DE60221224T2 - Verfahren und vektoren zur plastidentransformation höherer pflanzen - Google Patents

Verfahren und vektoren zur plastidentransformation höherer pflanzen Download PDF

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung gehört zum Bereich der pflanzlichen Biotechnologie im Allgemeinen und zu den neuen Verfahren zur Plastidentransformation im Speziellen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Nach allgemeinem Kenntnisstand leiten sich die zwei Klassen von Zellorganellen – Plastiden und Mitochondrien – von ursprünglich unabhängigen Prokaryoten ab, die von einem Vorläufer heutiger eukaryotischer Zellen in getrennten Endosymbiose-Vorgängen aufgenommen wurden (Gray, 1991). Als Folge davon enthalten diese Organellen ihre eigene DNA, DNA-Transkripte in der Form von Boten-RNA (mRNA), Ribosomen und wenigstens einige der für eine Decodierung der genetischen Information benötigten tRNA-Moleküle (Marechal-Drouard et al., 1991).
  • Zwar waren diese Organelle kurz nach der endosymbiotischen Aufnahme noch genetisch autonom, da sie alle für das prokaryotische Leben notwendigen Elemente besaßen. Doch wurde diese Autonomie während der Evolution durch einen Transfer von genetischer Information zum Zellkern hin reduziert. Trotzdem blieb ihren genetischen Kompartimenten genügend Komplexität erhalten, um sie zu einem attraktiven Ziel für die Gentechnik werden zu lassen. Das trifft insbesondere auf die Plastiden zu, da diese Organellen immer noch ca. 50% der für ihre wichtigste Funktion innerhalb der Pflanzenzelle – Fotosynthese – benötigenden Proteine kodieren. Außerdem kodieren die Plastiden ihre eigenen ribosomalen RNAs, die meisten ihrer tRNAs und ribosomalen Proteine. Die Gesamtzahl der Gene im Plastom liegt bei etwa 120 (Palmer, 1991). Allerdings wird die überwiegende Mehrheit aller in den Plastiden vorhandenen Proteine vom Zellkern bzw. dem Cytosol importiert.
  • Plastiden kennen durch Transformation genetisch verändert werden
  • Mit der Entwicklung molekularer Klonierungstechniken gelang es bald, höhere Pflanzen durch Transformation genetisch zu verändern. Die Hauptanstrengungen im Bereich der Pflanzen-Transformation war und ist die Zellkern-Transformation, da sich die Mehrheit aller Gene dort befindet. Im Falle von Arabidopsis thalina, dessen komplette Genomsequenz kürzlich publiziert wurde (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), sind das ca. 26.000 Gene. Die Transformation des Zellkerns konnte einfacher erreicht werden, da biologische Vektoren wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens verfügbar waren, die so verändert werden konnten, dass sie eine effiziente Kern-Transformation ermöglichen (Galvin, 1998). Hinzu kommt, dass der Zellkern fremden Nukleinsäuren direkter zugänglich ist, während die Organellen von zwei Hüll-Membranen umgeben sind, die – allgemein ausgedrückt – für Makromoleküle wie DNA undurchdringbar sind.
  • Die Möglichkeit Plastiden zu transformieren zu können ist sehr wünschenswert. Denn damit könnte die sehr hohe Gendosis in diesen Organellen, die das Potenzial für außergewöhnlich starke Transgen-Expression trägt, nutzbar gemacht werden. In einer Zelle können nämlich über 10 000 Plastom-Kopien vorhanden sein. Eine weitere attraktive Eigenschaft der Plastiden-Transformation besteht darin, dass Plastiden-kodierte Merkmale nicht über Pollen übertragen werden können. Folglich wird die potenzielle Gefahr eines unerwünschten Ausbreitens der Transgene auf zu den Transformanten verwandte Wild-Typ Arten stark reduziert. Zu den weiteren potenziellen Vorteilen der Plastidentransformation gehört die Möglichkeit, mehrere Gene gleichzeitig als polycistronisches Operon zu exprimieren, sowie das Ausschalten von Positionseffekten und "gene silencing" (Abschaltung von Genen), die in Folge von Zellkern-Transformationen auftreten können.
  • Tatsächlich konnten für höhere Pflanzen Methoden entwickelt werden, die die stabile Transformation von Plastiden ermöglichen. Bisher sind zwei unterschiedlich Methoden verfügbar: Beschuss von Geweben – insbesondere Blattgewebe – mit einer Genkanone ("particle gun") (Svab et al., 1990), sowie die PEG (Polyethylenglykol) Behandlung von Protoplasten in Anwesenheit eines geeigneten Transformations-Vektors (Koog et al., 1996). Beide Methoden vermitteln ein Eindringen von Plasmid DNA in das Stroma der Plastiden durch zwei Hüllmembranen hindurch.
  • Ein eklatanter Nachteil aller heute gebräuchlichen Transformationsmethoden für multizelluläre Pflanzen ist die Anwesenheit von Markergenen in der transgenen Pflanze. Die Markergene, die für die Selektion der transgenen Pflanzenzellen vom riesigen Hintergrund der nicht-transformierten Zellen benötigt werden, kodieren für Antibiotika- oder Herbizidresistenz. Beispiele für plastidäre Resistenz-Gene sind aadA, das eine Resistenz gegen Spectinomycin und Streptomycin vermittelt (Svab & Maliga, 1993) oder nptII, das eine Resistenz gegen Kanamycin vermittelt (Carrer et al., 1993). Da diese Marker zusammen mit den interessierenden Genen ("gene of interest" = GOI) stabil in das Genom integriert werden, bleiben sie auch in den homoplastomischen transgenen Pflanzen erhalten, obwohl sie für die Funktion der interessierenden Gene (GOI) nicht benötigt werden. Diese in den Pflanzen verbleibenden Markergene sind ein Hauptkritikpunkt an der Pflanzen-Biotechnologie, da sie theoretisch die Antibiotikaresistenz von Pathogenen oder die Herbizidresistenz von Wildkräutern erhöhen könnten. Die Entwicklung eines Selektionssystems, bei dem in der transgenen Pflanze keine Resistenzgene mehr vorhanden sind, ist deshalb höchst erstrebenswert (Iamtham and Day, 2000).
  • Ein weiteres Problem bei der Plastidentransformation stellt der Mangel an verfügbaren Selektionsmarkergenen dar: Das aadA-Gen ist der einzige routinemäßig eingesetzte Selektionsmarker (Heifetz, 2000). Das nptII-Gen ist die einzige Alternative, von dem gezeigt wurde, dass es bei der Plastidentransformation höherer Pflanzen funktioniert (Carrer et al., 1993). Da weder das aadA-Gen noch das nptII-Gen universell eingesetzt werden können, ist die Anzahl von Spezies höherer Pflanzen, die im Plastom transformiert wurden, immer noch sehr gering (Heifetz, 2000). Die Plastidentransformation höherer Pflanzen kann bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht seinem tatsächlichen Potenzial entsprechend ausgebeutet werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein einfaches und dennoch vielseitiges Verfahren zur Erzeugung von genetisch stabilen in ihrem Plastom transformierten multizellulären Pflanzen, Pflanzenorganen oder Pflanzengeweben, die frei von zu ihrer Selektion benötigten Fremdgenen wie zum Beispiel Antibiotika- oder Herbizid-Resistenzgene sein können.
  • Dieses Ziel wird erreicht durch ein Verfahren zur Herstellung von plastomtransformierten multizellulären Pflanzen, Pflanzenorganen oder Pflanzengeweben gemäß Anspruch 1.
  • Bevorzugte Ausführungsformen werden in den Unteransprüchen definiert.
  • Es ist überraschend, dass dieses neue Verfahren bei vielzelligen Pflanzen, Pflanzenorganen oder Pflanzengeweben angewendet werden kann, da diese in jeder Zelle eine Vielzahl von Plastiden enthalten. Dies bedeutet, dass eine Segregation von Genotypen jeweils auf Plastomebene, Plastidenebene und Zellebene erfolgen muss. Es wurde herausgefunden, dass dieses neue Verfahren bei Pflanzengewebe sehr effizient ist, da während des Wachstums Segregation erfolgt. Bei entsprechender Ausführung kann die Abtrennung daher einfach durch optische Überprüfung und manuelle Bearbeitung erfolgen. Im Fall der Inhibitor – unterstützten Selektion (Schritt (b)) kann die Selektion sehr schnell durchgeführt werden, da der Inhibitor bei vielzelligen Pflanzen, Pflanzenorganen oder Pflanzengeweben nicht während der gesamten Regenerationsprozedur, sondern nur am Anfang eingesetzt werden kann. (Natürlich ist es – wie oben dargestellt – auch möglich, den Einsatz von Inhibitoren ganz zu vermeiden). Dies zeigt einen Kombinationseffekt von Vielzelligkeit und der Transformationsmethode.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren der Transformation von Pflanzengeweben werden die Auswirkungen einer Veränderung oder Unterbrechung eines Gens, die häufig im Falle isolierter Zellen letal sein können (wenn dieses Gen beispielsweise für Stoffwechselwege von essentieller Bedeutung ist), dadurch abgemildert, dass die einzelne Zelle nicht isoliert ist. Vielmehr ist die Zelle Teil einer Population von Zellen, zwischen denen Metabolite ausgetauscht werden können.
  • Es gibt viele unterschiedliche plastidäre Gene, die für den Zweck dieser Erfindung verändert oder ausgeschaltet werden können. Ein solches Gen sollte für eine plastidäre Funktion in dem Sinne wichtig sein, dass ein Ausfall oder eine Veränderung einen selektierbaren oder erkennbaren Phänotyp hervorbringt. Eine solche Funktion kann jede plastidär kodierte Funktion sein. Vorzugsweise ist diese Funktion direkt oder indirekt an der Fotosynthese beteiligt. Beispiele für Funktionen, die indirekt für die Fotosynthese nötig sind, sind alle für die Transkription und/oder Translation plastidärer Gene nötigen Funktionen. Beispiele für Funktionen, die direkt an der Fotosynthese beteiligt sind, sind alle Proteine, die zumindest unter Selektionsbedingungen für die Fotosynthese benötigt werden.
  • Vorzugsweise sollte der erkennbare Phänotyp leicht zu erkennen sein. Da die Funktion vorzugsweise direkt oder indirekt mit Fotosynthese zu tun hat, kann ein leicht erkennbarer Phänotyp Pigment-Defizienz – vorzugsweise Chlorophyll-Defizienz oder veränderte Fluoreszenz – sein. Die transformierte Pflanze kann dann heterotroph kultiviert werden, und die transformierten Pflanzen, Pflanzen-Organe oder Pflanzen-Gewebe können abgetrennt oder selektiert werden. Eine solche Abtrennung kann manuell erfolgen, indem transformierte Gewebebereiche optisch identifiziert werden. Selektion kann aufgrund von Resistenz gegen einen Inhibitor erreicht werden, welche auf einem in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeführten Resistenzgen beruht. Alternativ kann die Resistenz gegen einen Inhibitor auch eine Folge der veränderten oder inaktivierten Funktion selbst sein.
  • Nachdem der homoplastomische Zustand aufgrund von Segregation während mehrerer Regenerationszyklen erreicht wurde, wird die transformierte Pflanze, das Pflanzenorgan oder das Pflanzengewebe zum zweiten Mal transformiert (Schritt (c)), wobei die veränderte oder inaktivierte Funktion wieder hergestellt wird und das Markergen – sofern ein solches vorhanden ist – entfernt wird.
  • Die transformierten Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, die den wiederhergestellten Phänotyp aufweisen – beispielsweise Fototropismus – werden daraufhin abgetrennt oder selektiert.
  • Zusätzliche Sequenzen oder interessierende Gene können in Schritt (a) und/oder Schritt (c) eingeführt werden, beispielsweise um ein gewünschtes Gen zu exprimieren, um ein nützliches Merkmal einzubringen oder um jede andere gewünschte Plastommodifikation zu erreichen.
  • Ferner können in Schritt (a) und Schritt (c) eingeführte Sequenzen zusammen zu einer weiteren Funktion führen. Beispiele für diese Ausführungsform sind u.a. die folgenden: Einführen von Sequenzen in Schritten (a) und (c), die für verschiedene Untereinheiten eines Proteins mit mehreren Untereinheiten kodiert; Bereitstellen von regulatorischen Sequenzen in Schritt (a) oder Schritt (c), die eine in Schritt (c) bzw. Schritt (a) eingeführte Kodiersequenz exprimierbar machen; Einführen von Sequenzen in Schritt (a) und (c), die für Proteine eines biosynthetischen Weges kodieren, usw.
  • Spezielle Beispiele für zu inaktivierende Funktionen stellen "knock Outs" von rpoA oder rpoB dar. Diese Gene kodieren für die α– bzw. β–Untereinheit der plastidär kodierten plastidären RNA-Polymerase. Plastiden, denen diese Gene fehlen, können keine Fotosynthese betreiben, zeigen einen Albino-Phänotyp und können nicht fototrop wachsen. Nach einer Wiederherstellung von rpoA oder rpoB während der zweiten Transformationsrunde können die transgenen Pflanzen fototrop im Licht wachsen, und sie zeigen einen grünen Phänotyp.
  • Ein weiteres Beispiel für ein Zielgen bei Schritt (a) stellt die Inaktivierung von ycf3 dar. Unter normalen Licht-Bedingungen ist dieses Gen nicht essentiell (Ruf et al., 1997). Wenn jedoch eine ycf3 "knock out"-Mutante in Starklicht transferiert wird, entwickelt sie einen Albino-Phänotyp, und das Wachstum ist unter fotosynthetischen Kulturbedingungen reprimiert. Pflanzen mit wiederhergestelltem ycf3-Gen können unter Starklicht-Bedingungen fototrop wachsen. In diesem Fall kann der Selektionsdruck bei der zweiten Transformation über die Lichtintensität eingestellt werden. Deshalb kann die zweite Transformation – im Gegensatz zu dem Beispiel, bei dem rpoA oder rpoB verwendet wird – mit grünen, normal wachsenden Mutanten durchgeführt werden, wenn diese unter Schwachlicht-Bedingungen wachsen. Der Selektionsdruck kann nach einer Regenerationszeit einfach durch Erhöhen der Lichtintensität verstärkt werden. Da der Zustand des Pflanzenmaterials kritisch für den Erfolg der Transformation ist, ist diese Methode einer Transformation von Albinomaterial überlegen.
  • Ein weiteres Beispiel für eine zu verändernde oder auszuschaltende Funktion ist die Inaktivierung von petA während der ersten Transformations-Runde (Schritt (a)). petA kodiert eine Untereinheit des Cytochrom b/f Komplexes. petA "knock out"-Mutanten zeigen einen "high chlorophyll fluorescence"-Phänotyp (hcf; "starke Chlorophyll Fluoreszenz"), und sind nicht in der Lage, Fotosynthese zu betreiben. Deshalb können diese Mutanten auch nicht fototrop wachsen. Das fototrope Wachstum in Licht wird wieder hergestellt, wenn petA in der zweiten Transformations-Runde (Schritt (c)) reaktiviert wird.
  • DEFINITIONEN
  • Die folgenden Definitionen werden angegeben, um die Bedeutung bestimmter Ausdrücke klarzumachen, die in vorliegender Erfindung benutzt werden.
    • 3'-UTR:
    transkribierte aber nicht translatierte Region eines (→) Gens, abwärts einer kodierenden Region; in (→) plastidären (→) Genen, dienen die 3'-UTRs unter anderem zur Stabilisierung der mRNA gegen 3' zu 5' exonukleolytischem Abbau;
    5'-UTR:
    transkribierte aber nicht translatierte Region eines (→) Gens, aufwärts einer kodierenden Region; in (→) plastidären (→) Genen, enthält die 5'-UTR Sequenzinformation für die Translationsinitiation (Ribosomen Binde Stelle, (→) RBS) in der Nähe ihres 3'-Endes;
    aadA:
    (→) kodierende Region von bakterieller Aminoglykosid-adenyl-Transferase, einem häufig benutzten Protein, das die (→) antibiotische Selektionsinhibitoren Spectinomycin und/oder Streptomycin entgiftet.
    Chloroplast:
    (→) Plastide die Chlorophyll enthält;
    Gewünschte(s) Gen (Sequenz):
    veränderte oder neu eingeführte Sequenz: der Grund für eine Transformation;
    Flanke, flankierende Region:
    DNA-Sequenz am 5' und 3'-Ende eines Inserts in einem (→) plastidären Transformation (→) Vektor, welche die Integration in das Ziel (→) Plastom von Sequenzen zwischen den Flanken durch doppelt reziproke homologe Rekombination vermittelt. Durch denselben Mechanismus können Sequenzen verändert oder vom Ziel (→) Plastom entfernt werden. Daher legen die Flanken des (→) plastidären (→) Transformations (→) Vektors fest, wo Veränderungen im Ziel (→) Plastom durch Transformation erzeugt werden;
    Gen Expression:
    Prozess, bei dem Geninformation in Funktion umgesetzt wird; in (→) Genen die für Polypeptide kodieren, wird für die Genexpression die Aktivität eines (→) Promoters benötigt, der die RNA-Polymerase Aktivität startet und steuert, dies führt zur Bildung einer Messenger RNA, die anschließend in ein Polypeptid übersetzt wird; in (→) Genen, die für RNA kodieren, generiert die Promoter-vermittelte Aktivität der RNA-Polymerase die kodierte RNA.
    Gen(e):
    Nukleotidsequenz(en), welche für alle Elemente kodiert, die notwendig sind, um das unabhängige Funktionieren z.B. Expression sicherzustellen; Gene sind in (→) Operons organisiert, die mindestens eine komplette kodierende Region beinhalten; In (→) Genen, die für Polypeptide kodieren sind diese Elemente: (1) ein (→) Promoter, (2) eine 5'-untranslatierte Region ((→) 5'-UTR), (3) eine (→) komplette kodierende Region, (4) eine 3'-untranslatierte Region ((→) 3'-UTR); in (→) Genen die für RNA kodieren, fehlen der (→) 5'-UTR und der (→) 3'-UTR; in (→) Operons die aus mehr als einer kodierenden Region bestehen, sind zwei aufeinander folgende vollständige (→) kodierenden Regionen durch (→) Spacer getrennt; (→) Promoter, (→)) 5'-UTR und (→) 3'-UTR Elemente werden von allen kodierenden Regionen diese Operons geteilt;
    Genom:
    Komplette DNA Sequenz eines Zellkerns oder einer Zellorganelle;
    Gewebe:
    ein Pflanzengewebe besteht aus einer Anzahl von Zellen mit ähnlicher oder identischer Struktur und Funktion; Zellen in Pflanzengeweben sind über Plasmodesmata verbunden; Beispiele sind: Kallus, Palisaden-Parenchym, Schwamm-Parenchym, Kambium, Epidermis, Mark, Endosperm, Phloem, Xylem etc.
    hcf
    High Chlorophyll Fluorescence; starke Chlorophyll Fluoreszenz; hcf-Mutanten zeigen einen charakteristischen, Fotosynthese-defizienten Phänotyp
    Heteroplastomische Plastide/Zelle:
    eine Plastide oder Zelle, die genetisch verschiedene Plastome enthält
    Homologe Rekombination:
    Prozess der zum Austausch, Insertion oder Deletion von Sequenzen führt, aufgrund der Anwesenheit von (→) Flanken mit genügender Sequenzhomologie zur Zielstelle in einem (→) Genom;
    Homoplastomische Plastide/Zelle:
    eine Plastide oder Zelle, die genetisch einheitliche Plastome enthält
    Insertionsstelle:
    Stelle in einem (→) Plastom, in die neue Sequenzen eingeführt werden;
    Intergenischer Bereich:
    Sequenzen zwischen zwei (→) Genen in einem (→) Genom; eine solche Region kann als interoperonischer Bereich oder als intraoperonischer Bereich vorkommen, in letzterem Fall werden sie auch Spacer genannt;
    Intragenischer Bereich:
    Sequenz innerhalb eines (→) Gens;
    Intron:
    Sequenz die eine (→) kodierende Region unterbricht;
    Kodierende Region:
    Nukleotid-Sequenz die Information für a) die Aminosäure-Sequenz eines Polypeptides oder b) die Nukleotide einer funktionellen RNA, enthält; kodierende Regionen können optional von einem oder mehreren (→) Intron(s) unterbrochen sein;
    Organ:
    ein Pflanzenorgan ist eine Struktur, die einer besonderen biologischen Funktion dient und aus einem oder mehreren charakteristischen (→) Geweben besteht; Beispiele sind: Wurzeln, Sproß, Blätter, Blüte, Stamina, Fruchtknoten, Frucht, etc.
    Operon:
    Organisationsstruktur von mehreren (→) Genen
    petA
    (→) kodierende Region des plastidären Gens des Cytochrom f Proteins, das am fotosynthetischen Elekronentransport beteiligt ist
    Pflanze(n):
    Organismus, der (→) Plastiden in seinen Zellen enthält; diese Erfindung bezieht sich auf multizelluläre zweikeimblättrige (→) Pflanzen; das schließt die Gruppe der Nacktsamer (wie Kiefer, Fichte, Tanne) and Bedecktsamer (wie die einkeimblättrigen Nutzpflanzen Mais, Weizen, Gerste, Reis, Roggen, Triticale, Hirse, Zuckerrohr, Spargel, Knoblauch, Palmen und einkeimblättrigen Nicht-Nutzpflanzen, und zweikeimblättrige Nutzpflanzen wie Tabak, Kartoffel, Tomate, Raps (rage seed), Zuckerrübe, Kürbis, Gurke, Melone, Pfeffer, Citruspflanzen, Aubergine, Weintrauben, Sonnenblume, Soja, Luzerne, Baumwolle usw.), und zweikeimblättrige Nicht-Nutzpflanzen wie auch Farne, Lebermoose, Moose und mehrzellige grüne, rote und braune Algen;
    Plastide(n):
    Organelle(n) mit eigener genetischer Maschinerie in (→) Pflanzen Zellen, die in verschiedenen funktionellen und morphologisch unterschiedlichen Formen vorkommen, z.B. Amyloplasen, (→) Chloroplasten, Chromoplasten, Etioplasten, Gerontoplasten, Leukoplasten, Proplastiden etc.;
    Plastome:
    Komplette DNA-Sequenz von (→) Plastiden;
    Promoter:
    Nukleotid Sequenz, die Transkription initiiert und reguliert;
    RBS, Ribosomen Binde Stelle:
    DNA-Sequenz-Element aufwärts des (→) Translation Start Kodons eines (→) kodierenden Bereichs, diese vermittelt Ribosomen Bindung und Translationsinitiation vom entsprechenden RNA-Transkript; RBS Elemente sind entweder Teil eines (→) 5'-UTRs oder eines (→) Spacers;
    rpoA/B/C:
    kodierende Region eines plastidären (→) Gens für die plastidär kodierte RNA-Polymerase (PEP)
    Selektionsinhibitor:
    Chemische Verbindung, die Wachstum und Entwicklung von nicht-transformierten Zellen oder Organellen stärker behindert als von Transformierten;
    Transformation Vektor:
    geklontes DNA-Molekül, das hergestellt wurde um (→) Transformation eines (→) Genoms zu vermitteln;
    Transformation:
    Prozess der zum Einführen, Entfernen oder Verändern von DNA-Sequenzen durch Behandlung von (→) Pflanzen oder Pflanzen Zellen einschließlich der Benutzung von wenigstens einem (→) Transformations Vektor, führt;
    Transgen:
    DNA-Sequenz die aus einem (→) Genom in ein anderes überführt wurde;
    Translationsstartkodon:
    Sequenz Element, das die erste Aminosäure eines Polypeptids kodiert;
    Translation Stopp Kodon:
    Sequenz Element, das Abbruch der Translation bewirkt;
    uidA:
    (→) kodierender Bereich bakterieller β-Glucuronidase, einem häufig benutzten Reporter-Protein;
    ycf3:
    (→) kodierender Bereich für ein Protein, das am PSI Zusammenbau beteiligt ist; ycf3-Minus-Mutanten zeigen eine bleichen Phänotyp und eine Wachstumsdepression, wenn sie unter Standard-Lichtbedingungen kultiviert werden (3,5-4 W/m2). Unter Schwachlicht-Bedingungen (0,4-0,5 W/m2) ist der Phänotyp viel schwächer.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC571. "Priming site" bedeutet "Startstelle".
  • 2 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC554. "Priming site" bedeutet "Startstelle".
  • 3 ist eine schematische Darstellung von Vector pGEM-rpoA-del und der abgezielten Plastomregion.
  • 4 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC598 und der abgezielten Plastomregion.
  • 5 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC553
  • 6 ist eine schematische Darstellung von Vector pKCZ-GFP
  • 7 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC526
  • 8 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC558 und der abgezielten Plastomregion. "gene" bedeutet "Gen".
  • 9 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC558.
  • 10 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC597, pIC599 und pIC600 und der abgezielten Plastomregion. "gene" bedeutet "Gen".
  • 11 ist eine schematische Darstellung von Vector pIC597.
  • 12 ist eine Karte von pIC577.
  • 13 ist eine schematische Darstellung von Vektor pIC577 und der abgezielten Plastomregion.
  • 14 ist eine Karte von pIC637.
  • 15 ist eine schematische Darstellung von Vektor pIC637 und der abgezielten Plastomregion.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Vektoren der vorliegenden Erfindung bieten einen sichtbaren Marker während der Selektion
  • Für die Plastidentransformation können nicht-letale Inhibitorkonzentrationen verwendet werden, die die Pflanzenzellen nicht abtöten, sondern das Wachstum zu einem gewissen Grad hemmen. Nur eine oder wenige der bis zu 10 000 Plastomkopien pro Zelle sind vermutlich nach dem ursprünglichen Transformationsereignis rekombinant. Würde man die kultivierten Zellen nach der Transformation mit letalen Inhibitorkonzentrationen behandeln, so wäre es nicht möglich, heteroplastomische Zellen zu erhalten, die aufgrund ihrer geringen Kopienzahl an transformierten Plastomkopien nur eine mäßige Resistenz ausprägen. Selektion und Segregation führt zum Auftreten von sowohl Wildtyp als auch transgenem Gewebe. Ein größeres Problem während diese Prozesses besteht darin, zwischen Wildtyp und transgenem Gewebe zu unterscheiden, da die transformierten Plastiden die Wildtyp-Plastiden maskieren können. Khan and Maliga (1999) haben einen fluoreszierenden Antibiotika-Resistenzmarker, der die kodierenden Regionen von aadA und GFP enthielt, verwendet, um die Segregation von Plastidentransformanten im UV-Licht zu verfolgen. In der vorliegenden Erfindung stellen wir einen sichtbaren Marker für transplastomische Gewebe-Bereiche vor, der mit dem nackten Auge nachgewiesen werden kann. Der schrittweise Vorgang des Aussortierens von Wildtyp und rekombinanten Plastiden kann auf einfache Weise überwacht und dadurch beschleunigt werden. Das Auftauchen von grünen Sektoren über dem weißen Hintergrund des mutanten Phänotyps kann sehr einfach detektiert werden.
  • Vektoren der vorliegenden Erfindung bieten verbesserte Regeneration-Effizienz
  • Konventionelle Chloroplastentransformations-Strategien basieren auf der Selektion nach Resistenz gegen einen Inhibitor wie beispielsweise Spectinomycin. Die Inhibitoranwendung beginnt nach der Transformation und wild während des gesamten Vorgangs der wiederholten Regenerationsrunden, die zum Erreichen eines homoplastomischen Genotyps notwendig sind, aufrechterhalten. Die Anwendung von Inhibitoren hat den Nachteil, dass sie das Regenerationspotential vermindert. Die Regeneration von ganzen Pflanzen aus einzelnen Protoplasten oder Blattstückchen ist ein kritischer Schritt bei der Chloroplastentransformation, insbesondere wenn die Methode auf Arten, für etablierte und zuverlässige Regenerationsprotokolle nicht existieren, ausgedehnt wird. Ein großer Vorteil dieser Erfindung besteht darin, dass Inhibitoren möglicherweise nur für eine kurze Zeitspanne nach der ersten Transformation benützt werden müssen. Durch Verwendung unseres neuartigen Verfahrens kann die Verwendung von Inhibitoren während der wiederholten Regenerationsrunden zur Erreichung des homoplastomischen Zustandes und während des gesamten zweiten Transformationsschrittes vermieden werden.
  • Vektoren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Herstellung genetisch stabiler Plastom-Transformanten.
  • Es ist bekannt, dass die homloge Rekombination in den Plastiden mit hoher Frequenz auftritt. Als Folge davon können ungewünschte Rekombinationsereignisse zwischen Regelelementen von Antibiotikaresistenzmarkern und endogenen Regelelementen zu genetischer Instabilität führen (Eibl et al., 1999). Nach dem zweiten Transformationsschritt enthält die Transformante keine Marker-Expressionskassette mehr. Folglich enthalten die endgültigen Transformanten weniger homologe Regionen als konventionelle Plastiden-Transformanten. Die genetische Stabilität der Transformanten wird erhöht und unerwünschter Verlust von Sequenzen wird vermindert (Eibl et al., 1999).
  • Mit dieser Erfindung wird eine neuartiges Antibiotika-freies und auf der Fotosynthese beruhendes Selektionssystem für die Chloroplastentransformation höherer Pflanzen zur Verfügung gestellt. Das neue System benutzt sichtbare Marker und kann auf der Inaktivierung von Genen wie rpoA, rpoB, ycf3 oder petA, das zu einem bleichen Phänotypen führt, beruhen. In einem zweiten Schritt kann das entsprechende defiziente Gen der mutanten Linie wiederhergestellt werden und dabei eine oder mehrere Transgene inseriert werden. Die resultierende transgene Pflanze kann frei von Antibiotikaresistenzgenen sein.
  • Andere mögliche Zielfunktionen für Schritt (a) des in der vorliegenden Erfindung vorgestellten Verfahrens sind beliebige andere plastidär kodierte Funktionen, die entweder direkt oder indirekt für die Fotosynthese benötigt werden. Abgesehen von den speziellen unten beschriebenen Anwendungen kann die Inaktivierung und Reaktivierung von zahlreichen in der Fotosynthese involvierten Ziel-Genen (wie beispielsweise psbA) auf entsprechende Weise wie in der Erfindung beschrieben verwendet werden.
  • Plastidäre Chromosomen kodieren für vier RNA-Polymerase Gene, die als rpoA, B, C1 und C2 bezeichnet werden und die den drei RNA-Polymerase "Haupt"-Genen der Eubakterien entsprechen. Die Gene für als rpoB, C1 und C2 sind in einem Operon angeordnet (das durch die Zellkern-kodierte NEP RNA-Polymerase transkribiert wird), während rpoA auf einem großen Gen-Cluster, das hauptsächlich für ribosomale Proteine kodiert, liegt.
  • Da die Menge an "Sense"-Transkripten des rpoA Gens in PEP- (plastdär kodierte RNA-Polymerase) defizienten Mutanten abnimmt (Krause et al., 2000), könnte rpoA von der PEP transkribiert werden.
  • Die Deletion von rpoA, rpoB oder rpoC1 vom Plastidengenom führt zu einem Pigment-defizienten Phänotyp (Allison et al., 1996; De Santis-Maciossek et al., 1999). Die Pigment-defizienten ΔrpoA, ΔrpoB or ΔrpoC1 Pflanzen (weiße Pflanzen) können nicht fotoautotroph wachsen. Wenn sie allerdings auf einem Medium gehalten werden, das Sucrose enthält, um die fehlende Fähigkeit zur Fotosynthese zu kompensieren, so wachsen sie normal, jedoch mit im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen reduzierter Geschwindigkeit.
  • Von ycf3 wurde kürzlich gezeigt, dass es für die stabile Akkumulation von Fotosystem I (PS I) in Tabak erforderlich ist (Ruf et al., 1997). Eine Unterbrechung diese Gens führt zu einem konditionell Pigmentdefizientem Phänotyp im Licht. Homoplastomische ycf3 Pflanzen zeigen bei Regeneration auf Wirkstoff- und phytohormonfreiem Medium unter Standard-Lichtbedingungen (3.5-4 W/m2) einen vollständig weißen Phänotyp, während der Phänotyp unter Schwachlichtbedingungen (0.4-0.5 W/m2) viel schwächer (hellgrün) ausgeprägt ist.
  • Es ist ein weiterer mutanter Pflanzenphänotyp, der als hcf (high chlorophyll fluorescence) bezeichnet wird, bekannt. Dieser Phänotyp beruht auf einer Mutation in der Expression und/oder Prozessierung von Genen, die in die Fotosynthese involviert sind (entweder bei Zellkern-kodierten oder bei Plastiden-kodierten Genen; Bock et al. 1994; Monde et al., 2000; Monde et al., 2000b). Diese Mutanten zeigen einen charakteristischen Fotosynthese-defizienten Phänotyp: verschlechtertes Wachstum unter Gewächshausbedingungen, hellgrüne Blätter und "high chlorophyll fluorescence" (starke Chlorophyll-Fluoreszenz; rote Fluoreszenz) unter UV-Beleuchtung. Hcf tritt auf, wenn der fotosynthetische Elektronentransport blockiert wird ("Elektronen Rückstau"). Eine Möglichkeit, einen hcf-Phänotyp herbeizurufen besteht darin, das plastidäre petA-Gen zu inaktivieren. Es kodiert für eine Untereinheit des im fotosynthetischen Elektronentransport verwickelten Cytochrom b/f Komplexes.
  • Unter Ausnützung des Pigment- oder Fotosynthese-defizienten Phänotyps von z.B. Δrpo-, Δycf3- or ΔpetA-Pflanzen kann eine zweite Transformationsrunde durchgeführt werden: dabei werden die Pigment-defizienten Transformanten der ersten Runde als Substrat verwendet, um gleichzeitig die ausgeschaltete Funktion wiederherzustellen, den Selektionsmarker der ersten Runde zu entfernen (sofern ein solcher verwendet wurde) und bei Bedarf interessierende Sequenzen zu inserieren. Indem ein entsprechendes Wildtyp-Gen in das Plastom der Pigment-defizienten Mutanten eingebracht wird, erhält man wieder grüne Pflanzen. Deshalb werden solche sekundären Transformanten die Fähigkeit zu fotosynthetischem Wachstum wiedererlangen und zudem einen grünen Phänotyp und/oder – im Falle des hcf Phänotyps – normale Chlorophyll Fluoreszenz zeigen. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um transformierte Gewebe zu selektieren. Folglich ist in diesem zweiten Schritt keine Antibiotika-Selektion nötig. Noch wichtiger jedoch ist, dass der Selektionsmarker, der für die erste Transformations-Runde verwendet wurde, in der zweiten Runde entfernt wird, und Marker-freie transplastomische Pflanzen entstehen.
  • Die Plastidentransformation beruht auf homologer Transformation. Dies kann durch die Verwendung von flankierenden Regionen von ausreichender Homologie zu den Zielbereichen im Plastom auf dem Transformationsvektor erreicht werden, wie es in diesem Wissenschaftsbereich wohlbekannt ist. Bei der vorliegenden Erfindung kann die Transformation mit jeder in der Wissenschaft allgemein bekannten Methode durchgeführt werden. Derzeit gibt es zwei solcher allgemein bekannter Methoden, nämlich die "particle gun" Transformation ("Teilchenbeschuss", "Genkanone") und die PEG-vermittelte Transformation. In der vorliegenden Erfindung wird die "particle gun"-Transformation bevorzugt. Beide Schritte (a) und (c) des in der Erfindung beschriebenen Prozesses können auch durch Ko-Transformation, d.h. unter Verwendung von mehr als einem Transformations-Vektor erreicht werden.
  • Die Verfahren der Erfindung können auf jede vielzellige zweikeimblättrige Pflanze angewandt werden, vorzugsweise zweikeimblättrigen Nutzpflanzen. Spezielle Beispiele für Nutzpflanzen sind in dem Kapitel "Definitionen" unter dem Stichwort "Pflanzen" aufgeführt.
  • Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Funktion eines plastidären Gens in Schritt (a) zu verändern oder zu unterbrechen, solange ein selektierbarer oder erkennbarer Phänotyp damit erzeugt wird. Zu den Beispielen gehören eine teilweise oder vollständige Deletion der kodierenden Region des entsprechenden Gens oder eines für die Expression des entsprechenden Gens benötigten funktionellen Elementes, wie zum Beispiel Promoter, 5'-UTR, 3'-UTR und Start-Kodon. Die Funktion dieser Elemente kann auch verändert oder unterbrochen werden durch: Insertion einer fremden Sequenz in diese Elemente oder in die kodierende Region, durch vollständigen oder teilweisen Austausch dieser Elemente durch eine fremde Sequenz oder durch das Einfügen eines Stopp-Kodons in die kodierende Region. Die oben erwähnten Mittel können auch kombiniert werden. Wenn ein Resistenzmarker in Schritt (a) eingeführt wird, so wird das Markergen vorzugsweise als die entsprechende Fremd-Sequenz verwendet. In Schritt (a) kann gleichzeitig jede zusätzliche interessierende Sequenz inseriert werden.
  • Schritt (a) des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahrens wird durch genetische Transformation erreicht.
  • In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, die Plastiden haben, welche den interessierenden Phänotyp exprimieren, abgetrennt oder auf einem Medium selektiert, welches heterotrophes Wachstum unterstützt. Die Selektion kann durchgeführt werden, indem ein in Schritt (a) eingeführtes selektierbares Markergen und ein geeignetes Antibiotikum oder ein Inhibitor verwendet wird. Alternativ können die neuartigen Verfahren dieser Erfindung, die Fotosystem I-Akzeptor-Herbizide verwenden (wie unten genauer beschrieben) angewandt werden. In letzterem Fall muss in Schritt (a) kein Resistenzgen eingeführt werden. Wie oben beschrieben müssen Inhibitoren oder Antibiotika nur für einen kurzen Zeitraum nach der ersten Transformation eingesetzt werden, um die Segregation zu unterstützen, und die Verwendung eines solchen Agens kann sogar vollständig vermieden werden. Nach Wachstum und mehreren Zellteilungen führt die Segregation zur Bildung von Bereichen, die sich in der Menge an vorhandenem Pigment oder in der Fluoreszenz unterscheiden. Gewebe von solchen Bereichen wird manuell abgetrennt und für weitere Regenerationszyklen eingesetzt.
  • In Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Plastom einer Pflanze, die im vorangehenden Schritt erhalten wurde, mit einem Vektor transformiert, der eine wiederherstellende Sequenz enthält, welche in der Lage ist, die in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Funktion wieder herzustellen. Diese Wiederherstellung kann mit verschiedenen Mitteln erfolgen, abhängig davon wie die Veränderung oder Unterbrechung in Schritt (a) durchgeführt wurde. Inserierte Sequenzen können entfernt werden, ausgetauschte Sequenzen können noch einmal mit durch die ursprüngliche, vollständig funktionelle Sequenz ersetzt werden und deletierte Sequenzen können wieder eingeführt werden. Gleichzeitig kann ein in Schritt (a) eingeführtes Resistenzgen entfernt oder seine Funktion zerstört werden und eine zusätzliche genetische Modifikation des Plastoms durchgeführt werden oder eine zusätzliche Funktion eingeführt werden. Zu den Beispielen gehören das Einbringen einer zusätzlichen Sequenz oder interessierenden Gens, das Einbringen mehrerer Gene, das Eliminieren einer bestehenden Funktion oder Sequenz etc.
  • In Schritt (d) werden Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, welche Plastiden enthalten, die die entsprechende wiederhergestellte Funktion exprimieren, abgetrennt oder auf einem Antibiotikum-freiem Medium selektiert. Die Selektion kann durch zumindest teilweises fototrophes Wachstum erreicht werden, und die transformierten Pflanzen sind durch den wiederhergestellten Phänotyp erkennbar. Nach Wachstum führt die Segregation zur Bildung von Bereichen, die sich in der Menge an Pigment unterscheiden. Grüne Bereiche werden manuell abgetrennt und für weitere Regenerationszyklen eingesetzt. In dieser Erfindung werden für Schritt (d) vorzugsweise mixotrophe Bedingungen angewandt. Dies bedeutet, dass der Kohlenhydratgehalt des Mediums so weit wie möglich herabgesetzt wird, so dass Plastiden, die transformierte Plastome enthalten, und Zellen, die transformierte Plastiden enthalten, welche ihre Fähigkeit zur Fotosynthese wiedererlangt haben, im Starklicht einen Wachstumsvorteil haben. Solche mixotrophen Bedingungen können Schritt (d) beschleunigen.
  • Ausführungsform 1: Verfahren zur Selektion von Plastidentransformanten, die auf der Inaktivierung und Reaktivierung der rpoA- oder rpoB-Gene beruht
  • Für die gezielte Unterbrechung der Funktion von rpoB kann der rpoB-Promoter und das Start-Codon beispielsweise durch den aadA-Marker oder ein anderes Markergen ersetzt werden. Beschossenes Gewebe kann im Falle des aadA-Markers unter vorübergehender Selektion auf Spectinomycin-haltigem Medium regeneriert werden. Transformanten weisen einen Antibiotikum-resistenten und im Licht anfangs grünen Phänotyp auf, solange sie noch heteroplastomisch sind. Diese primären Transformanten enthalten eine Mischung aus Wild-Typ und transformierten Genomen. Das grüne, heteroplastomische Material wird auf nicht-selektives Medium übertragen. Segregation führt zum Auftreten von weißen, gemischten und grünen Bereichen. Material dieser weißen Bereiche kann mehreren zusätzlichen Regenerationszyklen auf nicht-selektivem Medium unterworfen werden, um homoplastomisch mutierte Transformanten zu erhalten.
  • Bei der zweiten Transformation können die homoplastomischen ΔrpoB-Pflanzen mit einem Vektor transformiert werden, welcher so entworfen wurde, dass das rpoB-Gen wiederhergestellt wird, das Markergen entfernt wird und vorzugsweise ein oder mehrere interessierende Gene dabei gleichzeitig eingeführt werden. Das behandelte Gewebe kann unter Selektion auf Sucrose-reduziertem Medium (Antibiotikum-frei) im Starklicht regeneriert werden. Transformanten, die einen grünen Phänotyp zeigen und in der Lage sind, fotoautotroph zu wachsen, können selektiert werden.
  • Eine Unterbrechung und Wiederherstellung des rpoA-Gens kann auf eine ähnliche Weise erreicht werden.
  • Ausführungsform 2: Verfahren zur Selektion von Plastidentransformanten, die auf der Inaktivierung und Reaktivierung des ycf3-Gens beruht
  • Die Unterbrechung des ycf3-Gens kann erreicht werden, indem das 5'-Regelelement und das erste Exon des ycf3-Gens durch eine Markergen wie den aadA-Marker ersetz wird. Der Transformationsvektor kann in Tabakplastiden beispielsweise mit der "biolistischen Methode" (Verwendung einer Genkanone; "particle gun") oder durch Verwendung der PEG-vermittelten Transformation eingebracht werden. Das beschossene Gewebe (im Falle der biolistischen Transformation) wird unter Selektion auf einem Medium, welches einen Inhibitor oder ein Antibiotikum enthält (Spektinomycin im Falle des aadA-Gens) regeneriert. Transformanten zeigen Inhibitor-Resistenz und unter Standard-Lichtbedingungen (3,5-4 W/m2) einen anfangs grünen Phänotyp, solange sie noch heteroplastomisch sind. Diese primären Transformanten enthalten normalerweise eine Mischung aus Wild-Typ und transformierten Chloroplasten-Genomen. Nach einer Übertragung auf Antibiotikum-freies Medium führt Segregation zum Auftreten von gelb-weißen und grünen Bereichen (unter Standard-Lichtbedingungen; siehe oben). Material der weißen Bereiche kann mehreren zusätzlichen Regenerationszyklen auf nicht-selektivem Medium unterworfen werden, um homoplastomisch mutierte Transformanten zu erhalten. Neben ihrem bleichen, beinahe weißen Phänotyp im Licht zeigen die Mutanten vermindertes Wachstum. Um adäquates Material für den zweiten Transformationsschritt zu erhalten, kann die mutierte Pflanzenlinie in Schwachlicht-Bedingungen überführt werden. Unter diesen Bedingungen (0,4-0,5 W/m2) zeigen die Pflanzen einen viel schwächer ausgeprägten Phänotyp und können eine ausreichende Menge an Spendermaterial – beispielsweise für eine "particle gun"-Transformation (Genkanone) – hervorbringen. Bei dieser zweiten Transformation werden die homoplastomischen Δycf3-Pflanzen mit einem Vektor transformiert, welcher so entworfen wurde, dass das ycf3-Gen wiederhergestellt wird, das Markergen entfernt wird und vorzugsweise ein oder mehrere interessierende Gene dabei gleichzeitig eingeführt werden. Das beschossene Gewebe kann unter Selektion auf Sucrose-reduziertem Medium (Antibiotikum-frei) im Starklicht regeneriert werden. Transformanten, die einen normalen grünen Phänotyp zeigen und in der Lage sind, fotoautotroph zu wachsen, können selektiert werden.
  • Ausführungsform 3: Verfahren zur Selektion von Plastidentransformanten, die auf der Inaktivierung und Reaktivierung des petA-Gens beruht
  • Für eine gezielte Unterbrechung des petA-Gens kann die codierende Region durch ein Markergen, beispielsweise den aadA-Marker ersetz werden. Beschossenes Blattgewebe (im Falle der biolistischen Transformation) kann unter Selektion auf Antibiotikum-haltigem Medium regeneriert werden. Transformanten zeigen Antibiotikum-Resistenz und anfangs einen normalen grünen Phänotyp im Licht, solange sie noch heteroplastomisch sind. Diese primären Transformanten enthalten eine Mischung aus Wild-Typ und transformierten Chloroplasten-Genomen. Nach einer Übertragung auf Antibiotikum-freies Medium kann die Segregation zum Auftreten von Bereichen führen, die den hcf-Phänotyp zeigen, welcher unter UV-Beleuchtung erkannt werden kann. Material der mutierten Bereiche kann mehreren zusätzlichen Regenerationszyklen auf nicht-selektivem Medium unterworfen werden, um homoplastomisch mutiertes Material zu erhalten.
  • Bei der zweiten Transformation können die homoplastomischen ΔpetA-Pflanzen durch Beschuss mit einem Vektor transformiert werden, welcher so entworfen wurde, dass das petA-Gen wiederhergestellt wird, das Markergen entfernt wird und vorzugsweise ein oder mehrere interessierende Gene dabei gleichzeitig eingeführt werden. Das beschossene Gewebe kann unter Selektion auf Sucrose-reduziertem Medium (Antibiotikum-frei) im Starklicht regeneriert werden. Transformanten, die einen normalen grünen Phänotyp zeigen und in der Lage sind, fotoautotroph zu wachsen, können selektiert werden.
  • Ausführungsform 4: Verfahren zur Selektion von Plastidentransformanten, die auf der Inaktivierung und Reaktivierung des petA-Gens beruht, wobei die Inaktivierungs-Mutanten mittels eines neen Verfahrens selektiert werden
  • Dieses Verfahren kann bei alle Mutanten angewandt werden, die Fotosynthese-defekt sind. Vergleichbar zu Ausführungsform 3 kann die Selektion der Plastidentransformanten auf der Inaktivierung und Reaktivierung des petA-Gens beruhen. Allerdings kann die Selektion der ΔpetA-Mutanten auf einem Medium durchgeführt werden, das ein Herbizid enthält, welches für seine Wirkung aktive Fotosynthese benötigt, wie beispielsweise das Herbizid Paraquat. Jede vollständige Inaktivierung des petA-Gens kann im Vergleich zum Wild-Typ in der mutierten Pflanzenlinie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber einem solchen Herbizid führen. Als wichtige Konsequenz ergibt sich daraus, dass das Einführen von einem Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenzmarker während des ersten Transformationsschrittes vermieden werden kann.
  • Vektoren dieser Erfindung bieten die Möglichkeit, neuartige Funktionen während des ersten oder zweiten Transformationsschrittes einzuführen
  • Interessierende Gene oder Sequenzen können während des ersten oder während des zweiten Transformationsschrittes oder in beiden Schritten eingeführt werden. Deshalb können mehrere Gene oder funktionelle Operons in die Zielpflanze eingebracht werden. Unter anderem ist dies von hoher Bedeutung für die Erzeugung neuer metabolischer Wege in transplastomen Pflanzen, da dabei eine bedeutende Anzahl neuartiger Gene und/oder Regulationsfaktoren in das Plastom integriert werden müssen.
  • Ebenso können gewünschte Sequenzen eingebracht oder entfernt werden, beispielsweise um das Muster der plastidären Genexpression zu verändern.
  • Vektoren dieser Erfindung bieten die Möglichkeit, Selektionsmarker wiederzuverwenden
  • Eine weitere Anwendung der in dieser Erfindung beschriebenen zwei-Schritt-Strategie ist die Möglichkeit, den gleichen Selektionsmarker für eine weitere Transformation wiederzuverwenden, nachdem dieser beim zweiten Schritt aus dem Genom entfernt wurde. Danach kann dieser wieder entfernt werden und der Vorgang kann wiederholt werden. Dies bietet Möglichkeiten für die Insertion einer potenziell unbegrenzten Anzahl von Genen oder funktionellen Operons in das Plastidengenom unter Verwendung des gleichen Selektionsmarkers. Dies ist ein wichtiger Schritt, um den Mangel an Selektionsmarkern für die Plastiden-Gentransformation zu überwinden.
  • Vektoren dieser Erfindung bieten die Möglichkeit, interessierende Sequenzen an unabhängigen (Plastom-)Orten zu inserieren
  • Durch die Verwendung der unterschiedlichen Kombinationen der beschriebenen Verfahren (beispielsweise Ausführungsform 1, 2 und 3 unter Verwendung von jeweils rpoA, ycf3 und petA als Zielorte) können die interessierenden Gene in verschiedene Zielorte des Plastoms eingebracht werden. Die hier beschriebenen Verfahren werden auch unter Verwendung von Inaktivierung und Reaktivierung von anderen zur Fotosynthese in Beziehung stehenden Zielgenen funktionieren, wie z.B. psbA. Folglich gibt es zahlreiche potenzielle Zielorte. Unter Verwendung der homologen Rekombination können neuartige Funktionen auch an von den Markergenen unabhängigen Stellen eingeführt werden.
  • Vektoren dieser Erfindung bieten neuartige Selektionsverfahren
  • Das aadA-Gen ist der einzige Selektionsmarker, der routinemäßig eingesetzt wird (Heifetz, 2000), und das nptII-Gen, welches Resistenz gegen Kanamyzin vermittelt, ist die einzige Alternative, von der gezeigt wurde, dass sie bei der Plastidentransformation höherer Pflanzen funktioniert (Carrer et al., 1993). Die Vektoren dieser Erfindung überwinden den Mangel an selektierbaren Markergenen. Zu den hier beschriebenen neuen Selektions-Inhibitoren für die Plastidentransformation gehören Paraquat, Morphamquat, Diquat, Difenzoquat und Cyperquat. Diese Substanzen gehören zur Gruppe der "Fotosystem I-Akzeptor-Herbizide" (Hock & Elsner, 1995). Sie sind keine Inhibitoren von Fotosystem I, sondern werden von Fotosystem I anstelle von Ferredoxin und NADP reduziert. Die Autooxidation der reduzierten Inhibitoren erzeugt dann Sauerstoffradikale, die sehr toxisch sind. Die Toxizität dieser Herbizide hängt deshalb von Licht und Sauerstoff ab. Wenn der Elektronentransport durch Fotosystem I entweder durch die Deletion eines essentiellen Gens für Fotosystem I oder für den Cytochromb/f-Komplex (z.B. petA) unterbrochen wird, so sind diese mutierten Pflanzen resistenter gegen "Fotosystem I-Akzeptor-Herbizide" (wie z.B. Paraquat) als Wild-Typ Pflanzen. Solche Herbizide können deshalb geeignete Selektionsmittel für das Ausschalten ("knock out") dieser Gene sein. Jeder Albino wird gegenüber diesen Inhibitoren unempfindlich sein; deshalb könnte auf diese Weise auf jede Deaktivierung hin, die zu Fotosynthese-Defizienz führt, selektiert werden.
  • In einer Ausführungform dieser Erfindung kann Schritt (d) durch Inhibitorresistenz unterstützt werden. Inhibitorresistenz kann über stabile oder transiente Einführung einer Inhibitor- oder Antibiotikumresistenz in Schritt (c) erreicht werden. Vorzugsweise ist eine in Schritt (c) eingeführte Inhibitorresistenz transient, um die Generierung selektionsmarkerfreier transplastomischer Pflanzen als Endergebnis zu ermöglichen. Ein Inhibitorresistenzgen kann nach einem im Stand der Technik bekannten Verfahren entfernt werden, wie z.B. von Fischer et al. (1996) oder von Iamtham und Day (2000) beschrieben. Alternativ kann ein Inhibitor oder Antibiotikum in Schritt (d) lediglich anfänglich appliziert werden wie oben für Schritt (b) beschrieben. Das Fortlassen des Inhibitors in einem späteren Stadium erlaubt das Verlieren eines in Schritt (c) eingeführten Resistenzgens. Diese Ausführungsform macht sich die Regeneration eines erkennbaren Phänotyps in Schritten (c) und (d) gemäß der Erfindung zu Nutze, jedoch kann das Erzielen eines homoplastomischen Zustandes in Schritt (d) effizienter gestaltet werden.
  • BEISPIELE
  • Die Erfindung wird im folgenden durch den Verweis auf folgende detaillierte Beispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen nur zum Zweck der Illustration und sind nicht als Beschränkung gedacht, solange dies nicht anders angegeben ist. Standard Techniken für rekombinante DNA und molekulare Klonierung, die hierbei benutzt werden sind hinlänglich bekannt und werden bei Ausubel, 1999, Maniatis et al., 1989 und Silhavy et al., 1984 beschrieben.
  • Beispiel 1: Konstruktion eines Selektionssystems basierend auf der Inaktivierung des rpoB Gens
  • Konstruktion von Transformationsvektor pIC571 für die Inaktivierung des plastidär kodierten rpoB Gens
  • Blattmaterial von Tabakpflanzen wurde in Anwesendheit von flüssigem Stickstoff zermahlen und Gesamt-DNA (Nicotiana tabacum L. var. Petit havanna) mit Hilfe des Qiagen 'DNeasy Plant Mini Kit' isoliert.
  • Auf diese Weise isolierte genomische DNA kann als Templat zur Amplifikation der Plastom-Region 'rpoB-trnA7' mittels PCR verwendet werden. Dazu wurde das folgende Primer-Paar verwendet: p38 5'-AAG ATG AAC CTG TTC CCA TG-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 25967-25986; die Nukleotid-Positionen entsprechen der Gene Bank Accession Number Z00044.1) und p39 5'-CAC TTC TTC CCC ACA CTA CG-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 29616-29597). Für die PCR wurde die Taq-Polymerase (Sigma) verwendet und folgendes PCR Programm: 60 sec bei 95°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 60 sec bei 55°C, 240 sec bei 72°C, 32 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das PCR Produkt wurde mittels Gelelektrophorese analysiert. Eine einzige Bande der erwarteten Größe 3.65 kb wurde detektiert. Dieses Fragment wurde in den Vektor pCRII (Invitrogen) kloniert, der PCR rpoB01 bezeichnet wurde. Die korrekte Sequenz wurde mittels Sequenzierung bestimmt (Toplab; München).
  • Zur Inaktivierung des rpoB-Operons sollte die aadA Kassette als selektierbarer Marker die 5'-upstream Region und den Translationsstart des rpoB Gens, repräsentiert durch ein 699 bp AvaI Fragment (Plastom Sequenz 27508-28206), ersetzen. Als Vorraussetzung musste eine zusätzliche AvaI Restriktionsschnittstelle in der 'multiple cloning site' des Plasmids PCR rpoB01 entfernt werden. Dies wurde dadurch erreicht, dass das Plasmid mit XhoI geschnitten wurde, gefolgt von einer Auffüllreaktion unter Verwendung der Klenow Polymerase und Nukleotiden. Das lineare Fragment wurde religiert und in Bakterien transformiert. Das erhaltene Plasmid PCR rpoB ΔXhoI enthielt nur die beiden oben erwähnten AvaI Schnittstellen.
  • Das Plasmid PCR rpoB ΔXhoI wurde mit AvaI verdaut und das größere der beiden resultierenden Fragmente (6861 bp and 699 bp) aus einem Agarose Gel mit Hilfe des Qiagen 'gel extraction kit' gereinigt. Die 'stickt' ends' des 6861 bp Fragments wurden in 'blunt ends' (stumpfe Enden) mit Hilfe der Klenow Polymerase und Nukleotiden umgewandelt. Um Selbstligation zu verhindern, wurde das erhaltene DNA Fragment mit 'calf alkaline phosphatase' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) behandelt.
  • Schließlich wurde ein 1412bp SmaI-Fragment enthaltend die aadA Expressionskassette aus dem Vektor pUC16SaadA-Sma (Koog et al., 1996) in das 6861 bp AvaIFragment ligiert. Das Ligationsprodukt wurde in Bakterien transformiert. Plasmide resultierender Bakterienldone wurden analysiert, um die Anwesenheit und Orientierung des aadA Inserts zu bestimmen. 7 positive Klone zeigten eine Insertion der aadA Expressionskassette in sense-Leserichtung im Vergleich zum rpoB Gen. Dieses Plasmid wurde als pIC571 (pCR rpoB aadA-I) (1) bezeichnet. Größere Mengen an pCR rpoB aadA-I DNA wurden unter Verwendung des Qiagen 'plasmid maxiprep kit' isoliert.
  • Primärtransformation und Selektion homoplastomischer ΔrpoB Mutanten
  • PEG vermittelter transmembraner DNA Transfer in Protoplasten ist eine reproduzierbare Methode zur Transformation von Plastiden in höheren Pflanzen (Golds et al., 1993; O'Neill et al., 1993). Die Regeneration von Protoplasten wurde kürzlich optimiert, wie in Dovzhenko et al., 1998 beschrieben.
    • A. Protoplasten-Isolation: Blätter 3 Wochen alter Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. petit havanna) wurden in ca. 1 mm lange Streifen geschnitten und übernacht mit 0,25% Cellulase R10 und 0,25% Macerozyme R10 (Yakult, Honsha Japan) gelöst in F-PIN Medium inkubiert. Nach Filtrations-, Flotierungs- und Sedimentations-Standardprozedur (Koog et al., 1996) wurden die Protoplasten in Transformations Medium resuspendiert, die Gesamtmenge an Protoplasten bestimmt und die Dichte auf 5 × 106 Protoplasten pro ml eingestellt. F-PIN Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): KNO3 (1012 μg/ml), CaCl2·2H2O (440 μg/ml), MgSO4·7H2O (370 μg/ml), KH2PO4 (170 μg/ml), NH4-Succinat (10 ml of 2 M Stammlösung), EDTA-Fe(III)·Na-Salz (40 μg/ml), KJ (0,75 μg/ml), H3BO3 (3 μg/ml), MnSO4·H2O (10 μg/ml), ZnSO4·7H2O (2 μg/ml), Na2MoO4·2H2O (0,25 μg/ml), CuSO4·5H2O (0,025 μg/ml), CoCl2·6H2O (0,025 μg/ml), Inositol (200 μg/ml), Pyridoxin-HCl (2 μg/ml), Thiamin-HCl (1 μg/ml), Biotin (0,02 μg/ml), Nicotinsäure (2 μg/ml), BAP (1 μg/ml), NAA (0,1 μg/ml), Polypuffer 74 (10 ml), Saccharose (~130 000 μg/ml). Transformations Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): MgCl2·6H2O (3050 μg/ml), MES (1000 μg/ml), Mannit (~80000 μg/ml).
    • B. Plastidentransformation und Protoplasten-Einbettung: 50 μg DNA (Transformationsvektor pIC571), 7 μl F-PCN, und 100 μl (500.000 Zellen) Protoplasten-Suspension wurden zu 125 μl 40% PEG Lösung zugegeben, vorsichtig vermischt und für 7.5 min. inkubiert. Dann wurden 125 μl of F-PCN zugegeben, gemischt und für 2 min inkubiert. Nachdem das Volumen auf 3 ml mit F-PCN aufgefüllt wurde, wurden 3 ml F-Alginat Medium zugegeben. Die Alginat-inbettung in dünne Schichten erfolgt durch das Huftropfen der Protoplasten-Alginat Mischung auf Polypropylen-Netze, die auf der Oberfläche von Ca2+ Medium Platten liegen. Nach Erstarrung des Alginats wurden die Netze vom Ca2+ Medium entfernt, zum Equilibrieren umgedreht in flüssiges F-PCN Medium gelegt (2 × 10 ml, je 30 min) und dann in neue Petrischalen mit 2 ml F-PCN Medium transferiert. Die eingebetteten Protoplasten wurden für die ersten 20 Stunden in Dunkelheit inkubiert, gefolgt vom gewöhnlichen 16 h Tag/8 h Nacht Rhythmus. F-PCN Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): KNO3 (1012 μg/ml), CaCl2·2H2O (440 μg/ml), MgSO4·7H2O (370 μg/ml), KH2PO4 (170 μg/ml), NH4-Succinat (10 ml of 2 M Stammlösung), EDTA-Fe(III)·Na-Salz (40 μg/ml), KJ (0,75 μg/ml), H3BO3 (3 μg/ml), MnSO4·H2O (10 μg/ml), ZnSO4·7H2O (2 μg/ml), Na2MoO4·2H2O (0,25 μg/ml), CuSO4·5H2O (0,025 μg/ml), CoCl2·6H2O (0,025 μg/ml), Inositol (200 μg/ml), Pyridoxin-HCl (2 μg/ml), Thiamin-HCl (1 μg/ml), Biotin (0,02 μg/ml), Nicotinsäure (2 μg/ml), BAP (1 μg/ml), NAA (0,1 μg/ml), Polypuffer 74 (10 ml), Saccharose (~20 000 μg/ml), Glucose (65 000 μg/ml). F-Alginat Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): MES (1370 μg/ml), MgSO4·7H2O (2500 μg/ml), MgCl2·6H2O (2040 μg/ml), Mannit (~77000 μg/ml), Alginat (24000 μg/ml). Ca2 +-Medium (pH 5,8 (KOH), Osmolarität: 550 mOsm): MES (1950 μg/ml), CaCl2·2H2O (2940 μg/ml), Mannit (~82000 μg/ml), Agar, gereinigt (10000 μg/ml).
  • Eine Woche nach der Einbettung der transformierten Protoplasten wurden die Netze auf RMOP Festmedium mit je 500 μg/ml Spectinomycin und Streptomycin übertragen (siehe Bespiel 3). Alle 3 Wochen wurden dann im folgenden die Netze auf frisches Medium transferiert bis keine weiteren grünen Regenerste erschienen. Erste grüne Regenerste erscheinen nach etwa 5 Wochen und wurden dann einzeln in Petrischalen gesetzt. Wie erwartet zeigten erste ΔrpoB Transformanten Spectinomycin-Resistenz und einen grünen Phänotyp unter Normallicht Bedingungen, waren jedoch noch heteroplastomisch. Um transformierte plastidäre DNA Moleküle zu vermehren und Wildtyp Genome zu eliminieren, wurden transformierte Linien auf RMOP Medium ohne Inhibitoren transferiert. Nach 3 bis 5 Wochen zeigten sich weiße Sektoren. Material von diesen weißen Sektoren wurde weiter auf nicht-selektivem Medium für 5 Regenerations-Zyklen kultiviert, um homoplastomische mutierte Transformariten zu erhalten. Die dabei heranwachsenden Linien zeigten einen weißen Phänotyp. Diese transplastomischen Linien wurden zum Wurzeln auf VBW Medium (fest) transferiert, um mutiertes Pflanzenmaterial für die zweite Transformation heranzuziehen.
  • Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blotting
  • Blattmaterial von ΔrpoB transplastomischen Pflanzen wurde in Anwesendheit von flüssigem Stickstoff zermahlen, und Gesamt-DNA (Nicotiana tabacum L. var. Petit havanna) mit Hilfe des Qiagen 'DNeasy Plant Mini Kit' isoliert.
  • Plastidäre Transformanten wurden mit Hilfe von PCR analysiert. Gesamt DNA wurde von verschiedenen Linien transplastomischer Pflanzen isoliert und als Template für separate PCR-Reaktionen eingesetzt. Dabei wurden 2 Sets von Primern eingesetzt: oFCH59 5'-TGCTGGCCG TACATTTGTACG-3' (von der 5' Region der aadA kodierenden Sequenz abgeleitet) und oFCH60 5'-CACTACATTTCGCTCATCGCC-3' (abgeleitet von der 3' Region der aadA kodierenden Sequenz), um die Anwesendheit des aadA Gens zu detektieren. Die Primer oFCH60 und p42 5'-ATTTGTAGTAGAAGGTAATTGC-3' (entspricht im Tabak Plastom der Sequenz 29081-29102) wurden verwendet, um eine korrekte Integration ins Plastom nachzuweisen. p42 5'-ATT TGT AGT AGA AGG TAA TTG C-3' (bindet an Plastomnukleotide 29081-29102) und oFCH60 wurden verwendet, um eine korrekte Integration des aadA-Gens zu detektieren.
  • Ein weiterer Nachweis der korrekten Integration ins Plastom und des homoplastomischen Genotyps wurde durch DNA Gel Blot Analysen durchgeführt. Für DNA-Gel-Blot-Analysen wurde genomische DNA von steril angezogenen Pflanzen verwendet. Im Detail wurde wie folgt vorgegangen: 3 μg Gesamt-DNA pro zu analysierender Pflanze wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonden in DIG Easy Hyb Buffer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert, und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 75 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert. Als Hybridisierungssonde wurde ein 398 bp SmaI/HindIII Fragment verwendet, welches aus dem Vektor pCR rpoB01 herausgeschnitten, über Gelelektrophorese gereinigt und mit Hilfe des DIG 'probe labeling kit' (Roche) markiert wurde.
  • Konstruktion des Transformationsvektors pIC554 zur Rekonstitution des rpoB Gens
  • Als Nachweis des Prinzips (proof of principle) dieses Selektionssystems wurde ein Transformationsvektor konstruiert, der die Deletion des rpoB Gens wiederherstellt und gleichzeitig eine neue Marker Restriktionsschnittstelle einbringt. Diese zusätzliche Schnittstelle dient der Unterscheidung zwischen rekombinanten Plastomfragmenten in der betreffenden Plastomregion und potenziellen Resten an Wildtyp Plastom-Kopien (für den Fall, dass die mutanten Linien noch nicht komplett homoplastomisch sind).
  • Das Plasmid pIC571 (pCR rpoB01) wurde mit XmaI verdaut, und die Enden dieses linearen Fragments wurden mit Hilfe der Klenow Polymerase und Nukleotiden in 'blunt ends' umgewandelt. Dieses Fragment wurde religiert und in Bakterien transformiert. Plasmid DNA bakterieller Klone wurde isoliert und auf die Abwesendheit der SmaI Restriktionsschnittstelle hin untersucht. DNA des Plasmids pIC554 (pCR rpoB01-ΔSmaI; 2) wurde isoliert und für die Plastiden Transformation eingesetzt.
  • Die SmaI Restriktionsschnittstelle von Vektor pIC571 erlaubt einfache Einschritt-Klonierungen jedes Fremd-Gens zum Zweck der Expression in Plastiden.
  • Plastidentransformation von ΔrpoB Mutanten und Selektion homoplastomischer Linien
  • Das Ziel der zweiten Transformation ist es, die regulatorische Region des rpoB Gens funktionstüchtig wiederherzustellen (inklusive Translationsstart), die aadA Kassette zu entfernen und gleichzeitig eine neue Marker Restriktionsschnittstelle einzubringen. Junge Blätter steriler homoplastomischer ΔrpoB Mutanten herangewachsen auf VBW Medium wurden mit mit Plasmid pIC554 beladenen Goldpartikeln beschossen ('particle gun', Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm) und diese auf festes RMOP Medium mit reduziertem Zucker (3 g Saccharose/Liter) transferiert. Nach zwei Wochen wurden die Blattstückchen erneut geschnitten und auf neues Medium transferiert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3-wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert bis keine weiteren Regenerate erschienen. Transformanten, die einen grünen Phänotyp zeigten und sind in der Lage waren, fotoautotroph zu wachsen, wurden selektiert und mehreren weitern Regenerationszyklen auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker durchgeführt, um homoplastomisches Gewebe zu erhalten. Homoplastomische Linien wurden zur Wurzelbildung auf B5 Medium transferiert.
  • Molekulare Analyse der Transformanten der zweiten Transformation
  • Gesamt-DNA von steril herangewachsenen Pflanzen der zweiten Transformation wurden für die DNA Gel Blot Analyse eingesetzt.
  • Dabei wurde wie folgt vorgegangen: 3 μg Gesamt-DNA pro zu analysierender Pflanze wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SmaI gleichzeitig verdaut und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit Digoxigenin-markierten Sonden in DIG Easy Hyb Buffer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert, und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 75 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert. Als Hybridisierungssonde wurde ein 398 bp großes SmaI/HindIII Fragment verwendet, welches aus dem Plasmid pCR rpoB01 herausgeschnitten, über Gelelektrophorese gereinigt und mit Hilfe des DIG 'probe labeling kit' (Roche) markiert wurde. Diese Sonde sollte bei zweifach transformierten Plastomen ein 3629 bp großes Signal ergeben. Dies wäre der klare Nachweis, dass das rekombinante Fragment des Transformationsvektors in das Plastom integriert wurde. Das entsprechende Wildtyp Fragment hingegen besitzt eine Größe von nur 1628 bp. Eine Hybridisierungsbande bei 3629 bp zeigt ebenfalls an, dass die aadA Marker Kassette entfernt wurde.
  • Um die Entfernung der aadA Marker Kassette zu zeigen, wurde ein zweiter Blot gemacht (wobei nach der ersten Hybridisierung der Blot gestrippt wurde), bei dem ein 480 bp Fragment des aadA Gens als Sonde verwendet wurde. Zur Herstellung der Sonde wurden die Primer oFCH59 und oFCH60 (siehe oben) in einer PCR Dig-Markierungsreaktion gemäß Herstellerprotokoll (Roche) verwendet.
  • Beispiel 2: Konstruktion eines Selektionssystems basierend auf der Inaktivierung des rpoA Gens
  • Konstruktion von Transformationsvektor pGEM-rpoA-del für die Inaktivierung des rpoA Gens Die Region des Tabak Chloroplasten Genoms (entsprechend den Plastom Nukleotiden 79401-82470), die auch die rpoA kodierende Sequenz enthält, wurde per PCR amplifiziert, wobei genomische DNA isoliert aus Tabak-Blattgewebe als Templat eingesetzt wurde und die Taq-Polymerase (Qiagen) verwendet wurde. Dabei wurde das folgende Primerpaar eingesetzt: p78 5'-SphI-TTAGTAACAAGCAAACCTTG-3' (bindet zu den Plastom Nukleotiden 79401-79420), und p77 5'-SmaI-TAATTACTGAATCGCTTCCCA-3' (bindet zu den Plastom Nukleotiden 82470-82450).
  • Folgendes PCR Programm wurde verwendet: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 2 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das entstandene PCR Fragment wurde in den pGEM-T Vector (Promega) ligiert. Im folgenden wurde die gesamte kodierende Sequenz des rpoA Gens (entsprechend den Plastom Nukleotiden 80455-81468) herausgeschnitten mittels DraI/ScaI Verdau. Das chimäre aadA Gen wurde als SmaI Fragment aus dem Vektor pUC16SaadA (detaillierte Beschreibug siehe Koop et al., 1996) ausgeschnitten und anstelle des rpoA Gens integriert. Das aadA Gen kann dann als Marker für die Selektion von plastidären Transformanten verwendet werden. Ein Klon, der das aadA Gen in entgegengesetzter Richtung wie das rpoA Gen integriert hat, ergab Transformationsvektor pGEM-rpoA-del (3). Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung (MWG, München) bestätigt.
  • Erste Transformation und Selektion homoplastomischer ΔrpoA Mutanten
  • Junge Blätter steril angezogener Tabakpflanzen (Kultivierung siehe Beispiel 1) wurden mit mit Plasmid pGEM-rpoA-del beladenen Goldpartikeln beschossen unter Verwendung der 'particle gun' (Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die beschossenen Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm) und diese auf festes RMOP Medium mit 500 μg/ml Spectinomycin transferiert. Nach zwei Wochen wurden die Blattstückchen erneut geschnitten und auf neues Medium transferiert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3-wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert bis keine weiteren Regenerate erschienen. Erste ΔrpoA Transformanten zeigten einen Spectinomycin-resistenten, grünen Phänotyp unter Normallicht Bedingungen, waren jedoch noch heteroplastomisch. Um einen homoplastomischen Zustand zu erreichen und um transformierte plastidäre DNA-Moleküle zu amplifizieren, wurden die Transformanten 3 weiteren Regenerations-Zyklen auf RMOP ausgesetzt. Segregation an Blättern führt zu weißen und grünen Sektoren. Blattmaterial von weißen Sektoren wurde für weitere Regenerations-Zyklen auf nicht-selektivem RMOP Medium eingesetzt, um homoplastomische mutierte Transformanten zu erhalten. Homoplastomische transformierte Linien wurden zur Wurzelbildung und Vermehrung auf VBW Medium transferiert (Aviv und Galun, 1985; siehe Beispiel 1).
  • Analyse potenzieller Transformanten mittels Southern Blot
  • Gesamt-DNA von steril herangewachsenen transplastomischen Linien wurde für die DNA-Gel-Blot-Analyse eingesetzt.
  • Dabei wurde wie folgt vorgegangen: 3 μg Gesamt-DNA pro zu analysierender Pflanze wurde mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit Digoxigenin markierten Sonden in DIG 'Easy Hyb Buffer' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 75 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert.
  • Als Hybridisierungssonde wurde ein geeignetes DNA Fragment verwendet, mit Hilfe dessen man zwischen Wildtyp und transformierten Plastomen unterscheiden kann. Diese Sonde wurde mittels QIAquick 'Gel Extraction Kit' (QIAgen, Hilden, Germany) gereinigt, Digoxigenin markiert (Roche 'DIG DNA Labelling Kit') und für die Hybridisierung eingesetzt.
  • Konstruktion des Transformationsvektors zur Rekonstitution des rpoA Gens
  • Zur Demonstration des beschriebenen Selektionssystems, mit Hilfe dessen jedes interessierende Gen ins Plastom integriert werden kann, wurde ein Transformationsvektor konstruiert, mit Hilfe dessen die Deletion der rpoA kodierenden Sequenz aufgehoben wird und gleichzeitig das GUS Gen als neuer Marker integriert wird.
  • Dieser Vektor enthält die rpoA kodierenden Sequenz und das GUS Gen, flankiert von den 5'- und 3'-homologen Sequenzen, die aus dem Tabakplastom per PCR amplifiziert wurden. Dafür wurden die folgenden Primer eingesetzt: oFCH112 5'-NcoI-TACTATTAT TTGATTAGATC-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 81471-81490), oFCH113 5'-SmaI-TAA TTACTGAATCGCTTCCCA-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 82470-82450), und oFCH114 5'-SphI-TTAGTAACAAGCAAACCTTG-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 79401-79420), oFCH137 5'-PstI-ATCACTAGTTGTAGGGAGGGATCCATGGTTCGA GAGAAAGTAAC-3' (bindet zu Plastom Nukleotiden 81468-81449). Das amplifizierte 5' homologe Fragment (Plastome Nukleotiden 81471-82470) enhält 1000 Nukleotide stromaufwärts zum rpoA Startcodons. Das amplifizierte 3' homologe Fragment (Plastom Nukleotide 79401-81468) enthält die ribosomale Bindestelle (RBS), die kodierende Region des rpoA Gens und 1054 Nukleotide stromabwärts zum rpoA Stopcodon. Die beiden 5'/3' homologen Fragmente wurden in das Plasmid pUC16SRBSuidA3'rbcL (Koog et al., 1996) subkloniert, wodurch Transformationsvektor pIC598 erhalten wurde (4). Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung (MWG, München) bestätigt.
  • Plastidentransformation von ΔrpoA Mutanten und Selektion homoplastomischer Linien
  • Das Ziel der zweiten Transformation ist es, die rpoA kodierende Sequenz funktionstüchtig wiederherzustellen, die aadA Kassette zu entfernen und gleichzeitig das GUS Gen als neuen Marker einzubringen. Junge Blätter steriler homoplastomischer ΔrpoA Mutanten herangewachsen auf VBW Medium wurden mit mit Plasmid pIC598 beladenen Goldpartikeln beschossen ('particle gun', Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm) und diese auf festes RMOP Medium mit reduziertem Zucker (3 g Saccharose/Liter) transferiert. Nach drei Wochen wurden die Blattstückchen erneut geschnitten und auf neues Medium transferiert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3-wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert bis keine weiteren Regenerate erschienen. Transformanten, die einen grünen Phänotyp zeigten und fotoautotroph wuchsen, wurden selektiert und mehrere weiteren Regenerations-Zyklen auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker unterzogen, um homoplastomisches Gewebe zu erreichen. Homoplastomische transplastomische Linien wurden zur Wurzelbildung und Vermehrung auf B5 Medium transferiert.
  • Analyse der Transformanten mittels Southern Blotting
  • 3 μg Gesamt-DNA pro zu analysierender Linie wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und auf einem TAB Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG 'Easy Hyb Buffer' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 75 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert. Als Hybridisierungssonde wurde ein geeignetes DNA Fragment verwendet, mit Hilfe dessen man zwischen Wildtyp und transformierten Plastomen unterscheiden kann. Diese Sonde wurde mittels QIAquick 'Gel Extraction Kit' (QIAgen, Hilden, Germany) gereinigt, mit Digoxigenin markiert (Roche 'DIG DNA Labelling Kit') und konnte so für die Hybridisierung eingesetzt werden.
  • Beispiel 3: Konstruktion eines weiß/grün-Selektionssystems basierend auf der Inaktivierung des ycf3 Gens
  • Konstruktion von Transformationsvektor pIC553, zur gezielten Inaktivierung des ycf3 Gens Die Region des Tabak-Chloroplasten-Genoms, die den ycf3 Leserahmen enthält, wurde per PCR amplifiziert, wobei genomische DNA isoliert aus Tabakblattgewebe als Templat und die Taq-Polymerase (Qiagen) eingesetzt wurden. Dabei wurde das folgende Primerpaar eingesetzt: oFCH63 (5'-GAAGTTTCTTTCTTTGCTACAGC-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 45033-45053) und oFCH64 (5'-GAATTACCAAACCATTTGACCC-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 47667-47647).
  • Folgendes PCR Programm wurde verwendet: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 2 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 mm. Das amplifizierte Fragment wurde in den pGEM-T Vector (Promega) ligiert, wodurch Plasmid pIC517 erhalten wurde. Das erste Exon und die 5' regulatorischen Elemente von ycf3 wurden durch BbrPI/Bst1107I Verdau herausgeschnitten. Bst11071 schneidet 373 bp stromaufwärts des ycf3 Startcodons (Nukleotid Position 46266). Die BbrPI Restriktionsschnittstelle ist in Intron 1 von ycf3 lokalisiert (nahe des Endes des ersten Exons). Das chimäre aadA Gen wurde als SmaI Fragment aus dem Vektor pUC16SaadA (detaillierte Beschreibug siehe Koop et al., 1996) ausgeschnitten und anstelle von ycf3 Gens integriert. Das aadA Gen kann dann Marker für die Selektion von plastidären Transformanten verwendet werden. Ein Klon, der das aadA Gen in entgegengesetzter Richtung wie das ycf3 Gen integriert hat, kann als Transformationsvektor pIC553 (5) verwendet werden. Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung (MWG, München) bestätigt.
  • Elektrotransformation von E. coli Zellen
  • Herstellung elektrokompetenter Zellen: 1 liter LB-Medium (1% (G/V) Casein Hydrolysat, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 0,5% (G/V) NaCl) wird 1:100 mit einer frischen Übernacht-Kultur von E. coli JM109 Zellen (Promega, Madison, WI, USA) angeimpft. Die Zellen werden bei 37°C unter Schütteln bei 220 U/min bis zu einer optischen Dichte von 0,5 bei 600 nm wachsen gelassen. Die Zellen werden für 20 Min. auf Eis gekühlt und 15 Min zentrifugiert (4000 upm, 4°C). Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird in 1 L eiskaltem, sterilem 10% (V/V) Glycerin resuspendiert. Die Zellen werden zweimal wie oben beschrieben zentrifugiert und das Pellet wird in 2 ml eiskaltem, sterilem 10% (V/V) Glycerin resuspendiert. Diese Suspension wird in Aliquots von 80 μl eingefroren und bei –80°C gelagert.
  • Elektrotransformation unter Benutzung des Bio-Rad (Hercules, CA, USA) "Micro Pulser Elektroporators": Die elektrokompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut. 40 μl der Zellsuspension werden mit 2 μl der Ligationsmischung vermischt und in eine sterile, gekühlte 0,2 cm Küvette (Bio-Rad) übertragen. Die Suspension wird auf den Boden geschüttelt und die Küvette in den Küvetten Schlitten gestellt. Der Küvetten Schlitten wird in die Kammer geschoben und die Zellen werden bei 2,5 kV gepulst. Die Küvette wird aus der Kammer entnommen und die Zellen werden in 1 ml SOC-Medium (2% (G/V) Casein Hydrolysat, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 10 mMNaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM Glukose) suspendiert. Die Suspension wird für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt und 100 μl der Suspension werden auf LB-Platten, die 150 mg/l Ampicillin enthalten ausplattiert.
  • Erste Transformation und Selektion homoplastomischer Δycf3 Mutanten
  • Tabaksamen (Nicotiana tabacum cv. petit havanna) werden oberflächensterilisiert (1 Min in 70% Ethanol, 10 Min in 5% Dimanin C, Bayer, Leverkusen, Deutschland), 3 mal für 10 Min. in sterilem H2O gewaschen und auf B5 Medium (siehe unten) ausgebracht. Pflanzen werden bei 25°C in einem 16 h Tag/8 h Nacht Zyklus angezogen (0.5-1 W/m2, Osram L85W/25 Universal-White Fluoreszenz Lampen).
  • 6 Blätter von 4 Wochen alten, steril angezogenen Nicotiana tabacum Pflanzen werden geschnitten und auf RMOP Medium (Herstellung siehe unten) ausgebracht. 35 μl einer Goldsuspension (0.6 Mikron, Biorad, München; 60 mg/ml Ethanol) werden in ein steriles Eppendorf Cup (Treff, Fisher Scientific, Ingolstadt, Deutschland) überführt, durch Zentrifugation gesammelt und mit 1 ml sterilem H2O gewaschen. Das Goldpellet wird in 230 μl sterilem H2O and 250 μl 2.5 M CaCl2 resuspendiert und 25 μg DNA (Transformationsvektor pIC553) wird zugegeben. Nach sorgfältiger Resuspendierung der Mischung werden 50 μl 0.1 M Spermidin zugegeben, gemischt und 10 Min. auf Eis inkubiert. Dann wird die Goldsuspension durch Zentrifugation (1 Min., 10000 upm) gesammelt und zweimal mit 600 μl Ethanol (100%, p.A.) gewaschen. Das Gold wird durch Zentrifugation (1 Min., 10000 upm) gesammelt und abschließend in 72 μl Ethanol (100%, p.A.) resuspendiert. Ein Macrocarrier wird in den Macrocarrier-Halter eingesetzt und 5,4 μl der Goldsuspension werden aufgebracht. Der Beschuss wird mit einem Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He Biolistic particle delivery system unter folgenden Parametern durchgeführt:
    • – Berstscheibe 900 psi
    • – Heliumdruck 1100 psi
    • – Vakuum 26-27 inches Hg
    • – Macrocarrier auf oberstem Einschub
    • – Blattstück auf drittem Einschub
  • 6 Blattstücke werden mit jeweils 5,4 μl Goldsuspension beschossen. Nach dem Beschuss werden die Blattstücke für 2 Tage bei 25°C auf RMOP Medium inkubiert.
  • Zwei Tage nach dem Beschuss werden die Blattstücke in kleine Teile (ca. 3 × 3 mm) geschnitten und auf festes RMOP Medium, das 500 μg/ml Spectinomycin enthält, übertragen. Nach zwei Wochen werden die Blattstücke nochmals geschnitten, dann alle 3 Wochen bis keine weiteren Regenerate mehr erscheinen. Erste Δycf3 Transformanten zeigten einen Spectinomycin-resistenten, grünen Phänotyp unter Normallicht Bedingungen, waren jedoch noch heteroplastomsich. Um transformierte plastidäre DNA-Moleküle zur verstärken und Wildtypgenome zu eliminieren, wurden die Transformanten 3 weiteren Regenerationszyklen auf RMOP ausgesetzt. Segregation an Blättern führt zu weißen und grünen Sektoren. Blattmaterial von weißen Sektoren wurde für weitere Regenerationszyklen auf nicht-selektivem RMOP Medium eingesetzt, um den homoplastomischen Zustand zu erreichen. Homoplastomische transformierte Linien wurden zur Wurzelbildung auf VBW Medium transferiert (Aviv und Galun, 1985; siehe Beispiel 1) und unter Schwachlicht Bedingungen gehalten, um den typischen Δycf3 Mutanten Phänotyp sichtbar zu machen (schwach grüne Blätter).
    RMOP (pH 5,8 mit KOH): NH4NO3 (1650 μg/ml), KNO3 (1900 μg/ml), CaCl2 × 2H2O (440 μg/ml), MgSO4 × 7H2O (370 μg/ml), KH2PO4 (170 μg/ml), EDTA-Fe(III)Na-Salz (40 μg/ml), KI (0,83 μg/ml), H3BO3 (6,2 μg/ml), MnSO4 × H2O (22,3 μg/ml), ZnSO4 × 7H2O (8,6 μg/ml), Na2MoO4 × 2H2O (0,25 μg/ml), CuSO4 × 5H2O (0,025 μg/ml), CoCl2 × 6H2O (0,025 μg/ml), Inositol (100 μg/ml), Thiamin-HCl (1 μg/ml), Benzylaminopurin (1 μg/ml), Naphthalinessigsäure (0,1 μg/ml), Saccharose (30000 μg/ml), Agar, gereinigt (8000 μg/ml).
    B5 (pH 5,7 mit KOH): KNO3 (2500 μg/ml), CaCl2 × 2H2O (150 μg/ml), MgSO4 × 7H2O (250 μg/ml), NaH2PO4 × H2O (150 μg/ml), (NH4)2SO4 (134 μg/ml), EDTA-Fe(III)Na (40 μg/ml), KI (0,75 μg/ml), H3BO3 (3 μg/ml), MnSO4 × H2O (10 μg/ml), ZnSO4 × 7H2O (2 μg/ml), Na2MoO4 × 2H2O (0.25 μg/ml), CuSO4 × 5H2O (0,025 μg/ml), CoCl2 × 6H2O (0,025 μg/ml), Inositol (100 μg/ml), Pyridoxin-HCl (1 μg/ml), Thiamin-HCl (10 μg/ml), Nikotinsäure (1 mg/ml), Saccharose (20000 μg/ml), Agar, gereinigt (7000 μg/ml).
    VBW (pH 5,8 mit KOH): NH4NO3 (1650 μg/ml), KNO3 1900 (μg/ml), CaCl2 × 2H2O (440 μg/ml), MgSO4 × 7H2O (370 μg/ml), KH2PO4 (170 μg/ml), EDTA-Fe(III)Na (40 μg/ml), KI (0,83 μg/ml), H3BO3 (6,2 μg/ml), MnSO4 × H2O (22.3 μg/ml), ZnSO4 × 7H2O (8,6 μg/ml), Na2MoO4 × 2H2O (0,25 μg/ml), CuSO4 × 5H2O (0,025 mg/ml), CoCl2 × 6H2O (0,025 μg/ml), Inositol (100 μg/ml), Pyridoxin-HCl (0.5 μg/ml), Thiamin-HCl (1 μg/ml), Glycin (2 μg/ml), Nicotinsäure (0,5 μg/ml), Indolylessigsäure (2 μg/ml), Kinetin (01 μg/ml), Saccharose (30000 μg/ml), Casein Hydrolysat (500 μg/ml), Agar, gereinigt (7000 μg/ml).
  • Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot
  • Plastidentransformanten wurden mit Hilfe der PCR Methode identifiziert. Gesamt DNA isoliert von 40 unabhängigen Regeneraten wurde dabei als Template für separate PCR Reaktionen eingesetzt. Die Methode der DNA Isolation war wie folgt: 100 mg frisches Tabak-Blattmaterial wurde zerkleinert (2 × 1 min bei 25 Hz) in 200 μl AP1 Puffer (DNeasy plant mini kit, QIAGEN)/1 μl Reagens DX (Antischaum, QIAGEN) unter Verwendung des 'mixer mill MM 300' (Retsch) in 1.5 ml Eppendorf Cups tube mit einem 3 mm Wolframcarbidpartikel (tungsten carbide bead). DNa wurde dann mit dem DNeasy plant mini kit gereinigt. 5 Primerpaare (Sequenzen siehe Tabelle 1) wurde verwendet: oFCH59/oFCH60; oFCH52/oFCH53; oFCH52/oFCH60; oFCH53/oFCH59; oFCH60/oFCH27 wurden für die Analyse transplastomer Pflanzen eingesetzt. Primerpaar oFCH52/oFCH53 sollte ein Amplifikationsprodukt von 900 bp im Fall von Wildtyp Plastom liefern und ein Produkt von 1700 bp im Fall von transformiertem Plastom. Primerpaar oFCH59/oFCH60 sollte ein Amplifikationsprodukt von 480 bp liefern, wenn die Pflanze transformiert ist und kein Produkt bei wldtyp-Pflanzen. Ebenfalls sollten die Primerpaare oFCH52/oFCH60 und oFCH53/oFCH59 nur Amplifikationsprodukte (867 bp bzw. 1368 bp) im Fall von transformierten Pflanzen liefern. Mit Hilfe der Primerkombination oFCH60/oFCH27 kann die korrekte Integration ins Plastom nachgewiesen werden, wenn das Amplifikationsprodukt 2541 bp beträgt. Tabelle 1
    Primer Sequenzen Plastom-Bindestelle
    oFCH59 5'-TGC TGG CCG TAC ATT TGT ACG-3' 5' Bereich der aadA Kodierungssequenz;
    oFCH60 5'-CAC TAC ATT TCG CTC ATC GCC-3' 3' Bereich der aadA Kodierungssequenz;
    oFCH52 5'-CAC TAC ATT TCG CTC ATC GCC-3' bindet an Plastomnukleotide 45903-45922, lokalisiert im klonierten DNA Fragment;
    oFCH53 5'-GAC TAT AGT TAA TGG ATA CTC-3' bindet an Plastomnukleotide 46812-46792, lokalisiert im klonierten DNA Fragment;
    oFCH27 5'-TGC TCA AGA CTT TAG TGG ATC-3' bindet an Plastomnukleotide 44799-44819, lokalisiert im Plastom außerhalb der klonierten Fragmente
  • Die PCR Ergebnisse zeigten 24 Transformantenlinien mit korrektern Integration des aadA Gens ins Plastom, wobei der Zustand im ersten Regenerationszyklus noch heteroplastomisch war. Diese Resultate zeigten sich auch in der phänotypischen Erscheinung bestätigt, die einen Pigmentmangel aufwies, der mit der Deletion des ycf3 Gens korrelierte.
  • Homoplasmie konnte mittels Southern Blot verifiziert: Genomische DNA von jungen Blättern von Pflanzen des vierten Regenerationszyklus, die unter Schwachlichtbedingungen herangezogen waren, wurde für die DNA Gel Blot Analyse eingesetzt. Dabei wurde wie folgt vorgegangen: 3 μg Gesamt-DNA pro zu analysierender Pflanze wurden mit Restriktionsenzym Xma JI geschnitten und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG 'Easy Hyb Buffer' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert, und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für 80 Minuten auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert.
  • Für die Herstellung der DIG markierten Hybridisierungssonde wurde Plasmid pIC522 (siehe unten) als Template für die Amplifikation eines 520 bp Fragments, wobei folgende Primer eingesetzt wurden: oFCH69 (5'-CATTGGAACTGCTATGTAGGC-3', entsprechend Plastom-Nukleotiden 47149-47169) und oFCH64 (5'-GAATTACCAAACCATTTGACCC-3', entsprechend Plastomnukleotiden 47667-47647). Für diese PCR wurde das 'PCR DIG Probe Synthesis Kit' von Roche verwendet. Das eingesetzte PCR Programm war wie folgt: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 55°C, 1 min bei 72°C, 35 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte Fragment wurde mittels QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen, Hilden, Germany) gereinigt und wurde so für die Hybridisierung eingesetzt. Ein Hybridisierungssignal bei 2998 bp zeigt transformierte Plastome an, ein Signal bei 2198 bp zeigt WildtypPlastome an. Das Resultat des Southern Blots zeigte keine Wildtyp-Banden in allen 10 getesteten mutanten Linien.
  • Konstruktion des Transformationsvektors pIC526 zur Rekonstitution des ycf3 Gens
  • Transformationsvektor pIC526 wurde für die Transformation von mutanten Δycf3 Linien mit dem Ziel hergestellt, das ycf3 Gen zu rekonstituieren und gleichzeitig die aadA Kassette zu entfernen und das GFP Gen ins Plastom zu inserieren.
  • Die Region des Tabak Chloroplasten Genoms, die das erste Exon und die 5' regulatorischen Elemente des ycf3 Gens (571 bp) enthält, wurde von genomischer DNA, die aus Tabak-Blattgewebe isoliert wurde, per PCR amplifiziert. Dafür wurde das folgende Oligonukleotidpaar als Primer verwendet: oFCH48 5'-SmaI-DraI-KpnI-GTGTTTTTCTCCTCGTAAGAC-3' (bindet zu Plastomnuldeotide 46070-46090) und oFCH49 5'-SmaI-BamHI-BbrPI-NheI-CCGTTA TGTACACAAAATTG-3' (bindet zu Plastomnukleotide 46637-46618). Das eingesetzte PCR Programm war wie folgt: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 55°C, 1 min bei 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte Fragment wurde mit SmaI verdaut und in das Plasmid pIC517 (Konstruktion siehe oben) kloniert, das mit BbrPI und Bst1107I verdaut wurde. Ein Klon mit dem Plasmid, das das erste Exon und die 5' regulatorischen Elemente des ycf3 Gens in der korrekten Orientierung enthält, wurde als pIC522 bezeichnet. Dieser Klon enthält ein plastidäres DNA Fragment mit 5 zusätzlichen Restriktionsschnittstellen.
  • Die kodierende Sequenz des GFP Gens wurde von Plasmid pKCZ-GFP (6) per PCR amplifiziert, wobei folgende PCR-Primer verwendet wurden: oFCH25 (5'-CTAGCT AGCTTATTTGTATAGTTCATCCAT-3' und oFCH26 (5'-TCCCCCGGGGCCGTCGTT CAATGAGAATGG-3'). Das eingesetzte PCR Programm war wie folgt: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 55°C, 1 min bei 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte GFP Fragment wurde mit SmaI and NheI verdaut und in Vektor pIC522 kloniert, der mit BbrPI and NheI verdaut worden war. Der entstandene Vektor wurde pIC526 (3) genannt. Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung (MWG, München) bestätigt.
  • Plastiden Transformation von dycf3-Mutanten und Selektion homoplastomischer Linien
  • Das Ziel der zweiten Transformation war es, die ycf3 kodierende Sequenz funktionstüchtig wiederherzustellen, die aadA Kassette zu entfernen und gleichzeitig das GFP Gen als neuen Marker einzubringen. Junge Blätter steriler homoplastomischer Δycf3 Mutanten herangewachsen auf VBW Medium unter Schwachlicht Bedingungen wurden mit mit Plasmid pIC526 beladenen Goldpartikeln beschossen ('particle gun', Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm), diese auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker (3 g Saccharose/Liter) transferiert und unter Schwachlicht Bedingungen kultiviert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3-wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert und unter Starklichtbedingungen kultiviert, bis keine weiteren Regenerate erschienen. Transformanten, die einen grünen Phänotyp zeigten und sind in der Lage waren, fotoautotroph zu wachsen, wurden selektiert und mehreren weiteren Regenerationszyklen auf RMOP Medium mit reduziertem Zucker unterzogen, um homoplastomisches Gewebe zu erhalten. Homoplastomische Linien wurden zur Wurzelbildung auf B5 Medium transferiert und unter Staklicht Bedingungen kultiviert.
  • Analyse der Transformanten nach der zweiten Transformation
  • Plastidäre Transformanten wurden mit Hilfe von PCR identifiziert. Gesamt-DNA von Primärtransformanten, die einen grünen Phänotyp zeigten und fotoautotroph wuchsen, wurde isoliert und als Template für die PCR-Analyse eingesetzt. Dabei wurden folgende Primer verwendet: oFCH76 (5'-GTAGCAATCCATTCTAGAAT-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 46269-46288) and oFCH53 (5'-GACTATAGTTAATGGATACTC-3', bindet zu Plastom Nukleotiden 46812-46792). Das PCR Ergebnis sollte ein Amplifikationsprodukt von 540 bp bei Wildtyp-Plastomen ergeben, ein Produkt von 1400 bp bei Plastomen, die in der zweiten Runde korrekt transformiert wurden, und kein Amplifikationsprodukt bei unveränderten Erstrunden Transformanten (da die p76 Bindestelle deletiert wurde).
  • Homoplasmie wurde mittels DNA-Gelblot-Analyse nachgewiesen: Genomische DNA wurde aus junger Blättern von Pflanzen aus dem vierten Regenerationszyklus herangewachsen unter Starklicht Bedingungen isoliert und mit AvaI geschnitten. Die verwendete Sonde ist die gleiche wie die für den Nachweis von Δycf3 Mutanten (detaillierte Beschreibung siehe oben). Die Sonden erzeugen ein Signal bei 1212 bp für Wildtyp Plastomen, ein Signal bei 2015 bp für eine korrekte Integration ins Plastom in der zweiten Transformationsrunde und ein Signal von 6852 bp im Fall von unveränderten Erstrunden Transformanten.
  • Um die Entfernung der aadA Marker Kassette zu zeigen, wurde ein zweiter Blot gemacht (wobei nach der ersten Hybridisierung der Blot gestrippt wurde), bei dem ein 480 bp Fragment als Sonde verwendet wird. Als Sonde wurde ein Fragment des aadA Gens eingesetzt, amplifiziert mit den Primern oFCH59 und oFCH60 (siehe Beispiel 1). Für die PCR wurde der 'DIG labeling reaction kit' in Anlehnung an das Hersteller Protokoll verwendet.
  • Beispiel 4: Konstruktion eines Selektionssystems basierend auf der Inaktivierung eines Fotosynthese-Gens
  • Konstruktion von Transformationsvektor pIC558, der zur Inaktivierung des plastidär kodierten petA Gens verwendet werden kann
  • Alle Klonierungen wurden nach Standardprotokollen durchgeführt wie in Beispiel 1 und bei Ausubel et al., 1999 beschrieben.
  • Der Transformationsvektor pIC558 beinhaltet die aadA-Kassette (pUC16S aadA Sma vollst, Koop et al., 1996) umgeben von zwei flankierende Sequenzen (Tabak Plastiden-DNA). Diese beiden homologen Flanken entsprechen den DNA-Sequenzen der 5' und 3' Bereiche des petA Gens; die aadA-Kassette ersetzt im transgenen Plastom die Sequenz des petA Gens und 300 bp des direkt anschließenden 3' Bereichs.
  • Beide flankierenden Fragmente wurden mittels PCR amplifiziert, wofür die folgenden Primer verwendet wurden: oSK13 (5'-GGAATTCCATATGGTATAAAACTCATGTGTGTAAGAAA-3') und oSK14 (5'-TCCCCCGGGGGTCCAATCATTGATCGCGAAA-3'), mit Hilfe derer NdeI/SmaI Restriktionsschnittstellen erzeugt werden, und oSK15 (5'-TTCCCCGGGTTCTAAATAGAAAG AAAGTCAATTTG-3') und oSK16 (5'-CATGCATGCGAATGAATAAGATTCTCTTAGCTC-3'), mit derer Hilfe SmaI/SphI Restriktionsschnittstellen erzeugt werden. Folgendes Programm wird für die PCR verwendet: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 55°C, 1.5 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Die PCR Fragmente (linke/rechte Flanke) und die aadA-Kassette wurden in einem Schritt in den Vektor pUC19 kloniert, der NdeI/SphI verdaut worden war. Das entstandene Plasmid (Vektor pIC558) wurde über Restriktionsexperimente analysiert. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde sequenziert, um die Korrektheit der Sequenz der flankierenden Regionen zu zeigen. Der Plastiden-Transformationsvektor pIC558 ist in 8 und 9 abgebildet.
  • Konstruktion der Transformationsvektoren pIC597, pIC599 und pIC600 zur Wiederherstellung des petA Gens Das Ziel der zweiten Transformation ist es, das inaktivierte petA Gen wiederherzustellen und gleichzeitig ein neues Gen (uidA oder aphA-6, eventuell nptII) ins Plastom zu integrieren. Demzufolge wurden das petA Gen und eine Genkassette (inklusive 5'/3' Regel-Elemente) zwischen die flankierenden Sequenzen kloniert. Der resultierend Vektor (pIC597, mit uidA-Kassette) enthält dieselben flankierenden Fragmente wie Vektor pIC558, das petA Gen und die uidA-Kassette.
  • Als erster Schritt der Klonierung wurde ein ~2.2 kb langes DNA Fragment mittels PCR amplifiziert, welches die linke Flanke (1 kb), das petA Gen (962 bp) und 300 bp des 3' Bereichs enthält. Dazu werden folgende Primer verwendet: oSK13 (5'-GGAATTCCATATGGTATA AAACTCATGTGTGTAAGAAA-3') und oSK71 (5'-TCCCCCGGGTAGAAAACTATTGATACGTCTTATGG-3'), mit Hilfe derer NdeI/SmaI Restriktionsschnittstellen an den Enden erzeugt werden. Für diese PCR wird folgendes PCR Programm verwendet: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec at 94°C, 45 sec at 55°C, 3 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das resultierende PCR Fragment und die rechte Flanke (Vektor pIC558) werden zusammen in pUC19 kloniert. Dieser Vektor (pIC651 oder 'petA + 1 kb5' + 1,3 kb3'') enthält 1 kb linke Flanke, die kodierende Sequenz von petA, 300 bp der 3'-Region und 1 kb rechte Flanke, was der Plastom Sequenz 63.335-66.597 von Nicotiana tabacum entspricht.
  • Als neues interessierendes Gen wurde entweder das uidA Gen (Koop et al., 1996) oder das aphA-6 Gen (Vektor pSK.KmR, Bateman and Purton, 2000) oder das nptII Gen (Töpfer et al., 1987) als Genkassette (enthaltend 5'/3' regulatorische Elemente) zwischen die flankierenden Fragmente eingeführt. Die uidA-Kassette (als SmaI- Fragment) stammt aus dem Vektor pIC562 ('pUC16SRBSuidA3'rbcL', Koop et al., 1996). Das aphA-6 und nptII Gen wurden je in den Vektor pIC562 kloniert, wobei sie jeweils das uidA Gen ersetzen. Nach dieser Zwischenklonierung konnen die aphA-6-Kassette und die nptII-Kassette als SmaI-Fragment isoliert werden. Diese SmaI- Fragment (uidA-Kassette, aphA-6-Kassette, nptII-Kassette) wurden in den petA 3' Bereich (Insertionsstelle 300 bp downstream zu petA) kloniert. Dieresultierenden Vektoren werden 'petA-cureplasmids' genannt (pIC597 mit uidA; pIC599 mit aphA-6; pIC600 mit nptII). Die Konstrukte wurden mittels Restriktionsanalysen und Sequenzierung auf Richtigkeit hin untersucht. Eine schematische Abbildungen der drei Vektoren ist in 10 zu sehen. Der Transformationsvektor pIC597 ist in 11 abgebildet.
  • Erste Transformation und Selektion homoplastomischer ΔpetA Mutanten
  • Die Plastidentransformation mit Vektor pIC558 unter Verwendung der Particle Gun und die Selektion potenzieller Transformanten wird durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben. PEG vermittelte Plastidentransformation mit Vektor pIC558 und die Selektion potenzieller Transformanten wird durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Zweite Transformation und Selektion wiederhergestellter, homoplastomischer ΔpetA Mutanten
  • Die Plastiden Transformation mit Vektor pIC558 unter Verwendung der Particle Gun wurde durchgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben. PEG vermittelte Plastiden Transformation mit Vektor pIC558 wurde durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Selektion potenzieller Transformanten wurde durchgeführt
    • a) auf RMOP Medium mit reduziertem Zuckergehalt (0,3%). Transformanten mit wiederhergestelltem petA Gen sollten in der Lage sein, die durch Fotosynthese gewonnene Energie zum Wachstum zu verwenden.
    • b) auf RMOP Medium mit Kanamycin als Selektionsmittel (die Genprodukte von aphA-6 und nptII entgiften Kanamycin).
  • Transformanten zeigten eine Verminderung des hcf(high chlorophyll fluorescence)-Phänotyps während wiederholter Regenerations-Zyklen.
  • Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot nach der ersten Transformation Für die Isolation von DNA aus Pflanzenmaterial, die PCR-Analyse und den Southern Blot wurden Standardprotokolle verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur Bestimmung des aadA Gens in Transformanten wurden die Primer oFCH59-aadA480-li and oFCH60-aadA480-re (5'-CAC TAC ATT TCG CTC ATC GCC-3') verwendet. Um festzustellen, ob das aadA Gen ins Plastom integrierte, können die Primer oFCH60-aadA480-re and oSK116-petA-re (5'-AAAATAGATTCATTAGT CCGATACC-3') verwendet werden. Primer oSK116-petA-re bindet stromaufwärts (außerhalb) der flankierenden 5' Flanke. Für diese PCR wird folgendes PCR Programm: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec at 94°C, 45 sec at 55°C, 3 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min.
  • Erste PCR Resultate ergaben, dass 12 Spectinomycin-resistente Linien von der ersten Transformation das aadA Gen an der richtigen Stelle im Plastom integriert hatten. Weitere Tests und Southern Blot Analysen werden durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben, um zu zeigen, ob die Linien homoplastomisch oder heteroplastomisch sind.
  • Analyse der Transformanten mittels PCR und Southern Blot nach der zweiten Transformation Für die Isolation von DNA aus Pflanzenmaterial und die PCR-Analyse werden Standardprotokolle verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zur Bestimmung des uidA Gens wurden die Primer oSM61-GUS-N (5'-TCACACCGATA CCATCAGCG-3') and oSM62-GUS-C (5'-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3') verwendet. Um die korrekte Integration ins Plastom zu bestimmen, wurden die Primer oSM61-GUS-N (5'-TCACACCGATACCATCAGCG-3') and oSK138-petA-3'-re (5'-AATCGTAACCAGTCTCTACTGG-3') verwendet. Für die PCR wurde folgendes PCR Programm verwendet: 3 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec at 94°C, 45 sec at 55°C, 3 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min.
  • Für die Detektierung des aphA-6 Gens und des nptII Gens wurden genspezifische Primer verwendet. Um die korrekte Integration ins Plastom nachzuweisen, wird ein genspezifischer Primer und der Primer oSK138-petA-3' verwendet. Southern Bloting Analysen werden durchgeführt, wie in Standard Protokollen und in Beispiel 1 beschrieben.
  • Beispiel 5: Selektion auf Paraquat-Toleranz
  • Pflanzentransformation und Selektion auf Paraquat-Toleranz
  • 4 Blattstücke wurden jeweils mit 1 μg pIC558 (8) wie in Beispiel 4 beschrieben transformiert. Nach dem Beschuss wurden die Blattstücke für zwei Tage bei 25°C auf RMOP-Medium inkubiert.
  • Zwei Tage nach dem Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke (ca. 3 × 3 mm) geschnitten, auf frisches RMOP-Medium transferiert und für 10 Tage im Dunklen bei 25°C inkubiert. Dann wurden die Blattstücke erneut geschnitten, auf frisches Medium, das 5 mg/l Paraquat enthielt, übertragen und für 10 Tage im Licht bei 25°C inkubiert. Dann wurden die Blattstücke erneut geschnitten, auf frisches Medium, das 8 mg/l Paraquat enthielt, übertragen und für 12 Tage im Licht bei 25°C inkubiert. Grüne Regenerate von der Unterseite wurden abgetrennt und auf einzelne Platten, die RMOP mit 8 mg/l Paraquat enthielten, übertragen. Die Linien wurden wiederholten Zyklen von Sprossregenerationen unterworfen, indem sie in kleine Blattstückchen geschnitten wurden, welche neue Regenerate auf RMOP-Medium mit 8 mg/l Paraquat bilden.
  • Molekulare Analyse potenzieller Plastidentransformanten durch Southern-Analyse
  • 3 μg pflanzlicher gesamt-DNA pro untersuchter Pflanze werden mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und auf einem TBE-Agarosegel (1%) aufgetrennt. Die DNA wird denaturiert und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Hybond-N+, Amersham) wie in Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4. Auflage, Kapitel 2.9A beschrieben, übertragen. Der Filter wird mit Digoxigenin markierten Sonden in DIG Easy Hyb Puffer (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert. Die Hybridisierunssignale werden unter Verwendung des DIG Luminiscent Detection Kit (Roche) nachgewiesen. Die Membran wird auf einem X-OMAT LS-Film bei Raumtemperatur exponiert.
  • Ein Fragment, das für eine Unterscheidung zwischen Wild-Typ und transformiertem Plastom geeignet ist, wird unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen, Hilden, Germany) über ein Gel gereinigt, unter Verwendung des Roche DIG DNA Labelling mit Digoxigenin markiert und für die Hybridisierung verwendet.
  • Beispiel 6: Rekonstitution vo ycf3 mittels Kanamycinselektion
  • Konstruktion von Transformationsvektor pIC577 zur gezielten Inaktivierung des ycf3 Gens
  • Ein Transformationsvektor wurde konstruiert, der zur Inaktivierung des ycf3 Gens durch Ersetzen des ersten Exons und der Spleißstelle von ycf3 (entsprechend Plastomnukleotiden 46042-46206) mit der aadA-Kodierregion vorgesehen war. Dieser Vektor enthält keine 3' regulatorischen Elemente (weder für das aadA Markergen noch für das endogene ycf3 oder tRNA Gen). Ferner wurden keine Promotorelemente eingeführt. Es wird davon ausgegangen, dass das aadA Gen durch die endogenen stromaufwärts gelegenen ycf3 regulatorischen Elemente transkribiert und translatiert wird.
  • Dieser Vektor enthält die aadA Kodierregion flankiert von 5'- und 3'-homologen Sequenzen, die aus dem Tabak-Chloroplastengenom mittels PCR mit den folgenden zwei Primerpaaren amplifiziert wurden: oFCH76 (5'-NcoI-GTA GCA ATC CAT TCT AGA AT-3', bindet an Plastomnukleotide 46269-46288) und oFCH77 (5'-SmaI-CGG AAA GAG AGG GAT TCT AAC-3', bindet an Plastomnukleotide 47205-46185); oFCH78 (5'-SphI-GAA GTT TCT TTC TTT GCT ACA-3', bindet an Plastomnukleotide 45033-45053) und oFCH79 (5'-PstI-TAC GCT TTT T GA AGG TGA AGT-3', bindet an Plastomnukleotide 46041-46021).
  • Die PCR-Reaktion unter Verwendung der Pfu Polymerase (Promega) wurde wie folgt durch geführt:: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec at 94°C, 45 sec at 55°C, 2 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte 5' homologe Fragment (entsprechend Plastomnukleotiden 46269-47205) mit 936 Nukleotiden stromaufwärts des ycf3 Startkodons wurde mit SmaI und NcoI verdaut und in pUC16SaddA ligiert (Koog et al., 1996), das mit Eco RI verdaut worden war, gefogt von einer Auffüllreaktion mit Klenow-Polymerase (Promega) und dann mit NcoI verdaut, wodurch pIC565 erhalten wurde. Das amplifizierte 3' homologe Fragment (entsprechend Plastomnuldeotiden 45033-46041) mit 1000 Nukleotiden des ycf3 Gens wurde mit PstI und SphI verdaut und in pIC565 ligiert, das mit PstI und SphI verdaut worden war, wodurch der fertige Transformationsvektor pIC577 erhalten wurde (12 und 13). Die Identität des Plasmidinserts wurde mittels Sequenzieren (MWG, München) verifiziert.
  • Primärtransformation und Selektion homoplastomischer Δycf3 Mutanten
  • Junge Blätter steriler Tabakpflanzen (Kultivierung siehe Beispiel 3) wurden mit mit Plasmid pIC577 beladenen Goldpartikeln beschossen ('particle gun', Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3). Zwei Tage nach Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke geschnitten (ca. 3 × 3 mm) und diese auf festes RMOP Medium mit 500 μl/ml Spectinomycin transferiert. Nach zwei Wochen wurden die Blattstückchen erneut geschnitten und auf neues Medium transferiert. Im folgenden wurden die Blattstücke im 3-wöchigem Abstand wieder geschnitten und auf neues Medium transferiert, bis keine weiteren Regenerate erschienen. Primäre Δycf3 Transformanten zeigten einen Spectinomycinresistenz und einen grünen Phänotyp im Licht, waren jedoch noch heteroplastomisch. Um transformierte plastidäre DNA-Moleküle zu amplifizieren und um wildtyp-Genome zu eliminieren, wurden die Primärtransformanten 3 weiteren Regenerationsrunden auf Selektionsmedium unterworfen. Da Segregation zur Bildung weißer und grüner Sektoren führt, wurde Material von weißen Sektoren mehreren weiteren Regenerationsrunden auf nicht selektivem Medium unterworfen, um homoplastomische mutierte Transformanten zu erhalten. Homoplastomische transformierte Linien wurden auf festem VBW-Medium der Wurzelbildung und Vermehrung unterzogen.
  • Analyse mittels PCR und Southern Blotting
  • Plastidentransformanten wurden mit Hilfe der PCR Methode identifiziert. Gesamt-DNA isoliert von den ersten Regenersten von 24 unabhängigen Linien wurde als Template für die PCR eingesetzt. Zwei Primerpaare (Sequenzen siehe Beispiel 3): oFCH59/oFCH60 und oFCH52/oFCH53 wurden für die Analyse transplastomer Pflanzen eingesetzt. Primerpaar oFCH52/oFCH53 sollte ein Amplifikationsprodukt von 900 bp im Fall von wildtyp Plastom liefern und ein Produkt von 1476 bp im Fall von transformiertem Plastom. Primerpaar oFCH59/oFCH60 sollte ein Amplifikationsprodukt von 480 bp liefern, wenn die Pflanze transformiert ist und kein Produkt bei wildtyp-Pflanzen. Die Erbebnisse zeigten, dass 14 Linien von Transformanten korrekte aadA-Inserts im Plastidengenom trugen. Diese Daten sind im Einklang mit dem phänotypischen Erscheinungsbild der betreffenden Linien, was anzeigte, dass die Pigmendefizienz mit der Deletion von ycf3 korrelierte.
  • Homoplasmie wurde mittels Southern Blotting verifiziert: Genomische DNA von jungen Blättern von Δycf3 Pflanzen des vierten Regenerationszyklus, die unter Schwachlichtbedingungen herangezogen waren, wurde für die DNA Gel Blot Analyse eingesetzt. Dabei wurde wie folgt vorgegangen: 4 μg Gesamt-DNA pro zu analysierender Pflanze wurden mit Restriktionsenzym Xma JI geschnitten und auf einem TAE Agarose Gel (0.8%) aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA wurde diese auf eine positiv geladene Nylon-Membran (Hybond-N+, Amersham) transferiert, wie in Ausubel et al. (1999) beschrieben. Der Filter wurde mit einer Digoxigenin markierten Sonde in DIG 'Easy Hyb Buffer' (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) hybridisiert, und Hybridisierungs-Signale wurden unter Verwendung des DIG 'Luminescent Detection Kit' (Roche) sichtbar gemacht. Die Membran wurde für zwei Stunden auf einen X-OMAT LS Film bei Raumtemperatur exponiert.
  • Für die Herstellung der DIG-markierten Hybridisierungssonde wurde genomische Tabak-DNA als Templat für die Amplifikation eines 520 bp Fragments verwendet, wobei folgende Primer eingesetzt wurden: oFCH69 (5'-CATTGGAACTGCTATGTAGGC-3', entsprechend Plastomnukleotiden 47149-47169) und oFCH64 (5'-GAATTACCAAACCATTTGACCC-3', entsprechend Plastomnukleotiden 47667-47647). Für diese PCR wurde das 'PCR DIG Probe Synthesis Kit' von Roche verwendet. Das eingesetzte PCR Programm war wie folgt: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 55°C, 1 min bei 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das amplifizierte Fragment wurde mittels QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen, Hilden, Germany) gereinigt, und wurde so für die Hybridisierung eingesetzt. Ein Hybridisierungssignal bei 2780 bp zeigt transformierte Plastome an, ein Signal bei 2198 bp zeigt Wildtyp-Plastome an. Das Resultat zeigte, dass keine Wildtyp-plastidäre DNA in allen 6 getesteten mutanten Linien detektiert werden konnte.
  • Konstruktion des Transformationsvektors pIC637 zur Rekonstitution des ycf3 Gens
  • Transformationsvektors pIC637 war zur Transformation der mutierten Δycf3 Linie vorgesehen mit dem Ziel, das ycf3 Gen zu rekonstituieren, das aadA Gen zu deletieren und das aphA-6 Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, zu inserieren.
  • Das aphA-6 Gen wird in die stromaufwärts gelegene Position von ycf3 ohne die ycf3 Expression oder die Funktion der endogenen stromaufwärts gelegenen regulatorischen Elemente von ycf3 zu zerstören. Ein kurzes RBS (Ribosomenbindestelle) dient als Translationssignal für das rekonstituierte ycf3 Gen als neues künstliches Operon. Das aphA-6 Gen und ycf3 werden in derselben Richtung unter der Kontrolle des ycf3 5'-regulatorischen Elements transkribiert.
  • Die Region des Tabak-Chloroplastengenoms (entsprechend Plastomnukleotiden 45033-46266) mit dem N-Terminus von ycf3 (der in der ersten Transformationsrunde deletiert wurde) wurde aus genomischer DNA, die aus Blattgewebe von Tabak isoliert worden war, mittels PCR amplifiziert. Das folgende Oligonukleotidpaar wurde als Primer verwendet: oFCH139 (5'-PstI-ATCACTAGT TGT AGG GAG GGA TCC (Ribosomenbindungsstelle)-ATG CCT AGA TCA CGG ATA AA-3', bindet an Plastomnukleotide 46266-46247) und oFCH78 (5'-SphI-GAA GTT TCTTTC TTTGCT ACA-3', bindet an Plastomnukleotide 45033-45053). Die PCR Reaktion mit Taq Polymerase wurde wie folgt durchgeführt: 2 min bei 94°C, 1 Zyklus; 45 sec at 94°C, 45 sec at 55°C, 2 min at 72°C, 30 Zyklen; abschließende Elongation bei 72°C für 10 min. Das Produkt wurde mit PstI und SphI verdaut und in mit PstI und SphI geschnittenes pIC577 ligiert, wobei pIC636 erhalten wurde.
  • Die Kodierregion des aphA-6 Gens wurde aus Plasmid pSK.KmR (von Dr. Saul Purton, Department of Biology, University College London, UK erhalten) mit NcoI und PstI herausgeschnitten un in pIC636, das mit NcoI und PstI geschnitten worden war, ligiert, wobei der fertige Transformationsvektor pIC637 (14 and 15) erhalten wurde. Die Identität des Inserts wurde mittels Sequenzieren verifiziert (MWG, München).
  • Plastidentransformation von mutierten Δycf3 Linien und Selektion von homoplastomischen Linien
  • Das Ziel der zweiten Transformation war es, das ycf3 Gen zu rekonstituieren, den aadA Marker zu entfernen und das aphA-6 Gen, das Kanamycinresistenz verleiht, einzuführen. Eingebettete Protoplasten, die aus sterilen, homoplastomischen, unter Schwachlichtbedingungen auf festem VBW-Medium herangezogenen Δycf3 Mutanten isoliert worden waren, wurden mit mit Plasmid pIC637-beladenen Goldpartikeln beschossen ('particle gun', Bio-Rad (Hercules, CA, USA) PDS-1000/He 'particle delivery system'; detaillierte Beschreibung siehe Beispiel 3).
  • Zwei Tage nach dem Beschuss wurden die Netze auf RMOP Festmedium mit je 25 μg/ml Kanamycin übertragen und unter Schwachlichtbedingungen 2 Wochen kultiviert. Dann wurden alle 2 Wochen die Netze auf frisches Medium transferiert und unter Starklichtbedingungen kultiviert bis keine weiteren Regenerate erschienen. Die Transformanten, die Kanamycinresistenz und einen grünen Phänotyp zeigen, wurden selektiert und in B5 Medium in Starklicht kultiviert, um ycf3-rekonstituierte Plastome zu erhalten (ycf3-defiziente Plastome können auf B5 Medium unter Starklichtbedingungen nicht amplifiziert werden).
  • Molekulare Analyse der sekundären transplastomischen Pflanzen
  • Plastidentransformanten wurden mittels PCR Amplifizierung identifiziert. Gesamt-DNA, die von Primärtransformanten, die einen grünen Phänotpy zeigten und photoautotroph wuchsen, isoliert wurde, wurde also Templat für die PCR-Analyse verwendet. Die folgenden zwei Primerpaare wurden verwendet: oFCH168 (5'-TCA GTC GCC ATC GGA TGT TT-3', aus dem 5'- Bereich der aphA-6 Kodierregion) and oFCH169 (5'-ACC AAT CTT TCT TCA ACA CG-3', aus dem 3'- Bereich der aphA-6 Kodierregion); oFCH27 (5'-TGC TCA AGA CTT TAG TGG ATC-3', bindet an Plastomnukleotide 44799-44819) and oFCH168. oFCH168 und oFCH169 sollten ein Amplifikationsprodukt of 500 bp mit der rekonstituierten Pflanze und kein Produkt mit unveränderten Transformanten der ersten Runde ergeben. Die Kombination von oFCH27 und oFCH168 kann bestimmen, ob die Zweitrunden-Transformanten korrekte aphA-6 Insertionen tragen durch Amplifizierung eines Produktes von ca. 2300 bp mit korrek transformierten Plastomen. Insgesamt wurden 5 einzigartige ycf3-rekonstituierte Tabakplastidentransformanten aus 3 Netzbombardierungen erhalten.
  • Homoplasmie wurde mittels Southern Bloting verifiziert. Genomische DNA wurde aus jungen Blättern von ycf3-rekonstituierten, auf B5-Medium unter Starklichtbedingungen herangezogenen Pflanzen isoliert und mit HincII verdaut. Die verwendete Sonde war die gleiche wie die für die Δycf3 Mutanten (detailierte Beschreibung des DNA Blottings und der Hybridisierung siehe oben). Die Sonde generiert ein Signal von 3257 bp mit wildtyp Plastomen, ein Signal von 2046 bp für in der zweiten Runde korrekt transformierte Plastome und ein Signal von 3857 bp für veränderte Erstrundentransformanten.
  • Um die Entfernung des aadA Markers zu bestätigen, wurde eine zweite Hybridisierung des Blots durchgeführt (wobei nach der ersten Hybridisierung der Blot gestrippt wurde), bei dem ein 480 bp Fragment des aadA Gens als Sonde verwendet wurde. Die Primer oFCH59 und oFCH60 (siehe oben) wurden in einer PCR DIG Markierungsreaktion gemäß Herstellerprotokoll (Roche) verwendet.
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Claims (25)

  1. Verfahren zur Herstellung von in ihrem Plastom transformierten multizellulären zweikeimblättrigen Pflanzen, Pflanzenorganen oder Pflanzengeweben, umfassend die folgenden Schritte: (a) Verändern oder Unterbrechen der Funktion eines Gens in einem Plastidengenom mittels genetischer Transformation, um einen selektierbaren oder erkennbaren Phänotyp zu erhalten, wobei der Phänotyp eine Pigmentstörung und/oder eine Photosynthesestörung ist, (b) Abtrennen oder Selektieren von Pflanzen oder Zellen, die diesen Phänotyp exprimierende Plastide enthalten, (c) Transformieren des Plastidengenoms der abgetrennten oder selektierten Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe mit mindestens einem Transformationsvektor, der über eine Wiederherstellsequenz verfügt, die die Funktion wiederherstellen kann und (d) Abtrennen oder Selektion der transformierten Pflanzen, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe, die über Plastide verfügen, die die wiederhergestellte Funktion exprimieren.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Transformation von Schritt (c) die Funktion wiederherstellt und in Verbindung damit mindestens eine weitere Funktion einführt.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Transformation von Schritt (c) die Funktion wiederherstellt und in Verbindung damit eine gewünschte weitere genetische Modifizierung des Plastidengenoms verursacht.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Transformation von Schritt (c) zusätzlich eine bereits existierende Funktion eliminiert.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die genetisch Transformation zugleich die Einführung mindestens einer zusätzlichen Sequenz für mindestens eine weitere Fnunktion bewirkt.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die weitere Funktion eine Inhibitorresistenzfunktion ist und Schritt (b) in Gegenwart des entsprechenden Inhibitors durchgeführt wird.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der Inhibitor in Schritt (b) nur anfänglich zugesetzt wird.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Schritte (a) und (b) einen trophischen Typ verändern oder unterbrechen und die Schritte (c) und (d) den trophischen Typ wiederherstellen.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der wiederhergestellte trophische Typ Phototrophie ist.
  10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Schritte (c) und (d) eine in den Schritten (a) und (b) eingeführte Inhibitorresistenz oder -unempfindlichkeit rückgängig machen.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der (die) in Schritt (a) benutzte(n) Vektor(en) eine Sequenz aufweist (aufweisen), die zu einer Plastidsequenz des Wirtes für eine homologe Rekombination ausreichend homolog ist.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Pflanze, Pflanzenorgane oder Pflanzengewebe in Schritt (b) heterotroph aufgezogen oder kultiviert wird/werden.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Pigmentstörungsphänotpy Chlorophyllmangel ist.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Gen ein im Plastom codiertes Plastiddgen ist, das für die Transkription oder die Translation essentiell ist, insbesondere eine RNA Polymerase.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das für die Transkription oder die Translation essentielle Plastiddgen eine RNA Polymerase ist.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Gen ein plastidäres rpoA oder rpoB Gen ist.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der in Schritt (a) erhaltene Phänotyp in Abhängigkeit von den äußeren Wachstumsbedingungen zwischen zwei oder mehreren Erscheinungen wechseln kann.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das in Schritt (a) veränderte oder unterbrochene Gen ein ycf3 Plastidgen ist, wodurch bei Standardlichtbedingungen ein gelbweißer Phänotyp und bei schwachen Lichtbedingungen ein hellgrüner Phänotyp erhalten wird.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das veränderte oder unterbrochene Gen ein Plastidgen ist, das durch Verändern oder Unterbrechen zu einem Phänotyp mit starker Chlorophyllfluoreszenz führt.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das Plastidgen, das durch Verändern oder Unterbrechen zu einem Phänotyp mit starker Chlorophyllfluoreszenz führt, petA ist.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei in Schritt (b) ein Inhibitor benutzt wird, der zu seiner Wirksamkeit aktive Photosynthese benötigt.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei der Inhibitor Paraquat, Morphamquat, Diquat, Difenzoquat und/oder Cyperquat ist.
  23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei in Schritt (d) photomixotrophe Bedingungen benutzt werden.
  24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei eine in Schritt (a) eingeführte Sequenz und eine in Schritt (c) eingeführte Sequenz zusammen zu einer weiteren Funktion führen.
  25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei Schritt (d) durch eine Inhibitorresistenz unterstützt wird.
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