DE60303169T2 - Kationisches (Alkyl)acrylamid, hiervon abgeleitetes Polymeres sowie dieses enthaltendes Transfektions-System - Google Patents

Kationisches (Alkyl)acrylamid, hiervon abgeleitetes Polymeres sowie dieses enthaltendes Transfektions-System Download PDF

Info

Publication number
DE60303169T2
DE60303169T2 DE60303169T DE60303169T DE60303169T2 DE 60303169 T2 DE60303169 T2 DE 60303169T2 DE 60303169 T DE60303169 T DE 60303169T DE 60303169 T DE60303169 T DE 60303169T DE 60303169 T2 DE60303169 T2 DE 60303169T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
polymer
hpma
dmae
polyplexes
cationic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE60303169T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60303169D1 (de
Inventor
Arjen Mike Funhoff
Cornelis Franciscus Van Nostrum
Wilhelmus Everhardus Hennink
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
OctoPlus Technologies BV
Original Assignee
OctoPlus Technologies BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OctoPlus Technologies BV filed Critical OctoPlus Technologies BV
Application granted granted Critical
Publication of DE60303169D1 publication Critical patent/DE60303169D1/de
Publication of DE60303169T2 publication Critical patent/DE60303169T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/20—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a carbon atom of an acyclic unsaturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
    • C08F20/52—Amides or imides
    • C08F20/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F20/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
  • Polymerization Catalysts (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet synthetischer Transfektions- oder Hemmsysteme, die bei der Zufuhr von Genkonstrukten, RNS- oder DNS-Fragmenten an Zellen, besonders an Zellen in lebenden Organismen, nützlich sind. Genauer bezieht sich die Erfindung auf kationische Polymere, die geeignet sind, als ein DNS-, RNS- oder Genzufuhrsystem verwendet zu werden, welches zum Beispiel bei Gentherapieanwendungen verwendet werden kann.
  • Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf kationische Acrylamidderivate und kationische (Alkyl)acrylamidderivate. Zusätzlich bezieht sich die Erfindung auf Polymere auf der Basis dieser Derivate als Monomer. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Transfektionssystem, das dieses Polymer umfasst.
  • Gentherapie wird als ein viel versprechendes Verfahren angesehen, erbliche Defekte zu korrigieren oder lebensbedrohende Erkrankungen wie Krebs und AIDS zu behandeln. Bei der Gentherapie werden Nukleinsäurefragmente oder Genkonstrukte in Zielzellen gebracht, um ein fehlendes Gen zu kompensieren oder um eine neue Funktionalität in solche Zellen einzuführen. Diese Nukleinsäurefragmente oder Genkonstrukte werden bevorzugt in Plasmide eingebaut.
  • Falls rekonstruierte Plasmide per se an einem Organismus angewandt werden, führt dies allgemein zu einer niedrigen Expression des eingeführten Gens, falls überhaupt. Es gibt drei Hauptgründe für diese niedrige Expression. Erstens werden die Plasmide wegen Abbau- und Eliminierungsvorgängen kaum jemals die Zellpopulation erreichen, wo beabsichtigt ist, dass sie eingebaut werden. Zweitens, falls die Plasmide die Zielzellen erreichen, können sie nicht einfach die Zellmembran passieren aufgrund der stark polaren Natur und der Größe der Plasmide. Drittens, falls ein Plasmid in eine Zielzelle eindringt, wird es normalerweise in einem Endosom eingeschlossen, welches zu einem Lysosom umgewandelt werden wird. In dem Lysosom wird das Plasmid abgebaut werden, so dass das eingebaute Gen nicht exprimiert werden kann.
  • Aus den obigen Gründen werden bei der Gentherapie Plasmide oder andere Genkonstrukte mit einem Carrier oder Vehikel komplexiert.
  • In den vergangenen Jahren wurden viele Anstrengungen unternommen bei der Suche nach möglichen geeigneten Transfektionssystemen, sowohl viralen als auch nicht-viralen (kationische Lipide und kationische Polymere) Ursprungs. Diese Transfektionssysteme sollten das gewünschte Gen oder DNS-Fragment der Zielzelle zuführen und sie dazu bringen, dass es in einem hohen Grad exprimiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf synthetische Transfektionssysteme und genauer auf Transfektionssysteme in der Familie aus kationischen Polyacrylaten und Poly(alkyl)acrylaten und den entsprechenden Acrylamiden. Diese Familie kationischer Polymere wird in der WO-A-97/15680 beschrieben. Besagte internationale Patentanmeldung lehrt ein synthetisches Transfektionssystem, basierend auf Polyacrylaten, Polyacrylamiden, Poly(C1- 6-Alkyl)acrylaten oder Poly(C1-6-Alkyl)acrylamiden, welche kationische Substituenten enthalten. Allgemein und im Besonderen auf wasserlösliche oder wasserdispergierbare Transfektionssysteme, worin. organische kationische Einheiten an das Polyacrylat- oder das Poly(alkyl)acrylatgerüst oder das Gerüst der entsprechenden Acrylamide angeheftet werden.
  • Bevorzugt sind die an die Carboxylgruppe angehefteten kationischen Gruppen von der Formel -R3-N(R4)(R5), worin R3 für eine C1-6-Alkylengruppe steht oder mit inerten Substituenten ersetzt ist und worin R4 und R5, die gleich oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom, eine C1-6-Alkylgruppe oder eine Arylgruppe darstellen. Anstelle der zuvor genannten Acrylateinheiten können Acrylamideinheiten auch in der WO-A-97/15680 vorhanden sein, bevorzugt Einheiten der Formel C(O)NR4R5.
  • Die kationische Gruppe umfasst am bevorzugtesten eine Dimethylaminoethylgruppe. Dimethylaminoethylgruppen, ebenso wie andere tertiäre Amine, die in auf Acryl basierten Polymeren vorhanden sind, werden wenigstens teilweise unter physiologischen Bedingungen protoniert sein, was eine kationische Struktur ergibt, welche in der Lage ist, Nukleinsäurestrukturen wie RNS und DNS elektrostatisch zu binden und auf diesem Wege mit den Nukleinsäuren zu kondensieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung gegenüber den in der WO-A-97/15680 gelehrten, bekannten kationischen Transfektionssystemen bereit, dahingehend, dass sie Polymere bereitstellt, die in Transfektionssystemen zu verwenden sind, wobei die Polymere eine hohe Abbaurate unter physiologischen Bedingungen haben und besonders in einer wässerigen Umgebung bei einer Temperatur von 35 bis 39 °C und einen pH-Wert von 6,5 bis 8. Diese Verbesserung wird durch eine bestimmte Gruppe kationischer Polyacrylamid- und Poly(alkyl)acrylamidderivate erreicht.
  • Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt auf ein Polymer, basierend auf einem Monomer der folgenden Formel (I) CH2=C(R1)-C(O)NH-CH2-CHCH3-O-C(O)-O-CH2-CH2-N(CH3)2 (I)worin R1 entweder ein Wasserstoffatom oder eine C1-6-Alkylgruppe ist und vorzugsweise entweder ein Wasserstoffatom oder eine C1-3-Alkylgruppe und bevorzugter eine Methylgruppe. In einer bevorzugten Ausführung ist das Polymer ein Homopolymer.
  • In einem zweiten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das in dem vorangegangenem Absatz definierte Monomer. Bei der bevorzugtesten Ausführung trägt die Verbindung als Substitutent R1 eine Methylgruppe; diese Verbindung wird hierin unten als HPMA-DMAE identifiziert.
  • Dieses Monomer kann sehr geeignet durch eine Zweischrittsynthese zubereitet werden, worin in Schritt (i) N',N'-Dimethylaminoethanol (DMAE) durch 1,1'-Carbonyldiimidazol aktiviert wird; wobei der aktivierte Alkohol in Schritt (ii) mit N-(2-Hydroxypropyl)-(R1-substituiertem) Acrylamid (HPR1A) zur Reaktion gebracht wird. Dieser Prozess bildet einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
  • Es wird angenommen, dass die vorteilhaften Abbaueigenschaften des Monomers der vorliegenden Erfindung der zwischen der Dimethylaminoethanol-Startgruppe und der Acrylamid-Startverbindung eingeführten Carbonyleinheit zugeschrieben wird. In Beispiel 3, hierin unten, sind die Abbaueigenschaften von HPMA-DMAE erläutert. In den Beispielen 5 und 6 wird der Abbau des mit DNS komplexierten Polymers erläutert, worin das Abbauverhalten von Poly(dimethylaminoethylmethacrylat) (p(DMAEMA)), eines der bevorzugtesten Polymere innerhalb des Schutzumfangs der WO-A-97/15680, als eine Referenz verwendet wird. Zusätzlich ist gezeigt, dass dieses Abbauverhalten in der polymerisierten Form beibehalten wird. In 7 ist der mögliche Abbauvorgang gezeigt. Der Abbau wird auf der Hydrolyse der O-C(O)-O-Bindung basiert. Diese Hydrolyse geschieht nicht oder geschieht nicht wesentlich bei einem pH-Wert von ungefähr 5, noch geschieht sie in einem Medium, welches Hydrolyse nicht begünstigt, wie in DMSO.
  • Aus diesem Grund kann das Polymer der vorliegenden Erfindung geeignet zubereitet werden durch Radikalpolymerisierung des Monomers der Formel (I) und wahlweise anderer Monomere (siehe unten) in einer wässerigen Umgebung mit einem pH-Wert von ungefähr 5,0, wobei der pH-Wert zum Beispiel eingestellt werden kann unter Verwendung von HCl; oder alternativ in DMSO oder einem anderen polaren aprotischen Lösungsmittel. Ein geeigneter Polymerisierungsinitiator ist 2,2'-Azoisobutyronitril (AIBN), wenn Wasser nicht als das Reaktionsmedium verwendet wird. Geeignete Zubereitungstechniken sind beschrieben in G. Odian, Principles of Polymerization, Kapitel 3 „Radical Chain Polymerization", John Wiley and Sons, Inc. New York (1991), ebenso wie in Literaturstellen, auf welche dieses Handbuch verweist.
  • Vorzugsweise wird die Radikalpolymerisierung in der Anwesenheit eines Kettenübertragungsreagenz durchgeführt, z. B. β-Mercaptoethanol, 2-Aminoethanthiol oder Mercaptoessigsäure. Co-Polymere können durch Mischen der Monomere in den gewünschten Verhältnissen und Mengen und das nachfolgende Aussetzen dieser Mischung an Radikalpolymerisation gewonnen werden.
  • Das auf Monomeren der Formel (I) basierte Polymer kann als Teil des Polymergerüstes andere hydrophobe und hydrophile Einheiten umfassen. Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb sowohl Homopolymere aus Acrylamiden und (C1-6-Alkyl)Acrylamiden als auch Co-Polymere dieser Amide, umfassend verschiedene Acrylat-, Acrylamid-, (Alkyl)Acrylat oder (Alkyl)Acrylamideinheiten und andere Einheiten wie Methylmethacrylat, Triethylenglycolmethacrylat und Polyethylenglycolmethacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylmethacrylat, Laurylmethacrylat, Butylmethacrylat, N-Isopropylacrylamid, N-(3-Dimethylamino)propyl)methacrylamid usw. Weiter ist es nicht notwendig, dass sämtliche Gerüsteinheiten acrylamidähnliche Einheiten darstellen. Ein Teil der Einheiten kann zum Beispiel durch N-Vinylpyrrolidon oder Vinylacetat gebildet werden.
  • In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein synthetisches Transfektionssystem, welches wenigstens ein kationisches, wasserlösliches oder in Wasser dispergierbares Polymer der Erfindung als einen Carrier umfasst und das weiter ein Nukleinsäurefragment wie ein RNS- oder ein DNS-Fragment umfasst, zum Beispiel in der Form eines Plasmides, eines Genkonstruktes oder eines Oligonukleotids. Oligonukleotide können als Hemmstrukturen in Zellen verwendet werden, zum Beispiel um die Proteinsynthese zu kontrollieren.
  • Das Transfektionssystem der vorliegenden Erfindung wird durch Inkubieren von Nukleinsäuremolekülen und Polymeren der Erfindung gebildet. Dieser Vorgang wird schematisch in dem linken Teil der 8 gezeigt; der rechte Teil dieser 8 zeigt den Abbau des Komplexes unter physiologischen Bedingungen. Auch 9 zeigt die Freisetzung der Nukleinsäure aus dem Komplex in einer schematischen Ansicht.
  • Genauer können die Zufuhrsysteme selber leicht zubereitet werden, indem die Polymere der Erfindung und die Nukleinsäurefragmente wie z. B. DNS-Fragmente unter Bedingungen, unter welchen das Polymer positiv geladen ist, bevorzugt bei einem pH-Wert von 7,2, in einem geeigneten Puffersystem (z. B. ein PBS- oder HEPES-Puffer) bei Raumtemperatur in Kontakt gebracht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführung werden die Polymer-Polynukleotid-Komplexe in der Anwesenheit einer Substanz, die die Viskosität erhöht, bevorzugt in der Anwesenheit von Saccharose, zubereitet. Der Zusatz einer die Viskosität erhöhenden Substanz macht es möglich, kleinere Partikel zu gewinnen.
  • Die Zubereitung des Zuführsystems ist normalerweise innerhalb einer Komplexierungszeit von 10 Minuten abgeschlossen. Auf den Zubereitungsschritt kann ein Separationsschritt folgen, worin der Nukleinsäure-Polymer-Komplex von dem ungebundenen Polymer abgetrennt wird. In einem nachfolgenden Schritt kann der Komplex, umfassend Nukleinsäure und das Carrier-Polymer der Erfindung, lyophilisiert werden, bevorzugt in der Anwesenheit eines pharmazeutisch annehmbaren Tieftemperaturschutzstoffes wie Saccharose oder Manitol. Im lyophilisierten Zustand kann der Komplex für einen langen Zeitraum gelagert werden.
  • Die in 8 abgebildeten kationischen Einheiten und das Polymergerüst sind für Zellen nicht toxisch und werden ausgeschieden oder anderweitig aus dem System, in welchem die Komplexe als Transfektionssystem verwendet werden, entfernt.
  • Das Gewichtverhältnis des Carrier-Polymers zu den Nukleinsäurefragmenten und genauer zu den DNS- oder RNS-Fragmenten scheint kritisch zu sein. Geeignete Ergebnisse werden erhalten, wenn Gewichtsverhältnisse von Polymer zu Nukleinsäurefragmenten von zwischen 0,1 und 200, bevorzugt zwischen 1 und 20, am bevorzugtesten zwischen 2 und 5 verwendet werden. Das Molekulargewicht und/oder die verwendete Anzahl der Polymere kann leicht an die Art des zu transportierenden Plasmids angepasst werden. Normalerweise können Polymere mit einem Molekulargewicht von 1.000 bis 500.000 geeignet als ein DNS- oder RNS-Carrier verwendet werden. Bevorzugt ist das Molekulargewicht der in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendeten kationischen Polymere höher als 80.000 Da, bevorzugter höher als 100.000 Da, am bevorzugtesten höher als 250.000 Da.
  • Das Molekulargewicht der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polymere kann unter Verwendung und Aufrechterhaltung geeigneter Reaktionsbedingungen in den Polymerisierungsvorgang kontrolliert werden.
  • Es wird festgestellt, dass die das Polymer der Erfindung umfassenden kondensierten Partikel und Nukleinsäurefragmente in bekannte Arzneimittelzufuhrsysteme, z. B. in Liposomen oder Hydrogelen, eingeschlossen oder eingebaut werden können.
  • Gene zum Einbau in Carrier-Systeme oder Vehikel, um bei dem synthetischen Transfektionssystem verwendet zu werden, sind unter anderem dokumentiert in:
    • – McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked pheno-types. Achte Auflage. John Hopkins University Press (1988).
    • – Stanbury, J. B., Wyngaarden, J. B., Frederickson, D. S., Goldstein, J. L. und Brown, M. S. The metabolic basis of inherited disease. Fünfte Auflage. McGraw-Hill (1983).
  • In Ausführungen der vorliegenden Erfindung zu verwendende Vehikel schließen virale und nicht-virale Regulationselemente für die Expression und/oder Replikation ein.
  • Dieses Vehikel sind in dem Gebiet gut bekannt.
  • Geeignete Transfektionssysteme sind in der Lage, ein Genkonstrukt auf die beabsichtigte Zellpopulation zu richten. Das Transfektionssystem der vorliegenden Erfindung umfasst deshalb vorzugsweise wenigstens eine Gruppe, welche selektiv Proteine, die mit der Oberfläche der Zielzellen assoziiert sind, erkennt. Solche Zieleinheiten oder Homing-Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt und umfassen z. B. Tri- und Tetra-Antennen-Clusterglycoside, Transferrin oder andere Proteinkonstrukte, monoklonale Antikörper gegen Zellmembranproteine, Liganden für zelloberflächenassoziierte Rezeptoren und Bindungsfragmente von Derivaten dieser Zieleinheiten. Polyacrylamid- oder Poly(alkyl)acrylamid-System der vorliegenden Erfindung bis zu transportierenden Genfragmenten werden Hepatocyten durch den Galactoserezeptor von Hepatocyten zugeführt. Weiterhin erleichtert die Anwesenheit von erkennbaren Strukturen, die kovalent oder nicht-kovalent an den Polymerteil eines Polymer-Nukleinsäure-Komplexes gekoppelt sind, den Einbau des Nukleinsäurefragmentes, z. B. ein Genkonstrukt, in die Zielzelle.
  • Ferner kann das Transfektionssystem angepasst werden, um den Genkonstrukt zu ermöglichen, Endosomen in dem zellulären System zu verlassen. Daran sind membrandestabilisierende Strukturen, besonders Polypeptidfragmente, mit den wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren kationischen Polymersystemen der Erfindung konjugiert. Solche destabilisieren die endosomalen Membransysteme. Die ein Genkonstrukt einbauenden Plasmide erreichen so das Cytoplasma der Zielzelle, wo das Genkonstrukt in dem Kern exprimiert werden kann. Beispiele solcher membrandestabilisierender Strukturen, die in geeigneter Weise in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind fusogene Strukturen, z. B. gewisse Peptide und (Teile von) viralen Hüllproteinen, zum Beispiel Peptide, die vom Hämagglutinprotein des Influenzavirus abgeleitet sind (siehe in diesem Zusammenhang z. B. Plank et al. The influence of Endosome-Disruptive Peptides on Gene Transfer Using Synthetic Virus-Like Gene Transfer Systems, J. Biol. Chem. 269 (1994), 12918-12924), und besonders INF-7.
  • Andere in Übereinstimmung mit den vorliegenden Erfindungen nützliche Verbindungen sind Endosomen-destabilisierende Verbindungen wie Chloroquin. Es wird festgestellt, dass Chloroquin nur in In-vitro-Anwendungen verwendet wird, da es in vivo toxisch ist. Da die Erfindung sowohl auf In-vivo- als auch In-vitro-Anwendungen gerichtet ist, liegt diese Ausführung im Umfang der Erfindung.
  • In einer weiteren Ausführung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Einführen von Nukleinsäurefragmenten in Zielzellen, umfassend das Kontaktieren dieser Nukleinsäurefragmente mit einem Polymer der Erfindung und anschließend durch Kontaktieren des erhaltenen Transfektionssystems mit Zielzellen.
  • Das Carrier-System der vorliegenden Erfindung kann sowohl in In-vivo- als auch in In-vitro-Anwendungen verwendet werden.
  • Die Erfindung wird weiter in den Zeichnungen beschrieben, worin:
  • 1 das Abbauverhalten von HPMA-DMAE (⧫) und die entsprechende Bildung von HPMA (∎) über die Zeit bei 37 °C, bei pH = 10,0 (A), bei pH = 7,4 (B) und bei pH = 5,0 (C) zeigt.
  • 2 den Abbau von p(HPMA-DMAE) über die Zeit bei 37 °C und bei pH = 7,4 zeigt;
  • 3 eine Anzahl biophysikalischer Eigenschaften von auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen und besonders die Partikelgröße zeigt. (Zave: Z-Durchschnittsdurchmesser, bestimmt durch dynamische Lichtstreuung (DLS)) (⧫) und Zeta-Potential (∎) als Funktion des Verhältnisses von Polymer zu DNS;
  • 4 zeigt den Abbau von auf p(HPMA-DMAE) basierenden Polyplexen bei pH = 7,4
    Figure 00090001
    und bei pH = 5,0 (∎), ebenso wie von solchen auf der Basis von p(DMAEMA) (⧫); in 4(A) ist die Partikelgröße überwacht; in 4(B) wird der Signalintensität über die Zeit gefolgt;
  • 5 zeigt die Ergebnisse von Gelelektrophorese von auf p(HPMA-DMAE) basierenden Polyplexen bei pH = 7,4 und bei pH = 5,0 und von auf p(DMAEMA) basierenden Polyplexen bei pH = 7,4, inkubiert bei 37 °C; Spur 1: freie DNS; Spuren 2 bis 7: auf p(DMAEMA) basierte Polyplexe (pH = 7,4), Inkubationszeit 0, 2, 4, 7, 24 bzw. 48 Stunden, Spuren 8 bis 13: auf p(HPMA-DMAE) basierte Polyplexe (pH = 7,4), Inkubationszeit 0, 2, 4, 7, 24 bzw. 48 Stunden; und Spuren 14 bis 19: auf p(HPMA-DMAE) basierte Polyplexe (pH = 5,0), Inkubationszeit 0, 2, 4, 7, 24 bzw. 48 Stunden;
  • 6 zeigt die Transfektionseffizienz (A) und Toxizität (B) von auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen, ohne (∎) und mit (
    Figure 00100001
    dem membranzerstörenden Peptid INF-7; p(DMAEMA) (⧫) wird als eine Referenz verwendet;
  • 7 zeigt den Abbau von p(HPMA-DMAE) in chemischen Formeln;
  • 8 zeigt schematisch die Komplexierung von zirkulärer DNS durch p(HPMA-DMAE) und den Abbauvorgang; und
  • 9 zeigt schematisch die Freisetzung der DNS nach Abbau des Polymers.
  • Die Erfindung wird nun auf der Basis der folgenden nicht beschränkenden Beispiele beschrieben werden. In den Beispielen, ebenso wie in der obigen Beschreibung, sind sämtliche Prozentsätze Gewichts-Prozentsätze, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung, solange nicht anderweitig angegeben.
  • Beispiel 1: Synthese und Charakterisierung von (p)HPMA-DMAE
  • Synthese des Monomers wurde in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten Schritt wurde N'N'-Dimethylaminoethanol durch 1,1'-Carbonyldiimidazol mit einer guten Ausbeute von 68 % und guten Reinheit (> 97 % durch NMR) aktiviert. Im zweiten Schritt wurde der Reaktion zwischen dem aktivierten Alkohol und N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA) über die Zeit gefolgt, bis kein freies HPMA mit 1H-NMR mehr detektiert wurde.
  • Beispiel 2: Polymerisierung von HPMA-DMAE zu p(HPMA-DMAE)
  • Radikalpolymerisierung des in Beispiel 1 gebildeten Monomers wurde in einer wässrigen 1M HCl-Lösung, deren pH auf 5 eingestellt worden war, um Abbau des Monomers zu verhindern, durchgeführt; und auch in DMSO wurden Polymere mit einer Ausbeute von 75 % (in Wasser) und 80 % (in DMSO) gebildet. Die höhere Ausbeute in DMSO könnte dadurch erklärt werden, dass in DMSO der Abbau des Monomers in einem höheren Maße verhindert wird. Die massegemittelte Molekülmasse war 160 kDa (in Wasser) und 63 kDa (in DMSO), das Molekulargewicht-Zahlenmittel war 20 kDa (in Wasser) und 14 kDa (in DMSO).
  • Beispiel 3: Abbau des Monomers und Polymers
  • Dem Abbau des Monomers wurde mit RP-HPLC bei 37 °C gefolgt. Die relativen Peakflächen des Monomers und seines Abbauproduktes HPMA als eine Funktion der Zeit sind in 1(A) für pH 10, 1(B) für pH 7,4 und 1(C) für pH 5,0 abgebildet. Aus diesen Kurven kann die Halbwertszeit des Monomers bei diesen pH-Werten berechnet werden, welche 1,1 Stunden, 9,6 Stunden bzw. 380 Stunden betragen.
  • Um zu überprüfen, ob das in Beispiel 2 in Wasser hergestellte Polymer dieselbe Abbaurate hat wie das Monomer, wurde dem Abbau in D2O, gepuffert mit Na2HPO4/NaH2PO4 bei einem pH-Wert von 7,4 mittels 1H-NMR gefolgt. Dem Abbau wurde gefolgt durch das Integral des Peaks bei 4,8 ppm von HPMA-DMAE, welcher sich verschiebt, wenn der Alkohol durch Hydrolyse entfernt wird. 2 bildet das Peak-Integral dieses Protons als eine Funktion der Zeit ab. Indem dem Abbau über 19 Stunden gefolgt wurde, konnte die Halbwertszeit aus dieser Kurve als 12 Stunden seiend berechnet werden. Diese berechnete Halbwertszeit entspricht der Halbwertszeit des Monomers bei einem pH-Wert von 7,4, was folglich anzeigt, dass die Abbaurate des Polymers dieselbe ist wie die des Monomers.
  • Beispiel 4: Biophysikalische Charakterisierung von auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen
  • Die DNS-Bindungs- und -Kondensierungseigenschaften von p(HPMA-DMAE) wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zeta-Potential-Messungen als eine Funktion des Verhältnisses von Polymer zu DNS untersucht.
  • Detaillierter, diese physikalischen Eigenschaften von auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen wurden als eine Funktion des Verhältnisses des Polymerstickstoffes zu DNS-Phosphat (N/P-Verhältnis) untersucht. Plasmid-DNS, das Plasmid pCMVLacZ, enthaltend ein bakterielles LacZ-Gen, welchem ein nukleäres Lokalisierungssignal unter der Kontrolle eines CMV-Promotors voranging, vertrieben von Sanvertech (Heerhugowaard, Niederlande), wurde in 20 mM HEPES-Puffer, pH = 7,4, auf eine Konzentration von 75 μg/l verdünnt. Eine Stammlösung des Polymers (5 mg/ml) wurde in demselben Puffer auf verschiedene Konzentrationen (7 bis 450 μg/ml) verdünnt. Polyplexe wurden durch die Zugabe von 700 μl einer Polymerlösung zu 175 μl DNS-Lösung hergestellt, gründlich vermischt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Z-Durchschnittsdurchmesser der gebildeten Polyplexe wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bei 25 °C bestimmt und Zeta-Potentialmessungen wurden wie von Van de Wetering et al. in Bioconjugate Chem. 10 (1999), 589-597 beschrieben durchgeführt. Z-Durchschnittsdurchmesser von Polyplexen wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bei 25 °C mit einem Malvern-4700-System unter Verwendung eines Argon-Ionen-Lasers (488 nm), der bei 10,4 mW arbeitet (Uniphase), und PCS-(Photonenkorrelationsspektrometrie-(photon correlation spectrometry)) Software für Windows, Version 1.34 (Malvern, UK) bestimmt. Für die Datenanalyse wurden die Viskosität und der Brechungsindex von Wasser verwendet. Das System wurde mit einer Polystyroldispersion kalibriert, welche Partikel von 100 nm enthält. Für das Zeta-Potential wurden Messungen bei 25 °C in einer wässerigen DTS-5001-Zelle mit einer Zetasizer-2000-Einheit (Malvern, UK) und PCS-Software, Version 1.34 (Malvern, UK), gemacht. Für die Kalibrierung des Instrumentes wurde eine Polystyroldispersion mit bekanntem Zeta-Potential verwendet.
  • 3 zeigt, dass, wenn ein Überschuss des Polymers hinzugefügt wurde, das Polymer in der Lage war, DNS in kleine Partikel mit einer Größe von annähernd 110 nm, welche ein positives Zeta-Potential von annähernd +19 mV tragen, zu kondensieren. Dies ist vergleichbar mit Polyplexen, die aus DNS und anderen kationischen Polymeren wie pDMAEMA, pDAMA (Polydiaminomethacrylat und besonders Poly-(2-Methaycrylsäure 2-[(2-Dimethyl)aminoethyl)-Methylaminol]-Ethylester) und Polyphosphazenen (zubereitet gemäß Beispiel 1 der WO-A-97/07226) zusammengesetzt sind.
  • Beispiel 5: Destabilisierung von Polyplexen aus p(HPMA-DMAE) und DNS
  • Die Destabilisierung von auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen (zubereitet, wie in Beispiel 4 beschrieben (siehe unten)), wurde bei pH-Werten von 5,0 und 7,4 bei 37 °C durch dynamische Lichtstreuung untersucht. 4 bildet die Partikelgröße der Polyplexe (A) und die Intensität des Signals (B) als eine Funktion der Zeit ab.
  • Während die Partikelgröße der auf p(HPMA-DMAE) bei einem pH-Wert von 5,0 oder pDMAEMA bei pH 7,4 basierten Polyplexe über den untersuchten Zeitraum (nahezu) dieselbe blieb, nahm die Partikelgröße von auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen bei einem pH-Wert von 7,4 dramatisch über die Zeit ab. Dies zeigt, dass das p(HPMA-DMAE) tatsächlich abbaut und dass aufgrund der reduzierten Wechselwirkung zwischen Polymer und DMS die Partikel größer werden. Über die Zeit nahm die Signalintensität auch bei einem pH-Wert von 7,4 für p(HPMA-DMAE) ab, während sie bei einem pH-Wert von 5,0 und für pDMAEMA über die Zeit (4B) (nahezu) dieselbe blieb, was wiederum den Abbau von p(HPMA-DMAE) bei pH 7,4 und nicht bei pH 5,0 zeigt.
  • Beispiel 6: DNS-Freisetzung aus Polyplexen durch Abbau
  • Um zu untersuchen, ob sich durch den Abbau aus auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen freigesetzte DNS immer noch in ihrer intakten Form befindet, wurden Polyplexe, zubereitet gemäß Beispiel 4, bei 37 °C für unterschiedliche Zeitpunkte inkubiert und nachfolgend Gelelektrophorese ausgesetzt.
  • Genauer wurden Polyplexe aus p(HPMA-DMAE) und Plasmid-DNS hergestellt durch Mischen von 10 μl Plasmidlösung, 200 μg/ml, mit 40 μl pHPMA-DMAE-Lösung, 200 μg/ml, entsprechend einem N/P-Verhältnis von 5,4, und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dies wurde in 10 mM HEPES, pH 7,4, oder 10 mM Natriumacetat, pH 5, gemacht, wobei die Ionenstärke auf 150 mM mit NaCl eingestellt worden war. Als eine Kontrolle wurden auch auf pDMAEMA basierte Polyplexe bei pH 7,4 untersucht. Diese Polyplexdispersionen wurden nachfolgend bei 37 °C für 0, 2, 4, 7, 24 oder 48 Stunden inkubiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 10 μl des entsprechenden Puffers und 3 μl Probenpuffer (0,4 % (w/v) Bromphenol Blau, 10 mM EDTA, 50 % (v/v) Glycerol in Wasser) zu 20 μl jeder Polyplexdispersion hinzugefügt. 30 μl dieser Lösungen wurden auf ein 0,7 % Agarosegel, enthaltend 0,5 μg/ml Ethidiumbromid, aufgetragen und bei 100 V laufen gelassen.
  • Die Probe aus auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen, inkubiert für 2 Stunden bei pH 7,4, wurde offensichtlich während der Verarbeitung verloren. 5 zeigt die Elektrophoresemuster der Polyplexe. Für pDMAEMA bei pH 7,4 oder p(HPMA-DMAE) bei pH 5,0 verblieb die gesamte DNS in der Starttasche, was anzeigt, dass sämtliche DNS immer noch mit dem Polymer komplexiert war. Bei pH 7,4 und 48 Stunden Inkubation wurde sämtliche DNS aus den auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen freigesetzt, was zeigt, dass das Polymer zu solch einem Maß abgebaut war, dass Komplexierung überhaupt nicht mehr geschah. Nach 24 Stunden und 7 Stunden Inkubation konnte überhaupt keine DNS mehr nachgewiesen werden. Dies wurde auch für Polyplexe gefunden, wenn ein Polymer-DNS-Verhältnis von N/P = 3 gewählt worden war, wo große Aggregate gebildet werden, möglicherweise, da Ethidiumbromid nicht mehr in der Lage ist, zu der DNS noch länger Zugang zu finden. Folglich war zu diesen Zeitpunkten p(HPMA-DMAE) zum Teil abgebaut, und wegen der reduzierten Wechselwirkung zwischen DNS und Polymer wurden große Aggregate gebildet. Dieses Phänomen wird auch beschrieben für pEI-DNS-Polyplexe in Bieber et al., J. Control. Release 82 (2002), 441-454.
  • Beispiel 7: Transfektionseffizienz und Toxizität von auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen
  • 6 zeigt die Transfektionseffizienz und Toxizität von auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen in CDS-7-Zellen in der Abwesenheit oder Anwesenheit des die Membran zerstörenden Peptids INF-7 als eine Funktion des Polymer-DNS-Verhältnisses.
  • Detaillierter, Transfektionsstudien wurden in COS-7-Zellen unter Verwendung des Plasmids pCMVLacZ als Reportergen, wie beschrieben, gemacht. Kurz, auf 96-Well-Platten wurden Zellen in einer Dichte von 3 × 104/cm 24 Stunden vor der Transfektion ausgesät. An dem Tage der Transfektion wurden Polyplexe wie folgt zubereitet: 150 μl Polymerlösung (zahlreiche Konzentrationen) wurden zu 50 μl Plasmidlösung (50 μg/ml) hinzugefügt und nach Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden 50 μl jedes Puffers oder INF-7-Lösung (150 μg/ml) hinzugefügt und die Polyplexe wurden für weitere 15 Minuten vor der Zugabe zu den Zellen inkubiert. Nach dem Spülen der Zellen mit HBS wurden 100 μl Polyplexdispersion und 100 μl Kulturmedium (mit oder ohne 10 % Serum) mit den Zellen für 1 Stunde inkubiert. Nach Entfernen des Polyplexmediums wurde frisches Kulturmedium hinzugefügt und die Zellen wurden für weitere 48 Stunden inkubiert. Sämtliche Transfektionsexperimente wurden in zwei identischen Reihen auf gesonderten 96-Well-Platten durchgeführt. Eine Reihe wurde hinsichtlich der Reportergenexpression (β-Galactosidase) durch den kolorimetrischen ONPG-Test getestet, die andere Reihe wurde verwendet, um die Zahl lebender Zellen unter Verwendung eines kolorimetrischen XTT-Tests zu bestimmen. Als eine Referenz wurden pDMAEMA-Polyplexe, zubereitet mit derselben DNS-Konzentration und einem N/P-Verhältnis von 6, verwendet. Die Transfektionsaktivität dieser Polyplexformulierung wurde auf 1 eingestellt.
  • p(HPMA-DMAE) ist für Zellen nicht toxisch bei sämtlichen untersuchten Konzentrationen und ist in der Lage, Zellen zu einem gewissen Ausmaß zu transfizieren, besonders bei ziemlich hohen Polymer-DNS-Verhältnissen. Niedrige Transfektionseffizienten können an der Unfähigkeit der Polyplexe liegen, aus dem Endosom zu entweichen.
  • Um das endosomale Entweichen zu steigern, können membranzerstörende Peptide verwendet werden. Wenn das die Membran destabilisierende Peptid INF-7 in einem Transfektionsexperiment mit auf p(HPMA-DMAE) basierten Polyplexen verwendet worden war, wurde eine Zunahme in der Transfektionseffizienz beobachtet. Gleichzeitig wurde eine gewisse Toxizität beobachtet, aber diese Toxizität ist unabhängig von dem Polymer-DNS-Verhältnis und wird folglich möglicherweise von dem Peptid verursacht.

Claims (9)

  1. Polymer, basierend auf einem Monomer der Formel (I) CH2=C(R1)-C(O)NH-CH2-CHCH3-O-C(O)-O-CH2-CH2-N(CH3)2 (I)worin R1 entweder ein Wasserstoffatom oder eine C1-6-Alkylgruppe darstellt.
  2. Polymer nach Anspruch 1, bei dem es sich ein Homopolymer handelt.
  3. Polymer nach Anspruch 1 oder 2, worin R1 entweder ein Wasserstoffatom oder eine C1-3-Alkylgruppe darstellt.
  4. Polymer nach Anspruch 3, worin R1 eine Methylgruppe ist.
  5. Verbindung der Formel (I) CH2=C(R1)-C(O)NH-CH2-CHCH3-O-C(O)-O-CH2-CH2-N(CH3)2 (I)worin R1 entweder ein Wasserstoffatom oder eine C1-6-Alkylgruppe darstellt.
  6. Verbindung nach Anspruch 5, worin R1 entweder ein Wasserstoffatom oder eine C1-3-Alkylgruppe darstellt.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, worin R1 eine Methylgruppe ist.
  8. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach einem der Ansprüche 5-7, umfassend die Aktivierung von N',N'-Dimethylaminoethanol mit 1,1'-Carbonyldiimidazol, wobei der aktivierte Alkohol in einem folgenden Schritt (ii) mit N-(2-Hydroxypropyl)-(R1-substituiertem)-Acrylamid umgesetzt wird.
  9. Synthetisches Transfektionssystem, umfassend mindestens ein kationisches, wasserlösliches oder in Wasser dispergierbares Polymer nach einem der Ansprüche 1-4 als Träger und zusätzlich umfassend ein Nucleinsäurefragment.
DE60303169T 2003-08-07 2003-08-07 Kationisches (Alkyl)acrylamid, hiervon abgeleitetes Polymeres sowie dieses enthaltendes Transfektions-System Expired - Fee Related DE60303169T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03077473A EP1505089B1 (de) 2003-08-07 2003-08-07 Kationisches (Alkyl)acrylamid, hiervon abgeleitetes Polymeres sowie dieses enthaltendes Transfektions-System

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60303169D1 DE60303169D1 (de) 2006-04-06
DE60303169T2 true DE60303169T2 (de) 2006-08-31

Family

ID=33547691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60303169T Expired - Fee Related DE60303169T2 (de) 2003-08-07 2003-08-07 Kationisches (Alkyl)acrylamid, hiervon abgeleitetes Polymeres sowie dieses enthaltendes Transfektions-System

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1505089B1 (de)
AT (1) ATE315591T1 (de)
DE (1) DE60303169T2 (de)
ES (1) ES2255659T3 (de)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8464658B2 (en) 2011-03-01 2013-06-18 Andrew Lanter Container system
EP2522689A1 (de) 2011-05-13 2012-11-14 Universität Bayreuth Nicht virale Transfektionssysteme
DE102011118018B4 (de) 2011-10-25 2017-10-26 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Minicircles mit Transpositionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen
MX2016004620A (es) 2013-10-11 2016-08-01 Hercules Inc Modificadores de reologia de alta eficiencia con componentes cationicos y uso de los mismos.
DE102013220859B4 (de) 2013-10-15 2016-09-08 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Minicircles mit viralen Expressionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen zur Erzeugung rekombinanter Viren oder viraler Genvektoren
AU2016316027B2 (en) 2015-09-01 2022-04-07 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Systems and methods for selection of gRNA targeting strands for Cas9 localization
AU2017281706B2 (en) * 2016-06-23 2021-05-13 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Control of polymer network structures via nanogels

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0463597A (ja) * 1990-06-29 1992-02-28 W R Grace & Co 細胞への遺伝子導入法およびそれに用いる細胞固定板
EP0859857B1 (de) * 1995-10-25 2005-05-04 OctoPlus B.V. Kationische polyacrylate und poly(alkyl)acrylate oder die entsprechende acrylamide zur verwendung in synthetischen transfektions-systemen
EP1022340A1 (de) * 1999-01-21 2000-07-26 OctoPlus B.V. Stabilisierung von Zusammensetzungen die nicht-virale nukeinsäure-Transfer-Zusammensetzungen enthalten

Also Published As

Publication number Publication date
EP1505089B1 (de) 2006-01-11
ES2255659T3 (es) 2006-07-01
ATE315591T1 (de) 2006-02-15
EP1505089A1 (de) 2005-02-09
DE60303169D1 (de) 2006-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69634697T2 (de) Kationische polyacrylate und poly(alkyl)acrylate oder die entsprechende acrylamide zur verwendung in synthetischen transfektions-systemen
Oupický et al. DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers
DE60302784T2 (de) Kontrolliertes abbaubares polymer-biomolekül oder wirkstoffträger und verfahren zur synthese dieses trägers
DE69535540T9 (de) Zusammensetzung enthaltend nukleinsäuren und kationische polymere, zubereitung und verwendung
EP0905254B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines niedermolekularen Polyethylenimins
DE69906977T2 (de) In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
EP0938511B1 (de) Polymere mit antimikrobiellen eigenschaften
Srinivasachari et al. Versatile supramolecular pDNA vehicles via “click polymerization” of β-cyclodextrin with oligoethyleneamines
DE10220470A1 (de) ph-sensitives Polymer
Averick et al. Autotransfecting short interfering RNA through facile covalent polymer escorts
DE60119711T2 (de) Verfahren zur herstellung von funktionalierten polyalkyleniminen, diese enthaltende zusammenstellungen und ihre verwendungen
Nicol et al. Poly-L-glutamate, an anionic polymer, enhances transgene expression for plasmids delivered by intramuscular injection with in vivo electroporation
Mathew et al. Hyperbranched PEGmethacrylate linear pDMAEMA block copolymer as an efficient non-viral gene delivery vector
EP2363494A9 (de) Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems
DE69632303T2 (de) Poly(organo)phosphazene in synthetischen transfektions-systemen
DE60303169T2 (de) Kationisches (Alkyl)acrylamid, hiervon abgeleitetes Polymeres sowie dieses enthaltendes Transfektions-System
RU2617059C2 (ru) Способ получения амфифильных блок-сополимеров N,N-диметиламиноэтилметакрилата для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки
DE602004007155T2 (de) Kationische polymere mit abbaubaren vernetzungen
Sirianni et al. Self-immolative polyplexes for DNA delivery
Veron et al. Hydrolyzable p (DMAPEMA) polymers for gene delivery
WO2018019341A1 (de) Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen
Asgatay et al. Polynorbornene polycationic polymers as gene transfer agents: Influence of the counterion for in vitro transfection
DE69810925T2 (de) Verwendung eines kationischen Polymer zur Herstellung von Nukleinsäure-Komplexe und verwandte Zusammensetzungen
DE102020114183B4 (de) Mittel zur transfektion von nukleinsäuren in zellen
EP2380602B1 (de) Kunststoffe enthaltend Nukleinsäuren in komplexierter Form und Verfahren zu deren Herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee