DE60132972T2 - IMPROVED FERMENTATION PROCESS - Google Patents

Description

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Fermentationsmedium und ein Verfahren zum Herstellen einer aliphatischen Polycarbonsäure unter Verwendung des Mediums.The The present invention relates to an improved fermentation medium and a method for producing an aliphatic polycarboxylic acid Use of the medium.

Langkettige alpha,omega-Dicarbonsäuren, d. h. solche mit 9 oder mehr Kohlenstoffatomen, werden als Ausgangsmaterialien bei der Synthese einer Vielfalt von chemischen Produkten und Polymeren verwendet.Long-chain alpha, omega-dicarboxylic acids, d. H. those with 9 or more carbon atoms are used as starting materials in the synthesis of a variety of chemical products and polymers used.

Zweiwertige Säuren mit mehr als vier Kohlenstoffatomen werden gegenwärtig beinahe ausschließlich durch nichtbiologische Umwandlungsverfahren hergestellt. Diese Arten von chemischen Verfahren zur Herstellung von zweiwertigen Säuren weisen mehrere Beschränkungen und Nachteile auf. Jedes Verfahren ist auf die Herstellung von zweiwertigen Säuren mit einer bestimmten Länge der Kohlenstoffkette, die von den verwendeten Ausgangsmaterialien abhängt, beschränkt. Beispielsweise geht das Dodecandisäure-Verfahren von Butadien aus, so dass die Produkte dieses Reaktionsverfahrens auf Säuren mit Kettenlängen, die Mehrfache von vier darstellen, beschränkt sind. Außerdem stehen die Verfahren auf der Grundlage von nicht erneuerbaren petrochemischen Rohstoffen, und bei den Mehrreaktions-Umwandlungsverfahren entstehen unerwünschte Nebenprodukte, die zu einer verringerten Ausbeute, Schwermetallabfällen und Stickstoffoxiden, die in einem Reduktionsofen zerstört werden müssen, führen.divalent acids with more than four carbon atoms are currently almost exclusively by Non-biological conversion process produced. These types of chemical processes for the production of dibasic acids several restrictions and disadvantages. Each process is based on the production of divalent acids with a certain length the carbon chain derived from the starting materials used depends limited. For example, the dodecanedioic acid method is butadiene so that the products of this reaction process on acids with Chain lengths, which are multiples of four, are limited. In addition, stand the procedures based on non-renewable petrochemical Raw materials, and in the multi-reaction conversion process arise undesirable Byproducts resulting in reduced yield, heavy metal waste and Nitrogen oxides that are destroyed in a reduction furnace have to, to lead.

Biologische Umwandlungsverfahren zur Herstellung von zweiwertigen Säuren zeigen mehrere mögliche Vorteile gegenüber den bestehenden nichtbiologischen Umwandlungsverfahren. Der wichtigste davon ist die Verwendung von erneuerbaren Rohstoffen als Ausgangsmaterialien und die Möglichkeit, die zweiwertige Säure ohne die Entstehung von gefährlichen chemischen Nebenprodukten, die kostspielige Abfallentsorgungsverfahren erforderlich machen, herzustellen.biological Show conversion process for the production of dibasic acids several possible Advantages over the existing non-biological conversion process. The most important of which is the use of renewable raw materials as starting materials and the possibility the dibasic acid without the emergence of dangerous chemical by-products, the costly waste disposal process make necessary to manufacture.

Ein weiterer wichtiger Vorteil der Verwendung eines biologischen Verfahrens liegt darin, dass ein solches Verfahren einfach dafür eingerichtet werden kann, eine breite Vielfalt von zweiwertigen Säuren mit dem gleichen Biokatalysator und der gleichen Ausrüstung herzustellen. Da die gängigen organischen chemischen Synthesen nur für die Herstellung einer einzigen zweiwertigen Säure geeignet sind, würde die Synthese von mehreren verschiedenen zweiwertigen Säuren für jede zweiwertige Säure die Entwicklung eines neuen Syntheseschemas erfordern. Andererseits kann ein Hefe-Biokatalysator verwendet werden, um mit der gleichen Ausrüstung, dem gleichen Medium und den gleichen Protokollen zweiwertige Säuren mit verschiedenen Längen herzustellen, einfach indem der Hefe verschiedene Substrate geboten werden.One another important advantage of using a biological process lies in the fact that such a procedure simply set up for it It can be used with a wide variety of dibasic acids the same biocatalyst and the same equipment. Since the usual organic chemical syntheses only for the production of a single divalent acid would be suitable the synthesis of several different dibasic acids for each bivalent Acid the Require development of a new synthesis scheme. on the other hand can be a yeast biocatalyst used to be with the same equipment, the same medium and to produce divalent acids of different lengths and the same protocols, simply by the yeast different substrates are offered.

Die U.S.-Patentschrift Nr. 6,004,784 , deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, offenbart ein halbsynthetisches Fermentationsmedium, das Mais-Einweichlauge und Brauhefe-Extrakt verwendet, um die Kosten von herkömmlichen Fermentationsmedien, die kostspielige, stark standardisierte Hefeextrakte und Hefe-Stickstoff-Basen einsetzen, zu verringern.The U.S. Patent No. 6,004,784 the entire contents of which are incorporated herein by reference, discloses a semi-synthetic fermentation medium which uses corn steep liquor and brewing yeast extract to reduce the cost of conventional fermentation media employing costly, highly standardized yeast extracts and yeast nitrogen bases.

Mit der Verwendung solcher preiswerter Ersatzstoffe sind vielfache Probleme verbunden. Sie ergeben eine Fermentationsbrühe mit wesentlichen Geruchsemissionen beim Durchblasen mit Luft. Teilchenförmiges Material, insbesondere in Kombination mit hohen Bakterienpegeln, in Mais-Einweichlauge und rohen Hefeextrakten macht diese schwierig zu sterilisieren und trägt zur Keimzahl auf der Ausrüstung zum Sterilisieren der Medien bei.With The use of such inexpensive substitutes are multiple problems connected. They give a fermentation broth with significant odor emissions when blowing through with air. Particulate material, in particular in combination with high levels of bacteria, in corn steep liquor and raw yeast extracts makes them difficult to sterilize and contributes to Germ number on the equipment to sterilize the media.

Diese Ersatzstoffe enthalten auch viele nichtmetabolisierbare Komponenten, die zu Problemen mit der Farbe und der Farbstabilität beitragen und die unter Verwendung von zusätzlichen Reinigungsschritten mit deren unvermeidbaren Materialverlusten gelöst werden müssen. Die Wahl dieser Ersatzstoffe senkt zwar die Kosten für das Medium, sie führt aber zu zusätzlichen Verarbeitungskosten. Es bleibt daher ein Bedarf an einem preiswerten Biofermentationsmedium, das Nährstoffe zum Tragen des Wachstums des Hefe-Biokatalysators bereitstellt und eine hohe, spezifische Produktivität von Polycarbonsäuren, Polyolen und Polyhydroxysäuren ermöglicht.These Substitutes also contain many non-metabolizable components, which contribute to problems with color and color stability and those using additional Cleaning steps are solved with their unavoidable material losses have to. Although the choice of these substitutes lowers the cost of the medium, she leads but to additional Processing costs. There remains therefore a need for a cheap one Biofermentation medium containing nutrients provides for supporting the growth of the yeast biocatalyst and a high, specific productivity of polycarboxylic acids, Polyols and polyhydroxy acids allows.

Obwohl langkettige Dicarbonsäuren in ihrer nichtdissoziierten Form oder partiellen Salzform nur eine begrenzte Löslichkeit in Wasser aufweisen, müssen sie in vielen Fällen in einem wässrigen Medium gehandhabt werden. Beispiele dafür umfassen Fermentations- und Rückgewinnungsverfahren, die zur Herstellung von Dicarbonsäuren verwendet werden, Grenzflächen-Polymerisationsreaktionen, Emulsionspolymerisationsreaktionen und enzymatische Reaktionen.Even though long-chain dicarboxylic acids in its non-dissociated form or partial salt form only a limited solubility in water they in many cases in an aqueous Medium handled. Examples include fermentation and Recovery process, used for the preparation of dicarboxylic acids, interfacial polymerization reactions, Emulsion polymerization reactions and enzymatic reactions.

Wässrige Suspensionen von langkettigen Dicarbonsäuren sind tendenziell hochviskos und daher schwer zu handhaben. Die wichtigsten Betriebsvorgänge bei Fermentationsreaktionen zur Herstellung von Dicarbonsäuren umfassen Sauerstoffübertragung, Wärmeübertragung, Zurückhalten von Gas in der Fermentationsbrühe und Zurückhalten der Brühe von dem austretenden Gas (Schäumen), die alle von den rheologischen Eigenschaften der Brühe beeinflusst werden. Gleichermaßen führt eine hohe Viskosität bei Filtrationsschritten zum Gewinnen der Dicarbonsäuren aus der Fermentationsbrühe zu ungünstigen Filtrationsraten. Bei Polymerisations- und Enzymreaktionen stellen Viskositätseinflüsse auf den Massentransport einen wesentlichen Gesichtspunkt dar, da ein schneller und vorhersehbarer Kontakt der Reagenzien gewünscht wird.Aqueous suspensions of long-chain dicarboxylic acids tend to be highly viscous and therefore difficult to handle. The most important operations in fermentation reactions for the production of dicarboxylic acids Oxygen transfer, Heat transfer, retention of gas in the fermentation broth and holding back the broth from the escaping gas (foaming), all influenced by the rheological properties of the broth become. equally leads one high viscosity during filtration steps to recover the dicarboxylic acids the fermentation broth too unfavorable Filtration rates. In the case of polymerization and enzyme reactions Viscosity influences on Mass transport is an essential aspect, as a rapid and predictable contact of the reagents is desired.

In DE 2 909 420 A1 beschreiben Watanabe et al. ein Verfahren zum Behandeln von Suspensionen langkettiger Dicarbonsäuren in einer zellenfreien Fermentationsbrühe zum Verbessern der Filtrationsraten und der Reinheit der gewonnenen zweiwertigen Säuren. Sie konnten zeigen, dass durch 1 Stunde oder längeres Wärmen der wässrigen Dicarbonsäuresuspension mit einem pH-Wert von 4 oder niedriger bei über 50°C die Teilchengrößenverteilung und die Teilchenmorphologie gesteuert werden konnten. Sie beschreiben, dass sie die Teilchen bis zu einer mittleren Teilchengröße von 40 bis 50 μm wachsen ließen und dadurch verbesserte Filtrationsraten, eine geringere Feuchtigkeit des Filterkuchens und eine höhere Reinheit der Dicarbonsäuren im Filterkuchen erhalten konnten. Leider ist dieses Verfahren bei vielen Anwendungen, bei denen wässrige Suspensionen von langkettigen Dicarbonsäuren eingesetzt werden, nur von beschränktem Nutzen.In DE 2 909 420 A1 describe Watanabe et al. a method for treating suspensions of long-chain dicarboxylic acids in a cell-free fermentation broth to improve the filtration rates and purity of the dibasic acids recovered. They were able to show that the particle size distribution and particle morphology could be controlled by heating the aqueous dicarboxylic acid suspension having a pH of 4 or lower at over 50 ° C for 1 hour or more. They describe that they allowed the particles to grow to an average particle size of 40 to 50 microns and thus could obtain improved filtration rates, lower moisture of the filter cake and higher purity of the dicarboxylic acids in the filter cake. Unfortunately, this process is of limited use in many applications where aqueous suspensions of long chain dicarboxylic acids are used.

Viele Fermentations- und Enzymreaktionen verlaufen in einem breiteren pH-Wert-Bereich und unterhalb von 50°C. Unter den von Watanabe et al. beschriebenen Bedingungen würde in vielen Fällen die enzymatische und mikrobielle Aktivität zerstört. Grenzflächen- und Emulsionspolymerisationsreaktionen mit wässrigen Dicarbonsäuresuspensionen wären nur auf wärmestabile Reagenzien beschränkt. Es besteht daher Bedarf an anderen Verfahren zum Steuern der rheologischen Eigenschaften von wässrigen Suspensionen langkettiger Dicarbonsäuren.Lots Fermentation and enzyme reactions run in a broader pH range and below 50 ° C. Among those of Watanabe et al. conditions described in many cases destroys the enzymatic and microbial activity. Interfacial and emulsion polymerization reactions with watery Dicarbonsäuresuspensionen would only be on heat stable Limited reagents. There is therefore a need for other methods of controlling the rheological Properties of aqueous Suspensions of long-chain dicarboxylic acids.

Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention

Bei einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Fermentationsmedium und ein Verfahren zum Herstellen von Polycarbonsäuren, Polyolen und Polyhydroxysäuren unter Verwendung des Mediums. Das Fermentationsmedium umfasst:

• (a) eine Quelle von metabolisierbarem Kohlenstoff und Energie;
• (b) eine Quelle von anorganischem Stickstoff;
• (c) eine Quelle von Phosphat;
• (d) wenigstens ein Metall, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallen, Erdalkalimetallen, Übergangsmetallen und Gemischen davon; und
• (e) eine Quelle von Biotin, das im Wesentlichen frei von Teilchensubstanz und Bakterien ist.

In one embodiment, the present invention relates to a fermentation medium and a process for producing polycarboxylic acids, polyols and polyhydroxy acids using the medium. The fermentation medium comprises:

• (a) a source of metabolizable carbon and energy;
• (b) a source of inorganic nitrogen;
• (c) a source of phosphate;
• (d) at least one metal selected from the group consisting of alkali metals, alkaline earth metals, transition metals and mixtures thereof; and
• (e) a source of biotin that is substantially free of particulate matter and bacteria.

Ein Verfahren zum Herstellen von Polycarbonsäuren, Polyolen und Polyhydroxysäuren, umfassend:

• (a) Bereitstellen eines Organismus, der zum Herstellen einer Polycarbonsäure, eines Polyols oder einer Polyhydroxysäure fähig ist;
• (b) Bereitstellen eines Substrats, das von dem Organismus zu einer Polycarbonsäure, einem Polyol oder einer Polyhydroxysäure umgewandelt werden kann;
• (c) Bereitstellen eines Fermentationsmediums, umfassend:
• (i) eine Quelle von metabolisierbarem Kohlenstoff und Energie;
• (ii) eine Quelle von anorganischem Stickstoff;
• (iii) eine Quelle von Phosphat;
• (iv) wenigstens ein Metall, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallen, Erdalkalimetallen, Übergangsmetallen und Gemischen davon; und
• (v) eine Quelle von Biotin, das im Wesentlichen frei von Teilchensubstanz und Bakterien ist; und
• (d) Fermentieren des Organismus in dem Fermentationsmedium.

A process for producing polycarboxylic acids, polyols and polyhydroxy acids, comprising:

• (a) providing an organism capable of producing a polycarboxylic acid, a polyol or a polyhydroxy acid;
• (b) providing a substrate which can be converted by the organism to a polycarboxylic acid, a polyol or a polyhydroxy acid;
• (c) providing a fermentation medium comprising:
• (i) a source of metabolizable carbon and energy;
• (ii) a source of inorganic nitrogen;
• (iii) a source of phosphate;
• (iv) at least one metal selected from the group consisting of alkali metals, alkaline earth metals, transition metals and mixtures thereof; and
• (v) a source of biotin that is substantially free of particulate matter and bacteria; and
• (d) fermenting the organism in the fermentation medium.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine wässrige Suspension, die wenigstens eine Dicarbonsäure umfasst und auch Wasser und ein Fettmaterial in einer Menge umfasst, die dazu wirksam ist, die Bildung von im Wesentlichen scheibenförmigen, im Wesentlichen partiell kugelförmigen oder im Wesentlichen kugelförmigen Dicarbonsäureteilchen zu bewirken.The The present invention also relates to an aqueous suspension containing at least includes a dicarboxylic acid and also includes water and a fatty material in an amount that goes with it is effective, the formation of essentially disk-shaped, essentially partially spherical or substantially spherical Dicarbonsäureteilchen to effect.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, umfassend das Zugeben einer zum Bilden der Dicarbonsäure-Teilchenform wirksamen Menge eines Fettmaterials zu der Suspension, um die Bildung von geformten Dicarbonsäureteilchen zu bewirken, wobei die Form ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus im Wesentlichen scheibenförmig, im Wesentlichen partiell kugelförmig und im Wesentlichen kugelförmig.The present invention also relates to a method for modifying the rheological properties of an aqueous suspension containing a dicarboxylic acid, comprising adding to the suspension an amount of a fatty material effective to form the dicarboxylic acid particulate form to prevent the formation of to form shaped dicarboxylic acid particles, wherein the form is selected from the group consisting of substantially disc-shaped, substantially partially spherical and substantially spherical.

Kurze Beschreibung der FigurBrief description of the figure

1 zeigt eine graphische Darstellung der Brookfield-Viskosität einer 7%-igen wässrigen Fermentationsbrühen-Suspension von Dicarbonsäuren unter Verwendung eines Fettmaterials zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften der Brühe. 1 Figure 9 is a graph of the Brookfield viscosity of a 7% aqueous fermentation broth suspension of dicarboxylic acids using a fatty material to modify the rheological properties of the broth.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Alle Zahlen, die Mengen von Bestandteilen und/oder Reaktionsbedingungen ausdrücken, sind so zu verstehen, dass sie stets durch den Begriff „etwa" ergänzt sind.All Numbers, the quantities of constituents and / or reaction conditions express, are to be understood that they are always supplemented by the term "about".

Durch die wohlüberlegte Auswahl von anderen Nährstoffen zum Tragen des mikrobiellen Wachstums stellt die Erfindung ein Medium bereit, das die wirtschaftliche Herstellung von polyfunktionellen Materialien in großen Mengen unter Verwendung eines biologischen Umwandlungsverfahrens ermöglicht. Die Erfindung stellt eine kostengünstige Alternative zu Medien im Stand der Technik sowie Verfahren zu ihrer Verwendung bereit, die einfach herzustellen und zu sterilisieren ist, einen geringen Geruchspegel aufweist, zu einer geringeren Belastung durch Verunreinigungen für die nachfolgenden Verfahren führt und dennoch die Herstellung des Produkts mit einer wenigstens gleich hohen Ausbeute wie bei herkömmlichen Verfahren im Stand der Technik ermöglicht. Es ist überraschend, dass die unzähligen nicht identifizierten Komponenten von Mais-Einweichlauge und Hefeextrakt durch vergleichsweise wenige Komponenten ersetzt werden können, ohne die Qualität des mikrobiellen Wachstums und die Produktivität von polyfunktionellen Verbindungen zu opfern.By the thoughtful Selection of other nutrients for carrying the microbial growth, the invention provides a medium ready for the economic production of polyfunctional Materials in big Quantities using a biological conversion process allows. The invention provides a cost effective alternative to media in the prior art as well as methods for their use, which is easy to make and sterilize, a small one Odor level, to a lower burden of impurities for the following procedure leads and yet the manufacture of the product with one at least equal high yield as with conventional Method in the prior art allows. It is surprising that the countless unidentified components of corn steep liquor and yeast extract comparatively few components can be replaced without the quality microbial growth and productivity of polyfunctional compounds to sacrifice.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird also ein wirtschaftliches Fermentationsmedium bereitgestellt, das die biologische Umwandlung von verschiedenen Arten von Substraten ermöglicht. Das Fermentationsmedium umfasst folgende notwendige Komponenten: (i) eine Quelle von metabolisierbarem Kohlenstoff und Energie; (ii) eine Quelle von anorganischem Stickstoff; (iii) eine Quelle von Phosphat; (iv) wenigstens ein Metall, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallen, Erdalkalimetallen und Gemischen davon; und (v) eine Quelle von Biotin, das im Wesentlichen frei von Teilchensubstanz und Bakterien ist. Diese Materialien allein erfüllen die grundlegenden Nährstofferfordernisse zum Wachstum des Mikroorganismus und ergeben eine Biomasse, deren Menge und Qualität zur Durchführung der biologischen Umwandlung ausreicht.According to one embodiment The present invention thus becomes an economical fermentation medium provided the biological conversion of different Types of substrates allows. The fermentation medium comprises the following necessary components: (i) a source of metabolizable carbon and energy; (Ii) a source of inorganic nitrogen; (iii) a source of Phosphate; (iv) at least one metal selected from the group consisting alkali metals, alkaline earth metals and mixtures thereof; and V) a source of biotin that is essentially free of particulate matter and bacteria is. These materials alone meet the basic nutrient requirements to the growth of the microorganism and yield a biomass whose Quantity and quality to carry out sufficient for biological conversion.

Geeignete Quellen von metabolisierbarem Kohlenstoff und Energie umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Glucose, Fructose, Maltose, Glycerin, Natriumacetat, Methanol, kurzkettige Alkohole und Gemische davon. Die bevorzugte Quelle von metabolisierbarem Kohlenstoff und Energie ist Glucose, vorzugsweise ein flüssiger Glucosesirup, beispielsweise 95% dextroseäquivalenter Sirup oder ein sogar niedrigerer dextroseäquivalenter Sirup. Solche Materialien umfassen geringe Mengen von Disacchariden, Trisacchariden und Polysacchariden, die bei der Fermentation durch die Zugabe eines Amylaseenzyms, wie z. B. Amylase, Glucoamylase und Cellulase, hydrolysiert werden können. Somit kann zugleich mit der Biooxidation Glucose durch eine Reaktion in situ bereitgestellt werden.suitable Include sources of metabolizable carbon and energy, but are not limited to Glucose, fructose, maltose, glycerol, sodium acetate, methanol, short chain Alcohols and mixtures thereof. The preferred source of metabolizable Carbon and energy is glucose, preferably a liquid glucose syrup, for example 95% dextrose equivalent Syrup or even lower dextrose equivalent syrup. Such materials include small amounts of disaccharides, trisaccharides and polysaccharides, in the fermentation by the addition of an amylase enzyme, such as z. As amylase, glucoamylase and cellulase, can be hydrolyzed. Consequently may coincide with the biooxidation of glucose by a reaction in be provided in situ.

Anorganische Quellen von Stickstoff umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Alkalimetallnitrate, wie z. B. Natrium- oder Kaliumnitrat, Ammoniumsalze, wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat. Eine bevorzugte anorganische Stickstoffquelle ist Ammoniak oder Ammoniumhydroxid.inorganic Sources of nitrogen include, but are not limited to, alkali metal nitrates, such as z. As sodium or potassium nitrate, ammonium salts, such as. B. ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium nitrate and ammonium acetate. A preferred inorganic nitrogen source is ammonia or ammonium hydroxide.

Eine weitere notwendige Komponente des Fermentationsmediums gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Quelle von Phosphat, umfassend beliebige phosphathaltige Verbindungen. Beispiele davon umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Kaliumphosphat, Natriumphosphat und Ammoniumphosphat. Eine besonders bevorzugte Quelle von Phosphat zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist Kaliumphosphat.A further necessary component of the fermentation medium according to the present invention Invention is a source of phosphate, including any phosphate-containing Links. Examples thereof include, but are not limited to, potassium phosphate, Sodium phosphate and ammonium phosphate. A particularly preferred Source of phosphate for use in the present invention is potassium phosphate.

Geeignete Metalle zur Verwendung in dem Fermentationsmedium umfassen Alkalimetalle, Erdalkalimetalle, Übergangsmetalle und Gemische davon. Besonders bevorzugte Metalle umfassen Kalium, Calcium, und Magnesium in Kombination.suitable Metals for use in the fermentation medium include alkali metals, Alkaline earth metals, transition metals and mixtures thereof. Particularly preferred metals include potassium, Calcium, and magnesium in combination.

Die letzte entscheidende Komponente des Fermentationsmediums ist Biotin, das im Wesentlichen frei von Teilchensubstanz und Bakterien ist.The last crucial component of the fermentation medium is biotin, which is substantially free of particulate matter and bacteria.

Jede der Komponenten des Mediums kann als Teil der sterilen Anfangsfüllung des Mediums beigegeben werden, zum späteren Zugeben zu dem Fermentationsmedium als konzentrierte, wässrige Lösung sterilisiert werden, oder dem Fermenter-Inokulum in einem großen Überschuss zugesetzt werden, um zu dem Produktionsfermenter überführt zu werden.each The components of the medium may be included as part of the sterile initial filling of the medium Medium are added, for later adding to the fermentation medium as concentrated, watery solution sterilized or added to the fermenter inoculum in a large excess to be transferred to the production fermenter.

Um Probleme mit einer Geruchsemission, Farbinstabilität und Verunreinigung zu vermeiden, ist es erforderlich, dass das Biotin frei von Teilchensubstanz und Bakterien ist, die solche Probleme fördern und bei dem Verfahren zusätzliche Reinigungsschritte notwendig machen. Die Menge an Biotin, die benötigt wird, ist um mehrere Größenordnungen kleiner als die der organischen Stickstoffquellen in Medien im Stand der Technik, die es ersetzt.Around Problems with odor emission, color instability and contamination To avoid this, it is necessary that the biotin be free of particulate matter and bacteria that promote such problems and in the process additional Make cleaning steps necessary. The amount of biotin needed is several orders of magnitude smaller than that of organic nitrogen sources in media in the state the technology that replaces it.

Das Fermentationsmedium gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst in wässriger Lösung: (a) von etwa 10 g/l bis etwa 60 g/l, vorzugsweise von etwa 20 g/l bis etwa 40 g/l, einer Quelle von metabolisierbarem Kohlenstoff und Energie, vorzugsweise Glucose; (b) von etwa 50 ppm bis etwa 2000 ppm, vorzugsweise von etwa 50 ppm bis etwa 250 ppm, am bevozugtesten von etwa 100 ppm bis etwa 250 ppm, Stickstoff, der durch das Einschließen einer anorganischen Stickstoffquelle bereitgestellt ist; (c) von etwa 1 g/l bis etwa 10 g/l, vorzugsweise von etwa 1 g/l bis etwa 7 g/l, einer Quelle von Phosphat, vorzugsweise Kaliumphosphat; (d) von etwa 0,01 g/l bis etwa 2 g/l, vorzugsweise von etwa 0,01 g/l bis etwa 1 g/l, wenigstens eines Metalls, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallen, Erdalkalimetallen und Gemischen davon, vorzugsweise ein Gemisch von Calcium und Magnesium; und (e) von etwa 1 μg/l bis etwa 2000 μg/l, vorzugsweise von etwa 4 μg/l bis etwa 200 μg/l, am bevorzugtesten von etwa 4 μg/l bis etwa 20 μg/l, Biotin, wobei das Biotin im Wesentlichen frei von schädlichen Teilchensubstanzen und Bakterien ist.The Fermentation medium according to the present Invention comprises in aqueous Solution: (a) from about 10 g / l to about 60 g / l, preferably from about 20 g / l to about 40 g / L, a source of metabolizable carbon and energy, preferably glucose; (b) from about 50 ppm to about 2000 ppm, preferably from about 50 ppm to about 250 ppm, most preferred from about 100 ppm to about 250 ppm, nitrogen, by inclusion of a inorganic nitrogen source is provided; (c) of about 1 g / l to about 10 g / l, preferably from about 1 g / l to about 7 g / l, a source of phosphate, preferably potassium phosphate; (d) of about 0.01 g / L to about 2 g / L, preferably from about 0.01 g / L to about 1 g / l, of at least one metal selected from the group consisting of alkali metals, alkaline earth metals and mixtures thereof, preferably one Mixture of calcium and magnesium; and (e) from about 1 μg / L to about 2000 μg / l, preferably about 4 μg / L up to about 200 μg / l, most preferably about 4 μg / L up to about 20 μg / l, Biotin, where the biotin is essentially free of harmful Particle substances and bacteria.

Das in dem Fermentationsmedium vorhandene Wasser kann ein Verfahrenswasser sein, das durch Destillation, Entionisierung oder Enthärten gereinigt ist. Bevorzugte Quellen von Wasser umfassen solche aus einem kommunalen Wasserversorgungssystem, einem Rücklaufstrom des Verfahrens oder Quellwasser, wobei bei Mineralstoffen, die bereits in diesen Quellen von Wasser vorhanden sind, gegebenenfalls Anpassungen des Mineralstoffgehalts in Betracht gezogen werden müssen. Beispielsweise kann das Wasser zusammen mit anderen benötigten Bestandteilen bereits ausreichend Mineralstoffkomponenten enthalten, um alle oder im Wesentlichen alle für das Wachstum des Organismus benötigten Mineralstoffe bereitzustellen.The Water present in the fermentation medium can be a process water be purified by distillation, deionization or softening is. Preferred sources of water include those from a municipal Water supply system, a return flow of the process or spring water, taking in minerals already in these sources of water are present, if necessary adjustments of the Mineral content must be considered. For example, that can Water together with others needed Ingredients already contain sufficient mineral components, all or essentially all of the growth of the organism required Provide minerals.

Das Fermentationsmedium gemäß der vorliegenden Erfindung erfüllt die grundlegenden Nährstofferfordernisse für das Wachstum des Mikroorganismus, während es die Zugabe von organischen und anorganischen Komponenten, die das Abtrennen von dem Produkt zur Entsorgung als Abfall erfordern und zur Emission von Verfahrensgeruch beitragen, auf ein Mindestmaß verringert. Im Gegensatz zu Fermentationsmedium-Zusammensetzungen, die im Stand der Technik bekannt sind, enthält das Medium gemäß der vorliegenden Erfindung keine Teilchensubstanz, ist für eine kontinuierliche Sterilisierung in einem automatischen Herstellungsverfahren für das Medium besonders gut geeignet, und ist preiswert. Trotz der nährstoffmäßig knappen Zusammensetzung der Medien, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, gibt es eine breite Flexibilität bei der Formulierung der Medien, wobei hohe Produktivitäten von Polycarbonsäuren, Polyolen und Polyhydroxysäuren erzielt werden.The Fermentation medium according to the present Invention satisfied the basic nutrient requirements for the Growth of the microorganism while It is the addition of organic and inorganic components that require separation from the product for disposal as waste and contribute to the emission of process odor, minimized. In contrast to fermentation medium compositions which are in the state are known in the art contains the medium according to the present Invention no particulate matter, is for continuous sterilization especially good in an automatic media production process suitable, and is inexpensive. Despite the nutrient-tight composition the media provided by the present invention there is a wide flexibility in the formulation of the media, with high productivities of polycarboxylic Polyols and polyhydroxy acids be achieved.

Bei dem Fermentationsmedium gemäß der vorliegenden Erfindung können auch verschiedene Arten von Hilfskomponenten eingesetzt werden, um das biologische Fermentierungsverfahren weiter zu verbessern. Beispiele davon umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, verschiedene Arten von Spurenmetallen, chelatbildende Mittel, Antischaummittel und dergleichen.at the fermentation medium according to the present invention Invention can also different types of auxiliary components are used to further improve the biological fermentation process. Examples thereof include, but are not limited to, various types of Trace metals, chelating agents, antifoams and the like.

Das Fermentationsmedium gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit jeder beliebigen Polycarbonsäure-herstellenden, Polyol-herstellenden und Polyhydroxysäure-herstellenden Hefe und einer breiten Vielfalt von Substraten hergestellt werden. Beispielsweise kann, wenn das gewünschte Produkt eine Polycarbonsäure ist, wie z. B. eine zweiwertige Säure, jede Art von Fettsäure-, Fettsäureester- oder Alkansubstrat verwendet werden. Beispiele von geeigneten Substraten für die Herstellung von zweiwertigen Säuren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Laurylsäure, Myristylsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Oleinsäure, Plamitoleinsäure und deren Methylester, sowie Gemische davon. Beispiele von Alkanen umfassen Dodecan, Dodecen, Tridecan, Tetradecan, Octadecan und dergleichen.The Fermentation medium according to the present The invention can be used with any polycarboxylic acid producing polyol and polyhydroxy acid producing Yeast and a wide variety of substrates are produced. For example, if the desired product is a polycarboxylic acid, such as A dibasic acid, any kind of fatty acid, fatty acid ester or alkane substrate. Examples of suitable substrates for the Preparation of dibasic acids include, but are not limited to, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, plamitolic acid and their methyl esters, as well as mixtures thereof. Examples of alkanes include Dodecane, dodecene, tridecane, tetradecane, octadecane and the like.

Somit wird ein Verfahren zur Herstellung einer Polycarbonsäure, eines Polyols oder einer Polyhydroxysäure bereitgestellt. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird nur zum Zweck der Erläuterung mit Bezug auf die Herstellung von Polycarbonsäuren, insbesondere von zweiwertigen Säuren, als Endprodukt beschrieben.Consequently is a process for producing a polycarboxylic acid, a Polyols or a polyhydroxy acid provided. The method according to the present invention is included for the purpose of explanation only With respect to the production of polycarboxylic acids, especially of divalent ones acids, described as end product.

Das Verfahren kann in jedem pH-Wert-Bereich betrieben werden, in dem der Mikroorganismus wachsen und die gewünschte Umwandlungsreaktion katalysieren kann. Ein bevorzugter und besonders vorteilhafter pH-Wert-Bereich liegt im sauren Bereich, d. h. bei einem pH-Wert von etwa 7 oder weniger. Die Verbesserung durch einen niedrigen pH-Wert kann bei jedem Fermentationsverfahren angewandt werden, es ist jedoch bei der Anwendung auf ein Fermentierungsverfahren, bei dem Polycarbonsäuren hergestellt werden, besonders vorteilhaft. Geeignete Reagenzien zum Steuern des pH-Werts sind Ammoniak, Ammoniumhydroxidlösung und konzentriertes Kalium- oder Natriumhydroxid.The Process can be operated in any pH range in which the microorganism grow and the desired conversion reaction can catalyze. A preferred and particularly advantageous pH range is in the acidic area, d. H. at a pH of about 7 or fewer. The improvement by a low pH may be helpful be applied to any fermentation process, but it is in the Application to a fermentation process in which polycarboxylic acids are produced be, especially advantageous. Suitable reagents for controlling of pH are ammonia, ammonium hydroxide solution and concentrated potassium or sodium hydroxide.

Das organische Substrat kann eine beliebige organische Verbindung sein, die biologisch zu einer Mono- oder Polycarbonsäure oxidiert werden kann. Eine solche Verbindung kann eine beliebige gesättigte oder ungesättigte aliphatische Verbindung sein, oder eine beliebige carboxylische oder heterocyclische aromatische Verbindung mit wenigstens einer endständigen Methylgruppe, einer endständigen Carboxygruppe und/oder einer endständigen funktionellen Gruppe, die durch Biooxidation zu einer Carboxygruppe oxidiert werden kann. In dem Substratmolekül kann eine endständige funktionelle Gruppe, die ein Derivat einer Carboxygruppe ist, vorliegen, die durch eine andere Reaktion als eine Biooxidation zu einer Carboxygruppe umgewandelt werden kann. Beispielsweise kann bei dem Fermentationsschritt ein Lipaseenzym zugesetzt werden, um Fettsäuren aus einem sonst nicht metabolisierbaren Ester freizusetzen.The organic substrate can be any organic compound which can be biologically oxidized to a mono- or polycarboxylic acid. A Such compound may be any saturated or unsaturated aliphatic Compound, or any carboxylic or heterocyclic aromatic compound having at least one terminal methyl group, a terminal Carboxy group and / or a terminal functional group, which can be oxidized by biooxidation to a carboxy group. In the substrate molecule can be a terminal functional group which is a derivative of a carboxy group, by a reaction other than a biooxidation to a carboxy group can be converted. For example, in the fermentation step A lipase enzyme may be added to avoid fatty acids from one else releasable metabolizable ester.

Alkane sind eine Art von gesättigtem organischem Substrat, das bei der Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar ist. Die Alkane können linear oder cyclisch, verzweigt oder geradkettig, substituiert oder unsubstituiert sein. Besonders bevorzugte Alkane sind solche mit etwa 4 bis etwa 25 Kohlenstoffatomen, wie z. B., ohne darauf beschränkt zu sein, Butan, Hexan, Octan, Nonan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Octadecan und dergleichen.alkanes are a kind of saturated organic substrate used in carrying out the process according to the present invention Invention is usable. The alkanes can be linear or cyclic, branched or straight chain, substituted or unsubstituted. Particularly preferred alkanes are those having from about 4 to about 25 carbon atoms, such as B. without limitation butane, hexane, octane, nonane, dodecane, tridecan, tetradecane, Octadecane and the like.

Beispiele von ungesättigten organischen Substraten, die bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, innere Olefine, wie z. B. 2-Penten, 2-Hexen, 3-Hexen, 9-Octadecen und dergleichen; ungesättigte Carbonsäuren, wie z. B. 2-Hexensäure und Ester davon, Oleinsäure und Ester davon, einschließlich Triglycerylester mit einem vergleichsweise hohen Oleinsäuregehalt, Erucasäure und Ester davon, einschließlich Triglycerylester mit einem vergleichsweise hohen Erucasäuregehalt, Ricinoleinsäure und Ester davon, einschließlich Triglycerylester mit einem vergleichsweise hohen Ricinoleinsäuregehalt, Linolsäure und Ester davon, einschließlich Triglycerylester mit einem vergleichsweise hohen Oleinsäuregehalt; ungesättigte Alkohole, wie z. B. 3-Hexen-1-ol, 9-Octadecen-1-ol und dergleichen; ungesättigte Aldehyde, wie z. B. 3-Hexen-1-al, Octadecen-1-al und dergleichen. Zusätzlich zu den vorstehend genannten Verbindungen umfassen die organischen Substrate, die bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, alicyclische Verbindungen mit wenigstens einer inneren Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung und wenigstens einer endständigen Methylgruppe, einer endständigen Carboxygruppe und/oder einer endständigen funktionellen Gruppe, die durch Biooxidation zu einer Carboxygruppe oxidiert werden kann. Beispiele solcher Verbindungen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, 3,6-Dimethyl-1,4-cyclohexadien; 3-Methylcyclohexen; 3-Methyl-1,4-cyclohexadien und dergleichen.Examples of unsaturated organic substrates used in the process according to the present invention can be used include, but are not limited to, internal olefins, such as. 2-pentene, 2-hexene, 3-hexene, 9-octadecene and the like; unsaturated carboxylic acids, such as z. For example, 2-hexenoic acid and esters thereof, oleic acid and esters thereof, including Triglyceryl esters with a comparatively high oleic acid content, erucic and esters thereof, including Triglyceryl esters with a comparatively high erucic acid content, ricinoleic and esters thereof, including Triglyceryl esters with a comparatively high ricinoleic acid content, linoleic acid and esters thereof, including Triglyceryl esters with a comparatively high oleic acid content; unsaturated Alcohols, such as. 3-hexen-1-ol, 9-octadecen-1-ol and the like; unsaturated Aldehydes, such as. 3-hexene-1-al, octadecene-1-al and the like. In addition to the above-mentioned compounds include the organic substrates, in the method according to the present invention Invention can be used alicyclic compounds having at least one internal carbon-carbon double bond and at least one terminal one Methyl group, one terminal Carboxy group and / or a terminal functional group, which can be oxidized by biooxidation to a carboxy group. Examples of such compounds include, but are not limited to limited, 3,6-dimethyl-1,4-cyclohexadiene; 3-methylcyclohexene; 3-methyl-1,4-cyclohexadiene and the same.

Beispiele von aromatischen Verbindungen, die bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Arene, wie z. B. o-, m-, p-Xylol; o-, m-, p-Methylbenzoesäure; Dimethylpyridin und dergleichen. Das organische Substrat kann auch andere funktionelle Gruppen enthalten, die biologisch zu Carboxygruppen oxidiert werden können, wie z. B. eine Aldehyd- oder Alkoholgruppe. Das organische Substrat kann auch andere funktionelle Gruppen enthalten, die nicht biologisch zu Carboxygruppen oxidiert werden können und die Biooxidation nicht stören, wie z. B. Halogene, Ether und dergleichen.Examples of aromatic compounds which are used in the process according to the present invention Invention can be used include, but are not limited to, arenes such as e.g. B. o-, m-, p-xylene; o-, m-, p-methylbenzoic acid; Dimethyl pyridine and the like. The organic substrate can also contain other functional groups that are biologically to carboxy groups can be oxidized, such as B. an aldehyde or alcohol group. The organic substrate may also contain other functional groups that are not biological can be oxidized to carboxy groups and not biooxidation to disturb, such as Halogens, ethers and the like.

Der Kultur kann bei der Stufe der Fermentation, also wenn die Kultur das Substrat aktiv zu Produkten oxidiert, ein Cosubstrat bereitgestellt werden. Dies ist besonders dann zutreffend, wenn aus der Substratreaktion selbst kein nettoverwendbarer Kohlenstoff oder keine Energie gewonnen werden kann, so dass der Kohlenstoff und die Energie dann von dem Cosubstrat bereitgestellt wird.Of the Culture can be at the stage of fermentation, so if the culture actively oxidizing the substrate to produce a cosubstrate become. This is especially true if out of the substrate reaction even no net usable carbon or energy gained can be so that the carbon and the energy then from the Cosubstrat is provided.

Das Cosubstrat ist ein fermentierbares Kohlenhydrat, wie z. B. Glucose, Fructose oder Maltose; oder eine andere fermentierbare organische Verbindung, wie z. B. Glycerin, Natriumacetat, Methanol oder kurzkettige Alkohole; oder Gemische davon. Das bevorzugte Cosubstrat ist Glucose, vorzugsweise ein flüssiger Glucosesirup, beispielsweise ein 95% dextroseäquivalenter Sirup oder ein sogar niedrigerer dextroseäquivalenter Sirup. Solche Materialien umfassen geringe Mengen von Disacchariden, Trisacchariden und Polysacchariden, die bei der Fermentation durch die Zugabe eines Amylaseenzyms, wie z. B. α-Amylase, Glucoamylase und Cellulase, hydrolysiert werden können. Daher kann zugleich mit der Biooxidation Glucose durch eine Reaktion in situ bereitgestellt werden.The cosubstrate is a fermentable carbohydrate, such as. Glucose, fructose or maltose; or another fermentable organic compound, such as. Glycerol, sodium acetate, methanol or short chain alcohols; or mixtures thereof. The preferred cosubstrate is glucose, preferably a liquid glucose syrup, for example, a 95% dextrose equivalent syrup or an even lower dextrose equivalent syrup. Such materials include minor amounts of disaccharides, trisaccharides, and polysaccharides which, in the fermentation, are replaced by the addition of an amylase enzyme, such as, e.g. B. α-amylase, glucoamylase and Cellulase, can be hydrolyzed. Therefore, glucose can be provided by reaction in situ simultaneously with the bio-oxidation.

Es ist zweckmäßig, aber nicht absolut notwendig, wenn die Quelle von Kohlenstoff und Energie, die für das Wachstum der Biomasse verwendet wird, das gleiche wie das Cosubstrat ist, das zum Treiben der oxidativen Umwandlungsreaktion verwendet wird. Der praktische Vorteil liegt darin, dass weniger Ausgangsmaterialien gehandhabt werden müssen und die verschiedenen Stufen der Fermentation gut zusammengefügt werden können. So kann ein einziges System zur Sterilisierung und Abgabe von Cosubstrat verwendet werden, um sowohl die Quelle von Kohlenstoff und Energie für das Wachstum der Biomasse als auch das Cosubstrat zum Treiben der Oxidationsreaktion abzugeben.It is functional, but not absolutely necessary if the source of carbon and energy, the for the biomass growth is used the same as the cosubstrate that is used to drive the oxidative conversion reaction becomes. The practical advantage is that less starting materials must be handled and the various stages of fermentation are well put together can. Thus, a single system for sterilizing and dispensing cosubstrate used to both the source of carbon and energy for the Growth of the biomass as well as the cosubstrate for driving the oxidation reaction leave.

Der Mikroorganismus, der bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist ein beliebiger Mikroorganismus, der zum wie hier beschriebenen biologischen Oxidieren des Substrats fähig ist. Der Mikroorganismus kann ein beliebiger Mikroorganismus sein, bei dem die beta-Oxidation durch Unterbrechung, Inaktivierung oder Deletion eines oder mehrerer Acyl-CoA-oxidase-Gen(e) teilweise oder vollständig blockiert ist; eine beliebige Hefe, bei der die beta-Oxidation durch Inaktivierung oder Deletion eines oder mehrerer Acyl-CoA-oxidase-Gen(e) teilweise oder vollständig unterbrochen ist; ein beliebiger Candida-Stamm, bei dem die beta-Oxidation durch Inaktivierung oder Deletion eines oder mehrerer Acyl-CoA-oxidase-Gen(e) teilweise oder vollständig unterbrochen ist. Wenn das Fermentationsverfahren mit der Biooxidation eines Substrats zu einer Carbonsäure verbunden ist, wird der Mikroorganismus normalerweise eine Hefe sein. Ein solcher Mikroorganismus kann das Substrat auf eine solche Weise oxidieren, dass die gebildeten Mono- und/oder Dicarbonsäuren nicht durch Abbau weiter oxidiert werden, um zu kürzeren Ketten zu führen. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft jedoch die Verwendung eines beliebigen Mikroorganismus.Of the Microorganism used in the method according to the present invention can be used, is any microorganism, the as described herein biologically oxidizing the substrate. The microorganism may be any microorganism the beta oxidation by interruption, inactivation or deletion one or more acyl-CoA oxidase gene (s) partially or completely blocked is; Any yeast that undergoes beta oxidation by inactivation or deletion of one or more acyl-CoA oxidase gene (s) in part or completely is interrupted; any Candida strain that undergoes beta oxidation by inactivation or deletion of one or more acyl-CoA oxidase gene (s) partially or completely is interrupted. When the fermentation process with the bio-oxidation a substrate to a carboxylic acid normally, the microorganism will normally be a yeast. Such a microorganism may be the substrate in such a way oxidize that the mono- and / or dicarboxylic acids formed not further oxidized by degradation to result in shorter chains. The procedure according to the present However, the invention relates to the use of any microorganism.

Hefestämme, die alpha,omega-Dicarbonsäuren als Nebenprodukt absondern, wenn sie auf Alkanen oder Fettsäuren als Kohlenstoffquelle kultiviert werden, werden in der U.S.-Patentschrift Nr. 5,254,466 , deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird, beschrieben. Bei diesen Stämmen handelt es sich um teilweise oder vollständig oxidationsblockierte Stämme; d. h., sie sind genetisch so modifiziert, dass die chromosomalen Gene POX4A, POX4B und beide POX5 unterbrochen sind. Als Folge der funktionellen Inaktivierung des konkurrierenden β-Oxidationswegs durch die PDX-Genunterbrechung wird bei diesem Stamm der Substratstrom zu dem omega-Oxidationsweg umgelenkt. Ein vollständig oxidationsblockierter Stamm ist der C. tropicalis-Stamm H5343 (ATCC 20962), der in der U.S.-Patentschrift Nr. 5,254,466 beschrieben wird.Yeast strains that secrete alpha, omega-dicarboxylic acids as a by-product when cultured on alkanes or fatty acids as a carbon source are described in US Pat U.S. Patent No. 5,254,466 the entire contents of which are incorporated herein by reference. These strains are partially or completely oxidation-blocked strains; that is, they are genetically engineered to disrupt the chromosomal genes POX4A, POX4B, and both POX5. As a consequence of the functional inactivation of the competing β-oxidation pathway by the PDX gene disruption, this strain shifts the substrate current to the omega-oxidation pathway. A completely oxidation-blocked strain is the C. tropicalis strain H5343 (ATCC 20962), which is described in U.S. Pat U.S. Patent No. 5,254,466 is described.

Ein weiterer geeigneter Stamm ist ein solcher, bei dem ein oder mehrere Reduktase-Gene verstärkt sind, um eine Zunahme der Menge der ratenbeschränkenden omega-Hydroxylase durch 2450-Genverstärkung und eine Zunahme der Rate des Substratstroms durch den ω-Oxidationsweg zu ergeben. Stämme, welche die Menge der für die Oxidation von Fettsäuren wichtigen Enzyme erhöhen, sind ebenfalls bevorzugt. Solche Stämme enthalten vermehrte Kopien der CYP- und CPR-Gene. Diese Gene sind als diejenigen identifiziert worden, die die Herstellung des ω-Hydroxylasekornplexes, der die erste Stufe des Oxidationswegs katalysiert, betreffen. Der Stamm HDCl ist ein Beispiel für einen Stamm, der mehrere Kopien des CYP 52A2A-Gens in das Genom des Stamms H5343 eingefügt enthält. Dieser Stamm und ähnliche Stämme werden in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung Nr. 60/083,798, eingereicht am 05/01/98, deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben. Andere Stämme, die bei den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die C. tropicalis-Stämme HDC1, HDC5, HDC10, HDC15, HDC20, HDC23, HDC 23-1, HDC 23-2 und HDC 23-3, die in PCT/US99/20797 , deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben werden.Another suitable strain is one in which one or more reductase genes are enhanced to give an increase in the amount of rate-limiting omega-hydroxylase by 2450 gene amplification and an increase in the rate of substrate flow through the ω-oxidation pathway. Strains which increase the amount of enzymes important for the oxidation of fatty acids are also preferred. Such strains contain increased copies of the CYP and CPR genes. These genes have been identified as those that involve the production of the ω-hydroxylase nucleus catalyzing the first stage of the oxidation pathway. Strain HDCl is an example of a strain containing multiple copies of the CYP 52A2A gene inserted into the genome of strain H5343. This strain and related strains are described in copending application No. 60 / 083,798, filed on 05/01/98, the entire contents of which are incorporated herein by reference. Other strains that may be used in the methods of the present invention are the C. tropicalis strains HDC1, HDC5, HDC10, HDC15, HDC20, HDC23, HDC23-1, HDC23-2, and HDC23-3, respectively in PCT / US99 / 20797 the entire contents of which are incorporated herein by reference.

Geeignete Quellen von anorganischem Stickstoff umfassen beliebige ammoniumhaltige Verbindungen. Beispiele davon umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Alkalimetallnitrate und Ammoniumsalze, wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze oder Verbindungen, die durch die metabolische Wirkung des Organismus Ammoniak erzeugen, wie z. B. Harnstoff. Eine besonders bevorzugte Quelle von anorganischem Stickstoff zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist Ammoniak.suitable Inorganic nitrogen sources include any ammonium-containing ones Links. Examples thereof include, but are not limited to, alkali metal nitrates and ammonium salts, such as. As ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate and ammonium acetate. Preferred nitrogen sources are ammonium salts or compounds caused by the metabolic action of the organism Generate ammonia, such as. B. urea. A particularly preferred Source of inorganic nitrogen for use in the present invention Invention is ammonia.

Das Fermentationsverfahren kann durch die Verwendung eines Triglyceridfetts oder -öls als Quelle sowohl des organischen Substrats als auch des Cosubstrats modifiziert werden. Eine in die Fermentationsbrühe formulierte Lipase hydrolysiert oder spaltet das Fett oder Öl zu Fettsäuren und Glycerin. Der Verbrauch des Glycerins durch den Organismus treibt die Spaltungsreaktion zur Vollständigkeit und liefert die Energie, die zum Umwandeln der freien Fettsäuren zu ihren entsprechenden zweiwertigen Säuren erforderlich ist. Oleo-spezifische Lipasen sind besonders bevorzugt. Oleo-spezifische Lipasen zeigen eine hohe Selektivität für ein Triglycerid mit einem hohen Oleinsäureanteil und katalysieren selektiv die Hydrolyse der Oleatestergruppen. Beispiele von oleospezifischen Lipasen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Lipasen, die von Pseudomonas sp., Humicola lanuginosa, Candida rugosa, Geotrichum candidum und Pseudomonas (Burkholderia) hergestellt werden. Eine besonders bevorzugte Lipase ist UNLipase von Geotrichum candidum, ATCC Nr. 74170, die in der U.S.-Patentschrift 5,470,741 , deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben wird.The fermentation process may be modified by the use of a triglyceride fat or oil as the source of both the organic substrate and the cosubstrate. A lipase formulated in the fermentation broth hydrolyses or cleaves the fat or oil to fatty acids and glycerin. The consumption of glycerin by the organism drives the cleavage reaction to completion and provides the energy needed to convert the free fatty acids to their corresponding dibasic acids. Oleo-specific lipases are particularly preferred. Oleo-specific lipases show high selectivity for a high oleic acid triglyceride and selectively catalyze the hydrolysis of the oleate ester groups. Examples of oleospecific lipases include, but are not limited to, lipases produced by Pseudomonas sp., Humicola lanuginosa, Candida rugosa, Geotrichum candidum and Pseudomonas (Burkholderia). A particularly preferred lipase is UNLipase from Geotrichum candidum, ATCC No. 74170, which is described in US Pat U.S. Patent 5,470,741 the entire contents of which are incorporated herein by reference.

Der Fermentationsschritt wird vorzugsweise in drei Stufen durchgeführt, nämlich der Wachstumsphase, der Induzierungsphase und der Umwandlungsphase. Jede Phase kann unter den gleichen oder unter verschiedenen Fermenterbedingungen der Temperatur, des pH-Werts, der Belüftung usw. durchgeführt werden. Die Wachstumsphase beginnt, wenn die Zellkultur in den Fermenter gegeben wird und eine Phase schnellen Wachstums folgt. Abhängig von der Zusammensetzung des verwendeten Mediums kann das Wachstum exponentiell oder subexponentiell sein. Es setzt sich fort, bis die Kultur ein lineares Wachstum erreicht, wie durch eine Abnahme des Sauerstoffverbrauchs zu messen ist. Ein lineares Wachstum tritt auf, wenn das Wachstum durch die Zugaberate eines wesentlichen Nährstoffs zu dem Medium beschränkt ist, so dass das Wachstum proportional zu der Rate wird, mit welcher der beschränkende Nährstoff zugeführt wird. Üblicherweise wird bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung der wesentliche Nährstoff das Cosubstrat sein. Die zweite Phase ist die Induzierungsphase. In der Induzierungsphase werden zu Beginn der gewünschten Umwandlung des Substrats zu dem Produkt entscheidende metabolische Vorgänge ausgelöst. Die Kultur kann für eine gewisse Zeit in einer linearen Wachstumsphase gehalten werden, bevor die Kultur induziert wird. Das Induzierungsmittel wird üblicherweise das Substrat selbst sein, bei Verbindungen, die ihre eigene Umwandlung nicht induzieren, kann jedoch ein anderes Induzierungsmittel zusammen mit dem Substrat verwendet werden. Die Induzierungsphase kann verwendet werden, um die Phase schnellen Wachstums zu der Umwandlungsphase zu überführen. Die Fermentation kommt in die nächste Phase, nämlich die Umwandlungsphase, bei der das Substrat zu dem Produkt umgewandelt wird.Of the Fermentation step is preferably carried out in three stages, namely the Growth phase, the induction phase and the transformation phase. Each phase may be under the same or different fermenter conditions temperature, pH, aeration, etc. The Growth phase begins when the cell culture is placed in the fermenter and a phase of rapid growth follows. Depending on The composition of the medium used can grow exponentially or be sub-exponential. It continues until the culture enters achieved linear growth, as by a decrease in oxygen consumption to measure. A linear growth occurs when growth through the rate of addition of a substantial nutrient to the medium is limited so that the growth becomes proportional to the rate at which the limiting one nutrient supplied becomes. Usually is in the method according to the present Invention of the essential nutrient be the cosubstrate. The second phase is the induction phase. In the induction phase are at the beginning of the desired Transformation of the substrate to the product crucial metabolic operations triggered. The culture can be for be held in a linear growth phase for a certain period of time, before the culture is induced. The inducing agent usually becomes the substrate itself, in compounds that are their own transformation However, another inducer may not be present be used with the substrate. The induction phase can be used to bring the phase of rapid growth to the transformation phase. The Fermentation comes to the next one Phase, namely the conversion phase where the substrate is converted to the product becomes.

Während der Umwandlungsphase befindet sich die Fermentationsbrühe in einem sauren pH-Wert-Bereich zwischen 2 und 7. Der bevorzugte pH-Wert-Bereich erstreckt sich von etwa 3,5 bis 7,0, ein bevorzugterer Bereich erstreckt sich von etwa 5,0 bis etwa 6,5. Der pH-Wert kann durch automatische Titration unter Verwendung einer starken Base gesteuert werden, beispielsweise mit einer Natriumhydroxidlösung, Kaliumhydroxidlösung, Ammoniumhydroxidlösung oder mit Ammoniakgas. Es ist zu beachten, dass durch das Durchführen der Fermentation in diesem pH-Wert-Bereich im Vergleich zu Verfahren im Stand der Technik Ammoniak zum Steuern des pH-Werts verwendet werden kann, da er sich zu dem nichtflüchtigen wässrigen Ammonium-Ion umsetzt. Wenn Verfahren im Stand der Technik zur Herstellung von Dicarbonsäure im alkalischen pH-Wert-Bereich durchgeführt werden, kann das wässrige Ammonium-Ion nicht wirkungsvoll erzeugt werden, so dass unerwünschte Emissionen von Ammoniakdampf im Abgas und eine toxische Ansammlung von Ammoniak in der Brühe entsteht. Die Fermentation kann bei einer Temperatur von etwa 26°C bis etwa 40°C durchgeführt werden.During the Conversion phase, the fermentation broth is in one acidic pH range between 2 and 7. The preferred pH range ranges from about 3.5 to 7.0, a more preferred range extends from about 5.0 to about 6.5. The pH can be adjusted by automatic Titration can be controlled using a strong base, for example, with a sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution, ammonium hydroxide solution or with ammonia gas. It should be noted that by performing the Fermentation in this pH range compared to procedures In the prior art, ammonia was used to control the pH can be, since it converts to the non-volatile aqueous ammonium ion. When processes in the art for the production of dicarboxylic acid in alkaline pH range carried out can the watery Ammonium ion can not be generated effectively, leaving unwanted emissions of ammonia vapor in the exhaust gas and a toxic accumulation of ammonia in the broth arises. The fermentation may take place at a temperature of about 26 ° C to about 40 ° C are performed.

In der ersten Stufe wird ein Kulturmedium mit einer aktiven Kultur eines gegen beta-Oxidation blockierten Mikroorganismus inokuliert, wie z. B. einem gegen beta-Oxidation blockierten Stamm von C. tropicalis, so dass eine Periode mit schnellem, exponentiellem Wachstum beginnt. Der pH-Wert des Kulturmediums wird durch Zugeben einer Base gesteuert, beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, mit Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid oder Ammoniakgas. Die Zugabe des Cosubstrats zu dem Fermenter ist vorzugsweise eine Fed-Batch-Zugabe während der Umwandlungsphase. Das Ende der Phase exponentiellen Wachstums ist durch eine Verarmung an Glucose, eine schnelle Zunahme an gelöstem Sauerstoff, und, am empfindlichsten, eine schnelle Zunahme an Sauerstoff im Abgase und eine Abnahme an CO₂ im Abgas gekennzeichnet. Ohne ein induzierendes Substrat wird sich weiterhin Biomasse mit einer Rate anhäufen, die zu der Zugaberate von Glucose proportional ist (d. h. lineares Wachstum). Es ist wünschenswert, die Umwandlungsphase entweder am Ende des exponentiellen Wachstums oder an dem Punkt, an dem der gewünschte Pegel an Biomasse erreicht ist, auszulösen. Wenn die Sauerstoffabgabeeigenschaften des Produktionsgefäßes derartig sind, dass der gewünschte Pegel an Biomasse nicht mit der Kultur im exponentiellen Wachstum erreicht werden kann, kann eine Kombination von exponentiellem Wachstum, gefolgt von einer linearen, glucosebeschränkten Wachstumsphase (Induzierungsphase) verwendet werden, um einen gegebenen Pegel an Biomasse zu erreichen.In the first stage, a culture medium is inoculated with an active culture of a beta-oxidation-blocked microorganism, such as e.g. A beta-oxidation blocked strain of C. tropicalis, so that a period of rapid, exponential growth begins. The pH of the culture medium is controlled by adding a base, for example, but not limited to, ammonium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydroxide or ammonia gas. The addition of the co-substrate to the fermenter is preferably a fed-batch addition during the conversion phase. The end of the phase of exponential growth is characterized by depletion of glucose, a rapid increase in dissolved oxygen, and, most sensitively, a rapid increase in oxygen in the exhaust and a decrease in CO ₂ in the exhaust. Without an inducing substrate, biomass will continue to accumulate at a rate proportional to the rate of addition of glucose (ie, linear growth). It is desirable to initiate the transformation phase either at the end of exponential growth or at the point where the desired level of biomass is reached. When the oxygen delivery characteristics of the production vessel are such that the desired level of biomass can not be achieved with the culture in exponential growth, a combination of exponential growth followed by a linear glucose-limited growth phase (induction phase) can be used to approach a given level To reach biomass.

Um die Kultur während des Übergangs zu einem glucosebeschränkten, linearen Wachstum in einem gesunden Zustand zu halten, kann es wünschenswert sein, die Glucosezufuhr während des Wachstums zu beginnen, so dass der Kultur jederzeit Glucose verfügbar ist. Der Glucosepegel in der Anfangsfüllung des Mediums ist auf der Grundlage der gesamten Glucose, die zum Wachstum der Mikroorganismen gewünscht ist, gewählt, abzüglich der Menge, die währen des Wachstums zugegeben wird. Die Glucosezufuhr kann zu jedem Zeitpunkt nach dem Beginn des Wachstums gestartet werden. Da es jedoch bestimmte Schwankungen der Qualität des Inokulums und der Verzögerungszeit nach der Inokulation des Produktionsgefäßes gibt, ist es bevorzugt, die Glucosezufuhr während der Phase exponentiellen Wachstums bei einer vorbestimmten Konzentration der Biomasse, wie sie durch direkte Messung der Biomasse oder durch indirekte Verfahren, wie z. B. Messung der optischen Dichte, der Rate der Kohlendioxidentwicklung oder der Rate der Sauerstoffaufnahme, bestimmt wird, zu starten. Die Glucose kann ein raffinierter oder nichtraffinierter Maissirup sein. Die Glucose kann von der Oberseite des Gefäßes durch den Gasraum als kontinuierlicher Strom oder als kontinuierliche Folge von Pulsen oder Impulsen zugeführt werden. Die Glucosezufuhr kann dem Gefäß auch unterhalb der Oberfläche zugeführt werden, insbesondere zu einem Bereich hoher Scherung in der Nähe des Rührers, um eine schnelle Verteilung durch das Gefäß zu erreichen. Große Gefäße können mehrere Glucosezufuhrpunkte aufweisen.In order to keep the culture in a healthy state during the transition to glucose-limited, linear growth, it may be desirable to start the glucose supply during growth so that glucose is available to the culture at all times. The glucose level in the initial filling of the Me dium is selected based on the total glucose desired for the growth of the microorganisms, minus the amount added during growth. The glucose supply can be started at any time after the start of growth. However, as there are certain variations in inoculum quality and delay time after inoculation of the production vessel, it is preferred to control the glucose supply during the exponential growth phase at a predetermined concentration of the biomass, such as by direct measurement of the biomass or by indirect methods such as z. B. measurement of the optical density, the rate of carbon dioxide evolution or the rate of oxygen uptake is determined to start. The glucose may be a refined or unrefined corn syrup. The glucose may be supplied from the top of the vessel through the headspace as a continuous stream or as a continuous train of pulses. The glucose supply may also be delivered to the vessel below the surface, particularly to a high shear area near the stirrer to achieve rapid distribution through the vessel. Large vessels may have multiple glucose supply points.

Die Umwandlungsphase, bei der das Substrat oxidiert wird, wird durch Zugeben eines Induzierungsmittels und des Substrats, das eine oxidierbare Methylgruppe aufweist, ausgelöst. Bei Alkanen, Fettsäuren, Fettsäuremethylestern und Fettsäuresalzen lösen diese Stoffe und Kombinationen davon ihre eigene Oxidation zu Dicarbonsäuren aus und können zum Auslösen der Oxidation anderer Substanzen von Nutzens sein. Das Substrat kann portionsweise, als kontinuierliche Zufuhr oder als Folge von kontinuierlichen Pulsen oder Impulsen zugeführt werden. Das Substrat kann von der Oberseite des Gefäßes durch den Gasraum zugegeben werden, oder unterhalb der Oberfläche, insbesondere zu einem Bereich mit hoher Scherung. Große Gefäße können mehrere Substratzuführungspunkte aufweisen. Die Oxidation wird bei einem sauren pH-Wert von weniger als 7 durchgeführt, vorzugsweise nahe oder unterhalb des pKa-Werts, bei dem die Carboxygruppe durch die Oxidation gebildet wird oder in dem Substrat vorliegt.The Conversion phase, in which the substrate is oxidized, by Add an inducing agent and the substrate containing an oxidizable Has methyl group triggered. For alkanes, fatty acids, fatty acid methyl esters and fatty acid salts solve these Substances and combinations thereof make their own oxidation to dicarboxylic acids and can to trigger the oxidation of other substances of benefit. The substrate may be in portions, as a continuous feed or as a result of continuous pulses or pulses are supplied. The substrate can from the top of the vessel through the gas space are added, or below the surface, in particular to a high shear area. Large vessels may have multiple substrate delivery points exhibit. The oxidation becomes less at an acidic pH performed as 7, preferably near or below the pKa value at which the carboxy group passes through the oxidation is formed or present in the substrate.

Es ist bevorzugt, beim Fortschreiten der Umwandlung die Glucosezufuhrrate zu dem Fermenter stufenweise zu verringern, um die Anhäufung von Biomasse und Triacylglycerinestern zu verhindern. Bei der Umwandlung von in Handel erhältlicher Oleinsäure ist die Anhäufung von intrazellulären Speichervakuolen ein nützlicher Indikator dafür, ob die Glucosezufuhrrate angepasst werden muss. Anpassungen werden durch Absenken der Zufuhrrate um etwa 5% bis 25%, üblicherweise um etwa 10%, alle 24 Stunden der Umwandlungsphase durchgeführt. Es könnten auch andere Indikatoren verwendet werden, wie z. B. die Basenverwertungsrate, die Rate der CO₂-Entwickung oder der Atmungsquotient.It is preferred to gradually decrease the glucose feed rate to the fermenter as the conversion proceeds to prevent the accumulation of biomass and triacylglycerol esters. In the conversion of commercially available oleic acid, the accumulation of intracellular storage vacuoles is a useful indicator of whether the glucose feed rate needs to be adjusted. Adjustments are made by lowering the feed rate by about 5% to 25%, usually about 10%, every 24 hours of the conversion phase. Other indicators could be used, such as: The rate of recovery, the rate of CO ₂ evolution or the respiratory quotient.

Ein Problem, das bei dem Fermentationsverfahren oft auftritt, ist die Entstehung von Carbonsäureseifen und Schäumen als Folge des Arbeitens im herkömmlichen alkalischen pH-Wert-Bereich. In einer alkalischen Umgebung bilden Carbonsäuren Seifen, die zu einem unerwünschten Schäumen der Fermentationsbrühe führen. Die Folge der Seifenentstehung ist ein Abnehmen des pH-Werts der Brühe, der durch Zugeben einer Base, wie z. B. einer Alkalilauge, zu der Brühe eingestellt wird, um den pH-Wert der Brühe bei dem gewünschten Wert zu halten. Das Zugeben von Glucose zu der basischen Umgebung führt außerdem zu der Entstehung von Carbonaten, die den pH-Wert der Fermentationsbrühe beeinflussen. Um die Wirkung der Seifen- und Carbonatentstehung auf den pH-Wert zu kompensieren, müssen große Mengen an Base zugegeben werden, um den pH-Wert der Brühe bei dem gewünschten Wert zu halten.One Problem often encountered in the fermentation process is the Formation of carboxylic acid soaps and foaming as a result of working in the conventional alkaline pH range. Form in an alkaline environment carboxylic acids Soaps that cause an undesirable Foam the fermentation broth to lead. The consequence of soap production is a decrease in the pH of the broth, the by adding a base, such as. As an alkali, adjusted to the broth is added to the pH of the broth at the desired Value. Adding glucose to the basic environment also leads to the formation of carbonates that affect the pH of the fermentation broth. To the effect of soap and carbonate formation on the pH to compensate size Amounts of base are added to the pH of the broth at the desired Value.

Überraschenderweise ist gefunden worden, dass bei der Durchführung des Fermentationsverfahrens in einem sauren pH-Wert-Bereich von 2 bis 7, vorzugsweise von 3 bis 7, bevorzugter von 5 bis 6,5, anstelle eines alkalischen pH-Wert-Bereichs das Schäumen wesentlich verringert und die Entstehung von Carbonat aus Kohlendioxid, das bei der Metabolisierung von Glucose gebildet wird, verringert wird, so dass die Menge des zum Steuern des pH-Werts der Fermentationsbrühe benötigten Ausgangsmaterials wesentlich verringert wird. Durch das Durchführen des Fermentationsverfahrens bei einem sauren pH-Wert werden diese Probleme wesentlich verringert, so dass bei dem Fermentationsverfahren geringere Mengen an Base verwendet werden können. Während der Wachstumsreaktion gibt es einen Nettoverbrauch von Kationenäquivalenten gegenüber Anionenäquivalenten, die zu einer Absenkung des pH-Werts des Kulturmediums beitragen. Es ist wünschenswert, während des Wachstums den pH-Wert des Mediums durch Zusetzen einer Base zum Steuern des pH-Werts in den Bereich von 2 bis 7, vorzugsweise etwa 3 bis 6,5, zu steuern. Zu den Basen, die für diesen Zweck verwendbar sind, gehören Ammoniumhydroxid, Ammoniak, Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid. Es ist wünschenswert, eine Grundzusammensetzung zu wählen, die einen oder mehrere der Hauptnährstoffe bereitstellt, die während des Wachstums verbraucht werden, wie z. B. Ammoniumhydroxid, Ammoniak oder Kaliumhydroxid. Die Formulierung des Wachstumsmediums wird unter Berücksichtigung der Zugabe des Mittels zum Steuern des pH-Werts eingestellt. Die Verwendung von NH₄OH oder Ammoniakgas zum Steuern des pH-Werts verringert die Anzahl der Ausgangsmaterialien, die für das Wachstum der Mikroorganismen benötigt werden, indem das Mittel zum Steuern des pH-Werts und die Stickstoffquelle zu einem einzigen Ausgangsmaterial, das dem Fermenter zugegeben wird, kombiniert werden.Surprisingly, it has been found that in carrying out the fermentation process in an acidic pH range of from 2 to 7, preferably from 3 to 7, more preferably from 5 to 6.5, foaming is substantially reduced instead of an alkaline pH range and reducing the formation of carbonate from carbon dioxide formed in the metabolism of glucose so that the amount of starting material needed to control the pH of the fermentation broth is substantially reduced. By carrying out the fermentation process at an acidic pH, these problems are substantially reduced so that lower levels of base can be used in the fermentation process. During the growth reaction, there is a net consumption of cation equivalents to anion equivalents, which contribute to a decrease in the pH of the culture medium. It is desirable to control the pH of the medium during growth by adding a base to control the pH in the range of 2 to 7, preferably about 3 to 6.5. Among the bases which can be used for this purpose are ammonium hydroxide, ammonia, sodium hydroxide and potassium hydroxide. It is desirable to choose a base composition that will provide one or more of the major nutrients that are consumed during growth, such as, e.g. For example, ammonium hydroxide, ammonia or potassium hydroxide. The growth medium formulation is adjusted in consideration of the addition of the pH controlling agent. The use of NH ₄ OH or ammonia gas to control the pH reduces the number of starting materials needed for the growth of microorganisms by combining the pH controlling agent and the nitrogen source into a single feedstock added to the fermentor.

Hinsichtlich der Verwendung von Stickstoffquellen, wie z. B. Ammoniak oder Ammoniumhydroxid, ist es notwendig, dass nur 250 ppm oder weniger der Stickstoffgelle in dem Medium vorhanden sind, um das Wachstum und den Verbrauch dieser Reagenzien zum Steuern des pH-Werts auszulösen. Die Ammoniakkonzentration wird daher während des Wachstums der Kultur beinahe konstant bleiben. Somit kann die gewünschte Ammoniakkonzentration in dem Medium zum Zeitpunkt der Induzierung leicht durch Zugeben von Ammoniak oder Ammoniumsalzen zu der Anfangsfüllung des Mediums vorgewählt werden. Verwendbare Quellen von ammoniakartigem Stickstoff für die Anfangsfüllung des Fermenters umfassen Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniak, Harnstoff und Ammoniumhydroxid.Regarding the use of nitrogen sources, such as. As ammonia or ammonium hydroxide, it is necessary that only 250 ppm or less of the nitrogen level in the medium exist to growth and consumption these reagents to control the pH. The Ammonia concentration is therefore during the growth of the culture stay almost constant. Thus, the desired ammonia concentration in the medium at the time of induction slightly by adding from ammonia or ammonium salts to the initial filling of the medium. Usable sources of ammoniacal nitrogen for the initial filling of the Fermenters include ammonium phosphate, ammonium sulfate, ammonium nitrate, Ammonia, urea and ammonium hydroxide.

Eine weitere Ausführungsform ist die Formulierung eines Fermentationsmediums, das zur Ausbreitung von Candida tropicalis verwendbar ist und eine hohe Produktivität der Umwandlung von Substraten mit oxidierbaren Methylgruppen zu Carbonsäuren ergibt. Das Wachstum des Mikroorganismus kann durch geeignetes Einstellen der Zufuhrraten der Materialien zu der Fermentationsbrühe gesteuert werden. Die Hauptnährstoffe, die während des Wachstums des Mikroorganismus aus Glucose verbraucht werden, sind ammoniakartiger Stickstoff, Kalium, Magnesium, Phosphat und Sulfat. Natrium und Calcium werden nicht verbraucht, Calcium sollte jedoch mit einer Konzentration von etwa 5 bis 50 ppm oder mehr vorhanden sein, um, abhängig von der Formulierung des Inokulummediums, ein normales Wachstum zu erhalten. In dem Medium sind auch Spurenmineralstoffe und Biotin enthalten. Das Biotin kann eine vergleichsweise hohe Reinheit aufweisen oder in eher roher Form bereitgestellt werden, wie z. B. in Biotinhefe, Hefeextrakten oder Mais-Einweichlauge.A another embodiment is the formulation of a fermentation medium used to spread Candida tropicalis is useful and high conversion productivity of substrates with oxidizable methyl groups to give carboxylic acids. The growth of the microorganism can be adjusted by appropriate adjustment controlled rates of delivery of the materials to the fermentation broth become. The main nutrients that while of the growth of the microorganism are consumed from glucose, are ammoniacal nitrogen, potassium, magnesium, phosphate and Sulfate. Sodium and calcium are not consumed, calcium should but present at a concentration of about 5 to 50 ppm or more be, um, dependent from the formulation of the inoculum medium, a normal growth to obtain. The medium also contains trace minerals and biotin contain. The biotin can have a comparatively high purity or provided in a rather raw form, such as In biotin yeast, Yeast extracts or corn soak.

Verwendbare Quellen von Phosphat sind Ammoniumphosphat, ein-, zwei- und dreibasiges Kaliumphosphat, ein-, zwei- und dreibasiges Natriumphosphat und Phosphorsäure. Verwendbare Quellen von Kalium sind Kaliumsulfat, ein-, zwei- und dreibasiges Kaliumphosphat und alkalische Pottasche.usable Sources of phosphate are ammonium phosphate, mono-, di- and tribasic ones Potassium phosphate, one-, two- and tribasic sodium phosphate and phosphoric acid. Usable sources of Potassium is potassium sulfate, mono-, di- and tribasic potassium phosphate and alkaline potash.

Bei der Oxidation von Alkanen und/oder der Oxidation von Fettsäuren kann ein Fermentationshilfsmittel verwendet werden. Das bevorzugte Fermentationshilfsmittel ist ein Fettsäureester, ein besonders bevorzugtes Fermentationshilfsmittel ist ein Methylester. Ein Hauptvorteil der Verwendung eines solchen Fermentationshilfsmittels liegt in der Beherrschung des Schäumens und im Steuern des Fluidverhaltens der Fermentationsbrühe. Wenn die Kettenlängenverteilung des Produkts für die Güte des Endprodukts wichtig ist, ist es wünschenswert, eine Kettenlänge des Methylesters auszuwählen, die dem Alkan oder der Fettsäure ähnlich ist, da der Methylester ebenfalls zu dem Produkt umgewandelt wird. Der Ester kann portionsweise zugegeben oder der Zugabe beigemischt werden. Wenn er der Zugabe beigemischt wird, kann er etwa 10% oder weniger, vorzugsweise etwa 1% oder weniger, der Zugabe bilden. Einige im Handel erhältliche Fettsäuren enthalten natürlich einige Methylester und können direkt als Substrate für die Herstellung von Dicarbonsäuren verwendet werden. Beispielsweise ist EMERSOL^® 267 (Cognis Corporation) eine im Handel erhältliche Oleinsäure, die etwa 1% oder weniger Methylester enthält und die sich als gutes Substrat bei der vorliegenden Erfindung erwiesen hat. Eine typische technische Qualität von Oleinsäure, EMERSOL^® 267, die bei dem Verfahren verwendet wird, hat die ungefähre Zusammensetzung 0,3% C12, 2,4% C14, 0,6% C14:1, 4,7% C16, 4,6% C16:1, 0,2% C17, 0,8% C18, 69,9% C18:1, 10,5% C18:2, 0,3% C18:3.In the oxidation of alkanes and / or the oxidation of fatty acids, a fermentation aid can be used. The preferred fermentation aid is a fatty acid ester, a particularly preferred fermentation aid is a methyl ester. A major advantage of using such a fermentation aid is in the control of foaming and in controlling the fluid behavior of the fermentation broth. When the chain length distribution of the product is important to the quality of the final product, it is desirable to select a chain length of the methyl ester that is similar to the alkane or fatty acid since the methyl ester is also converted to the product. The ester may be added in portions or admixed with the addition. When added to the addition, it may form about 10% or less, preferably about 1% or less, of the addition. Of course, some commercially available fatty acids contain some methyl esters and can be used directly as substrates for the production of dicarboxylic acids. For example, EMERSOL ^® 267 (Cognis Corporation) is a commercial oleic acid containing about 1% or less Methylester and which has proved to be a good substrate in the present invention. A typical technical grade of oleic acid, EMERSOL 267 ^®, which is used in the process has the approximate composition 0.3% C12, 2.4% C14, 0.6% C14: 1, 4.7% C16, 4, 6% C16: 1, 0.2% C17, 0.8% C18, 69.9% C18: 1, 10.5% C18: 2, 0.3% C18: 3.

Es hat sich ferner gezeigt, dass bei der Oxidation von Alkan zu Dicarbonsäuren die Verwendung einer Fettsäure oder eines Fettsäuresalzes als Fermetationshilfsmittel von Nutzen ist. Dies führt zu einer besseren Verteilung des Alkans in der Fermentationsbrühe. Die Fettsäure kann portionsweise zugegeben oder der Alkanzugabe beigemischt werden. Wenn sie in die Zugabe formuliert ist, kann die Fettsäure oder das Fettsäuresalz typischerweise etwa 10% oder weniger, vorzugsweise etwa 5% oder weniger, der Zugabe bilden. Wenn die Kettenlängenverteilung für die Güte des Endprodukts wichtig ist, ist es auch hier wünschenswert, eine Kettenlängenverteilung der Fettsäure zu wählen, die dem Alkan ähnlich ist, da die Fettsäure ebenfalls zu dem Produkt umgewandelt wird.It has also shown that in the oxidation of alkane to dicarboxylic acids the Use of a fatty acid or a fatty acid salt as a Fermetationshilfsmittel is useful. This leads to a better distribution of the alkane in the fermentation broth. The fatty acid may be added in portions or admixed with the alkane addition. If it is formulated in the addition, the fatty acid or the fatty acid salt typically about 10% or less, preferably about 5% or less, form the addition. If the chain length distribution for the quality of the final product important, it is also desirable here, a chain length distribution the fatty acid to choose, similar to the alkane is because the fatty acid also converted to the product.

Es ist überraschenderweise gefunden worden, dass bestimmte Kombinationen von Fettmaterialien, beispielsweise Fettsäuren und Fettester, bewirken, dass feine wässrige Suspensionen von langkettigen Dicarbonsäuren bei Temperaturen unterhalb von 50°C hochdefinierte Teilchen bilden. Es können auch andere Fettmaterialien getrennt oder in Kombination verwendet werden, einschließlich Fettalkohole, Fettether und so weiter, und werden als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen. Die so erhaltenen Suspensionen zeigen wünschenswerte Scherverdünnungs-Eigenschaften, die ihre Handhabung und praktische Anwendung erleichtern. Es ist wünschenswert, dass die so in der Suspension gebildeten Teilchen Größen mit einer schmalen Größenverteilung aufweisen. Diese Ausführungsform der Erfindung ist für die Anwendung in Produktionsausrüstung von großem Maßstab gut geeignet. Tatsächlich war mit einer solchen Ausrüstung die Leistungsfähigkeit besser als bei einer Ausrüstung mit Labormaßstab. Dies legt nahe, dass bei dem Teilchenwachstum Wandeffekte eine Rolle spielen könnten.It has surprisingly been found that certain combinations of fatty materials, for example fatty acids and fatty esters, cause fine aqueous suspensions of long chain dicarboxylic acids to form highly defined particles at temperatures below 50 ° C. Other fatty materials may be used separately or in combination, including fatty alcohols, fatty ethers and so on, and are considered to be part of the present invention. The suspensions thus obtained exhibit desirable shear thinning properties which facilitate their handling and practical application. It is desirable that the particles thus formed in the suspension have sizes with a narrow size distribution. This embodiment of the invention is for use in production equipment well suited to large scale. In fact, with such equipment, the performance was better than with laboratory scale equipment. This suggests that wall effects could play a role in particle growth.

Nützliche Fettmaterialien umfassen gesättigte und ungesättigte C10-C20-Fettsäuren und deren Ester, umfassend, aber nicht darauf beschränkt, Sonnenblumen-Fettsäuren, Sonnenblumen-Fettsäuremethylester, Talgfettsäuren und Talgfettsäuremethylester. Beispiele von typischen, im Handel erhältlichen Zusammensetzungen dieser Materialien sind in Tabelle 1 gezeigt.helpful Fatty materials include saturated ones and unsaturated C10-C20 fatty acids and their esters, including, but not limited to, sunflower fatty acids, sunflower fatty acid methyl esters, tallow fatty acids and Tallow. Examples of typical, commercially available compositions These materials are shown in Table 1.

Jede der nachstehend angegebenen Zusammensetzungen ist von Cognis Corp., Cincinnati, OH, im Handel erhältlich. Tabelle 1. Zusammensetzung von Beispielen von Zusatzstoffen Zusatzstoff Sonnenblumenfettsäuren mit hohem Oleinanteil Talgfettsäuremethylester Sonnenblumenfettsäuremethylester mit hohem Oleinanteil Methyloleat Handelsname Emery^® 244 Edenor^® PK 1805 Emery^® 2203 Edenor^® ME-V 05 Emery^® 2301 Fettsäure Fettsäureverteilung (%) C10 0,05 - C12 0,11 0,65 - C14 0,11 2,80 - 3,0 C14:1 - 47 - 2,0 C15 0,15 0,45 0,29 C15:1 0,21 - C16 3,87 23,82 4,17 4,0 C16:1 0,09 2,46 0,10 6,0 C17 - 1,26 - 1,0 C17:1 0,68 - C18 4,73 19,00 4,48 C18:1 84,45 42,20 87,4 76,0 C18:2 5,24 2,54 2,91 7,0 C18:3 0,43 0,25 - 1,0 20:1 0,30 0,33 - Each of the compositions given below is commercially available from Cognis Corp., Cincinnati, OH. Table 1. Composition of examples of additives additive Sunflower oil fatty acids with high olein content tallow Sunflower fatty acid methyl ester with high olein content methyl trade name Emery ^® 244 Edenor ^® PK 1805 ^Emery® 2203 Edenor ^® ME-V 05 ^Emery® 2301 fatty acid Fatty acid distribution (%) C10 0.05 - C12 0.11 0.65 - C14 0.11 2.80 - 3.0 C14: 1 - 47 - 2.0 C15 0.15 0.45 0.29 C15: 1 0.21 - C16 3.87 23.82 4.17 4.0 C16: 1 0.09 2.46 0.10 6.0 C17 - 1.26 - 1.0 C17: 1 0.68 - C18 4.73 19,00 4.48 C18: 1 84.45 42,20 87.4 76.0 C18: 2 5.24 2.54 2.91 7.0 C18: 3 0.43 0.25 - 1.0 20: 1 0.30 0.33 -

Die in Fermentationsbrühen hergestellten Dicarbonsäuren liegen typischerweise als nadelartige Kristalle mit Längen von 1 bis 10 μm vor. Die Zusammensetzung der zweiwertigen Säuren gibt die Kettenlängen des oxidierten Substrats wieder. Die Fermentationsbrühe kann hochviskos bis hin zu einem Feststoff sein. Wenn ein wie hier beschriebenes Fettmaterial bei einer solchen Fermentation verwendet wird, ist es möglich, in situ im Wesentlichen scheibenförmige, im Wesentlichen partiell kugelförmige (beispielsweise schalenförmige) und/oder im Wesentlichen kugelförmige Dicarbonsäureteilchen mit Durchmessern von etwa 15 bis 40 μm oder mehr und Dicken von etwa 1 bis 5 μm bei Temperaturen von unterhalb von etwa 50°C wachsen zu lassen. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden im Wesentlichen kugelförmige Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 1 cm hergestellt. Es wird daher angenommen, dass gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Dicarbonsäureteilchen Durchmesser und/oder Dicken im Bereich von etwa 1 μm bis etwa 1 cm oder mehr aufweisen können. Wenn wie hier beschriebene Fettmaterialien bei Fermentationen, die Dicarbonsäuren herstellen oder umfassen, angewendet werden, weist die erhaltene Brühe eine niedrige scheinbare Viskosität auf und ermöglicht die Handhabung der Fermentationsbrühe unter optimalen Bedingungen. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit kann der Begriff „scheibenförmig" hier auch verwendet werden, um im Wesentlichen partiell kugelförmige Teilchen zu bezeichnen. „Im Wesentlichen" wird hier so verwendet, dass es sowohl „näherungsweise" als auch „genau" umfasst.The in fermentation broths produced dicarboxylic acids are typically as needle-like crystals with lengths of 1 to 10 μm in front. The composition of the dibasic acids gives the chain lengths of the oxidized substrate again. The fermentation broth can reach high viscosity to be a solid. If a fatty material as described here used in such a fermentation, it is possible in situ essentially disk-shaped, essentially partially spherical (for example, cup-shaped) and / or substantially spherical Dicarbonsäureteilchen with diameters of about 15 to 40 microns or more and thicknesses of about 1 to 5 μm grow at temperatures below about 50 ° C. At a embodiment of the present invention were substantially spherical particles made with a diameter of about 1 cm. It is therefore assumed that according to the present Invention produced dicarboxylic acid particles Diameters and / or thicknesses in the range of about 1 micron to about 1 cm or more. When fatty materials as described herein in fermentations, the dicarboxylic acids manufacture or include, indicates the obtained Broth one low apparent viscosity on and allows the handling of the fermentation broth under optimal conditions. Out establish the expediency The term "disk-shaped" can also be used here to denote substantially partial spherical particles. "Essentially" is used here like this that it includes both "approximate" and "exact".

Bei einer Fermentationsreaktion zur Herstellung von Dicarbonsäuren liegt ein wünschenswerter Vorteil der Verwendung solcher Fettmaterialien darin, dass diese zusätzlichen Reagenzien potentiell ebenfalls zu Dicarbonsäuren umgewandelt werden können. Dies vereinfacht die Gewinnung der Dicarbonsäuren aus der Brühe, so dass keine zusätzliche Aufarbeitung zum Entfernen des Zusatzstoffs erforderlich ist.In a fermentation reaction for the production of dicarboxylic acids is a desirable advantage the use of such fatty materials in that these additional reagents can potentially also be converted to dicarboxylic acids. This simplifies the recovery of the dicarboxylic acids from the broth, so that no additional work-up to remove the additive is required.

Bestimmte, im Handel erhältliche Fettsäurepräparate können direkt verwendet werden, um die Entstehung von scheibenförmigen Teilchen zu bewirken, da bei deren Herstellungsverfahren Fettsäurederivate zurückbleiben, die bei der Fermentation das gewünschte Wachstum der Teilchen mit einer gewünschten Größenverteilung bewirken. Beispiele davon umfassen Emersol^® 267 Oleinsäure (von Cognis Corp., Cincinnati, Ohio im Handel erhältlich), das geringe Mengen an Methylester, teilhydrolysierten Fettsäuren und Mono-, Di- und Triglyceriden enthält. Bei Kenntnis der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann daher bei einer Dicarbonsäure-Fermentation eine wohlüberlegte Auswahl des Substrats aus den im Handel erhältlichen Substraten getroffen werden.Certain commercially available fatty acid preparations can be used directly to cause the formation of disc-shaped particles because their production process leaves fatty acid derivatives which, during fermentation, cause the desired growth of the particles having a desired size distribution. Examples thereof include Emersol ^® 267 Oleic acid (commercially available from Cognis Corp., Cincinnati, Ohio in the trade) which contains small amounts of Methylester, partially hydrolyzed fatty acids and mono-, di- and triglycerides. With knowledge of the methods according to the present invention, therefore, in a dicarboxylic acid fermentation, a judicious selection of the substrate can be made from the commercially available substrates.

Es wird erwogen, dass bei den verschiedenen hier beschriebenen Fermentationsmedien Fettmaterialien zusammen mit einer Vielfalt von Antischaummitteln, wie z. B. solchen vom Silicon- und Polypropylenglycoltyp, ohne hemmende Wirkung auf das Teilchenwachstum verwendet werden können.It it is contemplated that in the various fermentation media described herein Fatty materials together with a variety of anti-foaming agents, such as As those of the silicone and polypropylene glycol type, without inhibiting Effect on particle growth can be used.

Das Fettmaterial kann der wässrigen Suspension der Dicarbonsäuren portionsweise oder als Fed-Batch zugegeben werden. Im Allgemeinen können die Pegel der verwendeten Fettmaterialien im Bereich von etwa 10 ppm bis etwa 5% oder mehr liegen, vorzugsweise jedoch im Bereich von etwa 50 ppm bis etwa 1%, bezogen auf die Masse der Dicarbonsäure. Das Teilchenwachstum findet statt, solange ein geringer Pegel an Zusatzstoffen vorhanden ist. Es wird angenommen, dass die Fettsäure-Zusatzstoffe das Wachstum der Dicarbonsäureteilchen unterstützen, während Fettsäureester und andere Fettderivate zum Erhalten einer schmalen Verteilung der Teilchengrößen hilfreich sind.The Fat material can be the watery Suspension of dicarboxylic acids be added in portions or as a fed batch. In general can the levels of fatty materials used are in the range of about 10 ppm to about 5% or more, but preferably in the range from about 50 ppm to about 1%, based on the mass of the dicarboxylic acid. The Particle growth takes place as long as a low level of additives is available. It is believed that the fatty acid additives the Growth of dicarboxylic acid particles support, while fatty acid ester and other fat derivatives for obtaining a narrow distribution of Particle sizes helpful are.

Bei einer Fermentation zur Herstellung von Dicarbonsäuren aus Kohlenwasserstoffen ist es wünschenswert, eine Kombination von Fettderivaten, einschließlich Fettsäuren und Fettsäuremethylester, zuzugeben. Es ist am zweckmäßigsten, diese Materialien in die Kohlenwasserstoffzufuhr zu mischen, um die Herstellung, die Sterilisierung und das Zuführen der Zusatzstoffe zu der Fermentation zu vereinfachen.at a fermentation for the production of dicarboxylic acids from hydrocarbons it is desirable a combination of fatty derivatives, including fatty acids and fatty acid methyl esters, admit. It is most convenient to mix these materials into the hydrocarbon feed to the manufacture, the sterilization and the feeding of the additives to the Simplify fermentation.

Ähnlich ist es bei einer Fermentation zur Herstellung von Carbonsäuren aus einer Fettsäure wünschenswert, einen ähnlichen, entsprechenden Methylester zuzugeben. Der Zusatzstoff wird daher die Kettenlängenverteilung des Dicarbonsäureprodukts nicht verändern.Similar is it in a fermentation for the production of carboxylic acids a fatty acid desirable, a similar, add appropriate methyl ester. The additive is therefore the chain length distribution of the dicarboxylic acid product Don `t change.

Nach der Offenbarung der Verfahren zur Herstellung von scheibenförmigen Dicarbonsäureteilchen und der Beschreibung der Vorteile für die rheologischen Eigenschaften der Suspension sind bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung viele Kombinationen und Anwendungen möglich.To the disclosure of the processes for the preparation of disc-shaped dicarboxylic acid particles and the description of the benefits for the rheological properties of the suspension are in the execution of present invention many combinations and applications possible.

Überraschenderweise ist gefunden worden, dass es bei Halten der Konzentration des gelösten Sauerstoffs unter etwa 25%, vorzugsweise unter 20%, bezogen auf die Sättigung mit Luft, zu einer Verringerung der Menge an Cosubstrat kommt, das bei der Umwandlungsphase erforderlich ist. Wenn die Konzentration des gelösten Sauerstoffs unter diesem Pegel liegt, wird die Glucose wirkungsvoller bei der Lieferung von Energie für die Oxidation eingesetzt. Die Folgen einer zu starken Zugabe von Glucose umfassen die weitere Anhäufung von Biomasse und Triacylglycerinestern während der Umwandlungsphase bei einer verringerten Carbonsäureproduktion.Surprisingly It has been found that while keeping the concentration of dissolved oxygen below about 25%, preferably below 20%, based on saturation With air, the amount of cosubstrate comes to a reduction, the is required during the conversion phase. When the concentration of the solved Oxygen is below this level, the glucose is more effective in the supply of energy for the oxidation used. The consequences of too much addition of Glucose includes the further accumulation of Biomass and triacylglycerol esters during the conversion phase at a reduced carboxylic acid production.

Die Entstehung von Triacylglycerinestern mit öligen Hefen kann durch das Einstellen der Magnesiumkonzentration oder des Verhältnisses von Magnesium zu Phosphat in der Anfangsfüllung des Mediums gesteuert oder teilminimiert werden. Die bevorzugte Magnesiumkonzentration in dem Fermentationsinokulum beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,0 g/l, bevorzugter etwa 0,2 bis 0,8 g/l. Das bevorzugte Phosphat:Magnesium- Verhältnis beträgt etwa 20:1 bis etwa 2:1, vorzugsweise 15:1 bis etwa 3:1.The Formation of triacylglycerol esters with oily yeasts can be achieved by the Adjust the magnesium concentration or ratio controlled from magnesium to phosphate in the initial charge of the medium or part-minimized. The preferred magnesium concentration in the fermentation inoculum is about 0.1 to about 1.0 g / l, more preferably about 0.2 to 0.8 g / l. The preferred phosphate: magnesium ratio is about 20: 1 to about 2: 1, preferably 15: 1 to about 3: 1.

Ferner ist überraschend gefunden worden, dass sich in der Fermentationsbrühe während der Umwandlungsphase eine wärmeempfindliche katalaseartige Aktivität anhäuft, die H₂O₂ verbraucht. Dies kann Assays der Glucosekonzentration, mit denen das von der Glucoseoxidase gebildete H₂O₂ gemessen wird, stören.Furthermore, it has surprisingly been found that accumulates in the fermentation broth during the conversion phase, a heat-sensitive catalase-like activity that consumes H ₂ O ₂ . This can interfere with assays of the glucose concentration with which the H ₂ O ₂ produced by the glucose oxidase is measured.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von 9-Octadecendionsäure durch Biooxidation von Oleinsäure. Es kann zwar Oleinsäure beliebiger Qualität als Substrat verwendet werden, eine typische Oleinsäure mit technischer Qualität besteht aber aus folgenden Carbonsäuren: 0,42% C₁₂; 2,7% C₁₄; 0,86% C_14:1; 6,3% C₁₆; 4,6% C_16:1; 0,93% C₁₇; 2,8 C₁₈; 71,8% C_18:1; 8,3% C_18:2; 0,58% C_18:3. Die Oleinsäure kann auch eine Oleinsäure mit hoher Qualität aus einem Fettöl einer Helianthus annuus-Art (Sonnenblumensamenöl) sein, wie es beispielsweise in der U.S.-Patentschrift Nr. 4,627,192 beschrieben wird, deren gesamter Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Bei diesem Verfahren können auch andere Oleinsäuresorten mit hohem Oleinsäuregehalt aus Ölsaaten verwendet werden. Solche Öle sind sehr reich an Oleinsäure und enthalten wenigstens 70 bis 80 Gew.-% Oleinsäure.A preferred embodiment of the process according to the present invention is the preparation of 9-octadecenedioic acid by biooxidation of oleic acid. Although oleic acid of any quality can be used as the substrate, a typical oleic acid of industrial grade consists of the following carboxylic acids: 0.42% C ₁₂ ; 2.7% C ₁₄ ; 0.86% C _{14: 1} ; 6.3% C ₁₆ ; 4.6% C _{16: 1} ; 0.93% C ₁₇ ; 2.8 C ₁₈ ; 71.8% C _{18: 1} ; 8.3% C _{18: 2} ; 0.58% C _{18: 3} . The oleic acid may also be a high-quality oleic acid from a Helianthus annuus-type fatty oil (sunflower seed oil), as described, for example, in U.S. Pat U.S. Patent No. 4,627,192 is described, the entire contents of which are hereby incorporated by reference. In this process, other oleic acid oleic acid grades from oilseeds may also be used. Such oils are very rich in oleic acid and contain at least 70 to 80% by weight of oleic acid.

Die vorliegende Erfindung wird aus den nachstehenden Beispielen besser verstanden werden, die alle nur für veranschaulichende Zwecke gedacht sind und den Umfang der Erfindung auf keine Weise beschränken sollen. In allen Beispielen werden die Konzentrationen der Komponenten auf die wasserfreien Formen bezogen angegeben. Im Handel erhältliche Hydrate der angegebenen Komponenten können verwendet werden, wenn die Konzentration geeignet berichtigt wird, um Hydratationswasser zu berücksichtigen.The The present invention will be better understood from the examples below to be understood, all for illustrative purposes only are intended and are not intended to limit the scope of the invention in any way. In all examples, the concentrations of the components become the anhydrous forms referred specified. Commercially available Hydrates of the specified components can be used if the concentration is properly adjusted to hydration water to take into account.

Beispiel 1example 1

Es wurden Fermentationsmedien gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt, deren Komponenten in den nachstehenden Tabellen 2 und 3 angegeben sind. Tabelle 2 Synthetisches Herstellungsmedium Komponenten Konzentration (g/l) Glucose 27,0 Ammoniumsulfat 7,0 Kaliumphosphat, einbasig 5,1 Magnesiumsulfat 0,5 Calciumchlorid 0,1 Citronensäure 0,06 Eisen(III)-chlorid 0,023 Biotin 0,0002 Spurenmetalle: Borsäure 0,0009 Kupfer(II)-sulfat 0,00007 Kaliumiodid 0,00018 Eisen(III)-chlorid 0,00036 Mangansulfat 0,00072 Natriummolybdat 0,00036 Zinksulfat 0,00072 Wasser Ausgleich SAG 471^® Antischaummittel 0,8 ml Fermentation media according to the present invention were prepared, the components of which are given in Tables 2 and 3 below. Table 2 Synthetic Preparation Medium components Concentration (g / l) glucose 27.0 ammonium sulfate 7.0 Potassium phosphate, monobasic 5.1 magnesium sulfate 0.5 calcium chloride 0.1 citric acid 0.06 Iron (III) chloride 0.023 biotin 0.0002 Trace metals: boric acid 0.0009 Copper (II) sulfate 0.00007 potassium iodide 0.00018 Iron (III) chloride 0.00036 manganese sulfate 0.00072 sodium 0.00036 zinc sulfate 0.00072 water compensation SAG 471 ^® antifoam agent 0.8 ml

Die Komponenten des Mediums von Tabelle 2 wurden auf eine geeignete Weise wärmesterilisiert, bei der Präzipitationsreaktionen vermieden werden, und nach dem Abkühlen in einem sterilen Fermentergefäß kombiniert.The Components of the medium of Table 2 were selected for appropriate Heat sterilized, in the precipitation reactions be avoided, and combined after cooling in a sterile fermenter vessel.

Das vollständige, nicht inokulierte Medium war vollständig klar mit einer leicht strohartigen Färbung und ohne starken Geruch. Das Zugeben des Antischaummittels führte zu einer leichten Trübung.The complete, uninoculated medium was completely clear with a slight straw-colored and without a strong smell. The addition of the antifoam agent resulted a slight haze.

Candida tropicalis H5343 ALK 2-1 wurde in dem in Tabelle 2 angegebenen Medium in einem gerührten, belüfteten Fermenter unter sterilen Bedingungen mit einem Anfangsvolumen an Flüssigkeit von 12 l kultiviert. Das sterile Kulturmedium wurde mit einem 5%-Inokulum von Candida tropicalis H5343 ALK 2-1 inokuliert und bei 35°C und einem pH-Wert von 5,8 etwa 10 Stunden mit Rühr- und Belüftungsraten kultiviert, die ausreichten, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff über 20% zu halten. Als die Kultur das exponentielle Wachstum beendete und der Gehalt an gelöstem Sauerstoff anzusteigen begann, wurde die Umwandlungsphase durch Starten eines kontinuierlichen Zufuhrstroms von Exxon Developmental Fluid 137 (einem Kohlenwasserstoff, der etwa 94,4% Tridecan umfasst, wobei der Ausgleich hauptsächlich Dodecan ist), gemischt mit den Fermentationshilfsmitteln 1,25% Emersol^® 267 (einer Oleinsäure mit technischer Qualität) und 1,25% Emery^® 2203 (einem Talgsäuremethylester mit technischer Qualität) mit 0,7 g/l/h eingeleitet. Zugleich wurde die Temperatur in dem Fermenter von 35°C auf 30°C verringert, die Belüftungsrate auf 0,4 vvm verringert und an das Gefäß ein Rückdruck von 0,4 bar angelegt. Während der Wachstums- und Umwandlungsphase wurde der pH-Wert mit 6 N KOH zwischen 5,8 und 5,9 gehalten. Als die Konzentration der Biomasse etwa 10 g/l erreicht hatte, wurde ein kontinuierlicher Glucosezufuhrstrom zu dem Fermenter mit einer Rate von 1,58 g/l/h Glucose gestartet. Auf der Grundlage von mikroskopischen Beobachtungen und der Beurteilung der sich anhäufenden Speichervakuolen in den Hefezellen wurde die Glucosezufuhrrate bei der Umwandlung um zwischen 0 und 15% täglich verringert. Während der Umwandlung wurde dem Fermenter 7 ml PPG(Polypropylenglycol)-Antischaummittel zugesetzt, um das schwache Schäumen zu regeln. Nach 50 Stunden Dauer der Umwandlungsphase enthielt die gesamte Brühe in dem Fermenter 41,5 g/kg 1,13-Tridecandinsäure.Candida tropicalis H5343 ALK 2-1 was cultured in the medium indicated in Table 2 in a stirred aerated fermenter under sterile conditions with an initial volume of 12 L of liquid. The sterile culture medium was inoculated with a 5% inoculum of Candida tropicalis H5343 ALK 2-1 and cultured at 35 ° C and pH 5.8 for about 10 hours with stirring and aeration rates sufficient to increase the content to keep dissolved oxygen above 20%. When the culture terminated exponential growth and the dissolved oxygen content began to increase, the conversion phase was started by starting a continuous feed stream of Exxon Developmental Fluid 137 (a hydrocarbon comprising about 94.4% tridecane, the balance being mainly dodecane), mixed with the fermentation aids 1.25% Emersol ^® 267 (an oleic acid technical grade) and 1.25% Emery ^® 2203 initiated (a Talgsäuremethylester technical grade) 0.7 g / l / h. At the same time, the temperature in the fermenter was reduced from 35 ° C to 30 ° C, the aeration rate was reduced to 0.4 vvm and a back pressure of 0.4 bar was applied to the vessel. During the growth and conversion phase of the pH is maintained between 5.8 and 5.9 with 6N KOH. When the biomass concentration reached about 10 g / L, a continuous glucose feed stream to the fermentor was started at a rate of 1.58 g / L / hr glucose. Based on microscopic observations and the assessment of accumulating storage vacuoles in the yeast cells, the glucose feed rate was reduced by between 0 and 15% daily at conversion. During the conversion, 7 ml of PPG (polypropylene glycol) antifoam was added to the fermenter to control the weak foaming. After 50 hours of the conversion phase, all the broth in the fermenter contained 41.5 g / kg of 1,13-tridecanedic acid.

Beispiel 2Example 2

Tabelle 3 Synthetisches Herstellungsmedium Komponenten Konzentration (g/l) Glucose 27,0 Kaliumphosphat, einbasig 4,9 Magnesiumsulfat 0,6 Calciumchlorid 0,1 Citronensäure 0,06 Eisen(III)-chlorid 0,023 Biotin 0,000012 Spurenmetalle: Kupfer(II)-sulfat 0,00007 Mangansulfat 0,00432 Zinksulfat 0,00072 Citrat 0,00708 Wasser Ausgleich SAG 471^® Antischaummittel 0,6 ml Table 3 Synthetic Preparation Medium components Concentration (g / l) glucose 27.0 Potassium phosphate, monobasic 4.9 magnesium sulfate 0.6 calcium chloride 0.1 citric acid 0.06 Iron (III) chloride 0.023 biotin 0.000012 Trace metals: Copper (II) sulfate 0.00007 manganese sulfate 0.00432 zinc sulfate 0.00072 citrate 0.00708 water compensation SAG 471 ^® antifoam agent 0.6 ml

Die Komponenten des Mediums von Tabelle 3 wurden auf eine geeignete Weise sterilisiert, bei der Präzipitationsreaktionen vermieden werden, und in einem sterilen Fermentergefäß kombiniert. Das vollständige, nichtinokulierte Medium war vollständig klar mit einer leicht strohartigen Färbung und ohne starken Geruch.The Components of the medium of Table 3 were selected for appropriate Sterilized in the precipitation reactions be avoided and combined in a sterile fermenter vessel. The complete, uninoculated medium was completely clear with a slight straw-colored and without a strong smell.

Candida tropicalis H5343 HDC 23-3 wurde in dem in Tabelle 3 angegebenen Medium in einem gerührten, belüfteten Fermenter unter sterilen Bedingungen mit einem Anfangsvolumen an Flüssigkeit von 12 l kultiviert. Das sterile Kulturmedium wurde mit einem 3%-Inokulum von Candida tropicalis H5343 HDC 23-3 inokuliert und bei 35°C etwa 12 Stunden mit Rühr- und Belüftungsraten kultiviert, die ausreichten, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff über 20% zu halten.Candida tropicalis H5343 HDC 23-3 was as indicated in Table 3 Medium in a stirred, ventilated Fermenter under sterile conditions with an initial volume liquid of 12 l cultivated. The sterile culture medium was incubated with a 3% inoculum inoculated by Candida tropicalis H5343 HDC 23-3 and at 35 ° C about 12 Hours with stirring and ventilation rates cultured sufficient to increase the dissolved oxygen content above 20%. to keep.

Während der Wachstumsphase wurde der pH-Wert durch Zusetzen von 6 N NH₄OH, das auch die Quelle von anorganischem Stickstoff in dem Medium war, auf einen Wert zwischen 5,8 und 5,9 eingestellt und dort gehalten. Als die Kultur das exponentielle Wachstum beendete und der Gehalt an gelöstem Sauerstoff anzusteigen begann, wurde die Umwandlungsphase durch Zugeben einer Induzierungsfüllung und gleichzeitiges Starten eines kontinuierlichen Zufuhrstroms von Sonnenblumenfettsäuren mit hohem Oleinanteil (umfassend 84,4% Oleinsäure, 5,2% Linolsäure, 4,7% Stearinsäure, 3,9% Palmitinsäure, wobei der Ausgleich kleine Mengen von Eicosansäure (20:0), Eicosaensäure (20:1), Pentadecansäure, Laurinsäure und Myristinsäure umfasste) mit einer Rate von 2,0 g/l/h eingeleitet.During the growth phase, the pH was adjusted to and maintained between 5.8 and 5.9 by adding 6N NH ₄ OH, which was also the source of inorganic nitrogen in the medium. When the culture terminated exponential growth and the dissolved oxygen content began to increase, the conversion phase was completed by adding an induction fill and simultaneously starting a continuous feed stream of high olein sunflower fatty acids (comprising 84.4% oleic acid, 5.2% linoleic acid, 4, 7% stearic acid, 3.9% palmitic acid, the balance comprising small amounts of eicosanoic acid (20: 0), eicosenoic acid (20: 1), pentadecanoic acid, lauric acid and myristic acid) at a rate of 2.0 g / l / h ,

Zugleich wurde die Temperatur in dem Fermenter von 35°C auf 30°C verringert, die Belüftungsrate auf 0,4 vvm verringert und das Mittel zum Steuern des pH-Werts von NH₄OH auf NaOH umgestellt. Während der Umwandlungsphase wurde der pH-Wert mit 6 N KOH zwischen 5,8 und 5,9 gehalten. Als die Konzentration der Biomasse etwa 10 g/l erreicht hatte, wurde ein kontinuierlicher Glucosezufuhrstrom zu dem Fermenter mit einer Rate von 1,22 g/l/h Glucose gestartet. Auf der Grundlage von mikroskopischen Beobachtungen und der Beurteilung der sich anhäufenden Speichervakuolen in den Hefezellen wurde die Glucosezufuhrrate während der Umwandlung um zwischen 0 und 45% täglich verringert.At the same time, the temperature in the fermenter was reduced from 35 ° C to 30 ° C, the aeration rate reduced to 0.4 vvm, and the means for controlling the pH of NH ₄ OH switched to NaOH. During the conversion phase, the pH was maintained between 5.8 and 5.9 with 6N KOH. When the concentration of biomass reached about 10 g / L, a continuous glucose feed stream to the fermentor was started at a rate of 1.22 g / L / hr glucose. Based on microscopic observations and the assessment of accumulating storage vacuoles in the yeast cells, the glucose feed rate during conversion was reduced by between 0 and 45% per day.

Während der Umwandlungsphase wurde kein zusätzliches Antischaummittel zugesetzt. Nach 50 Stunden Dauer der Umwandlungsphase enthielt die gesamte Brühe in dem Fermenter insgesamt 71 g/kg an Dicarbonsäuren.During the Conversion phase was no additional Added antifoam. After 50 hours duration of the conversion phase contained the entire broth in the fermenter a total of 71 g / kg of dicarboxylic acids.

Beispiel 3Example 3

Tabelle 4 Synthetische Mediumformulierung Komponenten Konzentration (g/l) Glucose 20,0 Ammoniumsulfat 0,5 Kaliumphosphat, einbasig 5,1 Magnesiumsulfat 0,9 NaCl 0,5 Calciumchlorid 0,1 Biotin 0,0002 Spurenmetalle: Borsäure 0,00075 Kupfer(II)-sulfat 0,00006 Kaliumiodid 0,00015 Eisen(III)-sulfat 0,04 Eisen(III)-chlorid 0,0003 Mangansulfat 0,0006 Natriummolybdat 0,0003 Zinksulfat 0,0006 Wasser Ausgleich SAG 471^® Antischaummittel 2 Tropfen Table 4 Synthetic Medium Formulation components Concentration (g / l) glucose 20.0 ammonium sulfate 0.5 Potassium phosphate, monobasic 5.1 magnesium sulfate 0.9 NaCl 0.5 calcium chloride 0.1 biotin 0.0002 Trace metals: boric acid 0.00075 Copper (II) sulfate 0.00006 potassium iodide 0.00015 Iron (III) sulfate 0.04 Iron (III) chloride 0.0003 manganese sulfate 0.0006 sodium 0.0003 zinc sulfate 0.0006 water compensation SAG 471 ^® antifoam agent 2 drops

Die Komponenten des Mediums von Tabelle 4 wurden auf eine geeignete Weise sterilisiert, bei der Präzipitationsreaktionen vermieden werden, und in einem sterilen Fermentergefäß kombiniert. Das Medium war vollständig klar mit einer leichten Färbung und wenig Geruch. Das Zusetzen des Antischaummittels führte zu einer leichten Trübung. Der pH-Wert des Mediums wurde anfangs unter Verwendung einer 6 N Ammoniumhydroxidlösung auf 5,8 eingestellt. Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) wurde in diesem Medium in einem gerührten, belüfteten Fermenter unter Verwendung eines 4%-Inokulums, das in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung hergestellt war, kultiviert.The Components of the medium of Table 4 were selected for appropriate Sterilized in the precipitation reactions be avoided and combined in a sterile fermenter vessel. The medium was complete clear with a slight coloring and little smell. The addition of the antifoam agent resulted a slight haze. The pH of the medium was initially measured using a 6N ammonium hydroxide set to 5.8. Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) in this medium in a stirred, ventilated Fermenter using a 4% inoculum in a medium made with the same composition, cultured.

Nach einer kurzen Verzögerungsphase begann das exponentielle Wachstum. Als die Kultur gemäß Messungen der optischen Dichte etwa 5 g/l Biomasse Trockengewicht enthielt, wurde die Glucosezufuhr mit einer Rate von 1,25 g/h bezogen auf das Anfangsvolumen des Mediums gestartet. Als die Glucose wachstumsbeschränkend wurde, setzte sich das exponentielle Wachstum etwa neun Stunden mit einer während dieses Zeitraums nur geringen Abnahme der exponentiellen Wachstumsrate fort.To a short delay phase began the exponential growth. As the culture according to measurements the optical density contained about 5 g / l biomass dry weight, the glucose feed was at a rate of 1.25 g / h started the initial volume of the medium. As the glucose became growth limiting, The exponential growth continued for about nine hours with one while This period only a small decrease in the exponential growth rate continued.

Am Ende dieser Periode schnellen Wachstums wurde das Mittel zum Steuern des pH-Werts auf eine 6 N Kaliumhydroxidlösung umgestellt und die Glucosezufuhr wurde während der nächsten 110 Stunden unverändert gehalten. Während dieses Zeitraums wurde Ammonium, dessen Konzentration während des gesamten exponentiellen Wachstums konstant geblieben war, im Medium abgereichert und die Phosphatkonzentration sank auf einen niedrigen Pegel. Trotz des Verbrauchs dieser wesentlichen Nährstoffe häufte sich in dem Medium weiterhin Biomasse mit einer konstanten linearen Rate an. Die Zahl der lebenden Zellen nahm ebenfalls linear zu, bis das Ammonium aus dem Medium abgereichert war, und blieb dann unverändert. Am Ende hatte die Fermentation 71,5 g/l Biomasse Trockengewicht hergestellt.At the By the end of this period of rapid growth became the means to control The pH was switched to a 6N potassium hydroxide solution and the glucose feed was during the next 110 hours unchanged held. While This period became ammonium, its concentration during the total exponential growth had remained constant in the medium depleted and the phosphate concentration dropped to a low level Level. Despite the consumption of these essential nutrients heaped In the medium biomass with a constant linear Rate on. The number of living cells also increased linearly, until the ammonium depleted from the medium, and then remained unchanged. At the end, the fermentation had 71.5 g / l biomass dry weight produced.

Vergleichsbeispiel 1Comparative Example 1

Herstellungsmedium Komponenten Konzentration (g/l) Glucose 40,0 Ammoniumsulfat 8,0 Mais-Einweichlauge 9,0 Kaliumphosphat, einbasig 2,0 Kaliumphosphat, zweibasig 1,0 Magnesiumsulfat 0,5 NaCl 0,5 Calciumchlorid 0,1 Spurenmetalle: Borsäure 0,00075 Kupfer(II)-sulfat 0,00006 Kaliumiodid 0,00015 Eisen(III)-chlorid 0,0003 Mangansulfat 0,0006 Natriummolybdat 0,0003 Zinksulfat 0,0006 SAG 471^® Antischaummittel 2 Tropfen production medium components Concentration (g / l) glucose 40.0 ammonium sulfate 8.0 Corn soaking liquor 9.0 Potassium phosphate, monobasic 2.0 Potassium phosphate, dibasic 1.0 magnesium sulfate 0.5 NaCl 0.5 calcium chloride 0.1 Trace metals: boric acid 0.00075 Copper (II) sulfate 0.00006 potassium iodide 0.00015 Iron (III) chloride 0.0003 manganese sulfate 0.0006 sodium 0.0003 zinc sulfate 0.0006 SAG 471 ^® antifoam agent 2 drops

Die Komponenten des Mediums von Vergleichsbeispiel 1 wurden auf eine geeignete Weise sterilisiert, bei der Präzipitationsreaktionen vermieden werden, und in einem sterilen Fermentergefäß kombiniert. Das vollständige, nicht inokulierte Medium war sehr dunkel mit einem starken, für Mais-Einweichlauge typischen Geruch. Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) wurde in dem in Tabelle 4 beschriebenen Medium in einem gerührten, belüfteten Fermenter unter sterilen Bedingungen mit einem Anfangsvolumen an Flüssigkeit von 10 l kultiviert. Das sterile Kulturmedium wurde mit einem 6%-Inokulum von Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) inokuliert und bei 35°C etwa 9,5 Stunden mit Rühr- und Belüftungsraten kultiviert, die ausreichten, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff über 20% zu halten. Während des Wachstums wurde dem Fermenter 5 ml SAG 471 Antischaummittel zugesetzt, um das Schäumen der Kultur zu beherrschen. Der pH-Wert wurde während der Wachstumsphase durch Zusetzen von 6 N NH₄OH zwischen 5,8 und 5,9 gehalten. Als die Kultur das exponentielle Wachstum beendete und der Gehalt an gelöstem Sauerstoff anzusteigen begann, wurde die Umwandlungsphase durch Zugeben eines kontinuierlichen Zufuhrstroms von Emersol^® 267 (einer Oleinsäure mit Handelsqualität, umfassend 71,8% Oleinsäure, 8,3% Linolsäure, 6,3% Palmitinsäure, 4,6% Palmitoleinsäure, 2,8% Stearinsäure, 2,7% Myristinsäure, 0,93% C17:0-Säure, 0,86% Myristoleinsäure, 0,58% Linolensäure und 0,42% Laurinsäure) mit einer Rate von 2,0 g/l/h eingeleitet. Zugleich wurde die Temperatur in dem Fermenter von 35°C auf 30°C verringert, die Belüftungsrate auf 1,2 vvm verringert und das Mittel zum Steuern des pH-Werts von NH₄OH auf KOH umgestellt. Während der Umwandlungsphase wurde der pH-Wert mit 6 N KOH bei 5,8 oder darüber gehalten. Am Ende der Phase exponentiellen Wachstums, unmittelbar vor dem Beginn der Umwandlungsphase, wurde ein kontinuierlicher Glucosezufuhrstrom zu dem Fermenter mit einer Rate von 1,8 g/l/h gestartet. Diese Glucosezufuhrrate zu dem Fermenter wurde während der gesamten Umwandlungsphase beibehalten. Während der ersten 3 Stunden der Umwandlungsphase wurden dem Fermenter 17 ml SAG 471 Antischaummittel zugesetzt, um das sehr heftige Schäumen zu beherrschen. Nach 50 Stunden Dauer der Umwandlungsphase enthielt die gesamte Brühe in dem Fermenter insgesamt 64 g/kg Dicarbonsäuren.The components of the medium of Comparative Example 1 were sterilized in a suitable manner in which precipitation reactions are avoided and combined in a sterile fermenter vessel. The complete, uninoculated medium was very dark with a strong odor typical of corn steep liquor. Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) was cultured in the medium described in Table 4 in a stirred, aerated fermentor under sterile conditions with an initial volume of 10 L of liquid. The sterile culture medium was inoculated with a 6% inoculum of Candida tropicalis H5343 (ATCC 20962) and cultured at 35 ° C for approximately 9.5 hours with stirring and aeration rates sufficient to maintain the dissolved oxygen content above 20% , During growth, 5 ml of SAG 471 antifoam agent was added to the fermenter to control the foaming of the culture. The pH was maintained between 5.8 and 5.9 during the growth phase by adding 6N NH ₄ OH. When the culture completed the exponential growth and the content started to increase dissolved oxygen, the conversion phase was prepared by adding a continuous feed stream of Emersol ^® 267 (a commercial grade of oleic acid, comprising 71.8% of oleic acid, 8.3% linoleic acid, 6.3 % Palmitic acid, 4.6% palmitoleic acid, 2.8% stearic acid, 2.7% myristic acid, 0.93% C17: 0 acid, 0.86% myristoleic acid, 0.58% linolenic acid and 0.42% lauric acid) initiated at a rate of 2.0 g / l / h. At the same time, the temperature in the fermenter was reduced from 35 ° C to 30 ° C, the aeration rate was reduced to 1.2 vvm, and the pH control agent was switched from NH ₄ OH to KOH. During the conversion phase, the pH was maintained at 5.8 or above with 6N KOH. At the end of the exponential growth phase, just prior to the beginning of the conversion phase, a continuous glucose feed stream to the fermenter was started at a rate of 1.8 g / L / hr. This glucose feed rate to the fermentor was maintained throughout the conversion phase. During the first 3 hours of the conversion phase, 17 ml of SAG 471 antifoam were added to the fermenter to control the very vigorous foaming. After 50 hours of the conversion phase, the total broth in the fermenter contained a total of 64 g / kg dicarboxylic acids.

Beispiel 4Example 4

Modifikation einer wässrigen Suspension von DodecandisäureModification of an aqueous suspension of dodecanedioic acid

Zunächst wurde eine fein verteilte wässrige Suspension von 25 g/l langkettiger Dicarbonsäure durch Lösen von 12,5 Gramm Dodecandisäure, 99%, von Dupont (Aldrich Chemical Company) (DDDA) in Wasser mit einem Überschuss an KOH, um das wasserlösliche Dicarboxylat zu bilden, hergestellt. Anschließend wurde die Lösung unter Verwendung von H₂SO₄ schnell auf einen pH-Wert von 6 titriert, um die zweiwertige Säure zu präzipitieren.First, a finely divided aqueous suspension of 25 g / L long chain dicarboxylic acid was prepared by dissolving 12.5 grams of dodecanedioic acid, 99%, by Dupont (Aldrich Chemical Company) (DDDA) in water with an excess of KOH to form the water soluble dicarboxylate , produced. Subsequently, the solution was titrated rapidly to pH 6 using H ₂ SO ₄ to precipitate the diacid.

Zu acht Schraubfläschchen mit flachem Boden und einem Rührstab wurden jeweils zwanzig Milliliter dieser Suspension zugegeben. Somit enthielt jedes Fläschchen 0,5 Gramm fein verteilte, in Wasser suspendierte Dodecandisäure. Die Fläschchen wurden in einem Wasserbad mit 30°C auf einem Magnetrührer angeordnet, dann wurden die Suspensionen über Nacht unter Rühren äquilibrieren gelassen.To eight screw bottles with a flat bottom and a stir bar Twenty milliliters of this suspension were added. Consequently contained each vial 0.5 grams of finely divided dodecanedioic acid suspended in water. The phial were in a water bath at 30 ° C on a magnetic stirrer then the suspensions were allowed to equilibrate overnight with stirring calmly.

Es wurde der Einfluss von verschiedenen Zusatzstoffen auf das Verhalten der Suspension untersucht, indem den äquilibrierten Fläschchen Teststoffe mit verschiedenen Konzentrationen zugegeben wurden. Die Zusammensetzungen der in Handel erhältlichen Teststoffe sind in Tabelle 1 angegeben.It was the influence of various additives on the behavior The suspension is examined by placing the equilibrated vial Test substances with different concentrations were added. The compositions the commercially available Test substances are given in Table 1.

Die Gesamtformulierung in jedem Fläschchen ist in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5: Einfluss von Zusatzstoffen auf wässrige Dicarbonsäuresuspensionen Testvolumen = 20 ml, Testtemperatur = 30°C Dodecandisäure in der Suspension = 0,5 Gramm Fläschchen Zusatzstoff Menge (μg) Verhältnis Zusatzstoff/DDDA (ppm) 1 Oleinsäure 44 88 2 Oleinsäure 88 176 3 Talgsäuremethylester 44 88 4 Talgsäuremethylester 88 176 5 Methyloleat 44 88 6 Methyloleat 88 176 7 keines (Kontrolle) 0 0 The total formulation in each vial is given in Table 5. Table 5: Influence of additives on aqueous dicarboxylic acid suspensions Test volume = 20 ml, test temperature = 30 ° C Dodecanedioic acid in the suspension = 0.5 grams phial additive Quantity (μg) Ratio additive / DDDA (ppm) 1 oleic acid 44 88 2 oleic acid 88 176 3 Talgsäuremethylester 44 88 4 Talgsäuremethylester 88 176 5 methyl 44 88 6 methyl 88 176 7 none (control) 0 0

Das Aussehen und das Verhalten der Suspensionen wurde 4 Stunden, 24 Stunden oder länger nach dem Zusetzen der Test-Zusatzstoffe beobachtet und mit der Kontrolle (Fläschchen 7) verglichen. Unter einem Phasenkontrastmikroskop zeigte sich die Kontrolle als Suspension mit ein wenig Zusammenlagerung von Einzelteilchen.The Appearance and behavior of the suspensions was 4 hours, 24 Hours or longer observed after adding the test additives and with the control (vial 7) compared. Under a phase contrast microscope showed the Control as a suspension with a little aggregation of individual particles.

Beide Methylester-Zusatzstoffe führten bei beiden Konzentrationen zu einer besseren Zusammenlagerung der DDDA zu diskreten Teilchen ähnlicher Größe (Fläschchen 3 bis 6). Dies war zu erkennen, wenn die Fläschchen von dem Rührtisch entfernt und sich beruhigen gelassen wurden. Die Suspensionen mit den Methylester-Zusatzstoffen beruhigten sich wesentlich schneller als die Kontrolle. Die verbleibende wässrige Phase war klarer als bei der Kontrolle, die auf Grund der in Suspension bleibenden kleineren DDDA-Teilchen trübe blieb.Both Methylester additives led at both concentrations to a better collection of DDDA more like discrete particles Size (vial 3 to 6). This was evident when the vials from the mixing table removed and allowed to calm down. The suspensions with the methyl ester additives Calmed down much faster than the control. The remaining one aqueous phase was clearer than in the control, due to the suspension remaining smaller DDDA particles remained cloudy.

Die überraschendsten Ergebnisse wurden mit den Suspensionen mit den Oleinsäure-Zusatzstoffen erhalten, bei denen sich die Teilchen innerhalb von 4 Stunden zu großen Massen zusammenzulagern begannen. Nach zwanzig Stunden enthielt Fläschchen 1 große, dichte Massen von DDDA in der Nähe des Bodens und einige kleinere Massen oben im Fläschchen. Nach 20 Stunden enthielt Fläschchen 2 eine einzige Kugel DDDA mit einem Durchmesser von etwa 1 cm, während die wässrige Phase klar war.The most surprising Results were obtained with the suspensions containing the oleic acid additives obtained in which the particles within 4 hours huge Began to assemble masses. After twenty hours contained phial 1 big, dense masses of DDDA nearby of the soil and some smaller masses in the top of the vial. After 20 hours contained phial 2 a single ball DDDA with a diameter of about 1 cm, while the aqueous Phase was clear.

Nach dem Inkubieren der Fläschchen 1 und 2 über 20 Stunden hinaus zerbrachen Teile der größeren Massen. Diese Teile lagerten sich an den Rührstab an. Schließlich wuchs das gesamte DDDA auf den Rührstab, so dass das Fläschchen einen sich drehenden Klumpen DDDA in klarem Wasser enthielt.To incubating the vials 1 and 2 over 20 hours later, parts of the larger masses shattered. These parts were stored to the stir bar at. After all the entire DDDA grew on the stir bar, so the vial contained a spinning lump DDDA in clear water.

Dieses Beispiel zeigt, wie das Zusetzen von Fettsäuren und Fettsäurederivaten verwendet werden kann, um wässrige Suspensionen von Dicarbonsäuren herzustellen, die für die Trennung durch Verfahren wie Filtration, Sedimentation oder Größenklassifizierung besser geeignet sind.This Example shows how to add fatty acids and fatty acid derivatives Can be used to watery Suspensions of dicarboxylic acids produce that for separation by methods such as filtration, sedimentation or size classification are more suitable.

Beispiel 5Example 5

Viskosität von wässrigen Dicarbonsäuresuspensionen: Einfluss der TeilchenmorphologieViscosity of aqueous dicarboxylic acid suspensions: Influence of particle morphology

Eine etwa zwölfprozentige (117,0 g/kg) wässrige Suspension von gesättigten und ungesättigten Dicarbonsäuren, hauptsächlich C16 bis C18, wurde in einer Fermentationsbrühe aus Sonnenblumenöl mit hohem Oleinanteil unter Verwendung eines Mikroorganismus bei 30°C hergestellt. Während der Fermentation wurde der Fermentationsbrühe Methyloleat als Fed-Batch mit einer Rate zugeführt, die ein Verhältnis von Methyloleat zu Dicarbonsäuren von etwa 1% bereitstellte. Eine Probe der Brühe wurde zur Untersuchung mittels Phasenkontrastmikroskopie und zu Messungen der Viskosität, deren Ergebnisse in Tabelle 6 gezeigt sind, entnommen.A about twelve percent (117.0 g / kg) aqueous Suspension of saturated and unsaturated dicarboxylic acids, mainly C16 to C18, was in a fermentation broth of sunflower oil with high olein content prepared using a microorganism at 30 ° C. During the Fermentation was the fermentation broth methyl oleate as a fed-batch fed at a rate the one relationship of methyl oleate to dicarboxylic acids of about 1%. A sample of the broth was examined by phase contrast microscopy and for measurements of the viscosity, the results of which are shown in Table 6 taken.

Zum Vergleich wurde die Probe anschließend auf 70°C erwärmt und schnell auf Raumtemperatur abgekühlt, um die Scheibenstrukturen, die sich in der ursprünglichen Brühe gebildet hatten, zu zerbrechen. Dies wurde dann der gleichen Analyse unterzogen, wie ebenfalls in Tabelle 6 gezeigt ist. Tabelle 6: Einfluss der Teilchenmorphologie auf die Brookfield-Viskosität einer etwa 12%-igen wässrigen Fermentationsbrühen-Suspension von Dicarbonsäuren Probe Aussehen der Teilchen Spindel-Nr./Drehzahl der Spindel (Upm) Viskosität (cP) bei 21°C Fermentationsbrühe schüsselförmige Scheiben, 25–30 μm Durchmesser, 5 μm Dicke Spindel 2/3 Upm 5.000 erwärmte und wieder abgekühlte Fermentationsbrühe nadelartige Kristalle Spindel 4/0,3 Upm 1.000.000 For comparison, the sample was then heated to 70 ° C and rapidly cooled to room temperature to break up the disk structures that had formed in the original broth. This was then subjected to the same analysis as also shown in Table 6. Table 6: Influence of particle morphology on the Brookfield viscosity of an approximately 12% aqueous fermentation broth suspension of dicarboxylic acids sample Appearance of the particles Spindle No./ Spindle Speed (rpm) Viscosity (cP) at 21 ° C fermentation broth Bowl-shaped slices, 25-30 μm diameter, 5 μm thick Spindle 2/3 rpm 5000 heated and cooled fermentation broth needle-like crystals Spindle 4 / 0.3 rpm 1000000

Eine Reihe von ähnlichen Experimenten wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Dicarbonsäuren in Suspension durchgeführt und bestätigte die vorstehend gezeigten Ergebnisse, da sie ein im Wesentlichen gleiches Verhalten zeigten. Solche Konzentrationen waren wie folgt: 27,6 g/kg, 57,3 g/kg, 83,2 g/kg, 95,8 g/kg, 100,9 g/kg, 117,0 g/kg und 117,0 g/kg in einer wärmeabgeschreckte Probe.A Series of similar Experiments were done with different concentrations of dicarboxylic acids in Suspension performed and confirmed the results shown above, since they are essentially same behavior showed. Such concentrations were as follows: 27.6 g / kg, 57.3 g / kg, 83.2 g / kg, 95.8 g / kg, 100.9 g / kg, 117.0 g / kg and 117.0 g / kg in a heat quenched Sample.

Diese Ergebnisse zeigen den markanten Einfluss von Fettsäurederivaten auf die Morphologie von Dicarbonsäuren und die Viskosität einer Fermentationsbrühe.These Results show the striking influence of fatty acid derivatives on the morphology of dicarboxylic acids and the viscosity of a Fermentation broth.

Beispiel 6Example 6

Einfluss von verschiedenen Fettsäurederivaten und -konzentrationen auf die Präzipitatmorphologie von zweiwertigen SäurenInfluence of different fatty acid derivatives and concentrations on the precipitate morphology of dibasic acids

Verschiedene Pegel und Arten von Fettsäurederivaten wurden bei ähnlichen Fermentationen wie in Beispiel 5 eingesetzt, anschließend wurden die Proben mikroskopisch untersucht, um den Einfluss auf das Teilchenwachstum von Dicarbonsäuren zu bestimmen. Tabelle 7 zeigt mehrere Kombinationen von Substraten und Fettsäurederivat-Zusatzstoffen, die bei der Herstellung von Dicarbonsäuren verwendet wurden, und das Aussehen der erhaltenen Dicarbonsäuren in Suspension unter einem Phasenkontrastmikroskop. Tabelle 7: Einfluss von Fettsäurederivat-Zusatzstoffen auf die Morphologie in Suspension in einer Fermentationsbrühe Substrat, das zu Dicarbonsäuren oxidiert wird zugegebene Suspensionsmodifikationsmittel (Verhältnis zu zweiwertigen Säuren) Aussehen der suspendierten Dicarbonsäureteilchen Sonnenblumenfettsäuren mit hohem Oleinanteil 1,0% Methyloleat scheiben- bis schüsselförmig, schmale Verteilung, etwa 30 μm Durchmesser und 5 μm Dicke Sonnenblumenfettsäuren mit hohem Oleinanteil 0,1% Methyloleat einzelne schmale Vereilung, scheibenförmig, etwa 15 μm Durchmesser teilhydrolysiertes Sonnenblumenöl mit hohem Oleinanteil¹ enthielt 5% Fettsäureglycerinester einzelne schmale Vereilung, scheibenförmig, etwa 15 μm Durchmesser Sonnenblumenfettsäuren mit hohem Oleinanteil keine (Vergleichskontrolle für eine in situ Fettsäureoxidation) bimodale Verteilung von Scheibengrößen, um 5 und 10 μm zentriert Kohlenwasserstoffgemisch² 2,5% Emersol^® 267 +2,5% Talgsäuremethylester scheibenförmige Teilchen, 20 μm Durchmesser Kohlenwasserstoffgemisch² 1,25% Methyloleat +1,25% Oleinsäure einzelne schmale Verteilung, scheibenförmig, etwa 15 μm Durchmesser Kohlenwasserstoffgemisch² keine (Vergleichskontrolle für eine in situ Kohlenwasserstoffoxidation) wenige scheibenförmige Teilchen, die meisten Teilchen < 2 μm

• ¹ Hochdruckdampf-hydrolysiertes Ö1 mit einem Säurewert von 188,3 und einem Verseifungswert von 198,5, was eine 95%-ige Hydrolyse der Fettsäuretriglyceridester anzeigt und ein Gemisch von Mono-, Di- und Triglyceriden ergibt, die als Modifikationsmittel der Präzipitation dienen.
• ² NORPAR^® 13 SOLVENT, ein Produkt der Exxon Corporation, umfassend normale aliphatische Kohlenwasserstoffe C11 < 1%, C12 = 13%, C13 = 50%, C14 = 35%, C15 < 1%.

Various levels and types of fatty acid derivatives were used in similar fermentations as in Example 5, then the samples were examined microscopically to determine the effect on particle growth of dicarboxylic acids. Table 7 shows several combinations of substrates and fatty acid derivative additives used in the preparation of dicarboxylic acids and the appearance of the resulting dicarboxylic acids in suspension under a phase contrast microscope. Table 7: Influence of fatty acid derivative additives on the morphology in suspension in a fermentation broth Substrate that is oxidized to dicarboxylic acids added suspension modifier (ratio to dibasic acids) Appearance of the suspended dicarboxylic acid particles Sunflower oil fatty acids with high olein content 1.0% methyl oleate disc-shaped to bowl-shaped, narrow distribution, about 30 microns in diameter and 5 microns thick Sunflower oil fatty acids with high olein content 0.1% methyl oleate single narrow distribution, disk-shaped, about 15 μm in diameter partially hydrolyzed sunflower oil with high olein content ¹ contained 5% fatty acid glycerol ester single narrow distribution, disk-shaped, about 15 μm in diameter Sunflower oil fatty acids with high olein content none (comparative control for in situ fatty acid oxidation) bimodal distribution of disk sizes, centered around 5 and 10 microns Hydrocarbon mixture ² 2.5% Emersol ^® 267 + 2.5% Talgsäuremethylester disc-shaped particles, 20 μm diameter Hydrocarbon mixture ² 1.25% methyl oleate + 1.25% oleic acid single narrow distribution, disk-shaped, about 15 μm in diameter Hydrocarbon mixture ² none (comparative control for in situ hydrocarbon oxidation) a few disk-shaped particles, most particles <2 μm

• ¹ high pressure steam hydrolysed oil having an acid value of 188.3 and a saponification value of 198.5 indicating a 95% hydrolysis of the fatty acid triglyceride esters to give a mixture of mono-, di- and triglycerides which serve as modifiers of precipitation.
• ² NORPAR ^® 13 SOLVENT a product of Exxon Corporation, including normal aliphatic hydrocarbons C11 <1%, C12 = 13%, C13 = 50%, C14 = 35%, C15 of <1%.

Beispiel 7Example 7

Viskosität von wässrigen Dicarbonsäuresuspensionen: Scherverdünnungs-EigenschaftenViscosity of aqueous dicarboxylic acid suspensions: Shear thinning properties

Die Scherverdünnungs-Eigenschaften einer wässrigen Suspension von 70,3 g/kg (7%) C11-C15 gesättigten Dicarbonsäuren wurde in einer Fermentationsbrühe unter Verwendung von jeweils 1,25% Methyloleat und Oleinsäure hergestellt. Die Untersuchung durch Phasenkontrastmikroskopie der Brühe zeigte, dass die Suspension der zweiwertigen Säuren scheibenförmige Dicarbonsäureteilchen mit 15 μm Durchmesser enthielt.The Shear thinning properties an aqueous Suspension of 70.3 g / kg (7%) of C11-C15 saturated dicarboxylic acids in a fermentation broth prepared using 1.25% methyl oleate and oleic acid, respectively. The examination by phase contrast microscopy of the broth showed that the suspension of dibasic acids disc-shaped dicarboxylic acid particles with 15 μm Diameter contained.

1 zeigt die Scherverdünnungs-Charakteristik dieser wässrigen Suspension. Eine Reihe von ähnlichen Experimenten wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Dicarbonsäure in Suspension durchgeführt und bestätigte die vorstehend gezeigten Ergebnisse, da sie ein im Wesentlichen gleiches Verhalten zeigten. Solche Konzentrationen waren 17,8 g/kg, 26,4 g/kg und 59,9 g/kg. 1 shows the shear thinning characteristic of this aqueous suspension. A series of similar experiments were performed with various concentrations of dicarboxylic acid in suspension and confirmed the results shown above, as they showed a substantially similar behavior. Such concentrations were 17.8 g / kg, 26.4 g / kg and 59.9 g / kg.

Claims (23)

Wässrige Suspension, umfassend Wasser, mindestens eine Dicarbonsäure und ein Fettmaterial von im Wesentlichen scheibenförmigen, im Wesentlichen partiell kugelförmigen oder im Wesentlichen kugelförmigen Dicarbonsäureteilchen, wobei der Durchmesser der Dicarbonsäureteilchen größer als 15 μm ist und wobei das Fettmaterial in einer Menge von 10 Teilen pro Million bis 5%, bezogen auf die Masse der Dicarbonsäure, zugegen ist.aqueous Suspension comprising water, at least one dicarboxylic acid and a fatty material of substantially disc-shaped, substantially partial spherical or substantially spherical dicarboxylic acid particles, wherein the diameter of the dicarboxylic acid particles is greater than 15 microns is and wherein the fatty material is in an amount of 10 parts per million to 5%, based on the mass of the dicarboxylic acid, is present. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 1, wobei der Durchmesser der Dicarbonsäureteilchen von 15 μm bis 1 cm reicht.An aqueous suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 1, wherein the diameter of Dicarbonsäureteilchen from 15 microns to 1 cm ranges. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 1, wobei die Dicke der im Wesentlichen scheibenförmigen oder im Wesentlichen partiell kugelförmigen Dicarbonsäureteilchen von 1 μm bis 5 μm reicht.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 1, wherein the thickness of the substantially disc-shaped or substantially partially spherical Dicarboxylic acid particles of 1 μm to 5 μm is enough. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 1, wobei die Temperatur der Suspension unter 50°C gehalten wird.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 1, wherein the temperature of the suspension is kept below 50 ° C. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 1, wobei das Fettmaterial eine Fettsäure ist.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 1, wherein the fatty material is a fatty acid is. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 1, wobei das Fettmaterial ein Fettsäureester ist.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 1, wherein the fatty material is a fatty acid ester is. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 6, wobei der Fettsäureester ein Methylester ist.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 6, wherein the fatty acid ester is a methyl ester. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 1, wobei das Fettmaterial in einer Menge von 50 Teilen pro Million bis 1%, bezogen auf die Masse der Dicarbonsäure, zugegen ist.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 1, wherein the fatty material in an amount of 50 parts per million to 1%, based on the mass of the dicarboxylic acid, is present. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 1, wobei das Fettmaterial eine Kombination aus Fettsäure und Fettsäureester umfasst.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 1, wherein the fatty material is a combination of fatty acid and fatty acid ester includes. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 9, wobei der Fettsäureester ein Methylester ist.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 9, wherein the fatty acid ester is a methyl ester. Wässrige Suspension, die mindestens eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 1, wobei die wässrige Suspension ein Fermentationsmedium ist, umfassend: (a) eine Quelle für metabolisierbaren Kohlenstoff und Energie; (b) eine Quelle für anorganischen Stickstoff; (c) eine Quelle für Phosphat; (d) mindestens ein Metall, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Alkalimetall, einem Erdalkalimetall, Übergangsmetallen, und deren Gemischen; und (e) eine Quelle für Biotin, die im Wesentlichen frei von Teilchensubstanz und Bakterien ist.aqueous A suspension containing at least one dicarboxylic acid according to claim 1, wherein the watery Suspension is a fermentation medium comprising: (a) one Source for metabolizable carbon and energy; (b) a source for inorganic Nitrogen; (c) a source of phosphate; (d) at least a metal, selected from the group consisting of an alkali metal, an alkaline earth metal, transition metals, and their mixtures; and (e) a source of biotin, which is essentially free of particulate matter and bacteria. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, umfassend das Zugeben einer effizienten Dicarbonsäureteilchenform-bildenden Menge eines Fettmaterials zu der Suspension, so dass geformte Dicarbonsäureteilchen gebildet werden, wobei die Form ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus im Wesentlichen scheibenförmig, im Wesentlichen partiell kugelförmig und im Wesentlichen kugelförmig, und wobei die Teilchen einen Durchmesser größer als 15 μm aufweisen und wobei das Fettmaterial in einer Menge von 10 Teilen pro Million bis 5%, bezogen auf die Masse der Dicarbonsäure, zugegen ist.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains comprising adding an efficient dicarboxylic acid particulate forming Amount of a fatty material to the suspension such that shaped dicarboxylic acid particles are formed, wherein the form is selected from the group consisting essentially disc-shaped, essentially partially spherical and substantially spherical, and wherein the particles have a diameter greater than 15 microns and wherein the fatty material in an amount of 10 parts per million to 5%, based on the Mass of the dicarboxylic acid, is present. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 12, wobei der Durchmesser der Dicarbonsäureteilchen von 15 μm bis 1 cm reicht.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 12, wherein the diameter of the dicarboxylic acid particles of 15 μm to 1 cm is enough. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 12, wobei die Dicke der im Wesentlichen scheibenförmigen oder im Wesentlichen partiell kugelförmigen Dicarbonsäureteilchen von 1 μm bis 5 μm reicht.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 12, wherein the thickness of the substantially disc-shaped or essentially partially spherical Dicarbonsäureteilchen of 1 μm up to 5 μm enough. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 12, zudem umfassend das Halten der Temperatur der Suspension unter 50°C.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 12, further comprising maintaining the temperature of Suspension below 50 ° C. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 12, wobei das Fettmaterial eine Fettsäure ist.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 12, wherein the fatty material is a fatty acid. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 12, wobei das Fettmaterial ein Fettsäureester ist.A method of modifying the rheological properties of an aqueous suspension containing a di carboxylic acid, according to claim 12, wherein the fatty material is a fatty acid ester. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 17, wobei der Fettsäureester ein Methylester ist.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 17, wherein the fatty acid ester is a methyl ester. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 12, wobei die Menge von 50 Teilen pro Million bis 1%, bezogen auf die Masse der Dicarbonsäure, reicht.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 12, wherein the amount of 50 parts per million to 1%, based on the mass of the dicarboxylic acid, is sufficient. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 12, wobei das Fettmaterial eine Kombination aus Fettsäure und Fettsäureester ist.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 12, wherein the fatty material is a combination of fatty acid and fatty acid ester is. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 20, wobei der Fettsäureester ein Methylester ist.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 20, wherein the fatty acid ester is a methyl ester. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 12, wobei die wässrige Suspension ein Fermentationsmedium umfasst.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 12, wherein the aqueous Suspension comprises a fermentation medium. Verfahren zum Modifizieren der rheologischen Eigenschaften einer wässrigen Suspension, die eine Dicarbonsäure enthält, nach Anspruch 22, wobei das Fermentationsmedium umfasst: (a) eine Quelle für metabolisierbaren Kohlenstoff und Energie; (b) eine Quelle für anorganischen Stickstoff; (c) eine Quelle für Phosphat; (d) mindestens ein Metall, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Alkalimetall, einem Erdalkalimetall, Übergangsmetallen, und deren Gemischen; und (e) eine Quelle für Biotin, die im Wesentlichen frei von Teilchensubstanz und Bakterien ist.Method for modifying the rheological properties an aqueous Suspension containing a dicarboxylic acid contains according to claim 22, wherein the fermentation medium comprises: (A) a source for metabolizable carbon and energy; (b) a source for inorganic Nitrogen; (c) a source of phosphate; (d) at least a metal, selected from the group consisting of an alkali metal, an alkaline earth metal, transition metals, and their mixtures; and (e) a source of biotin, which is essentially free of particulate matter and bacteria.