DE602004001727T2

DE602004001727T2 - Verfahren zur herstellung cyclischer peptide

Info

Publication number: DE602004001727T2
Application number: DE602004001727T
Authority: DE
Inventors: Avi Tovi; Chaim Eidelman; Shimon Shushan; Shai Elster; Hagi Alon
Original assignee: Novetide Ltd
Current assignee: Novetide Ltd
Priority date: 2003-04-07
Filing date: 2004-04-05
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2024-04-06
Also published as: US20040249121A1; WO2004092202A1; PT1511761E; EP1511761B1; EP1511761A1; TW200505939A; US20100240865A1; ES2237356T1; US20100137559A1; ATE334998T1; DK1511761T3; DE04759123T1; ES2237356T3; DE602004001727D1

Description

Priorität
Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der vorläufigen US-Anmeldung mit der Serien-Nr. 60/461,222, eingereicht am 7. April 2003, deren Inhalt hierin mit einbezogen ist.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren zur Herstellung und Reinigung von zyklischen Peptiden.
Hintergrund der Erfindung
Somatostatin ist dafür bekannt, ein sehr breites therapeutisches Potential zu besitzen, und kann in einer großen Vielfalt klinischer Anwendungen verabreicht werden. Die durchschnittliche Halbwertzeit von Somatostatin in Plasma ist außerordentlich kurz, was die mögliche Anzahl möglicher Anwendungen dieses Reagens verringert. Mit dem Ziel, Analoge von Somatostatin zu entwickeln, die eine größere Stabilität und Wirksamkeit aufweisen, wurde Forschung durchgeführt. Eine Gruppe von Verbindungen, die als möglicherweise geeignete Somatostatinanaloge bewertet wurden, waren zyklische Oktapeptide. Eine Bewertung des zyklischen Oktapeptids Oktreotid zeigte, daß die Verbindung eine ausgezeichnete biologische Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo hat (Pless, J. Metabolism 41, 5-6 (1992)). Oktreotid hat die folgende Grundformel:
worin die Schwefelatome des Cys-Restes an den Positionen 2 und 7 durch eine Disulfidbrücke eingegrenzt sind. Die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure Threonin (Thr) ist zu dem Alkoholrest Thr-ol (Threoninol) reduziert.
Die Anwesenheit von D-Phenylalanin (D-Phe) am N-terminalen Ende und eines Aminoalkohols am C-terminalen Ende, zusammen mit dem D-Tryptophanrest (D-Trp) und der Disulfidbrücke, macht das Molekül sehr beständig gegenüber metabolischem Abbau. Oktreotid gestattet eine 24-stündige Inkubation in aggressiven Medien, wie Magensäften oder in der Darmschleimhaut.
Oktreotid hemmt Wachstumshormon für einen längeren Zeitraum, hemmt die Ausschüttung von Glucagon in geringerem Ausmaß und hemmt die Insulinausschüttung nur in vorübergehender Weise. Folglich ist Oktreotid mehr als andere Somatostatinanaloge selektiv bei der Steuerung der Wachstumshormonniveaus im Körper, und daher derzeit bei Akromegalie zur Steuerung und Verringerung des Plasmaniveaus eines solchen Hormons angezeigt. Oktreotid ist auch geeignet bei der Behandlung von zellulären Veränderungen mit innersekretorischem Ursprung in Magen, Darm oder Bauchspeicheldrüse und von bestimmten Tumorarten.
Die Synthese von Oktreotid und seinen Derivaten wurde durch zwei allgemeine Syntheseverfahren beschrieben. Das erste Verfahren ist ein Lösungsphaseverfahren, basierend auf der Kondensation von Fragmenten, wie von Bauer et al. in der europäischen Patentanmeldung Nr. 29,579 (1981) und in US-Patent Nr. 4,395,403 beschrieben. Das Verfahren umfaßt allgemein die Stufen: Entfernen einer Schutzgruppe von einem geschützten Hexapeptidrest, miteinander Verbinden von zwei Peptideinheiten durch eine Amidbindung, wobei eine einen Hexapeptidrest umfaßt, Umwandeln einer funktionellen Gruppe an dem N- oder C-terminalen Ende des entstehenden Polypeptids und Oxidieren des Polypeptids. Das Verfahren umfaßt eine zeitaufwendige Mehrschrittsynthese und weist zusätzliche Probleme während der Trennung von Oktreotid von den Reaktionsmischungen auf, da alle Synthesestufen in Lösungsphase ausgeführt werden.
Das zweite Verfahren zur Synthese von Oktreotid synthetisiert die gesamte Peptidkette unter Verwendung von Festphasenpeptidsynthese, wobei die Synthese an dem Threoninolrest gestartet wird. Dieses Verfahren setzt voraus, daß der Threoninolrest geschützt ist.
Das zweite Syntheseverfahren verwendet ein Aminomethylharz, auf welches der Threoninolrest gebunden ist, wobei die zwei Alkoholfunktionen in Acetalform geschützt sind. Mergler et al., „Peptides: Chemistry and Biology", Proceedings of the 12^th American Peptide Symposium, Poster 292 Präsentation (Smith, J. A. und Rivier, J. E., Hrsg. ESCOM, Leiden) (1991). Die Synthese wird einem Fmoc/t-Bu-Schutzschema folgend ausgeführt, wobei die Disulfidbrücke auf einem Harz durch Oxidation der Thiolgruppen der zuvor entschützten Cysteinreste gebildet wird und das Peptid mit einer 20%igen Mischung von TFA/DCM freigesetzt und entschützt wird.
Alsina et al. beschrieben den Einbau eines Threoninolrestes auf aktive Carbonatharze, wobei die Aminogruppe durch eine Boc-Gruppe und die Seitenkette durch eine Bzl-Gruppe geschützt war. Alsina et al., Tetrahedron Letters, 38, 883-886 (1997). Danach wurde die Synthese unter Verwendung einer Boc/Bzl-Strategie fortgeführt. Die Bildung der Disulfidbrücke wurde direkt auf dem Harz unter Verwendung von Jod ausgeführt, und mit HF/Anisol (9/1) wurde das Peptid von dem Harz abgespaltet und gleichzeitig seine Seitenkettenschutzgruppen entfernt. Bei einer letzten Stufe wurde die Formylgruppe mit einer Piperidin/DMF-Lösung entfernt. Neugebauer et al. beschrieben eine lineare Synthese mit einer Ausbeute von nur 7%. Neugebauer et al., PEPTIDES: CHEMISTRY, STRUCTURE AND BIOLOGY, S. 1017 (Marshal G. R. und Rivier, J. E., Hrsg. ESCOM, Leiden, 1990).
Edwards et al. offenbarten eine festphasenartige Annäherung durch die schrittweise Synthese des Peptids D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(t-Bu)-Cys(Acm)-HMP-Harz (SEQ. ID NO. 1) auf einem Harz. Edwards et al., J. Med. Chem. 37, 3749-3757 (1994). Anschließend wurde das Disulfid auf dem Harz hergestellt und das entstehende Produkt durch Aminolyse mit Threoninol von dem Harz freigesetzt. Die angegebene Gesamtausbeute betrug nur 14%.
Arano et al. führten ein anderes Festphasenverfahren für DTPA-Oktreotid durch. Arano et al., Bioconjugate Chem, 8, 442-446 (1997). Die Oxidation des DTPA-Peptids mit Jod ergab DTPA-D-Phe^I-Oktreotid mit insgesamt 31,8% Ausbeute, basierend auf dem anfänglichen Fmoc-Thr(tBu)-ol-Harz.
Wu et al. entwickelten ein Syntheseverfahren für Oktreotid, wobei die Disulfidbindung durch Oxidation unter Verwendung einer verdünnten Lösung von Oktreotid mit Luft während 48 Stunden gebildet wurde. Wu et al., Tetrahedron Letters, 39, 1783-1784 (1998). Lee et al. führten kürzlich ein neues Verfahren zur Verankerung von Thr(ol) (oder Thr-ol) an ein Festphasensyntheseharz zur Herstellung von Oktreotid durch. Siehe US-Patent Nr. 5,889,146. Fmoc-Thr(ol)-Terephtalacetal wurde auf das Harz geladen, und nach der Konstruktion der Peptidketten unter Verwendung von Fmoc-Chemie wurde die Zyklisierung des Peptids auf dem Harz durch Oxidation mit Jod erreicht. Die Spaltung des Peptidharzes mit Trifluoressigsäure ergab Oktreotid mit einer Gesamtausbeute von > 70% von dem anfänglichen Fmoc-Thr(ol)-Terephtalacetal-Harz. Alle diese Verfahren führten die Zyklisierung des Oktreotids entweder an vollständig entschütztem Peptid oder auf dem Harz durch.
Weitere zyklische, brückenzyklische und geradkettige Somatostatinanaloge und Verfahren für ihre Herstellung werden in den US-Patenten Nr. 4,310,518 und 4,235,886, den europäischen Patentbeschreibungen EP-A-1295, 70,021, 113,209, 215,171, 203,031, 214,872 und 143,307 und der belgischen Patentbeschreibung BE-A-900,089 beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren zur Herstellung und Reinigung von zyklischen Peptiden. In einer Ausführungsform umfassen die Verfahren die Stufen: (a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids, wobei das Peptid wenigstens zwei geschützte, Thiol enthaltende Reste enthält, von denen wenigstens einer mit einer orthogonalen Schutzgruppe geschützt ist, (b) Umsetzen des geschützten linearen Peptids mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung eines halbgeschützten linearen Peptids, das mit der orthogonalen Schutzgruppe an einem der Thiol enthaltenden Reste geschützt ist, (c) Reinigen des halbgeschützten, linearen Peptids durch Chromatographie, (d) Behandeln des in Stufe (c) erhaltenen gereinigten, halbgeschützten linearen Peptids mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung eines ungeschützten, zyklischen Peptids und (e) Reinigen des ungeschützten zyklischen Peptids durch Chromatographie. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren weiter die Neutralisierung überschüssigen Oxidationsmittels nach Stufe (d). In einer anderen Ausführungsform kann das Oxidationsmittel Jod sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das zyklische Peptid aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Somatostatinanalogen, mit Vasopressin verwandten Peptiden, α-atrialen natriuretischen Faktoren/Peptiden (ANF/ANP), Calcitoninen und anderen Disulfid enthaltenden Peptiden. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das zyklische Peptid Oktreotid, Calcitonin (Lachs), Desmopressin, Oxytocin, Nesiritid oder Eptifibatid.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das lineare Peptid von Stufe (a) an ein Harz gebunden oder in Lösung.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die orthogonale Schutzgruppe Acetamidomethyl, Benzyl, 4-Methoxybenzyl, tert-Butyl, Trimethylacetamidomethyl, Phenylacetamidomethyl oder tert-Butylmercapto. Bevorzugt ist die orthogonale Gruppe eine nicht säurelabile Schutzgruppe wie Acetamidomethyl (ACM).
Eine Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung eines zyklischen Peptids, das eine Reinheit von wenigstens etwa 98,5%, ermittelt durch HPLC, und be vorzugt von wenigstens etwa 99%, ermittelt durch HPLC, hat. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Herstellung eines zyklischen Peptids mit hoher Reinheit durch ein Verfahren, bei welchem das Reaktionsprodukt nach der Spaltung von einem Trägerharz, wenn es an ein Trägerharz gebunden ist, teilweise entschützt wird und wenigstens eine an einen Thiol enthaltenden Rest gehängte Schutzgruppe trägt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Verfahren, bei welchem Acm als Schutzgruppe für Cysteinreste verwendet wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung umfaßt Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden. Genauer umfaßt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von zyklischen Polypeptiden, wobei wenigstens eine an Thiol enthaltende Reste, wie Cysteinreste, gebundene Schutzgruppe unter den Bedingungen, die für die Abspaltung anderer Schutzgruppen benötigt werden, nicht von den Thiol enthaltenden Resten abgespaltet oder entschützt wird. Somit ist die Peptidkette nicht vollständig entschützt, sondern trägt wenigstens eine an einen Thiol enthaltenden Rest gebundene Schutzgruppe. Spezifisch umfaßt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von zyklischen Peptiden, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Somatostatinanalogen, mit Vasopressin verwandten Peptiden, α-atrialen natriuretischen Faktoren/Peptiden (ANF/ANP), Calcitoninen und anderen Disulfid enthaltenden Peptiden. Genauer ist das zyklische Peptid aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Oktreotid, Calcitonin (Lachs), Desmopressin, Oxytocin, Nesiritid und Eptifibatid.
Nesiritid hat die folgende Peptidsequenz:
Eptifibatid hat die folgende Peptidsequenz:
Das Reaktionsprodukt kann unter Erhalt eines zyklischen Peptids mit hoher Reinheit gereinigt werden. Der Begriff „Hohe Reinheit", wie er hierin benutzt wird, bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die wenigstens etwa 98,5%, ermittelt durch HPLC, und bevorzugt wenigstens etwa 99%, ermittelt durch HPLC, umfaßt. Der Begriff „zyklisches Peptid", wie er hierin benutzt wird, bezieht sich auf ein Peptid, das wenigstens zwei (2) Thiol enthaltende Reste, die durch eine Disulfidbrücke verbunden sind, enthält.
Die Synthese der halbgeschützten Peptide kann durch bekannte Verfahren zur Peptidsynthese ausgeführt werden, z.B. unter anderem auf einem festen Träger oder in Lösung. Das Verfahren der Erfindung zur Herstellung zyklischer Peptide ist ein Verfahren, bei dem wenigstens ein Thiol enthaltender Rest des Ausgangsmaterials durch eine orthogonale Schutzgruppe geschützt ist, die unter den für die Abspaltung der anderen Schutzgruppen oder Abspaltung des Peptids von dem Harz benötigten Bedingungen nicht von einem Thiol enthaltenden Rest abgespaltet oder entschützt wird. Der Begriff „orthogonale Schutzgruppe", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Schutzgruppe, die unter einem Satz ausgewählter Bedingungen chemisch resistent ist, aber unter einem anderen Satz an Bedingungen verantwortlich ist. Orthogonale Schutzgruppen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf wenigstens eine der Acetamidomethyl (Acm), Benzyl (Bzl), 4-Methoxybenzyl (Mob), tert-Butyl (Tbu oder t-Bu), Trimethylacetamidomethyl (Tacm), Phenylacetamidomethyl (Phacm) oder tert-Butylmercapto (StBu). Bevorzugt ist die orthogonale Schutzgruppe eine nicht säurelabile Gruppe wie Acetamidomethyl. Somit wird in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Peptidkette nach dem Entschützen oder der Abspaltung nicht vollständig entschützt, sondern trägt wenigstens eine an einen Thiol enthaltenden Rest gebundene Schutzgruppe (ein halbgeschütztes Polypeptid). Wahlweise kann das halbgeschützte Polypeptid unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens gereinigt werden. Anschließend werden die verbleibenden Schutzgruppen an dem halbgeschützten Polypeptid entfernt und zum Erhalt eines zyklischen Peptides unter Verwendung irgendeines herkömmlichen Verfahrens eine Disulfidbrücke geformt. Zum Beispiel umfaßt ein Verfahren die Oxidation des Thiols durch ein Oxidationsmittel wie Jod, ist aber nicht begrenzt darauf. Das zyklische Peptid wird unter Erhalt eines zyklischen Peptids mit hoher Reinheit durch geeignete Verfahren gereinigt. Wahlweise kann, sofern vorhanden, überschüssiges Oxidationsmittel vor der Reinigung neutralisiert werden. Bevorzugt wird die Reinigung unter Verwendung von HPLC ausgeführt.
Zum Zweck der Klarheit und als eine Hilfe zum Verständnis der Erfindung, wie sie hierin offenbart und beansprucht wird, werden die folgenden Begriffe und Abkürzungen nachstehend definiert:

TIS: – Triisopropylsilan
Trt: – Trityl
Mpa: – Mercaptopropionsäure.

An einem Polypeptid werden ein oder mehrere Thiol enthaltende Reste unter Verwendung einer orthogonalen Schutzgruppe wie Acetamidomethyl (Acm) geschützt. Wird Acm als eine Schutzgruppe des Thiol enthaltenden Restes verwendet, ergibt die azidolytische Spaltung des Peptids eine eine Acm-Gruppe tragende Peptidsequenz. Wenn zum Beispiel bei der Herstellung von Oktreotid Acm als eine Schutzgruppe eines ersten Thiol enthaltenden Restes, z.B. des an Thr-ol gebundenen Cysteinrestes, verwendet wird, ergibt die azydolytische Spaltung des Peptids eine eine Acm-Gruppe tragende Peptidsequenz, z.B. D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr(ol). Peptide können durch ein spezifisches Profil von verwandten Verunreinigungen charakterisiert werden, die durch HPLC-Analyse beobachtet werden. Einige dieser Verunreinigungen können leicht von der Hauptelutionsbande getrennt werden, wohingegen andere näher zu der Hauptelutionsbande eluieren. Eine grobe Reinigung durch präparative HPLC ergibt die teilweise geschützten Peptide mit einer Reinheit von wenigstens etwa 95%, bevorzugt wenigstens etwa 98,5% und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 99%, ermittelt durch HPLC, und bei einer Konzentration von etwa 0,1 g/l bis etwa 10 g/l. Die Zugabe einer ungefähr gleichen Menge an Oxidationsmittel, wie Jod, führt zum Entschützen der orthogonalen Schutzgruppe und gleichzeitigen Zyklisieren des Moleküls durch eine Disulfidbrücke. Eine Auswertung des Chromatographieprofils bei dieser Stufe zeigt deutlich, daß einige der zuvor nahe der Hauptelutionsbande eluierten Verunreinigungen nun getrennt von der Produktelutionsbande sind. Somit kann das Produkt einfach zum zweiten Mal durch Verfahren wie HPLC oder andere bekannte Verfahren unter Erhalt eines gereinigten Peptids wie Oktreotid in hoher Reinheit gereinigt werden. Durch diese Mittel wird ein Produkt mit hoher Reinheit leicht mit hoher Ausbeute erhalten, ohne das Erfordernis für mehrere Wiedergewinnungszyklen, die große Volumen an Lösungsmitteln erfordern, lange Verfahrenszeiten und eine geringere Reinheit und geringere Ausbeute des Endproduktes ergeben, im Vergleich zu herkömmlichen derzeit verwendeten Verfahren.
Das Verfahren zur Peptidsynthese gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird durch das folgende Schema ausgeführt:

a) Bereitstellen einer Peptidsequenz, welche wenigstens zwei geschützte Thiol enthaltende Reste enthält, von denen wenigstens einer mit einer nicht säurelabilen Schutzgruppe geschützt ist,
b) Abspalten der säureempfindlichen Schutzgruppen unter Verwendung einer mehrere Radikalfänger enthaltenden sauren Zusammensetzung unter Ausformung eines halbgeschützten linearen Peptids,
c) Grobe Reinigung des halbgeschützten linearen Peptids durch geeignete Chromatographieverfahren,
d) Entschützen der verbleibenden, nicht säurelabilen Schutzgruppe des halbgeschützten linearen Peptids und Zyklisieren des linearen Peptids durch Bildung einer Disulfidbindung durch geeignete Verfahren unter Ausbildung einer unbearbeiteten Lösung von zyklischem Peptid und
e) Reinigen der unbearbeiteten Lösung von zyklischem Peptid durch geeignete Trennungsverfahren unter Erhalt eines zyklischen Peptidprodukts.

Die entstehende Peptidlösung kann unter Erhalt eines trockenen zyklischen Peptidprodukts getrocknet werden. Wird das Peptid auf einer Festphase, wie einem Harz, synthetisiert und sind die orthogonalen Schutzgruppen nicht säurelabile Gruppen, spaltet die für das Entschützen der säureempfindlichen Schutzgruppen verwendete saure Zusammensetzung auch das entstehende, halbgeschützte Peptid von dem Harz.
Ein besonderes Beispiel des oben beschriebenen Verfahrens zur Peptidsynthese umfaßt die Stufen:

1. Herstellen einer geschützten Peptidsequenz auf einem Harz. Zum Beispiel ist bei der Herstellung von Oktreotid Thr(ol)(t-Bu)-2-Chlortritylharz ein geeignetes Ausgangsmaterial. Danach wird ein lineares Peptid durch einen Zyklus von sich wiederholenden Verfahren in der folgenden Reihenfolge synthetisiert: 1.1. Koppeln einer geeigneten, Fmoc-geschützten Aminosäure mit einem geeigneten Kopplungsmittel an den an das Harz gebundenen, endständigen Aminogruppenrest unter Ausbildung eines an das Harz gebundenen, Fmoc-geschützten Peptidfragments. 1.2. Waschen des Produkts von Stufe 1.1 mit wenigstens einem Lösungsmittel zum Entfernen aller löslicher Verbindungen von dem Harz. 1.3. Entschützen der Fmoc-Gruppe. 1.4. Waschen mit wenigstens einem Lösungsmittel zum Entfernen aller löslichen Verbindungen von dem Harz. 1.5. Zugeben zusätzlicher Aminosäurereste entsprechend der erforderlichen Sequenz, gefolgt von Waschen mit wenigstens einem Lösungsmittel und Entschützen der Fmoc-Gruppe nach Bedarf. 1.6. Koppeln der letzten Aminosäure D-Phe (N-geschützt). 1.7. Waschen und Trocknen des Peptidharzes.
2. Spaltung des (teilweise geschützten) linearen Peptidzwischenprodukts von dem Harz und gleichzeitiges Entschützen der säureempfindlichen Schutzgruppen unter Verwendung einer sauren, Trifluoressigsäure (TFA) und zahlreiche Radikalfänger enthaltenden Zusammensetzung unter Ausbildung eines halbgeschützten linearen Peptids.
3. Grobe Aufreinigung des halbgeschützten linearen Peptids durch ein geeignetes Chromatographieverfahren.
4. Entschützen der verbleibenden Schutzgruppe des halbgeschützten linearen Peptids.
5. Zyklisieren des linearen Peptids durch Bildung einer Disulfidbindung durch ein geeignetes Verfahren unter Ausbildung einer unbearbeiteten Lösung von zyklischem Peptid.
6. Reinigung einer unbearbeiteten Lösung von zyklischem Peptid durch ein geeignetes Trennungsverfahren.

Wird das Peptid auf einem festen Träger synthetisiert, umfassen geeignete Harze für die Verwendung in dem Verfahren Chlortritylharze, sind aber darauf nicht begrenzt. Geeignete Kopplungsmittel umfassen, sind aber nicht begrenzt auf 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU). Geeignete Lösungsmittel zur Verwendung bei den Waschschritten des Verfahrens umfassen, aber sind nicht begrenzt auf Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan (DCM), Methanol (MeOH) oder Isopropanol (IPA). Geeignete Schutzgruppen für die terminalen Aminosäurereste umfassen, aber sind nicht begrenzt auf 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) oder Boc. Geeignete Schutzgruppen für die Cysteinreste umfassen Acm. Die Schutzgruppe des endständigen Aminosäurerestes wird durch irgendein bekanntes Verfahren, wie das Umsetzen mit einer Piperidinlösung in DMF, entfernt. Jedoch kann ein Fachmann die Reagenzien durch andere geeignete Reagenzien ersetzen.
Die Abspaltung des teilweise geschützten linearen Zwischenprodukts von dem Trägerharz kann durch Zugabe einer sauren Zusammensetzung ausgeführt werden. Die saure Zusammensetzung basiert bevorzugt auf einem sauren Material wie TFA und enthält Radikalfängermittel, einschließlich aber nicht begrenzt auf Ethandithiol (EDT) und Wasser. Das relative Verhältnis von saurem Material zu Radikalfänger zu Wasser kann von etwa 85% bis etwa 99% saures Material, von etwa 0,1% bis etwa 15% Radikalfänger und von etwa 0,1% bis etwa 15 Gew.-% Wasser sein. Eine bevorzugte saure Zusammensetzung umfaßt etwa 95% TFA, etwa 2,5% EDT und etwa 2,5% Wasser.
Das unbearbeitete Peptidprodukt kann durch irgendein bekanntes Verfahren gereinigt werden. Bevorzugt wird das Peptid unter Verwendung von HPLC auf einer Umkehrphasensäule (RP) gereinigt. Das entstehende gereinigte Produkt wird getrocknet und kann gefriergetrocknet werden.
Besondere Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfassen, aber sind nicht begrenzt auf die Synthese von Oktreotid, Eptifibatid, Desmopressin und Calcitonin Lachs, wie nachstehend erläutert.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Oktreotid zur Verfügung, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids der Formel X-D-Phe-Cys(X)-Phe-D-Trp-Lys(X)-Thr(X)-Cys(Acm)-Thr(X)-ol, wobei X gleiche oder unterschiedliche Schutzgruppen bedeutet,
b) Umsetzen des linearen Peptids von Stufe (a) mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung von D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol,
c) Reinigen des Produkts aus Stufe (b) durch HPLC,
d) Behandeln des in Stufe (c) entstehenden, linearen Peptids mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung von (2,7-zyklischem) D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol und
e) Reinigen des Produkts von Stufe (d) durch HPLC.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Eptifibatid zur Verfügung, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids der Formel Mpa(X)-Har(X)-Gly-Asp(X)-Trp-Pro-Cys(Acm), wobei X gleiche oder verschiedene Schutzgruppen bedeutet,
b) Umsetzen des linearen Peptids von Stufe (a) mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung von Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH₂,
c) Reinigen des Produkts von Stufe (b) durch HPLC,
d) Behandeln des in Stufe (c) entstehenden, linearen Peptids mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung von (1,7-zyklischem) Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH₂ und
e) Reinigen des Produkts von Stufe (d) durch HPLC.

Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Desmopressin zur Verfügung, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids der Formel Mpa(X)-Tyr(X)-Phe-Gln(X)-Asn(X)-Cys(Acm)-Pro-D-Arg(X)-Gly, wobei X gleiche oder unterschiedliche Schutzgruppen bedeutet,
b) Umsetzen des linearen Peptids von Stufe (a) mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung von Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂,
c) Reinigen des Produkts von Stufe (b) durch HPLC,
d) Behandeln des in Stufe (c) entstehenden, linearen Peptids mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung von (1,6-zyklischem) Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ und
e) Reinigen des Produkts von Stufe (d) durch HPLC.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Calcitonin (Lachs) zur Verfügung, welches die folgenden Stufen umfaßt:

a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids der Formel Cys(X)-Ser(X)-Asn(X)-Leu-Ser(X)-Thr(X)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(X)-Leu-Ser(X)-Gln(X)-Glu(X)-Leu-His(X)-Lys(X)-Leu-Gln(X)-Thr(X)-Tyr(X)-Pro-Arg(X)-Thr(X)-Asn(X)-Thr(X)-Gly-Ser(X)-Gly-Thr(X)-Pro, wobei X gleiche oder unterschiedliche Schutzgruppen bedeutet,
b) Umsetzen des linearen Peptids von Stufe (a) mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung von Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂,
c) Reinigen des Produkts von Stufe (b) durch HPLC,
d) Behandeln des in Stufe (c) entstehenden, linearen Peptids mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung von (1,7-zyklischem) Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ und
e) Reinigen des Produkts von Stufe (d) durch HPLC.

Während die vorliegende Erfindung in Bezug auf bestimmte Beispiele und bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wird, versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele und Ausführungsformen beschränkt ist. Die vorliegende Erfindung, wie beansprucht, umfaßt daher Abweichungen von den hierin beschriebenen, bestimmten Beispielen und bevorzugten Ausführungsformen, wie für den Fachmann ersichtlich.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung von H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol (SEQ. ID NO. 1)
Die Synthese des Peptids wurde durch ein stufenweises Fmoc SPPS (Festphasenpeptidsynthese)-Verfahren ausgeführt, ausgehend von Thr(t-Bu)-ol-2-Cl-Trt-Harz (100 g, Beladung von 0,7 mmol auf 1 g vorbeladenes Harz). Nach dem Waschen des Harzes wurde die zweite Aminosäure (Fmoc-Cys(Acm)) zum Starten der ersten Kopplungsstufe eingebracht. Die Fmoc- geschützte Aminosäure wurde in situ unter Verwendung von TBTU/HOBt (N-Hydroxybenzotriazol) aktiviert und anschließend für 50 Minuten an das Harz gekoppelt. Diisopropylethylamin wurde während des Koppelns als eine organische Base verwendet. Die Beendigung der Kopplung wurde durch Ninhydrin-Test angezeigt. Nach dem Waschen des Harzes wurde die Fmoc-Schutzgruppe an dem ∀-Amin mit 20% Piperidin in DMF für 20 min. entfernt. Diese Stufen wurden entsprechend der Peptidsequenz jedesmal mit einer anderen Aminosäure wiederholt. Alle Aminosäuren waren Fmoc-N^∀-geschützt, mit Ausnahme der letzten Aminosäure Boc-D-Phe in der Sequenz. Dreifunktionelle Aminosäuren waren wie folgt seitenkettengeschützt: Thr(t-Bu), Cys(Trt), Cys(Acm) und Lys(Boc). Drei Äquivalente der aktivierten Aminosäuren wurden in den Kopplungsreaktionen eingesetzt. Am Ende der Synthese wurde das Peptidharz mit DMF, gefolgt von DCM gewaschen und unter Vakuum unter Erhalt von 223 g trockenem Peptidharz getrocknet.
Das wie oben beschrieben hergestellte Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung einer Lösung aus 95% TFA, 2,5% TIS, 2,5% EDT für zwei Stunden bei Raumtemperatur abgespaltet. Das Produkt wurde durch die Zugabe von 10 Volumen Ether gefällt, gefiltert und im Vakuum unter Erhalt von 111,7 g Pulver getrocknet. Es wurde durch LC/MS als H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol identifiziert. Beispiel 2: Herstellung von Oktreotid
Das unbehandelte Peptid H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol (SEQ. ID NO. 1) (100 g, wie in Beispiel (1) beschrieben hergestellt, wurde auf einer präparativen C₁₈RP-HPLC-Säule gereinigt. Fraktionen, die > 95% reines Produkt enthielten, wurden vereinigt und auf Konzentrationen von etwa 1 g/l verdünnt. Eine äquimolare Menge von Jod in Essigsäure wurde unter energischem Mischen bei Raumtemperatur zugegeben und anschließend überschüssiges Jod durch eine kleine Menge Ascorbinsäure neutralisiert. Die entstehende Lösung wurde auf eine C₁₈RP-HPLC-Säule geladen und unter Erhalt von Oktreotidtrifluoracetat mit einer Reinheit von > 98,5% enthaltenden Fraktionen gereinigt. Nach einer Behandlung unter Ersetzen von Trifluoracetat wurden die Fraktionen gesammelt und unter Erhalt des endgültigen, trockenen Peptids gefriergetrocknet. Die Ausbeute war 33 g (> 98,5% rein).
Beispiel 3: Herstellung von Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH₂ (Eptifibatid-Vorstufe)
Die Synthese des Peptids wurde durch ein normales, stufenweises Fmoc SPPS (Festphasenpeptidsynthese)-Verfahren, ausgehend von 2-Cl-Trt-Harz (50 g), ausgeführt. Die erste Aminosäure (Fmoc-Cys(Acm)) wurde in einer vorausgehenden Stufe auf das Harz geladen, wobei eine Beladung von etwa 0,7 mmol/g zur Verfügung gestellt wurde. Nach dem Waschen des Harzes wurde, zum Starten der ersten Kopplungsstufe, eine zweite Aminosäure (Fmoc-Pro) eingebracht. Die Fmoc-geschützte Aminosäure wurde in situ unter Verwendung von TBTU/HOBt aktiviert und anschließend für 50 Minuten an das Harz gekoppelt. Diisopropylethylamin oder Collidin wurden während des Koppelns als eine organische Base verwendet. Die Beendigung der Kopplung wurde durch Ninhydrin-Test angezeigt. Nach dem Waschen des Harzes wurde die Fmoc-Schutzgruppe an dem α-Amin mit 20% Piperidin in DMF für 20 min. entfernt. Diese Stufen wurden entsprechend der Peptidsequenz jedesmal mit einer anderen Aminosäure wiederholt. Alle verwendeten Aminosäuren waren Fmoc-N^α-geschützt, mir Ausnahme des letzten Bausteins Trt-Mpa in der Sequenz. Dreifunktionelle Aminosäuren wurden wie folgt seitenkettengeschützt: Asp(tBu), Har(Pbf) und Cys(Acm). Drei Äquivalente der aktivierten Aminosäuren wurden in den Kopplungsreaktionen verwendet. Am Ende der Synthese wurde das Peptidharz mit DMF, gefolgt von DCM gewaschen und unter Vakuum unter Erhalt von 80 g trockenem Peptidharz getrocknet.
Das wie oben beschrieben hergestellte Peptid wurde durch Waschen mit einer Lösung von 1% TFA in DCM von dem Harz abgespaltet. Die entstehende Lösung wurde durch Zugabe von DIPEA neutralisiert und auf etwa 10% Peptidgehalt konzentriert. Die Amidbildung des C-Terminus wurde durch Aktivieren des Carboxy-Terminus mit DCC/HOBt und Koppeln mit einer Ammoniaklösung in IPA erzielt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde das geschützte Peptid in Ether gefällt und getrocknet. Die Schutzgruppen wurden unter Verwendung einer Lösung aus 95% TFA, 2,5% TIS, 2,5% EDT für zwei Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Das Produkt wurde durch die Zugabe von 10 Volumen Ether gefällt, filtriert und in Vakuum unter Erhalt von 30 g Produkt getrocknet. Beispiel 4: Herstellung von Eptifibatid
Das unbehandelte Peptid Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH₂ (30 g, wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt) wurde auf einer präparativen C₁₈RP-HPLC-Säule gereinigt. Fraktionen, die > 95% reines Produkt enthielten, wurden vereinigt und auf Konzentrationen von etwa 1 g/l verdünnt. Eine äquimolare Menge von Jod in Essigsäure wurde unter energischem Mischen bei Raumtemperatur zugegeben und anschließend überschüssiges Jod durch eine kleine Menge Ascorbinsäure neutralisiert. Die entstehende Lösung wurde auf eine C₁₈RP-HPLC-Säule geladen und unter Erhalt von Eptifibatidtrifluoracetat mit einer Reinheit von > 98,5% enthaltenden Fraktionen gereinigt. Die Fraktionen wurden gesammelt und unter Erhalt von 6,9 g endgültigem, trockenem Peptid (> 98,5% rein) gefriergetrocknet.
Beispiel 5: Herstellung von Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ (Desmopressin-Vorstufe) durch ein SPPS-Verfahren
Die Synthese des Peptids wurde durch ein normales stufenweises Fmoc SPPS-Verfahren, ausgehend von einem Rink-Amidharz (50 g), ausgeführt. Die erste Aminosäure (Fmoc-Gly) wurde nach dem Entfernen der Fmoc-Gruppe von dem Harz durch ein normales Kopplungsverfahren auf das Harz geladen. Nach dem Waschen des Harzes wurde die zweite Aminosäure (Fmoc-D-Arg(Pbf)) zur Fortsetzung der Sequenzverlängerung eingebracht. Die Fmoc-geschützten Aminosäuren wurden in situ unter Verwendung von TBTU/HOBt aktiviert und anschließend über etwa 50 Minuten an das Harz gekoppelt. Diisopropylethylamin oder Collidin wurden während des Koppelns als eine organische Base verwendet. Die Beendigung der Kopplung wurde durch Ninhydrin-Test angezeigt. Nach dem Waschen des Harzes wurde die Fmoc-Schutzgruppe an dem α-Amin mit 20% Piperidin in DMF für 20 min. entfernt. Diese Stufen wurden entsprechend der Peptidsequenz jedesmal mit einer anderen Aminosäure wiederholt. Alle verwendeten Aminosäuren waren Fmoc-N^α-geschützt, mit Ausnahme des letzten Bausteins Trt-Mpa in der Sequenz. Dreifunktionelle Aminosäuren wurden wie folgt seitenkettengeschützt: Gln(Trt), D-Arg(Pbf), Tyr(tBu) und Cys(Acm). Drei Äquivalente der aktivierten Aminosäuren wurden in den Kopplungsreaktionen verwendet. Am Ende der Synthese wurde das Peptidharz mit DMF, gefolgt von DCM, gewaschen und unter Vakuum unter Erhalt von 91 g trockenem Peptidharz getrocknet.
Das wie oben beschrieben hergestellte Peptid wurde unter Verwendung einer Lösung aus 89% TFA, 5,0% Phenol, 1,0% TIS, 2,5% EDT, 2,5% Wasser für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur abgespaltet. Das Produkt wurde durch die Zugabe von 10 Volumen Ether gefällt, filtriert und in Vakuum unter Erhalt von 49,0 g Pulver getrocknet. Es wurde durch LC/MS als Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ identifiziert.
Beispiel 6: Herstellung von Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ (Desmopressin-Vorstufe) im Lösungsverfahren
Die Synthese des Peptids wird durch ein normales stufenweises „Lösungssynthese"-Verfahren ausgeführt. Die zweite Aminosäure (Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH) wird in DMF gelöst und durch die Zugabe von TBTU/HOBt in der Anwesenheit von DIPEA voraktiviert. Die erste Aminosäure (Gly-NH₂) wird in DMF gelöst, zugegeben und die Reaktion für etwa 1 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. DMF wird unter Unterdruck entfernt und der Rückstand in Essigsäureethylester gelöst. Die organische Lösung wird mehrmals mit wäßriger HCl (1 N), Wasser und NaHCO₃ (5%) gewaschen. Nachdem die Lösung über Na₂SO₄ getrocknet wurde, wird das Lösungsmittel unter Erhalt von Fmoc-D-Arg(Pbf)-Gly-NH₂ verdunstet. Die Fmoc-Gruppe wird durch Auflösen in Piperidin/DMF (20%) entfernt. Die Lösung wird konzentriert und das unbehandelte Dipeptid wird in kaltem Ether gefällt. Durch ein ähnliches Verfahren wird der Rest der Aminosäuren der Reihe nach zugegeben unter Erhalt des endgültigen, geschützten linearen Peptids. Fmoc-geschützte Aminosäuren werden in situ unter Verwendung von TBTU/HOBt aktiviert und anschließend an die wachsende Peptidkette gekoppelt. Diisopropylethylamin oder Collidin werden während des Koppelns als eine organische Base verwendet. Die Beendigung der Kopplung wird durch einen HPLC oder TLC-Test festgestellt. Diese Stufen werden entsprechend der Peptidsequenz jedesmal mit einer anderen Aminosäure wiederholt. Alle verwendeten Aminosäuren sind Fmoc-N^α-geschützt, mit Ausnahme des letzten Bausteins Trt-Mpa in der Sequenz. Dreifunktionelle Aminosäuren sind wie folgt seitenkettengeschützt: Gln(Trt), D-Arg(Pbf), Tyr(tBu) und Cys(Acm).
Das wie oben beschrieben hergestellte Peptid wird von seinen säureempfindlichen Schutzgruppen unter Verwendung einer Lösung aus 91,5% TFA, 1,0% TIS, 2,5% EDT, 5,0% Wasser für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur entschützt. Das unbehandelte Produkt Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ wird durch die Zugabe von 10 Volumen Ether gefällt, filtriert und in einem Vakuum unter Erhalt eines feinen Pulvers getrocknet. Das Produkt wird durch LC/MS identifiziert. Beispiel 7: Herstellung von Desmopressin
Das unbehandelte Peptid Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ (SEQ. ID NO. 3) (49 g, wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt) wurde auf einer präparativen C₁₈RP- HPLC-Säule gereinigt. Fraktionen, die > 95% reines Produkt enthielten, wurden vereinigt und auf Konzentrationen von etwa 1 g/l verdünnt. Eine äquimolare Menge an Jod in Essigsäure wurde unter energischem Mischen bei Raumtemperatur zugegeben und anschließend wurde überschüssiges Jod durch eine kleine Menge Ascorbinsäure neutralisiert. Die entstehende Lösung wurde auf eine C₁₈RP-HPLC-Säule geladen und unter Erhalt von Desmopressintrifluoracetat mit einer Reinheit von > 98,5% enthaltenden Fraktionen gereinigt. Nach dem Austausch des Gegenions mit Acetat wurden die Fraktionen gesammelt und unter Erhalt von 14,9 g endgültigem, trockenem Peptid (> 99,0% rein) gefriergetrocknet.
Beispiel 8: Herstellung von Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ (Calcitonin Lachs Vorstufe)
Die Synthese des Peptids wurde durch ein normales stufenweises Fmoc SPPS-Verfahren, ausgehend von Rink-Amidharz (30 g), ausgeführt. Die erste Aminosäure (Fmoc-Pro) wurde durch eine normale Kopplungsreaktion nach dem Entfernen der Fmoc-Gruppe von dem Harz auf das Harz geladen. Nach dem Waschen des Harzes wurde die zweite Aminosäure (Fmoc-Thr(tBu)) zur Fortsetzung der Sequenzverlängerung eingebracht. Fmoc-geschützte Aminosäuren wurden in situ unter Verwendung von TBTU/HOBt aktiviert und anschließend während etwa 60 Minuten an das Harz gekoppelt. Diisopropylethylamin oder Collidin wurden während des Koppelns als eine organische Base verwendet. Die Beendigung des Koppelns wurde durch Ninhydrin-Test angezeigt. Nach dem Waschen des Harzes wurde die Fmoc-Schutzgruppe an dem α-Amin mit 20% Piperidin in DMF für 20 min. entfernt. Diese Schritte wurden entsprechend der Peptidsequenz jedesmal mit einer anderen Aminosäure wiederholt. Alle verwendeten Aminosäuren waren Fmoc-N^α-geschützt. Dreifunktionelle Aminosäuren waren wie folgt seitenkettengeschützt: Cys(Trt), Ser(tBu), Asn(Trt), Gln(Trt), Thr(tBu), Glu(tBu), His(Trt), Lys(Boc), Arg(Pbf), Tyr(tBu) und Cys(Acm). Drei Äquivalente der aktivierten Aminosäuren wurden in den Kopplungsreaktionen eingesetzt. Am Ende der Synthese wurde das Peptidharz mit DMF, gefolgt von DCM gewaschen und unter Vakuum unter Erhalt von 77 g trockenem Peptidharz getrocknet.
Das wie oben beschrieben hergestellte Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung einer Lösung aus 94% TFA, 1,0% TIS, 2,5% EDT, 2,5% Wasser für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur abgespaltet. Das Produkt wurde durch die Zugabe von 10 Volumen Ether gefällt, filtriert und in Vakuum unter Erhalt von 42,0 g Pulver getrocknet. Es wurde durch LC/MS als Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ identifiziert.
Beispiel 9: Herstellung von Calcitonin (Lachs)
Das unbehandelte Peptid Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ (42 g, wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt) wurde auf einer präparativen C₁₈RP-HPLC-Säule gereinigt. Fraktionen, die > 95% reines Produkt enthielten, wurden vereinigt und zu Konzentrationen von etwa 1 g/l verdünnt. Eine äquimolare Menge von Jod in Essigsäure wurde unter energischem Mischen bei Raumtemperatur zugegeben und anschließend überschüssiges Jod durch eine kleine Menge Ascorbinsäure neutralisiert. Die entstehende Lösung wurde auf eine C₁₈RP-HPLC-Säule geladen und unter Erhalt von Calcitonintrifluoracetat mit einer Reinheit von > 98,5% enthaltenden Fraktionen gereinigt. Nach dem Austausch des Gegenions mit Acetat wurden die Fraktionen gesammelt und unter Erhalt von 8,8 g endgültigem, trockenem Peptid (> 99,0% rein) gefriergetrocknet. Das analytische Verfahren zur Umkehrphasenchromatographie (HPLC) verwendete eine 5μC18-Säule, 0,05% TFA im Acetonitril/Wasser-Elutionsmittel und eine Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min.

Claims

Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids, welches wenigstens zwei geschützte, Thiol enthaltende Reste enthält, von denen wenigstens ein Thiol enthaltender Rest mit einer orthogonalen Schutzgruppe geschützt ist, b) Umsetzen des geschützten linearen Peptids mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung eines halbgeschützten linearen Peptids mit der orthogonalen Schutzgruppe an einem der Thiol enthaltenden Reste, c) Reinigen des halbgeschützten linearen Peptids, d) Behandeln des in Stufe (c) erhaltenen gereinigten, halbgeschützten linearen Peptids mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung eines zyklischen Peptids und e) Reinigen des zyklischen Peptids unter Erhalt eines gereinigten zyklischen Peptids.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zyklische Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Somatostatinanalogen, mit Vasopressin verwandten Peptiden, α-atrialen natriuretischen Faktoren/Peptiden (ANF/ANP), Calcitoninen und anderen Disulfid enthaltenden Peptiden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zyklische Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Oktreotid, Calcitonin (Lachs), Desmopressin, Oxytocin, Nesiritid und Eptifibatid.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Stufe (a) bereitgestellte geschützte lineare Peptid an ein Harz gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das gereinigte zyklische Peptid aus Stufe (e) eine Reinheit von wenigstens etwa 98,5%, ermittelt durch HPLC, hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das gereinigte zyklische Peptid aus Stufe (e) eine Reinheit von wenigstens etwa 99%, ermittelt durch HPLC, hat.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die orthogonale Schutzgruppe eine nicht säurelabile Schutzgruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acetamidomethyl, Benzyl, 4- Methoxybenzyl, tert-Butyl, Trimethylacetamidomethyl, Phenylacetamidomethyl und tert-Butylmercapto.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die nicht säurelabile Schutzgruppe Acetamidomethyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das Neutralisieren von überschüssigem Oxidationsmittel nach Stufe (d) umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin das Trocknen des gereinigten zyklischen Peptids umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die saure Zusammensetzung Trifluoressigsäure umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die saure Zusammensetzung weiterhin Triisopropylsilan und Ethandithiol umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oxidationsmittel Jod ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reinigungsstufen (d) und (e) unter Verwendung von HPLC ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids der Formel X-D-Phe-Cys(X)-Phe-D-Trp-Lys(X)-Thr(X)-Cys(Acm)-Thr(X)-ol, wobei X gleiche oder verschiedene Schutzgruppen bedeutet, b) Umsetzen des geschützten linearen Peptids aus Stufe (a) mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung eines halbgeschützten linearen Peptids D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol, c) Reinigen des halbgeschützten linearen Peptids aus Stufe (b) unter Verwendung von HPLC, d) Behandeln des gereinigten, halbgeschützten linearen Peptids aus Stufe (c) mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung eines zyklischen Peptids (2,7-zyklisches) D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol und e) Reinigen des zyklischen Peptids aus Stufe (d) unter Verwendung von HPLC unter Erhalt eines gereinigten zyklischen Peptids.
Verfahren nach Anspruch 1, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids der Formel Mpa(X)-Har(X)-Gly-Asp(X)-Trp-Pro-Cys(Acm), wobei X gleiche oder verschiedene Schutzgruppen bedeutet, b) Umsetzen des geschützten linearen Peptids aus Stufe (a) mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung eines halbgeschützten linearen Peptids Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH₂, c) Reinigen des halbgeschützten linearen Peptids aus Stufe (b) unter Verwendung von HPLC, d) Behandeln des gereinigten, halbgeschützten linearen Peptids aus Stufe (c) mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung eines zyklischen Peptids (1,7-zyklisches) Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH₂ und e) Reinigen des zyklischen Peptids aus Stufe (d) unter Verwendung von HPLC unter Erhalt eines gereinigten zyklischen Peptids.
Verfahren nach Anspruch 1, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids der Formel Mpa(X)-Tyr(X)-Phe-Gln(X)-Asn(X)-Cys(Acm)-Pro-D-Arg(X)-Gly, wobei X gleiche oder verschiedene Schutzgruppen bedeutet, b) Umsetzen des geschützten linearen Peptids aus Stufe (a) mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung eines halbgeschützten linearen Peptids Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂, c) Reinigen des halbgeschützten linearen Peptids aus Stufe (b) unter Verwendung von HPLC, d) Behandeln des gereinigten, halbgeschützten linearen Peptids aus Stufe (c) mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung eines zyklischen Peptids (1,6-zyklisches) Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂ und e) Reinigen des zyklischen Peptids aus Stufe (d) unter Verwendung von HPLC unter Erhalt eines gereinigten zyklischen Peptids.
Verfahren nach Anspruch 1, welches die folgenden Stufen umfaßt: a) Bereitstellen eines geschützten linearen Peptids der Formel Cys(X)-Ser(X)-Asn(X)-Leu-Ser(X)-Thr(X)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(X)-Leu-Ser(X)-Gln(X)-Glu(X)-Leu-His(X)-Lys(X)-Leu-Gln(X)-Thr(X)-Tyr(X)-Pro-Arg(X)-Thr(X)-Asn(X)-Thr(X)-Gly-Ser(X)-Gly-Thr(X)-Pro-NH₂, wobei X gleiche oder verschiedene Schutzgruppen bedeutet, b) Umsetzen des geschützten linearen Peptids aus Stufe (a) mit einer sauren Zusammensetzung unter Erzeugung eines halbgeschützten linearen Peptids Cys-Ser-Asn-Leu-Ser- Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂, c) Reinigen des halbgeschützten linearen Peptids aus Stufe (b) unter Verwendung von HPLC, d) Behandeln des gereinigten, halbgeschützten linearen Peptids aus Stufe (c) mit einem Oxidationsmittel unter Erzeugung eines zyklischen Peptids (1,7-zyklisches) Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ und e) Reinigen des zyklischen Peptids aus Stufe (d) unter Verwendung von HPLC unter Erhalt eines gereinigten zyklischen Peptids.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15, 16, 17 oder 18, wobei das gereinigte zyklische Peptid aus Stufe (e) eine Reinheit von wenigstens etwa 98,5%, ermittelt durch HPLC, hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15, 16, 17 oder 18, wobei das gereinigte zyklische Peptid aus Stufe (e) eine Reinheit von wenigstens etwa 99%, ermittelt durch HPLC, hat.