DE60132656T2

DE60132656T2 - Quantifizierte fluoreszenzmikroskopie

Info

Publication number: DE60132656T2
Application number: DE60132656T
Authority: DE
Inventors: Jean I. Brookline MONTAGU
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 2000-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2021-02-10
Also published as: EP1254392B1; CA2399627A1; US6984828B2; US20070190566A1; WO2001059503A9; DE60132656D1; US20070012885A1; US20050206893A1; JP2003522973A; ATE385322T1; EP1254392A2; WO2001059503A3; WO2001059503A2; US6472671B1; US20030015668A1; US20030057379A1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf die Mikroskopie und insbesondere auf die Kalibration einer Position einer Probe in Bezug auf optische Elemente eines Mikroskops und/oder die Kalibration der Fluoreszenzerfassung bei Mikroskopen.
Hintergrund
Test- oder Kalibrationszielobjekte werden dafür eingesetzt, um die Systemleistungsfähigkeit herkömmlicher Mikroskope zu bewerten. Diese werden dazu verwendet, um ein Bezugsniveau zwischen verschiedenen Mikroskopsystemen zu definieren und die Bildqualität in Bezug auf seine herkömmlichen Komponenten zu charakterisieren: Auflösung, Kontrast, Schärfentiefe und Verzerrung. Übliche Angebote für die herkömmlichen Mikroskopie sind das USAF-Tiefenauflösungszielobjekt, das USAF-Kontrastauflösungszielobjekt, das Sternzielobjekt (Star Target), das Ronchi-Regelzielobjekt (Ronchi Ruling Target), Modulationsübertragungsfunktion-Zielobjekt (Modulation Transfer Function Target), Schärfentiefe-Zielobjekte, und Verzerrungs- und Aberrations-Zielobjekte. Es gibt auch noch weitere.
Zielobjekte sind typischerweise ein Muster, die auf Kunststoff- oder Glassubstraten gedruckt oder durch Abscheidung aus der Dampfphase gebildet sind. Die optischen Merkmale auf dem Zielobjekt sind vorzugsweise feiner als die Auflösung des getesteten optischen Systems. Während es erwünscht ist, dass die Bezugsmerkmale Abmessungen oder Parameter haben, die eine Größenordnung kleiner als diejenigen der Proben sind, die durch das Mikroskop untersucht werden sollen, mußten Praktiker Be zugsgrößen oder -parameter akzeptieren, die nur 4 bis 5 mal kleiner als diejenigen der zu untersuchenden Proben sind.
Die Fluoreszenzmikroskopie von Proben unterscheidet sich von der herkömmlichen Mikroskopie und ist anspruchsvoller als diese, weil sie auf relativ niedrigen Intensitäten von Fluoreszenzemissionen basiert, die durch Beleuchtung der Probe angeregt werden, wobei typischerweise konfokale Anordnungen eingesetzt werden, um das relativ schwache Signal durch eine Lochblende oder dergleichen zu detektieren. Ein Beispiel ist die Detektion von Fluoreszenz von getrockneten Flüssigkeitstropfen, die möglicherweise fluoreszierendes biologisches Material enthalten, wobei sich die getrockneten Tropfen im Wesentlichen in der Brennebene des Gerätes befinden (die Dicke der getrockneten Tropfen liegt unterhalb von wenigen Mikrometern). Ein anderes Beispiel ist die Fluoreszenz von einem biologischen Mikro-Array wie etwa ein biologisches Array-Produkt GeneChip^® wie von Affymetrix, Inc. hergestellt, bei dem das fluoreszierende Material eine relativ unmaßgebliche Dicke hat.
Für Test- oder Kalibrationszielobjekte für die Fluoreszenzmikroskopie gibt es neben zahlreichen herkömmlichen Bestandteilen der Bildqualität das Erfordernis, die optische Effektivität des Systems in Bezug auf Fluoreszenzemission zu testen. Dies führt zu erheblichen Komplikationen, da die Fluoreszenz einen angeregten photochemischen Effekt beinhaltet, um eine Spannung oder eine Signalamplitude in dem Detektor zu erzeugen, was zu Überlegungen in Bezug auf das Signal zu Rauschverhältnis führt, das mit Messungen in den verschiedenen optischen Bestandteilen in Wechselwirkung tritt, die bei der Kalibration beteiligt sind. Im Allgemeinen muss das Signal zu Rauschverhältnis wenigstens 3 zu 1 betragen, um einen zufriedenstellenden Betrieb zu erreichen.
Es war ein bislang ungelöstes Problem, ein Kalibrationszielobjekt zu finden, das in angemessener Weise die Fluoreszenzaktivität simuliert, die über einen breiten Bereich von Geräten und Betriebsbedingungen quantifiziert werden soll. Es ist erwünscht, die Fluoreszenzproben zu simulieren, die innerhalb der Schärfentiefe des Mikroskops liegen und die im Fall von Mikrotropfen biologischen Material im Wesentlichen in einer Ebene liegen, zum Beispiel in einer Tiefe von nur wenigen Mikrometern oder sogar wesentlich weniger. Da die Abmessungen der individuellen abzubildenden Proben mit den Fortschritten der Mirko-Array-Technologie immer kleiner werden, hat sich die Bedeutung des Problems, kein geeignetes Kalibrationsinstrument zu haben, als zunehmend schwerwiegend erwiesen.
Die Schwierigkeiten der Fluoreszenzmikroskopie liegen darin, dass es ohne die gewünschte Kalibrationsgenauigkeit schwierig ist, die Resultate zu vergleichen, die bei biologischer oder anderweitiger Forschung mit verschiedenen Geräten erhalten wurden, was ernsthafte Schwierigkeiten beim Vergleichen und Koordinieren der Resultate verschiedener Laboratorien hervorruft, egal ob die Laboratorien sich in verschiedenen Institutionen oder in getrennten Laboreinrichtungen innerhalb derselben Institution befinden. Ferner können auch bei einem gegebenen Gerät die Unsicherheiten der Kalibration Fehler in die Messungen wichtiger Vorgänge, wie etwa der proportionalen Expression etc., einführen. Insbesondere wird das Fehlen einer guten Referenz und Kalibration an der vordersten Front der Forschung wahrgenommen, wo die Ergebnisse noch so neu sind und noch nicht genügend Zeit oder Erfahrung vorhanden ist, um verlässliche Standards zu entwickeln. Die Entwicklung einer tatsächlich quantitativen Fluoreszenzmikroskopie kann diesen Bedarf erfüllen.
Auf der anderen Seite wird die Verfügbarkeit eines leistungsstarken Kalibrationsinstruments Möglichkeiten für die kosten günstige verlässliche Fluoreszenzgeräte und -verfahren für klinische Aufbauten zur Diagnose und bei der Behandlung eröffnen. Die vorhandenen Kalibrationsinstrumente für die herkömmliche Mikroskopie befriedigen die Bedürfnisse der Fluoreszenzmikroskopie nicht in zufriedenstellender Weise. Eine Anzahl von speziellen Techniken wurde vorgeschlagen.
Eine Technik, die von Max Levy Reprographics angeboten wird, verwendet eine Schicht aus organischem Fluoreszenzmaterial von zum Beispiel 3 μm Dicke, das Fluoreszenzemission über ein breites Wellenlängenspektrum zeigt und auf einem nicht-fluoreszierenden Glassubstrat wie etwa aus einem synthetischen Quarz aufgebracht ist. Es wird dann ein geeignetes Muster in das Fluoreszenzmaterial geätzt, so dass kritische Bezugskanten durch die freigelegten Kanten des Fluoreszenzmaterials definiert werden. Ein Nachteil dieser Technik besteht darin, dass die minimale Dicke des Fluoreszenzmaterials, die aufgebracht werden kann, in der Größenordnung von 3 μm liegt und dass bei einer solchen Dicke die Kanten des Musters nicht vollständig geätzt werden können. Man nimmt an, dass die feinsten Referenzdetails, die in diesem Material gebildet werden können, etwa 4 μm breite Linien sind, deren Mittellinien 8 μm voneinander entfernt sind. Das ist für die Kalibration von Geräten, die eine herkömmliche Punktgröße (spot size) von 5 μm einsetzen, nicht zufriedenstellend und ist eine Größenordnung größer als zur Bewertung von optischen Punkten die 0,5 μm im Durchmesser sind, erforderlich wäre, was mit einem Mikroskop mit einem Objektiv von 0,7 NA in Luft erreichbar ist, oder die einen Durchmesser von 0,25 μm haben, was mit einem Ölbadobjektiv mit 1,4 NA erreichbar ist.
Die relativ große Dicke der Fluoreszenzschicht schafft Probleme bei der Kantendefinition, insbesondere weil Fluoreszenzstrahlen unter spitzen Winkeln zu der Oberfläche abgestrahlt und durch die Kanten des Materials blockiert werden können, oder weil andererseits die Kanten selbst fluoreszieren, was eine Irreführung hervorbringt. Eine andere Technik zum Testen eines Fluoreszenzmikroskops verwendet als Substrat ein Fluoreszenzglas, auf dem eine sehr dünne Materialschicht aufgebracht ist, zum Beispiel mit einer Dicke von wenigen hundert Angström. Vorzugsweise wird eine Nickelschicht verwendet. Ein geeignetes Muster wird danach in das Metall geätzt, um die feinen Merkmale zu erzeugen, die eine so geringe Dimension wie etwa 0,5 μm haben. Während diese Technik nicht die zuvor erwähnte Problematik der Kanten hat, habe ich erkannt, dass es bei diesem Ansatz andere Nachteile gibt, die durch die Tatsache bedingt sind, dass das Glas ein signifikantes Fluoreszenzvolumen bildet, d.h. eine erhebliche Dicke von 1 mm hat, was die Schärfentiefe weit übersteigt (es ist zu bemerken, dass bei einer Punktgröße von 5 bzw. 0,5 μm die Schärfentiefe typischerweise 50 μm beziehungsweise 4,5 μm beträgt und bei kleineren Punktgrößen zunehmend kleiner wird). Die aus diesem Volumen ausgestrahlte Fluoreszenzstrahlung erschwert die genaue Definition des Fokus und bietet daher für viele Zwecke keinen zufriedenstellenden Standard. Demgemäß gibt es einen Bedarf für Kalibrationsinstrumente, Kalibrationsvorrichtungen, -verfahren und -instrumente, die in der Mikroskopie verwendet werden.
Ein Kalibrationsinstrument gemäß Oberbegriff von Patentanspruch 1 ohne eine dünne opake Maske ist in JP 10 153529 beschrieben, wobei das Fluoreszenzmuster erzeugt wird, indem Körner aus fluoreszierendem Material auf die Oberfläche eines nicht-fluoreszierenden Klebstoffs zwischen Scheiben aus Glas platziert werden. Die oben erwähnten Probleme der Kantendifinition bleiben durch diese Beschreibung ungelöst, da die kleinsten Referenzdetails, die erzeugt werden können, im Bereich von einigen Mikrometern liegen und nicht dazu geeignet sind, um erheblich kleinere Punktgrößen zu bewerten.
Der gleiche Nachteil besteht in dem aus JP 09 203865 bekannten Stand der Technik, bei dem ebenfalls ein Fluoreszenzmuster aus fluoreszierendem Material gebildet wird.
Das Dokument WO 99/00689 bezieht sich nicht speziell auf die Fluoreszenzmikroskopie, aber das darin beschriebene Kalibrationsinstrument verwendet eine sehr dünne Metallschicht auf einem Substrat, um ein Bezugsmuster zu definieren. Das Problem der Kalibration der Intensität eines Lichtsignals von einem Gerät, das in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, bleibt durch diese Beschreibung ungelöst, was durch das signifikante Fluoreszenzvolumen bedingt ist, das die Schärfentiefe übersteigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst die Probleme bekannter Kalibrationsinstrumente zum Kalibrieren der Intensität eines Lichtsignals von einer Einrichtung, die in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, gemäß Oberbegriff von Patentanspruch, um durch die kennzeichnenden Merkmale von Patentanspruch 1 einen zufriedenstellenden Kalibrationsstandard zu erhalten.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung schafft eine Lösung für das Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen Kalibrationsinstruments durch die kennzeichnenden Merkmale von Patentanspruch 11.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung schafft eine Lösung für das Verfahren der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie, mit Kalibrierung der Intensität eines Lichtsignals mit dem oben beschriebenen Kalibrationsinstrument, durch die kennzeichnenden Merkmale von Patentanspruch 15.
In Verbindung mit einem Aspekt umfasst ein Kalibrationsinstrument für die Fluoreszenzmikroskopie einen Träger, eine feste Oberflächenschicht mit einem fluoreszierenden Material und eine dünne opake Maske aus nicht-fluoreszierendem Material, die Referenzmerkmalöffnungen mit ausgewählten Abmessungen definiert, die Bereiche der Oberflächenschicht freilegen.
Vorzugsweise kann ein erster Typ des Kalibrationsinstruments einen Adhäsionsverstärker umfassen, der den Kontakt zwischen der Oberfläche des Trägers und der festen Oberflächenschicht, die das Fluoreszenzmaterial enthält und die in Kontakt mit der dünnen opaken Maske ist, verbessert. Alternativ kann ein zweiter Typ des Kalibrationsinstruments eine dünne opake Maske enthalten, die auf dem Träger (mit oder ohne einen Adhäsionsverstärker) erzeugt ist, wobei die feste Oberflächenschicht mit dem Fluoreszenzmaterial auf der dünnen opaken Maske angeordnet ist.
Zu den bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspektes gehören eine oder mehrere der Folgenden: Die dünne opake Maske wird auf dem Träger unter Verwendung eines Adhäsionsverstärkers gebildet. Der Träger ist flach und starr. Der Träger enthält Quarzglas. Die Oberflächenschicht ist opak. Die Maske umfasst eine dünne Metallfolie. Der Träger bildet ein optisches Fenster einer Kassette. Viele geeignete Arten von Kassetten sind in U.S. Patent 6,140,044 beschrieben.
Die Fluorophore sind durch optische Strahlung anregbar, die den Träger und/oder die Öffnungen in der Maske durchläuft. Die Fluorophore werden durch optische Strahlung angeregt, die durch den Träger und die Öffnungen in der Maske fällt, und der Träger absorbiert angeregte Fluoreszenzstrahlung.
Die feste Oberflächenschicht schafft einen breitbandigen Fluoreszenzstrahler. Die feste Oberflächenschicht stellt einen Fluoreszenzstrahler bereit, der bei wenigstens zwei Wellenlängen aktiv ist und der Emissionseigenschaften ähnlich denjenigen der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 hat. Die feste Oberflächenschicht schafft einen Fluoreszenzstrahler mit einer effektiven Fluoreszenzemission, die eine Antwort auf voller Skala für die Mikroskopkalibration erzeugen kann. Die das Fluoreszenzmaterial enthaltende feste Oberflächenschicht hat eine Dicke im Bereich von etwa 2 μm bis 250 μm. Die feste Oberflächenschicht ist aus Polyimid.
Die dünne opake Maske hat eine Dicke im Bereich von etwa 10 nm bis etwa 10 μm. Die dünne opake Maske hat eine Dicke im Bereich von etwa 10 nm bis etwa 100 nm.
In Verbindung mit einem anderen Aspekt wird bei einem Verfahren zur Herstellung eines Kalibrationsinstruments für die Fluoreszenzmikroskopie ein Träger bereitgestellt, eine Fluoreszenzmaterial enthaltende feste Oberflächenschicht bereitgestellt und eine dünne opake Maske aus nicht-fluoreszierendem Material hergestellt, die Referenzmerkmalöffnungen mit ausgewählten Abmessungen definiert, die Bereiche der Oberflächenschicht freilegen.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Aspekts können eine oder mehrere der folgenden umfassen: Die feste Oberflächenschicht, die das Fluoreszenzmaterial enthält, kann auf den Träger aufgebracht werden. Dies kann die Aufbringung eines Adhäsionsverstärkers auf den Träger beinhalten, um die das Fluoreszenzmaterial enthalende feste Oberflächenschicht zu bilden. Die Aufbringung kann die Zufuhr von Dampf zur Bildung der festen Oberflächenschicht mit dem Fluoreszenzmaterial umfassen, wie etwa durch Verdampfen oder Sputtern. Das Aufbringen beinhaltet auch die Rotationsbeschichtung zur Bildung der festen Oberflächenschicht mit dem Fluoreszenzmaterial.
Die Herstellung der dünnen opaken Maske umfasst das Aufbringen des nicht-fluoreszierenden Materials auf den Träger und die Musterbildung des nicht-fluoreszierenden Materials, um die Bezugsmerkmalöffnungen zu bilden. Dann wird die feste Oberflächenschicht mit dem Fluoreszenzmaterial auf die dünne opake Maske aufgebracht.
Der Träger kann aus Quarzglas sein. Die dünne opake Maske kann Metall enthalten. Der Träger kann als optisches Fenster für eine Kassette verwendet werden, die bei der Untersuchung von biologischem Material eingesetzt wird.
Die feste Oberflächenschicht stellte einen breitbandigen Fluoreszenzstrahler bereit.
Die feste Oberflächenschicht stellt einen Fluoreszenzstrahler bereit, der bei wenigstens 2 Wellenlängen aktiv ist und der Emissionseigenschaften ähnlich denen der Fluoreszenzfarbstoffe Cy3 und Cy5 hat.
In Verbindung mit einem anderen Aspekt wird bei einem Verfahren zur Kalibration eines Mikroskops ein Mikroskop bereitgestellt, das oben beschriebene Kalibrationsinstrument eingesetzt, ein Anregungsstrahl, der von einem Objektiv des Mikroskops ausgestrahlt wird, in den Fokus gebracht und die detektierte Intensität des Mikroskops kalibriert.
Das Einstellen in den Fokus kann das Einstellen einer Position eines Probentisches beinhalten, auf dem das Kalibrationsinstrument angeordnet ist. Das Mikroskop kann ein Mikroskop mit auf der Achse liegendem, beweglichem Objektiv sein. Das Mikroskop kann ein Mikrolinsenobjektiv haben, das von einem oszillierenden Dreharm getragen wird.
Das zur Anwendung bei konfokaler Mikroskopie geeignete Kalibrationsinstrument hat eine eingeschränkte Schärfentiefe, und die feste Oberflächenschicht, die die Fluorophore aufweist, hat eine effektive Dicke, die geringer als die Schärfentiefe des konfokalen Mikroskops ist, wobei die Oberflächenschicht vorzugsweise eine effektive Fluoreszenzemission hat, die eine Antwort des Mikroskops auf voller Skala erzeugen kann.
In Verbindung mit einem anderen Aspekt wird bei einem Verfahren der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie ein Fluoreszenz detektierendes Mikroskop bereitgestellt, ein Kalibrationsinstrument wie oben beschrieben eingesetzt, um das Mikroskop zu kalibrieren, und Fluoreszenzmikroskopie an Proben unter Verwendung des kalibrierten Mikroskops durchgeführt. Vorzugsweise ist das Mikroskop ein Mikroskop mit auf der Achse liegendem, beweglichem Objektiv, und besonders bevorzugt hat das Mikroskop eine Mikroobjektivlinse, die von einem schnell oszillierenden Dreharm getragen wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Fluoreszenzkalibrationsinstrument mit einer geeignet fluoreszierenden festen Oberflächenschicht konstanter Dicke aufgebaut, die opak ist, aus organischem oder anorganischem Material hergestellt ist und auf einem geeigneten Träger aufgebracht ist. Bei Materialien, die nicht von Natur aus opak sind, werden Farbstoffe oder Pigmente hinzugefügt. Eine sehr dünne Schicht wird danach auf das opake Fluoreszenzmaterial aufgebracht und wird mit einer Schicht aus Photowiderstand bedeckt. Dann wird ein geeignetes Muster auf dem Photowiderstand erzeugt und chemisch geätzt. Das resultierende Fluoreszenzmuster, das sich durch die geätzten Öffnungen zeigt, hat extrem feine Merkmale, weil die Metallschicht nur einen Bruchteil eines Mikrometer dick ist, vorzugsweise etwa 100 bis 300 × 10^–10 m (Angström).
Der Prozess der Mustererzeugung kann identisch mit den Prozessen sein, die bei der Herstellung von integrierten Schaltungen verwendet werden. Gegenwärtig ermöglicht diese Technologie die Bildung von Merkmalen, die so scmal sind wie 0,2 μm breite Linien, die von Zwischenräumen mit der gleichen Abmessung getrennt sind.
Bei dem Kalibrationsinstrument wird die Fluoreszenz als Oberflächenemissionsphänomen erzeugt, was eine verlässliche Fokussierung und Fluoreszenzkalibration ermöglicht, die als Standard verwendet werden kann und die es ermöglicht, alle Instrumente auf denselben Standard einzustellen. Vorzugsweise verwendet das Kalibrationsinstrument ein sehr stabiles Fluoreszenzmaterial, das unempfindlich gegenüber lichtinduziertem Zerfall ist.
Ein wichtiges Fluoreszenzmaterial mit einem breiten Band einer Fluoreszenzantwort ist ein ausgewähltes Polyimid, wie etwa Kapton, das in flüssiger Form erhältlich ist und bei der Rotationsbeschichtung von Substraten verwendet wird und Schichten mit einer Dicke von 1 bis 10 μm erzeugt. Ein geeignetes Material ist unter den Produktnamen WE-IIII oder PI-IIII von H.D. Microsystems, Wilmington, Delaware, erhältlich. Dieses Material ist ein Polyimid, das als Gerüstkette einen Polyaminsäurenvorgänger mit hohem Molekulargewicht hat, der aus einem spezifischen aromatischen Dianhydrid und einem aromatischen Diamin besteht.
Das fluoreszierende Material kann vorzugsweise ein anderes Polyimidprodukt sein, nämlich Probonide 116A, das bei Arch Chemicals, Portsmouth, New Hampshire erhältlich ist. Dieses Material zeigt breitbandige Fluoreszenz mit etwa ¼ der Intensität des Produktes von H.D. Microsystems, das in zufriedenstellender Weise verwendet werden kann. Alternativ kann das fluoreszierende Polyimidmaterial ein solches sein, das als selbst grundierende, nicht lichtempfindliche Polyaminsäureformulierung an die Halbleiterindustrie geliefert wird und das nach thermischem Aushärten eine vollkommene stabile Polyimidbeschichtung wird.
Ein anderes Material für die Oberflächenschicht, das für speziell interessierende Wellenlängen geeignet ist, ist eine extrem dünne Schicht eines Fluoreszenzglases, das zum Beispiel durch Aufdampfen oder durch einen Sol-Gel-Prozess auf einem nicht-fluoreszierenden Träger aufgebracht ist. Im Falle eines Sol-Gel-Prozesses werden großen Moleküle eines glasartigen Materials mit ausgewählten Fluorophoren in einem Wasser- oder Alkoholträger in Suspension gebracht und als Filmbeschichtung auf einen Träger aufgebracht. Sie wird bei relativ niedriger Temperatur gebacken, um einen dünnen, glasartigen Fluoreszenzfilm zu bilden. In diesen und in anderen Fällen werden Fluoreszenzfarbstoffe für spezifische Wellenlängen in einen geeigneten nicht-fluoreszierenden und vorzugsweise opaken Binder eingeführt, der als dünne Beschichtung mit gleichmäßiger Dicke aufgebracht wird. Beispiel für Fluoreszenzfarbstoffe sind Cy3, Cy5 und Fluoreszen.
In allen Fällen muss die Substanz für die Oberflächenschicht so ausgewählt sein, dass sie unter normalen Einsatzbedingungen der Geräte zur Untersuchung von Fluoreszenzproben zur Detektion ausreichende Fluoreszenz erzeugt. Die spezifische Auswahl eines fluoreszierenden Referenzmaterials hängt von vielen Parametern ab, wie etwa die Antwort des Gerätes, der ausgewählten Wellenlänge, der Größe der zu untersuchenden Merkmale und der Punktgröße des Anregungsstrahls. Im Fall eines kommerziellen Geräts, wie in dem Beispiel in dem nachfolgenden Anhang beschrieben, muss das Fluoreszenzmaterial von der Größenordnung her etwa 1 Million mal soviel Strahlung erzeugen, wie am Detektor detektiert wird. Die oben beschriebenen Polyimidmaterialien haben einen großen Vorteil gegenüber anderen, denn sie haben ein breites Band und sind daher als einzelner Bezugsstandard, für einen Bereich von ausgewählten Wellenlängen, bei denen wichtige Experimente durchgeführt werden, geeignet.
Einige Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie erfordern, dass das untersuchte Material hinter einem durchsichtigen Schutzfenster angeordnet wird, das aus einem nicht-fluoreszierenden optischen Glas hergestellt ist, wie etwa aus synthetischem Quarz. In solchen Fällen verdoppelt das Ausrichtungsinstrument die Anwendung vorzugsweise und das metallisierte Ziel wird erst auf dem Glas erzeugt und die Fluoreszenzmedien werden als eine Beschichtung aufgebracht, die sowohl die Metallisierung als auch das Glas überdeckt, oder ist als eine planare Beschichtung auf einem zweiten optisch flachen Teil aufgebracht, das dann Vorderseite an Vorderseite mit der Metallschicht auf dem ersten optisch flachen Teil angebracht wird.
In vielen Fällen sind die effektiven Fluorophore zum Erzeugen von Photonen, die den Detektor erreichen, im Wesentlichen nur in der Oberflächenschicht angeordnet. (Der Ausdruck "effektive Fluorophore" soll hierin bedeuten, dass darin im Wesentlichen alle die Fluorophore eingeschlossen sind, die dazu in der Lage sind, maßgebliche Fluoreszenzstrahlung von der Oberfläche der Oberflächenschicht zu erzeugen, die den Detektor eines Mikroskops erreichen können, und bezieht sich nicht auf Fluorophore, die entweder aufgrund der Undurchsichtigkeit der Matrix außerhalb des Bereichs der Anregungsstrahlung des Mikroskops sind oder die, obwohl sie innerhalb der Reichweite der effektiven Anregungsstrahlung sind, keine Fluoreszenzstrahlung erzeugen, die den Detektor des Mikroskops erreicht, zum Beispiel wegen der Absorption durch das undurchsichtige Matrixmaterial.) Die Oberflächen-Fluorophore schaffen eine Annäherung dessen, was geschieht, wenn Punkte von biologischem Probenmaterial, die nur einen Bruchteil eines Mikrometers dick sind, in Reaktion auf einen einfallenden Anregungsstrahl Fluoreszenz erzeugen.
Bei dem vorliegende Kalibrationsinstrument kann die Einschränkung der Fluoreszenz auf die Oberflächenschicht für eine gegebene Anwendung durch eine oder eine Kombination mehrerer Techniken erreicht werden. In einem Fall ist das Bindematerial zur Bildung der festen Matrix, in der die Kalibrationsfluorophore enthalten sind, im Wesentlichen undurchsichtig bei der Anregungs- oder Detektionswellenlänge oder beides gemacht, so dass ein großer Bruchteil, zum Beispiel 80% oder mehr, vorzugsweise soviel wie 99%, der detektierten Fluoreszenzstrahlung aus einer Oberflächenschicht einer Tiefe Δ_t austritt, die nur von der Größenordnung der Dicke der zu untersuchenden Proben ist und die innerhalb der Schärfentiefe des Gerätes ist. In einem anderen Fall war die Mikrometerdicke einer Schicht, in der die Fluorophore eingeschlossen sind, auf einen hohen Grad an Gleichmäßigkeit kontrolliert, wobei die Schicht auf einem opaken Träger liegt, der keine Fluorophore aufweist, so dass selbst wenn einige Fluoreszenz auf einer Tiefe jenseits der bevorzugten Grenze kommt, der resultierende Anteil von Lumineszenz außerhalb der Begrenzung wegen der Gleichförmigkeit der Beschichtungsdicke gleichförmig über das Instrument verteilt ist und daher nicht dazu wirksam ist, um die Kalibration signifikant zu stören.
In einem anderen Fall werden die Fluorophore in eine Oberflächenschicht eingebracht, nachdem die Oberflächenschicht vorgeformt ist, zum Beispiel durch Eindiffundieren, Sprüh- oder Implantationstechniken, die die Fluorophore im Wesentlichen auf die Oberfläche einschränken, die durch Öffnungen in dem Muster freigelegt werden soll. Daher wird bei dem Kalibrationsinstrument eine effektive feste Fluoreszenzoberflächenschicht bereitgestellt, das als Stellvertreter für eine zu untersuchende Probe dienen kann.
Die Dicke der dünnen Metallschicht oder eines anderen Materials, dass das Referenzmuster bildet, ist auch von Bedeutung, da viele Strahlen der detektierten Fluoreszenz einen großen Winkel, wie etwa 45°, mit der untersuchten Oberfläche einnehmen und durch die Kantenwände der Musterelemente, wenn diese Elemente zu dick sind, blockiert werden können, was die Auflösung der Detektion der Musterkanten verschlechtert. Je feiner die untersuchten Merkmale sind, desto feiner muss die Kalibration des Gerätes sein und desto kritischer wird die Dicke der Musterelemente, zum Beispiel der Referenzlinien, Kreise etc., die in der dünne opaken Maske enthalten sind.
Ein wichtiger Aspekt ist die durch die fluoreszierende Oberflächenschicht erzeugte Fluoreszenzwellenlänge. Vorzugsweise setzt das Kalibrationsinstrument ein Breitband-Fluoreszenzmaterial ein und ist daher mit verschiedenen Lasern und Wellenlängen verwendbar, die bei Mikroskopen verwendet werden, und hat verschiedene Typen von Fluorophoren, die in verschiedenen Gebieten wissenschaftlicher oder industrieller Forschung verwendet werden. In einem Beispiel wird ein Polyimidmaterial ausgewählt, das eine effektive Fluoreszenz zur Verwendung als Referenz bei Wellenlängen von 473 nm bis 850 nm, oder vorzugsweise von 450 nm bis 800 nm, hat, was im Wesentlichen den gesamten sichtbaren Spekralbereich abdeckt. (Das sichtbare Spektrum ist wichtig, da eine große Menge von historischen biologischen Daten in diesen Bereich erzeugt worden ist und als Bezug oder Vergleich, während die Forschung weitere Fortschritte macht, zur Verfügung steht.) Es können jedoch auch Fluorophore im nahen Infrarot- und Ultraviolettbereich eingesetzt werden, sofern die Umstände in Bezug auf die Biologie und die verfügbaren Beleuchtungsquellen und Detektoren es zulassen.
In Verbindung mit einem anderen Aspekt wird das Kalibrationsinstrument in Kombination mit einem auf der Achse liegen den, abtastend beweglichen Objektiv verwendet, um hochgradig reproduzierbare quantitative Fluoreszenzmikroskopie auszuführen. Während Mikroskope mit irgendwelchen Bewegungseinrichtungen für die Linse, vorzugsweise eine Mikrolinse, umfasst sind, können erhebliche weitere Vorteile erreicht werden, indem ein oszillierender Dreharm dazu verwendet wird, um die Mikrolinse über die Probe oder das Kalibrationsinstrument zu bewegen. Die Kalibration von Fluoreszenz detektierenden Mikroskopen umfasst Anwendungen von der Kalibration von auf der Achse liegenden, abtastenden Fluoreszenz-Mikroskopen mit weitem Gesichtsfeld und schließlich bis hin zur quantitativen Fluoreszenzmikroskopie, die Anwendungen an der vordersten Front der genetischen Forschung und Wirkstoffentdeckung bis hin zur klinischen Anwendung haben. Die Erfindung hat besondere Anwendbarkeit bei der exakten Auslese von Biochips und Mikro-Arrays.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Draufsicht auf ein Ausrichtungsinstrument, das in der Mikroskopie verwendet wird.
2 ist ein Querschnitt des Instruments, der durch bestimmte Ausrichtungsmerkmale entlang der Linien 2-2 aus 1 genommen ist.
3 ein Diagramm ist, das Herstellung des Ausrichtungsinstruments aus 1 illustriert.
4 zeigt eine Ausführungsform des Ausrichtungsinstruments, das mit einem Mikroskop verwendet wird.
4A zeigt eine alternativ Ausführungsform des Ausrichtungsinstruments, das mit einem Mikroskop verwendet wird.
5 illustriert ein Ablaufdiagramm eines anderen Verfahrens zur Herstellung eines Ausrichtungsinstruments, während 5a das resultierende Instrument zeigt.
5b zeigt ein Ablaufdiagramm eines anderen Verfahrens zur Herstellung eines Ausrichtungsinstruments, während 5c und 5d schematische Querschnittsansichten der Instrumentenherstellung sind.
6 eine Ansicht einer Alternative zu dem Aufbau des in 5B gezeigten Instruments ist.
7 die Verwendung des in 5B oder 6 gezeigten Instruments illustriert.
8 und 8A schematisch ein abtastendes Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskop zeigen, das eine hin- und hergehende Mikroobjektivlinse auf einem schnell sich drehenden, oszillierenden Arm einsetzt.
9 eine perspektivische Darstellung eines oszillierenden Arms des in 8 gezeigten abtastenden Mikroskops ist, bei dem das Ausrichtungsinstrument eingesetzt wird.
10 ist eine schematische Draufsicht auf den oszillierenden Arm aus 9, der bei der Abtastung eins Mikro-Arrays aus biologischem Material auf einem Glasobjektträger oder einem Biochips nach der Kalibration des in 9 gezeigten abtastenden Mikroskops verwendet wird.
Detallierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Mit Bezug auf 1 und 2 weist das Ausrichtungsinstrument 2a ein im Wesentlichen ebenes, starres Teil auf, das auf seiner Oberfläche ein detailliertes Muster von optischen Merkma len trägt, die für die Kalibration des Gerätes geeignet sind. Das starre Teil hat typischerweise die gleichen Abmessungen wie die Mikroskop-Objektträger, Mikro-Array-Chips oder die anderen zu untersuchenden Gegenstände, um in dieselbe Position an dem Gerät zu passen. Die optischen Merkmale des Ausrichtungsinstruments umfassen Linien und kreisförmige Punkte mit verschiedenen Abmessungen, um die verschiedenen Größen von Punkten und linearen Merkmalen von biologischem Material oder anderen Materialien zu simulieren, die untersucht werden. Die feinsten Merkmale haben Abmessungen von der Größenordnung von 1 μm oder weniger, um so in geeigneter Weise die Detektion von Merkmalen mit Abmessung von einigen Mikrometern oder weniger zu kalibrieren.
Das in 1 und 2 gezeigte Kalibrationsinstrument umfasst Regionen T-1, T-2, T-3, T-4 und T-5. Die Region T-1 enthält einen Satz von "Strichcode"-Linien mit einer Dicke von 2 μm, 4 μm, 6 μm, 8 μm, 10 μm und 12 μm, jeweils getrennt durch das 2-fache ihrer Größe. Die Region T-2 enthält eine lange 5 μm Linie und eine 10 μm Linie quer. Die Region T-3 enthält eine feste Schicht des fluoreszierenden Materials. Die Region T-4 umfasst drei Arrays von kreisförmigen Merkmalen mit Durchmessern von 300 μm bis 25 μm, und mit Quadraten mit Größen von 300 μm bis 25 μm. Die Region T-5 ist ein festes metallisches Gebiet.
Mit Bezug auf 3 ist bei einer bevorzugten Ausführungsform der erste Schritt bei der Herstellung des Kalibrationsinstruments die Bereitstellung einer festen Trägerplatte, die effektive Fluorophore eingeschlossen in einer festen Oberflächenschicht 4 hat, die nur ein Bruchteil der Dicke hat, siehe 2. Typischerweise ist diese Tiefe Δ_t vernachlässigbar, so dass die Fluoreszenzemission im Wesentlichen als ein Oberflächenphänomen stattfindet. Auf diese Schicht wird im zweiten Schritt ein Nickelfilm oder ein anderer geeigneter, sehr dünner und opaker Metallfilm aufgebracht, der geätzt werden kann, um ein Referenzmuster zu bilden. Beschichten durch Sputtern, Vakuummetallabscheidung oder andere bekannte Techniken können ebenfalls eingesetzt werden. Dann wird ein Photowiderstand auf die Metallschicht aufgebracht, der Photowiderstand auf dem Instrumentenvorläufer wird dann durch eine Präzisionsmaske beleuchtet, die die Ausrichtungsmerkmale definiert, und dann wird die Oberfläche chemisch geätzt, um das resultierende Referenzmuster zu bilden. Das resultierende Instrument wird dazu verwendet, um Fluoreszenzmessungen wie auch herkömmliche bildgebende Komponenten von Fluoreszenzmikroskopen zu kalibrieren.
Mit Bezug auf 4 trägt ein oszillierender Arm 19, der sich um die Achse A dreht, eine auf der Achse liegende Mikro-Objektivlinse 18 für auf der Achse liegende Abstastung des Ausrichtungsinstruments 2A, das an der Stelle platziert ist, die normalerweise durch die zu untersuchenden Proben eingenommen wird. Die Spiegel 15 und 17 dienen dazu, Anregungslicht von einer stationären Laserquelle entlang der Drehachse A, dann heraus entlang des Armes zu der Linse 18 und dann auf die Probe (oder in diesem Fall auf das Kalibrationsinstrument) zu lenken. Licht, das die Oberflächenschicht 4 des Instruments erreicht, regt effektive Fluorophore an, die in alle Richtungen und mit einer anderen Wellenlänge abstrahlen. Ein wesentliches Merkmal ist, dass diese Strahlung von der Mikrolinse 18 (deren Achse immer senkrecht zu der Objektebene steht) eingefangen und durch den optischen Weg und eine Blende, wie etwa eine Lochblende 103, zu einem Detektor D, 95 geworfen wird, typischerweise auf eine Photomultiplier-Röhre (PMT).
Im Fall von 4 ist die Oberflächenschicht 4 eine separat aufgebrachte Schicht mit einer gleichmäßigen minimalen Dicke, die auf eine feste, optisch flache, opake Trägerplatte aufgebracht ist. Vorzugsweise ist die Oberflächenschicht 4 auch opak, so dass anregendes Licht nicht einmal in die Oberflächenschicht wesentlich eindringt; aber selbst wenn sie zu ei nem gewissen Grad eindringt ist irgendwelche zufällige Fluoreszenz von unterhalb der Oberflächenschicht gleichmäßig verteilt wegen der großen Gleichmäßigkeit der Schicht und der nicht-ausstrahlenden Eigenschaft des Trägers, weswegen der störende Effekt solcher zufälliger Fluoreszenz in vielen Fälle toleriert werden kann. Abhängig von dem bestimmten Gerät und der Anwendung muss die Oberflächenschicht in manchen Fällen, in denen die feste Oberflächenschicht extrem dünn und ausreichend gleichmäßig in der Dicke und der Verteilung der Fluorophore ist, nicht opak sein und kann immer noch richtig funktionieren, um im Wesentlichen nur Oberflächenemissionen zu erzeugen.
Die alternativen Verfahren nach 5 und 5b erklären sich selbst, wobei bei beiden Kalibrationsinstrumente hergestellt werden, die im Betrieb durch Licht beleuchtet werden, das durch den durchsichtigen Musterträger fällt. Das Instrument aus 5A wird durch die Schritte aus 5 hergestellt, während die Instrumente aus 5D und 6 durch Ausführung der Schritte aus 5B hergestellt werden. Die Instrumente aus 5 und 6 unterscheiden sich in derselben Weise voneinander, wie sich die Instrumente aus 4 und 4A, wie oben beschrieben, unterscheiden.
Die resultierenden Instrumente dienen dazu, um eine Standardisierung von abtastenden Fluoreszenzmikroskopen mit weitem Sichtfeld wie den in 8 und 9 dargestellten zu ermöglichen. Dieses Mikroskop ist im Detail in der PCT Anmeldung PCT/US99/06097 , veröffentlicht als WO99/47964 mit dem Titel "Wide Field of View and High Speed Scanning Microscopy" beschrieben. Es ist ausreichend zu bemerken, dass die Mikro-Objektivlinse 18, die an dem Dreharm 19 auf der Achse liegend zur Abtastung angebracht ist, zu einer schnellen oszillierenden Drehbewegung durch ein Galvanometer oder einen oszillierenden Motor 3 angetrieben wird, dessen Stellung durch den Po sitionssensor 43 erfasst wird, um die Datenerfassung mit der Position auf der Probe in Beziehung zu setzen. Durch Einsatz einer Lochblende oder einer anderen Einengung 103 vor dem Lichtsensor 95 hat das resultierende konfokale Mikroskop eine signifikant begrenzte Schärfentiefe, die mit herkömmlichen Techniken nicht gut kalibriert werden konnten, aber die unter Verwendung von Kalibrationsinstrumenten mit breitbandiger Oberflächenemission durch Fluoreszenz wie hierin beschrieben leicht mit hoher Genauigkeit kalibriert werden können. 9 illustriert den Einsatz eines wie oben beschriebenen Kalibrationsinstruments mit einem Mikroskop mit beweglichen Objektiv, während 10 das darauffolgende Abtasten eines Mikro-Arrays unter Verwendung desselben Gerätes zeigt, das nun kalibriert ist, um quantitative Fluoreszenzmikroskopie zu realisieren, beider einfach die Resultate, die von anderen Mikroskopen erzeugt, die in dergleichen Weise kalibriert worden sind, zu vergleichen sind.
Eine grobe Analyse der Fluoreszenzmenge, die erforderlich ist, um eine tatsächliche Probe zu stimulieren, wird in dem folgenden Anhang in Bezug auf ein kommerzielles konfokales, abtastendes Fluoreszenzmikroskop, auf Basis einer Mikrolinse, die von einem schnell oszillierenden Arm getragen wird, und mit Bezug auf das 418 Array-Scanner^TM beschrieben, das von Genetic MicroSystems Inc. erhältlich ist. Bei Befolgen einer ähnlichen Analyse für andere Geräte kann man zu geeigneten Fluoreszenzintensitäten für diese Geräte kommen; durch Betrachten der Datensätze für alle Geräte ist ein Standardkalibrationsinstrument erhältlich.
Anhang

Analyse der benötigten Fluoreszenz für ein praktisches Abtastmikroskop mit weitem Sichtfeld und beweglichem auf der Achse liegendem Objektiv (418 Array-Scanner, der von Genetic MicroSystems, Inc. erhältlich ist)

Tabelle 1

(1) Beleuchtungsleistung: 3 mW auf der Probe bei 6,37 nm

(2) Transporteffizienz zu dem Photomultiplier-Detektor: Sammlungseffektivität: geometrisch: 13% 0,13 dichromatische Transmission 0,9 Emissionsfilter 0,6 Näherungsweise Transporteffizienz zu dem Photomultiplier = 0,070

(3) 5 V/nW minimale Verstärkung des Photomultipliers = Empfindlichkeit = S

(4) Näherungsweise 0,6 V auf der vollen Skala. Typisches Photomultipliersignal = C

(5) Annahme, dass der schwächste Photomultiplier (zum Beispiel Hammamatsu Photomultiplier) gesättigt ist für die Detektion von Σ = 637 nm Antwort = R = C : S R = 0,5 V : 5 V/nW = 0,1 nW am Photomultiplier S = 0,1 nW : 0,070 = 1,4 nW auf dem Mikroskopobjektträger

(6) Fluoreszenzerzeugunsrate = 1,4 (10^–9) : 3 (10^–3) von der Größenordnung von 1,5 : 3 (10^–6) = 0,5 (10^–6)

In dieser Tabelle repräsentiert die Beleuchtungsleistung die Leistung, die typischerweise zu dem Mikroskopobjektträger zum Anregen der Fluoreszenzemission geliefert wird. Die Transporteffizienz (2) wird durch drei Werte definiert. Der erste ist die geometrische Sammlungseffektivität der Linse, die auf der Größe der konfokalen Lochblende und dem Abstand zu dem Mi kroskopobjektträger basiert. Für das Gerät in diesem Beispiel werden 13% des emittierten Fluoreszenzlichts gesammelt, d.h. das Fluoreszenzlicht wird am Ziel mit sphärischer Verteilung abgestrahlt, und das Instrument sammelt 13% von diesem Licht. Das Licht läuft durch einen dichromatischen Spiegel, der notwendig ein Verlustfaktor mit sich bringt, so dass 90% des Lichtes hindurchläuft und 10% in andere Richtungen in das System reflektiert werden und verloren gehen. Schließlich lässt ein Emissionsfilter vor der Photomultiplier-Röhre etwa 60% des Fluoreszenzlichts hindurch. Der Emissionsfilter ist ein mehrlagiger optischer Filter, der das Anregungslicht zurückweist, das die Fluoreszenzenergie begleitet, die typischerweise mit ihrem Zentrum etwa 25 bis 30 nm weg von der Wellenlänge der Anregungslaserenergie liegt.
Das Gerätemodell 418 Array Scanner arbeitet bei 532 und 637 nm. Eine andere nützliche Wellenlänge ist 473 nm. Bei diesen Wellenlängen muss für dieses Gerät die Oberflächenschicht des Fluoreszenzmaterials in dem Kalibrationsinstrument Fluoreszenzleistung, die seine Oberfläche verlässt, in einer Größenordnung erzeugen, die wenigstens einem Millionstel der Beleuchtungsleistung, die die Probe erreicht, entspricht.
Das Produkt der drei diskutierten Zahlenwerte, 0,13 × 0,9 × 0,6, zeigt, dass die Transporteffizienz etwa 0,070 beträgt. Weiter mit Bezug auf die Tabelle betrifft die Zeile 3 die Verstärkung der Photomultiplier-Röhren, die in dem 418 Array-Scanner eingesetzt werden. Die Röhrenmodule mit der geringsten Verstärkung haben eine Verstärkung von 5 V pro nW, was bedeutet, dass typischerweise bei 637 nm die Photomultiplier-Röhre ein Signal von 5 V für jedes nW erzeugt, das sie erreicht.
In Zeile 4 ist das 418 Array-Scannersystem so, dass, wenn ein Signal voller Stärke erhalten wird, das Gerät 0,5 V an der Photomultiplier-Röhre erzeugt.
Indem man annimmt, dass ein gewünschtes Testmaterial die schwächste Photomultiplier-Röhre sättigt, wird eine Gleichung aufgestellt, die die gewünschte Leistungsfähigkeit des Materials angibt. Die Antwort der Photomultiplier-Röhre ist gleich der Verstärkung mal dem Signal (Menge des auf die Photomultiplier-Röhre auftreffenden Lichtes). Dies ergibt ein Signal gleich 0,5 V geteilt durch 5 V pro nW, oder 0,1 nW Licht, die an der Photomultiplier-Röhre erhalten werden. Indem man diese 0,1 nW nimmt und sie durch die Effizienz von 0,07 teilt, kann man bestimmten, dass an dem Mikroskop-Objektträger 1,4 nW Fluoreszenzlicht erzeugt werden oder etwas mehr. Mithin beträgt die Fluoreszenzerzeugungsrate etwa 1,4 oder 1,5 mal 10^–9, was den nW geteilt durch 3 × 10^–3 entspricht, was gleich 3 mW ist. Dies führt zu einem Wert von etwa ½ mal 10^–6 oder einem Faktor von 1 Million, was bedeutet, dass für jedes den Photomulitplier erreichende Fluoreszenzphoton etwa 1 Millionen Photonen erforderlich sind, die auf die Oberflächenschicht des Fluoreszenzmaterials auftreffen.
Dies zeigt, dass die Fluoreszenzeffizienz der Fluorophore etwa ein mal 10^–6 oder höher sein muss. Das Material benötigt den Empfang von 10⁶ Photonen für jedes Photon, das es abstrahlt. Demgemäß muss die Konversioneffizienz eines geeigneten Fluoreszenzreferenzmaterials von der Größenordnung ein mal 10^–6 oder höher sein.

Claims

Kalibrationsinstrument zum Kalibrieren der Intensität eines Lichtsignals von einem Gerät, das in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, mit: einem Träger, der eine feste Oberflächenschicht trägt, und einer dünnen opaken Maske, wobei die Oberflächenschicht (4) und die Maske in Kontakt miteinander aufgebracht sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächenschicht (4) gleichmäßig verteilte effektive Fluorophore aufweist und dass die Maske aus nicht-fluoreszierendem Material besteht, das Referenzmerkmalöffnungen mit ausgewählten und bekannten Abmessungen definiert, die Bereiche der Oberflächenschicht (4) freilegen.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 1, bei dem die Maske einen geätzten dünnen Metallfilm aufweist, der in engem Kontakt, Oberfläche an Oberfläche, mit der festen Oberflächenschicht liegt, die die gleichmäßig verteilten Fluorophore aufweist.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Instrument eine durchsichtige, nicht-fluoreszierende, die Maske überdeckende Schicht aufweist und die feste Oberflächenschicht dazu ausgestaltet ist, dass die Fluorophore durch Strahlung, die die transparente, nicht-fluoreszierende Schicht durchläuft, angeregt werden.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die Fluorophore aufweisende Oberflächenschicht (4) durch die Öffnungen in der Maske anregender Strahlung direkt ausgesetzt ist.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die feste Oberflächenschicht (4) ein breitbandiger Fluoreszenzstrahler ist.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 5, wobei die dünne Maske oder die feste Oberflächenschicht (4), die die gleichmäßig verteilten effektiven Fluorophore aufweist, direkt aufeinander aufgebracht ist.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 1, 2 oder 3 in Kombination mit einem konfokalen Mikroskop, das eine eingeschränkte Schärfentiefe und eine Antwort hat, und wobei die feste Oberflächenschicht (4), die die gleichmäßig verteilten effektiven Fluorophore aufweist, eine effektive Tiefe hat, die kleiner als die Schärfentiefe des konfokalen Mikroskops ist, das für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 7, bei dem die Oberflächenschicht (4) eine effektive Fluoreszenzemission hat, die eine Antwort des Mikroskops auf der vollen Skala erzeugen kann.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem feste Oberflächenschicht (4) fluoreszierendes Polyimid aufweist.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die Oberflächenschicht (4) Polyemid aufweist, das in Reak tion auf Anregung über ein breites Band von Wellenlängen fluoresziert.
Verfahren zur Herstellung eines Kalibrationsinstruments zum Kalibrieren der Intensität eines Lichtsignals von einem Gerät, das in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, bei dem ein Träger bereitgestellt wird, eine feste Oberflächenschicht (4), die gleichmäßig verteilte effektive Fluorophore aufweist, und eine dünne Maske aus nicht fluoreszierendem Material in Kontakt miteinander erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Erzeugen der dünnen Maske eine Musterbildung der dünnen Maske umfasst, um Referenzmerkmalöffnungen mit ausgewählten und bekannten Abmessungen zu definieren, die Bereiche der Fluorophore aufweisenden Oberflächenschicht (4) freilegen, wobei die Referenzmerkmalöffnungen Ausrichtungsmerkmale für die Fluoreszenzmikroskopie definieren.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Träger flach und fest ist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem ein gleichmäßiger Metallfilm auf der Oberfläche der Oberflächenschicht (4) aufgebracht wird, um die dünne Maske zu bilden, und danach geätzt wird, um das Muster zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die die gleichmäßig verteilten effektiven Fluorophore aufweisenden Oberflächenschicht (4) über der dünnen Maske aufgebracht wird.
Verfahren einer quantitativen Fluoreszenzmikroskopie, das die Intensität eines Lichtsignals von einem Gerät kalibriert, das in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, bei dem: ein Fluoreszenz detektierendes Mikroskop bereitgestellt wird, ein Kalibrationsinstrument mit einem Träger, der dazu ausgestaltet ist, um eine feste Oberflächenschicht (4) zu tragen, die gleichmäßig verteilte effektive Fluorophore aufweist, und eine dünne Maske eines nicht-fluoreszierendes Materials zu tragen, bereitgestellt wird, Fluoreszenz, die von der die Fluorophore aufweisenden Oberflächenschicht (4) ausgestrahlt wird, detektiert wird, das Kalibrationsinstrument dazu eingesetzt wird, um das Mikroskop zu kalibrieren, und Fluoreszenzmikroskopie von Proben unter Verwendung des kalibrierten Mikroskops durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluorophore aufweisende Oberflächenschicht (4) und die Maske in Kontakt miteinander aufgebracht werden und Referenzmerkmalöffnungen mit ausgewählten und bekannten Abmessungen definieren, die Bereiche der die Fluorophore aufweisenden Oberflächenschicht (4) freilegen.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Mikroskop ein Mikroskop mit auf der Achse variablem Objektiv ist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, bei dem das Mikroskop ein Mikrolinsenobjektiv hat, das von einem oszillierenden Dreharm getragen wird.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 1, bei dem der Träger optisch durchsichtig ist und bei dem die dünne opake Maske auf dem Träger hergestellt ist und bei dem die feste Oberflächenschicht (4), die die gleichmäßig verteilten effektiven Fluorophore aufweist, auf die dünne opake Maske aufgebracht ist.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 18, wobei die dünne opake Maske auf dem Träger unter Verwendung eines Adhäsionsverstärkers hergestellt ist.
Kalibrationsinstrument nach Anspruch 18 oder 19, bei dem der Träger flach und fest ist.