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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptidgerüste und
deren Anwendung.
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Hintergrund der Erfindung
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Das
de novo-Design gefalteter Polypeptide zielt ab auf die Verbesserung
des Verständnisses
der Proteinstruktur, und stellt auch eine Plattform für das Engineering
neuer Proteine mit maßgeschneiderten
Funktionen bereit [DeGrado, W. F.; Summa, C. M.; Pavone, V.; Nastri,
F.; Lombardi, A., Annu. Rev. Biochem. 1999, 68, 779–819; Micklatcher,
C.; Chmielewski, J., Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 724–729; Baltzer,
L.; Nilsson, H.; Nilsson, J. Chem. Rev. 101, 3153–3164].
Konstruierte gefaltete Polypeptide, die eine pH-gesteuerte, positionsspezifische
Selbstfunktionalisierung mit Liganden erleiden [Broo, K.; Brive,
L.; Lundh, A. C.; Ahlberg, P.; Baltzer, L., J. Am. Chem. Soc. 1996,
118, 8172–8173;
Baltzer, L.; Nilsson, J., Curr. Opin. 15 Biotechnol. 2001, 12, 355–360] stellen
ein hervorragendes Werkzeug für
die Konstruktion verschiedener komplexer molekularer Systeme, z.B.
von Modell-Glykoproteinen [Andersson, L.; Stenhagen, G.; Baltzer,
L., J. Org. Chem. 1998, 63, 1366–1367; Andersson, L. K.; Dolphin,
G. T.; Kihlberg, J.; Baltzer, L., J. Soc. Chem. Soc. Perkin Trans.
2, 2000, 459–464]
oder komplexen Rezeptoren dar.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Aufgabenstellung
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von gefalteten
Liganden-modifizierten Helix-Schleife-Helix-Polypeptidgerüsten, die
die biosensorischen Schlüsselvorgänge einer
Erkennung und Meldung verbinden. Für den Beweis einer prinzipiellen
Demonstration wurde die gut charakterisierte Wechselwirkung zwischen
dem Enzym menschliche Carbonatanhydrase II, HCAII, und ihrem Inhibitor
4-Carboxybenzolsulfonamid
[Vidgren, J.; Svensson, A.; Liljas, A., Int. J. Biol. Macromol.
1993, 15, 97–100]
(Ia) ausgewählt. Die
Vielzahl von Molekülen,
die eingebaut werden kann, und die Leichtigkeit, mit der ihre relativen
Positionen variiert werden können,
ermöglichen
jedoch die systematische Entwicklung funktioneller Einheiten für einen weiten
Bereich von Rezeptor-Liganden-Systemen.
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Genauer
gesagt betrifft die vorliegende Erfindung neue Peptide, die eine
Sequenz gemäß SEQ. ID. No.
1, SEQ. ID. No. 2 und/oder SEQ. ID. No. 3 aufweisen. Diese Peptide
bilden Helix-Schleife-Helix-Strukturprinzipien.
Das Helix-Schleife-Helix-Strukturprinzip, das SEQ. ID. No. 2 aufweist,
wird als KE2 in 6 gezeigt, und das Helix-Schleife-Helix-Strukturprinzip,
das SEQ. ID. No. 3 aufweist, wird als KE3 in 6 dargestellt.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Polypeptidgerüst, das aus einem aus zwei
Helix-Schleife-Helix-Strukturprinzipien
ausgebildeten vier Helix-Bündeln
besteht, d.h., aus zwei der vorstehend genannten Peptide, die dimerisiert
sind.
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Außerdem stellt
die Erfindung die Verwendung der vorstehend genannten Polypeptidgerüste in bioanalytischen/Biosensor-Anwendungen.
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Schließlich betrifft
die Erfindung die Verwendung solcher Polypeptidgerüste in Biosensoren
zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen und/oder Proteinaffinitäten. Die
kennzeichnenden Merkmale der Erfindung sind aus der nachfolgenden
Beschreibung und den anliegenden Ansprüchen ersichtlich.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Bevorzugte
Polypeptidgerüste
nach der Erfindung sind SEQ. ID. No. 1, KE2 (SEQ. ID. No. 2) und
KE3 (SEQ. ID. No. 3), gebunden an eine Polypeptidsequenz, die sie
dazu veranlasst, ein Helix-Schleife-Helix-Strukturprinzip auszubilden. KE2 kann
mit einer zweiten Kopie von KE2 unter Bildung eines Vier-Helix-Bündels dimerisieren, und KE3
kann mit einer zweiten Kopie von KE3 unter Bildung eines Vier-Helix-Bündels dimerisieren. KE2 kann
auch mit KE3 unter Bildung eines Heterodimers oder mit SEQ. ID.
No. 1 oder einer anderen auf der von KE2 oder KE3 basierenden Sequenz,
die die gleichen hydrophoben Reste in den gleichen Positionen in
der Sequenz aufweisen, und das Helix-Schleife-Helix-Strukturprinzip
bilden, dimerisieren.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptidgerüst umfasst
vorzugsweise einen Liganden mit Affinität für ein Zielmolekül oder -ion.
Unter "Zielmolekül oder -ion" wird ein Molekül oder Ion
verstanden, an das der Ligand zum Zwecke der Bestimmung und Quantifizierung
bindet. Wenn das Polypeptidgerüst
z.B. mit einem Liganden funktionalisiert wurde, der spezifisch ein
Metallion bindet, ist der Zweck die Bestimmung und Quantifizierung dieses "Ziel"-Metallions. Wenn
das Polypeptidgerüst
mit einem Liganden funktionalisiert wurde, der eine hohe Spezifität für ein Protein
aufweist, ist der Zweck die Identifizierung und Quantifizierung
dieses "Ziel"-Proteins. Ziele
umfassen, ohne darauf beschränkt
zu sein, Metallionen und Proteine. Interessante Zielmoleküle sind
z.B. Biomoleküle.
Vorzugsweise ist dieser Ligand an der Seitenkette eines Lysinrests
lokalisiert. In KE2 ist dieser Lysinrest vorzugsweise Lys34, weil
er aufgrund seines niedrigen pKa-Wertes
vorzugsweise acyliert wird, und in KE3 ist dieser Lysinrest Lys8,
weil dieser nahe zum His-Rest in Position 11 ist, was die Positionsselektivität sicherstellt.
Die Wahl des Liganden hängt
von der beabsichtigten Verwendung des Polypeptidgerüsts ab.
Zur Bestimmung von Enzymen wird der Ligand aus ihren bekannten Inhibitoren
ausgewählt,
zur Bestimmung von von Enzymen verschiedenen Proteinen, die Liganden
mit hoher Affinität
aufweisen, wird der an das Gerüst
anzulagernde Ligand aus den bekannten Liganden des Proteins ausgewählt. Für Kohlehydrat-bindende
Proteine ist der Ligand ein Kohlehydrat. Für DNA und RNA ist der Ligand
DNA, RNA oder PNA. Für
Zielproteine, für
die keine bekannten Liganden vorhanden sind, sind die an das Gerüst anzulagernden
Liganden mehrere Verbindungen aus einer kombinatorischen Bibliothek.
Ein Beispiel für
einen solchen Ligand ist Benzolsulfonamid, das ein Inhibitor für Carbonatde hydrase
II ist. Zur Bestimmung von Thrombin kann irgendein Thrombin-Inhibitor verwendet
werden, und zur Bestimmung von Proteasen können Proteasen-Inhibitoren
verwendet werden. Zur Bestimmung von Ionen ist der Ligand eine Ionen-bindende
Funktionalität
oder eine chelatisierende Gruppe.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptidgerüst umfasst
vorzugsweise auch eine Reportergruppe oder Reporter-Nachweisgruppe, um
die Bestimmung der Bindung an den Ligand zu ermöglichen. Bei der Untersuchung
der Umweltverschmutzung oder in einer Verfahrenskontrolle ist z.B.
die Identifizierung und die Quantifizierung eines Zielions von Interesse.
Die Identifizierung und Quantifizierung von Biomolekülen, wie
z.B. Metaboliten oder Proteinen, ist in der Diagnose und Behandlung
einer Erkrankung von Interesse. Die Reportergruppe kann z.B. ein
Fluoreszenzsensor sein. Dieser Fluoreszenzsensor kann z.B. Dansyl,
Fluorescein, Rhodamin oder Oregon Green-Derivate sein. Vorzugsweise
ist sie an der Seitenkette von Lys15 angelagert. Die Positionen
des Liganden und des Fluoreszenzsensors können in jedem Polypeptid ausgetauscht
werden.
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Der
Ligand und die Reportergruppe können
entweder beide an die gleiche Polypeptidkette angelagert oder an
verschiedene Polypeptidketten des Dimers angelagert sein.
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Zwei
oder mehrere Polypeptidgerüste
können
z.B. in Form einer Reihe auf einem Biosensorchip oder in den Vertiefungen
einer Mikrotiterplatte angeordnet sein. Wenn eine Mikrotiterplatte
verwendet wird, kann das Polypeptidgerüst in einer Lösung oder
in einem polymeren Hydrogel in den Vertiefungen der Platte vorhanden
sein. Es kann auch möglich
sein, eine Lösung
in Vertiefungen, Grübchen
oder Löchern
am Chip oder in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte zu verwenden.
Der Chip kann aus Metall, einem Isolator, einem Halbleiter oder
einem Polymer bestehen. Der Chip kann auch aus einem dünnen Überzug der
vorstehend genannten Materialien, z.B. in Form einer Reihe, an der
Oberseite eines Stützsubstrats
bestehen.
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Es
ist oft vorzuziehen, die Polypeptidgerüste an der Oberfläche von
z.B. einem Chip, einer Mikrotiterplatte, einem Vesikel, einer Micelle
oder einer Membran zu immobilisieren. Beispiele für solche
Oberflächen sind
künstliche
Oberflächen,
wie z.B. modifizierte oder nicht modifizierte Oberflächen aus
einem Metall, einem Isolator, einem Halbleiter oder einem Polymer.
Andere Beispiele von Oberflächen,
an die die Polypeptidgerüste immobilisiert
sein können,
sind Oberflächen
von Vesikeln, Micellen und Membranen. Es kann auch vorzuziehen sein,
eine Ankergruppe im erfindungsgemäßen Polypeptidgerüst einzubauen.
Ein Weg zu dieser Durchführung
ist es, eine Aminosäure
mit einer hohen Affinität
für die
Oberfläche,
auf die die Polypeptidgerüste
zu immobilisieren sind, wie z.B. einen Chip oder eine Mikrotiterplatte
oder ein Vesikel oder eine Membran, einzuführen. Ein Beispiel dafür ist es,
an Position 22 der Schleifenregion einen Cys-, Lys- oder Glu-Rest
oder eine nicht natürliche
Aminosäure
einzuführen.
Die Position der Einführung
ist nicht auf die Position 22 beschränkt, sondern kann irgendeine
Position in der Schleifenregion in den Positionen 20 bis 24 der
Sequenz sein. Die nicht natürliche
Aminosäure
kann z.B. eine Aminooxy-Funktion aufweisen. Ein anderer Weg ist
es, ein bifunktionelles Linkermolekül an einen Aminosäurerest
im Polypeptid anzulagern. Vorzugsweise wurde die Ankergruppe positionsspezifisch
in das Polypeptidgerüst
durch Anlagerung eines bifunktionellen Moleküls an einen spezifisch eingeführten Aminosäurerest
eingeführt,
um chemoselektiv oder positionsselektiv mit dem bifunktionellen
Linkermolekül
nach den vorstehend beschriebenen Prinzipien zu reagieren. Die eingeführte Aminosäure oder
das Linkermolekül
sollten dazu fähig
sein, eine starke chemi sche Bindung zur Oberfläche, auf der die Polypeptidgerüste zu immobilisieren
sind, wie z.B. einem Chip oder einer Mikrotiterplatte oder einem
Vesikel oder einer Membran, auszubilden, und sie könnten vom
Typ -SH, COOH, NH2, Biotin, His-tag, Fettsäure, Cholesterin
usw. sein. Das bifunktionelle Molekül kann die allgemeine Struktur
X-Rn-Y aufweisen, worin X eine funktionelle
Gruppe vom Typ COOH, NH2, SH, SSAr, CHO,
CH2Br, CH2Cl oder
CH2I ist, Rn eine
Alkyl- oder Ethylenglykolkette, die n Kohlenstoffe umfasst, und
Y eine Gruppe vom Typ COOH, NH2, SH, Biotin,
Biotinanalog, His-tag, Fettsäure
oder Cholesterin ist.
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Die
Bindung des Polypeptidgerüsts
kann entweder direkt zur Substratoberfläche, an die die Polypeptidgerüste zu immobilisieren
sind, wie z.B. einem Chip oder einer Mikrotiterplatte oder einem
Vesikel oder einer Membran, vorhanden sein, oder indirekt über eine
auf der Oberfläche,
auf der die Polypeptidgerüste
zu immobilisieren sind, wie z.B. einem Chip oder einer Mikrotiterplatte
oder einem Vesikel oder einer Membran, ausgebildeten Oberflächenmodifikation.
Die Oberflächenmodifikation
kann eine selbstarrangierte Monoschicht, eine Proteinschicht (z.B.
Streptavidin), ein Polymernetzwerk, ein Hydrogel, ein His-tag usw.
sein. Ein in das Polypeptidgerüst
eingeführter
Cysteinrest kann über
die SH-Gruppe direkt mit der Oberfläche, z.B. Gold, reagieren. Ein
auf die gleiche Weise eingeführter
Cysteinrest kann auch über
die SH-Gruppe mit einem an der Oberfläche angelagerten Disulfid reagieren, 9.
Dieses letztere Verfahren soll nur zur Veranschaulichung dienen
und wird in 8 erläutert, aber viele andere Methoden
sind vorhanden, die den gleichen Zweck erreichen.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptidgerüst ist zur
Bestimmung von Proteinkonzentrationen und Proteinaffinitäten in Biosensor-Anwendungen
sehr gut geeignet. Es kann auch zur Bestimmung von DNA-, RNA- und
PNA-Konzentrationen und -Affinitäten,
sowie von Kohlehydratkonzentrationen und -affinitäten verwendet werden.
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Bei
der Bestimmung der Proteinkonzentrationen oder -affinitäten können die
Polypeptidgerüste
in Reihen verwendet werden, in denen die Liganden der Polypeptidgerüste die
gleichen oder verschiedenen Affinitäten für das Protein oder eine andere
zu untersuchende Substanz aufweisen.
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Wenn
Polypeptidgerüste
mit verschiedenen Affinitäten
in Reihen für
Biosensor-Anwendungen verwendet werden, sind sie für Messungen
von Analytkonzentrationen geeignet, und wenn Polypeptidgerüste, die
die gleiche Affinität
aufweisen, in Reihen für
Biosensor-Anwendungen verwendet werden, sind sie zur Messung der
Affinität
des Analyten für
den Liganden geeignet, der bei der Verwendung verschiedener Verdünnungen der
Probe für
die verschiedenen Stellen der Reihe verwendet wird. Es ist z.B.
von Interesse, die Konzentrationen von Proteinen bestimmen zu können, die
mit einer Krankheit verbunden sind, oder die Affinitäten solcher Proteine
bestimmen zu können.
Verwendete Konzentrationen und Affinitäten können einen pathologischen Zustand
oder die Abwesenheit eines pathologischen Zustandes anzeigen. Es
ist auch von Interesse, die Konzentrationen und Affinitäten von
Proteinen zur Verhütung
einer Erkrankung verfolgen zu können,
und die Wahrscheinlichkeit der Erkrankung vorhersagen zu können. Es
ist auch von Interesse, die Konzentration von m-RNA oder Kohlehydraten
oder anderen Biomolekülen
zu bestimmen.
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Die
Erfindung wird nun im folgenden Beispiel näher erläutert. Das Beispiel soll die
Erfindung nur veranschaulichen und keinesfalls den Rahmen der Erfindung
begrenzen.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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In
den Beispielen wird auf die anliegenden Zeichnungen Bezug genommen,
in denen bedeuten:
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1 zeigt
eine Modellstruktur von KE2 und KE3, die die Positionen der Einführung von
Dansyl, Position 15, bzw. von Benzolsulfonamid, Positionen 34 und
8, zeigt. Gezeigt werden nur die Aminosäure-Seitenketten in Positionen, die von
einer Funktionalisierung betroffen sind, und nur die in der Sequenz
von KE2. Aminosäuresequenzen
von KE2 und KE3, worin hervorgehobene Lysinreste Positionen der
Modifikation darstellen, sind ebenfalls angegeben.
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2 zeigt
ein Fluoreszenzspektrum von 1 μM
KE2 (oberes) und KE3 (unteres), modifiziert mit dem Dansyl-Fluoreszenzsensor.
Fette und dünne
Kurven entsprechen Peptiden mit bzw. ohne Benzolsulfonamid (KE2-PL,
KE3-PL und KE2-P, KE3-P). Gepunktete Linien bedeuten Spektren in
Abwesenheit von HCAII, durchgezogene Linien bedeuten Spektren, worin
50 μM HCAII
zugegeben wurden. Die Fluoreszenz der Kontrollpeptide KE2-P und
KE3-P wird durch die Gegenwart von HCAII nicht beeinträchtigt,
die Fluoreszenz von KE2-PL wird aber um 80% erhöht. KE3-PL zeigt ein ähnliches,
aber weniger ausgeprägtes
Verhalten. Hinzuweisen ist auf den signifikanten Unterschied zwischen
der Fluoreszenz von KE3-PL und KE3-P.
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3 zeigt
eine S-förmige
Bindungskurve, erhalten bei Titration von 1 μM KE2-PL mit HCAII durch Auftragen
der maximalen Fluoreszenzintensität gegen den Logarithmus der
freien HCAII-Konzentration. Die Affinität der Wechselwirkung wurde
aus der Kurvenjustierung unter Verwendung eines Zwei-Zustandsbindungsmodells
mit 0,02 μM
bestimmt.
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4 zeigt
die mittlere Rest-Elliptizität
von 1 μM
KE2-PL (durchgezogene Kurve) und 1 μM KE2-PL in Gegenwart von 2 μM HCAII (gepunktete
Kurve). Die gepunktete Kurve ist das durch Subtrahieren des Spektrums
von 2 μM
HCAII von dem von 1 μM
KE2-PL + 2 μM
HCAII erhaltene Differenzspektrum. Das Spektrum von KE2-PL zeigt
zwei Minima bei 208 und 222 nm, die für α-Helix-Proteine typisch sind.
Die Helicität
des Peptids wurde beim Binden an HCAII beibehalten.
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5 zeigt
die Affinität
der Wechselwirkung zwischen KE2-PL und HCAII, aus einer Analyse
auf der Basis einer Oberflächenplasmon-Resonanz
mit 0,08 μM
bestimmt. Die durchgezogene Linie bedeutet die theoretische Kurve
für die
Gleichgewichtsreaktion als Funktion der Peptidkonzentration mit
Kd = 0,08 μM (bimolekulares Wechselwirkungsmodell).
Experimentelle Daten aus zweifachen Messungen sind dargestellt.
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6 zeigt
die Sequenzen von KE2 und KE3 und auch von LA-42b.
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7 zeigt
die Strukturen der Verbindungen Ia, Ib, Ic und Id.
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8 veranschaulicht
das Verfahren der Immobilisierung über PDEA, worin ein an die
Goldoberfläche eines
Biacore-Chips gebundener Carboxylatrest in einen N-Hydroxysuccinimid(NHS)ester
unter Verwendung von EDC als Haftvermittler überführt und mit PDEA umgesetzt
wird, um das entsprechende Amid zu bilden. Der Cys-Rest des Peptids
KE3 wurde dann mit der PDEA-Einheit unter Bildung der kovalenten
Disulfidbindung umgesetzt.
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9 zeigt
ein Biacore-Sensorgramm, das die Immobilisierung von KE3 in Dextranmatrix
und an einer 100%igen Carboxylat-darstellenden selbstarrangierten
Monoschicht (SAM) unter Verwendung des Verfahrens der 8 beschreibt.
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Beispiel
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Die
Struktur der Polypeptide KE2 und KE3 (siehe 1) basiert
auf der Sequenz von LA-42b, einem Polypeptid mit 42 Resten, das
sich zu einem Helix-Schleife-Helix-Strukturprinzip faltet, und unter
Bildung eines Vier-Helix-Bündels
dimerisiert [Andersson, L.; Stenhagen, G.; Baltzer, L., J. Org.
Chem., 1998, 63, 1366–1367] (gezeigt
in 6 und als SEQ. ID. No. 4). Aus den 42 Resten von
LA-42b wurden mehr als 32 in der Struktur von KE2 und KE3 beibehalten.
Die Lösungsstruktur
von LA-42b wurde mittels NMR- und CD-Spektroskopie extensiv untersucht, und
aufgrund der Sequenzähnlichkeiten
mit KE2 und KE3 wurde auch angenommen, dass sie in wässeriger
Lösung
zu Helix-Schleife-Helix-Dimer-Strukturprinzipien falten. Sie wurden
unter Verwendung der Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert und
durch Massenspektrometrie identifiziert. Die MALDI-TOF-Spektren
von KE2 und KE3 zeigten einzelne Peaks bei 4446,3 bzw. 4563,2 (berechnet
4446,0 und 4563,2). Die Peptide wurden konstruiert, um den positionsspezifischen
Einbau eines Fluoreszenzsensors an der Seitenkette von Lys15 zu
ermöglichen,
sowie eines Liganden mit hoher Affinität für ein Zielprotein an den Seitenketten
von Lys34 (KE2) oder Lys8 (KE3). Die Seitenkette von Lys15 wurde
orthogonal geschützt,
um das Kuppeln eines Fluoreszenzsensors an die Festphase zu ermöglichen.
Vor dem Spalten des Peptids vom Harz wurde die Lys15-Alloc-Schutzgruppe
durch drei Äquivalente
Pd (PPh3)4 in einer
Mischung aus 9,25 ml CHCl3, 0,5 ml AcOH
und 0,5 ml N-Methylmorpholin entfernt. Die Umsetzung der Peptide
mit selektiv entferntem Schutz mit zwei Äauivalenten Dansylchlorid in
Gegenwart von acht Äquivalenten
Diisopropylethylamin in DMF ergab KE2-P und KE3-P. Die MALDI-TOF-Spektren
von KE2-P und KE3-P zeigten einzelne Peaks bei 4680,4 bzw. 4868,2
(berechnet 4679,4 und 4867,6). Die Bezeichnung -P bedeutet, dass
ein Fluoreszenzsensor kovalent angelagert wurde, und die Bezeichnung
-PL zeigt die Anlagerung des Fluoreszenzsensors und des Liganden
mit hoher Affinität
an.
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Der
Einbau des Benzolsulfonamid-Liganden wurde durch Umsetzen der Polypeptide
mit dem aktiven Ester Id in wässeriger
Lösung
bei pH = 8 durchgeführt.
Einer der Erfinder et al. haben vorher gezeigt, dass in Bezug auf
die Reaktivität
gegenüber
aktiven Estern Lys34 von allen Lysinresten in LA-42b am reaktivsten
ist [Andersson, L. K.; Caspersson, M.; Baltzer, L., Chem. Eur. J.,
2002, im Druck], weil er an einer Position liegt, die einen Teil
des hydrophoben Kerns bildet, und einen selektiv abgesenkten pKa-Wert
besitzt. Es wurde etwas Konkurrenz von Lys19 beobachtet [Andersson,
L. K.; Dolphin, G. T.; Baltzer, L., ChemBio-Chem, 2002, im Druck], und deshalb wurde
Lys19 in der Sequenz von KE2 durch Arg19 ersetzt, und ebenfalls
Lys10. Auf der Basis der vorhergehenden Untersuchung wurde von Lys33
kein Wettbewerb erwartet, und es wurde deshalb nicht entfernt. In
KE3 ist Lys8 weniger reaktiv als Lys34 und Lys19, und nur gleich
reaktiv wie Lys10 und Lys33, und deshalb wurden in KE3 alle konkurrierenden
Lysine durch Arg-Reste ersetzt.
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Die
Affinität
von HCAII für
unprotoniertes Ia in wässerigem
Phosphat-Puffer bei Raumtemperatur und pH = 6,5, wurde bereits berichtet,
und die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante Kd betrug
27 μM [Taylor,
P. W.; King, R. W.; Burgen, A.S.V., Biochemistry, 1970, 9, 2638–2645].
Vorhergehende Affinitätsmessungen
auf der Basis von Oberflächen-Plasmonresonanz
legten nahe, dass Kd für KE2-PL, modifiziert mit Ib,
im μM-Bereich war, und
die Erfinder folgerten, dass, um eine Konkurrenz von einer nicht-spezifischen
Bindung von HCAII zu vermeiden, ein Ligand mit einer höheren Affinität als der,
der Ia entspricht, benötigt
wurde. Mit Benzolsulfonamid-Derivaten, die Alkylketten verschiedener
Länge in
para-Stellung tragen, wurden erhöhte
Affinitäten
gegenüber
HCAII im Vergleich zu der von Ia berichtet [King, R. W.; Burgen,
A.S.V., Proc. R. Soc. Lond. B, 1976, 193, 107–125]. Um die Affinität des Benzolsulfonamid-Inhibitors
zu erhöhen,
und um die sterischen Hinderungen bei der HCAII-Bindung zu minimieren,
die durch das Kuppeln des Benzolsulfonamid-Ligands an das Peptid
eingeführt
werden könnten,
wurde ein aliphatischer Spacer eingeführt. N-Hydroxysuccinimidylester von 4-Carboxybenzolsulfonamid
(Ib) wurde mit 6-Aminohexansäure
unter Bildung von Id umgesetzt, das weiter mit N-Hydroxysuccinimid
zur Bildung von Id aktiviert wurde. 1,4 Äquivalente von Id wurden mit
1 Äquivalent KE2-P
oder KE3-P in 50 mM Tris-HCl-Puffer bei pH = 8,0 bei Raumtemperatur
reagieren gelassen. Die modifizierten Peptide KE2-PL und KE3-PL
wurden durch Umkehrphasen-HPLC an einer Hichrom-C-8-Säule unter Verwendung
von 0,1% TFA in 40% wässerigem
2-Propanol als Eluens
gereinigt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 55% und 77% für KE2-PL
bzw. KE3-PL. Die
MALDI-TOF-Spektren von KE2-PL und KE3-PL zeigten einzelne Peaks
bei 4977,2 bzw. 5165,9 (berechnet 4975,7 und 5163,9).
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Die
Biosensor-Fähigkeiten
von KE2-PL und KE3-PL wurden durch Aufzeichnung ihrer Fluoreszenz-Emissionsspektren
zwischen 450 und 650 nm bei einer Anregung bei 335 nm untersucht.
Die Spektren wurden von 1 μM
Peptid-Lösungen
in 10 mM HBS-Puffer bei pH = 7,4 und 298 K in Abwesenheit und Gegenwart
von 50 μM
HCAII aufgezeichnet, mit 1 μM-Lösungen von
KE2-P und KE3-P als negative Kontrollen, 2. Nach
Zugabe von HCAII erhöhten
sich die Fluoreszenz-Intensitäten
von KE2-PL und KE3-PL um 80% bzw. 60%, während die Fluoreszenz-Intensitäten der
Kontrollpeptide durch HCAII nicht beeinflusst wurden. Die beobachteten
Intensitätsanstiege
wurden deshalb durch das Binden von HCAII an die Benzolsulfonamid-Einheit
der Peptidgerüste
verursacht, mit durch nicht spezifische Protein-Peptid-Wechselwirkungen
induzierten vernachlässigbaren
Effekten. Die Erfinder nehmen an, dass die Intensitätsanstiege
aus einer Veränderung
der Molekülumgebung
der Dansylgruppe beim Binden von HCAII durch die Polypeptide entstehen;
es scheint, dass der Sensor im ungebundenen Peptid partiell gequencht
ist, aber weniger, wenn an HCAII gebunden. Die Polypeptide KE2-PL
und KE3-PL sind deshalb dazu fähig,
die Gegenwart des Zielproteins HCAII anzuzeigen. Die Erkennung wird
durch die Spezifität
des Benzolsulfonamid-Liganden sichergestellt.
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Bei
Titration von 1 μM
KE2-PL mit 5 nM bis 50 μM
HCAII wurde eine S-förmige
Kurve erhalten, 3. Für die bimolekulare Assoziation
zwischen KE2-PL und HCAII entspricht die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante
Kd der Konzentration von freiem HCAII am
Wendepunkt. Aus der besten Justierung mit den experimentellen Resultaten
einer Gleichung, die die Dissoziation eines bimolekularen Komplexes beschreibt,
wurde Kd mit 0,02 μM bestimmt. Dieses Ergebnis
begründet
den Beweis des Prinzips für
funktionelle Biosensor-Einheiten auf der Basis Helix-Schleife-Helix,
da ein Binden zu Fluoreszenz-Intensitätsveränderungen
führt.
Die Verwendung einer Reihe von mit Liganden verschiedener Affinitäten modifizierten
Peptiden macht Messungen Analyse-Konzentrationen in begrenzter Messgenauigkeit
im Prinzip nur durch die Zahl verschiedener verfügbarer Ligandenvarianten und
durch den Affinitätsbereich
dieser Varianten möglich.
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Die
CD-Spektren der 1 μM-Lösungen von
KE2-P und KE3-P in 10 mM Phosphatpuffer bei pH = 7,5 ergaben einen
höheren
Grad and Helix-Gehalt als der des Templatpeptids LA-42b, bei vergleichbaren
Konzentrationen [Andersson, L. K.; Dolphin, G. T.; Kihlberg, J.;
Baltzer, L., J. Chem. Soc.-Perkin Trans. 2, 2000, 459–464]. Die
mittlere Restelliptizität θ222 betrug –18.200 und –15.900
Grad/cm2/dMol–1 für 1 μM KE2-P bzw. KE3-P,
und die von 3 μM
LA-42b betrug –7.500
Grad/cm2/dMol–1.
Die große
Differenz zwischen den KE-P-Peptiden und LA-42b legt nahe, dass
der Sensor eine Wirkung auf die Helixstabilität besitzt, möglicherweise
aufgrund der Entfernung einer positiven Ladung bei der Sensoranlagerung
[Andersson, L. K.; Dolphin, G. T.; Kihlberg, J.; Baltzer, L., J.
Chem. Soc.-Perkin Trans. 2, 2000, 459–464] oder aufgrund von Wechselwirkungen
zwischen dem Sensor und dem hydrophoben Kern. Durch Subtrahieren
des Spektrums von 2 μM
HCAII von dem von 1 μM
KE2-PL und 2 μM
HCAII erhaltene Differenz-CD-Spektren zeigten, dass die Helicität von KE3-PL beim
Binden an HCAII unverändert
war, 4. Bei diesen Konzentrationen und auf der Basis
einer Dissoziationskonstante von 0,02 μM sind mehr als 90% des Peptids
an HCAII gebunden.
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In
Abwesenheit von HCAII war ein signifikanter Unterschied zwischen
den Fluoreszenz-Intensitäten von
KE3-P und KE3-PL vorhanden. Die Anlagerung eines Liganden in Position
8 nahe zum Sensor in Position 15 könnte die Peptidstruktur genügend verändern, um
das Quenchen abzuschwächen.
Diese Hypothese wird durch die beobachteten Unterschiede in den
Helix-Gehalten zwischen 1 μM
KE3-P und 1 μM
KE3-PL, θ222 = –15.900
bzw. –21.300
Grad/cm2/dMol–1,
gestützt.
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Die
aus der Fluoreszenz-Spektroskopie erhaltene Affinität wurde
verglichen mit der mit einer Methode auf der Basis von Oberflächen-Plasmonresonanz
gemessenen, worin die Wechselwirkung zwischen immobilisiertem HCAII
und KE2-PL in Lösung
für eine
Reihe von Peptid-Konzentrationen im Bereich von 40 nM bis 10 μM aufgezeichnet
wurde. Die stationäre
Affinität
wurde aus einer Kurvenanpassung an ein Diagramm der Gleichgewichtsreaktionen
als Funktion der Peptid-Konzentration unter Verwendung eines 1:1-Bindungsmodells bestimmt.
Ein geringfügig
nicht ideales Verhalten wurde beobachtet, das erklärt werden
könnte
durch einen Einfluss einer Konzentrations-abhängigen supersekundären Strukturformation
des Peptids auf die Affinität.
Die stationäre
Affinität
von HCAII für
Ic wurde ebenfalls bestimmt, und Kd wurde
mit 0,044 μM
festgestellt. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Affinität von HCAII
für den
Liganden aufgrund sterischer Effekte abnimmt, wenn der Ligand an
das Peptid angelagert wird. Ein längerer Spacer könnte nützlich sein,
um die Affinität
von HCAII für
das Peptid noch stärker
zu erhöhen.
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Es
wurde gezeigt, dass Komponenten, die konstruiert wurden, um spezifisch
einen Analyten zu erkennen und zu binden, und dies über eine
Reportergruppe anzuzeigen, in ein kleines synthetisches Molekül als Teil eines
Chemosensors eingeführt
werden können
[Czarnik, a.W., Chem. Biol., 1995, 2, 423–428; Chen, C. T.; Wagner,
H.; Still, W. C., Science, 1998, 279, 851–853]. In einem Biosensor basiert
die Erkennung auf einem biochemischen Mechanismus, der z.B. Antikörper, Enzyme
oder ganze Zellen einbezieht [Thevenot, D. R.; Toth, K.; Durst,
R. A.; Wilson, G. S., Pure Appl. Chem., 1999, 71, 2333–2348].
Die erfindungsgemäßen Polypeptidgerüste wurden
konstruiert und synthetisiert, und weil sie ferner mit Liganden
modifiziert sind, ähneln ihre
Funktionen denen von Chemosensoren. Weil die Gerüste selbst nicht zur Erkennung
beitragen, die auf einem biochemischen Mechanismus basiert, stellt
die Erfindung die Liganden-modifizierten Polypeptide, mit oder ohne
Reportergruppe, gemäß der Erfindung
als funktionelle Einheiten in Biosensor-Systemen bereit.
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Diese
Ergebnisse zeigen die ersten Stufen in der erfolgreichen Anwendung
gefalteter Helix-Schleife-Helix-Peptide
auf dem Gebiet der Biosensorik. Es wurde gezeigt, dass ein Peptid,
das an einen Rezeptor bindet, dazu fähig ist, dies über einen
Fluoreszenzsensor anzuzeigen. Außerdem wurde dieses Konzept
auf die Bestimmung einer Affinitätskonstante
angewendet. Die Möglichkeit,
einen breiten Bereich von Sensoren und Liganden an verschiedenen
relativen Positionen geeignet einzubauen, stellt einen attraktiven
Weg zur Optimierung der Biosensor-Bedingungen, wie z.B. Sensitivität und Reaktion,
für irgendein
Ziel-Biomakromolekül bereit.
Wie durch diese Ergebnisse gezeigt, spielt die Struktur des Peptidgerüsts ebenfalls
eine wichtige Rolle für
die Leistungsfähigkeit
des Sensors. Die Bestimmung einer Analyt-Konzentration ist unter
Verwendung einer Reihe von mit Liganden verschiedener Affinitäten modifizierten
Peptiden möglich.
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