführungsform des Bioimpedanzmesssystems veranschaulicht.
1b ein Bioimpedanzsystem veranschaulicht, das gemäß einer Ausführungsform des Charakterisierungsverfahrens verwendet wird.
2 die Schritte des zellulären Bioimpedanzcharakterisierungsverfahrens veranschaulicht.
3 Rohwerte für die Impedanzgrößendifferenzen für vier Hauptrezeptorfamilien zeigt.
4 Legendreparametergraphen für drei Gs-Rezeptoren auf CHO-Zellen zeigt.
5 Legendreparametergraphen für drei Gq-Rezeptoren auf CHO-Zellen zeigt.
6 einen Vergleich von Parametergraphen für Gs- und Gq-Rezeptoren auf CHO-Zellen zeigt.
7 Legendreparametergraphen für drei Gq-Rezeptoren auf HeLa-Zellen zeigt.
8 Legendreparametergraphen für zwei Gi-Rezeptoren auf HeLa-Zellen zeigt.
9 Legendreparametergraphen von drei PTKR-Rezeptoren auf HeLa-Zellen zeigt.
10 einen Vergleich von Parametergraphen für Gq- und Gi-Rezeptoren auf HeLa-Zellen zeigt.
11 einen Vergleich von Parametergraphen für Gq eines PTKR-Rezeptors auf HeLa-Zellen zeigt.
12 einen Vergleich von Parametergraphen für Gi- und PTKR-Rezeptoren auf HeLa-Zellen zeigt.
13 eine Analysenmatrix für die Datenklassifizierung für CHO-Zellen zeigt.
14 eine Analysenmatrix für Daten für HeLa-Zellen zeigt.
Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Klassifizierung verschiedener zellulärer Ereignisse, wie z.B. der Aktivierung eines Signalgebungswegs. Insbesondere ermöglicht sie die Zuordnung eines spezifischen zweiter Messenger-Wegs zu einem unbekannten Ligand/Rezeptor-Paar, ohne dass molekulare Marker verwendet werden. Die Klassifizierung basiert auf Änderungen der elektrischen Eigenschaften der Zelle. Lebende Zellen werden in eine elektrische Schaltung einbezogen. Die Eigenschaften dieser Schaltung werden durch diese Zellen beeinflusst. Diese Eigenschaften können durch Mehrfachfrequenzmessungen über einen Bereich von Frequenzen gemessen werden. Es sollte beachtet werden, dass die zellulären Ereignisse die Zelle-Schaltung-Wechselwirkungen sowie die elektrischen Eigenschaften der Zelle verändern können. Die Änderungen der Zelle-Schaltung- Wechselwirkungen können Änderungen der Details der Zellpositionierung und -Bindung bezüglich der Elektroden oder Änderungen der Zellmorphologie umfassen. Diese durch ein zelluläres Ereignis induzierten Änderungen der Zelle-Schaltung-Wechselwirkungen können zur Klassifizierung der zellulären Ereignisse beitragen. Frequenzen des elektromagnetischen Spektrums (z.B. Mikrowellen, Radiowellen, Schall, IR, optisch, Röntgenstrahlen) werden verwendet. Um den Durchsatz zu erhöhen, können elektrische Schaltungen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte einbezogen werden. In einer Ausführungsform wird eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verwendet. Alternative Ausführungsformen umfassen Platten mit einer unterschiedlichen Anzahl an Vertiefungen. Daten können vor, während und nach dem Zusatz eines spezifischen Rezeptorliganden oder eines anderen Reizes gesammelt werden. Wenn die Zellen auf diesen Stimulus reagieren, werden sich auch die gemessenen elektrischen Eigenschaften ändern.
In einer Ausführungsform besteht unsere elektrische Schaltung aus ineinander greifenden coplanaren Elektroden, die auf dem Boden einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen strukturiert sind, obwohl zusätzlich 2-D- und 3-D-Ausführungsformen verwendet werden können, wie z.B. coplanare Wellenleiter, coaxiale Elektroden, Elektroden mit parallelen Platten oder jedwede andere mikroskopische oder makroskopische Elektrodengeometrie, die üblicherweise verwendet wird, um die elektrischen Eigenschaften einer festen oder flüssigen Probe festzustellen. Obwohl alternative Elektrodentypen verwendet werden können, haben wird in einer Ausführungsform ineinander greifende coplanare Elektroden verwendet, da sie verglichen mit anderen Elektrodentypen einen größeren Empfindlichkeitsbereich aufweisen und bezüglich Änderungen des Vertiefungsdurchmessers weniger empfindlich sind. 1. Zellen in einem physiologischen Puffer werden auf die Oberfläche plattiert, die partiell mit den Elektroden bedeckt ist und jede Vertiefung kann über einen Signalmultiplexer mit einer oder mehreren Impedanzanalyseeinrichtung(en) verbunden werden. Unter Verwendung der Impedanzanalyseeinrichtung werden sowohl die Impedanzgröße als auch die Impedanzphase über einem Frequenzbereich von 40 Hz bis 110 MHz in periodischen Intervallen aufgezeichnet. Bei diesen Frequenzen handelte es sich um den gesamten Bereich, der auf der verwendeten Agilent-Impedanzanalyseeinrichtung eingesetzt werden kann und den typischen alpha- und beta-Verteilungsbereich für Zellen in physiologischem Puffer abdeckt. Zusätzliche Informationen (Verteilungen) können bei höheren Frequenzen erhalten werden, einschließlich die gamma-Verteilungen von gebundenem Wasser (GHz-Bereiche), wobei dies jedoch bei der vorliegenden Vorrichtungsarchitektur aufgrund von Mikrowellenresonanzeffekten schwieriger wird. Alternative Ausführungsformen nutzen verschiedene Frequenzbereiche. Repräsentative Frequenzbereiche von alternativen Ausführungsformen umfassen 10 Hz bis 1000 GHz, 100 Hz bis 500 GHz und 100 Hz bis 1 GHz.
Bei der Wechselwirkung des Liganden mit dessen Rezeptor unterliegt die Zelle physiologischen Veränderungen im Zeitverlauf, welche die gemessenen elektrischen Eigenschaften verändern. Wie es vorstehend angegeben worden ist, sind die Änderungen der elektrischen Eigenschaften der Zelle ausreichend, um zu unterscheiden, welcher zweiter Messenger-Weg die zellulären Veränderungen ausgelöst hat. In einer Ausführungsform unseres Verfahrens liegt die erforderliche Information über die zellulären elektrischen Eigenschaften in der sich ändernden Impedanz vor. In alternativen Ausführungsformen können ähnliche Datensätze verwendet werden; wenn z.B. komplexe Reflexionskoeffizienten (S-Parameter) aufgezeichnet werden, würde die gleiche Information vorliegen, da S-Parameterdaten in Impedanzdaten umgewandelt werden können. Andere Beispiele umfassen die Messung des Widerstands, der Reaktanz, des Scheinleitwerts, des Wirkleitwerts oder des Blindleitwerts.
In anderen alternativen Ausführungsformen wird die Klassifizierung unter Verwendung anderer Informationen (Impedanz bei weniger Frequenzen, nur die Impedanzgröße, nur die Impedanzphase, oder Eigenschaften wie z.B. der Schaltungsgesamtwiderstand oder die Schaltungsgesamtkapazität, oder Änderungen der Schaltungsspannung oder des Schaltungsstroms) durchgeführt. Während sorgfältige Untersuchungen noch vervollständigt werden müssen, legen vorläufige Beweise nahe, dass einfachere Messungen für die Klassifizierung des Wegs ausreichen werden.
In einer repräsentativen Ausführungsform der Erfindung werden die Impedanzdaten in der in der 2 gezeigten Weise verarbeitet. Als erstes wird für jeden Zeitpunkt die Impedanz über einen Bereich von Frequenzen gemessen, nachdem Zellen mit bekannten Rezeptortypen in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte (Element 210 in der 2) eingebracht worden sind. Zweitens wird ein Zeitpunkt gewählt, der nahe an der Substanzzugabe, jedoch unmittelbar vorher liegt, und die „Bezugs"-Impedanz 212 wird gemessen. In der Ausführungsform von 2 ist die Substanz ein interessierender Arzneistoff, jedoch kann die Substanz in alternativen Ausführungsformen ein spezifischer Ligand, ein Protein, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure, Wasser, ein Ion oder jedwede andere interessierende Substanz sein. Nach der Arzneistoffzugabe (213, 214) wird an jedem nachfolgenden Zeitpunkt für jede Frequenz die Impedanz über einen Bereich von Frequenzen 216 gemessen und die „Bezugs"-Impedanzgröße und -phase 218 subtrahiert. Unsere Daten bestehen nun aus Änderungen der Impedanzgröße und -phase für jede Frequenz, die durch die Arzneistoffzugabe induziert worden sind. Viertens werden dann die Impedanzänderungsspektren unter Verwendung der Legendrepolynome angepasst, um die zelluläre Reaktion 222 zu parametrisieren. Insbesondere wird in einer Ausführungsform an jedem Zeitpunkt die Änderung der Im pedanzgröße an 7 Legendrepolynome angepasst und die Änderung der Impedanzphase wird an 7 Legendrepolynome angepasst. An jedem Zeitpunkt liegen dann 7 Koeffizienten von den Größendaten und 7 Koeffizienten für die Phasendaten vor. Wenn diese Sätze von Koeffizienten als Funktion der Zeit aufgetragen werden, enthalten die Graphen „kinetische" Trends, die durch Betrachten häufig mit spezifischen zweiter Messenger-Wegen in Zusammenhang gebracht werden können. Die objektive quantitative Klassifizierung, die durch einen Computer durchgeführt wird, beruht jedoch nicht auf diesen Strukturen und Trends. Vielmehr benötigt der Computeralgorithmus nur die Koeffizienten an einem Zeitpunkt nach der Arzneistoffzugabe (entsprechend den Impedanzdaten, die an diesem Zeitpunkt und zu der ausgewählten Vor-Arzneistoff-Zugabezeit gesammelt werden). Die Sätze von 7 Größenkoeffizienten und von 7 Phasenkoeffizienten werden dann mit Koeffizientensätzen von bekannten Wegen (von einem Trainingsdatensatz) verglichen und unter Verwendung von mehrdimensionalen Datenklassifizierungs-Standardalgorithmen einem bekannten Weg zugeordnet. Alternative Ausführungsformen können Koeffizienten, die an mehr oder weniger Legendrepolynome angepasst sind, oder zeitabhängig Merkmalsvektoren, die mit alternativen Verfahren parametrisiert worden sind, enthalten. Unter Verwendung von Impedanzdaten kann die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung in einer der vier Kategorien Gi, Gs, Gq oder PTKR klassifiziert werden. Folglich haben wir ein Werkzeug erzeugt, das nunmehr anschließend einen unbekannten Liganden einer Wechselwirkung mit einem Rezeptor der vorstehend genannten Klassen zuordnen kann.
Auffinden eines unbekannten Liganden
In einer repräsentativen Ausführungsform des Verfahrens zur Zuordnung eines unbekannten Liganden mit potenzieller pharmazeutischer Aktivität werden nach dem Anordnen von Zellen mit einem bekannten Rezeptortyp in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte (Element 230 von 2) die „Bezugs"-Impedanzgröße und -phase über einen Bereich von Frequenzen an einem Zeitpunkt gemessen, der nahe an der Arzneistoffzugabe 232, jedoch unmittelbar vor dieser liegt. Nachdem der Arzneistoff, der den Liganden enthält, zugesetzt worden ist 233, 234, werden die Impedanzgröße und -phase über einen Bereich von Frequenzen an jedem nachfolgenden Zeitpunkt für jede Frequenz gemessen 236, und die „Bezugs"-Impedanzgröße und -phase werden subtrahiert 238. Als nächstes werden die parametrisierten Koeffizienten der zellulären Reaktion auf den unbekannten Liganden berechnet und mit den Koeffizienten für bekannte Liganden verglichen 240, 242, 244. Die Klassifizierung der zellulären Reaktion auf den unbekannten Liganden unter Verwendung einer bekannten Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung ergibt wertvolle Informationen bezüglich der zellulären Reaktion, des stimulierten Rezeptorsubtyps und des zweiter Messenger-Wegs.
Auffinden des Orphan-Rezeptors
Entsprechend ermöglicht das Aussetzen intakter Zellen mit Orphan- oder unbekannten Rezeptoren gegenüber potenziellen Ligandenverbindungen das Auffinden des Liganden für den Orphan, wodurch der Rezeptor entorphanisiert wird. Gleichzeitig wird der Signalübertragungsweg, der von dem Rezeptor genutzt wird, durch einen Vergleich mit bekannten Strukturen, die von Trainingssätzen abgeleitet sind, bestimmt (260-276).
Diskussion experimenteller Daten
Die hier diskutierten Untersuchungen konzentrierten sich auf die Analyse von Rezeptoren der folgenden Typen. In der Kategorie von GPCR's wurden mit Gi, Gs und Gq zusammenhängende Rezeptoren untersucht. Darüber hinaus wurden verschiedene PTKR-Rezeptoren untersucht. Gi-, Gs- und Gq-Rezeptoren wurden in Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) untersucht, während Gi-, Gq- und PTKR-Rezeptoren in menschlichen Gebärmutterhals-Adenokarzinomzellen (HeLa) untersucht wurden. Die Daten werden in drei Kategorien dargestellt. Bei der ersten Kategorie handelt es sich um Impedanzdifferenzrohdaten, um eine Probe der tatsächlichen Daten zu zeigen. Bei der zweiten Kategorie handelt es sich um Legendrepolynom-parametrisierte Daten und bei der dritten Kategorie handelt es sich um mehrdimensionale Klassifizierungsdaten.
Zellen werden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die ineinander greifende Elektroden enthalten, die am Boden der Vertiefungen angebracht sind, eingebracht. Die Zellen werden in Standardgewebekulturmedien, die Serum enthalten, plattiert, und haften über Nacht in einem Standard-CO₂-Inkubator bei 37°C an. Am nächsten Tag werden die Platten, die anhaftende Zellen enthalten, mit HANKS ausgewogener Salzlösung, die 10 mM HEPES enthält (HH), gespült. HH wird dann den Vertiefungen zugesetzt und die Platten werden 1 Stunde bei Raumtemperatur äquilibrieren gelassen. Die Platten werden dann auf das Lesegerät bewegt und für 15 min werden Grundwertmessungen durchgeführt. Am Ende der 15 min werden den geeigneten Vertiefungen Liganden für die verschiedenen Rezeptoren zugesetzt und alle 20 s werden Werte für 30 min abgelesen. Die Vor-Zugabe-15 min-Grundwertdaten werden von den Nach-Zugabe-Daten subtrahiert und das Ergebnis wird als Impedanzgrößenrohdifferenz aufgetragen. Die 3 zeigt die Ergebnisse, wenn Liganden für Gq, Gi, Gs, GPCR's und für einen PTKR Zellen zugesetzt werden. Die Zahlen bei den Spuren beziehen sich auf die Anzahl von Minuten, die seit der Zugabe des Liganden vergangen sind. Wie es in dieser Figur ersichtlich ist, erzeugt jeder der Liganden bei der Im pedanzgrößendifferenz charakteristisch unterschiedliche Reaktionen. Diese Figur stellt eine Probe der tatsächlich erhaltenen Daten dar. Eine quantitative Analyse dieser Daten erwies sich als schwierig und daher wurde ein Mittel zur Parametrisierung der Daten unter Verwendung der Legendrepolynome entwickelt.
Legendreparametergraphen sind in den 4 bis 12 gezeigt. Die 4, 5 und 6 stellen Daten dar, die unter Verwendung von CHO-Zellen gesammelt worden sind, und die 7 bis 12 stellen Daten dar, die unter Verwendung von HeLa-Zellen gesammelt worden sind. Gemäß der 4 wurden zur Erzeugung der Daten drei verschiedene Liganden verwendet, die drei verschiedene Gs-Rezeptoren stimulieren. Die Rezeptoren waren der Calcitonin C1a-(endogen), der prostanoide EP4-(endogen) und der beta3-adrenerge (transfizierte) Rezeptor. Wie es vorstehend beschrieben worden ist, erzeugt die Transformationsanalyse 7 Parameter für die Impedanzgröße und 7 Parameter für die Impedanzphase. Diese Parameter sind in den Graphen mit C0 bis C6 bezeichnet. Für jeden Rezeptor ist ein Satz von zwei Graphen ersichtlich. Der obere Graph zeigt die Legendrepolynome für die Impedanzgröße und der untere Graph zeigt diejenigen für die Impedanzphase. In dieser Figur ist die Größe der Änderung des Parameterwerts auf der y-Achse gegen die Zeit (vom Beginn der Grundwertdaten) auf der x-Achse aufgetragen. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Für jeden Datenpunkt lag ein N von 16 bis 20 vor. Wenn die Daten auf diese Weise transformiert werden, ergeben sich klare Strukturen. Die in dieser Figur ersichtlichen Strukturen wurden dann als die Gs-Strukturen für CHO-Zellen bezeichnet. Diese Figur ist für die Arten von Strukturen, die unter Verwendung dieses Analyseverfahrens erzeugt werden, repräsentativ. Die 5 zeigt die Ergebnisse einer ähnlichen Transformation, jedoch wurden diesmal Liganden für die muskarinischen M1-(transfiziert), muskarinischen M3-(transfiziert) und P2Y-(endogen), Gq-Rezeptoren in CHO-Zellen verwendet. Es ist ersichtlich, dass sich aus den Graphen klar unterschiedliche Gq-Strukturen ergeben. Die in dieser Figur ersichtlichen Strukturen wurden dann als die Gq-Strukturen für CHO-Zellen bezeichnet. Die 6 zeigt eine Gegenüberstellung von einem Satz von Gs-Strukturen mit einem Satz von Gq-Strukturen. Die Differenzen zwischen den Strukturen sind signifikant und stellen die erste klare Demonstration des Nutzens unseres Verfahrens bereit.
In den 7 bis 9 wurden ähnliche Transformationen von Daten von HeLa-Zellen durchgeführt, die mit Liganden für drei Gq-Rezeptoren (Bradykinin, Endothelin-1 und P2Y (alle endogen), 7), zwei Gi-Rezeptoren (alpha2-Adrenozeptor, CXCR-4 (beide endogen), 8) und drei PTKR-Rezeptoren (epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF) und Hepatocytenwachstumsfaktor (HGF) (alle endogen), 9) stimuliert worden sind, um die Ergebnisse auf eine zusätzliche Zelllinie zu erweitern und eine weitere Rezeptorfamilie, die PTKR's, einzubeziehen. Die Ergebnisse zeigen für jeden Rezeptortyp innerhalb der Zelllinie verschiedene Strukturen. Die Verschiedenheit zeigt sich bei den in den 10 bis 12 gezeigten Gegenüberstellungen. Die 10 zeigt den Vergleich von einem Satz von Strukturen für Gq mit einem Gi-Satz. Die 11 zeigt den Vergleich des gleichen Satzes von Gq-Strukturen mit demjenigen, der durch einen repräsentativen PTKR erzeugt worden ist. In der 12 ist der letzte Vergleich zwischen dem Gi-Satz und dem PTKR-Satz gezeigt. Diese Daten zeigen deutlich, dass sich die verschiedenen intrazellulären Wege, die durch diese Liganden aktiviert werden, in Graphen der Legendreparameter als verschiedene Strukturen zeigen. Diese Korrelation ist die Basis für unser Klassifizierungsschema. Die Stimulation eines unbekannten Rezeptors, die zur Erzeugung einer Struktur führt, die den dargestellten Strukturen ähnlich ist, kann unter Verwendung des intrazellulären Wegs, der durch diese Struktur identifiziert worden ist, einfach klassifiziert werden.
Um zu verifizieren, was durch eine visuelle Untersuchung der Parameterstrukturergebnisse geschlossen werden kann, wurden die Daten mehrdimensionalen Datenklassifizierungsstandardtechniken unterzogen. Diese Analysen sind in den 13 und 14 dargestellt. Trainingssätze von Strukturdaten wurden gesammelt und in den Prozess eingespeist. Dann wurden nachfolgende Daten getestet, um zu sehen, ob die Klassifizierungstechnik den Daten den geeigneten, genutzten zweiter Messenger-Weg (Rezeptortyp) richtig zuordnen konnte. Die 13 zeigt die Analyse der CHO-Daten und die 14 zeigt die Analyse der HeLa-Daten. In beiden Fällen konnten die Algorithmen den Rezeptortyp mit relativ kleinen Fehlerraten einfach vorhersagen. Folglich haben wir gezeigt, dass dieses zelluläre Analyseverfahren den zweiter Messenger-Weg, der von einem Rezeptor genutzt wird, aus den Strukturdaten einfach und stabil vorhersagen kann.
Anwendungen der Technologie
Das hier beschriebene Marker-freie Klassifizierungs- und Charakterisierungsverfahren kann in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden:
Fall #1: Trefferidentifizierung für Agonisten bekannter transfizierter Rezeptoren
In diesem Fall wird das Verfahren für eine Trefferidentifizierung für Agonisten bekannter Rezeptoren verwendet. Die Frage, die von einem Pharmaunternehmen gestellt wird, ist: Gibt es Agonisten für bekannte Rezeptoren, die innerhalb der Verbindungsbibliothek des Unternehmens enthalten sind?
Das Beispiel, das wir hier verwenden, umfasst transfizierte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR's) (abhängig von dem Bedarf des Kunden können andere Rezeptortypen verwendet werden), und die Vorgehensweise ist wie folgt. Die interessierenden Rezeptoren werden in eine Zelllinie transfiziert, von der bekannt ist, dass sie die zweiter Messenger-Einrichtung aufweist, die zur Übertragung von Signalen von dem Rezeptor erforderlich ist. Eine Stammzelllinie wird mit einer non-sense-Sequenz transfiziert, um als Kontrolle für den Transfizierungsprozess während der Datenanalyse verwendet zu werden. Unbekannte Verbindungen (potenzielle Liganden) werden dann sowohl gegen die sense- als auch gegen die non-sense-transfizierten Zelllinien getestet. Wenn in der sense-transfizierten Gruppe eine Stimulation festgestellt wird und in der non-sense-Gruppe nicht, ist ein Treffer erhalten worden. Die Reaktionsstärke des Treffers würde mit der maximalen Reaktion verglichen werden, die mit einem bekannten Rezeptoragonisten erzeugt wird.
Die Vorteile unseres Verfahrens in diesem Anwendungsfall sind wie folgt. Unser Verfahren erfordert eine minimale Testentwicklung ohne einen Bedarf für Reportersysteme, um die Reaktion des transfizierten Rezeptors zu sehen, ohne Bedarf für zusätzliche Reagenzien oder Fluoreszenzmarker, und es kann mit vielen verschiedenen Arten von Rezeptoren, einschließlich GPCR's, Proteintyrosinkinase (PTKR) und Kernrezeptoren, verwendet werden. Kein anderes Einzelverfahren oder -gerät für die Analyse von GPCR-zweiter Messenger-Wegen kann alle drei (Gi, Gs und Gq) Wege auf der gleichen Plattform analysieren, wie dies hier der Fall ist. Darüber hinaus kann es mit anhaftenden und nicht-anhaftenden Zellen verwendet werden.
Fall #2: Trefferidentifizierung und Wegklassifizierung für Agonisten unbekannter transfizierter Rezeptoren
Auch in diesem Fall wird wieder eine Trefferidentifizierung beschrieben, jedoch wird nunmehr eine Beschreibung des Leistungsvermögens für eine Wegklassifizierung für Agonisten unbekannter transfizierter Rezeptoren hinzugefügt. Für diesen Fall wird die Entorphanisierung von Orphan-GPCR's beschrieben.
Die interessierenden Rezeptoren sind hier Orphan-GPCR's (oGPCR's). Dabei handelt es sich um Rezeptoren, die während der Sequenzierung des menschlichen Genoms gefunden wurden und bei denen es sich um potenziell extrem wichtige Mediatoren vieler Erkrankungsprozesse handelt. Gegenwärtig sind deren Liganden nicht bekannt und die zweiter Messenger-Wege, die sie nutzen, sind ebenfalls unbekannt. In diesem Fall wird erneut eine Datenbank von Strukturen (ein Trainingssatz) für HEK293-Zellen (oder jedwede andere Zelllinie, abhängig von dem Bedarf des Kunden) erstellt, die Strukturen umfasst, die während der Stimulation mit Liganden erzeugt worden sind, die für Gi-, Gs- oder Gq-GPCR's spezifisch sind. Das oGPCR-Gen wird in HEK293-Zellen transfiziert und die Mutterzellen werden non-sense-transfiziert. Beide Zelllinien werden dann der Verbindungsbibliothek des Unternehmens ausgesetzt. Wenn in der oGPCR-Gruppe eine Stimulation festgestellt wird und in der non-sense-Gruppe nicht, ist ein Treffer erhalten worden. Diese Stimulation wird eine Struktur erzeugen, die dann mit den in der Datenbank vorhandenen Strukturen verglichen werden kann, und folglich wird gleichzeitig der von dem oGPCR genutzte zweiter Messenger-Weg bestimmt.
Unser Verfahren stellt ein extrem leistungsfähiges Werkzeug für die Entorphanisierung von GPCR's dar. Mit diesem Verfahren können Informationen bezüglich der Trefferidentifizierung und den durch den oGPCR genutzten Weg gleichzeitig erhalten werden. Kein anderes Einzelverfahren oder Gerät, das auf dem Markt ist, kann dies erreichen. Dies wird enorme Einsparungen an Zeit und Reagenzien für Pharmaunternehmen, die an oGPCR's interessiert sind, bringen. Alle anderen Systeme, die gegenwärtig auf dem Markt sind, beruhen auf molekularen Markern oder transfizierten Reportergensystemen und erfordern umfangreiche Arbeiten nach der Trefferidentifizierung, um den durch den oGPCR genutzten zweiter Messenger-Weg zu bestimmen. Mit unserem Verfahren ist keine dieser zusätzlichen Arbeiten erforderlich.
Fall #3: Bestimmung von EC₅₀-Werten und der Einstufung der Wirksamkeit für Agonisten von bekannten und unbekannten, transfizierten und endogenen Rezeptoren
In diesem Fall wird beschrieben, wie unser Verfahren und unser Gerät zur Bestimmung von EC₅₀-Werten und der Einstufung der Wirksamkeit für Agonisten verwendet werden können.
Sowohl für bekannte als auch für unbekannte Rezeptoren werden dann, sobald ein Ligand identifiziert und mit dessen Rezeptor abgeglichen worden ist, EC₅₀-Werte unter Verwendung unseres Systems einfach erhalten. Der Ligand wird den Zellen in zunehmenden Konzentrationen zugesetzt und die Reaktion wird im Zeitverlauf aufgezeichnet. Die kinetische Information wird aufgezeichnet, um zu bestimmen, wann die Reaktion einen Maximalwert erreicht hat. Das maximale Impedanzsignal, das an einem eingestellten Endpunkt aufgezeichnet worden ist, wird gegen die zugesetzte Konzentration aufgetragen und die Daten werden an sigmoidale Kurven angepasst. Die EC₅₀-Werte werden dann aus den Anpassungsgleichungen berechnet. Die Einstufung der Wirksamkeit einer Reihe strukturell ähnlicher Agonisten kann durch Vergleichen der EC₅₀-Werte, die für jede Verbindung in separaten Experimenten erzeugt worden sind, erreicht werden. Folglich können das gleiche Verfahren und das gleiche Gerät, die den Liganden und den zweiter Messenger-Weg des Rezeptors bestimmen können, zur Erzeugung von EC₅₀-Werten und Wirksamkeitseinstufungen verwendet werden. In diesem Fall wird nur ein kleiner Teil der Informationen verwendet, die in unserem Verfahren gesammelt werden. Bei dem Ergebnis handelt es sich jedoch um sehr gut geeignete pharmazeutische Informationen.
Die Vorteile unseres Verfahrens und Geräts in diesem Fall sind mit denjenigen identisch, die für den Fall #1 angegeben worden sind. Darüber hinaus stellt unser Verfahren die einfache Analyse aller Arten von endogenen Rezeptoren bereit, ohne dass molekulare Marker erforderlich sind, wohingegen alle anderen Verfahren unter Verwendung irgendeiner Form eines Markers arbeiten. Dadurch wird der Vorteil erhalten, dass mehr physiologisch relevante Informationen erzeugt werden. Ein weiterer Vorteil ist die Tatsache, dass wir diese Analyse in Echtzeit erhalten können, ohne dass eine Zelllyse oder -fixierung erforderlich ist. Ein zusätzlicher Vorteil besteht darin, dass nur ein Gerät erforderlich ist, um viele Ziele zu erreichen, die mit der Analyse einer zellulären Reaktion zusammenhängen.
Fall #4: Zielidentifizierung, Bestimmung von IC₅₀-Werten und Einstufung der Wirksamkeit für Antagonisten von bekannten und unbekannten, transfizierten und endogenen Rezeptoren
In diesem Fall wird beschrieben, wie unser Verfahren und unser Gerät zur Bestimmung von EC₅₀-Werten und der Einstufung der Wirksamkeit für Agonisten verwendet werden können.
Sowohl für bekannte als auch für unbekannte Rezeptoren wird dann, sobald ein Ligand identifiziert und mit dessen Rezeptor abgeglichen worden ist, die Bestimmung einer Trefferidentifizierung und von IC₅₀-Werten für Antagonisten unter Verwendung unseres Systems einfach erreicht. Für eine Antagonistentrefferidentifizierung würde die Verbindungsbibliothek des Unternehmens auf Zellen angewandt werden, die den interessierenden Rezeptor enthalten. Nach der Stimulation mit einem bekannten oder gefundenen Liganden würden sich Treffer als gedämpfte Reaktionen zeigen. Für IC₅₀-Wert-Bestimmungen wird der Antagonist den Zellen mit zunehmenden Konzentrationen zugesetzt und die Reaktion auf die halbe maximal stimulierende Konzentration an Agonist wird im Zeitverlauf verfolgt. Die kinetischen Informationen werden aufgezeichnet, um zu bestimmen, wann die Inhibierung einen Maximalwert erreicht hat. Das minimale Impedanzsignal, das an einem eingestellten Endpunkt aufgezeichnet worden ist, wird gegen die zugesetzte Inhibitorkonzentration aufgetragen und die Daten werden an sigmoidale Kurven angepasst. Die IC₅₀-Werte werden dann aus den Anpassungsgleichungen berechnet. Die Einstufung der Wirksamkeit einer Reihe von strukturell ähnlichen Antagonisten kann durch Vergleichen der IC₅₀-Werte, die für jede Verbindung in separaten Experimenten erzeugt worden sind, erreicht werden. Folglich können das gleiche Verfahren und das gleiche Gerät, die den Liganden und den zweiter Messenger-Weg des Rezeptors identifizieren können, verwendet werden, um eine Antagonistentrefferidentifizierung durchzuführen, IC₅₀-Werte zu erzeugen und eine Einstufung von Inhibitoren bezüglich der Wirksamkeit durchzuführen. Auch in diesem Fall wird nur ein kleiner Teil der Informationen verwendet, die mit unserem Verfahren gesammelt werden. Bei dem Ergebnis handelt es sich jedoch wie bei dem Fall #3 um sehr gut geeignete pharmazeutische Informationen.
Fall #5: Identifizierung von Effektoren der Apoptose
In diesem Fall wird beschrieben, wie unser Verfahren und unser Gerät zur Identifizierung von Effektoren der Apoptose verwendet werden können.
In diesem Fall wird eine Datenbank von Apoptosestrukturen (ein Trainingssatz) für HEK293-Zellen (oder jedwede andere Zelllinie, abhängig von dem Bedarf des Kunden) erstellt, die Strukturen umfasst, die während der Stimulation mit bekannten Effektoren der Apoptose erzeugt worden sind. Während der Verwendung jedweder unbekannten Verbindung von einer Verbindungsbibliothek eines Unternehmens würden die erzeugten Strukturen mit den in den Trainingssätzen erzeugten Apoptosestrukturen verglichen werden. Wenn mit einer dieser Strukturen eine Übereinstimmung gefunden werden würde, dann würde ein neuer Effektor der Apoptose gefunden worden sein. Diese Analyse könnte separat oder zusammen mit einer Agonisten- oder Antagonistensuche durchgeführt werden. Dies wäre besonders bei der Antagonistensuche nützlich, da die Informationen gleichzeitig während der Datenerfassung erhalten werden könnten und jedwede Stimulatoren der Apoptose sofort als potenzielle Arzneistoffkandidaten ausgeschlossen werden könnten. Auf diese Weise könnte ein enormes Ausmaß an Zeit und Mühe bei dem Vorgang des Auffindens eines Arzneistoffs eingespart werden.
Unser Verfahren stellt die gleichzeitige Analyse eines apoptotischen Potenzials für jedwede getestete Verbindung bereit und führt daher zu einem enormen Ausmaß an Einsparungen für den Vorgang des Auffindens eines Arzneistoffs, da potenzielle Kandidaten, die eine Apoptose stimulieren, in dem Vorgang früh ausgeschlossen werden können.
Fall #6: Identifizierung von Effektoren einer Cytotoxizität
In diesem Fall wird beschrieben, wie unser Verfahren und unser Gerät zur Identifizierung von Effektoren einer Cytotoxizität verwendet werden können.
In diesem Fall wird eine Datenbank von cytotoxischen Strukturen (ein Trainingssatz) für HEK293-Zellen (oder jedwede andere Zelllinie, abhängig von dem Bedarf des Kunden) erstellt, die Strukturen umfasst, die während der Stimulation mit bekannten Effektoren einer Cytotoxizität erzeugt worden sind. Während der Verwendung jedweder unbekannten Verbindung von einer Verbindungsbibliothek eines Unternehmens würden die erzeugten Strukturen mit den in den Trainingssätzen erzeugten Cytotoxizitätsstrukturen verglichen werden. Wenn mit einer dieser Strukturen eine Übereinstimmung gefunden werden würde, dann würde ein neuer Effektor einer Cytotoxizität gefunden worden sein. Diese Analyse könnte separat oder zusammen mit einer Agonisten- oder Antagonistensuche durchgeführt werden. Dies wäre besonders bei der Antagonistensuche nützlich, da die Informationen gleichzeitig während der Datenerfassung erhalten werden könnten und jedwede cytotoxischen Verbindungen sofort als potenzielle Arzneistoffkandidaten ausgeschlossen werden könnten. Auf diese Weise könnte ein enormes Ausmaß an Zeit und Mühe bei dem Vorgang des Auffindens eines Arzneistoffs eingespart werden.
Unser Verfahren stellt die gleichzeitige Analyse eines cytotoxischen Potenzials für jedwede getestete Verbindung bereit und führt daher zu einem enormen Ausmaß an Einsparungen für den Vorgang des Auffindens eines Arzneistoffs, da potenzielle Kandidaten, die cytotoxisch sind, in dem Vorgang früh ausgeschlossen werden können.
Fall #7: Analyse von integrierten zellulären Reaktionen auf mehrere Reize
In diesem Fall wird die Verwendung unseres Verfahrens zur Analyse von integrierten zellulären Reaktionen auf mehrere Reize beschrieben.
Die Strukturen, die mit unserem Verfahren erzeugt werden, sind Darstellungen von komplexen integrierten zellulären Ereignissen, die nach einer Stimulation in und um die Zelle stattfinden. Für diesen Fall wird versucht, zu bestimmen, was der Effekt eines Reizes auf einen anderen sein wird. Wenn beispielsweise ein bekannter Gi-GPCR-Rezeptor stimuliert wird und, während die Zelle auf diesen Agonisten reagiert, ein Ligand für einen PTKR angewandt wird, was wäre der Effekt? Da unsere Verfahren Darstellungen von integrierten zellulären Ereignissen erzeugen, können diese Integrationen mit so vielen Reizen, wie es gewünscht ist, untersucht werden. Als erstes wird ein Satz von Datenbankstrukturen erstellt, welche die Stimulation bestimmter Wege innerhalb eines Zelltyps repräsentieren, wie es bereits für GPCR's diskutiert wurde. Dann wird vor, während oder nach einer Stimulation mit einem Liganden oder einem Stimulator ein zweiter Ligand oder Stimulator zugesetzt und der Effekt, der auf die Struktur ausgeübt wird, die durch den ersten Liganden oder Stimulator ausgelöst worden ist, wird analysiert. Es werden gegenwärtig Korrelationen zwischen einzelnen Legendreparametern und einzelnen zellulären physiologischen Ereignissen erstellt. Folglich kann unter dem Einfluss von mehreren Reizen bestimmt werden, welche zellulären physiologischen Ereignisse beibehalten und welche verändert werden, wenn auf eine Zelle mehr als ein Reiz ausgeübt wird. Dies ist bei dem Vorgang des Auffindens eines Arzneistoffs extrem wichtig, da schließlich alle Arzneistoffe in komplexen Individuen verwendet werden sollen, deren Zellen auf einer konstanten Basis vielen Reizen ausgesetzt sind.
Unser Verfahren ermöglicht die Analyse integrierter zellulärer Reaktionen ohne die Verwendung von Wegmarkern oder jedweder anderer Manipulationen. Kein anderes Verfahren kann dies in Echtzeit ohne die Verwendung von Markern erreichen.
Fall #8: Analyse einer Tumorzellenprogression
In diesem Fall wird beschrieben, wie unser Verfahren zur Analyse einer Tumorzellenprogression verwendet werden kann.
Tumorzellen beginnen als relativ gutartige Zellen und werden bei ihrer Teilung und Vermehrung immer aggressiver und schließlich stark metastasierend. Wenn dies stattfindet, befreien sich Tumorzellen von jedweden Beschränkungen, die sie nach wie vor aufweisen, und verbreiten sich im gesamten Körper. Dieser Vorgang wird als Progression bezeichnet und führt schließlich zum Tod des Patienten. Wenn dieser Vorgang stattfindet, reagieren die Zellen zunehmend anders auf die gleichen Reize, und zwar verglichen mit früheren Vorläufern. Da unser Verfahren eine integrierte Darstellung der Zelle erzeugt, sollte die Tumorzelle, wenn sie einer Progression unterliegt, auf den gleichen Reiz unterschiedliche Strukturen erzeugen. In diesem Fall werden Datenbanken von Strukturen auf bestimmte Liganden oder Reize erzeugt. Wenn die Tumorzellen einer Progression unterliegen, werden die gleichen Liganden wieder angewandt und die Änderungen in den Strukturen werden aufgezeichnet. Folglich kann dann, wenn Tumorzellen mit unserem Verfahren untersucht werden, deren Reaktionsstruktur mit der Datenbank verglichen werden und eine Bestimmung ihres Progressionszustands kann durchgeführt werden. Folglich wurde ein Analysewerkzeug zur Klassifizierung des Progressionszustands von Tumorzellen erzeugt.
Unser Verfahren ermöglicht die Analyse einer Tumorzellenprogression ohne die Verwendung von Markern oder jedweden anderen Manipulationen. Kein anderes Verfahren kann dies in Echtzeit ohne die Verwendung von Markern erreichen.
Fall #9: Bestimmung einer Stammzellendifferenzierung
In diesem Fall wird beschrieben, wie unser Verfahren zur Analyse einer Stammzellendifferenzierung verwendet werden kann.
Stammzellen beginnen als pluripotente Zellen mit dem Vermögen zur Differenzierung zu jedwedem Zelltyp. Wenn die Zelle verschiedene Reize von ihrer Umgebung erhält, ändert sie das Komplement von exprimierten Proteinen, die es aufweist, und ändert ihre Endfunktion. An einem gewissen Punkt stoppt dieser Vorgang und die Zelle wird auf die Durchführung dieser einen Funktion festgelegt. Folglich hat sie sich differenziert, um eine Leberzelle oder eine Knorpelzelle oder eine Herzzelle zu werden. Da unser Verfahren eine integrierte Darstellung der Zelle erzeugt, sollte die Stammzelle bei ihrer Differenzierung auf den gleichen Reiz verschiedene Strukturen erzeugen. In diesem Fall werden Datenbanken von Strukturen auf bestimmte Liganden oder Reize erzeugt. Wenn sich die Stammzellen differenzieren, werden die gleichen Liganden wieder angewandt und die Änderungen in den Strukturen werden aufgezeichnet. Folglich kann dann, wenn Teststammzellen mit unserem Verfahren untersucht werden, deren Reaktionsstruktur mit der Datenbank verglichen werden und eine Bestimmung ihres Differenzierungszustands kann durchgeführt werden. Folglich wurde ein Analysewerkzeug zur Klassifizierung erzeugt, zu was sich eine bestimmte Stammzelle differenzieren wird.
Unser Verfahren ermöglicht die Analyse einer Stammzellendifferenzierung ohne die Verwendung von Markern oder jedweden anderen Manipulationen. Kein anderes Verfahren kann dies in Echtzeit ohne die Verwendung von Markern erreichen.
Zusammenfassung
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass dieses Verfahren Wege, die sowohl durch transfizierte als auch durch endogene Rezeptoren stimuliert worden sind, einfach klassifizieren kann. Die Erfindung umfasst den Vorgang der Wegklassifizierung und umfasst das Vermögen der Vorrichtung und von Algorithmen und Software zur Klassifizierung von unbekannten Liganden, dass sie mit einer Anzahl von Zelloberflächenrezeptoren eine Wechselwirkung eingehen. Dies wurde durch Experimente gezeigt, die einen Gi-, Gs- oder Gq-GPCR oder einen PTKR umfassten. Ein einzigartiger Aspekt der Erfindung ist die Kombination von Vorgängen, die zur Klassifizierung eines Signalübertragungswegs führen, ohne den Bedarf für jedwede Art von Marker oder spezifischem Amplifizierungsmechanismus. Die Zelle selbst wirkt als Amplifizierungseinheit. In einer Ausführungsform wurden mit diesem System anhaftende eukaryotische Zellen eingesetzt. Eine alternative Ausführungsform umfasst die Verwendung von Prokaryoten. Weitere alternative Ausführungsformen können entweder eukaryotische oder prokaryotische Zelltypen sowie nicht-anhaftende Zellen umfassen. Darüber hinaus weisen die verschiedenen Ausführungsformen des Verfahrens das Potenzial zur Klassifizierung jedweden allgemeinen Zellereignisses auf, so lange es nach der Stimulation eindeutige Änderungen der dielektrischen Eigenschaften von Zellen gibt, und es ist daher nicht auf die vorstehend genannten Wege beschränkt.
Diese Technologie konnte in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden, einschließlich:

1. Die Erfassung einer Rezeptor-spezifischen Aktivierung für viele Rezeptor- und Zelltypen A. Oberflächenrezeptoren, cytoplasmatische Rezeptoren und Kernrezeptoren B. GPCR's (Gi-, Gs-, Gq-gekoppelte und gemischte GPCR's), Proteintyrosinkinaserezeptoren und Steroidrezeptoren C. Endogene und transfizierte Rezeptoren D. Anhaftende Schicht von Zellen E. Suspensionszellen, die als Schicht auf einer Elektrode sedimentiert sind
2. Die Erzeugung von Konzentration-Reaktion-Kurven zur Erzeugung von EC₅₀/IC₅₀-Werten zur Einstufung der Wirksamkeit einer Verbindung
3. Die Identifizierung von Rezeptor-spezifischen Agonisten und Antagonisten
4. Die Erzeugung von Reaktionsstrukturen, die für jedwede spezifische Rezeptorfamilie oder -subfamilie, wie z.B. für die 3 GPCR-Familien, die PTK-Rezeptorfamilie, die Cytokinrezeptorfamilie (die mittels Smads, oder Jak/STAT oder NF-kappa B wirken), die Kernrezeptorfamilie oder die Ionenkanalrezeptorfamilie, repräsentativ oder voraussagend sind
5. Der Nachweis des Blockierens und/oder Modulierens von Unterabschnitten eines biochemischen Signalgebungswegs, der an der Erzeugung einer Rezeptor-spezifischen Aktivierung mit chemischen Modulatoren beteiligt ist, die spezifische Moleküle oder zelluläre Ereignisse hemmen.
6. Der Nachweis einer nicht-Rezeptor-basierten zellulären Aktivierung
7. Die Entorphanisierung von Rezeptoren und Liganden durch: a. Identifizieren von Liganden/Agonisten/Antagonisten eines Orphan-Rezeptors und Bestimmen der Rezeptorfamilie (z.B. Gq-GCPR) und des Signalgebungswegs
8. Die Vorhersage des MOA (Wirkmechanismus) für einen Rezeptor oder eine Verbindung
9. Der Nachweis und die Messung des Zelltods und des Modus des Absterbens (z.B. Apoptose gegenüber Nekrose, spezifische Apoptosewege (z.B. bcl-2-abhängige gegenüber bcl-2-unabhängige Apoptose))
10. Der Nachweis einer integrierten zellulären Reaktion auf mehrere Reize
11. Der Nachweis einer Stammzellendifferenzierung
12. Der Nachweis einer Tumorzellenprogression

Während es sich vorstehend um eine vollständige Beschreibung möglicher Ausführungsformen und Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt, können verschiedene Alternativen, Modifizierungen und Äquivalente verwendet werden. Ferner werden alle Veröffentlichungen und Patentdokumente, die in dieser Anmeldung zitiert werden, für alle Zwecke in dem gleichen Maß unter Bezugnahme vollständig einbezogen, als ob jede einzelne Veröffentlichung und jedes einzelne Patentdokument einzeln angegeben wären.

Claims

Marker-freies Verfahren zum Klassifizieren zellulärer Ereignisse, wobei die Klassifizierung durch Messen von Änderungen der elektrischen Eigenschaften von Zellen, die in eine elektrische Schaltung einbezogen sind, nach dem Anwenden eines Reizes erreicht wird, wobei das Verfahren umfasst: (a) Messen eines Werts einer elektrischen Eigenschaft nach dem Anwenden einer Mehrzahl von Frequenzen des elektromagnetischen Spektrums innerhalb eines Bereichs von Frequenzen für ausgewählte Zeitpunkte während eines ausgewählten Zeitraums für die elektrische Schaltung, die Zellen mit einem Rezeptor umfasst, die einen bekannten Rezeptortyp und einen bekannten Messenger-Weg aufweisen, (b) Auswählen eines Bezugszeitpunkts, der einem Zeitraum unmittelbar vor dem Hinzufügen eines bekannten Rezeptorreizes entspricht, (c) Hinzufügen des bekannten Reizes zu der elektrischen Schaltung derart, dass der Reiz mit dem Rezeptor eine Wechselwirkung eingehen kann, (d) Berechnen von Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft für jede Frequenz durch Subtrahieren des Werts der gemessenen elektrischen Eigenschaft für den Bezugszeitpunkt von dem Wert der gemessenen elektrischen Eigenschaft für jeden Zeitpunkt nach dem Bezugszeitpunkt, (e) Parametrisieren der Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft für jeden Zeitpunkt, Rezeptor und Reiz, und (f) Zuordnen der parametrisierten Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft zu einer bekannten Reiz/Rezeptor-Wechselwirkungsklasse.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Schritte g) Messen des Werts der elektrischen Eigenschaft für die elektrische Schaltung, die Zellen umfasst, für eine Mehrzahl von Frequenzen in einem Bereich von Frequenzen für ausgewählte Zeitpunkte während eines ausgewählten Zeitraums für eine Zelle mit einem bekannten Rezeptortyp, h) Auswählen eines Bezugszeitpunkts, der einem Zeitraum unmittelbar vor dem Hinzufügen eines unbekannten Reizes entspricht, i) Hinzufügen des unbekannten Reizes zu der Schaltung derart, dass der Reiz mit dem Rezeptor eine Wechselwirkung eingehen kann, j) Berechnen von Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft für jede Frequenz durch Subtrahieren des Werts der elektrischen Eigenschaft für den Bezugszeitpunkt von dem Wert der elektrischen Eigenschaft für jeden Zeitpunkt nach dem Hinzufügen des unbekannten Reizes, k) Parametrisieren der Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft für jeden Zeitpunkt, Rezeptor und Reiz, l) Vergleichen der parametrisierten Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft nach dem Hinzufügen des unbekannten Reizes mit den parametrisierten Änderungen des Werts für bekannte Reize zum Korrelieren der Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft mit einer zellulären Reaktion, und m) Zuordnen der zellulären Reaktion auf den unbekannten Reiz zu einer bekannten Substanz/Rezeptor-Wechselwirkungsklasse und Klassifizieren des Reizes umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Schritte g) Messen des Werts der elektrischen Eigenschaft für die elektrische Schaltung, die Zellen umfasst, für eine Mehrzahl von Frequenzen innerhalb eines Bereichs von Frequenzen für ausgewählte Zeitpunkte während eines ausgewählten Zeitraums für eine Zelle mit einem unbekannten Rezeptortyp, h) Auswählen eines Bezugszeitpunkts, der einem Zeitraum unmittelbar vor dem Hinzufügen eines Reizes mit einer bekannten Reaktion entspricht, i) Hinzufügen des Reizes zu der Schaltung derart, dass der Reiz mit dem Rezeptor eine Wechselwirkung eingehen kann, j) Berechnen von Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft für jede Frequenz durch Subtrahieren des Werts der elektrischen Eigenschaft für den Bezugszeitpunkt von dem Wert der elektrischen Eigenschaft für jeden Zeitpunkt nach dem Hinzufügen des Reizes, k) Parametrisieren der Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft für jeden Zeitpunkt, Rezeptor und Reiz, l) Vergleichen der parametrisierten Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft nach dem Hinzufügen des Reizes mit den parametrisierten Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaften für bekannte Rezeptoren zum Korrelieren der Änderungen des Werts der elektrischen Eigenschaft mit einer zellulären Reaktion, und m) Zuordnen der zellulären Reaktion des unbekannten Rezeptors zu einer bekannten Substanz/Rezeptor-Wechselwirkungsklasse und Klassifizieren des Rezeptors umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die elektrische Eigenschaft die komplexe Impedanz ist.
Verfahren nach Anspruch 4, das ferner die Schritte g) Messen der komplexen Impedanz für eine Mehrzahl von Frequenzen innerhalb eines Bereichs von Frequenzen für jeden Zeitpunkt während eines ausgewählten Zeitraums für die elektrische Schaltung, die Zellen mit einem bekannten Rezeptortyp umfasst, h) Auswählen eines Bezugszeitpunkts, der einem Zeitraum unmittelbar vor dem Hinzufügen eines unbekannten Reizes entspricht, i) Hinzufügen des unbekannten Reizes zu der elektrischen Schaltung derart, dass der Reiz mit den Zellrezeptoren eine Wechselwirkung eingehen kann, j) Berechnen von Änderungen der Impedanz für jede Frequenz durch Subtrahieren des Werts der Impedanz für den Bezugszeitpunkt von dem Wert der Impedanz für jeden Zeitpunkt nach dem Hinzufügen des unbekannten Reizes, k) Parametrisieren der Änderungen der komplexen Impedanz für jeden Zeitpunkt, Rezeptor und Reiz, l) Vergleichen der parametrisierten Änderungen der komplexen Impedanz nach dem Hinzufügen des unbekannten Reizes mit den parametrisierten Änderungen der komplexen Impedanz für bekannte Reize zum Korrelieren der parametrisierten Änderungen der komplexen Impedanz mit einer zellulären Reaktion, und m) Zuordnen der zellulären Reaktion zu einer bekannten Substanz/Rezeptor-Wechselwirkungsklasse und Klassifizieren des Reizes umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, das ferner die Schritte g) Messen der komplexen Impedanz für eine Mehrzahl von Frequenzen innerhalb eines Bereichs von Frequenzen für jeden Zeitpunkt während eines ausgewählten Zeitraums für die elektrische Schaltung, die Zellen mit einem unbekannten Rezeptortyp umfasst, h) Auswählen eines Bezugszeitpunkts, der einem Zeitraum unmittelbar vor dem Hinzufügen eines Reizes mit einer bekannten Reaktion entspricht, i) Hinzufügen des Reizes zu der elektrischen Schaltung derart, dass der Reiz mit den Zellrezeptoren eine Wechselwirkung eingehen kann, j) Berechnen von Änderungen der komplexen Impedanz für jede Frequenz durch Subtrahieren der komplexen Impedanz für den Bezugszeitpunkt von der komplexen Impedanz für jeden Zeitpunkt nach dem Hinzufügen des Reizes, k) Parametrisieren der Änderungen der komplexen Impedanz für jeden Zeitpunkt, Rezeptor und Reiz, l) Vergleichen der parametrisierten Änderungen der komplexen Impedanz nach dem Hinzufügen des Reizes mit den parametrisierten Änderungen der komplexen Impedanz für bekannte Rezeptoren zum Korrelieren der parametrisierten Änderungen der komplexen Impedanz mit einer zellulären Reaktion, und m) Zuordnen der zellulären Reaktion zu einer bekannten Substanz/Rezeptor-Wechselwirkungsklasse und Klassifizieren des Rezeptors umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Änderungen der komplexen Impedanz als Widerstand oder Reaktanz gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Änderungen der komplexen Impedanz als Scheinleitwert, Wirkleitwert oder Blindleitwert gemessen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die zellulären Ereignisse aus der Gruppe, bestehend aus einer Signalübertragung von Ligand/Rezeptor-Wechselwirkungen, Cytotoxizität, Apoptose, Tumorzellenprogression und Stammzellendifferenzierung, ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die elektrischen Eigenschaften aus der Gruppe, umfassend Impedanzphase, Impedanzgröße, komplexe Rückwirkungskoeffizienten, Gesamtwiderstand der Schaltung und Gesamtkapazität der Schaltung, ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Bereich der Frequenzen 10 Hz bis 1000 GHz beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Reiz eine Substanz ist.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Substanz ein kleiner Molekülligand ist.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Substanz ein Ligand, ein Protein, ein Antikörper, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure, Wasser oder ein Ion ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Klassifizierung in Echtzeit erreicht wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die elektrische Schaltung doppelkammförmige, koplanare Elektroden umfasst.