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BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Vorrichtungen und Verfahren
zum Fördern
des Wachstums eines Gewebes in Versuchs- und Produktionsaufbauten,
insbesondere auf die Verwendung von spezialisierten Platten zum
Aufnehmen des Gewebes und des periodischen Durchlaufens eines Mediums,
um das Gewebe biologisch zu erhalten.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Hochdurchsatzscreening
erfordert normalerweise paralleles Verarbeiten von Stapeln von Proben,
typischerweise in Mehrfach-Well-Platten (multiple well plates, MWPs)
mit 24, 48, 96 und 384 oder mehr Wells pro Platte. MWPs sind Standardgrößen, welche
mit bestehenden Hochdurchsatzmaschinen, wie zum Beispiel mit robotergesteuerten
Pipettierern verwendet werden können.
Jede Pipettierstation eines robotergesteuerten Pipettierers sieht
Pipettierköpfe
mit einer Anordnung von Pipettenspitzen vor, welche mehrere Well
gleichzeitig behandeln. Obwohl die gebräuchlichen Mehrfach-Well-Platten
für das Screening
von flüssigen
Proben in wirksamer Weise verwendet werden, sind sie im Allgemeinen
für ein Screening
von Pflanzen und anderen Geweben unwirksam und die sekretorischen
Produkte, welche mit diesen Geweben in Verbindung gebracht werden,
erfordern oder bevorzugen komplexere Umgebungen, wie zum Beispiel
feste Stützstrukturen.
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Beispielsweise
wurden Versuche unternommen, Pflanzen in MWPs durch Aussetzen der
Pflanzen in einem flüssigen
Medium innerhalb jeden Wells zu züchten. Dem Pflanzengewebe wird
jedoch Sauerstoff vorenthalten, wenn es sich in der Flüssigkeit befindet,
was das Pflanzengewebe gewissermaßen in einer anaeroben Umgebung „ertränkt". Andere Versuche
wurden unternommen, welche Medien verwenden, die im Allgemeinen
fester gestützt
sind, und ein Substrat bereitstellen, auf welchem das Pflanzengewebe über der
Flüssigkeit
werden kann, wie zum Beispiel ein Gel oder eine Filterpapierscheibe.
Obwohl diese Arten der Unterstützung
ein Ertrinken der Pflanzen vermeiden, sind sie schwierig auszutauschen
und wiederaufzufüllen,
wenn die Nährstoffe oder
die Medien erschöpft
sind. Ferner wurden in flüssige
Medien getauchte Papierbrücken
als Gewebeunterstützungen
verwendet und das flüssige
Medium konnte etwas leichter aufgefrischt werden. Empirische Hinweise
haben jedoch gezeigt, dass Papierbrücken in einem automatisierten
System schwierig zu handhaben sind und im Allgemeinen unwirksam bei
einem Fördern
eines Pflanzengewebewachstums sind. Ohne mit einer speziellen Theorie
verbunden zu sein, kann dies sein, weil das flüssige Medium die Papierbrücke nicht
leicht durchdringt (d.h., die Papierbrücke ist nur ein bisschen hydrophil)
und es dem darauf gestützten
Gewebe an einer kontinuierlichen Versorgung mit dem Medium mangelt.
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Eine
gängige
Methode, dem Pflanzengewebe ein frisches Medium zuzuführen, ist,
das Pflanzengewebe zu einem Behälter,
welcher frisches Medium enthält,
zu bewegen. Ein Bewegen des Pflanzengewebes ist ein relativ langsamer
und arbeitsintensiver Vorgang, da Mehrfachplatten für jeden
Stapel von Pflanzengeweben aufgefüllt oder anderweitig vorbereitet
werden müssen.
Außerdem
besteht eine Gefahr eines Verlusts oder einer Verunreinigung der
Gewebeproben, wenn sie von den Wells entfernt werden.
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Ein
anderer Ansatz zum Absaugen und Entfernen eines verbrauchten Mediums
und Gewebenebenprodukten ist, eine Probenplatte zu verwenden, welche
mehrer Bohrungen aufweist, wobei jede Bohrung ein Loch oder einen
Anschluss an dem Boden des Wells aufweist. Ein Filter ist an dem
Boden eines jeden Wells angeordnet, um das Gewebe zu stützen. Verbrauchtes
Medium kann von jedem Well durch den Anschluss unter Verwendung
einer Vakuumverteileranordnung vakuumabgesaut werden. Ein Beispiel
einer Vakuumverteileranordnung ist das von MILLIPORE of Bedford,
Massachusetts, gefertigte MultiScreen Vakuum Manifold System. Die
Probenplatte liegt auf einem Verteiler auf, welcher ein Vakuum liefert,
welches das Medium durch die Filterscheiben aus den Well-Zellen und durch
die Anschlüsse herauszieht,
wo es in dem darunter liegenden Verteiler erfasst wird. Obwohl die
Filterscheiben in der Probenplatte dem Medium ermöglichen
aus der Platte herausgezogen zu werden, ist es für die Filterscheiben schwierig,
genügend
Medium zurückzuhalten, um
eine Gewebeversorgung und ein Wachstum für einen beliebigen Zeitraum
zu unterstützen.
Da die Anschlüsse
an dem Boden der Wells offen zu der Umgebungsluft sind, können die
Anschlüsse
dem Medium ermöglichen
zu entweichen oder zu verdunsten und können ferner einen Pfad für eine mikrobielle
Verschmutzung der Wells bereitstellen. Außerdem können die Wells der Probenplatte
nicht einzeln geprobt werden, da der Vakuumverteiler das Medium von
allen Wells auf einmal absaugt.
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Das
Gewebe von Tieren und andere Typen von Organismen kann auch feste
Stützstrukturen
erfordern oder bevorzugen, was die Verwendung von Mehrfach-Well-Platten- und Hochdurchsatzscreeningtechniken
verhindert. Zum Beispiel kann das Wachstum von Knorpelzellen durch
die Verwendung einer Kollagenfibrillenmatrix gefördert werden, welche eine Umgebung
im lebenden Organismus (in vivo) simuliert. Ähnlich zu dem zuvor erörterten
Pflanzengewebe brauchen die Knorpelzellen eine Versorgung mit frischem
Me dium, welches in verschiedenen Intervallen wiederaufgefrischt
wird, um zu überleben
und/oder sich zu vermehren. Außerdem
vermehren sich einige der Knorpelzellen innerhalb der Kollagenfibrillenmatrix
und können
nicht unabhängig von
der Matrix bewegt werden. Ein Bewegen der Zellen zu einer neuen
Platte mit einer frischen Versorgung des Mediums erfordert ein Bewegen
der gesamten Kollagenmatrix, was ein relativ langsamer und ineffizienter
Prozess ist, welcher das Gewebe einer Verunreinigung aussetzt.
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Es
wäre vorteilhaft
eine Mehrfach-Well-Platte zu besitzen, welche die Verwendung von
Hochdurchsatzscreeningverfahren für nicht flüssige Proben ermöglicht.
Außerdem
wäre es
vorteilhaft eine Mehrfach-Well-Platte zu besitzen, welche die Verwendung
von Hochdurchsatzscreeningverfahren für Gewebe, die feste Stützstrukturen
erfordern oder bevorzugen, ermöglicht.
Es wäre
ferner vorteilhaft eine Mehrfach-Well-Platte zu besitzen, welche
das Wachstum eines Gewebes, wie zum Beispiel ein Pflanzengewebe,
fördert,
ohne das Risiko des Ertränkens
des Gewebes in einem flüssigen
Medium aufzuwerfen oder zuzulassen, dass das Gewebe dehydriert oder
verunreinigt wird. Es wäre
auch vorteilhaft eine Mehrfach-Well-Platte zu besitzen, welche ermöglicht,
ein Medium einfach aufzufrischen ohne das in den Wells enthaltene
Gewebe übermäßig zu stören. Außerdem wäre es vorteilhaft
die Möglichkeit zu
haben, weniger als die gesamte Anzahl von Wells in der Platte zu
prüfen
ohne die nicht geprüften
Wells zu stören.
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EP 0483620 offenbart eine
Mehrfach-Well-Platte, worin jedes Well einen ersten Abschnitt zum
Aufnehmen eines Gewebes und einen zweiten Abschnitt, welcher ein
Hinzufügen
oder Entfernen einer Flüssigkeit
ermöglicht,
aufweist. Das Gewebe ist in einem getrennten Einsatz enthalten, welcher
in dem ersten Abschnitt des Wells sitzt und die Störung des
Gewebes während
eines Hinzufügens
oder Entfernens von Flüssigkeit
verhindert.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Unterstützen eines
Gewebes auf einer porösen
Fritte bereit, wobei das Gewebe und die Fritte in einem Medium feucht
gehalten werden sollen, welches regelmäßig von einer von oben zu befüllenden Pipettiervorrichtung
abgesaugt und aufgefrischt wird, wobei die Vorrichtung einen Körper mit
einer oberen Oberfläche
aufweist, wobei der Körper
ein erstes Loch mit einer Oberkante des ersten Lochs, welche durch
die obere Oberfläche
des Körpers
definiert ist, und mit einem Unterteil des ersten Lochs, welches
innerhalb des Körpers
und unterhalb der oberen Oberfläche
des Körpers
definiert ist, definiert, wobei das erste Loch ausgestaltet ist,
das Gewe be aufzunehmen und das Medium, welches das Gewebe feucht hält, zu halten;
wobei die Vorrichtung gekennzeichnet ist durch:
ein zweites
Loch mit einer Oberkante des zweiten Lochs, welche durch die obere
Oberfläche
des Körpers
definiert ist, und mit einem Unterteil des zweiten Lochs, welches
innerhalb des Körpers
und unterhalb der oberen Oberfläche
des Körpers
definiert ist, wobei das Unterteil des zweiten Lochs über eine
Flüssigkeitsverbindung
mit dem Unterteil des ersten Lochs derart verbunden ist, dass die
Pipettiervorrichtung über
die Oberkante des zweiten Lochs auf das erste Loch zugreifen kann,
um das Medium durch Anwenden eines Unterdrucks abzusaugen und das
Medium durch Einpumpen von frischem Medium aufzufrischen, ohne das
Gewebe aus dem ersten Loch zu entfernen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung
einer Platte zum Halten einer porösen Fritte, die ein Gewebe
unterstützt,
bereit, wobei die poröse
Fritte und das Gewebe, welches in einem Medium, das regelmäßig von
einer Pipettenvorrichtung abgesaugt und aufgefrischt wird, feucht gehalten
werden, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen
eines Körpers
mit einer oberen Oberfläche;
Definieren eines ersten Lochs in dem Körper durch Durchbohren der
Oberfläche
des Körpers,
um eine Oberkante des ersten Lochs auszubilden, und Bohren unterhalb
der oberen Oberfläche und
in den Körper,
um ein Unterteil des ersten Lochs auszubilden; und Definieren eines
zweiten Lochs in dem Körper
durch Durchbohren der oberen Oberfläche des Körpers, um eine Oberkante des
zweiten Lochs auszubilden, und Bohren unterhalb der oberen Oberfläche und
in den Körper,
um ein Unterteil des zweiten Lochs auszubilden; und
Verbinden
des Unterteils des ersten Lochs mit dem Unterteil des zweiten Lochs
durch Ausbilden eines Durchlasses in dem Körper und zwischen dem Unterteil
des ersten Lochs und dem Unterteil des zweiten Lochs.
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Die
vorliegende Erfindung behandelt die obigen Bedürfnisse und erzielt weitere
Vorteile durch Bereitstellen einer Mehrfach-Well-Platte (multiple well
plate, MWP) und eines Verfahrens zum Medienaustausch, welches das
Wachstum eines Pflanzengewebes und anderen Arten von Gewebe durch Steuern
der Zuführung
eines Mediums zu dem Gewebe und Ermöglichen des regelmäßigen Austausches
(Entfernen und Hinzufügen)
eines Mediums, ohne das Gewebe zu stören, fördert. Die MWP weist eine Anordnung
von Wells auf, wobei jedes Well mit einem benachbarten Absaugloch
gekoppelt ist, welches ermöglicht,
dass ein Medium von den Wells unter Verwendung eines herkömmlichen
automati sierten Pipettenkopfes abgesaugt wird. Die MWP und der Pipettenkopf
stellen aufgrund der neuen Doppel-Well-Architektur einen praktisch
vollständigen Austausch
des verbrauchten Mediums bereit. Eine hydrophile, poröse Fritte,
welche in jedem Well untergebracht ist, unterstützt das Gewebe und hält das Medium
in seinem Zwischenraum, was eine Verbindung zwischen dem Gewebe
und dem Medium ermöglicht,
während
ein anaerober Zustand vermieden wird. Das Medium wird in ausreichenden
Mengen aufwärts
transportiert, um Nährstoffe
für das
Gewebe bereitzustellen und eine Vermehrung des Gewebes zu fördern.
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In
einer Ausführungsform
weist die Erfindung eine Platte zum Halten einer porösen Fritte,
welche ein Gewebe unterstützt,
auf. Die poröse
Fritte wird in einem Medium getränkt,
welches regelmäßig, zum Beispiel
durch eine von oben zu befüllende
Pipettiervorrichtung, abgesaugt und aufgefrischt werden kann. Die
Platte umfasst einen Körper
mit einer oberen Oberfläche,
welche ein erstes Loch und ein zweites Loch definiert. Das erste
Loch weist eine Oberkante des ersten Lochs, die durch die obere
Oberfläche
des Körpers
definiert ist, und ein Unterteil des ersten Lochs auf, welches innerhalb
des Körpers
und unterhalb der oberen Oberfläche
des Körpers
definiert ist. Das erste Loch ist ausgestaltet, die poröse Fritte
und das Gewebe aufzunehmen und das Medium zu halten, welches die
poröse
Fritte und das Gewebe feucht hält.
Das zweite Loch weist eine Oberkante des zweiten Lochs, welche durch
die obere Oberfläche
des Körpers
definiert ist, und ein Unterteil des zweiten Lochs auf, welches
innerhalb des Körpers
und unterhalb der oberen Oberfläche
des Körpers
definiert ist. Das Unterteil des zweiten Lochs ist derart in Flüssigkeitsverbindung
mit dem Unterteil des ersten Lochs, dass die Pipettiervorrichtung
auf die Oberkante des zweiten Lochs zugreifen kann, um das Medium
durch Anwenden eines Unterdrucks abzusaugen. Die Pipettiervorrichtung
frischt ferner das Medium durch Hinzufügen von frischem Medium direkt
auf die Fritte in jedem Well auf.
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In
einem weiteren Aspekt definiert der Körper der Platte ferner einen
Durchlass, welcher das Unterteil des ersten Lochs und das Unterteil
des zweiten Lochs über
eine Flüssigkeitsverbindung
verbindet. Der Körper
kann ferner einen Vorsprung aufweisen, welcher in das Unterteil
des ersten Lochs hervorragt, um die Fritte oberhalb eines Vorrats
von Flüssigkeit zu
unterstützen.
Der Körper
kann ferner mehrere erste und zweite Löcher definieren, wobei jedes
erste Loch in Flüssigkeitsverbindung
mit einem entsprechenden der zweiten Löcher ist, um eine MWP auszubilden.
In einem weiteren Aspekt definiert der Körper eine Anordnung von ersten
und zweiten Löchern, zum
Beispiel 12, 24, 48, 96, 384 oder 1536 erste und zweite Löcher, wobei
jedes ersten Loch in Flüssigkeitsverbindung
mit einem entsprechenden der zweiten Löcher ist. Die ersten und zweiten
Löcher
weisen vorzugsweise zylindrische Formen auf.
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In
noch einem andere Aspekt ist die obere Oberfläche des Körpers ausgestaltet, um eine
darauf angeordnete Abdeckplatte aufzunehmen. Die Abdeckplatte ist
vorzugsweise lichtdurchlässig
und die Oberkante des ersten Lachs ist ausgestaltet, um auch Licht
durchzulassen, wodurch ein Pflanzengewebewachstum gefördert wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
weist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer
Platte zum Halten einer porösen
Fritte, die ein Gewebe unterstützt,
auf, wobei die poröse
Fritte mit einem Medium getränkt
ist. Das Medium wird regelmäßig von
einer Pipettenvorrichtung abgesaugt und aufgefrischt, um ein Wachstum
des Gewebes zu fördern.
Das Verfahren weist ein Bereitstellen eines Körpers mit einer oberen Oberfläche und
ein Definieren eines ersten und zweiten Lochs in dem Körper auf. Ein
Definieren eines ersten Lochs in dem Körper weist ein Bohren durch
die obere Oberfläche
des Körpers,
um eine Oberkante eines ersten Lochs auszubilden, und ein Bohren
unterhalb der oberen Oberfläche
auf, um ein Unterteil des ersten Lochs auszubilden. Das zweite Loch
wird durch Bohren durch die obere Oberfläche des Körpers, um eine Oberkante des
zweiten Lochs auszubilden, und ein Bohren unterhalb der oberen Oberfläche definiert,
um ein Unterteil des zweiten Lochs auszubilden. Die Unterteile des
ersten und zweiten Lochs sind durch Ausbilden eines Durchlasses
in dem Körper
und zwischen dem Unterteil des ersten Lochs und dem Unterteil des zweiten
Lochs über
eine Flüssigkeitsverbindung
verbunden. Vorzugsweise ist der Durchlass durch Einführen einer
Sägescheibe
in das Unterteil des ersten Lochs und Bewegen der Säge seitlich
bis zum Treffen auf das Bodenteil des zweiten Lochs ausgebildet.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform weist
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verwenden einer MWP
auf. Eine Fritte wird in jedes der mehreren ersten Löcher gelegt
und Gewebe, vorzugsweise ein Wasserlinsen- oder anderes Pflanzengewebe,
wird auf die Fritte gelegt. Ein Medium wird auf jedes der mehreren
ersten Löcher
ausgegeben. Eine Pipette wird in jedes der mehreren zweiten Löcher eingesetzt
und verwendet, um das Medium aus den ersten Löchern abzusaugen. Das Medium
wird durch Anwenden eines Saugdruckes auf die zweiten Löcher unter
Verwendung der Pipette abgesaugt. Der Saugdruck zieht das Medium
aus dem ersten Loch in das zweite Loch und in die Pipette, um so
das Medium aus der Platte zu spülen.
Frisches Medium kann wieder in die mehreren ersten Löcher nach
einem Absaugen des Mediums durch die zweiten Löcher ausgegeben werden.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform weist
die vorliegende Erfindung ein Frittenmaterial zum Unterstützen eines
Gewebes auf, welches eine poröse
Struktur, eine obere Oberfläche
und eine untere Oberfläche
aufweist. Die poröse
Struktur weist hydrophile Eigenschaften und mehrere Zwischenräume auf.
Die obere Oberfläche
ist ausgestaltet, um das Gewebe zu stützen. Die untere Oberfläche ist
in Flüssigkeitsverbindung
mit einem Vorrat von flüssigem
Medium. Die hydrophilen Eigenschaften der porösen Struktur transportieren
die Flüssigkeit
derart in ihre Zwischenräume,
dass das gestützte
Gewebe mit ausreichend flüssigem
Medium von dem Vorrat versorgt wird, um ein Wachstum des Gewebes
zu fördern.
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Die
vorliegende Erfindung weist mehrere Vorteile auf. Zum Beispiel müssen die
Gewebeproben in den Wells nicht bewegt oder gestört werden, wenn das zugeführte Medium
verbraucht ist, was eine Arbeitsbelastung herabsetzt und sterile
und optimale Wachstumsbedingungen sicherstellt. Die Platten können mit
herkömmlichen
Pipettenköpfen
zum Handhaben von Flüssigkeiten
mit festen Spitzen oder individuell steuerbaren Spitzenvarianten
verwendet werden, da die Absauglöcher
von der oberen Oberfläche
des Körpers,
d.h. einer von oben zu befüllenden
Anordnung, zugreifbar sind. Die Verwendung einer Roboterflüssigkeitshandhabungsvorrichtung
mit der Platte fördert
eine Well zu Well übereinstimmende
Behandlung des Gewebes sowie das effiziente Entfernen und Ersetzen
des Mediums. Der von oben zu befüllende
Aspekt ermöglicht
die Verwendung eines Standarddeckels für eine sterile Bedienung und
beseitigt den Bedarf für
eine getrennte Vakuumverteilerstation zum Herausziehen des Mediums.
Das Fehlen eines Verteilers ermöglicht
die unterschiedliche Behandlung eines jeden Wells und stellt Flexibilität bei der
Flüssigkeitshandhabungsvorrichtungsausführung und
-auswahl sowie bei experimentellen Ausführungen und Probenabfragefunktionen
bereit. Die Flüssigkeitsköpfe können ausgestaltet
werden, das Medium zu entfernen sowie neues Medium hinzuzufügen ohne
Werkzeuge oder Pipettenspitzen zu ändern.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Nachdem
somit die Erfindung in allgemeinen Worten beschrieben wurde, wird
jetzt Bezug auf die beigefügten
Zeichnungen genommen, welche nicht notwendigerweise maßstabsgerecht
gezeichnet sind, und wobei
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1 eine
Draufsicht einer MWP zum Austauschen eines flüssigen Mediums einer ersten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist;
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2 eine
vergrößerte Querschnittsansicht eines
einzelnen Wells und eines Absauglochs der MWP der 1 ist;
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3 eine
perspektivische Ansicht einer Spitzendichtung einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist;
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4 eine
perspektivische Ansicht eines Systems einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zum Auffrischen eines Mediums in der
in 1 gezeigten MWP ist;
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5 ein
Flussdiagramm eines Verfahrens zum Auffrischen eines Mediums, welches
in dem System der 4 verwendet wird, ist; und
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6 eine
Schnittansicht des Wells und des Absauglochs der 2 ist,
welche in einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wird jetzt im Folgenden unter Bezugnahme auf
die bei gefügten Zeichnungen
vollständiger
beschrieben werden, in welchen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
gezeigt sind. Diese Erfindung kann jedoch in vielen verschiedenen
Formen ausgeführt
werden und sollte nicht als auf die hierin dargelegten Ausführungsformen
begrenzt ausgelegt werden; vielmehr werden diese Ausführungsformen
bereitgestellt, so dass diese Offenbarung genau und vollständig sein wird
und den Umfang der Erfindung dem Fachmann vollständig übermitteln wird. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen
durchwegs gleiche Elemente.
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Eine
Mehrfach-Well-Platte (multiple well plate, MWP) 10 der
vorliegenden Erfindung weist einen Körper 12 mit einer
oberen Oberfläche 14 auf.
Der Körper 12 definiert
eine Anordnung von ersten Löchern
oder Wells 16 und eine Anordnung von zweiten Absauglöchern 22,
wie in 1 gezeigt. Mehrere Kanäle 28 verbinden jeweils
ein entsprechendes der Wells 16 mit einem benachbarten
der Absauglöcher 22,
wie in 2 gezeigt. In einer Ausführungsform ist in jedem der
Wells 16 eine poröse,
hydrophile Fritte 30 angeordnet, welche eine Gewebeprobe 32 über einem
Vorrat von flüssigem
Medium 36 stützt.
Die porösen,
hydrophilen Eigenschaften der Fritte 30 transportieren
das Medium 36 nach oben, um das Medium der Gewebeprobe 32 zuzuführen. Ein
Austauschen von altem, erschöpftem
Medium 36 wird durch die Absauglöcher 22 ermöglicht,
welche jeweils dimensioniert und ausgestaltet sind, um eine Pipettenspitze 34 aufzunehmen.
Mehrere der Pipettenspitzen sind während eines Absaugens in die
Absauglöcher 22 eingeführt und
bringen einen Unterdruck auf. Der Unterdruck zieht das flüssige Medium 36 aus
jedem der Wells 16 durch die Kanäle 28, durch das eine
benachbarte der Absauglöcher 22 und
in die Pipettenspitzen.
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Die
Gewebeprobe 32 ist vorzugsweise ein Pflanzengewebe, wie
zum Beispiel Dikotyledon- und Monokotyledongewebe, wie zum Beispiel
Gewebe von Mais (Zea mays), Brassica sp. (zum Beispiel B. napus,
B. rapa, B. juncea), insbesondere die als Quellen von Samenöl verwendbaren
Brassica-Spezien, Alfalfa (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen
(Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse
(zum Beispiel Perlhirse (Pennisetum glaucum), Rispenhirse (Panicum
miliaceum), Kolbenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine
coracana)), Sonnenblume (Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius),
Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana
tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle
(Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus),
Maniok (Maniho esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokusnuss (Cocos
nucifera), Ananas (Ananas comosus), Zitrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma
cacao), Tee (Camilla sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea
americana), Feige (Ficus casica), Guave (Psidium guajava), Mango
(Mangifera indica), Olive (Olea europea), Papaya (Carica papaya),
Kashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia),
Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Zuckerrohr
(Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Koniferen.
In einigen Ausführungsformen
ist das Gewebe Kallus-Gewebe von Wasserlinsen oder Gymnospermen.
Die vorliegende Erfindung kann insbesondere mit Pflanzengeweben, welche
mit wenig Wasser gedeihen, wie zum Beispiel ein aus Gymnospermen
abgeleitetes Gewebe, wirksam sein.
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Der
Körper 12 der
MWP 10 ist vorzugsweise aus einem Polycarbonatblock hergestellt,
welcher maschinell hergestellt werden kann und gegenüber Hitze
widerstandfähig
genug ist, um in einem Autoklav zur Wiederverwendung sterilisiert
zu werden. Im Allgemeinen ermöglicht
die Härte
des Polycarbonats, dass er mit einer computergesteuerten Fräsmaschine
(CNC) oder anderen automatischen Herstellungsverfahren in komplexe
Präzisionsformen
maschinell hergestellt wird. Der Körper kann auch aus anderen Materialien
hergestellt werden, wie zum Beispiel einem Polystyrol, Polysulfon,
andere synthetische Materialien, Metalle, Keramiken, Glas usw. Der
Körper 12 hat
eine rechteckige Form und eine Länge
von 12,78 ± 0,03
cm (5,03 ± 0,01
Inch), eine Breite von 8,55 ± 0,03
cm (3,365 ± 0,01
Inch) und eine Höhe
von 2,07 ± 0,03
cm (0,813 ± 0,01
Inch), eine mit den meisten üblichen
Flüssigkeitshandhabungsmaschinen kompatible
Form. Der Körper 12 weist
weitere Merkmale auf, wie zum Beispiel eine Basis 13 und
ein Paar von 45°-Abschrägungen 15 an
gegenüberliegenden
Ecken der Breite des Körpers.
Die Basis 13 stellt einen Vorsprung bereit und kann als
eine Griff- oder Befestigungsoberfläche in einer herkömmlichen Anlage
dienen. Das Paar von Abschrägungen 15 kann
als Referenzmarkierungen dienen, um die richtige Ausrichtung des
Körpers
sicherzustellen, besonders wenn es wichtig ist, den Ort eines jeden
Wells im Auge zu behalten. Der Körper 12 weist
ferner eine flache obere Oberfläche 14 auf,
durch welche die Löcher 16 und 22 gebohrt
sind. Es sollte erwähnt
werden, dass, obwohl die Abmessung des Körpers vorzugsweise ausgestaltet
ist, um kompatibel mit zuvor bestehenden Einrichtungen zu sein,
die Abmessungen des Körpers
wie gewünscht
verändert
werden können.
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Die
Anzahl, Abmessungen und Orte der Wells 16 sind auch zugeschnitten,
um kompatibel mit zuvor existierenden Anlagen zu sein. Zum Beispiel weist
die Platte vorzugsweise 24 Wells in einer Anordnung von 4 mal 6
oder 48 Wells in einer Anordnung von 6 mal 8 auf, um kompatibel
mit den meisten Flüssigkeitshandhabungsvorrichtungen
zu sein. Weitere Well-Dichten können
verwendet werden, wie zum Beispiel 6 Wells oder 96 Wells, welche
kompatibel mit herkömmlichen
Vorrichtungen sind. Es können
jedoch auch nicht standardisierte Well-Dichten verwendet werden,
wie zum Beispiel ein einzelnes Well oder 1000 Wells. Im Allgemeinen
wird die Anzahl der Wells durch derartige praktische Gegebenheiten
begrenzt werden, wie die Größe des Körpers 12,
der Typ des Gewebes, welches gezüchtet
wird, die Kapazitäten
der Anlagen, welche die Wells verwenden, und die Größe der Wells
selbst.
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Vorzugsweise
weist jeder der Wells 16 eine normale zylindrische Form
mit einem Durchmesser von 1,57 cm (0,62 Inch) und einer Tiefe von
1,52 ± 0,03
cm (0,60 ± 0,01
Inch) für
die 24 Well-Platte auf. Der Durchmesser eines jeden Wells kann wie
gewünscht
verändert
werden und basiert auf mehreren Faktoren, wie zum Beispiel die anfängliche
Größe des in
dem Well anzuordnenden Gewebes, die Wachstumsrate des Gewebes und
die Zeitdauer, in der sich das Gewebe in dem Well ausbreiten soll
bevor es entfernt wird. Ein Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den
Wells beträgt
1,93 cm (0,76 Inch) für
die 24 Well-Platte,
um sicherzustellen, dass die Anordnung und Bewegung einer normalen
automatisierten Pipettenvorrichtung kompatibel ist. Die 24 Well-Platte,
welche ein bevorzugtes Gleichgewicht von Gewebe 32 Volumen
und Well-Dichte darstellt, wurde von den Erfindern befunden, speziell
für die
Gewebeausbreitung von Wasserlinsenkallus geeignet zu sein. Die Dichte
der Zellenwells 16, welche für Wasserlinsen verwendet werden,
beträgt
vorzugsweise 96 Wells oder weniger aufgrund der Größe des Kallus und
dem schnellen Zellenwachstum. Natürlich können andere Anordnungen für besser
an Kundenwünsche
angepasste Anlagen verwendet werden, falls gewünscht.
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Die
Absauglöcher 22 erstrecken
sich durch die obere Oberfläche 14 des
Körpers 12.
Jedes der 24 Absauglöcher 22 ist
vorzugsweise benachbart zu und in Flüssigkeitsverbindung mit einem
entsprechenden der Wells 16 verbunden. Die paarweise Anordnung
der Absauglöcher 22 und
der Wells 16 ermöglicht
ein Absaugen ohne Kreuzverunreinigung der Proben, wie sie zum Beispiel
mit Verteiler-Well-Platten gemäß dem Stand
der Technik auftreten. Außerdem
ermöglicht
die paarweise Anordnung, dass das Medium von einzelnen interessanten Wells 16 wahlweise
abgesaugt und aufgefrischt werden kann. Einzelne Wells 16 können wahlweise
von Hand oder von einer automatisierten Anlage, welche den Betrieb
einer einzelnen Pipette unabhängig
von anderen Pipetten in dem Kopf ermöglicht, behandelt werden. Wahlweises
Behandeln von Wells wäre nützlich,
wenn zum Beispiel das Gewebe in einem der Wells eine starke Äußerung als
Antwort auf ein Mittel erzeugt, wie zum Beispiel erhöhtes Wachstum des
Gewebes, erhöhtes
Ausdrücken
eines Polypeptids, erhöhte
Widerstandsfähigkeit
gegenüber
einem ausgewählten
Mittel, wie zum Beispiel einem Herbizid, oder Widerstand gegen ein
Pflanzenpathogen. Weitere biochemische oder biophysikalische Reaktionen
können
mit der vorliegenden Erfindung in einzelnen Wells untersucht werden.
Das Medium von diesem Well kann häufiger als von den anderen
Wells abgesaugt und überprüft werden.
Neben anderen Vorteilen stellt ein häufigeres Sammeln und Überprüfen des
Mediums von diesem Well eine stärkere
statistische Korrelation bereit. Wenn eine Verunreinigung weniger
bedenklich ist, kann jedes der Absauglöcher 22 mit mehreren
Wells 16 verbunden werden, um die Anzahl der Absaugschritte
zu reduzieren.
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Jedes
der Absauglöcher 22 hat
auch vorzugsweise eine zylindrische Form mit einer Tiefe von 1,68 ± 0,03
cm (0,66 ± 0,01
Inch) und einen Durchmesser von 0,424 cm (0,167 Inch), um geeignet
zu sein, eine Pipettenspitze 34 von normaler Größe durch
seinen oberen Rand 24 aufzunehmen. Größere oder kleinere Durchmesser
und unterschiedlichen Mitte-zu-Mitte-Abständen können in
Abhängigkeit von
der Größe der darin
einzusetzenden Pipettenspitze verwendet werden. Natürlich können die
sonstigen Formen und sonstigen Abmessungen verändert werden, um zu einer kundenspezifischen
Anordnung oder anderen Standardpipettenformen und -längen, die
dem Fachmann bekannt sind, zu passen. Ferner sind zylindrische Absauglöcher 22 wünschenswert, da
sie mit drehenden Bohrern leichter maschinell hergestellt werden
können.
Der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen benachbarten Absauglöchern 22 ist
vorzugsweise der gleiche wie der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen
den Wells 16, welcher in der dargestellten Ausführungsform
mit 24 Wells 1,93 cm (0,76 Inch) beträgt. Die Platzierung der Absauglöcher durch
die obere Oberfläche 14 des
Körpers 12 und der
gleiche Mitte-zu-Mitte-Abstand stellen sicher, dass die gleiche
Pipettenkopfkonfiguration für
ein Absaugen des Mediums 36 verwendet werden kann wie für das Verteilen
des Mediums.
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Jeder
der Kanäle 28 verbindet
ein entsprechendes Paar von Zellenwells 16 und Absauglöchern 22 über eine
Flüssigkeitsverbindung,
wie in 2 gezeigt. Jeder der Kanäle 28 weist vorzugsweise
aufgrund des bevorzugten Herstellungsverfahrens, welches zum Erzeugen
der Kanäle,
wie nachfolgend beschrieben werden wird verwendet wird, eine näherungsweise
elliptische Form auf. Jeder der Kanäle ist unterhalb einem Unterteil
von einem der Wells 16 und der Absauglöchern 22 ebenfalls
aufgrund des bevorzugten Herstellungsverfahrens angeordnet. Viele
Arten von Formen können
für den
Kanal 28 verwendet werden, da die Druckverteilung des durch
die Pipette 34 angewendeten Vakuums über das Zellenwell, welches
abgesaugt wird, immer gleich verteilt sein wird. Jeder der Kanäle 28 arbeitet
zusammen mit dem entsprechenden einen der Wells 16 und
der Löcher 22 als
ein Vorratsbehälter
für überschüssiges Medium 36,
welches nicht in die Fritte 30 transportiert wurde. Zusätzlich zum
Bereistellen eines Vakuums zum Absaugen können die Kanäle 28 und
Absauglöcher 22 auch
verwendet werden, um Medium 36 zuzuführen. Ein Zuführen eines
Mediums durch die Kanäle 28 und
Absauglöcher 22 zu
den Wells 16 kann nützlich
sein, wenn zum Beispiel der Kallus des Pflanzengewebes 32 dicht
genug ist, um verhältnismäßig undurchlässig für ein Medium
zu sein, welches durch die Oberkante des Wells 16 verabreicht
wird. Vorzugsweise ist die Breite eines jeden der Kanäle 28 kleiner
als der Durchmesser des entsprechenden Wells 16, um einen
Vorsprung 29 an dem Boden des Wells zum Stützen der
Fritte 30 über
dem Medium 36 auszubilden.
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Jede
Fritte 30 ist vorzugsweise aus einem gesinterten Polyethylenmaterial
hergestellt, welches porös
und hydrophil ist, um das Anziehen und Zurückhalten des Mediums innerhalb
seiner Zwischenräume
zu fördern.
Die hydrophile Eigenschaft des Frittenmaterials kann permanent oder
zeitweise in Abhängigkeit
von dem Verfahren, von welchem es verwendet wird, oder ob das Material
inhärent
hydrophil ist, sein. Alternative Materialien mit porösen Strukturen
können
verwendet werden und ein oberflächenaktiver
Stoff kann auf Materialien verwendet werden, welche von Natur aus
nicht hydrophil sind, um sie hydrophil zu machen. Das Material wird
durch Sintern hergestellt und überträgt Lösungen durch
Kapillarwirkung und kann als eine sterile Grenzschicht aufgrund
seiner gewundenen Pfadeigenschaften arbeiten. Die Fritten werden
vorzugsweise in Scheibenformen, welche näherungsweise kongruent mit
den Wells 16 sind, aus einer porösen 0,635 cm (¼ Inch) dicken
Polyethylenschicht mit einer mittleren Porengröße von 90 bis 130 μm geschnitten
oder gestanzt, wie sie als Porex von Porous Products of Fairburn, Georgia
und auch als Teile Nr. Y2-PEH-250/90 von Small Parts Inc., Miami
Lakes, FL bekannt ist. Derartige Fritten können näherungsweise 550 μl eines Mediums
aufnehmen und das Gewebe für
einige Tage versorgen.
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Die
Kongruenz der Form zwischen der Fritte 30 und ihrem einen
entsprechenden der Wells 16 stellt eine Passung mit einem
minimalen Auslaufen des Mediums 36 um die Fritte sicher
und stellt auch sicher, dass die Fritte fest auf dem Vorsprung 29 oberhalb
des meisten des Mediums aufliegt. Unterschiedliche Dicken der Fritte
können
verwendet werden, wobei dickere Fritten im Allgemeinen mehr Material
aufnehmen und weniger häufig
mit neuem Medium aufgefrischt werden müssen. Eine Fritte mit größeren Durchmesser
kann für
Wells 16 mit größerem Durchmesser
verwendet werden, kann aber einen Verteiler unterhalb als eine zusätzliche
Stütze
erfordern, um die Fritte 30 mit dem großen Durchmesser vor einem Zusammenfallen
unter dem angewendeten Vakuumdruck zu bewahren. Zum Beispiel kann eine
Fritte 30 mit einem großen Durchmesser durch ein Sieb,
welches auf der Rückseite
des Frittenmaterials angeordnet wird, wenn das Frittenmaterial hergestellt
wird, unterstützt
werden. Trotz des möglichen Bedarfs
an einem unterstützenden
Verteiler sind die Fritten typischerweise erheblich stabiler als
vergleichbar dimensio nierte Membran- oder Papierträger, welche
nicht einmal gemäßigte Vakuumdrücke, welche
von der Pipettenspitze während
des Absaugens angewendet werden, aushalten. Das Frittenmaterial
der vorliegenden Erfindung sollte vorzugsweise geeignet sein, Drücken von
näherungsweise
76 cm (30 Inch) Hg (Quecksilbersäule)
auszuhalten. In noch einer weiteren Ausführungsform kann das Gewebe 32 auf
einer Schicht des Frittenmaterials gezüchtet werden und dann in einzelne
Fritten zum Platzieren in den Wells 16 geschnitten oder
gestanzt werden.
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Die
MWP 10 wird vorzugsweise aus einem Block von Polycarbonatmaterial
von näherungsweise den
gleichen rechteckigen Abmessungen wie der Körper 12 hergestellt.
Ein Herstellen der Platte aus einem einzelnen Block eines Materials
sichert gegen Undichtigkeiten zwischen Wells, was eine Kreuzverunreinigung
der Proben zur Folge haben könnte.
Die Wells 16 und die Absauglöcher 22 werden vorzugsweise
durch Verwendung einer CNC oder einer anderen automatisierten Bohrmaschine
mit Bohrern von ähnlichen
Abmessungen wie die gewünschten
Lochabmessungen ausgebildet. Falls erforderlich schneidet die Bohrmaschine
auch genug Polycarbonat weg, um die Basis 13, den Einsatz
oberhalb der Basis und die Abschrägungen 15 auszubilden
und entfernt genug Material, um weitere Oberflächen, wie zum Beispiel die
obere Oberfläche 14,
abzuflachen. Der Kanal 28 wird vorzugsweise unter Verwendung eines
sich drehenden Sägeblatts 80 auf
der gleichen Fräsmaschine
ausgebildet. Das sich drehende Sägeblatt
weist einen Schneiddurchmesser von etwas weniger als dem Well 16 auf
und wird in eins von den Wells eingesetzt bis es eine Tiefe gleich
der Dicke des sich drehenden Sägeblatts 80 weggeschnitten hat,
wie in 6 gezeigt. Das sich drehende Sägeblatte wird dann in die Richtung
des einen benachbarten der Absauglöcher 22 vorwärts bewegt,
bis es genug in das Absaugloch einschneidet, um den Kanal 28 mit
ausreichender Größe auszubilden,
um eine Flüssigkeitsverbindung
zwischen dem Well und dem Absaugloch wie in 2 gezeigt
zu ermöglichen.
Das Sägeblatte 80 wird
dann zurück
in die Mitte des Wells bewegt und aus dem Well herausgezogen. Der
unterdimensionierte Durchmesser des Sägeblatts bildet den Vorsprung 29 aus,
auf welchem die Fritte 30 gehalten wird.
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Wie
in 2 und 3 gezeigt, kann die vorliegende
Erfindung ferner eine Dichtung 35 aufweisen, welche die
Pipettenspitze 34 umfasst und um die Oberkante 24 von
einem der Ansauglöcher 22 angeordnet
ist, wenn die Spitze darin eingesetzt ist. Die Dichtung 35 weist
einen Elastomerring 50 auf, welcher unter einem festen
Rand 51 liegt. Der feste Rand ist vorzugsweise aus einem
steifen Material, wie zum Beispiel aus einer Stahlhülse, hergestellt und
weist optional eine Einstellschraube 52 auf, welche sich
durch seine Seite erstreckt. Festziehen der Einstellschraube spannt
den Rand um die Pipettenspitze 34, was dem festen Rand 51 ermöglicht,
eine Aufwärtswanderung
des Elastomerrings 50 zu verhindern, wenn dieser gegen
die Oberkante 24 des Absauglochs gedrückt wird. Das Ende des Elastomerrings 50,
welches in Berührung
mit der Oberkante 24 des Absauglochs ist, kann eine kegelstumpfartige Form
mit einem bevorzugten Winkel von näherungsweise 70° aufweisen,
um ferner ein Ausbilden einer vakuumdichten Abdichtung zu unterstützen. Die Dichtung 35 hat
ferner vorzugsweise einen Durchmesser von näherungsweise 0,3 Inch und ist
0,5 Inch lang, um an eine Standardpipettenspitze zu passen. Zum
Beispiel eine TECAN-Pipettenspitze
Nr. 71-7005 mit einer PTFE (TEFLON)-Beschichtung, einem Innenspitzendurchmesser
von 0,5 mm, einem Außenspitzendurchmesser
von 1,1 mm, einem Innenkörperdurchmesser
von 1,5 mm und einem Außenkörperdurchmesser
von 2,0 mm.
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Der
Elastomerring 50 kann ferner ausgestaltet sein, um auf
einen beliebigen Typ von Pipettenspitzen zu passen, indem seine Öffnung 53 auf
näherungsweise
90% des weitesten Außendurchmessers der
Pipettenspitze dimensioniert wird, was der Dichtung ermöglicht,
sich um die Spitze zu pressen, während
sie sich auf ihre normale Form entspannt, wenn sie von dem Absaugloch
entfernt wird. Umgekehrt weist der feste Rand 51 eine Öffnung auf,
welche 10% in Bezug auf den Außenseitendurchmesser
der Pipettenspitze 34 überdimensioniert
ist, was ihm ermöglicht,
die Pipettenspitze einfach aufzunehmen. Die Öffnung des Rands wird verkleinert,
wenn die Einstellschraube 52 angezogen wird, um den Rand um
die Pipettenspitze 34 zu sichern. In einer alternativen
Ausführungsform
kann die Dichtung 35 integriert mit der Pipettenspitze 34 ausgestaltet
sein. In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein weiches
Dichtungsmaterial um die Oberkante 24 der Absauglöcher verwendet
werden, um eine Spitze ohne die Dichtung 35 abdichtend
aufzunehmen.
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Die
MWP 10 wird verwendet, um Gewebewachstum und Ausbreitung
durch Liefern von Nährstoffen
in einer sterilen Umgebung zu fördern.
Das Verfahren zur Verwendung der MWP weist entweder ein manuelles
Befüllen
der Platte oder ein Verwenden eines Zellensortierers, welcher modifiziert
wurde, um Gewebeproben zu sortieren, wie zum Beispiel derartige,
welche zum Sortieren von Taufliegen verwendet werden, auf. Im Allgemeinen
verwendet diese Anlage ein Vakuum, um die Proben aufzunehmen. Der
nicht modifizierte Zellensortierer kann verwendet werden, wenn die
Gewebeproben klein genug sind. Die MWP 10 ist vorzugsweise
mit einer transparent Polystyrolabdeckung oder einem transparenten
Polystyroldeckel abgedeckt, um eine Übertragung von Licht zu dem
Gewebe zu ermöglichen.
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Sobald
das Gewebe 32 in den Wells 16 der Platte ist,
wird die Platte für
einen Zugriff durch eine Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung,
welche Mehrfachpipettenspitzen aufweist, die mit einem Medium und
einer Vakuumversorgung verbunden sind, gestapelt. Die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung
greift die Platte und entfernt den Deckel in einer dem Fachmann
bekannten Art und Weise. Die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung
fährt jede
Pipettenspitze 34 in ein entsprechendes der Absauglöcher 22 aus,
bis die Dichtung 35 gegen die Oberkante 24 des
Absauglochs und den Anteil der oberen Oberfläche 14 dort herum
anstößt. Die
Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung
gibt Medium durch die Spitzen in die Absauglöcher 22, durch die
Kanäle 28 und
in die Wells 16 ab. Auf diese Art und Weise hat das Gewebe 32 in jedem
der Wells 16 Zugriff zu einer Zulieferung des Mediums durch
die Fritte 30. Der Deckel wird wieder auf der Platte 10 angeordnet
und die Platte wird in einem Kulturraum mit einer Beleuchtung zum
Fördern des
Wachstums (in diesem Fall von Pflanzengeweben) platziert.
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Nachdem
das Gewebe wesentliche Nährstoffe
in dem Medium 36 verringert hat oder das Medium aus anderen
Gründen
ausgetauscht werden muss, wird die Platte 10 zurück auf die
Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung
geladen. Der Deckel wird von der Platte entfernt. Die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung
fährt jede
Pipettenspitze 34 in ein entsprechendes der Absauglöcher 22 heraus,
bis die Dichtung 35 gegen die Oberkante 24 des
Absauglochs und den Abschnitt der oberen Oberfläche 14 dort herum
anstößt. Die
Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung
wendet ein Vakuum oder einen Saugdruck durch die Pipettenspitzen
an, welches/welcher das Medium aus den Zellwells 16 durch
die Kanäle 28 in
die Ansauglöcher 22 und
in die Pipettenspitzen saugt, um ein Absaugen auszuführen. Das
Medium wird sooft wie benötigt
durch Wiederholen des obigen Verfahrens zyklisch ausgetauscht.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird ein automatisierter Pipettierkopf (oder eine Roboterflüssigkeitshandhabungsvorrichtung) 60 verwendet,
um einzelne oder mehrere Wells ausgewählt zu behandeln, wie zum Beispiel
die GENESIS-Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung
(TECAN, AG der Schweiz), wie in 4 gezeigt.
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Der
Roboter ist mit einem Sechswegeventil zum Umschalten zwischen unterschiedlichen
Medien-, Reagenz- und Ethanolversorgungen ausgerüstet. Der Roboter weist acht
Pipettierspitzen 61 an seinem Flüssigkeitshandhabungsarm 62 auf.
Vier der Spitzen sind ausgestaltet, um Medium zu mehreren der Mehrfach-Well-Platten 63,
welche auf seinem Boden 64 gelagert sind, zu liefern. Die
vier übrigen
Spitzen sind jeweils in eine Spitzendichtung eingepasst, welche
den vier übrigen
Spitzen ermöglicht,
die Wells 16 durch ihre entsprechenden Absauglöcher 22 abzusaugen.
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Vorzugsweise
wird die Roboterflüssigkeitshandhabungsvorrichtung 60 durch
Verwendung eines Softwareprogramms zum Steuern des Ausfahrens ihrer
Pipettenspitzen 61 in einer derartigen Art und Weise betrieben,
um eine Kreuzverunreinigung zwischen den Wells 16 zu minimieren.
Eine Verunreinigung der vier medienzuführenden Spitzen wird während der
Mediumzuführung
durch Schweben der Medienzuführungsspitzen über den
Wells, ohne die Platten zu berühren,
vermieden. Eine Verunreinigung der Absaugspitzen wird durch Spülen jeder
Spitze mit einer antimikrobiellen Ethanolflüssigkeit zwischen den Absaugzyklen
vermieden. Das Äußere der
Spitzen und Dichtungen wird in einer Oberflächenwaschstation 65 auf
dem Boden gewaschen, welche auch mit Ethanolflüssigkeit gefüllt ist.
Das Ethanol wird von einer Spritzenpumpe und/oder einer Hochgeschwindigkeits-(Schnellwasch-)Membranpumpe
von einem Vorratsbehälter,
welcher durch das Sechswegeventil zugreifbar ist, gepumpt.
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Ein
Programmieren des Roboters 60, um die richtigen Löcher anzusteuern
erfordert, dem Roboter die Stelle von sowohl den Absauglöchern 22 als
auch den Wells 16 beizubringen. Auf diese Art und Weise wird
der Roboter betrieben, als ob die Platte 10 zweimal so
viele Wells aufweisen würde,
da die Absauglöcher 22 entsprechend
der Wells einer Platte mit der doppelten Dichte angeordnet sind.
Die Tatsache, dass die Absauglöcher
einen kleineren Durchmesser als die Wells 16 aufweisen,
hat keine Auswirkungen, da der Roboter die Mitte der Absauglöcher 22 sucht. Zum
Beispiel wird der Roboter zum Ansteuern einer 24 Well-Platte so
programmiert, als ob sie 48 Wells hätte, wobei jedes Well einen
Durchmesser gleich dem der von den Absauglöchern aufweist. Besonders die
Programmierung der Well-Mitten (oder ihrer Stellen in Bezug auf
die Absauglöcher)
kann wegen des viel kleineren Durchmessers der Pipettenspitzen 61 bezogen
auf die Wells beträchtlich
daneben sein.
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5 stellt
ein Beispiel dar, wie der Roboter 60 programmiert werden
kann, um die Wells 16 und die Absauglöcher 22 der Platte 10 zu
behandeln. Zuerst werden die vier Mediumzuführungsspitzen über den
Wells 105–108 angeordnet
und, ohne die Platte 10 zu berühren, Medium in die Wells in
Schritt 125 abgegeben. Die Mediumzuführungsspitzen werden dann der
Reihe nach nach oben positioniert und geben Medium in die Wells 113–116 und 121–124 in den
Schritten 126 bzw. 127 ab. Die vier Absaugspitzen
werden dann in die Absauglöcher
(welche der Roboter als „Wells" erkennt) 101–104 eingeführt, und saugen
das verbrauchte Medium von den Wells 105–108 in
Schritt 128 ab. Nach dem Absaugen werden die Absaugspitzen
innen gespült
und außen
mit Ethanol an der Waschstation 65 im Schritt 129 gereinigt.
Absaugen und Reinigen werden abwechselnd für Löcher 109–112 in
den Schritten 130 und 131 und wieder für Absauglöcher 117–120 in
den Schritten 132 und 133 durchgeführt. Es
sollte erwähnt
werden, dass der Vorgang in Abhängigkeit
von der Anzahl der Pipettierspitzen und der Anzahl der Wells erweitert oder
reduziert werden kann. Zusätzlich
wird das Verfahren vorzugsweise innerhalb einer HEPA-gefilterten
Umgebung durchgeführt,
wie zum Beispiel einer unter Druck stehenden und gefilterten Haube,
um das Auftreten einer Verunreinigung zu minimieren.
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Der
Roboter 60 kann ferner in Verbindung mit einer hochdichten
Unterbringung oder einem Gestell zum Halten und Zuführen von
Licht zu den Geweben in hunderten von Platten verwendet werden, wie
in der demselben Anmelder gehörenden
US-Patentanmeldung
10/080,918 mit dem Titel „LED
Array for Illuminating Cell Well Plates and Automated Rack Systems
for Handling the Same" beschrieben
ist, welche durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen wird. Das automatisierte
Gestellsystem verwendet seinen eigenen Roboter, um die Platten handzuhaben
und dem Roboter des vorliegenden Systems vorzulegen.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform kann
die Well-Platte und das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, um eine feste Phasenextraktion durchzuführen. Jedes Well der Well-Platte
enthält
eine Matrix, welche zwischen einem Paar von Fritten, welche eine
Säule ausbilden, eingeschlossen
ist. Verschiedene Verbindungen (zum Beispiel Liganden oder Antikörper) werden durch
die Säule
gedrückt
und werden innerhalb der Matrix gefangen. Nach einer Festephasen-Extraktion kann
ein Mittel durch die Säule
gedrückt
werden, um die feste Phase aufzubrechen. Eine Hochdurchsatzverteilung
und Rückgewinnung
der Verbindung, Mittel usw. kann von einem automatisierten Pipet tierkopf unter
Verwendung der Wells und ihrer entsprechenden Absauglöcher gehandhabt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung weist verschiedene Vorteil auf. Zum Beispiel
müssen
die Gewebeproben 32 in den Wells 16 nicht bewegt
oder gestört
werden, was die Arbeitsbelastung reduziert und sterile und optimale
Wachstumsbedingungen sicherstellt. Die Platten 10 können mit
herkömmlichen
flüssigkeitshandhabenden
Pipettenköpfen
verwendet werden, da die Absauglöcher 22 von
der oberen Oberfläche
des Körpers
zugreifbar sind, d.h., eine von oben zu befüllende Anordnung. Die Verwendung
von Roboterflüssigkeitshandhabungsvorrichtungen
mit der Platte fördert
eine Well zu Well übereinstimmende Behandlung
der Gewebe sowie das wirksame Entfernen und Ersetzen des Mediums 36.
Der von oben zu beladende Aspekt ermöglicht die Verwendung eines Standarddeckels
für eine
sterile Bedienung und beseitigt die Notwendigkeit für eine getrennte
Vakuumverteilerstation zum Heraussaugen des Mediums. Das Fehlen
von einem Verteiler ermöglicht
die unterschiedliche Behandlung von jedem Well und bietet Flexibilität bei der
Gestaltung und Auswahl der Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung.
Der Flüssigkeitskopf
kann ausgestaltet sein, das Medium zu entfernen sowie neues Medium
hinzuzufügen
ohne Werkzeuge oder Pipettenspitzen auszutauschen.
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Einige
der hierin offenbarten Figuren enthalten Blockdiagramme, Flussdiagramme
und Kontrollflussdarstellungen von Verfahren, Systemen und Programmprodukten
gemäß der Erfindung.
Es ist klar, dass jeder Block oder Schritt des Blockdiagramms, Flussdiagramms
und der Kontrollflussdarstellung und Kombinationen von Blöcken in
dem Blockdiagramm, Flussdiagramm und der Kontrollflussdarstellung
von Computerprogrammbefehlen ausgeführt werden können. Diese
Computerprogrammbefehle können
in einen Computer oder eine andere programmierbare Vorrichtung geladen
werden, so dass die Befehle, welche auf dem Computer oder einer
anderen programmierbaren Vorrichtung ausgeführt werden, Mittel zum Realisieren
der Funktionen, welche in dem Blockdiagramm, dem Flussdiagramm oder
dem Kontrollflussblock (den Kontrollflussblöcken) oder -schritt (-schritten)
spezifiziert sind, erzeugen. Diese Computerprogrammbefehle können auch
in einem computerlesbaren Speicher gespeichert werden, welche einen
Computer oder eine andere programmierbare Vorrichtung steuern können, um
in einer speziellen Art und Weise zu arbeiten, so dass die in dem
computerlesbaren Speicher gespeicherten Befehle einen Beitrag zu
herstellungseinschließenden
Befehlsmitteln, welche die Funktion ausführen, die in dem Blockdiagramm, Flussdiagramm
oder dem Kontrollflussblock oder -schritt (den Kontrollflussblöcken oder
-schritten) spezifiziert sind, herstellen. Die Computerprogrammbefehle
können
ferner auf einen Computer oder eine andere programmierbare Vorrichtung
geladen werden, um eine Abfolge von Betriebsschritten zu bewirken,
die auf dem Computer oder einer anderen programmierbaren Vorrichtung
ausgeführt
werden sollen, um ein computerrealisiertes Verfahren derart herzustellen,
dass die Befehle, welche auf dem Computer oder einer anderen programmierbaren
Vorrichtung ausgeführt
werden, Schritte zum Realisieren der Funktionen bereitstellen, die
in dem Blockdiagramm, dem Flussdiagramm, dem Kontrollflussblock
oder -schritt (den Kontrollflussblöcken oder -schritten) spezifiziert
sind.
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Dementsprechend
unterstützen
Blöcke
oder Schritte des Blockdiagramms, Flussdiagramms oder der Kontrollflussdarstellung
Kombinationen von Mitteln zum Ausführen der spezifizierten Funktionen, Kombinationen
von Schritten zum Ausführen
der spezifizierten Funktionen und Programmbefehlsmitteln zum Ausführen der
spezifizierten Funktionen. Es ist ferner klar, dass jeder Block
oder Schritt des Blockdiagramms, Flussdiagramms oder der Kontrollflussdarstellung
und Kombinationen von Blöcken oder
Schritten in dem Blockdiagramm, Flussdiagramm oder der Kontrollflussdarstellung
von einem hardwarebasierten Spezialcomputersystem ausgeführt werden
kann, welches die spezifizierten Funktionen oder Schritte oder Kombinationen
von Spezialhardware und Computerbefehlen ausführt.
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Viele
Anderungen und andere Ausführungsformen
der Erfindung werden einem Fachmann, den diese Erfindung betrifft,
einfallen, welche den Nutzen der in den vorhergehenden Beschreibungen
und zugeordneten Zeichnungen dargestellten Lehren aufweisen. Daher
ist es selbstverständlich,
dass die Erfindung nicht auf die speziellen offenbarten Ausführungsformen
beschränkt
ist, und dass Änderungen und
weitere Ausführungsformen
von dem Umfang der beigefügten
Ansprüche
mit umfasst sein sollen. Zum Beispiel kann in einer weiteren Ausführungsform
die Well-Platte und das Verfahren auch verwendet werden, um Bakterien
zu züchten.
Obwohl hier spezifische Begriffe verwendet werden, werden sie nur
in einem allgemeinen und beschreibenden Sinn benutzt und nicht zum
Zweck der Beschränkung.